Kristijan Jezernik1, Mateja Erdani Kreft2
Tesnosticne pregrade v našem telesu
Tight Junction Barriers in Our Body
IZVLEČEK
KLJUČNE BESEDE: tesni stik, pregrada - bariera, bolezni
Tesni stiki so odločilni medcelični stiki, ki gradijo epitelijske pregrade. Oblikujejo molekulskim poram podobne strukture, ki obkrožajo vrhove posameznih celic. Nadzirajo prehajanje malih molekul med apikalnimi in bazolateralnimi kompartmenti. Oblikujejo razvejane mreže pečatnih povezav iz transmembranskih proteinov, kot so okludin in klavdini, katerih zunajcelične domene se med seboj neposredno povezujejo. Na citosolni strani plazmaleme pa so v povezavi z različnimi submembranskimi proteini, ki posredujejo povezavo z aktinskim citoskele-tom. To delo podaja pregled spoznanj o zgradbi in funkciji proteinov, ki gradijo tesne stike ali so z njimi povezani. Zbrani so podatki o tesnostičnih proteinih v epitelijih sesalcev ter o njihovih vlogah pri nekaterih boleznih. Razpravljamo tudi o možnostih koriščenja spoznanj o tesnih stikih za namene izboljšanega tarčnega vnosa učinkovin v telo.
ABSTRACT
KEY WORDS: tight junction, barrier, diseases
Tight junctions comprise a crucial part of epithelial barriers by forming a molecular pore like structure that encircles the apex of individual cells. They control the passage of small molecules between apical and basolateral compartments. Junctions are composed of a branching network of sealing strands. Each strand is formed from a row of transmembrane proteins namely occludin and claudins, embedded in both plasma membranes, with extracellular domains joining one another directly. These associate with different peripheral membrane proteins located on the intracellular side of plasma membrane, which anchor the strands to the actin cytoskeleton. This overview gives a detailed survey about the proteins associated with tight junctions, their structure and functions including a wealth of the relevant literature. We summarize our knowledge about tight junction proteins in mammalian epithelial tisue and their involvement in some diseases. Their putative suitability as new targets for improving drug delivery is discussed.
1	Prof. dr. Kristijan Jezernik, univ. dipl.biol., Inštitut za biologijo celice, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Lipiceva 2, 1000 Ljubljana; kristijan.jezernik @n£uni-lj.si
2	Doc.dr. Mateja Erdani Kreft, univ.dipl.biol., Inštitut za biologijo celice, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Lipiceva 2, 1000 Ljubljana
52
ZGRADBA TESNIH STIKOV
Epitelijska tkiva imajo vlogo pregrad ali barier, ki ločujejo različne predelke ali kompartmen-te (telo od zunanjosti in od notranjih telesnih votlin). Tesni stiki pa so glavne sestavine epi-telijskih celic, ki v veliki meri prispevajo k pregradni vlogi epitelijev. Nameščeni so tako, da obkrožajo vrhove posameznih celic kot neke vrste poram podobne strukture in tako nadzirajo potovanje majhnih molekul in ionov med luminalnim (apikalnim) in seroznim (ba-zolateralnim) kompartmentom. Prepustnost za ione je različna za različne vrste epitelijev in je v osnovi določena z molekularno sestavo tesnega stika (1).
Tesni stiki spenjajo lateralne plazmaleme sosednjih celic, od tod tudi prvotno ime v latinskem jeziku zonulae occludentes. Na povr -šini plazmaleme so vidni kot preplet - mreža anastomoznih, verigi podobnih povezav (slika 1). Število, dolžina in medsebojna prepletenost teh povezav se med različnimi epiteliji močno razlikuje. Pod plazmalemo pa je opazen plak, ki ga označuje krožno potekajoč pas aktinskih filametov (2). Tesni stik v osnovi gradijo transmembranski in submembranski proteini. Submembranski proteini se vežejo
na aktinske filamente in vključujejo tudi določene regulatorne proteine (slika 2).
Transmembranski proteini
Okludin je bil prvi znani stični membranski protein, ki je specifično lokaliziran v področju tesnega stika (3). Njegovo izražanje pa ni nujno potrebno za oblikovanje stičnega prepleta pa tudi njegova pregradna vloga v tem smislu ni popolnoma pojasnjena (4). Drugi pomemben protein je tricelulin. Ta bi lahko prevzemal pregradno funkcijo. Po zgradbi je zelo podoben okludinu (5). Posebno veliko ga je v področjih tromej med celicami (v t. i. tro -mejnih povezavah). Poleg dveh naštetih skupin proteinov so v stiku gotovo najpomembnejši od Ca2+ neodvisni proteini klavdini, ki so nujno potrebni za oblikovanje stičnih vezi (1, 6). Do danes je poznanih vsaj 24 različnih klav-dinov v klavdinski družini, vsak z značilno razporeditvijo v organih in tkivih. Ionsko selektivnost določajo regije v zanki klavdina zunaj celice, ki imajo naboj in izražajo različ -ne izoelektrične točke. Tako je ionska selektivnost različnih epitelijev v veliki meri odvisna od vrste klavdinskih molekul, ki se izražajo v določenem epiteliju (6). IgG-so-
rodna družina celičnih adhezivnih molekul (JAM) so četrta skupina transmembranskih molekul tesnega stika, ki jo predstavljajo mole -kule JAM-A, B in C. To so homofilne in hete -rofilne adhezijske molekule (7). Sodelujejo pri funkciji pregrade, so pa lahko izražene tudi tam, kjer se tesni stiki ne vzpostavljajo, na pri -mer pri transepitelijski migraciji levkocitov. Za JAM-C je znano, da regulira polarizacijo in diferenciacijo spermatidov z vključevanjem polarnega proteinskega kompleksa (razlaga v nadaljevanju). Torej ima JAM predvsem vlogo v določanju polarizacije celic in manj vlogo pregrade (8).
