UDK 636 / 637 ISSN 1581-9175 Acta agriculturae slovenica Letnik 84, številka 2 Volume 84, Number 2 Doslej: ZBORNIK BIOTEHNIŠKE FAKULTETE UNIVERZE V LJUBLJANI Kmetijstvo. Zootehnika Previously: RESEARCH REPORTS BIOTECHNICAL FACULTY UNIVERSITY OF LJUBLJANA Agriculture. Zootechny 84-2 Ljubljana, Acta agriculturae slovenica str. 91–170 december 2004 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2 Acta agriculturae slovenica Doslej: Zbornik Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani. Kmetijstvo. Zootehnika Izdaja Glavni in odgovorni urednik Tehnični urednik Uredniški odbor Jezikovni pregled Razmnoževanje Naslov uredništva E-pošta Domača stran Letna naročnina Posamezna številka Račun Sofinancira Zbornik redno selektivno zajemajo Dokumentacijska obdelava Publikacije v zameno za Zbornik pošljite na naslov Biotehniška fakulteta Univerze v Ljubljani, Jamnikarjeva 101, SI-1111 Ljubljana. Letno izhajata dva letnika vsak z dvema številkama. prof. dr. Peter DOVČ Jože STOPAR prof. dr. Tajana ČERNY (Zagreb), akad. prof. dr. Remzi BAKALLI (Athens, ZDA), prof. dr. Zdenko PUHAN (Zürich), dr. Michel BONNEAU (Saint Gilles), prof. dr.dr.h.c. Franz PIRCHNER (Innsbruck), prof. dr. Jasna M.A. STEKAR (Ljubljana), dr. Drago BABNIK (Ljubljana), izr.prof. dr. Jernej TURK (Maribor), izr.prof. dr. Dejan ŠKORJANC (Maribor), doc. dr. Slavica GOLC TEGER (Ljubljana), izr.prof. dr. Milena KOVAČ (Ljubljana) Vanda ŠUŠTERŠIČ Tiskarna Pleško d.o.o., Rožna dolina, cesta IV/32-36, SI-1000 Ljubljana v 450 izvodih Groblje 3, SI-1230 Domžale, tel.: 01 7217 800, telefaks: 01 7241 005 peter.dovc@bfro.uni-lj.si http://www.bf.uni-lj.si/aas 6 000 SIT, za tujino 35 USD 4 000 SIT, za tujino 25 USD 01100-6030707410, sklic na številko 40-521-200341 Ministrstvo za šolstvo, znanost in šport Republike Slovenije AGRIS, CAB Abstracts, COBISS in FSTA Mednarodna: Slovenski nacionalni center AGRIS Domača: INDOK Oddelka za zootehniko Centralna knjižnica Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani, Jamnikarjeva 101, SI-1111 Ljubljana, p.p. 2995 Avtorska pravica © 2004 Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko Acta agriculturae slovenica Previously: Research Reports Biotechnical Faculty University of Ljubljana. Agriculture. Zootechny Issued by Biotechnical Faculty, University of Ljubljana, Jamnikarjeva 101, SI-1111 Ljubljana., Slovenia. Editor-in-Chief Technical Editor Editor Board Proof Reading Printed by Address of Editor E-mail Home page Annual subscription Individual issue No. of Bank Account SWIFT Code Subsides by Res. Reports are regularly indexed and abstracted by Prof. Peter DOVČ, Ph.D. Jože STOPAR Prof. Tajana ČERNY, Ph.D. (Zagreb), Academician Prof. Remzi BAKALLI, Ph.D., (Athens, ZDA), Prof. Zdenko PUHAN, Ph.D. (Zürich), Michel BONNEAU, Ph.D. (Saint Gilles), Prof. Dr.h.c. Franz PIRCHNER, Ph.D. (Innsbruck), Prof. Jasna M.A. STEKAR, Ph.D. (Ljubljana), Drago BABNIK, Ph.D. (Ljubljana), Assoc.Prof. Jernej TURK, Ph.D. (Maribor), Assoc.Prof. Dejan ŠKORJANC, Ph.D. (Maribor), Ass.Prof. Slavica GOLC TEGER, Ph.D. (Ljubljana), Assoc.Prof. Milena KOVAČ, Ph.D. (Ljubljana) Vanda ŠUŠTERŠIČ Tiskarna Pleško d.o.o., Rožna dolina, cesta IV/32-36, SI-1000 Ljubljana, Slovenia, in 450 copies Groblje 3, SI-1230 Domžale, Slovenia, Tel.: +386 1 7217 800, Telefaks: +386 1 7241 005 peter.dovc@bfro.uni-lj.si http://www.bf.uni-lj.si/aas 6 000 SIT, for foreign countries 35 US$ 4 000 SIT, for foreign countries 25 US$ 27620-5085063007-040 Deželna banka Slovenije d.d., Kolodvorska 9, SI-1000 Ljubljana SZKB SI-2X Ministry of Education, Science and Sport of Republic Slovenia AGRIS, CAB Abstracts, COBISS and FSTA