Zdrav Var 2008; 47: 81-88
81
ODKRIVANJE NEKATERIH GENOV, POVEZANIH Z VIRULENCO, PRI SEVIH E. coli, KI POVZROČAJO ČREVESNE OKUŽBE
DETECTION OF SOME VIRULENCE RELATED GENES OF
DIARRHEAGENIC E. coli STRAINS
Marija Trkov1, Ingrid Berce2, Darja Dove~ar1, Eva Grilc1, Marina Bujko1, Alenka Kraigher1
Prispelo: 1. 10. 2007 - Sprejeto: 16. 1. 2008
Izvirni znanstveni ~lanek UDK 616.9
Izvle~ek
Namen dela: Odkrivanje virulentnih dejavnikov E. coli omogo~a bolj{e poznavanje bolezni, ki jo povzro~ajo. Zato smo preiskali dolo~eno {tevilo sevov E. coli, osamljenih iz vzorcev iztrebkov bolnikov, na prisotnost nekaterih genov, povezanih z virulenco teh bakterij in ugotavljali sposobnost izdelave verocitotoksinov VT1 in VT2. Preiskovane seve so osamili v letu 2006 v ljubljanski in novogori{ki regiji.
Metode: Z metodo »multipli« PCR (mPCR) smo odkrivali naslednjih {est genov, povezanih z virulenco E. coli: ipaH, eltA, estA, eae, vtx1 in vtx2. Sposobnost izdelave verocitotoksinov VT1 in VT2 smo ugotavljali z reverzno pasivno aglutinacijo lateksa.
Rezultati: Pri {estih od 42 preiskovanih sevov E. coli smo na{li vsaj en dejavnik, povezan z virulenco. Pri vseh smo ugotovili prisotnost gena za intimin (eae), pripadali pa so naslednjim serolo{kim skupinam: O26, O128, O145 in O157. Pri treh sevih, pri katerih smo ugotovili prisotnost gena za intimin, smo ugotovili tudi prisotnost genov za verotoksine (vtx1 ali vtx2). Dva med njimi sta pripadala serolo{ki skupini O26, eden pa O157. En sev serolo{ke skupine O26 je izdeloval VT1, en sev O26 in en sev O157 pa sta izdelovala VT2. Pri drugih preiskovanih sevih nismo ugotovili sposobnosti izdelovanja omenjenih toksinov. Prisotnosti genov ipaH, eltA in estA nismo ugotovili pri nobenem preiskovanem sevu.
Zaklju~ek: S to raziskavo smo ugotovili, da v novogori{ki in ljubljanski regiji kro‘i dokaj nizko {tevilo sevov E. coli, ki imajo gene za verocitotoksine oziroma so jih sposobni izdelovati. Za splo{no oceno bi bilo potrebno nadaljevati s preiskovanjem ve~jega {tevila sevov z razli~nih podro~ij Slovenije, raziskavo pa bi bilo smiselno raz{iriti na odkrivanje tudi drugih virulentnih dejavnikov.
Klju~ne besede: »multipli« PCR, virulentni dejavniki, Escherichia coli, ~revesne oku‘be
Original scientific article UDC 616.9
Abstract
Aim: Identification of E. coli virulence factors improves our understanding of the disease they cause. Different E. coli strains isolated from patient stool samples were examined for the presence of some virulence-related genes of these bacteria, and for their ability to produce verocytotoxins VT1 and VT2. The samples were obtained from patients in the Ljubljana and Nova Gorica regions in 2006.
Methods: We used the multiplex PCR (mPCR) method, which allows detection of six different virulence genes, i.e. ipaH, eltA, estA, eae, vtx1 and vtx2. The ability to produce verocytotoxins VT1 and VT2 was tested using the reverse passive latex agglutination method.
1In{titut za varovanje zdravja Republike Slovenije, Trubarjeva 2, 1000 Ljubljana 2Zavod za zdravstveno varstvo Nova Gorica, Vipavska cesta 13, 5000 Nova Gorica Kontaktni naslov: e-po{ta: marija.trkov@ivz-rs.si
82
Zdrav Var 2008; 47
Results: In six of the 42 E. coli strains examined, at least one virulence factor was identified. The presence of gene eae was confirmed in all six strains belonging to serogroups O26, O128, O145 and O157. Three intimin-positive strains were positive for vtx1 or vtx2 genes. Two strains belonged to serogroup O26 and one to serogroup O157. VT1 production was detected in one serogroup O26 strain, while one serogroup O26 strain and one serogroup O157 strain showed the ability to produce VT2. In the rest of the strains tested no verocytotoxin production was detected. All strains examined were negative for the genes ipaH, eltA and estA.