Submembranski proteini
Za povezovanje okludina, klavdina in JAM-pro-teinov v področju tesnega stika so odločilni citoplazemsko-submembransko nameščeni povezovalni proteini, tudi t. i. ogrodni protei -ni. Med temi so pomembni proteini zonula occludens, kot so ZO-1, ZO-2 in ZO-3 (slika 2, slika 3). To so proteini iz družine membransko vezanih gvanilatno kinaznih homologov (MAGUK). Ti se lahko direktno vežejo s klav-dini in preko posebne domene (PDZ1-do -mene) z okludinom in aktinom (9,10). ZO-1 lahko interagira z JAM ter oblikuje homodime-re ali heterodimere z ZO-2 ali ZO-3. ZO-pro-teini so torej najprimernejši ogrodni proteini, ki povezujejo različne transmembranske molekule s citoskeletom. Zaradi povezav med ZO-1 in ZO-2 ter klavdini je ta vrsta povezav ključna za oblikovanje tesnostičnega preple -ta in njegove pregradne vloge.
Slika 2. Shematskiprikaz molekularne zgradbe tesnega stika na nivoju krvno-možganske pregrade. Pod tesnostičnim kompleksom se nahaja adherentni stik. ZO - proteini zonula occludens.
Slika 3. Imunofluorescenčna označitev proteina ZO-1 (zeleno, puščica) kaže potek tesnega stika v površinskih urotelijskih celicah. V celici so označeni tudi citokeratini (CK 20, rdeče), ki sicer niso značilna citoskeletna sestavina tesnega stika.
Pod prepletom tesnostičnih proteinov v bazolateralni smeri celice se nahaja adherentni stik, ki lahko v določeni meri vključuje tudi posamezno molekularno komponento tesnega stika, vendar zgradba in vloga adhe-rentnega stika presegata predmet tega sestavka.
Aktin in regulatorni proteini
Aktin je na citoplazemski strani povezan s transmembranskimi tesnostičnimi proteini. Njegova porušitev, na primer s citohalazinom, poveča medcelično ali paracelično prepustnost (permeabilnost) in zniža čezcelično ali transepitelijsko upornost. Vse to dokazuje pomembno vlogo aktina pri zagotavljanju pregradne vloge tesnega stika (11). V področju tesnega stika se nahajajo tudi proteini Rho, gvanidinski izmenjevalni faktor (GEF) in GTP-azni aktivirajoči proteini (GAP). Te regu -latorne molekule lahko spreminjajo dinami -ko aktina v področju tesnega stika, s čimer vplivajo tudi na stabilnost in funkcijo tesno -stičnega kompleksa (12).
Prehod levkocitov skozi nepoškodovano steno krvnih žilic (med diapedezo) dokazuje, da je tesni stik strukturno in funkcijsko natančno reguliran in v določenih primerih tudi spremenljiv (13). Prehajanje skozi endo -telij zahteva precejšnjo dinamiko v zgradbi in delovanju tesnega stika. V to dinamiko pa je vključeno signaliziranje, ki poteka preko klav-dina, vključuje tudi endocitotske procese in preoblikovanje ključnih tesnostičnih komponent ter predvsem spreminjanje kontrak -tilnosti aktina ob soudeležbi miozina.
53
54
tesni stiki v vlogi pregrade IN EPITELIJSKA POLARNOST
Med oblikovanjem medceličnih stikov in vzpostavitvijo apikalno-bazolateralne polarnosti obstaja neodvisna povezanost (14). V oblikovanju polarnosti sodelujejo v področju tesnega stika nedavno odkriti multi-proteinski t. i. polarni kompleksi, kot sta Par in CRB (Crumbs), atipična proteinska kina-za (aPCK) ter kompleks Scribble. Kompleksi imajo antagonistične učinke in se nameščajo v ločena področja membranskih domen, torej apikalno ali bazolateralno. Kompleks CRB se namešča apikalno in delno v področju tesnega stika, kompleks Scribble pa lateral-no. Apikalno nameščeni kompleksi izrivajo nameščanje lateralnih in obratno. Ta prehod -na medsebojna izključitev v lokaciji nameščanja polarnih kompleksov vodi do vzpostavitve in vzdrževanja apikalno-bazolateralne polarnosti epitelija (15).
Tesni stiki predstavljajo zelo učinkovito pregrado za pasivni prehod tekočin, elektrolitov, makromolekul in tudi prehod celic po medcelični (paracelični) poti. Posledično nastane zaradi različne ionske sestave snovi v zunajceličnem prostoru in medceličnem prostoru določena upornost - paracelična upornost. Tesni stiki torej vzpostavljajo določeno upornost med svetlino (lumnom) in medceličnim prostorom. Ker pa večinoma snovi potujejo skozi apikalne površine v cito-plazmo in po citoplazmi na bazo celic ter nato ven iz celic, torej čez celico (transcelična pot) in le delno po medcelični poti, je celokupna in seveda specifična čezepitelijska (transepi-telijska) upornost določenega tkiva oziroma upornost skozi tkivo določena kot seštevek čezcelične (transcelične) in medcelične (pa-racelične) upornosti. Transcelično in tudi transepitelijsko upornost izražamo v ohmih cm2 (Qcm2).
Glavnino transepitelijske upornosti v naj -večji meri določajo tesni stiki v površinskih epitelijskih celicah. Med tkiva z največjo vlo -go pregrade gotovo spadata epitelij žolčnika in epitelij sečnega mehurja (urotelij). Zlasti slednji ima najmočnejši preplet tesnostičnih povezav, ki dejansko niso prehodne za vsebi -ne v svetlini sečnega mehurja. Pregrada, ki je vzpostavljena v uroteliju, zagotavlja upornost med 10.000 in 100.000 Qcm2.
