Veterinarska fakulteta, UL | Drobnica Jaka Jakob Hodnik VPLIV ULTRAVIJOLICNEGA-B SEVANJA MED ROBOTSKO MOLŽO NA KONCENTRACIJO VITAMINA D V KRVI KRAV MOLZNIC CRNO-BELE PASME Doktorska disertacija Ljubljana, 2023 Veterinarska fakulteta, UL | Drobnica UDK: 636.2:615.832.3:577.161.2:637.115(043.3) Jaka Jakob Hodnik, dr. vet. med. VPLIV ULTRAVIJOLICNEGA-B SEVANJA MED ROBOTSKO MOLŽO NA KONCENTRACIJO VITAMINA D V KRVI KRAV MOLZNIC CRNO-BELE PASME Doktorska disertacija THE INFLUENCE OF ULTRAVIOLET-B IRRADIATION LIMITED TO ROBOT MILKING TIME ON BLOOD VITAMIN D CONCENTRATION IN HOLSTEIN-FRISIAN DAIRY COWS Doctoral thesis Ljubljana, 2023 Jaka Jakob Hodnik Vpliv ultravijolicnega-B sevanja med robotsko molžo na koncentracijo vitamina D v krvi krav molznic crno-bele pasme Delo je bilo opravljeno na Oddelku za zdravstveno varstvo prežvekovalcev Klinike za reprodukcijo in velike živali Veterinarske fakultete v Ljubljani. Javni zagovor je bil opravljen: Mentor: prof. dr. Jože Staric, dr. vet. med. Clani strokovne komisije za oceno in zagovor: predsednik: prof. dr. Robert Frangež, dr. vet. med. clan: izr. prof. dr. Ožbalt Podpecan, dr. vet. med. clan: izr. prof. dr. Marko Cincovic, dr. vet. med. Izjava o delu: Izjavljam, da je doktorska disertacija rezultat lastnega raziskovalnega dela, da so rezultati korektno navedeni in da nisem kršil avtorskih pravic in intelektualne lastnine drugih. Izjavljam, da je elektronski izvod identicen tiskanemu. IZVLECEK Kljucne besede: ultravijolicni žarki; vitamin D; eritem, radioterapija; kri, kemicne analize; laktacija; govedo. Z našo raziskavo smo želeli opredeliti varen odmerek UV sevanja za sintezo vitamina D pri kravah molznicah crno-bele pasme in preveriti uporabnost obsevanja z UVB lucjo ozkega spektra, omejenega na cas robotske molže za sintezo vitamina D. Ugotoviti smo skušali tudi vpliv dolžine dlake in barve kože oziroma dlake na sintezo vitamina D pri govedu. V prvi del raziskave smo vkljucili 21 krav in telic crno-bele pasme z dveh kmetij, ki smo jih z narašcajocimi odmerki z UVB lucjo obsevali na 8 odlakanih in na 8 obritih mestih. V drugi del raziskave smo vkljucili 51 krav crno-bele pasme, ki smo jih na podlagi mlecnosti v predhodni laktaciji, dneva po telitvi in deleža crne dlake na hrbtu enakomerno in nakljucno razdelili v tri skupine. Krave v prvi skupini smo obrili vsaka dva tedna in jih obsevali z odmerkom 80 J/m2, krave v drugi skupini z maksimalnim odmerkom, ki ga je dopušcala dnevna robotska molža, a ni presegala 360 J/m2, tretja skupina krav pa je bila kontrolna skupina. V casu raziskave smo kravam štirikrat odvzeli kri, in sicer prvi dan ter 7 dni, 30 dni in 60 dni po zacetku obsevanja, ter z uporabo avtomatske imunsko-encimske fluorescencne metode dolocili koncentracijo 25-hidroksivitamina D. V prvem delu postopka smo ugotovili, da se rdecina na beli koži pojavi pri odmerku UVB 329 J/m2, na odlakani koži pa pri odmerku UVB 5595 J/m2, ter da je slednji odmerek linearno odvisen od dolžine dlake in da je za povzrocitev rdecine na odlakani koži potreben znacilno višji odmerek. V drugem delu raziskave smo ugotovili, da je v casu robotske molže mogoca sinteza vitamina D pod vplivom UVB luci ozkega valovnega spektra. V povprecju so najvec vitamina D proizvedle obrite krave (13,37 ng/mL), sledile so odlakane krave (9,96 ng/mL), medtem ko so najmanj vitamina D proizvedle krave iz kontrolne skupine (5,11 ng/mL). Ugotovili smo, da je sinteza vitamina D v koži odvisna tudi od barve kože, medtem ko vpliva barve dlake na sintezo vitamina D nismo potrdili. Naša raziskava je prva raziskava o konkretni opredelitvi minimalnega odmerka UVB za povzrocitev rdecine pri kravah molznicah crno-bele pasme na standardiziran nacin in omogoca primerjavo odmerkov med razlicnimi raziskavami. Ker ugotovljeni odmerek v zmernih geografskih širinah zlahka presežemo, je pomembno, da imajo krave na paši zavetje, kamor se lahko umaknejo z neposrednega soncnega sevanja. Ugotovili smo tudi vpliv dlake in barve kože na kožno sintezo vitamina D pri kravah crno-bele pasme in ponudili nov nacin nadomešcanja vitamina D, ki ne moti dnevne rutine komercialnih farm. ABSTRACT Key words: ultraviolet rays; vitamin D; erythema, radiotherapy; blood chemical analysis; lactation; cattle The goal of our study was to determine a safe UV irradiation dose for vitamin D supplementation in dairy cows of the Holstein Friesian breed and to investigate the utility of narrow-band UVB irradiation limited to robot milking time for vitamin D supplementation. We also wanted to determine the influence of hair and skin and/or hair colour on cutaneous vitamin D synthesis in cattle. For the first part of our study, we enrolled 21 cows and heifers of the Holstein Friesen breed from two farms. We irradiated them with a raising dose of irradiation using a narrow-band UVB light on 8 hair-covered and 8 shaven areas. In the second part of the study, we enrolled 51 cows of the Holstein Friesen breed, which we split into three equal and random groups based on milk yield in the previous lactation, days after calving and the percent of black hair on the back. The first group was shaven every two weeks and irradiated with a dose of 80 J/m2, the second group was irradiated with a maximum dose daily robot milking time would allow but did not exceed 360 J/m2, the third group served as a control group. During the study the cows were blood sampled four times on the first and at 7 days, 30 days and 60 days after the start of irradiation and the concentration of 25-hydroxyvitamin D was determined using an automated immune enzyme fluorescence method. In the first part of the study, we found that erythema on shaven will appear at a dose of 329 J/m2 and on haired skin at a dose of 5595 J/m2 and that the latter dose was linearly dependent on hair length, therefore, a significantly higher dose is needed to produce erythema on haired skin. In the second part of our study, we found that vitamin D supplementation using a narrow-band UVB light limited to robot milking time is possible. On average the shaven cows produced the most vitamin D (13,37 ng/mL), followed by the haired group (9,96 ng/mL), while the control group produced the least vitamin D (5,11 ng/mL). We also found that cutaneous vitamin D synthesis is dependent on skin colour; however, we could not confirm an effect of hair colour. This study is the first to determine the minimal erythema dose in Holstein Friesen dairy cattle in a standardised way, which allows the comparison of doses between different studies. The determined doses are easily exceeded at mild latitudes; therefore, it is important that cattle on pasture have shelter where they can get out of direct sun irradiation. We also found an effect of hair and skin colour on cutaneous vitamin D production in Holstein Friesen cattle and put forward a new way of vitamin D supplementation that does not interfere with daily farm routine. KAZALO VSEBINE IZVLECEK ............................................................................................................................... 4 ABSTRACT .............................................................................................................................. 6 KAZALO VSEBINE .............................................................................................................. 10 KAZALO TABEL .................................................................................................................. 13 KAZALO SLIK ...................................................................................................................... 15 1 UVOD ................................................................................................................................... 19 1.1 NAMEN .......................................................................................................................... 19 1.2 HIPOTEZE ..................................................................................................................... 19 2 PREGLED LITERATURE ................................................................................................ 21 2.1 BARVA CRNO-BELEGA GOVEDA ........................................................................... 21 2.1.1 Zašcitni ucinek eumelanina ................................................................................... 23 2.2 ULTRAVIJOLICNA SVETLOBA ................................................................................ 23 2.2.1 Dolocanje MED ...................................................................................................... 26 2.2.2 Škodljivi ucinki UV sevanja .................................................................................. 27 2.2.3 Pozitivni ucinki UV sevanja .................................................................................. 28 2.3 VITAMIN D ................................................................................................................... 30 2.3.1 Presnova vitamina D .............................................................................................. 31 2.3.2 Vloga vitamina D pri govedu................................................................................. 33 2.3.3 Priporocila glede krmljenja vitamina D3 kravam molznicam ........................... 36 2.3.4 Zastrupitev z vitaminom D .................................................................................... 36 2.4 MOLZNI ROBOT .......................................................................................................... 37 3 MATERIALI IN METODE ............................................................................................... 39 3.1 DOVOLJENJE KOMISIJE ZA DOBROBIT ................................................................. 39 3.2 DOLOCANJE MED ....................................................................................................... 39 3.2.1 Živali ........................................................................................................................ 39 3.2.2. UV luc ..................................................................................................................... 39 3.2.3 Obsevanje ................................................................................................................ 41 3.2.4. Statisticna analiza podatkov ................................................................................. 45 3.3 SPOSOBNOST SINTEZE VITAMINA D V KOŽI POD VPLIVOM OBSEVANJA MED ROBOTSKO MOLŽO ................................................................................................ 45 3.3.1 Živali ........................................................................................................................ 45 3.3.2 Analiza krme ........................................................................................................... 45 3.3.3 UV luc ...................................................................................................................... 47 3.3.4 Obsevanje ................................................................................................................ 47 3.3.5 Vzorcenje................................................................................................................. 50 3.3.6 Analiza krvi ............................................................................................................. 50 3.3.7 Statisticna analiza podatkov .................................................................................. 51 3.4 VPLIV DLAKE IN BARVE DLAKE OZ. KOŽE NA SINTEZO VITAMINA D V KOŽI .............................................................................................................................................. 51 3.4.1 Merjenje deleža crne obarvanosti ......................................................................... 51 3.4.2 Preostali materiali in metode za preiskavo tretje hipoteze ................................ 52 4 REZULTATI ........................................................................................................................ 53 4.1 DOLOCANJE MED ....................................................................................................... 53 4.2 SPOSOBNOST SINTEZE VITAMINA D V KOŽI POD VPLIVOM OBSEVANJA MED ROBOTSKO MOLŽO ................................................................................................ 55 4.2.1 Skupine .................................................................................................................... 55 4.2.2 Vitamin D ................................................................................................................ 56 4.3 VPLIV DLAKE IN BARVE DLAKE OZ. KOŽE NA SINTEZO VITAMINA D V KOŽI .............................................................................................................................................. 58 4.3.1 Hemogram in biokemija ........................................................................................ 60 4.3.2 Ocena kondicije ...................................................................................................... 60 4.3.3 Dolžina dlake .......................................................................................................... 60 4.3.4. Prireja mleka ......................................................................................................... 61 5 RAZPRAVA ......................................................................................................................... 64 5.1 DOLOCANJE MED ....................................................................................................... 64 5.2 SPOSOBNOST SINTEZE VITAMINA D V KOŽI POD VPLIVOM OBSEVANJA MED ROBOTSKO MOLŽO ................................................................................................ 67 5.2.1 Vitamin D ................................................................................................................ 67 5.3 VPLIV DLAKE IN BARVE DLAKE OZ. KOŽE NA SINTEZO VITAMINA D V KOŽI .............................................................................................................................................. 68 5.3.1 Hemogram in biokemija ........................................................................................ 69 5.3.2 Prireja mleka .......................................................................................................... 69 6 SKLEPI ................................................................................................................................ 71 7 POVZETEK ......................................................................................................................... 72 8 SUMMARY .......................................................................................................................... 74 9 ZAHVALE ........................................................................................................................... 77 10 LITERATURA .................................................................................................................. 78 11 PRILOGE ........................................................................................................................... 90 11.1 TABELE PARAMETROV HEMOGRAMA ............................................................... 90 11.2 TABELE VREDNOSTI DIFERENCIALNE BELE KRVNE SLIKE ......................... 92 11.3 TABELE VREDNOSTI BIOKEMIJSKIH PARAMETROV ...................................... 94 11.4 MNENJE KOMISIJE ZA DOBROBIT ŽIVALI NA VETERINARSKI FAKULTETI .............................................................................................................................................. 96 KAZALO TABEL Tabela 1: Protokol obsevanja za dolocanje MED .................................................................... 42 Table 1: Irradiation protocol for MED determination 42 Tabela 2: Sestava krmne mešanice (enoloncnice), ki so jo dnevno pokladali na kravo v dveh obrokih ...................................................................................................................................... 46 Table 2: Composition of total mixed ration fed daily per cow in two meals ........................... 46 Tabela 3: Sestava mocnih krmil po hranilnih snoveh............................................................... 47 Table 3: Nutritional composition of concentrated feeds .......................................................... 47 Tabela 4: Rezultati dolocanja minimalnega odmerka za povzrocitev rdecine (MED) ............. 54 Table 4: Results of minimal erythema dose (MED) determination ......................................... 54 Tabela 5: Primerjava skupin pri prvem vzorcenju z enosmerno ANOVO (xŻ ± SEM) in p-vrednosti ................................................................................................................................... 56 Table 5: Comparison of groups at first sampling with one-way ANOVA (xŻ ± SEM) with p - values ........................................................................................................................................ 56 Tabela 6: Opisna statistika celokupnega 25-hidroksivitamina D (25(OH)D) po skupinah in vzorcenjih (xŻ ± SEM). .............................................................................................................. 58 Table 6: Descriptive statistics of total 25-hydroxyvitamin D (25(OH)D) by study groups and samplings (xŻ ± SEM). ............................................................................................................... 58 Tabela 7: Opisna statistika ocene telesne kondicije in p-vrednosti razlik med skupinami in med vzorcenji pri posamezni skupini ............................................................................................... 60 Table 7: Descriptive statistics of body condition scoring and p-values of the differences between groups and samplings within groups ........................................................................................ 60 Tabela 8: Sprememba dolžine dlake v odlakani skupini .......................................................... 61 Table 8: Change in hair length in the haired group .................................................................. 61 Tabela 9: Prireja mleka po skupinah ........................................................................................ 62 Table 9: Milk yield by group .................................................................................................... 62 KAZALO SLIK Slika 1: Prenos melanosomov .................................................................................................. 22 Figure 1: Transfer of melanosomes 22 Slika 2: Povezanost med relativnim ucinkom obsevanja in razlicnimi valovnimi dolžinami UV sevanja. ..................................................................................................................................... 25 Figure 2: Connection between the relative effects of UV irradiation with different wavelengths. 25 Slika 3: Sinteza vitamina D v koži ........................................................................................... 30 Figure 3: Vitamin D synthesis in skin ...................................................................................... 