Pregledni œlanki - Review Articles
Ciljan vnos uœinkovin z uporabo lektinov – korak naprej v razvoju bioadhezivnih dostavnih sistemov
Lectin-mediated drug delivery – a step forward in development of bioadhesive drug delivery systems
Petra Kocbek, Julijana Kristl
Povzetek: Razvoj novih sistemov za dostavo uœinkovin je dandanes velik izziv farmacevtske tehnologije. Sodoben in obetajoœ pristop predstavlja uporaba lektinov. Lektini so proteini ali glikoproteini, ki imajo v strukturi vsaj eno domeno s katero prepoznajo in se reverzibilno veæejo na specifiœni mono- ali oligosaharid. Interakcije med lektini in sladkorji so specifiœne, saj jih lahko primerjamo z interakcijami encim–substrat ali antigen–protitelo. Za dostavo uœinkovin imajo velik pomen bioprepoznavne lastnosti lektinov, ki interagirajo s specifiœnimi sladkorji glikoproteinov mukusa ali glikokaliksa celic in vodijo do mukoadhezije, citoadhezije in/ali citoinvazije. Tako predstavlja uporaba lektinov moænost ciljanega dostavljanja uœinkovin v tarœne celice in tkiva po razliœnih poteh dajanja (oralno, peroralno, pulmonalno, okularno). Uporaba lektinov nudi perspektivno moænost za dostavo proteinskih uœinkovin, vakcin in terapevtskih genov. Ciljanje doseæemo tako, da pripravimo konjugate uœinkovine z lektini tj. lektinizirano predzdravilo, ali pa modificiramo povrøino nanodelcev, mikrosfer ali liposomov tako, da nanje pripnemo molekule lektina. Kljub øtevilnim prednostim lektinov, pa moramo biti pri izbiri lektinov za dostavo uœinkovin pozorni na toksiœnost in imunogenost doloœenih lektinov.
Kljuœne besede: lektini, bioadhezija, ciljano dostavljanje, predzdravila, nosilni sistemi
Abstract: Very promising and up-to-date approach in development of new drug delivery systems represents an application of lectins. Lectins are proteins or glycoproteins which have in structure at least one carbohydrate recognition-domain that is capable to bind reversibly to specific mono- or oligosaccharide. Interactions between lectins and sugars are highly specific, comparable to those between the enzyme and substrate, or antigen and antibody. Great importance of lectins in bioadhesive drug delivery arises from their biorecognition properties making them possible to interact with specific sugars in the mucus or cell glycocalix, leading to the mucoadhesion, citoadhesion and/or citoinvasion. Furthermore, lectins can be used as ligand molecules directing various delivery systems to specific cells and tissues following different routes of application such as oral, peroral, pulmonal, or ocular. They offer possibility for delivery of protein drugs, vaccines and therapeutic genes. Targeting can be achieved by conjugating lectins to specific drugs (lectinized prodrugs) or attaching them to the surface of nanoparticles, microsferes or liposomes. Despite many advantages lectins should be used by caution since some of them might attest with toxicity or immunogenicity.
Keywords: lectins, bioadhesion, drug targeting, prodrugs, carrier systems
1 Uvod
Zaœetki lektinologije segajo v leto 1888, ko je Stillmark ugotovil, da izvleœek iz ricinusovih semen povzroœi aglutinacijo eritrocitov (1). Nato so snovi s podobno bioloøko aktivnostjo, ki so jih izolirali iz rastlin, poimenovali hemaglutinini (2). Ko so opazili, da nekateri hemaglutinini selektivno aglutinirajo krvne celice glede na krvne skupine AB0, so te hemaglutinine poimenovali lektini. Beseda lektini izvira iz latinske
besede »legere«, kar pomeni izbrati; torej lektini selektivno izberejo vezalno mesto na glikoziliranih povrøinah (3, 4). Dandanes so lektini definirani kot proteini ali glikoproteini, ki imajo v strukturi vsaj eno domeno s katero prepoznajo in se reverzibilno veæejo na specifiœni mono- ali oligosaharid. Ali drugaœe, lektini so receptorji za sladkorne molekule (2, 3, 5, 6). Nekateri lektini so zgrajeni iz podenot z razliœnimi vezalnimi mesti za sladkorje. Lektini so v naravi zelo razøirjeni. Izolirali so jih iz mikroorganizmov, rastlin in æivali, virusov, bakterij, alg, gliv,
asist. Petra Kocbek, mag. farm., in prof. dr. Julijana Kristl, mag. farm., Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva 7, 1000 Ljubljana
162 farm vestn 2006; 57
Ciljan vnos uœinkovin z uporabo lektinov
telesnih tekoœin vretenœarjev in celiœnih membran sesalcev (7). Interakcije med lektini in sladkorji so zelo specifiœne, saj jih lahko primerjamo z interakcijami encim–substrat ali antigen–protitelo (5, 8). Lektini se lahko veæejo na proste sladkorje ali na doloœene sladkorne komponente polisaharidov, glikoproteinov ali glikolipidov, prostih ali vezanih v celiœnih membranah (slika 1).
Slika 1:   Zgradba   celiœne membrane, kjer so sladkorji vezani na
membranske proteine in lipide zunanje  strani celiœne
membrane. Figure 1: Schematic presentation of cell membrane structure. Sugars
are  bound  to  membrane  proteins  and  lipids  on  the
extracellular side of the cell membrane.