Namestitev tesnosticne pregrade v epitelijih
V osnovi velja, da so tesni stiki nameščeni vedno na meji apikalne in bazolateralne membranske površine enoskladnih, prehodnih in večskladnih epitelijev. Pri tem je zanimivo, da je bila v koži določena lokacija tesnih stikov in s tem pregrade šele nedavno. Dolgo časa sicer ni bilo znano, ali v večskladnih epiteli-jih tesni stiki sploh obstajajo. Tako so domnevali, da zlasti keratinizirani epiteliji vzdržujejo pregrado zaradi izločanja in nalaganja med seboj navzkrižno povezanih proteinov t. i. lamelarnih telesc v celicah (16). Vendar se je relativno pozno izkazalo, da so za nemoteno pregradno vlogo tudi v epidermisu (pokož-nici) potrebni tesni stiki. Tesni stiki se v človeškem epidermisu nahajajo v zrnati plasti (lat. stratum granulosum) (slika 4) (17, 18). Tesni stiki in stratum corneum ter stratum luci-dum tako skupaj ustvarjajo funkcionalno pregrado v večskladnem epiteliju. Pri tem imajo odločilno vlogo kinaze IKK1 ter signaliziranje prek NFkB. Prek teh poti namreč potekajo vplivi na izražanje retinoično kislinskih tarčnih genov, ki so vključeni v zagotavljanje pregradne vloge epitelijev. Poleg tega je pomembno, da specifična lega tesnega stika v stratum granulosum zagotavlja tarčenje »apikalnih« proteinov in lipidnih mešičkov naravnost proti stratum corneum. Epidermis ni klasično apikalno-bazolateralno polarizira -no tkivo, pač pa je polarizacija na apikalno in bazolateralno os epitelija dosežena s stratum granulosum, ki tako oblikuje vitalno apikal -no mejo. Verjetno je oblikovanje tesnih stikov v nižjih plasteh epitelija zavrto zaradi zaviral -nih signalov za oblikovanje stikov, ki priha -jajo iz celic, ki nosijo tesne stike.
TESNI STIKI V VLOGI ZAVESE
Tesni stiki preprečujejo lateralno gibljivost membranskih molekul, zaradi česar te ne morejo prehajati iz apikalnih v bazolateralne površine ali obratno. V tem smislu so tesni sti -ki v vlogi zavese. To nazorno dokazujejo štu -dije o vlogi teh stikov v regulaciji rasti celic. Zaradi namestitve tesnih stikov so namreč rastni dejavniki kot ligandi in njihovi recep -torji med seboj fizično ločeni v različnih membranskih domenah, eni apikalno, drugi
Slika 4. Tesni stiki (modro) so v epidermisu nameščeni v zrnati plasti (lat. stratum granulosum).
55
bazolateralno. Tako je na primer v dihalnem epiteliju receptor Erb3/4 lokaliziran v bazo-lateralni membranski domeni, njegov ligand pa se nahaja v apikalni membranski domeni (19). V primeru motnje delovanja stika in njegove vloge v smislu zavese in pregrade ter s tem tudi celične polarnosti (na primer ob poškodbi - rani ali zaradi različnih vnetnih dejavnikov) je omogočena vezava liganda in receptorja. Premiku receptorja v apikalno domeno sledi njegova aktivacija, ki lahko pripelje do intenzivne proliferacije celic.
V vzdrževanju polarnosti ima odločilno vlogo okludin. Znano je, da je izguba polar -nosti zaradi epitelijsko-mezenhimskega pre -hoda, ki jo povzroča transformirajoči rastni dejavnik beta (TGF-P), posledica interakcij TGF-P, okludina, polarnih proteinov Par6 in različnih regulatornih molekul. Prav interakcije med transmembranskimi in citoplazem-skimi molekulami, skupaj s citoskeletom, pa modulirajo obe temeljni vlogi tesnega stika -vlogo pregrade in zavese.
SIGNALIZIRANJE, KI POTEKA IZ TESNEGA STIKA
Netransformirane (normalne) celice tudi preko stikov dobivajo signale za terminalno dife -renciacijo in se posledično prenehajo gibati. Ta pojav na splošno označujemo kot kontaktna inhibicija in je v povezavi z izgubo spo -sobnosti preraščanja celic ter posredno tudi s preprečitvijo epitelijsko-mezenhimskega prehoda. V to signaliziranje so vključene kom -ponente tesnega stika in aktivnosti jedrnih transkripcijskih dejavnikov. Tako P-katenin (zbran v adherentnem in tesnem stiku) kot tudi p120 preko transkripcijskih dejavnikov in sprememb v zgradbi kromatina vplivata na izražanje genov. Tako na primer p120 zavre transkripcijske represorje (20). Gradbene kom -ponente tesnega stika pa tudi neposredno regulirajo aktivnost transkripcijskih dejav -nikov. Proteini ZO-1 se vežejo na določene transkripcijske dejavnike, zlasti v jedrih celic z nedokončno zgrajenimi tesnimi stiki, na pri-
mer med celjenjem ran (21). Podobno naj bi tudi ZO-2 vplival na transkripcijske dejavnike, torej imajo proteini ZO podobno vlogo kakor katenini.
