Zbornik predavanj, 5. izobraževalni dan programa ZORA – ZORA 2014 25 Razvrščanje in splošne lastnosti HPV Virusi iz družine Papillomaviridae ali papilomavirusi (PV) so zelo heterogena in široko razprostranjena skupina DNA-virusov, ki povzroča različne novo- tvorbe pri ljudeh in živalih. Na podlagi skladnosti nukleotidnih zaporedij PV razvrščamo v različne virusne genotipe, ki predstavljajo tudi osnovno taksonomsko enoto pri njihovi klasifi kaciji. PV naj- demo pri večini sesalcev in ptičev ter nekaterih pla- zilcih. Nekateri, predvsem evolucijsko nižji sesalci, imajo samo en za vrsto značilen genotip, medtem ko je raznolikost PV pri opicah in ljudeh mnogo ve- čja. Skupino genotipov PV, ki so pomembni v hu- mani medicini, imenujemo človeški papilomavirusi (angl. human papillomaviruses, HPV) (1–3). Kot novi genotip PV opredelimo vsak izolat, kate- rega nukleotidno zaporedje gena L1 se razlikuje za več kot 10 % od gena L1 vseh predhodno oprede- ljenih genotipov PV. V primeru, ko je neskladnost med dvema zaporedjema gena L1 med 2 in 10 %, je to virusni podtip. Če je razlika manjša od 2 %, novi virus opredelimo kot podtipsko (genetsko) različi- co enakega genotipa PV. Vse genotipe PV (do av- gusta 2014 je bilo popolnoma opredeljenih več kot 280 genotipov) razvrščamo v 37 rodov, od katerih jih je 23 označenih z grškimi črkami alfa–omega. Ker je število novoodkritih virusov preseglo število črk v grški abecedi, preostale rodove označujemo Značilnosti okužbe s HPV Mario Poljak, Boštjan J. Kocjan, Anja Oštrbenk, Lea Hošnjak Inštitut za mikrobiologijo in imunologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Zaloška 4, Ljubljana Povzetek Papilomavirusi predstavljajo zelo heterogeno skupino DNA virusov, ki jih povezujemo z nastankom različnih novotvorb pri ljudeh in živalih. Genom papilomavirusov predstavlja krožna dvojnovijačna DNA, velikosti približno 8 kbp, ki je sestavljena iz kodirajočega (beljakovine E1, E2, E4, (E5), E6, E7, L1 in L2) in nekodirajočega območja (LCR).V skupino človeških papilomavirusov (HPV) trenutno uvr- ščamo več kot 190 različnih genotipov HPV, ki so razvrščeni v pet rodov (alfa, beta, gama, mu in nu). HPV se prenašajo spolno in z neposrednim stikom kože s kožo. Okužba z visokorizičnimi genotipi iz rodu alfa, najpomembnejša sta HPV-16 in HPV-18, je tesno povezana z nastankom malignih novo- tvorb ploščatoceličnega epitela v anogenitalnem predelu, in sicer z rakom materničnega vratu (>99 %), rakom zadnjika in nožnice (70–90 %) ter rakom vulve in penisa (40–47 %). Nizkorizični genotipi iz rodu alfa so povezani z nastankom anogenitalnih bradavic in papilomov grla. HPV iz rodu beta pri imunsko kompetentnih osebah najpogosteje vzpostavijo prikrito okužbo in redkeje povzročajo be- nigne novotvorbe na koži. Genotipi HPV iz rodov gama, mu in nu, predvsem pri imunsko oslabljenih osebah, povzročajo različne benigne spremembe na koži. Ključne besede: Papilomavirusi, človeški papilomavirusi, razvrščanje, zgradba in pomnoževanje, molekularna patogeneza okužbe, model karcinogeneze, imunologija okužbe z grškimi črkami delta–rho, ki imajo dodano pred- pono dyo. Skladnost nukleotidnih zaporedij v celo- tnem genu L1 je med različnimi rodovi PV manjša kot 60 %. Virusne vrste znotraj posameznega rodu izkazujejo 60–70 % nukleotidno skladnost v genu L1, medtem ko genotipi znotraj posamezne vrste izkazujejo 71–89 % nukleotidno skladnost v genu L1. Za večino genotipov HPV, uvrščenih v eno vr- sto, velja, da imajo podobne biološke lastnosti, to je tropizem za specifi čna tkiva in/ali organe ter po- doben tumorogeni potencial (1, 2). Tradicionalno so genomska zaporedja PV prido- bivali iz epitelnih novotvorb s pomočjo klasičnih tehnik kloniranja, ki so primerne predvsem za opredeljevanje genotipov HPV, ki so v kliničnem vzorcu prisotni v zelo visokih koncentracijah. Z na- predovanjem molekularne biologije in razvojem tehnik, kot so PCR, podvojevanje celotnega geno- ma s pomočjo tehnike kotalečega se kroga (angl. rolling circle amplifi cation) in shotgun sekveniranje, so za identifi kacijo novih PV postale veljavne tudi te metode. Uporaba novejših metod je pripeljala do identifi kacije in karakterizacije številnih novih PV, ki so v kliničnih vzorcih praviloma prisotni v zelo nizkih koncentracijah (4, 5). Odkrivanje novih genotipov HPV spremljajo v Re- ferenčnem centru za HPV (Human papillomavirus Reference Center, Karolinska Institutet) v Stockhol- Zbornik predavanj, 5. izobraževalni dan programa ZORA – ZORA 2014 26 mu (Švedska), kjer določajo tudi zaporedne šte- vilke novo opredeljenih genotipov HPV. Genotipi HPV so (na žalost) oštevilčeni popolnoma naključ- no, glede na vrstni red osamitve, in ne glede na biološke lastnosti virusov ali njihovo genomsko podobnost. Tako npr. genotip HPV 16 oz. krajše HPV-16, predstavlja šestnajsti po vrsti odkriti geno- tip HPV. Do avgusta 2014 je bilo popolnoma opre- deljenih 195 različnih genotipov HPV, po podatkih nedavno objavljenih raziskav, pa obstaja 200–300 potencialno novih genotipov, ki čakajo na do- končno molekularno in fi logenetsko opredelitev. V zadnjih