Interakcije med sladkorji in laktini na celiœni povrøini imajo pomembno vlogo v œloveøkem organizmu pri procesih kot so opsonizacija mikrobov, fagocitoza, aktivacija in diferenciacija celic, adhezija in migracija celic, apoptoza idr.. Tudi patogene bakterije in bakterije, ki so del normalne mikrobne flore, se pritrjujejo vœasih na zelo specifiœen del œrevesa preko interakcij med lektini in doloœenimi sladkorji (5, 6). Tovrstne moænosti izkoriøœajo za razvoj lektiniziranih dostavnih sistemov (DS).
2 Vloga lektinov   pri ciljani dostavi uœinkovin
Zelo specifiœne interakcije med lektini in sladkorji so temelj uporabe parov lektin-oligosaharid za ciljano dostavo uœinkovin. V osnovi loœimo dva naœina takønega ciljanja. Pri prvem naœinu t.i. neposrednem ciljanju je oligosaharid del DS. Endogeni lektini na povrøini celic prepoznajo sladkorni del DS, ki je neke vrste »naslov« za ciljano dostavo uœinkovin v tarœne celice. Na podlagi sladkorne kode lahko lektini tarœnih celic prepoznajo, veæejo in internalizirajo lektiniziran DS (9). DS pripravimo s kovalentno vezavo sladkorjev na polimere in druge aglikone. Namenjeni so predvsem zdravljenju virusnih obolenj, imunski terapiji, nadomestnemu encimskemu zdravljenju in genskemu zdravljenju (5).
Drugi naœin t.i. reverzno ciljanje predstavlja obratni mehanizem prvega. DS je na povrøini prekrit z molekulami eksogenega lektina s specifiœnostjo za doloœen sladkor. V ta namen se veœinoma uporabljajo rastlinski lektini. Takøen DS lahko vstopa v interakcije s sladkornimi deli endogenih proteoglikanov, glikoproteinov ali glikolipidov na povrøini celic (9).
Glede na literaturne podatke je mnogo bolj poznano in raziskovano pripenjanje lektinov na DS, ki specifiœno prepozna sladkor na ciljnem mestu, kot pripenjanje sladkorjev na DS, ki jih specifiœno prepoznajo endogeni lektini na tarœnem mestu. Tako je tudi vsebina tega œlanka usmerjena k t.i. reverznemu ciljanju.
3 Bioadhezija, mukoadhezija in citoadhezija
Razvoj lektiniziranih DS temelji na natanœnem poznavanju interakcij med sladkornimi ligandi na povrøini celic in lektini. Za dostavo uœinkovin imajo velik pomen bioprepoznavne lastnosti lektinov preko interakcij s specifiœnimi sladkorji, rezultat œesar so mukoadhezija, citoadhezija in/ali citoinvazija (9).
Bioahezija je sposobnost medsebojne vezave dveh komponent od katerih je vsaj ena bioloøka (10). Tako definiran izraz je zelo øirok in obsega mukoadhezijo in citoadhezijo. Mukoadhezija pomeni vezavo na mukus, ki prekriva sluznice, citoadhezija vezavo neposredno na celiœno povrøino (slika 2).
Slika 2:   Interakcije lektinov   s celicami, vstop v celice   in prehod
skozi enterocite (9). Figure 2: Lectin interactions with  cells, entry into the cells and
crossing through the enterocytes (9).
farm vestn 2006; 57 163
Pregledni œlanki - Review Articles
Ideja o bioadhezivnih dostavnih sistemih sega kakønih dvajset let nazaj (11) in øe vedno predstavlja izziv za øtevilne raziskovalce. Kljub prednostim poznanih bioadhezivnih polimerov, le-ti niso brez pomanjkljivosti, saj se veæejo na ciljno mesto z nespecifiœnimi fizikalno-kemijskimi interakcijami kot so Van der Waalsove in vodikove vezi. Takøni polimeri, kot so hitosan, natrijev alginat, karboksimetilceluloza, hidroksipropilceluloza idr., pri vezavi ne loœijo med slojem mukusa, ki prekriva celiœno povrøino, in med mukusom, ki je æe odluøœen, ter med povrøinami drugih komponent œrevesne vsebine. Ciljano vezavo mukoadhezivnega DS na tarœno mesto na povrøini sluznic lahko tako prepreœijo predhodne interakcije z drugimi komponentami. Pomanjkljivost takønega DS je poleg nespecifiœnih interakcij tudi vezava na sloj mukusa, ki prekriva sluznice, in ne neposredna vezava na povrøino epitela, kjer poteka absorpcija. Œas zadræevanja takønega mukoadhezivnega pripravka na vezalnem mestu je omejen s œasom obnavljanja mukusnega sloja (1–3 ure) (6).