30 Slika 4: Moc obsevanja glede na valovno dolžino. .................................................................. 40 Figure 4: The power of irradiation weighted by wavelength. .................................................. 40 Slika 5: UV LED luc in UV luc s šablono premera 1 cm. ........................................................ 41 Figure 5: UV LED light and UV light with a 1 cm diameter template. ................................... 41 Slika 6: UV luc, pricvršcena na kravo s prijemalkami Rochester-Pean. .................................. 43 Figure 6: UV lamp attached to a cow with Rochester-Pean forcepses. .................................... 43 Slika 7: Mesto obsevanja na obriti koži.................................................................................... 44 Figure 7: Irradiation area on shaven skin. ................................................................................ 44 Slika 8: Obsevanje krave z UV LED lucjo, namešceno v molznega robota Fullwood Merlin 225 .................................................................................................................................................. 48 Figure 8: Irradiation of a cow with the UV LED light mounted into the milking robot Fullwood Merlin 225 ................................................................................................................................ 48 Slika 9: Programa Fullwood MerlinView in LabVIEW ........................................................... 49 Figure 9: Programs Fullwood MerlinView and LabVIEW ...................................................... 49 Slika 10: Model linearne regresije odvisnosti med dolžino dlake in minimalnim odmerkom za povzrocitev rdecine na odlakani koži (MED-H) ...................................................................... 55 Figure 10: Linear regression model of the correlation of hair length and minimal erythema dose of haired skin (MED-H) ........................................................................................................... 55 Slika 11: Razlika med koncentracijo 25-hidroksivitamina D (25(OH)D) pri 1. vzorcenju ter koncentracijami pri 2., 3. in 4. vzorcenju po skupinah ............................................................. 57 Figure 11: Difference in 25-hxdroxyvitamin D (25(OH)D) concentration at 1st sampling and the concentration at 2nd, 3rd, 4th sampling in different groups. ................................................. 57 Slika 12: Odvisnost razlike v koncentraciji 25-hidroksivitamina D (25(OH)D) med 1. in 4. vzorcenjem ter deležem crne kože na mestu obsevanja ........................................................... 59 Figure 12: Correlation of the difference in 25-hydroxyvitamin D (25(OH)D) concentration between 1st and 4th sampling and percent of black skin at the irradiation area ........................ 59 Slika 13: Prireja mleka v odvisnosti od casa pri kravah, vkljucenih v raziskavo..................... 63 Figure 13: Milk yield in relation to time in cows enrolled in the study ................................... 63 SEZNAM OKRAJŠAV IN SIMBOLOV 25(OH)D – 25-hidroksivitamin D 1,25(OH)2D – 1,25-dihidroksivitamin D ABCB1 – poddružina B ATP vezoce kasete clan 1 (angl. ATP binding cassette subfamily B member 1) BCS – ocena telesne kondicije (angl. body condition score) CIE – Mednarodna komisija za osvetlitev (fran. Commission internationale de l'éclairage) DCT – dopakrom tautomeraza DNK – deoksiribonukleinska kislina ED – dominantni Extension alel e – recesivni Extension alel E+, E1 in E2 – divji tip Extension alela ELFA – encimsko sklopljena fluorescentna analiza (angl. Enzyme Linked Fluorescent Assay) FGF-23 – fibroblastni rastni dejavnik 23 GGT – gama glutamil transferaza GLDH – glutamat dehidrogenaza HPLC/MS – tekocinska kromatografija visoke locljivosti, sklopljena z masno spektrometrijo IL – interlevkin KIT – protoonkogen receptor tirozin kinaze (angl. proto-oncogene receptor tyrosine kinase) LED – svetleca dioda (angl. light emitting diode) mA – miliamper MC1R – melanokortin 1 receptor (angl. melanocortin 1 receptor) MED – minimalni odmerek UV sevanja, potreben za povzrocitev rdecine na koži (angl. minimal erythema dose) MED-S – minimalni odmerek UV sevanja, potreben za povzrocitev rdecine na obriti koži MED-H – minimalni odmerek UV sevanja, potreben za povzrocitev rdecine na odlakani koži MITF – z mikroftalmijo povezan transkripcijski dejavnik (angl. microphthalmia-associated transcription factor) a-MSH – a-melanocite stimulirajoci hormon (angl. a-melanocyte-stimulating hormone) nm – nanometer PAX3 – parni škatlasti gen 3 (angl. paired box gene 3) PAX5 – parni škatlasti gen 5 (angl. paired box gene 5) PTH – paratiroidni hormon RANTES – reguliran ob aktivaciji normalnih celic T, izražen in izlocen (angl. regulated on activation normal T-cell expressed and secreted) SCC – plošcatocelicni karcinom SED – standardni odmerek UV sevanja za povzrocitev rdecine SEM – standardna napaka povprecja UV – ultravijolicen V – volt VDBP – vitamin D vezoci protein (angl. vitamin D binding protein) 1 UVOD Vitamin D je pri kravah najbolj poznan po odlocilni vlogi pri presnovi kalcija in fosfatov, novejše raziskave pa ga povezujejo tudi z delovanjem imunskega sistema (Nelson in sod., 2012; Yue in sod., 2018). Krave se naravno oskrbujejo z vitaminom D preko krme ali z lastno sintezo v koži. Ker je vecina krav vzrejena v hlevih, tj. brez neposredne izpostavljenosti soncnim ultravijolicnim (UV) sevanjem, so živali odvisne od kolicine vitamina D v krmi, ki pa ni vedno najbolje izkoristljiv (Hymřller in Jensen, 2011). Kožna sinteza vitamina D lahko poteka tudi v hlevskih pogojih z uporabo UV luci, a so v dosedanjih raziskavah uporabljali UV luci, ki so za doseganje zadovoljivih odmerkov UV sevanja in s tem zadovoljivo sintezo vitamina D potrebovale sorazmerno veliko casa (Jakobsen in sod., 2015; Hymřller in sod., 2017). Do zdaj še nobenemu raziskovalcu ni uspelo dokazati vpliva razmerja med crno in belo barvo kože oziroma dlake na sintezo vitamina D pri kravah (Hymřller in Jensen, 2012; Jakobsen in sod., 2015; Hymřller in sod., 2017). Pri ljudeh sinteza vitamina D poteka optimalno pri relativno nizkih valovnih dolžinah med 295 nm in 300 nm oz. celo pri 293 nm z uporabo luci UV LED (angl. light emitting diode) (MacLaughlin in sod., 1982; Kalajian in sod., 2017), kar bi lahko izkoristili za bolj ucinkovito obsevanje tudi pri govedu. 1.1 NAMEN V raziskavi smo želeli ugotoviti, ali lahko krave, ki so izpostavljene UVB sevanju ozkega spektra, zgolj v casu robotske molže sintetizirajo dovolj vitamina D za fiziološke potrebe. Zanimalo nas je tudi, kako dolžina dlake in delež crne obarvanosti dlake oz. kože na mestu obsevanja vplivata na koncentracijo vitamina D v krvi. Da je raziskava potekala varno za živali, smo morali dolociti minimalni odmerek UVB sevanja nizkih valovnih dolžin, ki je potreben za povzrocitev rdecine (angl. minimal erythema dose, MED) pri kravah crno-bele pasme, in ugotoviti, kako dolžina dlake vpliva na nastanek rdecine. 1.2 HIPOTEZE 1. MED krav molznic crno-bele pasme, izpostavljenih UVB (280–315 nm) na mestih belega obarvanja, presega enkratni odmerek 10 000 J/m2. 2. Za vzdrževanje fiziološke koncentracije vitamina D pri trajno uhlevljenih kravah molznicah crno-bele pasme je v vseh fizioloških pogojih dovolj obsevanje, omejeno na cas robotske molže z UVB ozkega valovnega spektra, ki ne presega MED krav. 3. Dlaka in delež crne in bele barve kože oziroma dlake na mestu obsevanja imata vpliv na koncentracijo vitamina D v krvi. 2 PREGLED LITERATURE 2.1 BARVA CRNO-BELEGA GOVEDA Obarvanost kože in dlake pri govedu je odvisna od koncentracije melanocitov in s tem tudi prisotnosti melanosomov v koži oziroma dlaki. Melanociti se nahajajo v bazalni plasti povrhnjice kože, kjer v specializiranih celicnih organelih (melanosomih) izdelujejo kožna pigmenta eumelanin in feumelanin (Gutiérrez-Gil in sod., 2007) (Slika 1). Melanociti lahko melanosome preko svojih dendriticnih podaljškov predajo drugim celicam, kot so keratinociti povrhnjice, in celicam dlacnih foliklov, kar koži oziroma dlaki da znacilno barvo (Hanel in Carlberg, 2020). Melanosomi s keratinociti ob lušcenju kože potujejo v višje plasti. Osnovna barva pri govedu je odvisna od razmerja v izražanju kožnih pigmentov eumelanina (crnorjava barva) in feumelanina (rdecerumena barva) v koži oziroma dlaki. Kateri pigment bo prevladal, doloca encim tirozinaza. Visoka aktivnost tirozinaze spodbuja nastanek eumelanina, nizka aktivnost tirozinaze pa nastanek feumelanina. Za izdelavo feumelanina je dodatno potrebna še aminokislina cistein (Kollias in sod., 1991). Aktivacija tirozinaze je odvisna od aktivacije melanokortin 1 receptorja (MC1R), zato stimulacija MC1R z a-melanocit-stimulirajocim hormonom (a-MSH) spodbuja nastanek eumelanina. Feumelanin se poveca ob izostanku a-MSH ali okvari oz. blokadi MC1R (Burchill in sod., 1986; Maresca in sod., 2015). Najbolje poznani antagonist MC1R je protein Aguti, ki se veže na MC1R in prepreci vezavo a-MSH (Gutiérrez-Gil in sod., 2007; García-Borrón in sod., 2014). Genetsko je tvorjenje pigmenta odvisno od izražanja alela Extension ali MC1R lokusa na 18. kromosomu, pri cemer so dominantne živali (ED) crne, recesivne (e) pa rdece. Omenjena alela nista obcutljiva na protein Aguti. Živali z mešanico crne in rdece dlake imajo Aguti obcutljive alele Extension, kot so E+, E1 in E2 (Adalsteinsson in sod., 1995; Royo in sod., 2005; Gutiérrez-Gil in sod., 2007; Schmutz, 2012). Slika 1: Prenos melanosomov Prenos melanosomov (rjavi krogci) iz melanocitov (modra celica) v celice povrhnjice kože (rumene celice) Povzeto po Hanel in Carlberg (2020). Figure 1: Transfer of melanosomes. Transfer of melanosomes (brown circles) from melanocytes (blue cell) to epithelial skin cells (yellow cells). Adapted from Hanel in Carlberg (2020). Bele lise pri živalih so posledica izostanka melanocitov na teh podrocjih kože. Pigmentne celice izvirajo iz nevralnega grebena in v casu embrionalnega razvoja migrirajo po telesu. Te celice se nato diferencirajo v melanoblaste z izražanjem genov, kot so z mikroftalmijo povezan transkripcijski faktor (MITF), protoonkogen receptor tirozin kinaza (KIT) in dopakrom tautomeraza (DCT). Melanoblasti nato migrirajo v epidermis, kjer se diferencirajo v melanocite in tvorijo pigment kože in dlake. Prekinitev procesa v kateri koli fazi povzroci izostanek melanocitov v koži in s tem belo pigmentacijo teh predelov (Jivanji in sod., 2019). Ta vrsta belega obarvanja se imenuje »piebald« (Schmutz, 2012). Na mestih »piebald« histološko najdemo malo ali celo nic melanocitov (Spritz, 1994). Pri govedu so bele lise in njihov obseg najverjetneje odvisni od izražanja gena MITF (22. kromosom), ki ga povezujemo z vlogo pri diferenciaciji in preživetju melanocitov (D’Mello in sod., 2016); gena KIT (6. kromosom), ki je kljucen za preživetje in migracijo melanoblastov ter diferenciacijo melanocitov (Baxter in sod., 2004); gena PAX3 (2. kromosom), ki deluje kot transkripcijski faktor za MITF, in gena PAX5 (8. kromosom) (Liu in sod., 2009; Hayes in sod., 2010; Jivanji in sod., 2019). 2.1.1 Zašcitni ucinek eumelanina Eumelanin absorbira fotone UV sevanja bolje pri nižjih valovnih dolžinah. Velja obratno sorazmerje med absorpcijo in valovno dolžino sevanja (Meredith in Sarna, 2006). Dodatno deluje tudi kot lovilec kisikovih radikalov, ki v koži nastanejo pod vplivom UV sevanja (Maresca in sod., 2015). To dejstvo je pomembno, saj kisikovi radikali in neposredni ucinek UV sevanja povzrocajo poškodbe DNK in zato delujejo karcinogeno. Pri ljudeh se vecina melanina nahaja ob bazalni membrani epidermisa (Saager in sod., 2015), pri govedu pa je vecina telesa pokrita z gosto dlako, a njenega zašcitnega ucinka še ne poznamo v celoti. Zašcitni ucinek barve in dlake lahko delno pripišemo dejstvu, da se pri govedu kožne novotvorbe pogosteje pojavljajo na slabo odlakanih in pigmentiranih mestih, kot so veke in vulva (Laws, 2013). Dlaka goveda je razlicno prepustna za UV sevanje. Prepustnost je odvisna od gostote dlake (Bianca in Wegmann, 1974) in verjetno tudi od barve dlake. Pri ljudeh so ugotovili, da rjavi lasje prepušcajo le približno 20 % UV žarkov valovnih dolžin 290–400 nm, kar ne velja za bele lase, pri katerih se prepustnost povecuje od približno 18 % pri 290 nm do približno 60 % pri 400 nm. Razliko lahko pripišemo višjim koncentracijam eumelanina v rjavih laseh in boljši prodornosti višjih valovnih dolžin UV sevanja (Lerche in sod., 2017). Poleg barve na prepustnost vplivajo tudi orientacija, debelina in gostota las (Laws, 2013; de Gálvez in sod., 2015). 2.2 ULTRAVIJOLICNA SVETLOBA UV sevanje glede na valovno dolžino razdelimo v tri razrede, in sicer UVC 100–280 nm, UVB 280–315 nm in UVA 315–400 nm. Za mejo med UVB in UVA se v literaturi pojavljata dve številki, in sicer 315 nm in 320 nm (CIE 209:2014). V naši raziskavi smo upoštevali mejo 315 nm. Soncno UV sevanje, ki doseže zemljo, je sestavljeno pretežno iz sevanja UVA (95 %) in v manjšini iz sevanja UVB (5 %). Sevanje UVC zaustavi že ozonska plast zemlje. Odmerek UV sevanja, ki smo mu izpostavljeni, je odvisen od debeline ozonske plasti, zenitnega kota sonca (tj. kota med lokalno vertikalno osjo in soncem), oblacnosti, odsevnosti talnih površin, nadmorske višine in onesnaženosti zraka. Ozonski plašc, oblacnost in onesnaženost zraka zmanjšujejo kolicino UV sevanja, ki doseže zemljino površino. Zenitni kot sonca je odvisen od casa v dnevu, letnega casa in geografske širine. Najmanjši je ob ekvatorju, okoli poldneva in v poletnem casu. Vecji kot je zenitni kot, manj UV sevanja nas doseže oziroma se spremeni njegova sestava, saj soncno sevanje, ki zaradi vecjega zenitnega kota potuje skozi debelejšo plast ozona, vsebuje manj UVB sevanja (IARC, 1992). Dnevni odmerki UV sevanja lahko povzrocijo rdecino, predvsem UVB, ki se spreminjajo skozi leto in na podobnih geografski širinah kot Slovenija (46° N) znašajo od < 500 J/m2 do > 5000 J/m2 (Reuder in Koepke, 2005; Rieder in sod., 2008; Bilbao in de Migue, 2020). Na južni polobli pri podobnih geografskih širinah (45° S) dnevni odmerek lahko preseže 7500 J/m2 na dan (McKenzie in Lucas, 2018). Na prejeti odmerek vpliva odsevnost talnih površin, saj lahko dobro odbojne površine, kot je sneg, odbijajo do 90 % UV sevanja, a vecina talnih površin odbije manj kot 10 % sevanja (IARC, 1992; Lerche in sod., 2017). Razlicne valovne dolžine soncnega UV sevanja, ki doseže zemljo, imajo razlicne biološke ucinke, najvecjega UVB. Biološki ucinki, za katere poznamo vplive sevanja v odvisnosti od valovnih dolžin, sta na primer povzrocitev rdecine in pretvorba 7-dihidroholesterola v previtamin D3. Obe krivulji sta sprejeti s strani Mednarodne komisije za osvetlitev (CIE) in omogocata standardizacijo odmerkov med razlicnimi viri UV sevanja. Za povzrocitev rdecine so optimalne valovne dolžine 250–298 nm, nato pa se ucinek s povecevanjem valovne dolžine zmanjšuje (ISO 17166:1999) ( Slika 2). Ucinke razlicnih valovnih dolžin na sintezo previtamina D3 v koži so prvi preucevali MacLaughlin in sod. (1982) in ugotovili, da optimalna sinteza poteka pri valovnih dolžinah 295–300 nm ( Slika 2). Pozneje je to krivuljo povzela tudi CIE (CIE 174:2006). Ugotovitve novejših raziskav kažejo, da lahko z uporabo luci LED optimalna sinteza poteka tudi pri nižjih valovnih dolžinah (Kalajian in sod., 2017). Slika 2: Povezanost med relativnim ucinkom obsevanja in razlicnimi valovnimi dolžinami UV sevanja Povezanost med valovnimi dolžinami UV sevanja in povzrocitvijo rdecine ter pretvorbo 7-dehidroholesterola v previtamin D3 v koži. Povzeto in prirejeno po ISO 17166 (1999) in CIE 174 (2006). Figure 2: Connection between the relative effects of UV irradiation with different wavelengths Connection of UV irradiation and erythema production and 7-dihydrocholseterol to pre-vitamin D3 conversion in the skin, respectively. Adapted from ISO 17166 (1999) and CIE 174 (2006). Za podajanje moci UV sevanja uporabljamo enoto W/m2, za merjenje odmerka pa J/m2 (= W/m2*s). Poljudno, torej v javnosti, intenzivnost soncnega UV sevanja podajamo kot UV indeks, ki je moc soncnega UV sevanja, preracunana na krivuljo za povzrocitev rdecine (ISO 17166:1999). UV indeks 1 predstavlja 25 mW/m2 (Kinney in sod., 2000; Lerche in sod., 2017). V Španiji lahko UV indeks preseže 10, na južni polobli pa celo 14 (McKenzie in Lucas, 2018; Bilbao in de Migue, 2020). Druge enote za podajanje odmerka UV sevanja so standardni odmerek UV sevanja za povzrocitev rdecine (SED), ki znaša 100 J/m2. SED je preracunan na krivuljo za povzrocitev rdecine (ISO 17166:1999). Podoben kot SED je minimalni odmerek za povzrocitev rdecine (MED), ki je specificen za vsakega posameznika in je odvisen od pigmenta kože in predhodne izpostavljenosti UV sevanju. Kadar ga dolocamo vizualno, je njegova ocena subjektivna. MED podajamo v J/m2 ali v SED. MED je pri ljudeh z najbolj bledo poltjo približno 200 J/m2 oziroma 2 SED (Fitzpatrick, 1988). Za merjenje odmerka za pretvorbo 7-dihidroholesterola v previtamin D3 lahko uporabljamo standardni odmerek UV za sintezo vitamina D in znaša 100 J/m2, pri cemer je ucinkovitost valovnih dolžin UV sevanja preracunana na krivuljo pretvorbe 7-dihidroholeseterola v previtamin D3 (Slika 2) (CIE 174:2006; McKenzie in sod., 2014). 2.2.1 Dolocanje MED Pri ljudeh dolocamo MED za ugotavljanje primernega odmerka UV za zdravljenje kožnih bolezni, kot so luskavica, ekcem, akne itd. Vrednost MED je pri ljudeh odvisna od prirojene barve polti, debeline kože ter predhodne izpostavljenosti UV sevanju in je specificna za vsakega posameznika (Heckman in sod., 2013) ter znaša 100–2000 J/m2 (Fitzpatrick, 1988; Sachdeva, 2009). Temnost polti in MED sta premo sorazmerna. Enako velja tudi za predhodno izpostavljenost UV sevanju. Ker vsi predeli kože niso enako izpostavljeni UV sevanju, je za dolocitev MED pomembna tudi izbira mesta obsevanja. Kot najbolj relevanten rezultat uporabljamo mesto, ki je cim manj izpostavljeno naravnemu UV sevanju (npr. koža na notranji strani podlakta ali ritnicah). MED dolocamo s šablonami, ki omogocajo izpostavitev kože razlicnim odmerkom UV sevanja. Rezultate testiranja ocenjujemo po 24 urah. Najnižji odmerek, ki je povzrocil zaznavno rdecino ali rdecino z jasnimi mejami, je MED za tistega posameznika (Heckman in sod., 2013). Pri govedu ne obstaja standardni protokol dolocanja MED, a lahko uporabljamo podoben protokol kot za ljudi. Za razliko od ljudi so krave po vecini telesa pokrite z gosto dlako, ki nudi UV zašcito, a gostota in dolžina dlake na vseh predelih nista enaki (Bianca in sod., 1974; Udo, 1978). Posebnost je tudi, da imajo nekatere pasme lisasto obarvanje. Iz podatkov pri ljudeh in živalih lahko sklepamo, da imajo svetlejši deli z manj melanina nižjo vrednost MED (Fitzpatrick, 1988). Tako lahko pri kravah dolocimo dve vrednosti MED – eno za odlakano kožo in eno za obrito kožo. Pri kravah ne obstaja standardizirana krivulja za povzrocitev rdecine, a se po vsej verjetnosti ne razlikuje pomembno od vrednosti, ki se uporablja za ljudi. Podatek o MED pri kravah v literaturi ni jasno opredeljen, saj je podan samo odmerek 100 J/m2 brez dolocenih uporabljenih valovnih dolžin in podane relativne ucinkovitosti valovnih dolžin za povzrocitev rdecine, ki so jo uporabili pri svojem izracunu (Mehlhorn in Steiger, 1975). V novejši raziskavi na kravah kljub višjemu odmerku UVB valovne dolžine 280–320 nm (2430 J/m2) na obriti koži niso ugotovili rdecine (Morrow in sod., 2001), a odmerka niso preracunali na krivuljo za povzrocitev rdecine (ISO 17166:1999). Pri upoštevanju krivulje je njihov odmerek znašal le 176 J/m2, kar še vedno presega odmerek, naveden v literaturi. V raziskavi, v kateri so neobrite krave en mesec obsevali z odmerkom, preracunanim na krivuljo za povzrocitev rdecine (ISO 17166:1999)) 2400 J/m2, tudi ta ni povzrocil rdecine (Hymřller in sod., 2017). 