letih je naša raziskovalna skupina odkrila in dokončno opredelila devet novih uradno pri- znanih genotipov HPV, in sicer HPV-120, HPV-125, HPV-150, HPV-151, HPV-159, HPV-174, HPV-179, HPV-184 in HPV-199 ter delno opredelila več kot 30 kandidatnih izolatov za nove genotipe. Za oprede- litev in uradno priznanje novega genotipa HPV je treba še vedno celotni genom izolata HPV (lahko tudi po delih) vklonirati v plazmidne vektorje in mu določiti nukleotidno zaporedje oz. za PV značilna genomska področja. Celotni genom potencialno novega genotipa HPV lahko pridobimo s PCR ali s tehniko klasičnega kloniranja (1, 2). Nedavno je bila ustanovljena prosto dostopna po- datkovna baza PaVE (PapillomaVirus Episteme), z namenom zagotovitve organiziranega in ažurnega vira informacij znanstveni skupnosti, ki se ukvarja z raziskavami na področju papilomavirusov. Tre- nutno vsebuje 303 referenčne genome PV, 3.126 posameznih genov in regij genoma, 2.823 zapo- redij virusnih beljakovin in 48 trodimenzionalnih struktur virusnih beljakovin, ki jih lahko uporabniki brezplačno prenesejo, raziskujejo in analizirajo (6). Uporabniki lahko brezplačno prenesejo podatke o novoodkritih genotipih HPV tudi iz podatkovne baze Referenčnega centra za HPV - http://www. hpvcenter.se/html/refclones.html. 195 do sedaj znanih genotipov HPV uvrščamo, sku- paj še z nekaterimi opičjimi PV, v 5 rodov (alfa, beta, gama, mu in nu). Posamezni rodovi HPV izkazujejo dokaj značilen tropizem za določeno vrsto epitela. Največji in za človeka klinično najbolj pomemben je rod alfa (sestavlja ga 14 virusnih vrst), v katerega so uvrščeni genotipi HPV, povezani z nastankom številnih benignih in malignih novotvorb plošča- toceličnega epitela. Približno 40 genotipov HPV iz rodu alfa izkazuje tropizem za epitel sluznic in se glede na vrsto novotvorb, ki jih povzročajo, deli na visokorizične in nizkorizične genotipe HPV. Visoko- rizični genotipi HPV (najpomembnejša sta HPV-16 in HPV-18) so odgovorni za nastanek več kot 99 % primerov raka materničnega vratu, 70–90 % raka zadnjika in nožnice, 40 % raka ženskega zunanje- ga spolovila (vulve), 47 % raka penisa ter 25–30 % raka ustnega dela žrela. Nasprotno so nizkorizični genotipi HPV iz rodu alfa (najpomembnejša sta HPV-6 in HPV-11) odgovorni za nastanek vseh pri- merov anogenitalnih bradavic in papilomov grla. V rod alfa so uvrščeni tudi nekateri genotipi HPV (npr. HPV-2, HPV-27 in HPV-57), ki okužijo predvsem več- skladni ploščatocelični epitel kože. Najpogosteje povzročajo navadne kožne bradavice in anogeni- talne bradavice pri otrocih. Rod beta (sestavlja ga 5 virusnih vrst) združuje genotipe HPV, povezane z nastankom različnih benignih in malignih novo- tvorb na koži pri imunsko oslabljenih osebah in pri bolnikih z redko dedno boleznijo, imenovano bra- davičasta epidermodisplazija. Pri osebah, ki niso genetsko predisponirane, ti virusi najpogosteje vzpostavijo t. i. prikrito (latentno) okužbo in red- ko povzročajo benigne novotvorbe kože. Genotipi HPV iz rodov gama (17 virusnih vrst), mu (2 virusni vrsti) in nu (1 virusna vrsta) povzročajo različne be- nigne spremembe na koži (1, 7–11). Zgradba in pomnoževanje HPV HPV so majhni DNA-virusi brez ovojnice, ki v pre- meru merijo približno 55 nm. Dedni material je obdan z dvoplastno beljakovinsko sredico. Virusna sredica (kapsida) ima ikozaedrično simetrijo in je sestavljena iz 72 morfoloških enot, t. i. kapsomer, ki jih sestavljata dva tipa strukturnih beljakovin, in sicer velika (L1) in mala (L2) plaščna beljakovina. Vsaka od 72 kapsomer je sestavljena iz petih belja- kovin L1 molekulske mase 54 kDa, ki se navzkrižno povežejo z disulfi dnimi mostički, in ene, aksialno vstavljene beljakovine L2 (74–80 kDa), ki pomaga oblikovati in vzdrževati strukturo kapsomere (1). Slika 1. Organizacija genoma HPV. (Vir: Kocjan BJ, Poljak M. Papilomavirusi. In: Poljak M, Petrovec M, eds. Medicinska virologija. Ljubljana: Medicinski razgledi; 2011. p. 41-60.) Zbornik predavanj, 5. izobraževalni dan programa ZORA – ZORA 2014 27 Virusni genom je krožna, zaprta, dvojnovijačna molekula DNA, velikosti 7,5–8 kbp in molekulske mase 5,2 x 10 6 Da (Slika 1). Genom je sestavljen iz kodirajočega in nekodirajočega območja. Kodira- joče območje genoma delimo na zgodnje območje E (angl. early) in pozno območje L (angl. late) (1). Območje E vsebuje zapise (gene) za beljakovine, pomembne za uravnavanje podvojevanja virusne DNA, uravnavanje izražanja virusnih genov in inte- rakcijo s celičnimi beljakovinami gostitelja. Večina do sedaj opredeljenih genotipov HPV ima do šest različnih genov E, in sicer E1, E2, E4, E5, E6 in E7. Ti se prepisujejo kot različne bi- ali policistronske molekule mRNA – vsebujejo bralne okvirje za več različnih beljakovin – iz zgodnjega promotorja P1 (HPV-11), ki se nahaja v nekodirajočem območju LCR (angl. long control region). Izjema so nizkorizič- ni genotipi HPV, pri katerih se mRNA-beljakovine E7 prepiše posebej, in sicer s promotorja P2 (HPV- 11), ki se nahaja v genu E6 (1, 12). Gena E6 in E7 sta med vsemi območji genoma HPV najbolj raziskana, saj imata najpomembnejšo