Indexing, Classification and Networking International: Slovene National AGRIS Center National: INDOC of zootechnics Please, address exchange publication to Central Library of the Biotechnical Faculty, University of Ljubljana, Jamnikarjeva 101, SI-1111 Ljubljana, P.O. Box 2995, Slovenia Copyright © 2004 University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Zootechnical Department Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2, 91-92. UDK 636 / 637 ISSN 1581-9175 Acta agriculturae slovenica Letnik 84 Ljubljana, december 2004 Številka 2 VSEBINA / CONTENTS stran page In memoriam Josef A. STARK (1942-2004) Janez POKLUKAR ....................................................................................................................... 93 Doc. dr. Janez POKLUKAR (1960–2004) Peter KOZMUS ............................................................................................................................. 95 Genetika / Genetics Transkripcijsko uravnavanje adipogeneze in vloga koaktivatorja PGC-1? Tamara MILOŠEVIČ BERLIČ in Peter DOVČ ........................................................................... 97 Milk production in the post-genomic era Polona FRAJMAN and Peter DOVČ .......................................................................................... 109 Polimorfizem genov za ß-laktoglobulin in ?s1-kazein paške ovce Ante IVANKOVIĆ in Peter DOVČ ............................................................................................ 121 Rodovi lipicancev slovenske reje glede na haplotip mitohondrijske DNK Tatjana KAVAR, Franc HABE in Peter DOVČ ......................................................................... 131 Mikrobiologija / Microbiology Razgradnja ksilana z različnimi ksilanazami vampne bakterije Pseudobutyrivibrio xylanivorans Mz5T Tadej ČEPELJNIK, Katarina FIDLER in Romana MARINŠEK-LOGAR ................................ 141 Živinoreja / Animal breeding Distribution of tissues in the carcass of Turopolje pig, an autochtonous Croatian breed Marija ĐIKIĆ, Krešimir SALAJPAL, Danijel KAROLYI, Ivan JURIĆ and Vlatko RUPIĆ ............................................................................................................................. 153 Subject index by Agrovoc descriptors Tomaž BARTOL ......................................................................................................................... 161 Subject index by Agris category codes Nataša SIARD ............................................................................................................................. 163 Abecedno kazalo avtorjev ........................................................................................................ 165 Navodila avtorjem ..................................................................................................................... 167 Notes for authors ....................................................................................................................... 169 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2, 93-94. JOSEF A. STARK (1942-2004) Prvega marca letos nas je zapustil član uredniškega odbora Josef A. Stark s Švedske univerze kmetijskih znanosti v Uppsali na Švedskem. Prijatelji smo ga na njegovo željo klicali enostavno Jože. Jože se je rodil 18. avgusta 1942 v Čurilih pri Metliki. Vojna vihra druge svetovne vojne mu je vzela očeta, tako, da je moral z bratoma in nesebičnim razdajanjem svoje matere in stare mame odraščati v skromnosti in nenehni borbi za življenje ter za dokazovanje – to znam, to zmorem. Osnovno šolo je končal v Metliki, srednjo kmetijsko šolo pa v