V nasprotju z mukoadhezijo (slika 2A), ki temelji na nespecifiœnih interakcijah med verigami mukoadhezivnih polimerov in mukusom, predstavljajo interakcije med lektini in sladkorji na povrøini celic korak naprej pri dostavi uœinkovin, saj je vezava lektinov na tarœno mesto zelo specifiœna (slika 2B) (6, 9). Za proces citoadhezije lektinov je znaœilno, da so interakcije zelo specifiœne in jih lahko primerjamo s specifiœnostjo interakcij med antigenom in protitelesom. Prednost citoadhezije pred mukoadhezijo je neposredna vezava na povrøino celic, kar pomaga pri prehajanju epitelijskih absorpcijskih barier. Prednosti takønih DS so:
(I)   podaljøano zadræevanje neposredno na povrøini celic, neodvisno od obnavljanja mukusnega sloja,
(II)  sproæanje in sodelovanje pri vezikularnih transportnih procesih (endo- in transcitoza) in
(III) sprememba permeabilnosti epitela z receptorsko posredovanim odpiranjem tesnih stikov med epitelijskimi celicami (8).
3.1 Mukoadhezivne lastnosti rastlinskih lektinov
Prebavni trakt sesalcev prekriva sloj mukusa, ki deluje kot drsilo; lajøa gibanje himusa in øœiti pod njim leæeœe tkivo pred delovanjem æelodœnega soka, proteazami, patogenimi mikroorganizmi in tudi pred mehanskimi poøkodbami (12). Pri œloveku je debelina mukusnega sloja v razliœnih delih prebavnega trakta zelo razliœna in se giblje od 50–500 mm v æelodcu do 50–150 mm v kolonu (13). V povpreœju tvori mukus v prebavnem traktu œloveka sloj z debelino 192 mm (3). Mucini so glikoproteini z molekulsko maso veœjo od 2 x 106 Da in so tvorilci gela (9). Glikoproteini œrevesnega mukusa vsebujejo 77,5 % ogljikovih hidratov sestavljenih iz N-acetil-galaktozamina, N-acetil-glukozamina, galaktoze, fukoze in sialiœne kisline (3). Mucini predstavljajo le 0,5–4,0 % mase mukusa. Poleg mucinov in vode (~ 95 %) vsebuje mukus tudi soli (0.5–1 %), proste beljakovine (1 %), lipide in odluøœene epitelijske celice (14).
Znaœilnosti interakcij med lektini in mucini so specifiœnost, pH-odvisnost in reverzibilnost. Pri prouœevanju interakcij med fluorescenœno oznaœenimi analogi rastlinskih lektinov in glikoproteini æelodœnega mukusa praøiœev so ugotovili, da vpliva na vezalno kapaciteto mucinov za lektine  pri nevtralnem pH poleg øtevila
specifiœnih vezalnih mest tudi njihova steriœna dostopnost. Ugotovili so, da imajo praøiœji æelodœni mucini najveœjo vezalno kapaciteto med preskuøanimi lektini za aglutinin iz pøeniœnih kalœkov (»wheat germ agglutinin«, WGA), saj se le-ta veæe na sialiœno kislino, ki je pogosto terminalni del linearnih ali razvejanih glikoproteinov (12).
Vsebnost nativnih glikoproteinov je v æelodœnem mukusu praøiœev primerljiva z vsebnostjo glikoproteinov v œrevesnem mukusu œloveka, zato æelodœni mukus praøiœev uporabljajo v in vitro øtudijah za prouœevanje interakcij med lektini in mukusom. Iz dobljenih rezultatov lahko sklepamo na interakcije med mucini in lektini v prebavnem traktu œloveka (12). Rezultati interakcij med WGA in praøiœjimi æelodœnimi mucini so pokazali najveœjo stopnjo vezave pri pH 5, kar pomeni, da se po peroralnem dajanju veœina WGA veæe v zgornjem delu duodenuma. Tako lahko sklepamo, da se le majhen deleæ lektiniziranega DS zaradi vezave na æelodœni mukus ne adsorbira na mukus v tankem œrevesu (9).
Œeprav predstavlja mukusni sloj difuzijsko bariero, so lahko mucini »lovilci« za lektinizirane DS zaradi specifiœnih interakcij z lektini. Mukoadhezija lektiniziranih DS predstavlja prvo stopnjo v procesu ciljane dostave uœinkovin. V raziskavah so ugotovili, da so interakcije med mucini in WGA reverzibilne, zato se lahko lektini sprostijo z mucinov in se specifiœno veæejo na prosta vezalna mesta na povrøini celiœnih membran (6, 12).
3.2  Citoadhezivne   lastnosti rastlinskih lektinov
Klasiœni polimerni mukoadhezivni DS se veæejo na mukus, kjer se uœinkovina sprosti. Lektinizirani sistemi ciljajo dostavo uœinkovin neposredno na celiœno povrøino enterocitov, kjer poteka absorpcija. Specifiœne interakcije med lektini in sladkorji glikokaliksa skrajøajo difuzijsko razdaljo, ki jo mora preiti uœinkovina v procesu absorpcije. Hkrati pa velika lokalna koncentracija uœinkovine na samem mestu absorpcije poveœa koncentracijski gradient in s tem hitrost absorpcije ter zmanjøa razgradnjo uœinkovine z encimi v svetlini prebavnega trakta (5, 15).
Z namenom, da bi ocenili vezalno kapaciteto za lektine in prouœili vzorec glikozilacije humanim enterocitom podobnih celiœnih linij (Caco-2, HT-29, HCT-8), celic karcinoma prostate (Du-145) in celic karcinoma mehurja (5637) so s pretoœno citometrijo in fluorimetrijo ugotavljali interakcije doloœenih lektinov z razliœnimi sladkorji (16, 17). Ugotovili so, da imajo celiœne linije najveœjo vezalno kapaciteto za lektin iz Triticum vulgare. WGA se ne veæe le na rakave celice kolona, ampak tudi na humane kolonocite. Le-ti imajo petnajst krat manjøo vezalno kapaciteto za WGA, øe zmeraj pa nudijo veliko øtevilo vezalnih mest za lektinizirane DS (17).