vlo- go v onkogenezi novotvorb, katerih nastanek se povezuje s HPV. Virusni beljakovini E6 in E7 vplivata na številne celične procese, ki lahko vodijo do mali- gne transformacije s HPV okuženih celic. Med njimi so najpomembnejši spodbujanje oz. vzdrževanje celične proliferacije, zaviranje zaščitnega delovanja celičnih tumor zavirajočih beljakovin ter indukcija celične nesmrtnosti. Onkogeno delovanje beljako- vin E6 in E7 je podrobneje opisano v poglavju Mo- lekularna patogeneza okužbe s HPV (1, 12). Transformirajoče lastnosti izraža tudi virusna be- ljakovina E5, za katero domnevamo, da bi lahko sodelovala v začetni stopnji onkogeneze, posre- dovane s HPV iz rodu alfa. Beljakovina E5 spodbuja receptorje celičnih rastnih dejavnikov EGF (angl. epidermal growth factor) in PDGF (angl. platelet derived growth factor) ter na ta način povišuje nivo mitogenih dejavnikov, ki spodbujajo celično pro- liferacijo. Najnovejše raziskave ji pripisujejo tudi pomembno vlogo pri spodbujanju angiogeneze in antiapoptotsko delovanje. Poleg tega E5 omogoča tudi izmikanje HPV imunskemu odgovoru, saj ovira zorenje molekul PHK razreda I. Zapis za beljakovino E5 manjka pri večini genotipov HPV iz rodov beta in gama. E5 je trenutno ena najbolj raziskovanih vi- rusnih beljakovin (1, 12). Virusna beljakovina E1 je pomembna za začetek podvojevanja virusne DNA in vzdrževanje HPV v obliki zunajkromosomskih krožnih DNA-delcev ali episomov. E1 se veže skupaj z beljakovino E2 v bližino ori mesta podvojevanja virusnega genoma (angl. origin of replication) v nekodirajočem obmo- čju LCR in deluje kot encim z ATP-azno in helikazno aktivnostjo (1, 12). Beljakovina E2 se veže na značilna zaporedja DNA v nekodirajočem področju LCR in uravnava podvoje- vanje, segregacijo in izražanje virusnega genoma. Vezava E2 je nujna za pritrditev beljakovine E1 na ori mesto, ki v naslednjem koraku veže celične be- ljakovine, potrebne za podvojevanje virusne DNA, vključno z beljakovino RPA (angl. replication protein A) in DNA-polimerazo alfaprimazo. Poleg tega je beljakovina E2 potrebna za pritrditev virusnih epi- somov na mitotske kromosome in njihovo pravilno segregacijo med celično delitvijo. Beljakovina E2 je izjemno pomembna tudi za uravnavanje izražanja virusnih onkogenov. V nizkih koncentracijah E2 spodbuja izražanje E6 in E7, medtem ko v visokih koncentracijah E2 zavira izražanje E6 in E7 z nepo- srednim oviranjem vezave celičnih dejavnikov pre- pisovanja SP1in TFIID na zgodnji virusni promotor p97 (HPV-16) (1, 12). Vloga virusne beljakovine E4 še ni povsem znana. Dosedanje raziskave so pokazale, da se E4 veže na citokeratine okuženih celic in na ta način povzroči propad celičnega citoskeleta. Domnevamo, da je porušenje citokeratinske mreže potrebno za lažje izstopanje zrelih virusnih delcev iz okuženih celic (1, 12). Območje L virusnega genoma vsebuje zapisa za strukturni beljakovini virusne kapside (L1 in L2), ki se prepisujeta kot bi- in/ali policistronske mRNA iz poznega promotorja P3 (HPV-11), ki se nahaja v genu E7. Omenjeni promotor je pomemben tudi za prepis zgodnjih virusnih beljakovin E1, E2 in E4, ki so pomembne za pomnoževanje virusa v diferenci- rajočih se epitelih celicah. Gen L1 vsebuje zapis za veliko plaščno beljakovino, ki je skupaj z odprtim bralnim okvirjem za beljakovino E1 najbolj ohra- njeni del genoma med različnimi genotipi HPV in predstavlja osnovo za klasifi kacijo ter raziskave evolucijske sorodnosti (H)PV. Beljakovina L1 pred- stavlja najbolj imunogeno virusno beljakovino, ki v gostitelju izzove nastanek nevtralizirajočih pro- titeles, ki so značilna za posamezen genotip HPV. Gen L2 ima zapis za malo plaščno beljakovino, ki je pri posameznih genotipih HPV različna. Za belja- kovino L2 je značilno, da vsebuje visoko ohranjene epitope, ki v gostitelju izzovejo nastanek nevtralizi- rajočih protiteles, ki ščitijo proti širokemu spektru genotipov HPV. Navzkrižno nevtralizirajoči epitopi so skriti v notranjosti kapside in se razkrijejo šele ob vezavi kapside na gostiteljsko celico (1, 12). Nekodirajoče območje LCR ne vsebuje zapisa za virusne beljakovine, ampak zaporedja DNA, po- membna za uravnavanje podvojevanja in prepi- Zbornik predavanj, 5. izobraževalni dan programa ZORA – ZORA 2014 28 sovanja virusnega genoma: mesto ori, zgodnje virusne promotorje, vezavna mesta za dejavnike prepisovanja, ojačevalce in represorske uravnalne beljakovine. LCR se nahaja med genoma L1 in E6. Pomen drugega nekodirajočega območja, ki se na- haja med genoma E5 in L2, še ni znan (1, 12). Molekularna patogeneza okužbe s HPV Okužba s HPV se prične z vstopom virusa skozi poškodovani epitel kože ali sluznice, najpogosteje skozi mikroskopsko razpoko v epitelu, in z okužbo bazalnih celic večvrstnega ploščatoceličnega epi- tela (Slika 2). Domnevamo, da so za vezavo virusa na gostiteljsko celico ključni heparan-sulfatni pro- teoglikani (HSPG), ki se nahajajo na bazalni mem- brani in površini epitelnih celic. V začetni stopnji okužbe pride do vezave virusne kapside oz. belja- kovin L1 na primarno vezavno mesto, ki ga pred- stavljajo receptorji HSPG na