2.2.2 Škodljivi ucinki UV sevanja Pri govedu so najbolj pogost škodljiv ucinek UV sevanja soncne opekline, ki so predvsem posledica UV sevanja kratkih valovnih dolžin (Rowe, 1989). Najveckrat se pojavijo na slabo odlakanih in obarvanih delih kože. Kronicna izpostavljenost UV sevanju vodi v nastanek plošcatocelicnega karcinoma (SCC), najpogosteje na podrocju neodlakane kože okrog oci in vulve. Pojavnost (incidenca) SCC je vecja pri živalih s svetlejšo pigmentacijo okoli oci in pri živalih, ki so izpostavljene vecji kolicini UV sevanja (Anderson, 1991; Pausch in sod., 2012). Vecja je tudi na podrocjih z nižjo geografsko širino in višjo nadmorsko višino ter je odvisna od casa izpostavljenosti soncu (Tsujita in Plummer, 2010; Schmalwieser in sod., 2018). Pri miših so najvecjo pojavnost tumorjev ugotovili pri valovnah dolžinah približno 293 nm, vendar ima tudi UVA sevanje karcinogene ucinke (de Gruijl, 1995). Ugotovljena valovna dolžina je lahko posledica slabše prodornosti nižjih valovnih dolžin skozi kožo in boljše sinteze pigmenta pri višjih valovnih dolžinah, ki varuje kožo pred nadaljnjimi poškodbami. Pri testiranju UVB luci ozkega in širokega spektra z maksimalno mocjo pri valovni dolžini (313 nm) so ugotovili, da UVB luc ozkega spektra bolj pogosto povzroca rakave spremembe na koži pri odmerku 1 MED (El-Ghorr in Norval, 1997). V etiologijo SCC naj bi bili vpleteni tudi herpesvirus in papiloma virusi (Tsujita in Plummer, 2010). Zaradi svetle obarvanosti glave je pasma Hereford nagnjena k nastanku SCC na podrocju oci, a se lahko SCC pojavi tudi pri drugih pasmah, najpogosteje lateralno na ocesni veznici ter na meji med roženico in belocnico (Tsujita in Plummer, 2010). Pojavnost SCC se s starostjo povecuje, kar je lahko posledica daljše celokupne izpostavljenosti karcinogenim ucinkom, na primer UV sevanju, ali pešajoci imunosti s staranjem živali (Heeney in Valli, 1985). Tudi umetni viri UV sevanja lahko povzrocijo SCC pri govedu (Kopecky in sod., 1979). SCC je ekonomsko pomemben, saj zmanjšuje prirast živali ter poveca verjetnost predcasne izlocitve in zaseg trupov v klavnici zaradi tumorskih sprememb, ki so posledica zasevkov. SCC najpogosteje zaseva v podrocne bezgavke in pljuca (Heeney in Valli, 1985; Tsujita in Plummer, 2010), pri govedu pa se lahko pojavi tudi na vulvi. Podobno kot pri oceh na pojavnost SCC na vulvi vpliva pigmentacija (Schmalwieser in sod., 2018). Pojavnost SSC v ZDA pri pasmi Hereford je 0,8–5 %, medtem ko je pri preostalih pasmah le 0,8–1,6 % in se s padajoco geografsko širino povecuje. Na Nizozemskem so po pregledu 35.000 živali ugotovil, da je pojavnost SCC le 0,04 %. Diagnozo SCC postavimo na podlagi tipicnega videza in umešcenosti ter jo lahko potrdimo s citološko preiskavo odtisa spremembe na objektnem stekelcu ali s histopatološko preiskavo vzorca tkiva, pridobljenega z biopsijo (Tsujita in Plummer, 2010). Tretji negativen ucinek UV sevanja je fotosenzibilizacija, ki podobno kot soncne opekline in SSC prizadene predvsem slabo odlakana podrocja in pigmentirano kožo. Za razliko od soncnih opeklin jo povzroca UV sevanje višjih valovnih dolžin (> 320 nm). Fotosenzibilizacijo delimo na tri tipe: i) primarna fotosenzibilizacija, ki nastane zaradi zaužitja toksicnih snovi v rastlinah (hipericin, furanokumarin, fagopirin), ii) fotosenzibilizacija zaradi proizvodnje fotosenzibilnih pigmentov (porfirini) in iii) hepatogena fotosenzibilizacija, ki nastane zaradi poškodbe jeter in zmanjšane razgradnje toksicnih presnovkov (Rowe, 1989). 2.2.3 Pozitivni ucinki UV sevanja Poglavitni pozitiven ucinek UV sevanja je sinteza vitamina D3. Sinteza vitamina D3 v koži se zacne s proizvodnjo 7-dehidroholesterola iz acetata v povrhnjici kože (epidermis). 7-dehidroholestrol je vezan na celicne membrane celic povrhnjice kože, njegove koncentracije pa so najvecje v bazalni plasti (lat. stratum basale) in trnasti plasti (lat. stratum spinosum) (Herrmann in sod., 2017). UVB sevanje prekine vez med ogljikoma C9 in C10 7-dehidroholesterola in nastane previtamin D3, ki se nato pod vplivom telesne temperature izomerizira v vitamin D3 (Hymřller in sod., 2009). Pri ljudeh se 80 % previtamina D3 izomerizira v vitamin D3 v 8 urah (Holick, 1995). Pod vplivom nadaljnjega UV sevanja se lahko previtamin D3 izomerizira v lumisterol3, tahisterol3 in toksisterole, vitamin D3 pa v 5,6-trans-vitamin D3, suprasterol 1 ali suprasterol 2. Izomerizacija med razlicnimi presnovki onemogoca sintezo prevelikih kolicin vitamina D3 (Slika 3) (van Dijk in sod., 2016). Optimalna pretvorba 7-dehidroholestrola v previtamin D3 poteka pri valovnih dolžinah 295–300 nm. Pri 295 nm se vzpostavi ravnovesje, pri katerem 55–65 % predstavlja previtamin D3, 25–30 % tahisterol3, 5–10 % lumisterol3 in 2–5 % 7-dehidroholestrol, medtem ko pri simulirani soncni svetlobi le 20 % predstavlja previtamin D3, 3–6 % tahisterol3, 50–60 % lumisterol3 in 10–20 % 7-dehidroholesterol (MacLaughlin in sod., 1982). Razlika nastane zaradi razlicne obcutljivosti teh presnovkov na višje valovne dolžine UV sevanja. Previtamin D3 in tahisterol3 sta bolj obcutljiva na valovne dolžine, vecje od 315 nm, zato pri obsevanju s soncno svetlobo lumisterol3 in 7-dehidroholesterol zavzameta vecji delež ravnovesja (MacLaughlin in sod., 1982). Pri ljudeh na sintezo previtamina D3 vpliva tudi koncentracija melanina v koži, saj je pri temnejših osebkih potreben daljši cas obsevanja za sintezo enake kolicine previtamina D3 (Holick in sod., 1981). Pri živali sintezo vitamina D3 v koži dodatno ovira dlaka, saj otežuje proizvodnjo, a je ne onemogoci, ker govedo proizvaja vitamin D3 s celotno površino kože in ne samo na manj odlakanih predelih (Hymřller in Jensen, 2010a). Obrite ovce imajo vecje koncentracije vitamina D od neobritih (Dittmer in Thompson, 2011; Kohler in sod., 2013). Tudi barva dlake oz. kože vpliva na kožno proizvodnjo vitamina D, saj imajo v enakih okoljskih pogojih temnejše alpake nižje koncentracije vitamina D od svetlejših (Judson in sod., 2008). Pri odraslem govedu vpliva razmerja med crno in belo barvo dlake na kožno sintezo vitamina D3 niso opredelili še v nobeni raziskavi (Hymřller in Jensen, 2012; Jakobsen in sod., 2015; Hymřller in sod., 2017). V afriški raziskavi so ugotovili, da imajo svetlejša teleta vec 25(OH)D3 in 25(OH)D kot temnejša (Callaby in sod., 2020). Slika 3: Sinteza vitamina D v koži Povzeto po van Dijk in sod. (2016). Figure 3: Vitamin D synthesis in skin Adapted from van Dijk in sod. (2016). 2.3 VITAMIN D Vitamin D je esencialni vitamin za cloveka in veliko živali, tudi za govedo. Govedo lahko naravno pridobi vitamin D na dva nacina – z uživanjem krme oz. krmnih dodatkov, ki vsebujejo vitamin D, ter z lastno sintezo vitamina D v koži. V krmi je lahko vitamin D v dveh oblikah, kot holekalciferol ali vitamin D3 in ergokalciferol ali vitamin D2 (Nelson in sod., 2016a). Holekalciferol je živalskega izvora, a lahko njegove presnovke najdemo tudi v nekaterih rastlinah (Mello, 2003). Ergokalciferol najdemo v rastlinski krmi. Pod vplivom soncne svetlobe ga proizvajajo glive, ki rastejo na rastlinah (Hymřller in Jensen, 2011; Jäpelt in Jakobsen, 2013; Nelson in sod., 2016a). Govedo iz krme bolje izkorišca holekalciferol (Hymřller in Jensen, 2010b, 2011; Duffy in sod., 2018). Ker je celoletna sinteza vitamina D pri višjih geografskih širinah onemogocena in ker se veliko goveda vzreja izkljucno v hlevih brez izpostavljenosti neposrednemu soncnemu sevanju, je govedo odvisno od kolicine vitamina D v voluminozni krmi oz. vitaminskih krmnih dodatkih (Holcombe in sod., 2018). Trpežna ljuljka lahko vsebuje 2,8–255,6 IU/kg vitamina D2 (povprecno 80 IU) pri 19,2 % suhe snovi. Koncentracija je odvisna od letnega casa in izpostavljenosti soncu. Krava z maso 700 kg lahko na dan z zaužitjem 22,4 kg suhe snovi iz takšne paše pridobi 320–29880 IU vitamina D2 na dan (Jäpelt in sod., 2011). Lucernino seno lahko vsebuje do 1920 IU/kg vitamina D2 (% suhe snovi ni podan) (Horst in sod., 1984). Poleg izpostavljenosti soncu in metode konzerviranja na koncentracijo vitamina D2 vpliva tudi zrelost rastlin oz. prisotnost odmrlih listov, ki vsebujejo vec gliv, ki tvorijo vitamin D2 (Jäpelt in Jakobsen, 2013). V Evropi je kot krmni dodatek za govedo registriran le vitamin D3 (Uredba (ES) No 1831/2003). Izvedbena uredba komisije (EU) 2017/1492 doloca, da je maksimalna kolicina vitamina D3 v krmi za odraslo govedo 4000 IU/ kg oz. 10000 IU/kg v mlecnih nadomestkih za teleta. 2.3.1 Presnova vitamina D Vitamin D3, ki je sintetiziran v koži, preide v kri zaradi vezave na vitamin D vezoce proteine (DBP), ki ga lipoproteini transportirajo v celice jeter (Holick in sod., 1980; Ziv in sod., 1985; Dusso in sod., 2005; Herrmann in sod., 2017). Vitamin D3, sintetiziran v koži, se v krvni obtok sprošca pocasi. Po enkratnem UV obsevanju lahko traja tudi tri dni, preden se v celoti resorbira iz kože v kri (Holick in sod., 1980). Vitamin D se v prebavilih absorbira z aktivnim transportom v tankem crevesu. Absorpcija poteka s pomocjo proteinov, odgovornih za absorpcijo mašcob in holesterola (Reboul in sod., 2011). Prenos poteka s pomocjo treh proteinov. Prvi je zbiralni receptor razreda B tipa I (angl. scavenger receptor class B type I), prisoten v dvanajstniku in kolonu, drugi je seženjska determinanta 36 (angl. cluster determinant 36), prisotna v dvanajstniku in jejunumu, in tretji Niemann-Pick C1-podoben znotrajcelicni holesterolni transporter 1 (angl. Niemann-Pick C1-like intracellular cholesterol transporter 1), ki se nahaja v enterocitih. Vitamin D se nato vgradi v hilomikrone in preide v limfo (Rebould, 2015). Iz prebavil pride v kri hitreje kot pri kožni sintezi (vrh resorpcije je 10–12 ur po zaužitju) in je vezan na hilomikrone, lipoproteine in DBP (Reboul, 2015). V jetrih potece prva hidroksilacija na 25. ogljikovem atomu (glavni encim je CYP2R1), pri cemer nastane 25-hidroksivitamin D (25(OH)D). Maksimalna koncentracija 25(OH)D v krvi je dosežena 24–48 ur po UVB obsevanju (Krause in sod., 1998; Mostafa in Hegazy, 2013). Razpolovni cas 25(OH)D pri govedu je 16–32 dni in je odvisen od starosti, saj so imele krave v drugi laktaciji krajši razpolovni cas kot krave v tretji laktaciji (Wilkens in sod., 2013). Zaradi dolgega razpolovnega casa, majhnih kratkorocnih nihanj in relativno visokih koncentracij 25(OH)D uporabljamo za dolocanje oskrbljenosti organizma z vitaminom D. Je tudi skupni presnovek sintetiziranega in zaužitega vitaminu D ter zaradi minimalnega internega uravnavanja dobro odraža sezonsko nihanje, nadomešcanje in povezavo z boleznimi kosti (Dusso in sod., 2005; Herrmann in sod., 2017). Zlati standard za merjenje 25(OH)D je tekocinska kromatografija, sklopljena z masno spektrometrijo (Holick, 2009), a imajo tudi nekatere imunsko-encimske metode, kot je VIDAS® 25-OH Vitamin D Total assay (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Francija) primerljive rezultate. S slednjo metodo lahko izmerimo celokupni 25(OH)D, tako tistega, ki je vezan na vitamin D vezoce proteine (VDBP), kot tudi prosto obliko (Moreau in sod., 2016). Vezan na DBP se 25(OH)D prenese v ledvice, kjer se v celicah proksimalnih ledvicnih cevk ponovno hidroksilira, tokrat na prvem ogljikovem atomu (encim CYP27B1), pri cemer nastane 1,25-dihidroksivitamin D (1,25(OH)2D), ki je aktivna oblika vitamina D. Podobno kot 25(OH)D je tudi 1,25(OH)2D v krvi vecinoma vezan na VDBP in albumine (Bikle in sod., 1985). Hidroksilacija v 1,25(OH)2D lahko poteka tudi v drugih tkivih, npr. v kosteh, posteljici, prostati, keratinocitih, makrofagih, limfocitih, epitelnih celicah debelega crevesa in v trebušni slinavki. Vendar 1,25(OH)2D, ki nastane zunaj ledvice, deluje le na lokalni ravni (Dusso in sod., 2005; Herrmann in sod., 2017). Ker vecina celic nima receptorja megalin/kubulin (imajo ga celice v obšcitnici, posteljici in skeletnih mišicah), ne morajo uporabljati 25(OH)D, vezanega na VDBP, in so odvisne od prostega 25(OH)D v krvi (Bikle, 2020). Glavno vlogo pri vzdrževanju koncentracije 25(OH)D igrajo skeletne mišice, saj ga stalno sprošcajo in absorbirajo ter s tem podaljšujejo njegovo življenjsko dobo v cirkulaciji. Absorpcija in sprošcanje 25(OH)D v mišicah uravnava paratiroidni hormon (PTH) (Abboud in sod., 2017). Zaloge presnovkov vitamina D v skeletnih mišicah so sestavljene pretežno iz presnovkov vitamina D3, saj so presnovki vitamina D2 le tretjina vseh zalog. Koncentracije obeh oblik vitamina D so odvisne od letnega casa. Njune koncentracije so v skeletnih mišicah najvecje na koncu poletja (Cashman in sod., 2020), a sta sezonsko nihanje in razmerje najverjetneje odvisni od dostopnosti do soncnega sevanja in razmerja med oblikami vitamina D v krmi, ki jo zaužijejo živali. Zaloge 25(OH)D najdemo tudi v mašcevju, a v mašcevju ni dostopen, dokler ne pride do mobilizacije mašcobnih kislin za energijo (Rybchyn in sod., 2020). Katabolizem vitamina D se zacne v proksimalnih ledvicnih cevkah, kjer se hidroksilira na 24. ogljikovem atomu (encim CYP24A1), s cimer nastane 24,25-dihidroksivitamin D oz. 1,24,25-trihidroksivitamin D. Koncni produkt njegove razgradnje je kalcitroicna kislina, ki se izloci z žolcem (Dusso in sod., 2005; Herrmann in sod., 2017). Isti encim hidroksilira 1,25(OH)D na 23. ogljikovem atomu in tvori 1,25(OH)D-26,23-lakton, ki se tudi izloci z žolcem (Jones in sod., 2014). Vitamin D in 25(OH)D se lahko neposredno izlocata v svetlino crevesa skozi enterocite, kar je še en mehanizem uravnavanja koncentracije vitamina D v telesu. Miši, ki so jim izbili gen za transporter poddružine B ATP vezoce kasete clan 1 (ABCB1), so imele vecje koncentracije 25(OH)D kot vrstniki v naravi (Margier in sod., 2019). Kljucni regulator koncentracije presnovkov vitamina D v krvi je encim CYP27B1, ki 25(OH)D pretvarja v 1,25(OH)2D. Na njegovo delovanje vplivajo 1,25(OH)2D neposredno ali posredno preko zaviranje sinteze paratiroidnega hormona, ki spodbuja izražanje CYP27B1. Spodbuja tudi nastajanje fibroblastnega rastnega dejavnika-23 (FGF-23), ki zavira izražanje CYP27B1. Delovanje encima zavira tudi povecan vnos kalcija in fosfatov. FGF-23 in 1,25(OH)2D spodbujata izražanje encima za katabolizem vitamina D (CYP24A1) (Herrmann in sod., 2017). 2.3.2 Vloga vitamina D pri govedu 1,25(OH)2D deluje preko vitamin D-receptorja (VDR) v citoplazmi celic. Vezava 1,25(OH)2D na VDR sproži aktivacijo receptorja, ki nato tvori kompleks z retinoid X-receptorjem. Kompleks se translocira v jedro in veže s promotorsko regijo ciljnih genov ter sproži transkripcijo oziroma supresijo genov (Ramagopalan in sod., 2010). 1,25(OH)2D deluje tudi neposredno na receptorje na celicnih membranah in lahko aktivira razlicne signalne poti, na primer gvanilat ciklazo, fosfatidilinozitol-3-kinazo, ciklicno adenozin monofosfatazo, z mitogenom-aktivirane proteinske kinaze, protein kinazo A, fosfolipazo C, odprtje razlicnih, od napetosti odvisnih kalcijevih in klorovih kanalov, ter mobilizacijo kalcija iz sarkoplazemskega retikuluma (Eder in Grundmann, 2022). Neposredno delovanje na transmembransko obliko VDR spodbuja razlicne pomembne funkcije, kot so absorpcija kalcija v crevesu, izlocanje inzulina v celicah trebušne slinavke in številne druge (Saponaro in sod., 2020). Vitamin D je kljucni hormon za uravnavanje koncentracije kalcija in koncentracije fosfatov v telesu, saj uravnava izražanje kalcijevih kanalov na apikalni površini enterocitov, transport kalcija skozi enterocite in njegovo izlocanje v intersticijsko tekocino, iz katere nato preide v kri. Stimulira tudi absorpcijo fosfata iz crevesa (Dusso in sod., 2005). Koncentracijo kalcija in fosfatov vzdržuje tudi s povecanjem njune reabsorpcije iz ledvicnih cevk. Vitamin D je pomemben tudi za razvoj in stabilnost okostja, saj je kljucen za uravnavanje osteoblastne sinteze in osteoklastne razgradnje kosti. Prek uravnavanja izlocanja PTH zavira diferenciacijo osteoklastov, neposredno pa stimulira osteoblaste, saj spodbuja njihovi proliferacijo in maturacijo (Siddiqui in Partridge, 2016). Izboljša delovanje prirojenega in pridobljenega imunskega sistema, odpornost na kronicne bolezni in reprodukcijske motnje ter uravnava lokalno imunost v mlecni žlezi (zmanjša kolonizacijo bakterij in število somatskih celic) (Lippolis in sod., 2011; Nelson in Merriman, 2014). Od imunskih celic vpliva predvsem na makrofage, ki sintetizirajo 1,25(OH)2D ob stimulaciji Tollu-podobnih receptorjev. Tudi limfociti B imajo sposobnost tvorbe 1,25(OH)2D. V vimenu 1,25(OH)2D stimulira nastanek dušikovega oksida in beta-defenzinov, ki imajo protimikrobne ucinke (Lippolis in sod., 2011; Merriman in sod., 2015; Poindexter in sod., 2020). Poleg naštetega sproži tudi nastanek kemokina RANTES (angl. regulated on activation normal T-cell expressed and secreted), ki na mesto vnetja privablja imunske celice (Merriman in sod., 2015). Aktivna oblika vitamina D zavira proliferacijo CD4+ in .dTCR+ T- limfocitov, kar zavira nastanek interferona gama in interlevkina-17 (IL-17), dveh glavni vnetnih citokinov. Poleg teh zniža tudi koncentracijo nekaterih drugih vnetnih citokinov, kot so IL-1ß, IL-6 in IL-8, ter tumor nekrotizirajocega faktorja-a ter poviša koncentracijo protivnetnega citokina IL-10 (Asgharpour in sod., 2020). Po tem lahko sklepamo, da 1,25(OH)2D, sintetiziran v makrofagih in limfocitih B, parakrino uravnava delovanje limfocitov T (Nelson in sod., 2012). Krave z eksperimentalno povzrocenim mastitisom, ki so intramamarno prejele 25(OH)D3, so imele v mleku manj bakterij in manj levkocitov ter nižjo telesno temperaturo kot krave v kontrolni skupini (Lippolis in sod., 2011). Na vlogo vitamina D pri imunskem odgovoru kaže tudi dejstvo, da so se njegove koncentracije zmanjšale (za 51 %) ob umetni okužbi z virusom bovine virusne diareje v obratnem sorazmerju s koncentracijami proteinov akutnega vnetja pri teletih, medtem ko so pri kravah v kontrolni skupini ostale enake. Vendar v raziskavi niso porocali, kaj se je zgodilo z vnosom mleka in s tem vitamina D, kar bi lahko vplivalo na rezultat. Koncentracije proteinov akutnega vnetja in vitamina D so dolocili s testom ELISA (Nonnecke in sod., 2014). Krave s klinicno obliko paratuberkuloze so imele nižje koncentracije 25(OH)D (dolocene z radioimunološko analizo) kot subklinicno okužene in negativne (Stabel in sod., 2019). Nižje koncentracije so ugotovili tudi pri kravah, ki so bile seropozitivne na okužbo z bakterijo Myocbacterium avium subsp. paratuberculosis v primerjavi z negativnimi kontrolami (Sorge in sod., 2013). Vitamin D deluje tudi na sintezo rdecih krvnih celic, saj so pri ljudeh ugotovili VDR v celicah kostnega mozga (Zhou in sod., 2010). Pri bolnikih s kronicno odpovedjo ledvic je zdravljenje z 1,25(OH)2D povecalo vrednosti hemoglobina in hematokrita (Aucella in sod., 2003). V