TESNI STIKI IN CELJENJE RAN
Tesni stiki so nujni za ponovno vzpostavitev in vzdrževanje zajezitvene vloge epitelijev po poškodbi. Ob celjenju ran poteka izražanje in potovanje različnih tesnostičnih proteinov usklajeno glede na različne fiziološke ali tudi patološke dejavnike. Znano je, da se med fiziološko samoobnovo epitelijev stare, odmrle celice odstranjujejo in nadomeščajo z novimi celicami, ne da bi se pri tem spremenila funkcionalnost epitelijske pregrade (22) . Poš-
kodbi različnih epitelijev (kože, črevesa, pljuč, žil, sečnega mehurja) sledi celjenje ran, pri katerem se torej kontrolirano izražajo tesno-stični proteini (23). Na primer, na in vitro modelih večplastnih poškodb urotelija sečnega mehurja, ki mu sledi celjenje rane, je pomembno dogajanje na t. i. rastočem ali vodilnem robu. Na tem mestu sta zgodnja celična dogodka proliferacija in gibanje celic, ki ju spremlja izražanje proteinov tesnih stikov. Že v enoskladnem uroteliju so prisotni proteini ZO-1, okludin in klavdin-4, kar je predpogoj za oblikovanje funkcionalne krv-no-urinske permeabilnostne pregrade (slika 5). Ker je ZO-1 le submembranski ogrodni protein, ki se povezuje z okludinom ali posameznim klavdinom, prisotnost ZO-1 torej ni
56
klavdin-B
klavdin-G
¿tSSfci - 'V
■ ■ v .	■ &
! fc: -i M
fcSV/
k

50 llh
Slika 5. Izražanje in razporejanje tesnostičnih proteinov med obnovo urotelija in vitro. Imunofluorescenca ZO-1, okludina in klavdina-8. A - ZO-1 je prisoten na mejah med sosednjimi celicami na vodilnem robu (puščica) ter v neprekinjenih linijah na apikalno-bazolate -ralnih delih plazmaleme (glava puščice) površinskih celic v dvoskladnem uroteliju za vodilnim robom. B - Okludin se nahaja v neprekinjenih linijah med površinskimi celicami v dvoskladnem uroteliju in v prekinjenih linijah na mejah med bazalnimi celicami. C - Klavdin-8 v enoskladnem uroteliju na vodilnem robu ni prisoten. D - Klavdin-8 je izražen na mejah med površinskimi urotelijskimi celicami v dvo-do triskladnem uroteliju za vodilnim robom.
pogojena tudi s funkcionalnimi tesnimi stiki (24). Novejše raziskave potrjujejo, da tudi vsi klavdini niso ključni za funkcionalnost tesnih stikov. V obnavljajočem se uroteliju po poškodbi je klavdin-8 tisti, ki se izrazi nazadnje in je prisoten v tesnih stikih med diferenciranimi površinskimi urotelijskimi celicami (slika 5) (25). Predvideva se, da je v uroteli-ju prav klavdin-8 tisti, ki je odgovoren za izredno visoko transepitelijsko upornost.
Zanimivo je, da lahko v primerih površinskih poškodb urotelija k hitrejšemu celjenju poškodbe prispevajo tudi že obstoječe, dokončno diferencirane površinske urotelij-ske celice, in sicer na dva načina. Prvič, v stiku z novimi, še ne dokončno diferenciranimi površinskimi celicami razvijejo tesne stike že eno uro po poškodbi, in drugič, z zalogami api-kalne plazmaleme v veziklih, shranjenih v apikalni citoplazmi, lahko povečajo površino apikalne plazmaleme celo do trikrat, s čimer zelo hitro in učinkovito prekrijejo obsežen del površinske poškodbe (26).
TESNI STIKI IN BOLEZNI
Tesni stiki v osnovi preprečujejo izgubo tekočin iz telesa, vstop vsebine iz notranjih telesnih svetlin v telo in tudi prodiranje bakterij med celicami epitelijev globlje v telo. V določenih primerih so spremembe v zgradbi tesne -ga stika osnovni vzrok za nekatere bolezni. So pa stanja, kjer ni trdnih zagotovil, ali so spremembe v tesnih stikih vzrok ali posledica bolezni. Pri pojavljanju bolezni so gotovo ključni klavdini, ki so v povezavi s čisto dolo -čenimi spremembami v pregradni vlogi tesnih stikov. Mutacije klavdinov lahko namreč pri -vedejo do specifičnih bolezni pri človeku, npr. mutacije klavdina-16 povzročajo dedno hipo -magneziemijo, mutacije klavdina-14 in/ali tricelulina pa gluhost (1, 6). Mutacije klavdi -na-1 v večskladnih epitelijih so vzrok neona-talnega sindroma ichthyosis sclerosis cholangitis. Do mutacije pride v genu na 3. kromosomu (3q28-q29), ki kodira klavdin-1 in se deduje avtosomno recesivno. Bolezen se izrazi z lu -skavico, pojavom levkocitinih vakuol, alope -cijo in kroničnim jetrnim obolenjem - skle-roznim holangitisom.
Za mnoge viruse in bakterije je znano, da zlorabijo spremembe tesnih stikov za vstop
v celico. Nekateri, zlasti virusi, uporabljajo tesnostične komponente kot receptorje, spet drugi spreminjajo strukturo tesnih stikov. Tako retrovirusi delujejo preko proteina JAM. Bakterija Helicobacter pylori pa se s proteinom CagA veže na ZO-1, Jam-A in nekatere proteine, ki določajo celično polarnost. Cag-A-pozitivni sevi so krivi za gastritise in adeno-karcinom (27, 28). Podobno se dogaja tudi v primeru Crohnove bolezni, pri atopičnem dermatitisu ali luskavici (29, 30). Znano je, da lahko vnetni citokini, kot sta npr. tumorski nekrozni faktor a (TNF-a) ali interferon Y, povzročijo internalizacijo tesnostičnih komponent in spremembo aktomiozinskega cito-skeleta ter tako spremenijo pregradno vlogo celic. Tako tudi mutacija filagrina, ki je ključni epidermalni pregradni protein, povzroči vnetje kože in atopični dermatitis.