bazalni membrani. V nadaljevanju se kapsida prenese do sekundarne- ga vezavnega mesta, ki je na površini celic in ki ga prav tako predstavljajo receptorji HSPG. Pri tem pride do konformacijske spremembe, zaradi katere se izpostavi visokoohranjeni N-terminalni del be- ljakovine L2, ki ga v nadaljevanju cepi celični encim furin. Ti dogodki privedejo do nadaljnjih konfor- macijskih sprememb v kapsidi, ki bodisi zmanjšajo afi niteto kapside do receptorjev HSPG ali pa vodi- jo do izpostavitve mest, ki so potrebna za vezavo kapside oz. beljakovine L1 na še nepoznane sekun- darne receptorje, ki sprožijo endocitozo. HPV vsto- pa v celico relativno počasi (prve prepise virusnih genov lahko zaznamo šele po 12–24 urah). HPV-16 vstopa v celice s pomočjo klatrinsko posredovane endocitoze. Ta mehanizem vstopa najverjetneje ni univerzalen za vse HPV, saj se lahko razlikuje med posameznimi genotipi. Tako npr. HPV-31 v celice vstopa s pomočjo kaveolnega endocitotskega sis- tema, neodvisnega od klatrina. Poleg tega so ugo- tovili, da se lahko nekateri HPV, ki v celico vstopijo s pomočjo klatrinskega enodocitotskega sistema, znotrajcelično prenašajo tudi s kaveosomi. Po vstopu v celico se virusni delci razgradijo v poznih endosomih in/ali lizosomih; s pomočjo virusne beljakovine L2 se genom HPV na še neznan način (najverjetneje s pomočjo mikrotubolov) prenese v jedro bazalnih celic (1, 12–14). V nadaljevanju HPV okužba lahko poteka kot (i) klinično nema, (ii) produktivna ali (iii) nepopolna (transformirajoča, abortivna). Proces pomnože- vanja HPV je natančno uravnan in je odvisen od prisotnosti oz. odsotnosti določenih virusnih be- ljakovin in tudi od stopnje zrelosti epitelnih celic gostitelja. Tako je npr. pomnoževanje HPV v bazal- Slika 2. Potek okužbe s HPV. (Vir: Kocjan BJ, Poljak M. Papilomavirusi. In: Poljak M, Petrovec M, eds. Medi- cinska virologija. Ljubljana: Medicinski razgledi; 2011. p. 41-60.) Zbornik predavanj, 5. izobraževalni dan programa ZORA – ZORA 2014 29 nih epitelnih celicah močno omejeno. Pozneje se sočasno z dozorevanjem okuženih celic povečuje tudi sposobnost pomnoževanja HPV, kompletni virioni pa se sproščajo le iz popolnoma dozorelih celic. V jedrih bazalnih celic se genom HPV naha- ja izključno v obliki zunajkromosomskih krožnih delcev oz. v t. i. episomih. Bazalne celice z episomi so nosilke latentne HPV-okužbe in jih histološko ni mogoče razlikovati od neokuženih celic. Kmalu po okužbi bazalnih celic se število kopij virusnega genoma poveča na od 50 do 100 kopij na celico, neodvisno od celičnega cikla. Podvojevanje viru- snega genoma nato tesno sledi celičnemu ciklu gostiteljske celice. Navadno se pri eni celični de- litvi virusni genom podvoji le enkrat. Ko je HPV v bazalnem sloju, je sinteza virusnih beljakovin mini- malna. V glavnem se sintetizirata beljakovini E6 in E7, poleg minimalne količine drugih virusnih belja- kovin, predvsem E1 in E2, ki sta potrebni za zače- tek podvojevanja in oddvojitve virusnega genoma (episoma). S pomočjo beljakovin E6 in E7, katerih izražanje spodbuja nizka raven E2 (v tem primeru beljakovina E2 deluje kot aktivator prepisovanja E6 in E7), HPV v nadaljevanju okužbe spremeni celič- no okolje z namenom, da ustvari pogoje za podvo- jevanje virusa med potekom diferenciacije okuže- nih celic v keratinocite. V fi zioloških pogojih (to je brez prisotnosti HPV) bazalne celice, ki vstopijo v suprabazalne epitelne sloje, po določenem števi- lu delitev izstopijo iz celičnega ciklusa in začnejo proces terminalne diferenciacije s ciljem, da vzpo- stavijo zaščitni keratinski sloj, ki ga normalno za- gotavlja koža. Nasprotno se zaradi vpliva beljako- vin E6 in E7 ter delno tudi E5 s HPV okužene celice suprabazalnega sloja delijo večkrat kot običajno, preden preidejo v višje sloje epitela. Ko pridejo v stratum spinosum, v njih naraste količina beljako- vin HPV, ki so nujne za podvojevanje virusa (E1 in E2). Povišana raven beljakovine E2 zavre izražanje virusnih onkogenov, kar zaustavlja proliferacijo epitelnih celic in omogoča njihovo diferenciacijo v keratinocite. Glede na to, da je izražanje genov E6 in E7 zavrto, se beljakovini E1 in E2 vežeta na značilna zaporedja DNA v območju LCR in aktivi- rata celične beljakovine oz. mehanizme, potrebne za podvojevanje virusne DNA. Predvideva se, da tu podvajanje virusnega genoma poteka po načinu kotalečega se kroga (angl. rolling circle), tako da v gostiteljskih celicah nastaja na tisoče kopij viru- snega genoma. Ko okuženi keratinociti pridejo v zgornje sloje epitela (stratum granulosum), pod- vojevanju virusnega genoma sledi sinteza virusnih beljakovin, ki so potrebne za sestavljanje virionov (L1, L2) oz. njihovo sproščanje (E4) iz gostiteljskih celic. Pri oblikovanju infektivnih virusnih delcev ima pomembno vlogo tudi beljakovina E2, saj po- večuje učinkovitost vključitve virusnega genoma v virusno sredico s strani L1 in L2. Virusni delci na- stajajo v zelo velikem številu in so sposobni okužiti sosednje celice (1, 12–14). Aktivno pomnoževanje HPV v anogenitalnem po- dročju se klinično največkrat odraža kot benigne, bradavicam