Križevcih na Hrvaškem pri svojemu stricu. Po odsluženi vojaščini je odšel v Ljubljano. Kmalu se je odločil, da bo poskušal na novo začeti v Kaliforniji pri svojem stricu. Tja naj bi odpotoval preko Švedske. Usoda je hotela drugače – ostal je na Švedskem. Zaposlil se je kot fizični delavec na farmi blizu Uppsale. Ob delu je končal gimnazijo. V letu 1975 je z delom »Studies of microorganisms active on the degradation of 2,4-D and MCPA« diplomiral na Švedski univerzi kmetijskih znanosti v Uppsali. Na Univerzi se je najprej zaposlil kot asistent, v letih 1979-1982 je napredoval v pomočnika vodje odseka za čebelarstvo. Leta 1982 je doktoriral z delom »Persistence of herbicides in forest soils« in napredoval v vodjo odseka za čebelarstvo. Na Univerzi je bil zaposlen do leta 2003, ko je po reorganizaciji le-te odšel v pokoj. Poleg številnih znanstvenih del smo lahko vedno znova občudovali njegovo energijo in dejavnost pri čebelarjih v Skandinaviji in tudi na mednarodni ravni. Srečali smo ga lahko povsod v zahodno evropskih državah. Večkrat je v okviru raziskovalnih projektov obiskal Kubo, Peru, Bolivijo, Japonsko, Avstralijo, ZDA, Poljsko in Slovenijo. Ni čudno, da je bil na Švedski univerzi kmetijskih znanosti cenjen mentor številnim dodiplomskega in podiplomskega študija. Bil je predsednik strokovnega združenja rejcev temne čebele SICAMM in veliki občudovalec naše kranjske čebele. Jože je sodeloval tudi v številnih dokumentarnih filmih, televizijskih in radijskih oddajah. Med čebelarji je bil poznan kot odličen predavatelj. Bil je član številnih združenj in organizacij. Prejel je najvišje kraljevo odlikovanje Švedskega kralja. Jože je bil velik svetovljan. Slovenska vlada ga je leta 2000 imenovala za častnega konzula republike Slovenije na Švedskem, pisnega 94 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2. imenovanja pa iz njemu neznanih razlogov ni prejel. Na žalost ga je zaradi dolgotrajnosti formalnih postopkov in nekaterih proceduralnih zapletov tik pred končnim pisnim sklepom o imenovanju prehitela smrt. Kljub trdemu delu in razpetostjo med rojstnim krajem in novo domovino, je Jože našel čas za druženje z belokranjskimi in slovenskimi čebelarji ter strokovnjaki s tega področja. Kadar koli ga je pot prinesla domov, nam je pripravil čudovita predavanja. Na zadnjem svetovnem čebelarskem kongresu v Ljubljani je vodil posvet »Biologija čebel in vpliv okolja nanje«. Slovenski čebelarji so mu zelo hvaležni za njegov prispevek k uspešni izvedbi kongresa. Jože je bil ponosen, da so lahko čebelarji Švedske in drugih držav sveta, videli in dojeli našo urejenost in kulturo. Domači in najtesnejši prijatelji so se od njega poslovili v petek 10. marca 2004 v katoliški cerkvi v Uppsali. Tudi mi ga ohranimo v trajnem spominu. doc. dr. Janez POKLUKAR Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2, 95-96. Doc. dr. JANEZ POKLUKAR (1960–2004) V ponedeljek, 5. aprila je za posledicami poškodb pri delovni nesreči, v ljubljanskem Kliničnem centru, umrl doc. dr. Janez Poklukar iz Seničnega pri Tržiču, ugleden, svetovno znan čebelarski strokovnjak, raziskovalec, znanstvenik in pedagog na Biotehniški fakulteti. Rodil se je 2. maja 1960 v Kranju, kot sin kmečkih staršev Jakoba in Ane Poklukar. Po prvih štirih letih osnovne šole, ki jo je obiskoval v Dupljah, je osnovno šolanje nadaljeval v Kranju. Po končani osnovni šoli se je leta 1975 vpisal na živinorejsko-veterinarsko tehnično šolo v Ljubljani, kjer je leta 1978 z odliko maturiral. Po končani srednji šoli se je vpisal na višješolski študij živinoreje na Biotehniški fakulteti v Ljubljani in po opravljeni diplomi nemudoma nadaljeval