raziskavi na bikih crno-bele pasme so ugotovili negativen vpliv visokih odmerkov vitamina D3, vbrizganega intramuskularno (3.300.000–9.900.000 IE), na število belih krvnih celic (limfocitov, granulocitov) ter pozitiven vpliv na hematokrit in hemoglobin 6 dni po dajanju vitamina D3. Hematološke vrednosti so dolocali avtomatsko s števcem krvnih celic (Keywanloo in sod., 2021). Pri kravah molznicah crne-bele pasme niso ugotovili sprememb v številu levkocitov, limfocitov ali monocitov, ko so jim v 29 dneh v krvi dvignili koncentracijo 25(OH)D s 13,5 ng/mL na 28–46,1 ng/mL. Vitamin D so dodajali na razlicne nacine, in sicer z dodajanjem vitamina D2 in/ali D3 v krmo, z izpostavljanjem soncu na paši 6,5 ure dnevno ter z dodajanjem D2 v krmo in s pašo (6,5 ur). Najbolj uspešna metoda dodajanja vitamina D je bila slednja (Yue in sod., 2018). Vitamin D vpliva tudi na reprodukcijo. V raziskavi iz leta 1971 so ugotovili, da so se krave, ki so prejemale 300.000 IU vitamina D3 na teden po porodu, vrnile v estrus 16 dni prej in bile breje 37 dni prej kot krave brez nadomešcanja (Ward in sod., 1971). Krave, ki so na dan prejele 40 000 IU vitamina D2, so proizvedle vec mleka in zaužile vec krme kot kontrolna skupina brez dodatka in skupina, ki je prejemala 80.000 IU/dan. Odmerek 80.000 IU/ dan so v raziskavi opredelili kot zacetek intoksikacije (National Research Council, 2001). Pri kravah vrednosti 25(OH)D v krvi pod 5 ng/mL kažejo na absolutno pomanjkanje, ki vodi v rahitis oziroma osteomalacijo (Horst in sod., 1997). Za vzdrževanje homeostaze kalcija in fosfatov naj bi bile koncentracije 25(OH)D v krvi višje od 20 ng/mL. Meja 20 ng/mL je bila dolocena po raziskavi na ljudeh, v kateri so ugotovili, da vrednosti paratiroidnega hormona dosežejo plato pri tej koncentraciji (Malabanan in sod., 1998). Meja, do katere se povecujejo pozitivni ucinki vitamina D v krvi, še ni znana (Nelson in Merriman, 2014). Po porodu krave, ki so imele koncentracijo 25(OH)D 175 ng/mL, niso imele višjih koncentracij 1,25(OH)2D, a so imele nižje vrednosti kalcija kot krave s koncentracijo 40 ng/mL (Nelson in Merriman, 2014). Vrednosti 25(OH)D, višje od 30 ng/mL, veljajo za zadovoljive, a je meja povzeta po raziskavah na ljudeh, v katerih so ugotovili, da je resorpcija kalcija iz crevesa vecja pri 30 ng/mL oz. da je delovanje imunskega sistema zavrto pri nižjih koncentracijah, in ne, da je njegovo delovanje pri tej koncentraciji optimalno (Heaney in sod., 2003; Adams in sod., 2007). Nelson in Merriman (2014) za govedo predlagata optimalne koncentracije 25(OH)D v krvi med 40 ng/mL in 80 ng/mL. Spodnjo mejo sta dolocila na podlagi dejstva, da bi lahko zaradi individualnih razlik nekatere krave imele koncentracijo nižjo od 20 ng/mL, ce bi ciljali na optimalno koncentracijo, nižjo od 40 ng/mL. Za zgornjo mejo sta se odlocila, ker raziskave, v kateri bi ugotovili pozitivne ucinke pri koncentracijah nad 100 ng/mL, za zdaj ni. 2.3.3 Priporocila glede krmljenja vitamina D3 kravam molznicam National Reserach Council priporoca krmljenje 30 IU/kg telesne mase/dan vitamina D (National Research Council, 2001), vendar je priporocena koncentracija zaradi povecevanja proizvodnje mleka na kravo od objave priporocil prenizka. V švedski raziskavi na vzorcu krav, ki so jih krmili z 20.000 IU vitamina D3 na dan (približno 30 IU/kg telesne mase/dan), so imele krave pozimi koncentracije 25(OH)D približno 10 ng/mL (Hymřller in sod., 2009). Kravam v Ameriki v krmo pogosto dodajajo nekajkrat vecje koncentracije vitamina D3, kot so navedene v priporocilih (Nelson in sod., 2016a). Potrebe po vitaminu D se še povecajo v poporodnem obdobju, kar se odraža z nižjimi koncentracijami vitamina D v krvi po porodu (Holcombe in sod., 2018). Pri teletih priporocajo nadomešcanje s 600 IU/kg suhe snovi (National Research Council, 2001). Nelson in sod. priporocajo nadomešcanje s 6000 IU/kg suhe snovi za doseganje koncentracij 25(OH)D v krvi 50–60 ng/mL (Nelson in sod., 2016a). 2.3.4 Zastrupitev z vitaminom D Vitamin D je ob prekomernem dodajanju v krmo ali ob zaužitju kalcinogenih rastlin lahko tudi toksicen in povzroca kalcifikacijo mehkih tkiv. Z lastno sintezo vitamina D v koži intoksikacija ni mogoca zaradi internih kontrolnih mehanizmov, ki smo jih opisali v prejšnjih poglavjih. Tudi intoksikacija zaradi cezmernega dodajanja je redka. Koncentracije 25(OH)D lahko dosežejo 400 ng/mL v plazmi brez vidnih posledic (Celi in sod., 2018; Tomkins in sod., 2020). Raziskovalni odbor National Research Council poroca, da lahko krave tolerirajo 2200 IE vitamina D3/kg krme (priporocilo je 30 IE vitamina D3/ kg krme) daljše obdobje (60 dni) in celo 25.000 IE vitamina D3/kg krme krajša obdobja (2001). Paranteralni odmerek 15 milijonov IE vitamina D3 32 dni pred telitvijo in drugi odmerek 5 milijonov IE vitamina D3 7 dni pred telitvijo sta bila toksicna za breje krave pasme Jersey (Littledike in Horst, 1980). Najpomembnejše kalcinogene rastline so Solanum malacoxylon, Cestrum diurnum, Trisetum flavescens in Nierembergia veitchii. Slednje vsebujejo 1,25(OH)2D3 glikozide ali celo aktivno obliko vitamina D. 1,25(OH)2D3 glikozidi se aktivirajo v vampu s pomocjo mikrobne prebave, ki odcepi glikozid od 1,25(OH)2D3. Klinicna znamenja zastrupitve z vitaminom D so hujšanje, podaljšan cas ležanja, težave pri gibanju, povišani frekvenci bitja srca in dihanja ter slabša plodnost, kar vodi v ekonomske izgube v proizvodnji. Na sekciji lahko vidimo obsežne kalcifikacije endokarda, sten velikih žil, pljuc, ledvic in kit. Kljub negativnim ucinkom lahko nekatere kalcinogene rastline uporabljamo tudi za preprecevanje hipokalcemije (Mello, 2003). 2.4 MOLZNI ROBOT Molzni roboti so stroji, ki omogocajo molžo krav brez prisotnosti cloveka. Njihova glavna namena sta sprostitev casa, ki ga lastnik lahko nameni drugim dejavnostim, in domnevno vecja proizvodnja mleka zaradi bolj pogoste molže (Jacobs in Siegford, 2012; Pitkäranta in sod., 2019). Krave v napravo prihajajo prostovoljno oz. je gibanje v hlevu urejeno tako, da morajo krave skoznjo, da pridejo od ležalnih boksov do krme. Krave so za prihod v napravo motivirane tudi s krmili, a je v credi v povprecju še vedno 8 % krav, ki jih moramo na molžo prignati (King in sod., 2016). Molzni robot ima kapaciteto 50–70 krav, odvisno od kolicine proizvedenega mleka in števila predvidenih dnevnih molž. Robot vsak dan ucinkovito molze 20–22 ur, preostali cas pa je namenjen vzdrževanju in cišcenju. Ceprav je robot kravam na voljo tako rekoc cel dan, se še vedno pojavljajo konice povecanega prometa v jutranjih in popoldanskih urah, ki sovpadajo s polaganjem krme (Jacobs in Siegford, 2012; John in sod., 2016). V ameriški raziskavi so ugotovili, da se v povprecju krave molzejo 2,91-krat na dan in da povprecna molža traja 6,84 minute (Tremblay in sod., 2016). Ce krava pride na molžo prehitro po predhodni molži, jo robot zavrne. Število zavrnitev na kravo na dan naj bi bilo vecje od 1, saj to pomeni, da so krave motivirane za prihod v napravo (Tremblay in sod., 2016). Ob molži molzni roboti merijo dolocene parametre mleka, kot so kolicina mleka, delež (%) mašcob, delež (%) beljakovin, elektricna prevodnost in nekateri tudi barva mleka. Oddajniki, namešceni na živali (na nogi ali okoli vratu), omogocajo, da jih robot prepozna, in imajo zelo pogosto tudi merilnike pospeška, ki zaznavajo aktivnost živali (gibanje). S tem podatkom lahko robot zazna, da se žival goni, in jo izloci v poseben cakalni prostor za osemenitev. Opozarja tudi, ali je krava presegla dovoljeni interval med molžama, in sporoci lastniku, da je potrebno kravo prignati v napravo (Jacobs in Siegford, 2012). Glavne prednosti molznih robotov so sprostitev casa lastnika za druge dejavnosti, pogostejša molža krav, molža vsakega seska posebej, standardizirana molzna rutina, individualno krmljenje krav ter spremljanje dodatnih parametrov mleka in krav, pomanjkljivosti pa pretirano zanašanje na merilce (odkrivanje gonitve ali vnetja mlecne žleze), potreba po priganjanju nekaterih krav v robota, relativno visoka cena robota, omejeno število krav na robota, nujnost selekcije krav na konformacijo vimena, navajanje novih krav na robota ter tudi neoptimalno cišcenje in razkuževanje seskov z vecjim številom mastitisov in vecjim številom somatskih celic (Hovinen in Pyörälä, 2011; Jacobs in Siegford, 2012). V številnih raziskavah so ugotovili, da se število somatskih celic po preusmeritvi s sistema molže na robota poveca in da imajo kmetije z robotsko molžo vec somatskih celic v mleku in vec krav z visokimi vrednostmi somatskih celic kot kmetije s konvencionalno molžo. Razlogi slabšega stanja bi lahko bili molža samo z eno molzno enoto, slabše cišcenje seskov in neredna molža. Tudi število zdravljenj se je na nekaterih kmetijah povecalo, kar je morda posledica alarmov za mastitis, ki jih dobijo kmetje pri vsakodnevnem merjenju somatskih celic pri robotski molži (Hovinen in Pyörälä, 2011). 3 MATERIALI IN METODE 3.1 DOVOLJENJE KOMISIJE ZA DOBROBIT Raziskavo je odobrila Komisija za dobrobit živali Veterinarske fakultete Univerze v Ljubljani dne 25. 3. 2020. 3.2 DOLOCANJE MED 3.2.1 Živali V raziskavo dolocanja MED smo vkljucili 16 krav in 5 starejših telic iz dveh cred. Živali so bile crno-bele pasme. Starost govedi, vkljucenih v postopek, je bila med 22 meseci in 10,6 leta (mediana 3,8 leta). Vzreja živali je potekala izkljucno v hlevih in brez dostopa do neposrednega soncnega UV sevanja. Raziskava je potekala aprila in maja leta 2021. Živali za raziskavo smo izbirali nakljucno. Edini pogoj za vkljucitev je bila dovolj velika bela lisa na hrbtni strani medenice, ki je zagotovila dovolj veliko površino za izvedbo obsevanja. MED smo dolocili v hlevu, pri cemer smo kravo ulovili v jasli z možnostjo zaklepa. Živali pri tem nismo sedirali ali jih dodatno fiksirali. 3.2.2. UV luc Za dolocanje MED smo uporabili LED diodo ozkega valovnega spektra UV LED Houkem-SMD 3535-290-300 nm (Dongguan Houke Electronic Co., Ltd., Guang Dong, Kitajska), namešceno na racunalniški hladilnik. Za napajanje smo uporabili napetost 7 V in tok 140 mA. Moc luci je bila 3 mW/cm2. Vrh proizvedene moci je bil pri valovni dolžini 292 nm (Slika 4). Za dolocanje valovnega spektra luci smo uporabili spektrometer HR4000 (Ocean Optics Inc., Dunedin, Florida, ZDA). Celokupno opticno moc smo izmerili z 10-W Thermal power meter S310C (Thorlabs GmbH, Bergkirchen, Nemcija). Vecina (89,75 %) moci naše UV luci je bila sposobna proizvesti rdecino (preracunano na CIE krivuljo za povzrocitev rdecine) (Slika 4). Luc je bila namešcena na šablono z odprtino premera 1 cm, ki je zožila kot obsevanja in je prepušcala le 55 % celokupnega sevanja (Slika 5), kar pomeni, da je kožo krave doseglo le 1,48 mW/cm2 (preracunano na CIE krivuljo za povzrocitev rdecine). Slika 4: Moc obsevanja glede na valovno dolžino Moc obsevanja UV luci (crtkasta krivulja), moc obsevanja, preracunana na CIE krivuljo za povzrocitev rdecine (modra krivulja), in CIE krivulja (rdeca krivulja). Povzeto in prirejeno po ISO 17166 (1999). Figure 4: The power of irradiation weighted by wavelength. Irradiation power of the UV light (doted curve), calculated irradiation power based on the CIE erythema graph (Blue curve) and the CIE graph (red curve). Adapted from ISO 17166 (1999). Slika, ki vsebuje besede notranji Opis je samodejno ustvarjen Slika 5: UV LED luc in UV luc s šablono premera 1 cm Figure 5: UV LED light and UV light with a 1 cm diameter template 3.2.3 Obsevanje Za obsevanje smo izbrali hrbtno stran medenice, ker zagotavlja relativno ravno površino za namestitev UV luci in je v naravnih pogojih med podrocji, ki so najbolj izpostavljena soncnemu UV sevanju. Obsevali smo le bela podrocja kože, ker so bolj obcutljiva za UV sevanje. Krave smo obsevali na osmih odlakanih in osmih obritih mestih, da bi ugotovili MED odlakane kože (MED-H) in MED obrite kože (MED-S). Odmerek smo stopnjevali med razlicnimi mesti obsevanja (Tabela 1). Pred obsevanjem smo dlako na mestu obsevanja pogladili z roko oziroma jo obrili z elektricnim brivnikom. Na mestu obsevanja smo tudi izpulili nekaj dlak za izmero povprecne dolžine dlake. UV luc smo na kravo namestili s prijemali Rochester-Pean (Slika 6). Rezultate obsevanja (rdecino) sta po 24 urah ocenjevala dva ista raziskovalca. Najnižji odmerek, ki je povzrocil zaznavno rdecino, smo izbrali za MED (Slika 7). Tabela 1: Protokol obsevanja za dolocanje MED Table 1: Irradiation protocol for MED determination MED-H MED-S odmerek (J/m2) cas (s) odmerek (J/m2) cas (s) 1500 101 100 7 3000 203 200 14 4000 270 300 20 5000 338 400 27 6000 405 600 41 7000 473 800 54 8000 540 1000 68 10000 675 1500 101 Slika, ki vsebuje besede crna, sesalec Opis je samodejno ustvarjen Slika 6: UV luc, pricvršcena na kravo s prijemalkami Rochester-Pean Figure 6: UV lamp attached to a cow with Rochester-Pean forcepes. Slika, ki vsebuje besede stojece, sesalec, vodni sesalec, tjulenj Opis je samodejno ustvarjen Slika, ki vsebuje besede besedilo Opis je samodejno ustvarjen Slika 7:Mesto obsevanja na obriti koži Takoj po obsevanju (levo) in 24 ur po obsevanju (desno). Zaznavna rdecina je oznacena z modrimi pušcicami. Pri kravi je bil tretji odmerek (300 J/m2) najmanjši odmerek, ki je še povzrocil rdecino, zato smo ga izbrali za MED te krave na obriti koži. Figure 7: Irradiation area on shaven skin. Immediately after irradiation (left) and 24 hours after irradiation (right). The detectable erythema is marked with blue arrows. In this cow the third dose (300 J/m2) was the minimum dose which produced erythema; therefore, it was chosen as the MED on shaven skin for this cow. 3.2.4. Statisticna analiza podatkov Statisticno analizo in grafe smo pripravili s statisticnim programom R (R Foundation for Statistical Computing, Dunaj, Avstrija). Za oceno normalnosti porazdelitve podatkov smo uporabili Shapiro-Wilkov test, za ugotavljanje razlike v MED med kravami in telicami na obritih in odlakanih mestih pa Wilcoxonov test vsote rangov. Razliko v dolžini dlake smo analizirali s Studentovim t-testom. Korelacijo med dolžino dlake in MED na odlakanih mestih smo ugotavljali s Spearmanovim korelacijskim koeficientom. Povezavo smo preucili tudi z modelom linearne regresije in znacilnost dolocili pri vrednosti p < 0,05. 3.3 SPOSOBNOST SINTEZE VITAMINA D V KOŽI POD VPLIVOM OBSEVANJA MED ROBOTSKO MOLŽO 3.3.1 Živali V postopek smo vkljucili 51 krav crno-bele pasme z ene kmetije. Edina pogoja za vkljucitev v poskus sta bila, da je krava v laktaciji in da v casu preskusa ni presušena, zato smo izbrali le krave, ki še niso bile breje oziroma so bile breje manj kot 160 dni. Ob prvem vzorcenju smo vsako kravo v stojecem položaju slikali s pticje perspektive in z analizo slike dolocili razmerje med crno dlako in belo dlako na podrocju hrbta med lopaticama in kolcnima grcama s programom ImageJ 1.52 (National Institutes of Health, ZDA). Izbrane krave smo nato z metodo stratificiranega vzorcenja razdelili nakljucno v tri enakovredne skupine po 17 živali na podlagi mlecnosti v prejšnji standardni laktaciji oziroma glede na povprecno življenjsko mlecnost mater v primeru prvesnic, razmerje med crno in belo dlako na hrbtu (< 50 % / > 50 %) in cas po telitvi (< 30 dni / > 30 dni). Med potekom raziskave smo izlocili štiri krave, eno v skupini krav, ki smo jih brili, in tri v skupini krav, ki jih nismo brili. V kontrolni skupini so bile ves cas postopkov v raziskavo vkljucene vse krave. 3.3.2 Analiza krme Krave so bile krmljene s krmno mešanico (enoloncnico) s sestavo, ki jo prikazujemo v Tabeli 2. Poleg obroka na krmilni mizi so krave v molznem robotu prejele tudi mocna krmila, in sicer vsaka krava 0,5 kg krmila K-22 (Jata Emona d. o. o., Ljubljana, Slovenija) ter za vsakih 10 kg mleka nad 20 kg dnevne prireje 1 kg K-TOP (Jata Emona d. o. o., Ljubljana, Slovenija) in 1 kg K-TOP-50 (Jata Emona d. o. o., Ljubljana, Slovenija). Sestavo krmil prikazujemo v Tabeli 3. Krmo smo odvzeli ob prvem, tretjem in cetrtem vzorcenju po metodi, opisani v Uredbi komisije (ES) 152/2009. Vzorce smo odvzeli s krmilne mize. Krma je bila analizirana po Uredbi komisije (ES) 152/2009 na Inštitutu za varno hrano, krmo in okolje Veterinarske fakultete Univerze v Ljubljani, kjer so izvedli Weendsko analizo. Dodatno smo vzorce poslali tudi v laboratorij Chelab (Italija), kjer so dolocili vsebnost vitamina D3 z metodo visokozmogljive tekocinske kromatografije, sklopljene z masno spektrometrijo (HPLC/MS). Tabela 2: Sestava krmne mešanice (enoloncnice), ki so jo dnevno pokladali na kravo v dveh obrokih Table 2: Composition of total mixed ration fed daily per cow in two meals Sestavina Masa (kg) pšenicna slama 0,5 koruzna silaža 20 travna silaža 26 koruza 0,8 sojine tropine 0,3 repicne tropine 0,3 mašcoba v prahu 0,1 pivske tropine 1 K-mix-PASS* 0,8 Rumisal-10* 0,15 apnenec 0,08 soda bikarbona 0,150 Complett EXTRA-Keragen®+ 0,1 Skupna masa 50,280 Opomba: *Proizvajalec Jata Emona d.o.o., Ljubljana, Slovenija; +Proizvajalec Josera d.o.o., Ljubljana, Slovenija. Comment: *Manufacturer Jata Emona d.o.o., Ljubljana, Slovenia; +Manufacturer Josera d.o.o., Ljubljana, Slovenia Tabela 3: Sestava mocnih krmil po hranilnih snoveh Table 3: Nutritional composition of concentrated feeds Sestava K-22* K-TOP* K-TOP-50* surove beljakovine (%) 22 10 21 surove mašcobe (%) 2,2 7,2 5,4 surova vlaknina (%) 7,8 5,1 6,4 surovi pepel (%) 6,6 6,5 7,9 kalcij (%) 0,85 1,2 1,2 fosfor (%) 0,65 0,4 0,7 natrij (%) 0,25 0,5 0,3 magnezij (%) 0,3 0,4 0,5 vitamin D3 (IE/kg) 1000 0 1000 Opomba: *Proizvajalec Jata Emona d. o. o., Slovenija. Comment: *Manufacturer Jata Emona d. o. o., Slovenia 3.3.3 UV luc Za obsevanje krav v casu robotske molže smo uporabljali UV luc, ki smo jo izdelali sami. Luc je sestavljalo 90 UV LED diod Houkem-SMD 3535-290-300 nm (Dongguan Houke Electronic Co., Ltd., GuangDong, Kitajska), namešcenih na ukrivljeno aluminijasto ogrodje (širina 40 cm, dolžina 120 cm), sestavljeno iz šestih rešetk. Na vsako rešetko je bilo namešcenih 15 LED diod, ki so bile vezane v skupine s po tremi zaporedno vezanimi LED diodami (Slika 8). Skupna moc naprave je bila 295,2 mW, moc UV luci pa je bila najvecja pri valovni dolžini 295 nm. Za dolocanje valovnega spektra in moci luci smo uporabili spektrometer HR2000+ (Ocean Optics Inc., Dunedin, FL, ZDA). 3.3.4 Obsevanje Kravam, razdeljenim v tri enakovredne skupine, smo dolocili tri razlicne protokole obsevanja v casu robotske molže na molznem robotu Merlin 225 (Fullwood Packo, Ellesmere, Združeno Kraljestvo). Krave smo obsevali le po hrbtu, da smo se izognili glavnim mestom nastanka SCC (ocem in vulvi) in da smo zašcitili na UV sevanje obcutljive komponente molznega robota. Krave v prvi skupini so bile obrite in dnevno obsevane z 80 J/m2, krave v drugi skupini pa so bile odlakane in obsevane z odmerkom, ki je bil odvisen od casa robotske molže in dnevno ni presegal 360 J/m2. Za takšen protokol obsevanja smo se odlocili zaradi omejene moci luci. Krave v tretji skupini so služile kot kontrolna skupina in niso bile obsevane. Dnevni odmerek smo zagotovili s programom Fullwood MerlinView (Fullwood Packo, Ellesmere, Združeno kraljestvo) in s programom LabVIEW: Advanced programming technique (National Instruments, Austin, Texas, ZDA). Program MerlinView je prepoznal vsako kravo preko digitalnega transponderja, ki so ga krave nosile na sprednji desni nogi, in v realnem casu sporocal, kaj se trenutno dogaja s kravo v robotu. S programom LabVIEW smo zajemali posnetke zaslona programa MerlinView in ob zacetku molže sprogramirali vklop luci. Program je beležil tudi cas obsevanja, s cimer smo lahko omejili dnevni odmerek obsevanja na kravo za vsako skupino (Slika 9). Obsevanje je potekalo dva meseca, od 25. 