Conclusion: The study showed limited circulation of E. coli strains with verocytotoxin genes and of strains able to produce verocytotoxins in the Nova Gorica and Ljubljana regions. In order to get a larger-scale estimate, a larger number of strains from different geographical regions of Slovenia will have to be tested, and research will have to be expanded to include identification of other potential virulence factors.
Key words: multiplex PCR, virulence factors, diarrheagenic Escherichia coli
1 Uvod
Bakterije iz rodu Escherichia, ki obsega pet vrst, so po Gramu negativne, oksidaza negativne, gibljive ali negibljive pal~ke. Vrsta E. coli je del normalne ~revesne flore ljudi in ‘ivali. Ve~ina sevov E. coli je nepatogenih, ob zmanj{ani odpornosti gostitelja, pomanjkljivem imunskem odzivu ali ob vstopu v telesne predele, kjer obi~ajno ni mikrobov, pa lahko povzro~ajo oportunisti~e oku‘be (1, 2). Zaradi {tevilnih virulentnih dejavnikov lahko nekateri sevi povzro~ajo razli~ne bolezni, kot so driska, meningitis in oku‘be se~il, ki so najpogostej{e zunaj~revesne oku‘be (3). Seve, ki povzro~ajo ~revesne oku‘be, delimo v razli~ne skupine predvsem glede na klini~no sliko bolezni, ki jo povzro~ajo, in specifi~ne virulentne dejavnike. Te skupine so: enteropatogene E. coli (EPEC), enterotoksigene E. coli (ETEC), enteroinvazivne E. coli (EIEC), enteroagregativne E. coli (EAggEC), difuzno adherentne E. coli (DAEC) in E. coli, ki izdelujejo [igove toksine (STEC) ali verocitotoksine (VTEC). Med slednje sodijo tudi enterohemoragi~ne E. coli (EHEC) (4, 2). Enteropatogene E. coli (EPEC) povzro~ajo histopatolo{ke spremembe ~revesnega epitela, vendar ne izdelujejo verotoksinov (4, 2). Povzro~ajo vodeno drisko, ki jo lahko spremljajo vro~ina, slabost, bruhanje, pomanjkanje teka, dehidracija in izguba telesne te‘e. Iztrebek lahko vsebuje sluz, vendar je brez krvi (5). Med enteropatogene E. coli lahko sodijo naslednje O-serolo{ke skupine O26, O55, O86, O88, O103, O111, O114, O119, O125ac O126, O127, O128ab, O142, O145, O157, O158 (2). Verotoksigene E. coli
(VTEC) izdelujejo verotoksine VT1 ali VT2, nekateri sevi pa lahko izdelujejo obe skupini verotoksinov. Podobni so [igovim toksinom, ki jih izdeluje Shi-gella dysenteriae tipa 1 (2). V to skupino sodi nad 100 razli~nih serotipov, najpogostej{e O-serolo{ke skupine pa so O157, O6, O26, O91, O103, O111, O113, O117, O118, O121, O128, O145 (6, 7). Vir so razli~ne, pogosto zdrave doma~e ‘ivali, zlasti govedo. Z iztrebki oku‘enih ‘ivali se {irijo v okolje, v vodo, na zelenjavo in sadje (7). Rezultati raziskave iz leta 1997 so pokazali, da je bilo v Sloveniji govedo naravni vir verotoksigenih E. coli, saj so jih dokazali v 20,4 % vzorcev rektalnih brisov govedi. Med njimi je bila ob~asno prisotna E. coli O157 (8). Klini~ni znaki bolezni so vodena, lahko tudi krvava driska, ki jo pogosto spremljajo bole~ine v trebuhu, pa tudi slabost, bruhanje in povi{ana telesna temperatura. V~asih pride zlasti pri otrocih in starej{ih do nevarnega zapleta, hemoliti~no uremi~nega sindroma (HUS) (6). Enterotoksigene E. coli (ETEC) izdelujejo toplotno labilne (LT) ali pa toplotno stabilne (ST) enterotoksine, nekateri sevi pa izdelujejo obe skupini enterotoksinov (9, 2). Klini~ni znaki bolezni so obilna vodena, v~asih pa le blaga driska, kr~i v trebuhu, lahko vro~ina, slabost, bruhanje, izguba teka, glavobol, bole~ine v mi{icah (9). Med enterotoksigene E. coli lahko sodijo O6, O8, O25, O78, O153, O128, O86 in druge O-serolo{ke skupine (2). Enteroinvazivne E. coli (EIEC) so sorodne {igelam, obi~ajno povzro~ajo vodeno drisko, v~asih dizenterijo in kolitis. Njihova zna~ilnost je, da vstopijo v epitelne celice, se v njih razmno‘ujejo, potujejo v citoplazmi in prehajajo v sosednje celice (4). Za enteroagregativne E. coli
Trkov M. et al. Odkrivanje nekaterih genov, povezanih z virulenco, pri sevih E. coli, ki povzro~ajo ~revesne oku‘be
83
(EAggEC) je zna~ilno, da se na celice ~revesne sluznice pritrjujejo v zna~ilnem vzorcu, bakterije se povezujejo tudi med seboj, povzro~ajo pa dolgotrajno drisko. Izdelujejo nekatere enterotoksine in citotoksine (4).