Raziskave vezave WGA na izolirane receptorje za epidermalni rastni faktor (»epidermal growth factor«, EGF) in na in vitro model intestinalnega epitela (monosloj Caco-2 celic) so potrdile, da EGF-receptorji sodelujejo pri citoadheziji WGA (19). Kljuœna vloga EGF-receptorja pri vezavi lektinov odpira dve zanimivi podroœji za uporabo WGA pri dostavi uœinkovin (15):
1. EGF-receptor je prekomerno izraæen pri øtevilnih rakavih obolenjih (npr. rak jeter, prsi, pljuœ, mehurja), zato lahko priœakujemo, da bodo
164 farm vestn 2006; 57
Ciljan vnos uœinkovin z uporabo lektinov
z WGA lektinizirana predzdravila ali DS primerni za ciljano dostavo protitumornih uœinkovin.
2. Celice, ki imajo izraæen EGF-receptor so prisotne tudi v veœini zdravih tkiv, zato lahko citoadhezivne lastnosti vezanega lektina omogoœijo receptorsko pot privzema uœinkovin in s tem poveœanje njihove bioloøke uporabnosti.
4 Modificirana dostava uœinkovin z lektini
Sluznice prebavnega, dihalnega in urogenitalnega trakta ter oœesna sluznica, nudijo dve tarœni mesti za dostavo uœinkovin s pomoœjo lektinov: gelski sloj mukusa in glikokaliks epitelijskih celic. Mukus prekriva veœino epitelov, kjer poteka absorpcija, in je prvo tarœno mesto za lektinizirane sisteme. Kadar lektiniziran DS preide sloj mukusa, je glikokaliks celic sekundarno tarœno mesto. Glikokaliks sestavljajo sladkorni deli proteoglikanov, glikolipidov in glikoproteinov, ki so zasidrani v lipidni dvosloj celiœnih membran (15). Razliœne vrste celic imajo na povrøini izraæene razliœne sladkorje. Prav tako se po vzorcu glikozilacije med seboj razlikujejo zdrave od obolelih celic (npr. rakavih). Tako lahko z uporabo lektinov doseæemo ciljano dostavo uœinkovin v specifiœne celice in tkiva (1, 6).
4.1   Privzem lektinov v celice
Vezavi lektiniziranih DS na membrane celic lahko sledi citoinvazija, ki jo sproæijo lektini. Privzem lektiniziranih DS v celice povzroœi sprostitev vezalnih mest za lektine na povrøini celic. Rezultat je lahko pospeøen intracelularni privzem lektiniziranih DS (6, 12), ki se lahko v celici razgradijo ali pa sledi transcelularni transport (3). V nasprotju s citoadhezijo, ki je konstantna in neodvisna od temperature, sta za proces privzema v celice potrebna poviøana temperatura in daljøi œas, kar so ugotovili z in vitro øtudijami vezave WGA na Caco-2 celice. Poveœana fluidnost celiœnih membran igra kljuœno vlogo pri privzemu lektinov v celice (3, 15). Glavna znaœilnost citoinvazije (slika 2C), ki jo sproæijo lektini, je aktiven transport. V skladu z ugotovitvijo, da je receptor za EGF vezalno mesto za lektine, lahko privzem lektinov pripiøemo receptorski endocitozi. Kar 60 % WGA se po vstopu v celice nahaja v lizosomih. Ta lizosomska pot (slika 2 C in D) v celici je primerna za dostavo uœinkovin, ki so stabilne v kislem. Uœinkovina se iz lektiniziranega DS sprosti, ko pride do razgradnje ogrodja DS v lizosomih tarœnih celic (3). Receptorska pot privzema v celice omogoœa premostitev epitelijske absorpcijske bariere po peroralnem dajanju, lahko pa jo izkoristimo tudi za prevajanje signalov v celice z namenom sproæanja vezikularnih transportnih procesov v ali skozi polarizirane epitelijske celice (2).
Receptorsko posredovan privzem uœinkovin, vkljuœno z lektinizacijo in ciljanjem glikoziliranih zunajceliœnih domen membranskih receptorjev, je obetajoœ pristop za poveœanje absorpcije uœinkovin z majhno bioloøko uporabnostjo. Veliko raziskovalnega dela pa je øe potrebno, da bi ugotovili prednosti in slabosti takønega ciljanja v in vivo pogojih.
4.2   Transcitoza lektinov
Na Caco-2 celicah so prouœevali transport fluorescenœno oznaœenih delcev z velikostjo 50 nm, ki so imeli na povrøini vezane lektine. Ugotovili so, da s pripenjanjem WGA  na povrøino nanodelcev
doseæejo poveœanje transcitoze za 20 %. Podobnne izsledke so dobili tudi v raziskavah s konkavalinom A (slika 3) (20). Rezultati torej kaæejo, da lektinizacija povrøine koloidnih dostavnih sistemov poveœa njihov transcelularni transport (slika 2D) v in vitro pogojih. Nekateri strokovnjaki menijo, da tudi v in vivo pogojih pride do transcitoznega transporta lektinov, kar potrjuje detekcija aglutinina iz araøidov (lektin prisoten v prehrani) v periferni venski krvi (2).