Tesni stiki torej ustvarjajo v telesu različne pregrade med polariziranimi celicami epitelov in endotelov. Pregradna vloga, ki jo vzdržujejo tesni stiki v epitelijih in endotelijih, je ključna za homeostatsko delovanje tkiv. Le tako zagotavljajo normalno delovanje celic in tkiv v njih in preprečujejo specifična obolenja. Nekatere teh pregrad so dandanes že dobro preučene in med pomembnejšimi so gotovo pregrada med krvjo in zrakom v pljučih, možganovino, urinom, testisi in mrežnico.
Pregrada med krvjo in zrakom v pljučih ali alveolo-kapilarna bariera
Pregrada je nameščena v področju izmenja -ve plinov v pljučih. Gradijo jo tesni stiki med prevmociti tipa 1 v alveolarnih stenah, endo-telijskih celic kapilar in bazalna lamina pod celicami. Tovrstna pregrada je seveda pro -pustna za pline, kot so kisik, ogljikov dioksid, ogljikov monoksid in mnoge druge. Pregra -da je kljub izredno tanki strukturi (lahko samo 200 nm) mehansko izjemno močna, stabilna in omogoča zadovoljivo izmenjavo plinov z difuzijo. Kljub tej trdnosti pa se pri tlaku okrog 40mmHg lahko poruši, do česar prihaja v primeru izredno povišanega krvnega tlaka.
Ker so tesni stiki neposredno vključeni v regulacijo prehajanja ionov in makromole -kul tako v epitelijskih kot endotelijskih celi -cah, ponuja moduliranje te njihove zaporne vloge in s tem posredno tudi prepustnosti
57
58
med celicami možnost, da tako vplivamo na vnos in tudi povečamo vnos farmakoloških učinkovin kot tudi genskih vektorjev. Dihalni epitelij je neprehoden za makromolekule, ki bi vstopale z apikalne strani. Snovi, ki se uporabljajo za spreminjanje prepustnosti tesnih stikov, kot so na primer EGTA, natrijeve soli, nasičene maščobne kisline, lizofos-fatidilholin, resnično povečajo prepustnost tesnega stika, vendar tudi vplivajo na mnoge proteine v tesnem stiku ter izzovejo vnetje. Za zmanjšanje vnetnega odgovora, ki ga povzročajo omenjene snovi, pa je mogoča alternativna strategija zdravljenja, in sicer preko vplivov le na določene molekule tesnega stika. Ti postopki zdravljenja ciljajo neposredno na specifične tesnostične proteine. Takšno tarčo predstavlja predvsem okludin (31). Z vplivanjem nanj se tako nudi možnost manjše toksičnosti za dihalni epitelij in doseže večji specifični odgovor.
Pregrada med krvjo
in možganovino
ali krvno-možganska bariera
Bakteriolog Paul Ehrlich (1854-1915), ki je injiciral anilinska barvila v živali, je opazil, da ostanejo možgani neobarvani. Tako je bil Ehrlich prvi, ki je empirično opisal krvno-mož-gansko pregrado. Delo je nadaljeval leta 1913 njegov študent Edwin Goldmann, ki je barvilo vnesel v spinalno tekočino in opazil, da se v tem primeru možgani obarvajo, vendar ne preostalo telo. Takrat so menili, da so za pojav te pregrade odgovorne krvne žile, kaj -ti v sistemu, ki so ga preučevali, niso opazili nobene membrane. Koncept krvno-možgan -ske pregrade pa je dejansko bil potrjen šele leta 1960 s pomočjo presevne elektronske mikroskopije. Krvno-možganska pregrada, imenovana tudi hematoencefalna pregrada, je osnovana na celični ravni v centralnem živčnem sistemu. V principu omejuje preha -janje različnim snovem in mikroorganizmom med krvjo in živčnim tkivom. Pri tem pa omo -goča prehod snovi, ki so nujno potrebne za metabolno funkcijo živčnega tkiva (npr. kisik). Ta pregrada je posledica tesnih stikov med endotelijskimi celicami in centralnim živčnim sistemom. Na stičišču krvi in možganovine se povezujejo endotelijske celice in astrociti, na teh mestih se oblikujejo tesni stiki. Krv -
no-možgansko pregrado sestavlja v osnovi izjemna gostota celic, ki je nekajkrat večja kakor med endotelijskimi celicami drugod
v	telesu. Podaljški astrocitov (imenovani tudi glia meja) obdajajo endotelijske celice krv-no-možganske pregrade in poskrbijo za izmenjavo snovi za živčne celice. Krvno-možganska bariera se loči od sorodne krvno-cerebrospi-nalne tekočinske bariere, ki jo določajo povezave med celicami horoidnega pleksusa.
Krvno-možganska pregrada je zelo učinkovita prepreka med krvjo in možganskim tkivom, ki ima pomembno vlogo zlasti pri varovanju možganov pred številnimi bakterijskimi okužbami. Zaradi te vloge so bakterijske okužbe možganov zelo redke, vendar pa nekateri virusi lažje kakor bakterije prehajajo to pregrado. Ker je torej le-ta zgrajena izredno trdno in tesno, se pojavljajo težave v primeru nekaterih zdravljenj, ki zahtevajo vnos protiteles. Protitelesa so namreč zelo velike molekule, ki težko prehajajo pregrado, zato so okužbe možganov povezane z zelo resnimi in hkrati težko ozdravljivimi obolenji.