3. 2022 do 24. 5. 2022. Slika, ki vsebuje besede notranji, sesalec, goveji, umazano Opis je samodejno ustvarjen Slika 8: Obsevanje krave z UV LED lucjo, namešceno v molznega robota Fullwood Merlin 225 Figure 8: Irradiation of a cow with the UV LED light mounted into the milking robot Fullwood Merlin 225 Slika, ki vsebuje besede besedilo, elektronika, prikaz, racunalnik Opis je samodejno ustvarjen Slika 9: Programa Fullwood MerlinView in LabVIEW Program Fullwood MerlinView in (zgoraj levo in desno) in program LabVIEW za beleženje slike zaslona (levo spodaj) in vodenje evidence obsevanja na dan (desno spodaj). Figure 9: Programs Fullwood MerlinView and LabVIEW Program Fullwood MerlinView (top right and left) and program LabVIEW capturing the screen (bottom left) and recording the daily irradiation (bottom right). 3.3.5 Vzorcenje Med raziskavo smo štirikrat opravili vzorcenje krvi – prvic 14. 3. (–11 dni), drugic 1. 4. (+7 dni), tretjic 25. 4. (+30 dni) in zadnjic 24. 5. (+60 dni). Pri prvem vzorcenju smo kravam odvzeli vzorec krvi iz repne vene (lat. v. caudalis mediana) v epruveto z antikoagulantom EDTA in v epruveto brez dodatka za pridobitev seruma (BD Vacutainer®, Franklin Lakes, New Jersey, ZDA). Po odvzemu smo kri cim hitreje transportirali v laboratorij (v eni uri). Hemogramsko preiskavo smo opravili še istega dne. Vzorce serumske krvi smo pustili v hladilniku preko noci, da se je lahko izlocil serum. Naslednji dan smo vzorce dvakrat centrifugirali (10 minut pri 3000 obratih na minuto), serum razdelili na tri enake dele in ga zamrznili na –20 °C do laboratorijskih analiz. Krave smo slikali za oceno razmerja med crno in belo barvo na podrocju hrbta med lopaticama in kolcnima grcama s pticje perspektive. Izpulili smo tudi nekaj dlak (vsaj 10) z mesta obsevanja (precni podaljški ledvenih vretenc) za dolocitev povprecne dolžine dlake na hrbtu. Za dolocitev dolžine dlake smo izmerili dolžino treh nakljucno izbranih dlak in uporabili povprecje. Vsem kravam smo izmerili višino v vihru in ocenili telesno kondicijo po lestvici Body Condition Score (BCS) z ocenami 1–5 po metodi Univerze Pennsylvania State, ZDA. Pri nadaljnjih vzorcenjih smo odvzeli le vzorce krvi in ocenili telesno kondicijo. Pri zadnjem vzorcenju smo kravam v odlakani skupini ponovno odvzeli vzorec dlake po opisani metodi. Med celotno raziskavo je molzni robot spremljal kolicino namolzenega mleka na molžo. Zbrali smo tudi podatke o proizvodnji mleka iz vsakomesecnih mlecnih kontrol, ki so sovpadale s casom raziskave (11. 3. 2022, 8. 4. 2022, 13. 5. 2022). 3.3.6 Analiza krvi V vsakemu vzorcu krvi smo dolocili vrednosti hemograma (število belih krvnih celic, število rdecih krvnih celic, hemoglobin, hematokrit, povprecno prostornino eritrocitov, povprecno kolicino hemoglobina v eritrocitih, povprecno koncentracijo hemoglobina v eritrocitih, število trombocitov) z napravo Vet abc PlusTM (Scil animal care company GmbH, Viernheim, Nemcija). Diferencialno belo krvno sliko smo dolocili s štetjem celic v krvnem razmazu na imerzijskem mikroskopu po predhodnem barvanju po metodi Hemacolor® (Merck KGaA, Dramstadt, Nemcija). Vzorce smo po navodilih proizvajalca analizirali tudi za biokemijske parametre (glutamat dehidrogenazo – GLDH [kataloška številka: GL 441], gama glutamil transferazo – GGT [kataloška številka: GT8320], albumine [kataloška številka: AB8000], proteine [kataloška številka: TP3869], kalcij [kataloška številka: CA3871], fosfor [kataloška številka: PH3872] RX Daytona+ (Randox Laboratories Ltd., Crumlin, Združeno kraljestvo)) na napravi RX Daytona+ (Randox Laboratories Ltd., Crumlin, Združeno kraljestvo). Vrednosti 25(OH)D smo izmerili na napravi miniVIDAS (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, Francija) po metodi imunskega testa ELFA (angl. Enzyme Linked Fluorescent Assay). Uporabili smo reagentni komplet VIDAS® 25 OH Vitamin D Total [kataloška številka: 30463] (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, Francija). Pri tej metodi vzorec zmešamo z reagentom, ki loci 25(OH)D od vitamin D vezocega proteina. Zmes nato s pomocjo receptala trde faze prenesemo v posodico s protitelesi za vitamin D, ki so oznaceni z alkalno fosfatazo. 25(OH)D v vzorcu tekmuje z 25(OH)D na receptalu trde faze za mesta na protitelesih. V zadnjem koraku receptal trde faze spiramo s substratom (4-metillumbeliferil fosfat). Alkalna fosfataza na protitelesih anti-25(OH)D katalizira hidrolizo substrata v fluorescirajoci produkt (4-metilumbeliferon). Njegovo fluorescenco merimo pri valovni dolžini 450 nm. Intenzivnost fluorescence je obratno sorazmerna s koncentracijo 25(OH)D v vzorcu. Naprava nato sama preracuna koncentracijo 25(OH)D v vzorcu (Moreau in sod., 2016). 3.3.7 Statisticna analiza podatkov Statisticno analizo in grafe smo pripravili s statisticnim programom R (R Foundation for Statistical Computing, Avstrija). Za oceno normalnosti porazdelitve podatkov smo uporabili Shapiro-Wilkov test, za primerjavo vrednosti parametrov med skupinami pa test analize varianc (ANOVA) oz. njegov neparametricni ekvivalent Kruskal-Wallisov test. Za analizo razlik med posameznimi skupinami smo uporabili Tukeyjev HSD pristop oz. Wilcoxonov test vsote rangov z Bonferronijevim popravkom p-vrednosti. Za analizo razlik med vzorcenji smo uporabili test ANOVA ponovljene meritve oz. Friedmanov test pri nenormalno porazdeljenih podatkih. Za analizo korelacij smo uporabili metodo po Pearsonu oz. Spearmanu s korekcijo p-vrednosti po Holmu. Za analizo odvisnosti prozvodnje vitamina D od deleža crnosti kože na hrbtu smo uporabili linearno regresijo. Znacilnost smo dolocili pri vrednosti p < 0,05. 3.4 VPLIV DLAKE IN BARVE DLAKE OZ. KOŽE NA SINTEZO VITAMINA D V KOŽI 3.4.1 Merjenje deleža crne obarvanosti Za analizo tretje hipoteze smo morali dolocili razmerje med crno in belo dlako na podrocju hrbta. Ob prvem vzorcenju smo vsaki kravi fotografirali hrbet s pticje perspektive. Slike smo nato analizirali s programom Image J 1.52 (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, ZDA). Najprej smo slike pretvorili v crno-beli format, nato pa smo na sliki omejili željeno polje preiskave (podrocje hrbta med lopaticama in kolcnima grcama) in izmerili njegovo površino. S funkcijo Analyse particles smo nato izmerili površino crnih lis. Nazadnje smo površino crnih lis delili s površino preiskovanega dela hrbta in dobili delež crne obarvanosti na hrbtu. 3.4.2 Preostali materiali in metode za preiskavo tretje hipoteze ostale materiale in metode, uporabljene za preverjanje tretje hipoteze, opisujemo v tockah 3.3.1–3.3.7. 4 REZULTATI 4.1 DOLOCANJE MED Nobena žival med obsevanjem in po njem ni kazala znakov nelagodja (gledanje proti mestu obsevanja, brcanje, praskanje, upiranje, odmikanje ipd.). Rezultate obsevanja predstavljamo v Tabeli 4. Rdecina je izginila v nekaj dneh. Povprecna vrednost MED ± SEM na odlakanih mestih je bila 5595 ± 380 J/m2, na obritih mestih pa 329 ± 14 J/m2. Telice so imele na odlakanih mestih višji MED (7600 J/m2) kot krave (4969 J/m2) (p = 0,004). Telice so imele tudi daljšo dlako (xŻ ± SEM 20,2 ± 0,8 mm) kot krave (xŻ ± SEM 11,2 ± 1,8 mm) (p = 0,001). Razlika na obritih mestih ni bila znacilna (p = 0,053). Kolicina UV sevanja, ki je prodrla skozi dlako, je bila odvisna od dolžine dlake. V povprecju je dlaka prepustila 6,7 % UV sevanja (prepustnost = MED na obriti koži (J/m2)/MED na odlakani koži (J/m2)). Spearmanov korelacijski koeficient med dolžino dlake in MED na odlakanih mestih je bil 0,76 (p = 0,00006). Model linearne regresije je razložil 80 % variabilnosti povezave med dolžino dlake in MED na odlakanih mestih (p = 3,4*10-8). Za vsak milimeter dolžine dlake se je MED na odlakanih mestih povecal za 316 J/m2 (MED na odlakani koži (J/m2) = 1350 + 316 x dolžina dlake (mm)) (Slika 10) . Tabela 4: Rezultati dolocanja minimalnega odmerka za povzrocitev rdecine (MED) Table 4: Results of minimal erythema dose (MED) determination Starost MED-H (J/m2) MED-S (J/m2) UV prepustnost Dolžina dlake Krave 5,3 5000 300 6 11 10,7 6000 300 6,7 17 6,5 3000 300 10 5 3,8 5000 400 8 12 4,3 4000 200 5 12 3,9 6000 400 6,7 11 5,7 5000 400 8 10 5,0 5000 400 8 14 2,8 6000 400 6,7 13 7,9 5000 400 8 10 3,7 6000 400 6,7 13 2,8 5000 300 6 13 4,9 6000 300 5 13 8,5 =1500 300 20 4 2,7 6000 400 6,7 11 2,5 5000 300 6 12 Povprecje krav 5,0 4969 344 7,6 11,3 Telice 1,8 8000 200 2,5 20 2,1 6000 300 5 16 1,8 8000 300 3,8 20 2,0 6000 300 5 20 2,3 10000 300 3 25 Povprecje telic 2,0 7600 280 3,85 20,2 Povprecje skupno 4,3 5595 329 6,7 13,4 MED-S – minimalni odmerek za povzrocitev rdecine na obriti koži, MED-H – minimalni odmerek za povzrocitev rdecine na odlakani koži. MED-S – Minimal erythema dose for shaven skin, MED-H – Minimal erythema dose for haired skin. Slika 10: Model linearne regresije odvisnosti med dolžino dlake in minimalnim odmerkom za povzrocitev rdecine na odlakani koži (MED-H) Slika ponazarja linearno odvisnost dolžine dlake in minimalnega odmerka za povzrocitev rdecine na odlakani koži. Crne pike so posamezne krave, modra crta pa trend. Z modelom lahko pojasnimo 80 % variabilnosti (R2 = 0,8). Figure 10: Linear regression model of the correlation of hair length and minimal erythema dose of haired skin (MED-H) The figure shows the linear relationship between hair length and minimal erythema dose of haired skin. The black dots are individual cows and the blue line the trend. The model explains 80 % of the variability (R2=0,8). 4.2 SPOSOBNOST SINTEZE VITAMINA D V KOŽI POD VPLIVOM OBSEVANJA MED ROBOTSKO MOLŽO 4.2.1 Skupine Skupine so bile pri prvem vzorcenju izenacene (Tabela 5), nekoliko so odstopale le vrednosti vitamina D pri kontrolni skupini, a razlika ni bila znacilna. Krave v odlakani skupini so se v povprecju molzle 17 minut in 33 sekund na dan. Med raziskavo pri nobeni kravi nismo opazili neželenih ucinkov obsevanja z UV lucjo. Tabela 5: Primerjava skupin pri prvem vzorcenju z enosmerno ANOVO (xŻ ± SEM) in p-vrednostmi Table 5: Comparison of groups at first sampling with a one-way ANOVA (xŻ ± SEM) with p - values Obrite Odlakane Kontrola p-vrednost Dnevi po telitvi 1178 ± 24 160 ± 31 153 ± 24 0,98 Mleko (kg) 30,3 ± 1,5 29,9 ± 2,1 28,2 ± 2,1 0,84 Višina vihra (cm) 142,5 ± 0,9 141,4 ± 1,2 142,1 ± 1 0,74 Telesna kondicija 2,9 ± 0,1 2,9 ± 0,11 2,9 ± 0,1 0,92 % crne obarvanosti 59, ± 8,7 51,7 ± 9,5 55,5 ± 8,5 0,71 25(OH)D (ng/mL) 10,8 ± 0,5 11,6 ± 0,7 13,2 ± 0 ,8 0,07 4.2.2 Vitamin D V raziskavi smo ugotovili znacilne razlike v proizvedenem vitaminu D med testnimi skupinami (Slika 11). Krave, ki so bile obrite in obsevane s cetrtino odmerka, potrebnega za povzrocitev rdecine, dolocenega v prvem delu raziskave, so v casu raziskave (60 dni) proizvedle najvec vitamina D (13,44 ng/mL 25(OH)D). Sledile so krave, ki so bile odlakane in so prejele poljubni odmerek sevanja, v povprecju 210 J/m2 (10,6 ng/mL 25(OH)D). V kontrolni skupini se je 25(OH)D povecal zgolj za 5,1 ng/mL 25(OH)D. Poglavitno povecanje koncentracije vitamina D v kontrolni skupini se je zgodilo med prvim in drugim vzorcenjem, v nadaljnjih vzorcenjih pa koncentracija ni znacilno porastla. Razlike med skupinami so bile znacilne (Tabela 6), v obriti skupini pa je le ena krava presegla mejo zadovoljive koncentracije 30 ng/mL 25(OH)D v krvi. Vecina krav (22/30) v obsevanih skupinah je presegla mejo pomanjkanja (20 ng/mL 25(OH)D). Slika 11: Razlika med koncentracijo 25-hidroksivitamina D (25(OH)D) pri 1. vzorcenju in koncentracijo pri 2., 3. in 4. vzorcenju po skupinah Slika ponazarja razliko v proizvedenem 25-hidroksivitamina D (25(OH)D) med prvim vzorcenjem in nadaljnjimi vzorcenji. Skupine: obrita (oranžna), odlakana (zelena) in kontrolna (modra). Obrita skupina je proizvedla najvec 25(OH)D. Razlika med obrito in kontrolno skupino je bila znacilna že pri drugem vzorcenju. Po tretjem vzorcenju so bile vse skupine znacilno razlicne. Figure 11: Difference in 25-hxdroxyvitamin D (25(OH)D) concentration at 1st sampling and the concentration at 2nd, 3rd, 4th sampling in different group. The figure shows the difference in the synthetised 25-hxdroxyvitamin D (25(OH)D) between the first and all the other samplings. The groups: shaven (orange), haired (green) and control (blue). The shaven group produced the most 25(OH)D. The difference between the shaven and control groups was significant at second sampling. After the third sampling all the groups were significantly different from each other. Tabela 6: Opisna statistika celokupnega 25-hidroksivitamina D (25(OH)D) po skupinah in vzorcenjih (xŻ ± SEM) Table 6: Descriptive statistics of total 25-hydroxyvitamin D (25(OH)D) by group and sampling (xŻ ± SEM). 25(OH)D (ng/mL) Obrite Odlakane Kontrola 0 dni 10,79 ± 0,52a,1 11,58 ± 0,67a,1 13,15 ± 0,8a,1 7 dni 16,61 ± 0,56b,1 16,36 ± 0,95b,1 16,96 ± 0,76b,1 30 dni 20,74 ± 0,66c,1 19,36 ± 0,87b,1 17,75 ± 0,82b,2 60 dni 24,16 ± 0,85d,1 21,54 ± 0,76c,2 18,26 ± 0,72b,3 Opomba: Crke in številke ponazarjajo znacilno razliko. Razlicne crke ponazarjajo znacilne razlike med vrsticami, razlicne številke pa znacilne razlike med stolpci. Comment: Letters and numbers indicate significant differences. Different letters indicate the significant differences between rows. Different numbers indicate the significant differences between columns. 4.3 VPLIV DLAKE IN BARVE DLAKE OZ. KOŽE NA SINTEZO VITAMINA D V KOŽI Pri obriti skupini je bila proizvodnja vitamina D med prvim vzorcenjem in cetrtim vzorcenjem negativno povezana s površino crne obarvanosti kože (vitamin D (ng/mL) = 17 – 0,0642 x delež crne kože (%)) (Spearmanov rho = –0,64; p= 0,03) (Slika 12). Enake korelacije nismo ugotovili pri odlakani skupini (Spearmanov rho = 0,084; p = 0,78). Ugotovili smo tudi, da dlaka vpliva na sintezo vitamina D v koži, saj so krave v obriti skupini v casu raziskave proizvedle znacilno vec vitamina D kljub nižjemu dnevnemu odmerku obsevanja (p = 0,002) (Slika 11). Slika 12: Odvisnost razlike v koncentraciji 25-hidroksivitamina D (25(OH)D) med 1. in 4. vzorcenjem ter deležem crne kože na mestu obsevanja Slika ponazarja linearno odvisnost razlike v koncentraciji 25-hidroksivitamina D (25(OH)D) med prvim in cetrtim vzorcenjem ter deležem crne kože na mestu obsevanja. Crne pike predstavljajo posamezne krave, modra crta pa trend. Z modelom lahko pojasnimo 53 % variabilnosti (R2 = 0,53). Figure 12: Correlation of the difference in 25-hydroxyvitamin D (25(OH)D) concentration between 1st and 4th sampling and percent of black skin at the irradiation area The figure shows the linear correlation of the difference in 25-hydroxyvitamin D (25(OH)D) concentration between 1st and 4th sampling and percent of black skin at the irradiation area. The black dots represent individual cows and the blue line the trend. The model explains 53 % of the variability (R2=0,53). 4.3.1 Hemogram in biokemija Pri krvnih parametrih nismo ugotovili znacilnih razlik med skupinami, ki bi jih lahko povezali z UV obsevanjem. Tudi nihanja med vzorcenji so bila podobna med skupinami in jih ne moramo prepisati obsevanju. Tabele z opisno statistiko posameznih krvnih in biokemijskih parametrov so v prilogi. Pri nekaterih kravah so vrednosti pri nekaj vzorcenjih pri posameznih vrednostih odstopale od referencnih vrednosti. 4.3.2 Ocena kondicije Pri oceni kondicije med skupinami ali med vzorcenji nismo opazili znacilnih razlik (Tabela 7). Tabela 7: Opisna statistika ocene telesne kondicije ter p-vrednosti razlik med skupinami in med vzorcenji pri posamezni skupini Table 7: Descriptive statistics of body condition scoring and p-values of the differences between groups and samplings within groups Obrite Odlakane Kontrola p-vrednost 0 dni 2,9 ± 0,1 2,9 ± 0,1 2,9 ± 0,1 1 7 dni 2,9 ± 0,1 2,7 ± 0,1 2,7 ± 0,1 1 30 dni 2,8 ± 0,1 2,7 ± 0,1 2,6 ± 0,1 1 60 dni 2,9 ± 0,1 2,6 ± 0,1 2,7 ± 0,1 0,48 p-vrednost 0,61 0,59 0,2 4.3.3 Dolžina dlake V odlakani skupini se je dlaka v casu raziskave v povprecju skrajšala za 8,4 ± 1,2 milimetra (Tabela 8) in je bila znacilno razlicno dolga v primerjavi z dlako na zacetku poskusa (p = 0,000014). Tabela 8: Sprememba dolžine dlake v odlakani skupini Table 8: Change in hair length in the haired group Krava Dolžina dlake Dolžina dlake Razlika A 17 10 7 B 22 9 13 C 23 19 4 D 11 12 –1 E 26 11 15 F 21 14 7 G 18 11 7 H 16 6 10 I 20 15 5 J 21 8 13 K 22 10 12 L 23 9 14 M 16 12 4 N 28 21 7 Povprecje 20,3 12 8,4 4.3.4. Prireja mleka Prireja mleka na podlagi mlecnih kontrol se med skupinami ni znacilno razlikovala. Ko smo primerjali podatke, zbrane s strani molznega robota, smo ugotovili znacilne razlike. Povprecna prireja na dan se je med skupinami razlikovala (p = 2,961 x 10–10). Odlakana skupina in obrita skupina sta proizvedli znacilno vec mleka kot kontrolna skupina (p = 1,2 x 10-6 oz. p = 1,6 x 10-9) (Tabela 9). Razlika med obrito in odlakano skupino ni bila znacilna (p = 0,79). Kolicina proizvedenega mleka je bila odvisna od casa in od skupine (p < 0,000); ko smo podatke razdelili po skupinah, smo znacilno povezavo (p=0,0024) ugotovili le pri kontrolni skupini, v kateri se je prireja mleka zmanjševala skozi celotni cas raziskave (Slika 13). Tabela 9: Prireja mleka po skupinah Table 9: Milk yield by group Mleko (kg) Obrita Odlakana Kontrola Kontrola 11. 3. 2022 26,5 28,6 28,3 Kontrola 8. 4. 2022 26,9 27,6 28 Kontrola 13. 5. 