Slika 3:   Struktura kompleksa konkavalina A s trisaharidom manoze
(7). Figure 3: Structure of concavalin A in complex with the trisaccharide
of mannose (7).
5 Lektinizirana predzdravila
Lektinizirano predzdravilo je zgrajeno iz lektina kot dela namenjenega ciljanju specifiœnih sladkorjev, uœinkovine kot aktivnega dela in distanœnika, ki povezuje oba dela (slika 4). Topnost takønega predzdravila v vodnem okolju je pogoj za njegovo absorpcijo. Kadar lektiniziramo lipofilne uœinkovine, zagotavlja topnost konjugata v vodi hidrofilni del, ki ga predstavlja lektin. Z izbiro ustreznega distanœnika, ki povezuje molekulo uœinkovine in lektin, lahko doseæemo sproøœanje uœinkovine pod toœno doloœenimi pogoji (9). Kot primer lahko navedemo konjugat doksorubicina in WGA s cis-akonitinskim distanœnikom, ki je nestabilen v kislem. Uœinek ciljanja rakavih celic kolona s takønim predzdravilom je posledica velike vezalne kapacitete rakavih celic kolona za WGA in sproøœanja citostatika øele, ko le-ta doseæe kislo okolje v lizosomih tarœnih celic (21).
Za uœinkovito peroralno dostavo proteinov so potrebne oblike, ki prepreœujejo inaktivacijo in izboljøajo absorpcijo takønih uœinkovin. Da bi odkrili, ali z lektini posredovana citoadhezija in citoinvazija poveœa absorpcijo proteinov, so s stabilno amidno vezjo povezali fluorescenœno oznaœen goveji serumski albumin in WGA ter spremljali vezavo in vstop takønega konjugata v Caco-2 celice. Izsledki kaæejo,
farm vestn 2006; 57 165
Pregledni œlanki - Review Articles
Slika 4:   Shematski prikaz   lektiniziranega predzdravila in   njegovih
interakcij z glikokaliksom enterocitov (3). Figure 4: Schematic presentation of lectin-grafted prodrug   and its
interactions with the glycocalyx of enterocytes (3).
da WGA vpliva na privzem proteinov velike molekulske mase v celice in da lahko z uporabo lektinov premostimo membransko bariero pri dostavi proteinskih uœinkovin (22).
6 Nosilni sistemi
Lektinizirani nosilni sistemi so DS pri katerih je povrøina rezervoarja (kot so mikrodelci (23), nanodelci (24) ali liposomi (25)) z vgrajeno uœinkovino prekrita z lektini. Lektini na povrøini tako vodijo rezervoar z uœinkovino na samo mesto absorpcije (slika 5).
Vgrajevanje uœinkovin v ustrezne nosilne sisteme zaøœiti uœinkovine pred økodljivimi vplivi okolja (pH-vrednost, encimi). Hkrati je koliœina vgrajene uœinkovine v nosilnem sistemu veœja v primerjavi s koliœino uœinkovine v predzdravilu, zato z dajanjem uœinkovine vgrajene v mikrodelce, nanodelce ali liposome laæje doseæemo terapevtske koncentracije kot pri dajanju uœinkovine v obliki predzdravila. Nadalje lahko ogrodje nosilnega sistema, omogoœa nadzorovano sproøœanje uœinkovine (3). Modifikacija takønega »trojanskega konja« z lektini pa lahko pripelje uœinkovino neposredno na glikozilirano povrøino epitelijskih celic in sproæi privzem DS v celice.
V procesu specifiœnega ciljanja oligosaharidov z lektini so mucini prvo tarœno mesto. V kakønem obsegu prevlada mukoadhezija nad ciljanjem sladkorjev glikokaliksa je odvisno od velikosti dostavnega sistema. Nanodelci preidejo skozi sloj mukusa, medtem ko mikrodelce veœje od 1 mm zadræi sloj viskoznega mukusa (13, 26, 27). Po drugi strani so reverzibilne interakcije med mucini in lektini lahko prednost, saj zadræevanje DS v gelskem sloju mukusa upoœasni hitrost potovanja lektinizirane oblike skozi prebavni trakt (9).
Slika 5:   Shematski prikaz     lektiniziranega nosilnega sistema  z
vgrajeno uœinkovino   in njegovih interakcij z glikokaliksom
enterocitov (3). Figure 5: Schematic presentation of lectin-grafted carrier system with
incorporated drug and its interactions with the glycocalyx of
enterocytes (3).
Prednost lektiniziranih koloidnih pred veœjimi DS so tudi citoinvazivne lastnosti, ki so posledica lektinskega plaøœa. Osnovni pogoj, da lahko pripravimo lektinizirane nosilne sisteme, je prisotnost reaktivnih funkcionalnih skupin na povrøini delcev na katere lahko kovalentno veæemo izbrane lektine (28). Sinteza novih biorazgradljivih polimerov z reaktivnimi funkcionalnimi skupinami predstavlja tako korak naprej v razvoju lektiniziranih DS (29).