podobne spremembe ali kot cervikal- na intraepitelijska neoplazija 1. stopnje, ki s svoje površine sproščajo veliko količino infektivnih viru- snih delcev. Okužbo, v kateri virus uspešno zaključi svoj življenjski krog, imenujemo produktivna viru- sna okužba, same spremembe, ki pri tem nastane- jo, pa produktivne spremembe oz. lezije. V produk- tivnih spremembah je izražanje virusnih genov na- tančno uravnavano. Virusne beljakovine se namreč izražajo v točno določenih časovnih intervalih in v nadzorovanih količinah ter sovpadajo z dozoreva- njem gostiteljskih celic. Številni genotipi HPV pov- zročajo samo to vrsto sprememb, in redko oz. nikoli nastanek malignih sprememb. Dogodki, ki vodijo do nastanka zrelih virusnih delcev v zgornjih pla- steh epitela, so skupni tako nizkorizičnim kot tudi visokorizičnim genotipom HPV. Zaradi pomno- ževanja HPV v dokončno diferenciranih epitelnih celicah se le-te morfološko spremenijo in začnejo postopoma propadati. Ta citopatski učinek, znači- len za HPV, imenujemo koilocitoza. Za koilocite so značilna skrčena, hiperkromna jedra različnih oblik, kromatin je grudast, okoli jeder se pojavlja značilen svetli pas ali halo. Koilocitoza je znak produktivne virusne okužbe, ki se odraža v propadu celic, in je histološko najbolje vidna v zgornji tretjini epitela benignih sprememb, povezanih s HPV (1, 12–14). Rak materničnega vratu je najhujša posledica okužbe s HPV, ki se razvije postopoma, skozi zapo- redje relativno dobro poznanih dogodkov. Rak ma- terničnega vratu lahko nastane le pri ženskah, ki so dolgotrajno okužene z enim ali več visokorizičnimi genotipi HPV, najpogosteje s HPV-16 ali HPV-18. Pri teh osebah izguba zaščitnega delovanja celič- nih tumorje zavirajočih beljakovin, ki nastane kot posledica nenadzorovanega izražanja (delovanja) virusnih beljakovin E6 in E7, vodi do kopičenja raz- ličnih sekundarnih mutacij, ki lahko čez leta prive- dejo do nastanka raka (1, 8, 13). Molekularni model karcinogeneze, posredova- ne z visokorizičnimi genotipi HPV Novejša spoznanja o HPV so privedla do razvoja molekularnega modela karcinogeneze, posredova- ne z visokorizičnimi genotipi HPV. Temelj modela je interakcija virusnih beljakovin z močno kontro- liranim spletom celičnih onkogenov in tumorje za- virajočih beljakovin, predvsem p53 in pRB, ki urav- navajo rast in delitev celic. Model opisuje nastanek malignih novotvorb v treh stopnjah, pri čemer kot vzorčni tumor služi rak materničnega vratu. V prvi Zbornik predavanj, 5. izobraževalni dan programa ZORA – ZORA 2014 30 stopnji HPV okuži bazalne celice ploščatoceličnega epitela. V drugi stopnji pride do vključevanja (inte- gracije) HPV DNA v genom gostiteljske celice, kar je tudi ključni dogodek v nastanku raka. Do vklju- čevanja virusne DNA pride le v primeru razmeroma redke, dolgotrajne (perzistentne) okužbe z visoko- rizičnimi genotipi HPV. Nagnjenost k vključevanju v humani genom izkazujejo predvsem visokorizični genotipi HPV (med njimi največjo HPV-16 in HPV- 18), medtem ko je ta dogodek pri okužbi z nizko- rizičnimi genotipi HPV (npr. HPV-6 in HPV-11) izje- mno redek (Slika 3). V tretji stopnji razvoja tumorja imajo poleg HPV (ta deluje kot endogeni karcino- gen) pomembno vlogo tudi dodatne karcinogene snovi, kot so cigaretni dim, UV-žarki, obsevanje, najrazličnejši kemični agensi itd., ker povzročajo nastanek številnih sprememb človeškega genoma, ki vodijo v nesmrtnost okuženih celic in na koncu do njihove maligne preobrazbe (1, 13). Številne raziskave so pokazale, da je fi zikalno stanje genoma HPV v benignih in malignih novotvorbah oz. različnih predrakavih spremembah epitela raz- lično (Slika 3). V benignih novotvorbah, kot so ge- nitalne bradavice, je virusna DNA prisotna v obliki episoma, medtem ko je pri večini malignih novo- tvorb in delu CIN III vsaj del virusne DNA (vedno sta vključena vsaj zapisa za E6 in E7) integriran v genom gostiteljske celice. Genom HPV je vključen tudi pri manjšem deležu CIN I, zato domnevamo, da je virusna integracija najverjetneje zgodnji do- godek v procesu nastanka raka. Mesto v DNA ba- zalnih celic, na katerem pride do vključevanja ge- noma HPV, ni specifi čno. Vgrajeno virusno DNA so našli na različnih kromosomih, vendar pogosto v bližini t. i. krhkih mest, medtem ko se krožni genom virusa pred vključitvijo skoraj vedno prekine na is- tem mestu, tj. v področju gena E2 (Slika 4). Glede na to, da je beljakovina E2 odgovorna za zaviranje pre- pisovanja zgodnjih virusnih genov E6 in E7, fi zična prekinitev gena E2 vodi do izgube njene biološke vloge. Rezultat tega je povečano in nekontrolira- no izražanje oz. kopičenje beljakovin E6 in E7, ki se vežeta na celični tumorje zavirajoči beljakovini p53 in pRB in sodelujeta pri njihovi razgradnji (Slika 4). Do nekontroliranega izražanja virusnih onkogenov redkeje prihaja v primeru, ko gen E2 ni prekinjen, oz. v primeru, ko je vezavno mesto za beljakovino E2 znotraj uravnalnega območja LCR nedostopno oz. metilirano. Ne glede na mehanizem, zmanj- ševanje fi zioloških količin beljakovin p53 in pRB znotraj celice in prekinitev njunega