2022 28 29,9 26,7 Povprecna prireja na dan* 28,7 ± 2,7 29,4 ± 2,1 26,5 ± 1,8 Opomba: *Podatki iz molznega robota. Comment: * Data from the milking robot Slika 13: Prireja mleka v odvisnosti od casa pri kravah, vkljucenih v raziskavo Slika ponazarja povprecno prirejo mleka po skupinah (obrita (oranžna), odlakana (zelena) in kontrolna (modra)) na dan raziskave (0–60 dni). Podatke o prireji je spremljal molzni robot. Obrita in odlakana skupina sta proizvajali znacilno vec mleka proti koncu raziskave. Pri kontrolni skupini se je proizvodnja mleka s casom raziskave zmanjševala. Figure 13: Milk yield in relation to time in cows enrolled in the study The figure shows the average daily milk yield per group (shaven (orange), haired (green), control (blue)) during the study (0-60 days). The milk yield data was recorded by the milking robot. The shaven and haired groups produced significantly more milk towards the end of the study. The milk yield in the control group was dropping as the study went on. 5 RAZPRAVA 5.1 DOLOCANJE MED Vrednost MED pri govedu je slabo raziskana. V literaturi obstaja le ena raziskava, v kateri so dolocili vrednost MED goveda pri 100 J/m2, a podatki o valovnih dolžinah UV svetlobe, ki so jo uporabili pri poskusu, niso natancno opisali (Mehlhorn in Steiger, 1975). V naši raziskavi smo ugotovili, da je vrednost MED bele kože pri kravah crno-bele pasme višja od odmerka 100 J/m2, ki ga kot MED krav navajajo v literaturi. V raziskavi, ki sta jo opravila Mehlhorn in Steiger, tudi ni navedeno, kakšno UV obtežitev za povzrocitev rdecine sta uporabila. V naši raziskavi smo uporabili UV LED luc ozkega spektra z vrhom obsevalne moci pri 292 nm. MED smo izracunali z uporabo obtežitve za povzrocitev rdecine, ki je bila sprejeta s strani Mednarodne komisije za osvetlitev (CIE) za ljudi. Vrednosti MED na obriti in odlakani beli koži, ki smo ju ugotovili, se ujemata tudi s podatki drugih raziskav, v katerih so uporabili odmerek 176 J/m2 (Morrow in sod., 2001) na obriti koži in odmerek 2400 J/m2 (Jakobsen in sod., 2015; Hymřller in sod., 2017) na odlakani koži, pri cemer niso ugotovili rdecine obsevane kože pri kravah. V našem poskusu je bila le ena krava z dlako dolžine 4 milimetre, ki je imela vrednost MED na odlakani koži nižjo od 1500 J/m2 in bi lahko proizvedla rdecino na odlakani koži pri obsevanju z odmerkom iz omenjenih raziskav. Odmerek soncnega sevanja, ki ga prejmemo na zemljini površini, je odvisen od geografske širine, letnega casa, ure v dnevu, nadmorske višine, oblacnosti, onesnaženja zraka in debeline ozonskega plašca (Lerche in sod., 2017). Ugotovljeni odmerki za povzrocitev rdecine v naši raziskavi so lahko poleti na geografski širini Slovenije preseženi (4900–6120 J/m2) (Reuder in Koepke, 2005; Rieder in sod., 2008; Bilbao in de Migue, 2020). To še dodatno potrjuje priporocilo, da morajo imeti živali na pašniku senco, kamor se lahko umaknejo pred soncnim sevanjem, sicer lahko pride do soncnih opeklin. Slednjim so dodatno podvrženi obrita koža in mesta s slabšim odlakanjem, kot so smrcek, vime, vulva in koža okoli oci. Odmerek 300 J/m2 je presežen v pol ure pri UV indeksu 6. Dejstvo je, da smo v naši raziskavi MED dolocali pri kravah, ki so bile celo življenje rejene v hlevih brez stika z neposrednim soncnim UV sevanjem, kar pomeni, da so bile brez kakršne koli zašcitne prilagoditve na UV sevanje. Ker krave, ki se pasejo, zacnejo pašo spomladi, ko UV sevanje še ni tako mocno, se lahko koža postopno zadebeli in s tem krave zašciti pred višjimi odmerki UV sevanja in opeklinami. Cez dan krave tudi spreminjajo svoj položaj glede na sonce, kar pomeni, da celokupnemu dnevnemu soncnemu UV odmerku ne izpostavljajo zgolj ene površine. Vrednost MED, ki smo jo izmerili na obriti koži, je vecja od vrednosti, ki jo v literaturi navajajo za prašice (165 J/m2), in manjša od odmerka pri konjih (450 J/m2) (Schmalwieser in sod., 2018). Pri ljudeh je vrednost MED odvisna od pigmentacije (Fitzpatrick, 1988). Bela podrocja kože pri kravah crno-bele pasme so posledica pomanjkanja melanocitov na teh podrocjih. To obarvanje imenujemo »piebald« in nastane zaradi motene migracije melanocitov na ta podrocja med fetalnim razvojem (Schmutz, 2012; Jivanji in sod., 2019). Ker je melanin eden glavnih dejavnikov zašcite pred UV sevanjem v koži, so ta mesta bolj obcutljiva za UV poškodbe (Meredith in Sarna, 2006). Jasen kazalnik omenjenega sta fotosenzibilizacija in plošcatocelicni karcinom, ki se pri govedu pojavljata predvsem na nepigmentirani koži (Anderson, 1991; Pausch in sod., 2012; Hussain in sod., 2018). UV zašcito koži nudijo tudi drugi dejavniki, kot so antioksidanti (karoteni, selen, vitamina E in C ter polifenoli), ki tudi vplivajo na MED (Sies in Stahl, 2004). UV svetloba povzroci poškodbe v koži s tvorbo kisikovih radikalov v celicah, poškodbe v celicah pa vodijo v vnetni odgovor, ki ga lahko s prostim ocesom zaznamo kot rdecino. Ker antioksidanti nevtralizirajo kisikove radikale, zvišajo potreben odmerek UV sevanja za povzrocitev vidne rdecine na koži (Sies in Stahl, 2004), s cimer bi lahko pojasnili razliko v vrednostih MED med ljudmi, prašici in kravami, ki imajo približno enako debelo povrhnjico kože (Netzlaff in sod., 2006). Dlaka je pomemben dejavnik zašcite pred UV sevanjem. Gostota dlake je vecja pri telicah, saj je število dlacnih foliklov doloceno ob rojstvu, a se ti razporedijo cez vecjo površino pri kravah, ki so vecje (Lyne in Heideman, 1959; Bianca in sod., 1974). V naši raziskavi smo ugotovili pozitivno povezanost med dolžino dlake in MED. UV prepustnost bele dlake je bila pri naših živalih 2,5–20 %, v povprecju 6,7 %, kar se ujema z izsledki predhodnih raziskav (Bianca in Wegmann, 1974). Oba dejavnika lahko pojasnita, zakaj smo pri telicah ugotovili višjo vrednost MED na odlakani koži. Gostota dlake se razlikuje med razlicnimi podrocji telesa, najbolj gosta je na plecih. Dolžina dlake se spreminja z letnimi casi in je najvecja pozimi (Bianca in sod., 1974; Udo, 1978). Spremembo v dolžini dlake (v povprecju za 8,4 milimetrov) smo ugotovili tudi v naši raziskavi, in sicer z merjenjem dolžine dlake marca in maja. Zato je lahko dejanska vrednost MED na odlakani koži pri govedu na razlicnih delih telesa in ob razlicnih letnih casih razlicna. Pri ljudeh za varno UV obsevanje za pokritje dnevnih potreb po vitaminu D3 velja Holickovo pravilo, ki priporoca, da se dnevno izpostavimo cetrtini svoje vrednosti MED na cetrtino svoje telesne površine (Dowdy in sod., 2010). V drugem delu naše raziskave smo zato želeli ugotoviti, ali to velja tudi pri kravah. Na smiselnost predloga nakazujejo tudi izsledki nekaterih raziskav. V raziskavi, v kateri so krave obsevali od zadaj in po hrbtu z odmerkom 1200 J/m2 (približno cetrtina našega MED na odlakani koži), so ugotovili, da je odmerek zadostoval za dvig ravni 25(OH)D nad raven zadovoljivosti (> 30 ng/mL 25(OH)D). V raziskavo so vkljucili 16 krav crno-bele pasme, ki so jih razdelili v štiri skupine. Vsaka skupina je prejemala razlicen odmerek. Za obsevanje so uporabili UV luc, ki je posnemala valovne dolžine UV sevanja sonca. 25(OH)D3 so dolocali z metodo tekocinske kromatografije, sklopljene s tandemsko masno spektrometrijo (Jakobsen in sod., 2015). V drugi raziskavi so ugotovili, da je 90-minutno dnevno izpostavljanje naravnemu sevanju na paši z odmerkom 1800 J/m2 (približno tretjina našega MED na odlakani koži) povsem dovolj za vzdrževanje ravni vitamina D v krvi krav crno-bele pasme. Dvajset krav so razdelili v 5 skupin in jim odmerili cas paše (15–300 minut), razporejen okoli zenita. Vrednost 25(OH)D3 so dolocali z metodo visokozmogljive tekocinske kromatografije (Hymřller in Jensen, 2012). V naši raziskavi smo uporabili UVB luc ozkega spektra, kar bi lahko vplivalo na vrednost MED na odlakani koži, ker sevanja višjih valovnih dolžin bolje prehajajo dlako (de Gálvez in sod., 2015). Zato bi morda ugotovili nižje MED na odlakani koži pri uporabi višjih valovnih dolžin, a smo pri uporabi višjih valovnih dolžin ponovno omejeni, saj imajo daljše valovne dolžine slabšo sposobnost povzrocitve rdecine (ISO 17166:1999). Za valovno dolžino približno 295 nm smo se odlocili zaradi optimalne proizvodnje vitamina D3 pri tej valovni dolžini (MacLaughlin in sod., 1982). Za nadaljnje raziskave MED pri govedu tako predlagamo tudi meritev gostote dlake na mestu obsevanja in obsevanje na razlicnih delih telesa. Tudi s krajšimi intervali med odmerki bi lahko vrednost MED dolocili bistveno bolj natancno, kot smo ga. V raziskavi smo posplošili, da je pri kravah ucinkovitost razlicnih valovnih dolžin za povzrocitev rdecine enaka kot pri ljudeh, kar pa ne velja nujno. Za bolj objektivno oceno rdecine priporocamo uporabo spektrofotometra. V naši raziskavi smo potrebovali le okvirne vrednosti MED na dorzalnem delu živali, in sicer zaradi drugega dela raziskave. Zato smo se odlocili za vizualno oceno rdecine. 5.2 SPOSOBNOST SINTEZE VITAMINA D V KOŽI POD VPLIVOM OBSEVANJA MED ROBOTSKO MOLŽO 5.2.1 Vitamin D Kontrolna skupina je imela na zacetku raziskave najvišje koncentracije 25(OH)D (Tabela 5). Koncentracija slednjega se je pri tej skupini nepricakovano povecala tudi med prvim in drugim vzorcenjem. Tudi pri obsevanih skupinah smo v tem casu opazili vecje povecanje vrednosti 25(OH)D kot pri nadaljnjih vzorcenjih. Ker smo raziskavo izvajali spomladi, ko se kolicina dnevnega soncnega obsevanja povecuje, bi lahko krave preko odbojev dobile tudi nekaj naravnega UV sevanja. Vendar se nespecificno povecevanje koncentracij 25(OH)D pri nadaljnjih vzorcenjih ni nadaljevalo, kar bi pricakovali, ce bi bil to razlog povecanja. Možno je, da je povecanje posledica nihanja vsebnosti vitamina D v obroku, kar bi lahko potrdili z vzorcenjem obroka pri drugem vzorcenju, ki ga v protokolu raziskave nismo predvideli. Zato smo za primerjavo 25(OH)D med skupinami namesto koncentracije 25(OH)D pri posameznem vzorcenju uporabili razlike med prvim vzorcenjem in ostalimi vzorcenji, Krave v obriti skupini so proizvedle najvec 25(OH)D. Sledile so odlakane krave, medtem ko je kontrolna skupina ostala na približno enaki ravni, razen povecanja koncentracij med prvim in drugim vzorcenjem (Slika 11). Pri vseh kravah v obriti skupini se je raven 25(OH)D skozi vsa vzorcenja povecevala. Na zacetku raziskave je imelo nekaj krav koncentracije vitamina D < 10 ng/mL, kar velja za hudo pomanjkanje. Med raziskavo je vecina z UV obsevanih krav (22/30) presegla mejo 20 ng/mL 25(OH)D v krvi, ki velja za spodnjo kriticno mejo pomanjkljive oskrbljenosti, le ena pa je presegla mejo 30 ng/mL 25(OH)D, kar pri kravah velja za zadovoljivo vsebnost (Nelson in sod., 2016b). Nobena krava ni dosegla vrednosti nad 40 ng/mL, ki jih Nelson in Marriman predlagata kot optimalne (2014). S Slike 11 je razvidno, da se je raven 25(OH)D ob koncu raziskave še povecevala, torej bi lahko s casom vse krave presegle zadovoljive koncentracije in morda tudi optimalne. Pri odlakanih kravah bi lahko uporabili višji dnevni odmerek obsevanja, ne da bi tvegali rdecino (opeklino). To bi lahko dosegli z uporabo mocnejše UV luci ali z daljšim casom obsevanja. Molža je pri odlakanih kravah v naši raziskavi trajala v povprecju 17 minut in 33 sekund, kar je nekoliko manj kot v ameriški raziskavi (19 minut 54 sekund) (Tremblay in sod., 2016). V dveh minutah in 21 sekundah bi naša luc proizvedla dodatnih 28,8 J/m2 na dan, kar je vec kot tretjina dnevnega odmerka, uporabljenega pri obritih kravah. Maksimalno dnevno kožno sintezo vitamina D3 pri odlakanih kravah (1 ng/mL/dan) so v raziskavi ugotovili pri odmerku 1800 J/m2, pri cemer so krave obsevali z UV lucjo širokega valovnega spektra po hrbtu in od zadaj, kar je vecja površina kot površina v naši raziskavi (Hymřller in sod., 2017). To vrednost bi lahko po podatkih iz literature najverjetneje presegli, saj je kožna sinteza vitamina D optimalna pri uporabi nižjih valovnih dolžin (Kalajian in sod., 2017). Proizvodnja vitamina D je pozitivno odvisna tudi od obsevane površine, kar pomeni, da bi lahko dosegli višjo proizvodnjo, ce bi obsevali celotno kožno površino (Hymřller in Jensen, 2010a). V naši raziskavi smo ugotovili pozitivno povezanost med dnevnim odmerkom sevanja in proizvedenim vitaminom D, kar je presenetljivo, saj povezave med koncentracijo vitamina D v obroku in koncentracijo 25(OH)D v krvi ne ugotavljamo vedno. Raven vitamina D je odvisna od števila dni po telitvi, saj imajo krave manj kot 30 dni po telitvi manjše koncentracije vitamina D kot krave v poznejših stadijih laktacije. Razlog je morda manjši vnos vitamina D v obdobju presušitve, pa tudi povecane potrebe po vitaminu D in spremembe v dostopnosti VDBP (Nelson in sod., 2016a). Po tem lahko sklepamo, da je koncentracija 25(OH)D odvisna tudi od drugih dejavnikov, kot je dejanski vnos vitamina D pri posamezni kravi, ki se lahko razlikuje od vnosa, izracunanega iz obroka. 5.3 VPLIV DLAKE IN BARVE DLAKE OZ. KOŽE NA SINTEZO VITAMINA D V KOŽI Krave proizvajajo vitamin D s celotno površino kože, ne samo na slabo odlakanih mestih (Hymřller in Jensen, 2010a), ceprav dlaka zavira prehajanje UV sevanja (de Gálvez in sod., 2015). V naši raziskavi so najvec 25(OH)D proizvedle obrite krave in tudi pri ovcah so ugotovili, da obrite ovce proizvedejo vec vitamina D (Quarterman in sod., 1964; Hidiroglou in Karpinski, 1989). V prvem delu raziskave smo ugotovili, da dlaka slabo prepušca UV svetlobo, kar je zaviralo prehod UV svetlobe potrebne za proizvodnjo vitamina D v odlakani skupini, ki je kljub skoraj trikrat vecjemu odmerku v povprecju proizvedla manj vitamina D. Pri obriti skupini je bila razlika v vsebnosti vitamina D v krvi med prvim in cetrtim vzorcenjem negativno povezana z deležem crne kože na mestu obsevanja (p = 0,009). Kot smo ugotovili v prvem delu raziskave, dlaka slabo prepušca UV svetlobo. Razlicna dolžina dlake med kravami je najverjetneje botrovala dejstvu, da te povezave nismo ugotovili pri odlakanih kravah. Tudi v drugih raziskavah niso ugotovili vpliva barve dlake na proizvodnjo vitamina D (Hymřller in Jensen, 2012; Jakobsen in sod., 2015; Hymřller in sod., 2017), a je znano, da je koncentracija 25(OH)D manjša pri alpakah s temnejšo volno (Judson in sod., 2008) in tudi pri teletih v Afriki s temnejšo dlako (Callaby in sod., 2020). Razlaga, zakaj so v slednjih raziskavah ugotovili omenjeno povezavo, bi lahko bila v bolj izenaceni dolžini dlake pri alpakah in teletih ter drugih vplivih na koncentracijo 25 (OH)D pri kravah v laktaciji (razlika v prireji mleka, koliko dni so v laktaciji itd.). V raziskavo na teletih so vkljucili teleta druge pasme in podvrste (Bos indicus), ki imajo drugacno barvo kože kot teleta crno-bele pasme in torej morda drugacne prilagoditve na UV sevanje. 5.3.1 Hemogram in biokemija Posebno pozornost smo namenili dejstvu, da bi med obsevanjem lahko prišlo do fotosenzibilizacije ali tvorbe hepatotoksicnih snovi, kar s preiskavami krvi v raziskavi nismo zaznali. Ker klinicno in na podlagi vrednosti hemograma in biokemije nismo zaznali nobenega vnetja ali hepatotoksicnosti, lahko sklepamo, da naše obsevanje vsaj kratkorocno živalim ni škodovalo. Med raziskavo tudi nismo zaznali nobenih sprememb v številu levkocitov, povezanih z rastjo koncentracije 25(OH)D v krvi, kar se ujema z raziskavo na kravah molznicah crno-bele pasme, pri katerih so raven vitamina D povecali z nadomešcanjem vitamina D v krmi, z izpostavitvijo soncnemu sevanju ali s kombinacijo obojega (Yue in sod., 2018), in z raziskavo, v kateri so kravam v krmo dodajali vitamin D3 ali 25(OH)D v razlicnih koncentracijah (Poindexter in sod., 2020). V prvi raziskavi tudi niso zaznali povišanja levkocitov pri kravah, ki so bile izpostavljene soncu, v primerjavi z neobsevanimi skupinami. V raziskavi, ki so jo opravili na bikih, pa so ugotovili, da lahko vitamin D ugodno vpliva na raven hemoglobina in raven hematokrita (z vplivom na maturacijo in proliferacijo eritrocitov ter sintezo eritropoetina) ter negativno na število levkocitov (protivnetni ucinek vitamina D), a so v raziskavi uporabili zelo visoke odmerke vitamina D (Keywanloo in sod., 2021). 5.3.2 Prireja mleka V naši raziskavi nismo ugotovili znacilnih razlik v prireji mleka z uporabo podatkov iz mlecnih kontrol. Analiza dnevno zbranih podatkov iz molznega robota je pokazala znacilne razlike med vsemi tremi skupinami. Krave v obsevanih skupinah so lahko vzdrževale koncentracijo vitamina D med celotno raziskavo, medtem ko smo le v kontrolni skupini ugotovili negativno povezanost med trajanjem raziskave in prirejo mleka. Prav tako pri nobenem vzorcenju nismo ugotovili povezanosti med ravnijo vitamina D in kumulativno dnevno prirejo mleka. V casu raziskave smo iz obeh obsevanih skupin izlocili tri krave, kar je morda tudi delno vplivalo na razliko. Krave so bile pomolžene veckrat na dan, kar je lahko vplivalo na prirejo v 24 urah, ce so se posamezne krave kakšen dan molzle veckrat kot obicajno. To je razvidno iz opaznih nihanj v proizvodnji mleka med zaporednimi dnevi (Slika 13). V nekaterih raziskavah niso ugotovili povezave med nadomešcanjem vitamina D ali 25(OH)D in proizvodnjo mleka. V eni od raziskav so uporabili 60 krav molznic crno-bele pasme, ki so jim dodajali vitamin D3 in ali 25(OH)D3 v razlicnih kombinacijah pred telitvijo in po njej (Guo in sod., 2018), v drugi raziskavi pa so 20 kravam molznicam crne-bele pasme v krvi dvignili raven 25(OH)D s 13,5 na 28–46,1 ng/mL v 29 dneh. Vitamin D so dodajali z dodajanjem vitamina D2 in/ali vitamina D3 v krmo, z izpostavljanjem soncu na paši 6,5 ure dnevno ter z dodajanjem vitamina D2 v krmo in s pašo (6,5 ure) (Yue in sod., 2018). V tretji raziskavi so kravam (n = 1182) dodajali samo 25(OH)D3 od 21 dni pred telitvijo do konca laktacije (Golder in sod., 2021), medtem ko so v drugih raziskavah ugotovili, da krave, ki so dobile nadomestek vitamina D (40000 IE vitamina D2 na dan) oz. so imele vec 25(OH)D v krvi, proizvedejo vec mleka (National Research Council, 2001; Martinez in sod., 2018). V slednjo raziskavo so vkljucili 79 krav crno-bele pasme, ki so jim 21 dni pred telitvijo v kombinaciji z anionskimi solmi dodajali vitamin D3 oz. 25(OH)D3. Za dolocitev odlocujocega dejavnika v naši raziskavi bodo potrebne nadaljnje raziskave in tudi bolj natancno spremljanje razlicnih dejavnikov, ki lahko vplivajo na prirejo mleka (dnevni vnos krme, pojavnost mastitisa, dnevi po telitvi) v povezavi z vitaminom D, ki bi ga morali meriti bolj pogosto. 6 SKLEPI 1) Vrednost MED krav molznic crno-bele pasme, izpostavljenih UVB valovne dolžine 280–315 nm, na mestih belega obarvanja ne presega enkratnega odmerka 10.000 J/m2, a je še vedno nekajkrat višja od odmerka, ki ga navajajo v literaturi (100 J/m2) (Mehlhorn in Steiger, 1975). 2) Obsevanje uporabljene intenzivnosti z UVB ozkega spektra valovnih dolžin, omejeno na cas robotske molže, ki ne presega vrednosti MED krav, pri trajno uhlevljenih kravah molznicah crno-bele pasme ni zadostovalo za vzdrževanje fizioloških koncentracij vitamina D. 3) Dolžina dlake pomembno vpliva na sintezo vitamina D v koži, saj so obrite krave proizvedle znacilno vec 25(OH)D kljub nižjemu prejetemu odmerku UVB sevanja. 4) Delež crno obarvane kože vpliva na sintezo 25(OH)D pri obritih kravah, saj je bil delež crne kože negativno povezan s koncentracijo 25(OH)D v krvi. 5) Povezanosti med deležem crne dlake na mestu obsevanja in proizvodnjo 25(OH)D nismo ugotovili. 