Pri E. coli so virulentni dejavniki, ki povzro~ajo diarejo, {tevilni in zelo razli~ni, mnogi med njimi se pojavljajo pri razli~nih skupinah. Njihovo prepoznavanje nam omogo~a bolj{o diagnostiko bolezni, ki jo povzro~ajo, kot to omogo~a zgolj serolo{ko diagnosti~no tipiziranje glede na O-somatske antigene. Zato je bil namen naloge preiskati dolo~eno {tevilo sevov E. coli, ki so jih osamili v letu 2006 iz iztrebkov bolnikov v novogori{ki in ljubljanski regiji, na prisotnost nekaterih genov, povezanih z virulenco teh bakterij in ugotavljati sposobnost izdelave verocitotoksinov VT1 in VT2.
2 Materiali in metode
Pridobivanje epidemiolo{kih podatkov: V skladu z Zakonom o nalezljivih boleznih (Ur. l. RS {t. 69/1995) in Pravilnikom o prijavi in ukrepih za obvladovanje nalezljivih bolezni (Ur. l. RS {t. 16/1999) so zdravniki dol‘ni prijavljati gastroenterokolitise, ki jih povzro~a E. coli, v roku treh dni po postavitvi diagnoze. Nalezljive bolezni prijavijo na standardnem obrazcu (Obr. {t. 8,163) – Prijava obolenja – smrti za nalezljivo boleznijo. Prijavnice po{ljejo na obmo~ne zavode za zdravstveno varstvo. Ta m jih registrirajo z nacionalnim ra~unalni{kim programom Survival 5.00 po ustaljenem postopku.
Bakterijski sevi: V {tudijo smo vklju~ili 42 sevov E. coli razli~nih O-serolo{kih skupin, 16 sevov so osamili v Zavodu za zdravstveno varstvo Nova Gorica, 26 sevov pa v Centru za nalezljive bolezni, In{tituta za varovanje zdravja Republike Slovenije. Vse seve so osamili iz iztrebkov bolnikov v letu 2006 po klasi~nih bakteriolo{kih metodah, O-serolo{ke skupine pa so bile dolo~ene po navodilih proizvajalcev antiserumov (Imunolo{ki zavod Zagreb, Hrva{ka; Sifin, Nem~ija; Statens Serum Institut, Danska). Pomno‘evanje v »multipli« veri‘ni reakciji s polimerazo (mPCR): Tar~no DNK smo pripravili tako, da smo do 10 kolonij E. coli, zraslih na trdnem goji{~u, suspendirali v 200 µl 10% Chelex-100 (Sigma, ZDA) v 1 x pufru TE. Suspenzijo smo segrevali 5 min pri 100oC, centrifugirali 5 min pri 2200 x g, nato pa 15 µl supernatanta prenesli v 100 µl 1x pufra TE, 8 µl tako red~enega supernatanta smo
uporabili za »multipli PCR«. Z me{anico za~etnih oligonukleotidov »DEC Primer Mix« smo, po navodilu proizvajalca (Statens Serum Institut, Danska), ugotavljali prisotnosti naslednjih genov, povezanih z virulenco E. coli: ipaH (povezan z invazivnostjo), eltA (toplotno labilen enterotoksin), estA (toplotno stabilen enterotoksin), eae (intimin), vtx1 (verotoksin 1) in vtx2 (verotoksin 2). Omenjena me{anica je vsebovala tudi za~etne oligonukleotide za prepoznavanje dela gena za 16S rDNK (notranja kontrola PCR). Reakcijska me{anica za pomno‘evanje v veri‘ni reakciji s polimerazo je poleg tar~ne DNK vsebovala {e: 5 µl 10x pufra PCR, 3,5 µl 50mM MgCl2, 8 µl me{anice dNTP (vsakega 1,25 mM) (Applied Biosystems, ZDA), 4 µl me{anice za~etnih oligonukleotidov (Statens Serum Institut, Danska), 0,4 µl 5 U/ µl polimeraze DNK Platinum Taq (Invitrogen, ZDA) in 11 µl vode (Sigma, ZDA). Pomno‘evanje s PCR je potekalo po naslednji shemi: dveminutni za~etni denaturaciji DNK pri 95o C je sledilo 35 ciklov (50 sekundna denaturacija pri 94o C, 40 sekundno prileganje za~etnih oligonukleotidov pri 62o C, 50 sekundno podalj{evanje pri 72o C) in tri minutno podalj{evanje pri 72o C. Za pomno‘evanja s PCR smo uporabili cikli~ni termostat Eppendorf (Nem~ija). Ob vsakem pomno‘evanju preiskovane DNK smo pomno‘evali tudi dve kontrolni me{anici DNK E. coli, ki sta vsebovali gene za eae, vtx1 in vtx2 ter ipaH, eltA in estA (Statens Serum Institut, Danska).