Prehod krvno-možganske pregrade za potrebe vnosa terapevtskih učinkovin za zdravljenje možganskih okvar je zato v določen predel možganov zelo težaven. Terapevtske molekule in geni, ki bi lahko bili zelo učinkoviti v diagnosticiranju in zdravljenju možganskih obolenj, ne prehajajo krvno-možganske pregrade v zadostnih količinah. Zaradi tega se uporabljajo različni sistemi za vnos sestavin v možgane. Mnogi od teh obidejo pre -grado (receptorsko pogojena transcitoza, intra -cerebralna implantcija, metode za lokalno porušenje pregrade). Zelo obetaven vnos sno -
vi	čez krvno-možgansko pregrado predstav -ljajo novejše tehnologije, kot je na primer nanotehnologija. Z razvojem in uporabo nano -delcev, vgrajenih v liposome, je mogoč lažji prehod čez omenjeno pregrado. Liposomi z nanodelci tako predstavljajo možnost tarč -nega uničevanja celic v možganih in so potencialno uporabni pri zdravljenju možganskih tumorjev. V novejšem času pa je predlagan predvsem mehanizem prehajanja preko barie-re med možgani in krvjo s pomočjo mikrove -ziklov.
Prenos učinkovin čez to pregrado pa ven -dar predstavlja eno najbolj obetavnih aplika -cij nanotehnologije v klinični nevroznanosti.
Nanodelci lahko potencialno rešujejo mnoge naloge, ki so zelo pomembne za sproščanje in prenos učinkovin čez to pregrado. Tako v novejšem času preskušajo nekatere antineo-plastične učinkovine proti tumorjem centralnega živčevja, kot je tretiranje s polietilen-glikolom prekrite heksadecilcianakrilatne nanokroglice, ki tarčijo in se zbirajo (poskusi pri podganah) v gliosarkomu. Vedeti pa je treba, da so žilne endotelijske celice in periciti v tumorjih pogosto abnormalni in pregrada v možganskih tumorjih ni vedno neokrnjena, tako da lahko tudi drugi dejavniki, kot so astrociti, vplivajo na odpornost možganskih tumorjev na takšna zdravljenja.
Pregrada med krvjo in urinom ali krvno-urinska bariera
Tesni stiki med površinskimi urotelijskimi celicami in specializirana apikalna plazmalema površinskih celic, tako njena lipidna kot tudi proteinska sestava, zagotavljajo najmočnejšo pregrado v našem telesu, to je krvno-urinsko pregrado (32-34). Upornost urotelija je med 10.000 in celo več kot 100.000 Qcm2. Ocenjeno je, da tesni stiki med površinskimi urote-lijskimi celicami zagotavljajo paracelično upornost, ki lahko izjemoma preseže celo vrednost 300.000 Qcm2. Razlog za visoko transepitelijsko upornost urotelija je predvsem v molekularni sestavi apikalne plazma-leme površinskih urotelijskih celic in v tesnih stikih. V apikalni plazmalemi so v visokem deležu prisotni transmembranski proteini
uroplakini (UPIa, UPIb, UPII, UPIII), katerih velika zunajcelična domena je razlog, da je apikalna plazmalema v površinskih urotelijskih celicah debelejša kot pri ostalih celicah. Kar v 90% je njena debelina 12nm in le v preostalem odstotku je debelina običajnih 7 nm. Uroplakini skupaj z lipidi, ki jih najdemo tudi v mielinu, npr. sfingolipidi in holesterol, učinkovito zmanjšujejo prepustnost apikalne plazmaleme (34). Dodatno k temu prispeva tudi značilno zmanjšana apikalna endo-citoza v diferenciranih površinskih urotelij-skih celicah. V primerjavi z ledvičnimi epitel-nimi celicami MDCK imajo površinske uro-telijske celice kar 5-15-krat nižjo endoci -totsko aktivnost (35). Nedavno so Kreplak in sodelavci (2007) s pomočjo mikroskopa na atomsko silo ugotovili, da k transepitelijski upornosti prispevajo tudi značilni prepleti med sosednjimi celicami (slika 6). Ti prepleti oziroma zajede ene celice v drugo ustvarjajo nekakšno membransko zadrgo, ki verjetno še dodatno prispeva h krvno-urinski pregradi (36).
S krvno-urinsko pregrado je vsebina odpadnih snovi, med katerimi so nekatere tudi toksične in potencialno kancerogene, skladiščena v svetlini sečnega mehurja do mikcije in tako varno ločena od bazolateralnega prostora, ki je izmenljiv s krvjo. Pod vplivom pato-genov ali pri določenih obolenjih sečnega mehurja, kot so vnetje sečnega mehurja (cistitis), vezikouretralni refluks ali neoplastna transformacija, se na površini urotelija izpo -stavijo manj diferencirane celice s slabše raz-
59
Slika 6. Povezave med površinskimi urotelijskimi celicami. A - Z mikroskopom na atomsko silo slikane medceliine povezave, ki so vidne kot prepleti oz. zajede ene celice v drugo (označeno s puščicami). Orientacija teh zajed se izmenično spreminja. B - Preplet (glava puščice) in nižje ležeči tesni stik (puščica) med dvema sosednjima celicama. Slikano s presevnim elektronskim mikroskopom.
60
vitimi tesnimi stiki. V takih primerih je funkcionalnost krvno-urinske pregrade okrnjena.