V øtudijah so prouœevali moænost uporabe razliœnih lektinov (npr. WGA, konkavalina A) za izboljøanje transporta nanodelcev iz œrevesa v krvni obtok. Ugotavljali so vpliv velikosti, gostote lektinov na povrøini delcev in prisotnosti inhibitorjev na privzem lektiniziranih nanodelcev (20). Raziskave so pokazale, da ima najveœji vpliv na stopnjo privzema gostota lektinov na povrøini delcev, manjøi vpliv pa imata velikost in vrsta vezanega lektina (5).
Zanimivo je, da izkazujejo lektini vezani na nanodelce veœjo stopnjo transcitoze kot prosti lektini. Stopnja transcitoze se poveœa z naraøœajoœo gostoto lektinov na povrøini nanodelcev (20). Ta ugotovitev kaæe, da lektinizirani nanodelci verjetno sproæijo drugo pot prehoda skozi celice kot pa prosti lektini. Znanstveniki menijo, da lahko vezava lektinov na povrøino koloidnih delcev povzroœi organizacijo receptorjev v skupke (klastre), kar vodi v poveœan transcitozni prenos (3).
Z lektini modificirana dostava uœinkovin, ki vkljuœuje aktivne transportne procese epitelijskih celic, lahko postane uœinkovit naœin za poveœanje bioloøke uporabnosti uœinkovin z majhno permeabilnostjo.
166 farm vestn 2006; 57
Ciljan vnos uœinkovin z uporabo lektinov
7 Dejavniki, ki omejujejo peroralno uporabo lektinov
7.1   Vpliv hrane in prebavnih encimov
Ciljanje tarœnega mesta z lektini lahko ovirajo ogljikovi hidrati prisotni v obiœajni prehrani ljudi. Obseg takøne neæelene vezave je odvisen od specifiœnosti uporabljenih lektinov. Tako lahko priœakujemo, da bodo DS z vezanimi lektini s specifiœnostjo za glukozo ali galaktozo v veliki meri inaktivirale komponente hrane preden doseæejo tarœno mesto, medtem ko bodo DS z vezanimi lektini s specifiœnostjo za sladkorje, ki jih je v prehrani le malo ali jih ni, pripeljali takøen DS na tarœno mesto (9).
Drug pomemben dejavnik povezan s peroralnim dajanjem je prisotnost proteolitiœnih encimov v prebavnem traktu. Lektini kot del DS morajo biti odporni na encimsko razgradnjo, da lahko ohranijo sposobnost vezave na specifiœne sladkorje (9). Nekateri lektini (npr. WGA in lektin iz paradiænika) so odporni na kislo okolje in prisotnost proteolitiœnih encimov v prebavnem traktu, kar sta dva temeljna pogoja za peroralno uporabo (3).
7.2   Imunogenost lektinov
Uporabnost lektinov v razvoju novih farmacevtskih oblik lahko zmanjøajo njihove antigenske lastnosti. Lektini so organizmu tuji proteini z veliko molekulsko maso in rigidno strukturo, zato lahko priœakujemo, da bodo v telesu izzvali lokalni in/ali sistemski imunski odgovor (9). Rastlinski lektini se med seboj moœno razlikujejo v imunogenosti. Na primeru lektina iz paradiænika so dokazali, da peroralno zauæitje povzroœi tvorbo specifiœnih protiteles tako pri miøih kot pri œloveku (30). Poslediœno lahko prisotna protitelesa IgG in IgA nevtralizirajo tisti del lektiniziranega DS, ki predstavlja »naslov« za specifiœno ciljanje, in tako zmanjøajo privzem lektiniziranih predzdravil ali nosilnih sistemov (9).
Pri uporabi lektinov za dostavo uœinkovin se moramo zavedati, da so æe v krvi zdravih ljudi prisotna protitelesa proti proteinom v prehrani (tudi proti rastlinskim lektinom). Ugotovili so, da so interakcije protein-protein in ne interakcije ogljikov hidrat-protein tiste, ki so vkljuœene v interakcije med protitelesi in lektini. Ker vezava protiteles na lektine ne vpliva na aglutinacijske lastnosti lektinov, lahko sklepamo, da sta vezavno mesto, ki predstavlja antigensko determinanto, in vezavno mesto za ogljikov hidrat, razliœni (9).
Obiœajno je del lektina, ki se specifiœno veæe na doloœen oligosaharid, le majhen del celotne lektinske molekule. Ta ugotovitev kaæe perspektivno pot za razvoj (s tehnologijo rekombinantne DNA) veliko manjøih, lektinom podobnih molekul (lektinomimetikov), ki bodo manj toksiœni in/ali imunogeni kot nekateri naravni lektini, ohranili pa bodo sposobnost specifiœne citoadhezije in/ali citoinvazije (9).
Medtem ko je imunogenost nezaæelen stranski uœinek pri dostavi uœinkovin, je imunostimulativni uœinek nekaterih lektinov cilj peroralnega cepljenja. Vrsta imunskega odgovora, ki ga na tak naœin izzovemo, je moœno odvisna od mesta absorpcije. Privzem antigena skozi Peyerjeve ploøœice lahko povzroœi lokalni imunski odgovor (IgA), medtem ko transport antigena skozi enterocite izzove sistemski imunski odziv (IgG) (3). Pri peroralnem cepljenju lahko vgradimo cepiva oz. antigene, ki povzroœijo imunski odziv, v ustrezen DS.