Agarozna gelska elektroforeza: Pomno‘ke PCR smo pregledovali v 1,5 – 2,0 % 0,5 x TBE (Sigma, ZDA) agaroznih gelih.
Sposobnosti izdelave verotoksinov VT1 in VT2: Pri vseh sevih E. coli smo jo ugotavljali z reverzno pasivno aglutinacijo lateksa s testom VTEC – RPLA, po navodilu proizvajalca (Oxoid, Velika Britanija). Preiskovan sev E. coli smo nacepili na trdno po{evno goji{~e BHI (Merck, ZDA) in ga po inkubaciji preko no~i pri 37oC, suspendirali v 0,85-odstotni raztopini natrijevega klorida s polimiksinom B. Tako pripravljen vzorec smo inkubirali 30 min pri 37oC in ga nato centrifugirali 20 minut pri 4° C in 4000 obratih/min. ^e je bil v supernatantu prisoten verocitotoksin VT1 in / ali VT2, je le-ta aglutiniral z delci lateksa, na katere so vezana specifi~na protitelesa bodisi za verocitotoksin VT1 bodisi za verocitotoksin VT2. Test smo izvedli na mikrotitrski plo{~ici, rezultate pa od~itali po inkubaciji preko no~i na sobni temperaturi. Prisotnost verocitotoksinov se opazi kot motnost na dnu jamice, ~e pa ti niso prisotni, je na dnu opazna kompaktna tvorba.
84
Zdrav Var 2008; 47
3 Rezultati
V Tabeli 1 so prikazani prijavljeni primeri ~revesnih oku‘b, povzro~enih z E. coli, po posameznih mesecih od leta 1997 do leta 2006. Najve~ oku‘b je bilo v toplej{ih mesecih leta, predvsem avgusta in septembra, nekoliko manj pa maja, junija in julija. V Sloveniji so E. coli na tretjem mestu med bakterijskimi povzro~itelji ~revesnih nalezljivih bolezni (10).
Zanimala nas je prisotnost virulentnih dejavnikov pri sevih E. coli, osamljenih iz iztrebkov bolnikov. Zato smo preiskali 42 sevov, nekateri so bili osamljeni v novogori{ki, nekateri pa v ljubljanski regiji, v letu 2006. Pripadali so 15 razli~nim O-serolo{kim skupinam, ki so navedene v Tabeli 2. Enega ali ve~ genov, povezanih z virulenco E. coli, smo odkrili pri {estih od 42 preiskovanih izoliranih sevov. Pripadali so {tirim razli~nim O-serolo{kim skupinam in sicer O26, O128, O145 in O157. Preiskali smo pet sevov E. coli O26, pri treh smo odkrili gen za intimin (eae). Pri dveh sevih, izoliranih v ljubljanski regiji, smo poleg gena za intimin, odkrili {e gen za verotoksin, pri enem za verotoksin 1 (vtx1), pri enem pa za verotoksin 2 (vtx2). Pri obeh sevih smo ugotovili tudi sposobnost
izdelave verotoksinov VT1 oziroma VT2. Pri sevu, ki je imel le gen za intimin (novogori{ka regija), sposobnosti izdelave verotoksinov nismo ugotovili. Pri dveh sevih E. coli O26 nismo odkrili niti genov, povezanih z virulenco, niti sposobnosti izdelave verotoksinov (Tabela 3). Prisotnost gena za intimin smo ugotovili tudi pri enem od dveh sevov serolo{ke skupine O128, ki sta bila izolirana v novogori{ki regiji in enem od treh testiranih sevov O145. Vsi trije sevi so bili izolirani v novogori{ki regiji. Verotoksinov VT1 ali VT2 ni izdeloval noben od omenjenih izolatov. Pri enem od dveh preiskovanih sevov O157 smo ugotovili prisotnost genov za intimin in verotoksin 2. Ta sev je tudi izdeloval verotoksin VT2 (Tabela 3), izoliran pa je bil v novogori{ki regiji. Pri preostalih 30 testiranih sevih nismo ugotovili niti sposobnosti izdelave verotoksinov VT1 in/ali VT2 niti genov eae, vtx1, vtx2. Prisotnosti genov ipaH, eltA in estA z uporabljeno metodo nismo odkrili pri nobenem od 42 preiskovanih sevov E. coli. Slika 1 prikazuje prisotnost preiskovanih genov, ki smo jih na{li pri petih sevih E. coli, in kontrolni DNK. Glede sposobnosti izdelovanja verotoksinov VT1 in / ali VT2 z metodo RPLA in prisotnosti genov vtx1 in / ali vtx2
Tabela 1. Prijavljeni primeri oku‘b, povzro~enih z E. coli, po mesecih v Sloveniji, od leta 1997 do leta 2006. Table 1.   E. coli infections notified in Slovenia during the period 1997-2006, by months.