tumorsko-za- ščitnega delovanja predstavlja ključni dogodek v razvoju raka (1, 13–19). Nedavne raziskave so pokazale, da se beljakovina E6 visokorizičnih genotipov HPV v gostiteljskih ce- licah poveže v tridelni kompleks s celično beljako- vino p53 in celično ubikvitinsko ligazo E6AP (angl. cellular E6AP ubiquitin ligase) in sproži hitro razgra- dnjo p53 z od ubikvitina odvisnim sistemom pro- teaz oz. s proteasomi. Beljakovina p53 je dejavnik prepisovanja, ki normalno uravnava prepisovanje celičnih beljakovin, ki sodelujejo v nadzoru celič- Slika 3. Povzetek ključnih dogodkov v patogenezi anogenitalnih bradavic in raka materničnega vratu. (J. Triglav, 2011. Prirejeno po: Beutner KR, Tyring S. Human papilloma virus and human disease. Am J Med. 1997; 102: 9–15, Figure 2; Doorbar J. Molecular bio logy of human papilloma virus infection and cervical cancer. Clin Sci (Lond). 2006; 110: 525–41, Figure 2, Figure 5.) Zbornik predavanj, 5. izobraževalni dan programa ZORA – ZORA 2014 31 nega cikla na prehodu iz G1- v S-fazo. Njeno izraža- nje lahko sprožijo različni geno- ali citotoksični de- javniki, ki predstavljajo potencialno nevarnost za celico (najpogosteje so to poškodbe DNA). Po po- škodbi celične DNA, ki lahko nastane kot posledica normalnega celičnega pomnoževanja in/ali zaradi izpostavitve celične DNA različnim fi zikalnim ali ke- mijskim agensom, raven p53 naglo naraste (sama beljakovina se aktivira s potranslacijskimi modifi - kacijami), kar zaustavi celično delitev za tako dolgo, dokler celični popravljalni mehanizmi ne popravijo okvarjenih odsekov DNA. Po odpravi poškodb ra- ven p53 upade in celični ciklus napreduje v S-fazo, kjer se podvoji popravljena DNA. V primeru, ko so poškodbe celičnega genoma preobsežne ali nepo- pravljive, p53 sproži proces celične apoptoze. Be- ljakovino p53 so zaradi te vloge poimenovali varuh človeškega genoma. Nasprotno pa trajno znižana raven beljakovine p53, do katere lahko pride zaradi mutacij ali odsotnosti gena p53, ali pa beljakovino p53 inaktivira HPV-E6, omogoča neovirano delitev celic s poškodovano DNA, kar v končni fazi lahko privede do njihove maligne preobrazbe. Čeprav je osrednja vloga beljakovine HPV-E6 vezana na raz- gradnjo tumorje zavirajoče beljakovine p53, se ta veže tudi na nekatere ostale celične beljakovine ali uravnava njihovo izražanje. Na ta način se prepreči nespecifi čni imunski odgovor na okužbo s HPV npr. z oviranjem inteferonskega protivirusnega odziva in signalne poti TLR (angl. toll-like receptor) in od p53 neodvisne apoptotske poti (npr. apoptotska si- gnalna pot preko membranskih receptorjev TNF ali mitohondrijskih beljakovin Bak in Bax) ter se spod- budi proliferacija epitelnih celic in nastanek mali- gnih tumorjev (npr. z aktivacijo encima telomeraze oz. njegove katalitične podenote hTERT, kar vodi v nesmrtnost celic, s povzročanjem kromosomalnih aberacij, z oviranjem celične adhezije, z rušenjem medceličnih stikov in celičnega citoskeleta, z ovi- ranjem diferenciacije epitelnih celic ter spodbuja- njem angiogeneze) (1, 12, 13). Čeprav lahko tudi beljakovine E6 nizkorizičnih ge- notipov HPV tvorijo stabilne komplekse z beljako- vino E6AP , ti ne vežejo oz. ne vodijo do razgradnje p53. Zato domnevamo, da so tarča kompleksa E6-E6AP nizkorizičnih HPV nekatere druge, še ne- znane celične beljakovine. Nasprotno pa se lahko beljakovine E6, tako nizkorizičnih kot tudi visoko- rizičnih genotipov HPV, vežejo neposredno na p53 ali povzročajo njegovo nestabilnost (npr. z inakti- vacijo encima acetiltransferaze p300 in beljakovine CBP) in na ta način dodatno ovirajo njegovo vezavo na značilna zaporedja v celični DNA (1, 12, 13). Virusna beljakovina E7 je strukturno in funkcional- no podobna antigenu E1A adenovirusov (Ad EA1) in velikemu antigenu T virusa polioma SV40 (SV40 T-Ag). Vse omenjene beljakovine tvorijo komplekse s celično tumorje zavirajočo beljakovino pRB (reti- noblastomska beljakovina) in sorodnima žepnima beljakovinama (angl. pocket proteins) p107 in p130, ki jih tako zavrejo. Po vezavi E7 visokorizičnih geno- tipov HPV na beljakovino pRB pride do proteolitske Slika 4. Shematski prikaz molekularnih interakcij med virusnima beljakovinama E6 in E7 ter celičnima tumorje zavirajočima beljakovinama p53 in pRB (J. Triglav, 2011. Prirejeno po: Vousden K. Interactions of human papilloma virus transforming proteins with the products of tumor suppressor genes. FASEB J. 1993; 7: 872–9, Figure 1; Lazo PA. The molecular genetics of cervical carcinoma. Br J Cancer. 