Imunski odziv pri dajanju takønega pripravka je odvisen od deleæa absorbiranega antigena. S pripenjanjem lektinov na povrøino DS lahko poveœamo transport v toœno doloœen tip celic, kar sproæi veœji imunski odgovor.
Glikokaliks M celic se moœno razlikuje od glikokaliksa enterocitov. Povrøino M celic prekriva tanjøi sloj mukusa kot povrøino enterocitov kar olajøa nanodelcem dostop do povrøine celic in omogoœi poveœnje trancitoznega transporta nanodelcev (13).
7.3 Toksiœnost lektinov
Pred uporabo lektinov pri oblikovanju farmacevtskih oblik so nujne tudi øtudije varnosti le-teh. 30 % prehrane œloveka, surove in kuhane, vsebuje sestavine z znatno hemaglutininsko aktivnostjo in v 53 uæitnih rastlinah najdemo lektine. Tako so nekateri lektini (npr. lektin iz paradiænika, WGA iz pøeniœnih kalœnov) sestavni del œlovekove prehrane. Ti lektini naj bi bili z vidika toksiœnosti za œloveka varni. Obstajajo pa tudi podatki o znanih toksiœnih uœinkih doloœenih lektinov. Zelo znan primer povezan s toksiœnostjo lektinov se je zgodil leta 1973 v Londonu. Sovjetska tajna sluæba je ubila tajnega agenta s konico deænika, ki je bila prepojena z ricinom (3). Ricin (slika 6) je citotoksiœni protein iz semen rastline Ricinus communis, ki specifiœno in ireverzibilno blokira sintezo proteinov na ribosomih eukariontskih celic (31).
Slika 6:   Struktura kompleksa prve domene podenote B ricina z
laktozo (7). Figure 6: Structure of the first domain of the B-subunit ricin in complex
with lactose (7).
Dandanes øe ni dokazana (ne)toksiœnosti uporabe lektinov za ciljano dostavo uœinkovin. Veœina razpoloæljivih podatkov je rezultat spremljanja uæivanja lektinov v prehrani. Tako strokovnjaki menijo, da mikrogramske koliœine lektinov, ki so potrebne za z lektini posredovano dostavo uœinkovin, nimajo toksiœnih uœinkov. Ta trditev izhaja iz razpoloæljivih podatkov uæivanja WGA v obiœajni prehrani (9).
farm vestn 2006; 57 167
Pregledni œlanki - Review Articles
Toksiœne uœinke lektinov pa lahko izkoriøœamo v terapevtske namene npr. v terapiji raka. Tako lahko lektin s toksiœnim uœinkom deluje kot molekula za specifiœno ciljanje doloœenega mesta oz. celic s specifiœnim vzorcem glikozilacije, hkrati pa ima citotoksiœen uœinek (32).
8  Zakljuœek
Kljub øtevilnim vpraøanjem, ki øe zmeraj ostajajo neodgovorjena, je ideja uporabe lektinov pri dostavi uœinkovin veœ kot aktualna. Ker lektini selektivno prepoznajo doloœene sladkorje, ki so sestavni del glikokaliksa epitelijskih celic, predstavlja oblikovanje lektiniziranih DS moænost selektivnega ciljanja doloœenega dela œrevesa ali celo ciljanja doloœene vrste celic (npr. M celic). Citoadhezija in citoinvazija sta predpogoj za transcelularno absorpcijo, kar vodi v uspeøno dostavo uœinkovin, ki imajo drugaœe majhno bioloøko uporabnost.
Poleg specifiœnega prepoznavanja sladkorjev lahko lektini izboljøajo dostavo uœinkovin v sistemski krvni obtok s sproæanjem receptorske endo- ali transcitoze. Z lektini konjugirane uœinkovine ali lektinizirani DS poveœajo dostavo uœinkovin skozi sluznice tako, da podaljøajo œas zadræevanja na mestu absorpcije in vzpodbujajo privzem v enterocite.
Koncept lektiniziranih dostavnih sistemov je aktualen zadnjih deset let. Omejitvam uporabnosti naravnih lektinov se lahko izognemo z modifikacijo lektinov z genskim inæeniringom in biotehnologijo. Ekspresija rekombinantnih proteinov, ki imajo v strukturi vezavne domene za ciljanje absorpcijskega okna in sproæanje specifiœne endo-in transcitoze so moænosti, ki jih nudijo in izkoriøœajo nove tehnologije za oblikovanje uœinkovitejøih in varnejøih dostavnih sistemov.
9  Literatura
1.    Kennedy JF, Palva PMG, Corella MTS et al. Lectins, versatile proteins of recognition: a review. Carbohydr Polym 1995; 26: 219–230.
2.    Bies C, Lehr M, Woodley JF. Lectin-mediated drug targeting: history and applications. Adv Drug Del Rev 2004; 56: 425–435.
3.    Gabor F, Wirth M. Lectin-mediated drug delivery: fundamentals and perspectives. S.T.P. Pharma Sciences 2003; 13: 3–16.
4.    Irache JM, Durrer C, Duchêne D et al. Bioadhesion of lectin-latex conjugates to rat intestinal mucosa. Pharm Res 1996; 13: 1716–1719.