LETO/ MESEC YEAR/ MONTH	JAN	FEB	MAR	APR	MAJ	JUN	JUL	AVG	SEP	OKT	NOV	DEC	SKUPAJ	Incidenca/ 100000 prebivalcev Rate per 100,000 population
1997	0	5	4	4	3	7	12	15	16	13	11	5	95	4,8
1998	5	10	12	16	14	14	20	16	13	13	27	17	177	9,0
1999	20	19	32	30	31	35	19	27	37	32	25	24	331	16,7
2000	22	22	32	10	31	13	19	17	21	17	16	13	233	11,8
2001	21	18	10	17	17	18	16	23	12	12	18	16	198	10,1
2002	14	6	11	9	12	24	18	13	8	19	8	10	152	7,6
2003	12	9	12	24	19	11	14	18	25	11	9	5	169	8,5
2004	17	19	11	8	12	15	14	14	9	14	7	13	153	7,7
2005	9	9	12	4	6	15	13	17	13	9	4	6	117	5,9
2006	6	4	6	8	15	15	6	14	19	12	9	7	121	6,0
SKUPAJ TOTAL	126	121	142	130	160	167	151	174	173	152	134	116	1746	
Trkov M. et al. Odkrivanje nekaterih genov, povezanih z virulenco, pri sevih E. coli, ki povzro~ajo ~revesne oku‘be
85
Tabela 2. [tevilo preiskanih sevov E. coli po posameznih O-serolo{kih skupinah. Table 2.   The number of E. coli strains tested, by O-serogroups.
O-serološka skupina O-serogroup	Število preiskanih sevov No. of strains tested	% preiskanih sevov % of strains tested
02	5	11,9
026	5	11,9
01	4	9,5
06	4	9,5
0103	4	9,5
04	3	7,1
075	3	7,1
0145	3	7,1
018	2	4,8
091	2	4,8
0128	2	4,8
0157	2	4,8
05	1	2,4
015	1	2,4
086	1	2,4
Skupaj Total	42	100
z uporabljenim »multiplim« PCR smo pri vseh preiskovanih sevih ugotovili enake rezultate.
4 Razprava
E. coli, ki povzro~ajo oku‘be prebavil, sodijo v razli~ne skupine, predvsem glede na klini~no sliko bolezni, ki jo povzro~ajo, in specifi~ne virulentne dejavnike. Ti so {tevilni in zelo razli~ni. Nekateri so skupni razli~nim skupinam E. coli, ki povzro~ajo drisko, pa tudi drugim skupinam E. coli, ki povzro~ajo zunaj~revesne oku‘be. Zapisi za posamezne virulentne dejavnike so pogosto na mobilnih genetskih elementih, kot so plazmidi in bakteriofagi. Prepoznavanje specifi~nih virulentnih
dejavnikov nam omogo~a bolj{o diagnostiko bolezni, ki jo E. coli povzro~ajo, kot nam to omogo~a serolo{ko tipiziranje glede na O-somatske antigene. Zato je bil namen tega dela preiskati seve E. coli razli~nih O-serolo{kih skupin, ki so jih osamili iz vzorcev iztrebkov bolnikov, na prisotnost nekaterih virulentnih dejavnikov. Uporabljeni »multipli PCR« in me{anica za~etnih oligonukleotidov omogo~ajo odkrivanje {estih genov, ipaH, eltA, estA, eae, vtx1 in vtx2, povezanih z virulenco E. coli, ki povzro~ajo diarejo (11). Gen ipaH je prisoten pri enteroinvazivnih E. coli pa tudi pri nekaterih {igelah. Gena eltA in estA kodirata toplotno labilni (LT) in toplotno stabilni (ST) enterotoksin enterotoksigenih E. coli (ETEC). Te lahko izdelujejo le
86
Zdrav Var 2008; 47
Tabela 3. O-serolo{ke skupine, izdelava verotoksinov VT1 / VT2 in prisotnost genov, povezanih z virulenco,
pri sevih E. coli. Table 3.   O-serogroups, production of VT1/VT2 verocytotoxins and presence of virulence-related genes in