7 POVZETEK Vitamin D je esencialni vitamin za govedo in tudi za ljudi. Njegovo vlogo v telesu povezujemo predvsem s presnovo kalcija in fosforja ter z vzdrževanjem homeostaze kosti, v novejših raziskavah pa tudi z delovanjem imunskega sistema. Krave molznice lahko vitamin D pridobivajo na dva nacina, in sicer s krmo in z lastno sintezo v koži pod vplivom UVB svetlobe. Ker vzreja vecine govedi poteka pretežno v pokritih hlevih brez neposrednega stika s soncnim UV sevanjem, je vnos odvisen od vitamina D v krmi, ki ni vedno najbolje izkoristljiv in ob cezmernem dajanju lahko povzroci intoksikacijo. Ker je sinteza vitamina D v koži natancno uravnavana, do intoksikacije ne more priti in je tako bolj naraven, varen in ucinkovit nacin nadomešcanja vitamina D. Pri tem se moramo zavedati, da so krave, tako kot ljudje, dovzetne za soncne opekline. V literaturi navedena vrednost minimalnega odmerka za povzrocitev rdecine pri govedu je 100 J/m2, a je to podrocje slabo raziskano, saj so v kasnejših raziskavah uporabili višje odmerke, ki pa na koži goveda niso povzrocili rdecine. V literaturi se pojavljajo razlicni nacini podajanja moci UV luci, ki so jih uporabljali v raziskavah, kar otežuje primerjavo izsledkov razlicnih raziskav. UV luci so v raziskavah že uporabljali za nadomešcanje vitamina D pri govedu, a so žal potekale na majhnem številu živali v ekspirimentalnih pogojih. Tudi cas obsevanja je bil relativno dolg in neprakticen za uporabo v komercialnih farmah. V naši raziskavi smo želeli dolociti minimalni odmerek za povzrocitev rdecine pri kravah crno-bele pasme na standardiziran nacin, ki omogoca primerjavo podatkov med razlicnimi raziskavami in opredeljuje varen odmerek UVB sevanja za nadomešcanje vitamina D pri kravah molznicah crno-bele pasme. Preizkusiti smo želeli tudi smotrnost uporabe nadomešcanja vitamina D z obsevanjem krav z UV lucjo ozkega spektra v komercialni reji z robotsko molžo ter ugotoviti vpliv dlake in barve kože oziroma dlake na mestu obsevanja na sintezo vitamina D v koži pri govedu. V prvi del raziskave smo vkljucili 21 krav in telic crno-bele pasme z dveh kmetij, ki smo jih obsevali s stopnjujocimi se odmerki UVB sevanja na 8 odlakanih in 8 obritih mestih z UVB lucjo ozkega spektra. Rezultate obsevanja smo odcitali po 24 urah. Ugotovili smo, da krave crno-bele pasme za povzrocitev rdecine na obriti beli koži potrebujejo v povprecju odmerek 329 J/m2, na odlakani koži pa odmerek 5595 J/m2. Slednji odmerek je bil pozitivno linearno odvisen od dolžine dlake, s cimer lahko pojasnimo, zakaj so telice z daljšo dlako za povzrocitev rdecine na odlakani koži potrebovale znacilno višji odmerek. V drugi del raziskave smo vkljucili 51 krav crno-bele pasme, ki smo jih na podlagi mlecnosti v predhodni laktaciji, dneva po telitvi in deleža crne dlake na hrbtu razdelili v tri skupine. Krave v prvi skupini smo obrili in obsevali z 80 J/m2, krave v drugi skupini smo obsevali z maksimalnim odmerkom, ki ga je dopušcala dnevna robotska molža, a ni presegala 360 J/m2, krave v tretji skupini pa so služile kot kontrolna skupina. Krave smo obsevali vsak dan v casu robotske molže s tocno dolocenim odmerkom glede na skupino. Proces zaznave krav in vklopa UV luci je bil avtomatiziran z racunalniškimi programi. V casu raziskave smo kravam štirikrat odvzeli kri – prvi dan ter 7 dni, 30 dni in 60 dni po zacetku obsevanja – ter dolocili vrednosti 25-hidroksivitamina D. Obrita skupina je proizvedla najvec 25(OH)D (13,37 ng/mL), sledila ji je odlakana skupina (9,96 ng/mL), kontrolna skupina pa je vrednosti 25(OH)D le vzdrževala po nespecificnem dvigu med prvim in drugim vzorcenjem (5,11 ng/mL). V casu raziskave na nobeni kravi nismo zaznali rdecine in krave niso kazale nobenih znakov nelagodja. Tudi z krvnimi preiskavami nismo zaznali vnetja. Ugotovili pa smo, da je nadomešcanje vitamina D z obsevanjem z UVB lucjo ozkega spektra v casu robotske molže mogoce, saj je vecina krav (22/30) presegla mejo 25-hidroksivitamina D, ki se smatra pomanjkanje, ena pa je presegla mejo 30 ng/mL, ki še velja za zadovoljivo raven vitamina D v krvi. Ugotovili smo tudi, da je kožna sinteza odvisna od barve kože in pokritosti z dlako na mestu obsevanja. Vpliva barve dlake na mestu obsevanja nismo potrdili. Obsevane krave v naši raziskavi so proizvedle znacilno vec mleka kot krave v kontrolni skupini, a vecje proizvodnje mleka nismo uspeli povezati z višjimi vrednostmi 25(OH)D v krvi. Naša raziskava je prva raziskava, v kateri smo dolocili minimalne odmerke za povzrocitev rdecine pri kravah molznicah crno-bele pasme na obriti in odlakani koži na standardiziran nacin, ki omogoca primerjavo odmerkov med razlicnimi raziskavami. Ugotovili smo pozitivno linearno odvisnost med minimalnim odmerkom za povzrocitev rdecine in dolžino bele dlake. Ker sta lahko ugotovljena odmerka za povzrocitev rdecine v krajih na zmernih geografskih širinah presežena, moramo za zagotovitev dobrobiti govedu na paši ponuditi zavetje, kamor se lahko umakne pred neposrednim soncnim sevanjem. V drugem delu raziskave smo kot prvi ugotovili, kako dlaka in barva kože vplivata na sintezo vitamina D v koži krav crno-bele pasme, saj so obrite krave proizvedle najvec vitamina D, proizvodnja pa je bila odvisna od deleža crne kože na mestu obsevanja. Vpliva barve dlake nismo ugotovili, kar se ujema z rezultati drugih raziskav. S tem smo ponudili nov nacin nadomešcanja vitamina D, ki nima kratkorocnih škodljivih ucinkov na zdravje krav in ne moti dnevne rutine komercialnih farm. 8 SUMMARY Vitamin D is an essential vitamin for cattle as well as for humans. Its role in the body is most commonly associated with the metabolism of calcium and phosphorus and control of bone homeostasis. Newer studies, connect it to the workings of the immune system. Dairy cows can get vitamin D in two ways. Through consumption in feed or self-synthesis in skin under the influence of UVB light. Because most cattle are raised in sheltered stalls without access to direct UV irradiation from the sun, they are completely reliant on the vitamin D in feed, which is not always the most utilisable and can cause intoxication with over supplementation. Because cutaneous vitamin D synthesis is strictly regulated, intoxication is impossible and represents a more natural, safe and efficient way of supplementing vitamin D. However, we need to acknowledge that cattle like humans are susceptible to sunburn. In the literature the minimal erythema dose for cattle was 100 J/m2. However, this field is poorly researched as newer studies used higher doses with no erythema on the skin of cattle. In the literature the power of UV lights used in studies is given in different ways, which makes the comparison of studies difficult. UV lamps have already been used for vitamin D supplementation in past studies; however, the studies used relatively few animals and they were done in experimental settings. Additionally, time of irradiation was relatively long and impractical for use in a commercial farm. The goal of our study was to determine the minimal erythema dose for Holstein Friesian cattle in a standardised way, which would allow comparison of data from different studies and also to determine the safe UVB dose for vitamin D supplementation in Holstein Friesian cattle. We also wanted to assess the usefulness of vitamin D supplementation with a narrow-band UV light in a commercial farm with automated milking and determine the effect of hair and colour of skin or hair at the irradiation area on cutaneous vitamin D production in cattle. In the first part of our study, we have included 21 cows and heifers of the Holstein Friesen breed from two farms, which we irradiated with increasing UVB doses on 8 haired and 8 shaven areas with a narrow-band UVB lamp. We assessed the results after 24 hours. We found that cows of the Holstein Friesen breed require on average 329 J/m2 for erythema production on shaven white skin and 5595 J/m2 on haired skin. The latter dose is positively linearly correlated with hair length, which also explains why heifers with longer hair required a significantly higher dose to produce erythema on haired skin. In the second part of our study, we enrolled 51 dairy cows of the Holstein Friesen breed, which we have divided into three groups based on milk yield in the previous lactation, days since calving and the percent of black fur on the back. The first group was shaven every two weeks and irradiated with 80 J/m2, the second group was irradiated with the maximum dose that daily robot milking time would allow but not exciding 360 J/m2, the third group served as a control group. The cows were irradiated each day during robot milking time with a specific dose dependent on the group. The process of cow identification and turning on of the light was automated with the help of computer software. During the study the cows were blood sampled four times on the first day, 7 days, 30 days and 60 days after the start of irradiation and the concentrations of 25-hydroxyvitamin D in the samples were determined. The shaven group produced the most 25(OH)D (13.37 ng/mL), followed by the haired group (9,96 ng/mL), the control group only maintained its 25(OH)D concentrations after the unspecific raise between the first and second sampling (5,11 ng/mL). During the study we didn’t detect any erythema on any of the cows and cows showed no signs of discomfort. We didn’t detect any inflammation also on the blood analysis. We found that vitamin D supplementation using a narrow-band UVB lamp limited to robot milking time is possible, as most cows (22/30) surpassed the threshold of 25-hydroxivitamin D concentrations that is considered as deficiency. One cow surpassed the threshold of 30 ng/mL, which is regarded as a sufficient concentration of vitamin D in blood. We also found that cutaneous vitamin D production is dependent on skin colour and hair cover at the area of irradiation. We did not find an influence of hair colour at the irradiation site. The irradiated cows in our study produced significantly more milk compared to the control group, however, we were unable to connect the higher milk yield to higher concentrations of 25(OH)D in the blood. This study is the first to determine the minimal erythema dose in Holstein Friesen dairy cattle on shaven and haired skin in a standardised way, which allows the comparison of doses between different studies. We also found a positive linear correlation between the minimal erythema dose on haired skin and hair length. Because the determined minimal erythema doses are easily exceeded at mild latitudes, it is important for welfare reasons that cattle on pasture have shelter where they can get out of direct sun irradiation. With the second part of our study, we were the first to find an effect of hair and skin colour on cutaneous vitamin D production in Holstein Friesen cattle, as shaven cows produced the most vitamin D and the production was dependent on the percentage of black skin at the irradiation area. We did not detect an effect of hair colour, which is in agreement with previous studies. With this we put forward a new way of vitamin D supplementation that has no short-term negative effects on the health of the cows and does not interfere with daily farm routine. 9 ZAHVALE Zahvalil bi se rad: - mentorju, prof. dr. Jožetu Staricu, ki mi je bil vedno pripravljen pomagati in je zame vedno našel cas;. - Vsem na Kliniki za prežvekovalce, ki so pomagali pri oblikovanju raziskave, vzorcenju na kmetiji, izvedbi laboratorijskih analiz in me spodbujali med izvedbo raziskave in pisanjem doktorskega dela; - dr. Marku Jankovcu ter Žigi in Jožetu Krušicu za izdelavo UV luci ter elektrotehnicno podporo; - zaposlenim na Inštitutu za varno hrano, krmo in okolje za izvedbo analize krme; - zaposlenim na KŽK d.o.o. za pomoc pri izvedbi prvega dela raziskave; - lastniku živali g. Gašperju Zabretu in njegovi družini, ki so nas vedno lepo sprejeli in pomagali pri izvedbi raziskave na kmetiji; - Kaji, Pici, Brigiti, Udbi, Cedri, Tari, Cimi, Maci, Krimi, Pisi, Kanji, Tunki, Heidi, Mrhi, Bojki, Cesti, Lajki, Rogli†, Bori†, Loti, Brezi, Bajni, Vitki, Jasni, Ceni, Celi, Resi, Bilki, Borzi, Ronki, Pšati†, Bandi†, Barki, Inki, Muri, Cevki, Komni, Banki, Polki, Elmi, Coli, Brini, Trenti, Jeri, Cajni, Cibi, Bosi, Celei, Cisti, Pivki, Bunki in Uni, ki so kooperativno sodelovale pri vzorcenju in britju ter pridno hodile na molžo; - dr. Janezu Jeretini s Kmetijskega inštituta Slovenije za zbiranje in posredovanje podatkov o molži; - Katarini Faganel za lektoriranje; - Društvu Podiplomskih študentov VF in podpornikom za nasvete in spodbujanje; - družini in prijateljem za brezpogojno ljubezen in podporo. 10 LITERATURA Abboud M, Rybchyn MS, Liu J, et al. The effect of parathyroid hormone on the uptake and retention of 25-hydroxyvitamin D in skeletal muscle cells. J Steroid Biochem Mol Biol 2017: 173; 173–9. Adalsteinsson S, Bjarnadottir S, Vage DI, Jonmundsson JV. Brown coat color in Icelandic cattle produced by the loci Extension and Agouti. J Hered 1995; 86(5): 395–8. Adams JS, Liu PT, Chun R, Modlin RL, Hewison M. Vitamin D in defense of the human immune response. Ann N Y Acad Sci 2007; 1117: 94–105. Anderson DE. Genetic study of eye cancer in cattle. J Hered 1991; 82(1): 21–6. Asgharpour P, Dezfouli MRM, Nadealian MG, Eftekhari Z, Borojeni GRN. Effects of 1, 25-dihydroxy vitamin D3 on clinical symptoms, pro-inflammatory and inflammatory cytokines in calves with experimental pneumonia. Res Vet Sci 2020; 132: 186–93. Aucella F, Scalzulli RP, Gatta G, Vigilante M, Carella AM, Stallone C. Calcitriol increases burst-forming unit-erythroid proliferation in chronic renal failure: a synergistic effect with r-HuEpo. Nephron Clin Pract 2003; 95(4): c121–7. Baxter LL, Hou L, Loftus SK, Pavan WJ. Spotlight on spotted mice: a review of white spotting mouse mutants and associated human pigmentation disorders. Pigment Cell Res 2004; 17(3): 215–24. Bianca W, Wegmann-Bosshardt H, Näf F. Untersuchungen an Rinderhaaren. J Anim Breed Genet 1974; 91(1|4): 217–31. Bianca W, Wegmann H. Die Durchlässigkeit von Rinderhaaren für ultraviolette Strahlung. Schweiz Arch Tierheilkd 1974; 116: 114–6. Bikle DD. The free hormone hypothesis: when, why, and how to measure the free hormone levels to assess vitamin D, thyroid, sex hormone, and cortisol status. JBMR plus 2020; 5(1): e10418 (10 str.) doi: 10.1002/jbm4.10418. Bikle DD, Siiteri PK, Ryzen E, Haddad JG. Serum protein binding of 1,25-dihydroxyvitamin D: a reevaluation by direct measurement of free metabolite levels. J Clin Endocrinol Metab 1985; 61(5): 969–75. Bilbao J, de Migue A. Erythemal solar irradiance, UVER, and UV index from ground-based data in central Spain. Appl Sci 2020; 10(18): e6589 (14 str.) doi: 10.3390/app10186589. Burchill SA, Thody AJ, Ito S. Melanocyte-stimulating hormone, tyrosinase activity and the regulation of eumelanogenesis and phaeomelanogenesis in the hair follicular melanocytes of the mouse. J Endocrinol 1986; 109 (1): 15–21. Callaby R, Hurst E, Handel I, Toye P, Bronsvoort BMC, Mellanby RJ. Determinants of vitamin D status in Kenyan calves. Sci Rep 2020; 10(1): e20590 (14 str.) doi: 10.1038/s41598-020-77209-5. Cashman KD, O’Sullivan SM, Galvin K, Ryan M. Contribution of Vitamin D 2 and D 3 and Their Respective 25-Hydroxy Metabolites to the Total Vitamin D Content of Beef and Lamb. Curr Dev Nutr 2020; 4(7): enzaa112(6 str.) doi: 10.1093/cdn/nzaa112. Celi P, Williams S, Engstrom M, McGrath J, La Marta J. Safety evaluation of dietary levels of 25-hydroxyvitamin D 3 in growing calves. Food Chem Toxicol 2018; 111: 641–9. CIE 174:2006. Action spectrum for the production of previtamin D3 in human skin. Dunaj: International Commission on Illumination, 2006: 16 str. CIE 209:2014. Rationalizing nomenclature for UV doses and effects on humans. Dunaj: International Commission on Illumination, 2014: 14 str. de Gálvez MV, Aguilera J, Bernabő JL, Sánchez-Roldán C, Herrera-Ceballos E. Human hair as a natural sun protection agent: a quantitative study. Photochem Photobiol 2015; 91(4): 966–70. de Gruijl FR. Action spectrum for photocarcinogenesis. Recent Results Cancer Res 1995; 139: 21–30. D’Mello SA, Finlay GJ, Baguley BC, Askarian-Amiri ME. Signaling pathways in melanogenesis. Int J Mol Sci 2016; 17(7): e1144 (18 str.) doi: 10.3390/ijms17071144. Dittmer K, Thompson K. Vitamin D Metabolism and Rickets in Domestic Animals: a review. Vet Pathol 2011; 48(2): 389–407. Dowdy JC, Sayre RM, Holick MF. Holick’s rule and vitamin D from sunlight. J Steroid Biochem Mol Biol 2010; 121(1|2): 328–30. Duffy SK, O’Doherty JV, Rajauria G, et al. Vitamin D-biofortified beef: a comparison of cholecalciferol with synthetic versus UVB-mushroom-derived ergosterol as feed source. Food Chem 2018; 256: 18–24. Dusso AS, Brown AJ, Slatopolsky E. Vitamin D. Am J Physiol Renal Physiol 2005; 289(1): F8–28. Eder K in Grundmann SM. Vitamin D in dairy cows: metabolism, status and functions in the immune system. Arch Anim Nutr 2022; 76(1): 1–33. el-Ghorr AA, Norval M. Biological effects of narrow-band (311 nm TL01) UVB irradiation: a review. J Photochem Photobiol B 1997; 38(2|3): 99–106. Fitzpatrick TB. The validity and practicality of sun-reactive skin types I through VI. AMA Arch Derm 1988; 124(6): 869–71. García-Borrón JC, Abdel-Malek Z, Jiménez-Cervantes C. MC1R, the cAMP pathway, and the response to solar UV: Extending the horizon beyond pigmentation. Pigment Cell Melanoma Res 2014; 27(5): 699–720. Golder HM, McGrath J, Lean IJ. Effect of 25-hydroxyvitamin D 3 during prepartum transition and lactation on production, reproduction, and health of lactating dairy cows. J Dairy Sci 2021; 104(5): 5345–74. Guo J, Jones AK, Givens DI, Lovegrove JA, Kliem KE. Effect of dietary vitamin D3 and 25-hydroxyvitamin D3 supplementation on plasma and milk 25-hydroxyvitamin D3 concentration in dairy cows. J Dairy Sci 2018; 101(4): 3545–53. Gutiérrez-Gil B, Wiener P, Williams JL. Genetic effects on coat colour in cattle: dilution of eumelanin and phaeomelanin pigments in an F2-Backcross Charolais × Holstein population. BMC Genet 2007; 8(1): e56 (12 str.) doi: 10.1186/1471-2156-8-56. Hanel A in Carlberg C. Skin colour and vitamin D: an update. Exp Dermatol 2020; 29(9): 864–75. Hayes BJ, Pryce J, Chamberlain AJ, Bowman PJ, Goddard ME. Genetic architecture of complex traits and accuracy of genomic prediction: coat colour, milk-fat percentage, and type in Holstein cattle as contrasting model traits. PLoS Genet 2010; 6(9): e1001139 (11 str.) doi: 10.1371/journal.pgen.1001139. Heaney RP, Dowell MS, Hale CA, Bendich A. Calcium absorption varies within the reference range for serum 25-hydroxyvitamin D. J Am Coll Nutr 2003; 22(2): 142–6. Heckman CJ, Chandler R, Kloss JD, et al. Minimal Erythema Dose (MED) testing. J Vis Exp 2013; 75: e50175 (5 str.) doi: 10.3791/50175. Heeney JL, Valli VE. Bovine ocular squamous cell carcinoma: an epidemiological perspective. Can J Comp Med 1985; 49(1): 21–6. Herrmann M, Farrell CL, Pusceddu I, Fabregat-Cabello N, Cavalier E. Assessment of Vitamin D status - a changing landscape. Clin Chem Lab Med 2017; 55(1): 3–26. Hidiroglou M, Karpinski K. Providing vitamin D to confined sheep by oral supplementation vs ultraviolet irradiation. J Anim Sci 1989: 67(3): 794–802. Holcombe SJ, Wisnieski L, Gandy J, Norby B, Sordillo LM. Reduced serum vitamin D concentrations in healthy early-lactation dairy cattle. J Dairy Sci 2018; 101(2): 1488–94. Holick MF. Environmental factors that influence the cutaneous production of vitamin D. Am J Clin Nutr 1995; 61(suppl 3): S638–45. Holick MF. Vitamin D Status: Measurement, Interpretation, and Clinical Application. Ann Epidemiol 2009; 19(2): 73–8. Holick MF, Maclaughlin JA, Clark MB, et al. Photosynthesis of previtamin D3 in human skin and the physiologic consequences. Science 1980; 210(4466): 203–5. Holick MF, MacLaughlin JA, Doppelt SH. Regulation of cutaneous previtamin D3 photosynthesis in man: skin pigment is not an essential regulator. Science 1981; 211(4482): 590–3. Horst RL, Goff JP, Reinhardt TA. Calcium and vitamin D metabolism during lactation. J Mammary Gland Biol Neoplasia 1997; 2(3): 253–63. Horst RL, Reinhardt TA, Russel JR, Napoli JL. The isolation and identification of vitamin D2 and vitamin D3 from Medicago sativa (alfalfa plant). Arch Biochem Biophys 1984; 231(1): 67–71. Hovinen M, Pyörälä S. Invited review: udder health of dairy cows in automatic milking. J Dairy Sci 2011; 94(2): 547–62. Hussain SM, Herling VR, Rodrigues PHM, Naz I, Khan H, Khan MT. Mini review on photosensitization by plants in grazing herbivores. Trop Anim Health Prod 2018; 50(5): 925–35. Hymřller L, Jensen SK. Vitamin D3 synthesis in the entire skin surface of dairy cows despite hair coverage. J Dairy Sci 2010(5); 93: 2025–9. Hymřller L, Jensen SK. Stability in the rumen and effect on plasma status of single oral doses of vitamin D and vitamin E in high-yielding dairy cows. J Dairy Sci 2010(12); 93: 5748–57. Hymřller L, Jensen SK. Vitamin D2 impairs utilization of vitamin D3 in high-yielding dairy cows in a cross-over supplementation regimen. J Dairy Sci 2011; 94(7): 3462–6. Hymřller L, Jensen SK. 25-Hydroxycholecalciferol status in plasma is linearly correlated to daily summer pasture time in cattle at 56°N. Br J Nutr 2012; 108(4): 666–71. Hymřller L, Jensen SK, Kaas P, Jakobsen J. Physiological limit of the daily endogenous cholecalciferol synthesis from UV light in cattle. J Anim Physiol Anim Nutr (Berl) 2017; 101(2): 215–21. Hymřller L, Jensen SK, Lindqvist H, Johansson B, Nielsen MO, Nadeau E. Supplementing dairy steers and organically managed dairy cows with synthetic vitamin D3 is unnecessary at pasture during exposure to summer sunlight. J Dairy Res 2009; 76(3): 372–8. IARC Monograhs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humas. Solar and ultraviolet radiation. Lyon: International Agency for Research on Cancer, 1992:1-284.