1999; 80: 2008–18, Figure 1.) Zbornik predavanj, 5. izobraževalni dan programa ZORA – ZORA 2014 32 razgradnje pRB v celičnih proteasomih. Beljakovina pRB normalno deluje kot zaviralec (represor) dru- žine dejavnikov prepisovanja E2F, ki imajo ključno vlogo v aktivaciji genov, potrebnih za sintezo DNA, in stimulaciji vstopa celice v S-fazo celičnega cikla; z vezavo na E2F beljakovina pRB prepreči izražanje teh genov. Na koncu G1-faze celičnega cikla, ko so izpolnjeni vsi fi ziološki pogoji za vstop celice v S-fa- zo, od ciklina odvisne kinaze fosforilirajo pRB in ga tako inaktivirajo, E2F se odcepi od pRB in aktivira podvojevanje DNA oz. delitev celic. Vezava virusne beljakovine E7 z defosforilirano obliko pRB ima v osnovi enak učinek kot fosforilacija pRB; to je odce- pitev E2F od pRB in spodbujanje celične proliferaci- je. Ta je za razliko od proliferacije, ki poteka fi ziolo- ško oz. brez prisotnosti HPV, nekontrolirana in po- višana ter tako odpira vrata maligni preobrazbi ce- lice. Inaktivacija pRB z beljakovino E7 visokorizičnih genotipov HPV se odraža v povečanem izražanju njegovega zaviralca – beljakovine p16 INK4A . Ugota- vljanje povečanega izražanja p16 INK4A v citoloških in histoloških vzorcih z imunohistokemično metodo se v zadnjih nekaj letih uporablja tudi v diagnostič- ne namene za dokazovanje HPV-okuženih celic, ki imajo povišano raven izražanja beljakovine E7 oz. za dokazovanje CIN višjih stopenj in raka maternič- nega vratu. Beljakovina E7 lahko tvori komplekse tudi z nekaterimi ostalimi celičnimi beljakovinami, ki so posredno ali neposredno odgovorne za urav- navanje celične proliferacije (različni prepisovalni dejavniki, histonske deacetilaze, beljakovine pre- pisovalnega kompleksa AP1, ciklina A in E, inhibi- torja od ciklina odvisnih kinaz p21 in p27) in preko katerih lahko dodatno spodbuja pomnoževanje gostiteljskih celic. Podobno kot beljakovina E6 tudi beljakovina E7 povzroča genetsko nestabilnost ce- ličnega genoma, npr. s povzročanjem anevploidije in preureditve kromosomov, in na ta način pospe- šuje proces karcinogeneze. Povzročanje genomske nestabilnosti s strani E6 in E7 se smatra za zgodnji dogodek v procesu karcinogeneze, pred integraci- jo HPV-DNA v celični genom, in je značilno le za vi- sokorizične genotipe HPV. Beljakovina E7 naj bi bila pomembna tudi za vzdrževanje aktiviranega stanja telomeraz in podaljševanje telomer s sistemom ALT (angl. alternative lengthening of telomeres). Po- membna dodatna vloga E7 je aktivacija nekaterih celičnih metabolnih encimov (npr. piruvat kinaze in alfa glukozidaze), ki omogočajo hitrejšo izrabo celičnih zalog glikogena, pospešujejo biosintezo in obenem zmanjšujejo potrebo celice po kisiku (značilnost tumorskih celic), ovirajo različne kom- ponente inteferonskega protivirusnega odziva in apoptotsko pot anoikis – ta pot se sproži v celicah, ki vstopajo v S-fazo celičnega cikla in ki niso pritr- jene na zunajcelični matriks; z oviranjem te poti vi- rusni beljakovini E6 in E7 dodatno usmerjata celice v maligno preobrazbo. Sposobnost vezave s tumor zavirajočo beljakovino pRB imajo tudi virusne be- ljakovine E7 nizkorizičnih genotipov HPV, vendar je njihova moč vezave v primerjavi z beljakovinami E7 visokorizičnih HPV približno stokrat manjša (1, 12, 13). Z oviranjem normalnega delovanja poglavitnih protitumorskih zaščitnikov naših celic virusni be- ljakovini E6 in E7 visokorizičnih genotipov HPV omogočata neovirano škodljivo delovanje različ- nih karcinogenih dejavnikov (E6 in E7 delujeta kot endogena mutagena) in nenadzorovano prolifera- cijo celic s poškodovano DNA, kar lahko vodi do ko- pičenja različnih sekundarnih mutacij znotraj ene ali več celic in s tem do velike nagnjenosti k nesmr- tnosti in maligni preobrazbi s HPV okuženih celic. Zgodnji genetski dogodki v procesu karcinogene- ze, posredovane s HPV, ki so povezani z indukcijo nesmrtnosti, vključujejo delecije na kromosomih 3p, 6q, 10p, 11p, 11q, 13q in 18q, pridobitve (angl. non-random gains) na kromosomih 5, 7q, 8q, 9q in 20q ter strukturne spremembe na kromosomih 10, 18 in 20. Genetske spremembe na kromosomih 3p in 6q vodijo do: • delecije genov, ki nosijo zapise za tumorje zavi- rajoče beljakovine, • reaktivacije encima telomeraze (npr. zaradi iz- gube gena za telomerazni represor) in • izmikanja virusa imunskemu odgovoru (npr. izguba genov za antigene PHK razreda I) (1). Pozni genetski dogodki v procesu karcinogeneze, ki so povezani z indukcijo celične transformacije (invazije), vključujejo: • pridobitve na kromosomu 3q, zaradi katerih se poveča število genov za strukturno podenoto hTR-encima telomeraze, • izgube na kromosomu 11, ki vodijo do delecije genov za nekatere tumorje zavirajoče beljako- vine in • epigenetske spremembe oz. hipermetilacijo promotorjev za tumor zavirajoče beljakovine, kot so TSLC1, CDH1, DAPK, FHIT, HIC-1, p16, RAR-beta, RASSF1A in TIMP-2 (1). Genetske spremembe na gostiteljskih kromoso- mih vplivajo tudi na nepravilno oz. povečano iz- ražanje celičnih onkogenov, kot so EGF-receptor, c-myc, neu/c-erb-B2, MDM2 in ras, ki tako najver- jetneje prispevajo svoj delež k nastanku malignih sprememb. Njihovo povečano izražanje je najpo- gosteje posledica pomnoževanja kromosomskih odsekov, ki nosijo zapise za te gene (1). Imunologija okužbe s HPV Imunski odgovor na okužbo s HPV je še poln ne- znank in je v primerjavi z večino ostalih virusov Zbornik predavanj, 5. izobraževalni dan programa ZORA – ZORA 2014 33 nenavadno slab in počasen, kar nakazuje na to, da so HPV evolucijsko razvili mehanizme, s katerimi se uspešno izmikajo imunskemu odgovoru. Mehani- zem imunskega izmikanja HPV temelji predvsem na oviranju učinkovite predstavitve