E. coli strains.
0-serološka skupina 0-serogroup	Verotoksin Verocytotoxin		Prisotnost preiskovanih genov Presence of genes tested	O-serološka skupina 0-serogroup	Verotoksin Verocytotoxin		Prisotnost preiskovanih genov Presence of genes tested
	VT1	VT2			VT1	VT2	
01*				026			—
01*				026			—
01*				026			eae
01*				026*	+		eae, vfrl
02*				026*		+	eae, vtx2
02*				075			—
02*				075			—
02*				075			—
02*				086*			—
04*				091			—
04*				091*			—
04*				O103			—
05*				O103			—
06*				O103			—
06*				0103*			—
06*				0128			—
06*				0128			eae
015*				0145			—
018*				0145			—
018*				0145			eae
0157*				0157		+	eae, vtx2
Legenda:
*; sevi, ki so jih osamili v ljubljanski regiji, seve brez oznake so osamili v novogoriški regiji,
* strains isolated in the Ljubljana region; other strains were isolated in the Nova Gorica region
_; sev ni izdeloval verotoksina, +; sev je izdeloval verotoksin
_; strain unable to produce verocytotoxin, +; verocytotoxin producing strain
_; preiskovani geni, povezani z virulenco E. coli, niso bili odkriti
j,the virulence-related genes ofE.coli tested were not detected
Trkov M. et al. Odkrivanje nekaterih genov, povezanih z virulenco, pri sevih E. coli, ki povzro~ajo ~revesne oku‘be
87
>600 bp vtx2
eae
vtx\
16SrDNK ipaH
eltA
estA
Slika 1. Elektroforeza pomno‘kov mPCR: proga 1: sev E. coli O26 (vtx1, eae), proga 2: kontrola 1 (vtx1, eae, vtx2), proga 3: velikostni standard DNK (100 bp, Invitrogen, ZDA), proga 4: kontrola 2 (estA, eltA, ipaH), proga 5: sev E. coli O26 (eae, vtx2), proga 6: kontrola 1(vtx1, eae, vtx2), proga 7: sev E. coli O157 (eae, vtx2), proga 8: sev E. coli O103, proga 9: kontrola 2 (estA, eltA, ipaH), proga 10: kontrola 1 (vtx1, eae, vtx2), proga 11: sev E. coli O145 (eae), proga 12: sev E. coli O128 (eae), proga 13: kontrola 1 (vtx1, eae, vtx2).
Figure 1. Electrophoresis of the mPCR products: track 1: E.coli O26 ((vtx1, eae) strain; track 2 : control 1 (vtx1, eae, vtx2)); track 3: DNA size standard (100 bp, Invitrogen, USA); track 4; control 2 (estA, eltA, ipaH), track 5: E. coli O26 (eae, vtx2) strain; track 6: control 1 ((vtx1, eae, vtx2), track 7: E. coli O157 (eae, vtx2) strain, track 8: E. coli O103 strain; track 9: control 2 ((estA, eltA, ipaH); track 10: control 1 (vtx1, eae, vtx2); track 11: E. coli O145 (eae) strain; track 12: E. coli O128 (eae) strain; track 13: control 1(vtx1, eae, vtx2).