5.    Minko T. Drug targeting to the colon with lectins and neoglycoconjugates. Adv Drug Del Rev 2004; 56: 491–509.
6.    Lehr CM. Lectin-mediated drug delivery: The second generation of bioadhesives. J Control Release 2000; 65: 19–29.
7.    Loris R. Principles of structures of animal and plant lectins. Biochim Biophys Acta 2002; 1572: 198–208.
8.    Haltner E, Easson JH, Lehr CM. Lectins and bacterial invasion factors for controlling endo- and transcytosis of bioadhesive drug carrier systems. Eur J Pharm Biopharm 1997; 44: 3–13.
9.    Gabor F, Bogner E, Weissenboeck A et al. The lectin–cell interaction and its implications to intestinal lectin-mediated drug delivery. Adv Drug Deliv Rev 2004; 56: 459–480.
10.  Smart JD. The basics and underlying mechanisms of mucoadhesion. Adv Drug Del Rev 2005; 57: 1556–1568.
11.  Peppas NA, Buri PA. Surface, interfacial and molecular aspects of polymer bioadhesion on soft tissues. J Control Release 1985; 2: 257–275.
12.  Wirth M, Gerhardt K, Wurm C et al. Lectin-mediated drug delivery: influence of mucin on cytoadhesion of plant lectins in vitro. J Control Release 2002; 79: 183–191.
13.  Zang N, Ping QN, Huang GH et al. Investigation of lectin-modified insulin liposomes as carriers for oral administration. Int J Pharm 2005; 294: 247–259.
14.  Khanvilkar K, Donovan MD, Flanagan DR. Drug transfer through the mucus. Adv Drug Del Rev 2001; 48: 173–193.
15.  Wirth M, Kneuer C, Lehr CM et al. Studying cellular binding and uptake of bioadhesive lectins. V: Cell culture models of biological barriers. Taylor & Francis, New York, 2002.
16.  Gabor F, Stangl M, Wirth M. Lectin-mediated bioadhesion: binding caracteristics of plant lectins on the enterocyte-like cell lines Caco-2, HT-29 and HCT-8. J Control Release 1998; 55: 131–142.
17.  Gabor F, Klausegger U, Wirth M. The interactions between wheat germ agglutinin and other plant lectins with prostate cancer cells Du-145. Int J Pharm 2001; 221: 35–47.
18.  Gabor F, Wirth M, Jurkovich B et al. Lectin-mediated bioadhesion: proteolytic stability and binding-characteristics of wheat germ agglutinin and Solanum tuberosum lectin on Caco-2, HT-29 and human colonocytes. J Control Release 1997; 49: 27–37.
19.  Lochner N, Pittner F, Wirth M et al. Wheat germ agglutinin binds to the epidermal growth factor receptor of artifical Caco-2 membranes as detected by silver nanoparticle enhanced fluorescence. Pharm Res 2003; 20: 833–839.
20.  Russell-Jones GJ, Veitch H, Arthur L. Lectin-mediated transport of nanoparticles across Caco-2 and OK cells. Int J Pharm 1999; 190: 165–174.
21.  Wirth M, Fuchs A, Wolf M et al. Lectin-mediated drug targeting: preparation, binding characteristics and antiproliferative activity of wheatogearm agglutinin conjugated doxorubicin in Caco-2 cells. Pharm Res 1998; 15: 1031–1037.
22.  Gabor F, Schwarzbauer A., Wirth M. Lectin-mediated drug delivery: binding and uptake of BSA-WGA conjugates using the Caco-2 model. Int J Pharm 2002; 237: 227–239.
23.  Kim BY, Jeong JH, Park K et al. Bioadhesive interaction and hypoglicemic effect of insulin-loaded lectin-microparticle conjugates in oral insulin delivery systems. J Control Release 2005; 102: 525–538.
24.  Mo Y, Lim LY. Preparation and in vitro anticancer activity of wheat germ agglutinin (WGA)-conjugated PLGA nanoparticles loaded with paclitaxel and isopropyl myristate. J Control Release 2005; 107: 30–42.
25.  Ponchel G, Irache JM. Specific and non-specific bioadhesive particulate systems for oral delivery to the gastrointestinal tract. Adv Drug Del Rev 1998; 34: 191–219.
26.  Hussain N, Jaitley V, Florence AT. Recent advances in understanding of uptake of microparticulates across the gastrointestinal lymphatics. Adv Drug Rev 2001; 50: 107–142.
27.  Desai MP, Labhasetwar V, Walter E et al. The mechanism of uptake of biodegradable microparticles in Caco-2 cells is size dependent. Pharm Res 1997; 14: 1568–1573.
28.  Montisci MJ, Giovannuci G, Duchêne D et al. Covalent coupling of asparagus pea and tomato lectins to poly(lactide)microspheres. Int J Pharm 2001; 215: 153–161.
29.  Rodrigues JS, Santos-Magalhães NS, Coelho LCBB et al. Novel core(polyester)-shell(polysaccharide) nanoparticles: protein loading and surface modification with lectins. J Control Release 2003; 92: 103–112.
30.  Naisbett B, Woodley J. The potential use of tomato lectin for oral drug delivery. 4. Immunological consequences. Int J Pharm 1995; 120: 247–254.
31.  Roberts LM, Smith DC. Ricin: the endoplasmic reticulum connection. Toxicon 2004; 44: 469–472.
32.  Heinrich EL, Welty Lily, Banner LR et al. Direct targeting of cancer cells: A multiparameter approach. Acta Histochem 2005; 107: 335–344.
168 farm vestn 2006; 57