virusnih anti- genov. HPV se namreč pomnožujejo le v zgornjih plasteh epitela kože in sluznic, pri čemer ne povzro- čajo pomembnejše celične lize oz. nekroze tkiv. Za razliko od večine drugih virusov v poteku okužbe s HPV ni viremije. Vse to zmanjšuje količino virusnih antigenov, ki so predstavljeni imunskim celicam, in obenem zagotavlja minimalno količino vnetnih signalov, ki bi lahko aktivirali imunski sistem. Ker je vnetnih citokinov premalo in ker virusni beljakovini E6 in E7 zavirata izražanje genov MIP3α, IL-8, TLR9, je pomembno motena aktivacija in migracija anti- gen predstavitvenih celic (Langerhansove celice) in posledično aktivacija limfocitov T in B. Poleg tega je izražanje najbolj imunogene beljakovine HPV, tj. velike plaščne beljakovine L1, omejeno le na do- končno diferencirane epitelne celice, ki se nahajajo v zgornjih plasteh epitela. Da bi se izognili hitremu in učinkovitemu imunskemu odgovoru, HPV moti- jo tudi signalne poti, ki jih sprožata interferona alfa in gama, ter ovirajo izražanje celične beljakovine IRF-1 (angl. interferon regulatory factor 1). Le-ta je odgovorna za prepis interferona alfa in beta ter za od interferonov spodbujeno prepisovanje celičnih genov. HPV v okuženih celicah ovirajo tudi nasta- janje polipeptidih verig molekul PHK razreda I, kar dodatno ovira proces predstavitve virusnih antige- nov. Vse skupaj vodi do relativno počasnega celič- nega in zlasti humoralnega imunskega odgovora. Po mnenju strokovnjakov se pri večini okuženih v prvih treh mesecih po okužbi najprej pojavi celični imunski odgovor proti virusnim beljakovinam E2 in E6, ki povzroči uspešno regresijo večine novona- stalih genitalnih bradavic in CIN I. Humoralni imun- ski odgovor se pojavi le nekaj mesecev kasneje in zanj je značilen zelo nizek nivo protivirusnih proti- teles anti-HPV. Ocenjeno je, da je povprečen čas od okužbe s HPV do pojava merljive količine protiteles anti-HPV v serumu (serokonverzije) 12 mesecev. Poleg tega v 18 mesecih po okužbi samo 54–69 % okuženih oseb razvije merljiv nivo protiteles proti virusni beljakovini L1. Večina strokovnjakov je pre- pričana, da so protitelesa anti-HPV, ki nastanejo po naravni okužbi, značilna za določen genotip HPV in ne ščitijo navzkrižno pred okužbo z drugimi geno- tipi HPV, za razliko od protiteles anti-HPV, spodbu- jenih s cepljenjem proti HPV. Po preboleli okužbi s HPV (merilo je izguba HPV-DNA) nivo protiteles anti-HPV z leti pada in pri pomembnem deležu inicialno anti-HPV-pozitivnih žensk po nekaj letih protitelesa izginejo iz seruma oz. njihova količina pade pod merljivi nivo. Nedavne raziskave so poka- zale, da po naravni okužbi nastala protitelesa anti- HPV ne ščitijo popolnoma pred ponovno okužbo z istim genotipom HPV. Zaenkrat ni jasno, ali je ta fenomen povezan s padcem minimalne količine protiteles, ki bi bila potrebna za dolgotrajno zaščito pred ponovno okužbo z istim genotipom skozi čas, ali s kakšnim drugi razlogom (1, 14). Reference 1. Kocjan BJ, Poljak M. Papilomavirusi. In: Poljak M, Petrovec M, eds. Medicinska virologija. Ljubljana: Medicinski razgledi; 2011. p. 41–60. 2. de Villiers EM. Cross-roads in the classifi cation of papillomaviruses. Virology 2013; 445: 2–10. 3. Rector A, Van Ranst M. Animal papillomaviruses. Vi- rology 2013; 445: 213–23. 4. Chouhy D, Bolatti EM, Pérez GR, Giri AA. Analysis of the genetic diversity and phylogenetic relationships of putative human papillomavirus types. J Gen Virol 2013; 94: 2480–8. 5. Rector A, Tachezy R, Van Ranst M.A sequence-inde- pendent strategy for detection and cloning of cir- cular DNA virus genomes by using multiply primed rolling-circle amplifi cation. J Virol 2004; 78: 4993–8. 6. Van Doorslaer K, Tan Q, Xirasagar S, Bandaru S, Go- palan V, Mohamoud Y. The Papillomavirus Episteme: a central resource for papillomavirus sequence data and analysis. Nucleic Acids Res 2013; 1: D571–8. 7. Cubie HA. Diseases associated with human papillo- mavirus infection. Virology 2013; 445: 21–34. 8. Quint W, Jenkins D, Molijn A, et al. One virus, one le- sion-individual components of CIN lesions contain a specifi c HPV type. J Pathol 2012; 227: 62–71. 9. Schiff man M, Cliff ord G, Buonaguro FM. Classifi ca- tion of weakly carcinogenic human papillomavirus types: addressing the limits of epidemiology at the borderline. Infect Agent Cancer 2009; 4: 8. 10. Poljak M, Cuzick J, Kocjan BJ, et al. Nucleic acid tests for the detection of alpha human papillomaviruses. Vaccine 2012; Suppl 30: F100-F106. 11. Cubie HA, Cuschieri K. Understanding HPV tests and their appropriate applications. Cytopathology 2013; 24: 289–308. 12. Doorbar J, Quint W, Banks L, et al. The biology and life-cycle of human papillomaviruses. Vaccine 2012; Suppl 30: F55-F70. 13. Moscicki AB, Schiff man M, Burchell A, et al. Updat- ing the natural history of human papillomavirus and anogenital cancers. Vaccine 2012; Suppl 30: F24–33. 14. Maglennon GA, McIntosh P, Doorbar J. Persistence of viral DNA in the epithelial basal layer suggests a model for papillomavirus latency following immune regression. Virology 2011; 414: 153–63.