enega od obeh ali pa oba enterotoksina (9, 4). Vendar pri nobenem od 42 preiskovanih sevov E. coli nismo ugotovili prisotnosti omenjenih genov, ~eprav so nekateri pripadali O-serolo{kim skupinam, ki lahko sodijo med enterotoksigene E. coli (2). Sevi EIEC in ETEC so v industrijsko razvitih dr‘avah redkeje prisotni (12), nasprotno pa so v dr‘avah v razvoju zlasti enterotoksigene E. coli pogoste povzro~iteljice driske pri majhnih otrocih (9). Gen eae nosi zapis za adhezin intimin, ki sodeluje pri pritrjevanju enteropatogenih (EPEC) in nekaterih verotoksigenih E. coli na celice epitela ~revesne sluznice (12, 5). Ugotovili smo ga pri {estih sevih, ki so pripadali naslednjim O-serolo{kim skupinam: O26, O128, O145 in O157. Geni vtx1 in vtx2 nosijo zapis za verocitotoksine VT1 in VT2 pri enterohemoragi~nih (EHEC) in drugih verotoksigenih E. coli (VTEC) (6). Nekateri verotoksigeni sevi izdelujejo le verotoksine 1, nekateri verotoksine 2, nekateri pa obe skupini verotoksinov (13, 6). V {tudiji, ki so jo izvedli na Irskem in je vklju~evala 207 sevov VTEC, izoliranih od leta 2002 – 2004, so ugotovili, da je 89 % sevov pripadalo serolo{ki skupini O157, 7,2 % serolo{ki skupini O26, posamezni sevi pa so pripadali serolo{kim
skupinam O103, O146, O145 in O111 (14). V na{i raziskavi smo ugotovili zapis za verotoksine kakor tudi sposobnost izdelave le-teh pri treh sevih, dva sta pripadala serolo{ki skupini O26, eden pa O157. Vsi trije sevi so izdelovali le eno od obeh skupin verotoksinov, vsi pa so imeli tudi gen za intimin. Ve~jo verjetnost za nastanek hemoliti~no-uremi~nega sindroma raziskovalci pripisujejo oku‘bam s sevi E. coli, ki so sposobni izdelovati VT2 (6) in imajo gen za intimin (15). V skupino verotoksigenih E. coli sodi veliko {tevilo razli~nih serotipov, mnogi med njimi pa so bili izolirani iz klini~nih vzorcev bolnikov s hemoliti~no-uremi~nim sindromom (2). Zato smo v raziskavo vklju~ili tudi seve O-serolo{kih skupin O1, O2, O4, O5, O15 in O18, saj bi lahko {lo za morebitne verotoksigene seve (2, 16, 17). Vendar pri nobenem sevu omenjenih O-serolo{kih skupin nismo ugotovili prisotnosti genov za verotoksine niti sposobnosti za izdelavo le-teh. Za zaklju~ek naj omenimo dve {tudiji, ki sicer nista povsem primerljivi z na{o, a ka‘eta na pomembnost odkrivanja E. coli in prepoznavanja njihovih virulentnih dejavnikov. V {tudiji, ki so jo izvajali na Danskem od marca 2000 do decembra 2001 in je zajela 424 otrok z drisko, mlaj{ih
88
Zdrav Var 2008; 47
od 5 let, so ugotovili prisotnost VTEC v 11 primerih, klasi~nih EPEC v 10, EAggEC pa v 11 primerih. Vendar so bile slednje prisotne tudi v kontrolni skupini zdravih ljudi, zato ni nujno, da so povzro~ile drisko pri bolnikih (18). E. coli je bila povzro~iteljica driske pri skoraj 30 % od 280 otrok, mlaj{ih od 5 let, ki so bili hospitalizirani od decembra 2005 do februarja 2006 v Tanzaniji. Pri 41 bolnikih so izolirali enteroagregativne E. coli, pri 13 enteropatogene, pri 10 enterotoksigene, enterohemoragi~nih in enteroinvazivnih sevov pa niso osamili (19).
5 Zaklju~ek
Preiskovani sevi so pripadali 15 razli~nim O-serolo{kim skupinam. Pri {estih sevih, ki so pripadali {tirim razli~nim O-serolo{kim skupinam (O26, O128, O145 in O157), smo na{li vsaj en virulentni dejavnik. Prisotnost gena za intimin (eae) smo ugotovili pri treh sevih O26, od tega pri dveh sevih tudi gena za vtx1 ali vtx2, pri katerih smo ugotovili tudi sposobnost izdelave verotoksinov VT1 ali VT2. Prisotnost gena eae smo ugotovili pri enem sevu O128, ter pri enem sevu O145. Pri enem sevu O157 smo ugotovili prisotnost gena eae in vtx2 ter sposobnost izdelave verotoksina VT2. Genov ipaH, eltA, estA nismo ugotovili pri nobenem preiskovanem sevu E. coli. S to {tudijo smo odkrili, da v novogori{ki in ljubljanski regiji kro‘i dokaj nizko {tevilo sevov E. coli (3 od 42), ki imajo gene za verocitotoksine oziroma so jih sposobni izdelovati. Za podajo splo{ne ocene glede prisotnosti virulentnih dejavnikov pri patogenih ~revesnih sevih E. coli bi bilo potrebno nadaljevati s preiskovanjem ve~jega {tevila sevov z razli~nih podro~ij Slovenije. V raziskovanje bi bilo potrebno vklju~iti odkrivanje tudi drugih virulentnih dejavnikov, ki so pri patogenih sevih E. coli {tevilni in zelo razli~ni.