Uropatogena Escherichia coli (UPEC), ki povzroča več kot 80 % vseh okužb urinarne-ga trakta, se z adhezinom FimH, ki se nahaja na koncu fimbrij tipa 1, veže na UPIa na apikalni plazmalemi površinskih urotelijskih celic. Najnovejše raziskave s krio-elektronsko mikroskopijo so pokazale, da FimH ob vezavi na receptor (UPIa) sproži zvišanje znotraj-celične koncentracije kalcija in fosforilacijo citoplazemskega repa UPIIIa, kar povzroči prerazporeditev citoskeleta in vstop bakterije v urotelijsko celico (37). Obenem UPEC na še nepoznan mehanizem povzroči prekinitve tesnih stikov. Prekinitvi tesnostičnih in tudi ostalih medceličnih vezi sledi intenzivno luš-čenje površinskih urotelijskih celic. To ima za posledico porušitev krvno-urinske bariere in vdor toksičnih snovi po medceličnem prostoru v globlje plasti urotelija. Takšne spremembe vodijo v nastanek vnetij, posledično sprožajo intenzivnejšo proliferacijo celic, kar lahko kasneje vodi tudi v neoplastno transformacijo. Zaradi vsega tega je krvno-urinska bariera ključnega pomena za normalno delovanje sečnega mehurja.
Pregrada med krvjo in testisi ali bariera med testisi in krvjo
Oblikujejo jo tesnostične povezave med Serto-lijevimi celicami kot opornimi celicami v se -menskih kanalčkih in spermatogoniji (38). Osnovni namen te bariere je preprečitev pre -hajanja citotoksičnih snovi (toksičnih mole -kul ali infekcijskih celic v testisove kanalčke). Pregrada se lahko prekinja zaradi travmatičnih dogodkov ali mehanskih poškodb testisov ali zaradi kirurškega posega - vazektomija. V primeru porušitve lahko spermiji vstopajo v krvožilje, kar izzove imunski odgovor oziro -ma avtoimunski odgovor. Protitelesa, usmerje -na proti spermijem, se lahko vežejo na številna antigenska vezavna mesta na površini sper -mijev. Ce se vežejo na glavico spermija, je okrnjena oploditvena sposobnost z jajčno celico. Prav tako je možnost za oploditev manjša
v primeru, če se protitelesa vežejo na rep spermija.
Pregrada med krvjo in mrežnico v očesu ali krvno-očesna bariera
Pregrada med krvjo in mrežnico je del obsežne krvno-očesne bariere. Sestoji iz nefeni-striranih kapilar, ki gradijo krvožilni sistem mrežnice, in tesnih stikov med retinalnimi pigmentnimi epitelijskimi celicami (39). Tako je preprečen vstop določenim snovem iz tkiv v mrežnico oziroma je preprečeno prehajanje velikih molekul iz horio-kapilarnega prepleta v mrežnico. Ta pregrada ima dve sestavni komponenti: mrežnično-vezikularni endote-lij in retinalni pigmentni epitelij. V bistvu kapilare v mrežnici, ki so podobne kapilaram v možganih, vzdržujejo notranjo krvno očesno pregrado. Tesni stiki so neprehodni za številne označevalce, zaradi česar številne snovi ne morejo prehajati v očesno beločnico. V primeru sladkorne bolezni je porušena krv -no-očesna pregrada, kar posledično privede do okvar oči in obolenja, imenovanega diabetična retinopatija. Rizični dejavnik predstavlja tudi povečan krvni pritisk, saj postane v tem primeru ta pregrada prepustnejša.
ZAKLJUČEK
Tesni stiki so zelo pomembna vrsta povezav med celicami, saj v osnovi ločujejo naše telo od zunanjosti in od notranjih telesnih votlin. Posledično vzpostavljajo in vzdržujejo mnoge pregrade v telesu in čeznje omejujejo prosto prehajanje snovem ali ga povsem preprečijo. Pregrade so pogoj za normalno delovanje celic in tkiv. Znanje o molekularni sestavi, name -stitvi in vlogi tesnostičnih pregrad v telesu je dandanes že zelo temeljito. Ravno pregradna vloga stika pa hkrati predstavlja tudi težavo pri vnosu določenih učinkovin v telo. Razvija -jo se pomembne nove strategije ciljnega vnosa učinkovin v telo preko tesnostične pregrade, kar že predstavlja bistven doprinos pri zdravljenju nekaterih obolenj.
LITERATURA
1.	Van Itallie CM, Anderson JM. Claudins and epithelial paracellular transport. Annu Rev Physiol. 2006; 68: 403-29.
2.	Farquhar MG, Palade GE. Junctional complexes in various epithelia. J Cell Biol. 1963; 17: 375-412.
3.	Fujimoto K. Freeze-fracture replica electron microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Application to the immuno gold labelling of intercellular junctional complexes. J Cell Sci. 1995; 108: 3443-9.
4.	Saitou M, Fujimoto K, Doi Y, et al. Occludin-deficient embryonic stem cells can differentiate into polarized epithelial cells bearing tight junctions. J Cell Biol. 1998; 141: 397-408.
5.	Ikenouchi J, Furuse M, Furuse K, et al. Tricellulin constitutes a novel barrier at tricellular contacts of epithelial cells. J Cell Biol. 2005; 171: 939-45.
6.	Furuse M, Tsukita S. Claudins in occludin junctions of human and flies. Trends Cell Biol. 2006; 16: 181-8.
7.	Rehder D, Iden S, Nasdala I, et al. Junctional adhesion molecule-a participates in the formation of apico-basal polarity through different domains. Exp Cell Res. 2006; 312: 3389-403.
8.	Gliki G, Ebnet K, Aurrand-Lions M, et al. Spermatid differentiation requires the assembly of a cell polarity complex downstream of junctional adhesion module C. Nature. 2004; 421: 320-4.
9.	Scheeberger EE, Lynch RD. The tight junction: a multifunctional complex. Am J Physiol. 2004; 286: C1213-28.
10.	Fanning AS, Ma TY, Anderson JM. Isolation and functional characterization of the actin binding region in the tight junction protein ZO-1. FASEB J. 2002; 16: 1835-7.