(NO. 55). ISO 17166:1999. Erythema reference action spectrum and standard erythema dose. Dunaj:International Commission on Illumenattion, 1999: 12 str. Jacobs JA, Siegford JM. Invited review: the impact of automatic milking systems on dairy cow management, behavior, health, and welfare. J Dairy Sci 2012; 95(5): 2227–47. Jakobsen J, Jensen SK, Hymřller L, et al. Short communication: Artificial ultraviolet B light exposure increases vitamin D levels in cow plasma and milk. J Dairy Sci 2015; 98(9): 6492–8. Jäpelt RB, Didion T, Smedsgaard J, Jakobsen J. Seasonal variation of provitamin D 2 and vitamin D 2 in perennial ryegrass (Lolium perenne L.). J Agric Food Chem 2011; 59(20): 10907–12. Jäpelt RB, Jakobsen J. Vitamin D in plants: A review of occurrence, analysis, and biosynthesis. Front Plant Sci 2013: 4: e136 (20 str.) doi: 10.3389/fpls.2013.00136. Jivanji S, Worth G, Lopdell TJ, et al. Genome-wide association analysis reveals QTL and candidate mutations involved in white spotting in cattle. Genet Sel Evol 2019: 51(1): e62 (18 str.) doi: 10.1186/s12711-019-0506-2 John AJ, Clark CEF, Freeman MJ, Kerrisk KL, Garcia SC, Halachmi I. Review: milking robot utilization, a successful precision livestock farming evolution. Animal 2016; 10(9): 1484–92. Jones G, Prosser DE, Kaufmann M. Cytochrome P450-mediated metabolism of vitamin D. J Lipid Res 2014; 55(1): 13–31. Judson GJ, McGregor BA, Partington DL. Factors associated with low vitamin D status of Australian alpacas. Aust Vet J 2008; 86(12): 486–90. Kalajian TA, Aldoukhi A, Veronikis AJ, Persons K, Holick MF. Ultraviolet B light emitting diodes (LEDs) are more efficient and effective in producing vitamin D3 in human skin compared to natural sunlight. Sci Rep 2017; 7(1): e11489 (8 str.) doi: 10.1038/s41598-017-11362-2 Keywanloo M, Ahmadi-Hamedani M, Javan JA, Zabol RF. Effects of Parenteral Vitamin D3 Supplementation on Hematological Parameters of Healthy Holstein Bulls. Arch Razi Inst 2021; 76(5): 1509–17. King MTM, Pajor EA, LeBlanc SJ, DeVries TJ. Associations of herd-level housing, management, and lameness prevalence with productivity and cow behavior in herds with automated milking systems. J Dairy Sci 2016; 99(11): 9069–79. Kinney JP, Long CS, Geller AC. The ultraviolet index: a useful tool. Dermatol Online J 2000; 6(1): e2. doi: 10.5070/D35925w4hq Kohler M, Leiber F, Willems H, Merbold L, Liesegang A. Influence of altitude on vitamin D and bone metabolism of lactating sheep and goats. J Anim Sci 2013; 91(11): 5259–68. Kollias N, Sayre RM, Zeise L, Chedekel MR. New trends in photobiology: photoprotection by melanin. J Photochem Photobiol B Biol 1991; 9: 135–60. Kopecky KE, Pugh GW Jr, Hughes DE, Booth GD, Cheville NF. Biological effect of ultraviolet radiation on cattle: bovine ocular squamous cell carcinoma. Am J Vet Res 1979; 40(12): 1783–8. Krause R, Bühring M, Hopfenmüller W, Holick MF, Sharma AM. Ultraviolet B and blood pressure. Lancet 1998; 352(9129): 709–10. Lerche CM, Philipsen PA, Wulf HC. UVR: sun, lamps, pigmentation and Vitamin D. Photochem Photobiol Sci 2017; 16(3): 291–301. Lippolis JD, Reinhardt TA, Sacco RA, Nonnecke BJ, Nelson CD. Treatment of an intramammary bacterial infection with 25-hydroxyvitamin D 3. PLoS One 2011; 6(10): e25479 (7 str.) doi: 10.1371/journal.pone.0025479. Littledike ET, Horst RL. Problems with vitamin D injections for prevention of milk fever  [in dairy cows]: toxicity of large doses and increased incidence with small doses. Am Dairy Sci Assoc 1980; 63(1): 89. Liu L, Harris B, Keehan M, Zhang Y. Genome scan for the degree of white spotting in dairy cattle. Anim Genet 2009; 40(6): 975–7. Lyne AG, Heideman MJ. The pre-natal development of skin and hair in cattle (Bos taurous L.). Aust J Biol Sci 1959; 12(1): 72–95. MacLaughlin JA, Anderson RR, Holick MF. Spectral character of sunlight modulates photosynthesis of previtamin D3 and its photoisomers in human skin. Science 1982; 216(4549): 1001–3. Malabanan AO, Turner AK, Holick MF. Severe generalized bone pain and osteoporosis in a premenopausal black female: effect of vitamin D replacement. J Clin Densitom 1998; 1(2): 201–4. Maresca V, Flori E, Picardo M. Skin phototype: a new perspective. Pigment Cell Melanoma Res 2015; 28(4): 378–89. Margier M, Collet X, le May C, et al. ABCB1 (P-glycoprotein) regulates vitamin D absorption and contributes to its transintestinal efflux. FASEB J 2019; 33(2): 2084–94. Martinez N, Rodney RM, Block E, et al. Effects of prepartum dietary cation-anion difference and source of vitamin D in dairy cows: lactation performance and energy metabolism. J Dairy Sci 2018; 101(3): 2544–62. McKenzie RL, Lucas RM. Reassessing impacts of extended daily exposure to low level solar UV radiation. Sci Rep 2018; 8(1): e13805 (5 str.) doi: 10.1038/s41598-018-32056-3 Mehlhorn G in Steiger A. Künstliche UV-Strahlung in der Tierproduktion. Jene: Fischer, 1975:1-299. Mello JRB. Calcinosis - calcinogenic plants. Toxicon 2003; 41(1): 1–12. Meredith P, Sarna T. The physical and chemical properties of eumelanin. Pigment Cell Res 2006; 19(6): 572–94. Merriman KE, Kweh MF, Powell JL, Lippolis JD, Nelson CD. Multiple ß-defensin genes are upregulated by the vitamin D pathway in cattle. J Steroid Biochem Mol Biol 2015; 154: 120–9. Moreau E, Bächer S, Mery S, et al. Performance characteristics of the VIDAS® 25-OH Vitamin D Total assay - comparison with four immunoassays and two liquid chromatography-tandem mass spectrometry methods in a multicentric study. Clin Chem Lab Med 2016; 54(1): 45–53. Morrow CK, Colditz IG, Cope RB. Simulated solar UVB exposure inhibits transcutaneous immunization to cholera toxin via an irradiated skin site in cattle. Vet Immunol Immunopathol 2001; 83(1|2): 107–14. Mostafa WZ in Hegazy RA. Vitamin D and the skin: Focus on a complex relationship: a review. J Adv Res 2013; 6(6): 793–804. National Research Council. Nutrient requirements of dairy cattle. 7th ed. Washington: National Academy Press, 2001: 164-6. Nelson CD, Lippolis JD, Reinhardt TA, et al. Vitamin D status of dairy cattle: outcomes of current practices in the dairy industry. J Dairy Sci 2016; 99(12): 10150–60. Nelson CD, Merriman KE. Vitamin D metabolism in dairy cattle and implications for dietary requirements. In: 25th Annual Florida Ruminent Nutrition Symposium: proceedings. Geinesville: Institute of Food and Agricultural Sciences, 2014:78–90 Nelson CD, Powell JL, Price DM, et al. Assessment of serum 25-hydroxyvitamin D concentrations of beef cows and calves across seasons and geographical locations. J Anim Sci 2016; 94(9): 3958–65. Nelson CD, Reinhardt TA, Lippolis JD, Sacco RE, Nonnecke BJ. Vitamin D signaling in the bovine immune system: a model for understanding human vitamin D requirements. Nutrients 2012; 4(3): 181–96. Netzlaff F, Schaefer UF, Lehr CM, et al. Comparison of bovine udder skin with human and porcine skin in percutaneous permeation experiments. Altern Lab Anim 2006; 34(5): 499–513. Nonnecke BJ, McGill JL, Ridpath JF, Sacco RE, Lippolis JD, Reinhardt TA. Acute phase response elicited by experimental bovine diarrhea virus (BVDV) infection is associated with decreased vitamin D and E status of vitamin-replete preruminant calves. J Dairy Sci 2014; 97(9): 5566–79. Pausch H, Wang X, Jung S, et al. Identification of QTL for UV-protective eye area pigmentation in cattle by progeny phenotyping and genome-wide association analysis. PLoS One 2012; 7: e36346 (10 str.) doi: 10.1371/journal.pone.0036346 Pitkäranta J, Kurkela V, Huotari V, Posio M, Halbach CE. Designing automated milking dairy facilities to maximize labor efficiency. Vet Clin North Am Food Anim Pract 2019; 35(1): 175–93. Poindexter MB, Kweh MF, Zimpel R, et al. Feeding supplemental 25-hydroxyvitamin D3 increases serum mineral concentrations and alters mammary immunity of lactating dairy cows. J Dairy Sci 2020; 103(1): 805–22. Quarterman J, Dalgarno AC, Adam A. Some factors affecting the level of vitamin D in the blood of sheep. Br J Nutr 1964; 18: 79–89. Ramagopalan S V., Heger A, Berlanga AJ, et al. A ChIP-seq defined genome-wide map of vitamin D receptor binding: associations with disease and evolution. Genome Res 2010; 20(10): 1352–60. Reboul E. Intestinal absorption of vitamin D: From the meal to the enterocyte. Food Funct 2015; 6: 356–62. Reboul E, Goncalves A, Comera C, et al. Vitamin D intestinal absorption is not a simple passive diffusion: evidences for involvement of cholesterol transporters. Mol Nutr Food Res 2011; 55(5): 691–702. Reuder J in Koepke P. Reconstruction of UV radiation over Southern Germany for the past decades. Meteorol Zeitschrift 2005; 14(2): 237–46. Rieder HE, Holawe F, Simic S, et al. Reconstruction of erythemal UV-doses for two stations in Austria: a comparison between alpine and urban regions. Atmos Chem Phys 2008; 8: 6309–23. Rowe LD. Photosensitization problems in livestock. Vet Clin North Am Food Anim Pract 1989; 5(2): 301–23. Royo LJ, Alvarez I, Fernandez I, Arranz JJ, Gomez E, Goyache F. The coding sequence of the ASIP gene is identical in nine wild-type coloured cattle breeds. J Anim Breed Genet 2005; 122: 357–60. Rybchyn MS, Abboud M, Puglisi DA, et al. Skeletal muscle and the maintenance of vitamin D status. Nutrients 2020; 12(11): e3270 (11 str.) doi: 10.3390/nu12113270. Saager RB, Balu M, Crosignani V, et al. In vivo measurements of cutaneous melanin across spatial scales: using multiphoton microscopy and spatial frequency domain spectroscopy. J Biomed Opt 2015; 20(6): e066005 (11 str.) doi: 10.1117/1.JBO.20.6.066005. Sachdeva S. Fitzpatrick skin typing: applications in dermatology. Indian J Dermatol Venereol Leprol 2009; 75(1): 93–6. Saponaro F, Saba A, Zucchi R. An Update on vitamin D metabolism. Int J Mol Sci 2020; 21: e6573 (19 str.) doi: 10.3390/ijms21186573. Schmalwieser AW, Weihs P, Schauberger G. UV Effects on Living Organisms. In: Meyers R ed. Encyclopedia of sustainability science and technology. New York: Springer, 2018; 1–63. Schmutz S. Genetics of coat color in cattle. In: Womack JE ed. Bovine genomics. Hoboken: John Wiley & sons, 2012; 20–33. Siddiqui JA, Partridge NC. Physiological bone remodeling: systemic regulation and growth factor involvement. Physiology 2016; 31(3): 233–45. Sies H, Stahl W. Nutritional protection against skin damage from sunlight. Annu Rev Nutr 2004; 24: 173–200. Sorge US, Molitor T, Linn J, Gallaher D, Wells SW. Cow-level association between serum 25-hydroxyvitamin D concentration and Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis antibody seropositivity: a pilot study. J Dairy Sci 2013; 96: 1030–7. Spritz RA. The molecular basis of human piebaldism. Pigment Cell Res 1992; 5(5): 340–3. Stabel JR, Reinhardt TA, Hempel RJ. Short communication: vitamin D status and responses in dairy cows naturally infected with Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis. J Dairy Sci 2019; 102(2): 1594–600. Tomkins NW, Elliott R, McGrath JJ, et al. Managing plasma P concentrations in beef heifers with a slow release vitamin D supplementation. Anim Prod Sci 2020: 60(5): 610–17. Tremblay M, Hess JP, Christenson BM, et al. Factors associated with increased milk production for automatic milking systems. J Dairy Sci 2016; 99(5): 3824–37. Tsujita H in Plummer CE. Bovine Ocular Squamous Cell Carcinoma. Vet Clin North Am - Food Anim Pract 2010; 26(3): 511–29. Udo HMJ. Hair coat characteristics in Friesian heifers in the Netherlands and Kenya : Experimental data and a review of literature. Wageningen: H. Veenman & Zonen B.V, 1978. van Dijk A, den Outer P, van Kranen H, Slaper H. The action spectrum for vitamin D3: initial skin reaction and prolonged exposure. Photochem Photobiol Sci 2016; 15(7): 896–909. Ward G, Marion GB, Campbell CW, Dunham JR. Influences of calcium intake and vitamin D supplementation on reproductive performance of dairy cows. J Dairy Sci 1971; 54(2): 204–6. Weihs P, Schmalwieser AW, Schauberger G. UV Effects on living organisms. In: Laws EA ed. Environmental toxicology: selected entries from the encyclopedia of sustainability science and technology. New York: Springer, 2013: 609–88. Wilkens MR, Cohrs I, Lifschitz AL, Fraser DR, Olszewski K, Schroder B, Breves G. Is the metabolism of 25-hydroxyvitamin D3 age-dependent in dairy cows? J Steroid Biochem Mol Biol 2013; 136: 44–6. Yue Y, Hymřller L, Jensen SK, Lauridsen C. Effect of vitamin D treatments on plasma metabolism and immune parameters of healthy dairy cows. Arch Anim Nutr 2018; 72(3): 205–220. Zhou S, LeBoff MS, Glowacki J. Vitamin D metabolism and action in human bone marrow stromal cells. Endocrinology 2010; 151(1): 14–22. Ziv E, Bar-On H, Silver J. Vitamin D3 uptake by the isolated perfused rat liver from lipoprotein fractions is separate from cholesterol and triglyceride uptake. Eur J Clin Invest 1985; 15(2): 95–9. 11 PRILOGE 11.1 TABELE PARAMETROV HEMOGRAMA Tabela 1: Levkociti (povprecje ± SEM 103/mm3) 103/mm3 Obrite Odlakane Kontrola p-vrednost 0 dni 7,63 ± 0,4 8,41 ± 0,62 8,36 ± 0,54 1 7 dni 7,84 ± 0,59 7,31 ± 0,44 6,98 ± 0,34 1 30 dni 8,14 ± 0,42 7,757 ± 0,48 7,28 ± 0,32 0,86 60 dni 7,92 ± 0,41 8,4 ± 0,49 7,48 ± 0,34 1 p-vrednost 1 0,07 0,2 Tabela 2: Eritrociti (povprecje ± SEM 106/mm3) 106/mm3 Obrite Odlakane Kontrola p-vrednost 0 dni 6,78 ± 0,24 6,89 ± 0,21 6,77 ± 0,15 1 7 dni 6,37 ± 0,16 6,49 ± 0,17 6,49 ± 0,16 1 30 dni 6,42 ± 0,16 6,68 ± 0,21 6,49 ± 0,18 1 60 dni 6,66 ± 0,11 6,66 ± 0,18 6,52 ± 0,156 1 p-vrednost 0,23 0,2 0,29 Tabela 3: Hemoglobin (povprecje ± SEM g/dL) g/dL Obrite Odlakane Kontrola p-vrednost 0 dni 9,81 ± 0,36 9,9 ± 0,26 9,54 ± 0,17 1 7 dni 9,24 ± 0,23 9,31 ± 0,21 9,32 ± 0,17 1 30 dni 9,24 ± 0,19 9,3 ± 0,25 9,19 ± 0,18 1 60 dni 6,58 ± 0,22 9,33 ± 0,23 9,42 ± 0,14 1 p-vrednost 0,35 0,04 1 Tabela 4: Hematokrit (povprecje ± SEM %) % Obrite Odlakane Kontrola p-vrednost 0 dni 31,4 ± 1,22 31,79 ± 0,95 30,59 ± 0,57 1 7 dni 29,04 ± 0,77 29 ± 0,69 29,13 ± 0,62 1 30 dni 29,25 ± 0,62 29,33 ± 0,89 28,96 ± 0,65 1 60 dni 29,99 ± 0,76 28,77 ± 0,84 29,13 ± 0,52 0,75 p-vrednost 0,23 0,009 0,17 Tabela 5: Povprecna prostornina eritrocitov (povprecje ± SEM µm3) µm3 Obrite Odlakane Kontrola p-vrednost 0 dni 46,31 ± 0,87 46,29 ± 1,07 45,35 ± 0,84 1 7 dni 45,65 ± 0,85 44,81 ± 1,06 45 ± 0,76 1 30 dni 45,82 ± 0,92 44,14 ± 1,05 45,06 ± 0,85 1 60 dni 45,06 ± 0,91 43,36 ± 1,03 44,94 ± 0,85 1 p-vrednost 1 0,003 1 Tabela 6: Povprecna kolicina hemoglobina v eritrocitih (povprecje ± SEM pg) pg Obrite Odlakane Kontrola p-vrednost 0 dni 14,5 ± 0,25 14,45 ± 0,33 14,15 ± 0,28 1 7 dni 14,52 ± 0,26 14,43 ± 0,34 14,43 ± 0,27 1 30 dni 14,45 ± 0,31 14,01 ± 0,35 14,26 ± 0,27 1 60 dni 14,37 ± 0,26 14,06 ± 0,3 14,51 ± 0,27 1 p-vrednost 1 0,53 0,16 Tabela 7: Povprecna koncentracija hemoglobina v eritrocitih (povprecje ± SEM g/dL) g/dL Obrite Odlakane Kontrola p-vrednost 0 dni 31,31 ± 0,15 31,19 ± 0,17 31,21 ± 0,14 1 7 dni 31,84 ± 0,11 32,13 ± 0,19 32,03 ± 0,18 1 30 dni 31,56 ± 0,14 31,81 ± 0,15 31,77 ± 0,15 1 60 dni 31,93 ± 0,18 32,48 ± 0,18 32,36 ± 0,16 0,196 p-vrednost 0,036 0,00000025 0,000025 11.2 TABELE VREDNOSTI DIFERENCIALNE BELE KRVNE SLIKE Tabela 8: Odstotek nevtrofilnih granulocitov (povprecje ± SEM %) % Obrite Odlakane Kontrola p-vrednost 0 dni 45,19 ± 3,33 49,94 ± 2,14 45,12 ± 3,85 1 7 dni 51,41 ± 2,65 45,44 ± 1,9 44,18 ± 2,8 0,67 30 dni 51,47 ± 2,2 50 ± 1,93 48,81 ± 3,54 1 60 dni 47,69 ± 2,65 48,57 ± 3,01 46,35 ± 3,5 1 p-vrednost 0,28 0,75 1 Tabela 9: Odstotek limfocitov (povprecje ± SEM %) % Obrite Odlakane Kontrola p-vrednost 0 dni 48,06 ± 2,97 42,65 ± 2,31 48,41 ± 4,16 1 7 dni 42,41 ± 2,52 49,56 ± 1,99 50,12 ± 2,95 0,316 30 dni 42,47 ± 2,85 44,93 ± 2,17 45,56 ± 3,41 1 60 dni 45,31 ± 2,64 43,93 ± 2,91 44,88 ±3,72 1 p-vrednost 0,393 0,24 0,69 Tabela 10: Odstotek eozinofilnih granulocitov (povprecje ± SEM %) % Obrite Odlakane Kontrola p-vrednost 0 dni 3,88 ± 0,83 2,47 ± 0,51 3,06 ± 0,75 1 7 dni 3,65 ± 0,75 2,75 ± 0,62 3,24 ± 0,68 1 30 dni 2,24 ± 0,64 2,29 ± 0,49 2,5 ± 0,53 1 60 dni 3,88 ± 0,67 3,5 ± 0,99 4,29 ± 0,68 1 p-vrednost 0,57 1 0,69 Tabela 11: Odstotek bazofilnih granulocitov (povprecje ± SEM %) % Obrite Odlakane Kontrola p-vrednost 0 dni 0 ± 0 0 ± 0 0,059 ± 0,059 1 7 dni 0,059 ± 0,059 0 ± 0 0,059 ± 0,059 1 30 dni 0,12 ± 0,081 0 ± 0 0,19 ± 0,1 0,82 60 dni 0 ± 0 0 ± 0 0,24 ± 0,14 0,34 p-vrednost 0,58 / 0,49 Tabela 12: Odstotek monocitov (povprecje ± SEM %) % Obrite Odlakane Kontrola p-vrednost 0 dni 2,31 ± 0,45 3,12 ± 0,73 2,59 ± 0,7 1 7 dni 2,35 ± 0,94 2,19 ± 0,61 2,35 ± 0,56 1 30 dni 3,06 ± 0,64 2,64 ± 0,49 2,56 ± 0,58 1 60 dni 3 ± 0,47 3,71 ± 0,62 4,06 ± 0,78 1 p-vrednost 1 0,67 0,8 Tabela 13: Odstotek palicastih nevtrofilnih granulocitov (povprecje ± SEM %) % Obrite Odlakane Kontrola p-vrednost 0 dni 0,5 ± 0,02 1,29 ± 0,51 0,82 ± 0,37 1 7 dni 0,059 ± 0,059 0 ± 0 0,059 ± 0,059 1 30 dni 0,059 ± 0,059 0,07 ± 0,07 0,31 ± 0,15 0,81 60 dni 0 ± 0 0,21 ± 0,11 0,18 ± 0,13 1 p-vrednost 0,069 0,14 0,26 11.3 TABELE VREDNOSTI BIOKEMIJSKIH PARAMETROV Tabela 14: Vrednost celokupnega kalcija (povprecje ± SEM Mmol/L) Mmol/L Obrite Odlakane Kontrola p-vrednost 0 dni 2,43 ± 0,029 2,45 ± 0,035 2,46 ± 0,034 1 7 dni 2,43 ± 0,028 2,44 ± 0,037 2,47 ± 0,024 1 30 dni 2,37 ± 0,027 2,39 ± 0,038 2,32 ± 0,031 1 60 dni 2,54 ± 0,32 2,59 ± 0,042 2,53 ± 0,034 1 p-vrednost 0,00061 0,001 0,00000059 Tabela 15: Vrednosti anorganskega fosforja (povprecje ± SEM Mmol/L) Mmol/L Obrite Odlakane Kontrola p-vrednost 0 dni 1,93 ± 0,06 1,99 ± 0,05 2,1 ± 0,06 0,9 7 dni 1,88 ± 0,05 1,88 ± 0,06 1,94 ± 0,07 1 30 dni 1,89 ± 0,03 1,85 ± 0,04 1,86 ± 0,05 1 60 dni 1,91 ± 0,04 1,86 ± 0,06 2 ± 0,06 0,74 p-vrednost 1 0,11 0,0011 Tabela 16: Vrednosti glutamat dehidrogenaze (povprecje ± SEM U/L) U/L Obrite Odlakane Kontrola p-vrednost 0 dni 16,4 ± 2,6 39,83 ± 19,83 15,53 ± 1,4 0,65 7 dni 15,75 ± 1,4 19,34 ± 2,37 21,04 ± 5,16 0,63 30 dni 18,91 ± 2,24 26,51 ± 2,8 21,02 ± 2,73 0,65 60 dni 15,06 ± 1,25 19,43 ± 1,81 16,53 ± 2,14 0,99 p-vrednost 0,79 0,89 0,1 Tabela 17: Vrednosti gama glutamil transferaze (povprecje ± SEM U/L) U/L Obrite Odlakane Kontrola p-vrednost 0 dni 19,22 ± 2,03 22,71 ± 2,69 23,06 ± 2,1 0,57 7 dni 22,65 ± 1,83 25,12 ± 2,39 22,53 ± 2,06 1 30 dni 27,76 ± 1,63 25,21 ± 2,47 26,75 ± 1,69 1 60 dni 26,56 ± 1,1 29 ± 3,01 26,65 ± 2,25 1 p-vrednost 0,003 0,021 0,0011 11.4 MNENJE KOMISIJE ZA DOBROBIT ŽIVALI NA VETERINARSKI FAKULTETI Graphical user interface, application Description automatically generated Graphical user interface, application Description automatically generated