Literatura
1.    Koren S, Ihan A, Gubina M. Patogeneza in {irjenje bakterijskih oku‘b. In: Gubina M, Ihan A, editors. Medicinska bakteriologija z imunologijo in mikologijo. Ljubljana. Medicinski razgledi, 2002: 65-73.
2.    Scheutz F, Strockbine NA. Escherichia. In: Brenner DJ, Krieg NR. Staley JT, Garrity GM, editors. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. 2nd ed. New York: Springer, 2005: 607-24.
3.    Andlovic A. Escherichia coli. In: Gubina M, Ihan A, editors. Medicinska bakteriologija z imunologijo in mikologijo, Ljubljana, Medicinski razgledi, 2002: 65-73.
4.    Kaper JB, Nataro J P, Mobley HLT. Pathogenic Escherichia coli. Nature reviews, Microbiol 2004; 2: 123-40.
5.    Blank TE, Nougayrede J P, Donnenberg MS. Enteropathogenic Escherichia coli. In: Donnenberg MS, editor. Escherichia coli. Virulence mechanisms of a versatile pathogen. San Diego: Academic Press, 2002: 81-118.
6.    Thorpe CM, Ritchie JM, Acheson DWK. Enterohemorragic and other Shiga toxin-producing Escherichia coli. In: Donnenberg MS, editor. Escherichia coli. Virulence mechanisms of a versatile pathogen. San Diego: Academic Press, 2002: 119-54.
7.    Verocytotoxigenic Escherichia coli. In: World Organization for Animal Health: OIE Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds and bees). 5th ed., vol II, O.I.E., Paris, 2004: 1127-37.
8.    Breznik B. Enterohemoragi~ni tipi bakterije E. coli pri govedu in toplotno neobdelanih mesninah v Sloveniji. Magistrska naloga. Ljubljana: Veterinarska fakulteta, 1997.
9.    Elsinghorst EA. Enterotoxigenic Escherichia coli. In: Donnenberg MS, editor. Escherichia coli. Virulence mechanisms of a versatile pathogen. San Diego: Academic Press, 2002: 155-87.
10.  In{titut za varovanje zdravja Republike Slovenije. Poro~ilo o nalezljivih boleznih, 2005: 36-8.
11.  Persson S, Olsen KE, Scheutz F, Krogfelt KA, Gerner-Smidt P. A method for fast and simple detection of major diarrhoeagenic Escherichia coli in the routine diagnostic laboratory. Clin Microbiol Infect 2007; 13: 516-24.
12.  Cleary J, Ali LC, Shaw RK, Straatman-Iwanowska A, Donnenberg S, Frankel G, Knutton S. Enteropathogenic Es-cherichia coli (EPEC) adhesion to intestinal epithelial cells: role of bundle-forming pili (BFP), EspA filaments and intimin. Microbiol 2004: 150: 527-38.
13.  Reischl U, Youssef MT, Kilwinski J, Lehn N, Zhang WL, Karch H et al. Real-time fluorescence PCR assays for detection and characterization of Shiga toxin, intimin, and enterohemolysin genes from Shiga toxin-producing Escherichia coli. J Clin Microbiol 2002; 40: 2555-65.
14. Carroll AM, Gibson A, McNamara EB. Laboratory-based surveillance of human verocytotoxigenic Escherichia coli infection in the Republic of Ireland, 2002 – 2004. J Med Microbiol 2005; 54:1163-69.
15.  Karmali MA, Mascarenhas M, Shen S, Ziebell K, Johnson S, Reid-Smith R et al. Association of genomic O island 122 of Escherichia coli EDL 933 with Verocytotoxin-producing Es-cherichia coli seropathotypes that are linked to epidemic and/ or serious disease. J Clin Microbiol 2003; 41: 4930-40.
16.  Bettelheim KA. Serotypes of VTEC. Pridobljeno 30.8.2007 s spletne strani: http:/www.microbionet.com.au/vtectable.html.
17.  Bopp CA, Brenner FW, Fields PI, Wells JG, Strockbine NA. Escherichia, Shigella, and Salmonella. In: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, Yolken RH, editors. Manual of clinical microbiology. 8th ed. Washington: ASM Press, 2003: 654-71.
18.  Olsen B, Neimann J, Böttiger B, Ethelberg S, Schiellerup P, Jensen C et.al. Etiology of diarrhea in young children in Denmark: a case-control study. J Clin Microbiol 2005; 43: 3636-41.
19.  Moyo SJ, Maselle SY, Matee MI, Langeland N, Mylvaganam H. Identification of diarrheagenic Escherichia coli isolated from infants and children in Dar es Salaam, Tanzania. BCM Infect Dis 2007, 7: 92.