11.	Stevenson BR, Begg DA. Concentration-dependent effects of cytochalasin D on tight junctions and actin filaments in MDVK epithelial cells. J Cell Sci. 1994; 107: 367-75.
12.	Wells CD, Fawcett JP, Traweger A, et al. A Rich1/Amot complex regulates the Cdc42 GTPase and apical-polarity proteins in epithelial cells. Cell. 2006; 125: 535-48.
13.	Vestweber D. Regulation of endothelial cell contracts during leukocyte extra vasation. Current Opinion Cell Biol. 2002; 14: 587-93.
14.	Nelson WJ. An adaptation of core mechanisms to generate cell polarity. Nature. 2003; 422: 766-74.
15.	Shin K, Fogg VC, Margolis B. Tight junctions and cell polarity. Annu Rev Cell Dev Biol. 2006; 22: 207-35.
16.	Orleando RC, Lacy ER, Tobey NA, et al. Barriers to paracellular permeability in rabbit esophagel epithelium. Gastroenterology. 1992; 102: 910-23.
17.	Tsuruta D, Green KJ, Getsios S, et al. The barrier function of skin: how to keep a tight lid on water loss. Trends in Cell Biol. 2002; 12: 355-8.
18.	Schluter H, Wepf R, Moll I, et al. Sealing the live part of the skin: the integrated meshwork of desmosomes, tight junctions and curvilinear ridge structures in the cells of the uppermost granular layer of the human epidermis. Eur J Cell Biol. 2004; 83: 655-65.
19.	Vermeer PD, Einwalter LA, Moninger TO, et al. Segregation of receptor and ligand regulates activation of epithelial growth factor receptor. Nature. 2003; 422: 322-6.
20.	Daniel JM. Dancing in and out of the nucleus: p120 (ctm) and the transcription factor Kaiso. Biochem Biophys Acta. 2007; 1773: 59-68.
21.	Gottardi CJ, Arpin M, Fanning AS, et al. The junction-associated protein, zonula occludens-1, localizes to the nuc -leus before the maturation and during the remodeling of cell-cell contacts. Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93: 10779-84.
22.	Fuchs E, Tumbar T, Guasch G. Socializing with the neighbors: stem cells and their niche. Cell. 2004; 116: 769-78.
23.	Malminen M, Koivukangas V, Peltonen J, et al. Immunohistological distribution of the tight junction components ZO-1 and occludin in regenerating human epidermis. Br J Dermatol. 2003; 149 (2): 255-260.
24.	Rajasekeran AK, Hojo M, Huima T, et al. Catenins and Zonula Occludens-1 form a coplex during early stages in the assembly of tight junctions. J Cell Biol. 1996; 132: 451-463.
25.	Kreft M, Sterle M, Jezernik K. Distribution of junction- and differentiation-related proteins in urothelial cells at the leading edge of primary explant outgrowths. Histochem Cell Biol. 2006; 125: 475-85.
26.	Kreft ME, Sterle M, Veranic P, et al. Urothelial injuries and the early wound healing response: tight junctions and urothelial differentiation. Histochem Cell Biol. 2005; 123: 529-39.
27.	Krueger S, Hundertmark T, Kuster D, et al. Helicobacter pylori alters the distribution of ZO-1 and p120cttm in primary human gastic epithelial cells. Pathol Res Pract. 2007; 203: 433-44.
28.	Saadat I, Higashi H, Obuse C, et al. Heliobacter pylori CagA targets PAR1/MARK kinase to disrupt epithelial cell polarity. Nature. 2007; 447: 330-3.
29.	Turner JR. Molecular basis of epithelial barrier regulation: from basic mechanisms to clinical application. Am J Pathol. 2006; 169: 1901-9.
30.	Laukoetter MG, Bruewer M, Nusrat A. Regulation of intestinal epithelial barrier by the apical junctional complex. Curr Opin Gastroenterol. 2006; 22: 85-9.
31.	Everett RS, Vanhook MK, Barozzi N, et al. Specific Modulation of Airway Epithelial Tight Junctions by Apical Application of an Occludin Peptide. Mol Pharmacol. 2006; 69: 492-500.
61
32.	Hicks RM. The fine structure of the transitional epithelium of the rat ureter. J Cell Biol. 1965; 26: 25-48.
33.	Jezernik K, Pipan N. Blood-urine barrier formation in mouse urinary bladder development. Anat Rec. 1993; 235: 533-8.
34.	Hu P, Deng FM, Liang FX, et al. Ablation of uroplakin III gene results in small urothelial plaques, urothelial leakage, and vesicoureteral reflux. J Cell Biol. 2002; 151 (5): 961-71.
35.	Kreft ME, Romih R, Kreft M, et al. Endocytotic activity of bladder superficial urothelial cells is inversely related to their differentiation stage. Differentiation. 2009; 77 (1): 48-59.
36.	Kreplak L, Wang H, Aebi U, et al. Atomic force microscopy of mammalian urothelial surface. J Mol Biol. 2007; 374(2): 365-73.
37.	Wang H, Min G, Glockshuber R, et al. Uropathogenic E. coli adhesin-induced host cell receptor conformational changes: implications in transmembrane signaling trunsduction. J Mol Biol. 2009; v tisku.
38.	Russell LD. Movement of spermatocytes from the basal to the adluminal compartment of the rat testis. Am J Anat. 1977; 148: 313-28.
39.	Vinores SA. Assessment of blood-retinal barrier integrity. Histol Histopathol. 1995; 10(1): 141-54. Prispelo: 16.7. 2009
62