študij na visokošolskem študiju živinoreje. Diplomiral je 3. septembra 1982 z diplomskim delom »Primerjava mlečnih proizvodenj na družbenem obratu in na kmetijah« in si s tem pridobil strokovni naziv diplomirani inženir kmetijstva živinorejske smeri. Po študiju je odšel na služenje vojaškega roka, potem pa se je za določen čas zaposlil kot pripravnik na Kmetijsko živilskem kombinatu v Kranju. Leta 1984 se je poročil z Miro Papler iz Žej pri Naklem. Preselila sta se v Senično, in v zakonu so se jima rodili trije otroci: Tanja, Klavdija in Aleš. Janez Poklukar je bil od 1. novembra 1984 zaposlen na Kmetijskem inštitutu Slovenije, kjer je bil vodja selekcije v čebelarstvu. Že med služenjem vojaškega roka je vpisal podiplomski študij na Biotehniški fakulteti s področja genetike in selekcije v živinoreji. Magistrski študij genetike in selekcije v živinoreji je zaključil z delom »Uspešnost masovne selekcije domače čebele v pogojih kontroliranega in svobodnega parjenja matic v letu 1989«. V letu 1992 je uspešno zagovarjal doktorsko disertacijo z naslovom »Genetski parametri površine domaće pčele (Apis mellifera carnica) i proizvodnja meda«, na Agronomski fakulteti Vseučilišča v Zagrebu. S tem je zaključil dobo usposabljanja v okviru programa mladih raziskovalcev. V letu 1995 si je pridobil naziv višji znanstveni sodelavec, v letu 1997 pa je bil habilitiran za docenta na področju čebelarstva na Biotehniški fakulteti v Ljubljani. V času izvolitve v naziv je bil mentor 11 diplomantom visokega strokovnega in univerzitetnega študija zootehnike na 96 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2. Biotehniški fakulteti. Dve diplomski nalogi sta bili nagrajeni s Prešernovo nagrado Biotehniške fakultete. V zadnjem času je bil mentor dvema podiplomskima študentoma. Poleg dela, ki ga je opravljal na kmetijskem inštitutu Slovenije in na Biotehniški fakulteti, je bil zelo dejaven tudi na drugih področjih: Med drugim je bil član stalne delovne skupine za čebelarstvo pri Evropski komisiji v Bruslju, nosilec predmeta "Genetika pčela" na podiplomskem študiju "Stočarstvo, Mljekarstvo, Pčelarstvo na Agronomski fakulteti Vseučilišča v Zagrebu, član upravnega odbora Čebelarske zveze Slovenije, član delovne skupine za pripravo Zakona o živinoreji, vodja vertikalne delovne skupine za pripravo podzakonskih aktov na področju čebelarstva, član programskega sveta Mednarodnega kmetijsko – živilskega sejma, Gornja Radgona, član oz. predsednik komisije za ocenjevanje medu, koordinator strokovnih nalog v čebelarstvu ter vodja opazovalno- napovedovalne službe gozdnega medenja. Za dr. Janeza Poklukarja lahko rečemo, da je delal kolikor je mogel in da se ni skrival za obveznostmi, ki so mu bile dane s strani Kmetijskega inštituta. Tudi zaradi tega je njegova znanstvena, strokovna in poljudna bibliografija tako obsežna. Od leta 1982 je napisal preko 220 prispevkov, med drugim 24 znanstvenih in 77 strokovnih člankov, 20 znanstvenih prispevkov na konferencah, 17 strokovnih prispevkov na konferencah, 17 povzetkov znanstvenih prispevkov na konferencah, 20 končnih poročil o rezultatih raziskav ter 9 elaboratov, predštudij in študij. Neprecenljivo je tudi njegovo uredniško in avtorsko delo pri izdaji knjige »Od čebele do medu«, ki je izšla pred šestimi leti pri založbi Kmečki glas. Zaradi svoje široke znanstvene in strokovne razgledanosti je bil tudi odličen pedagog, ki je svoje bogato znanje razdajal študentom pa tudi na predavanjih za čebelarje, po vsej Sloveniji in v tujini. Tudi njegov mednarodni ugled je pripomogel, da je bil lani v Sloveniji svetovni čebelarski kongres Apimondia 2003, kjer je skupaj s pred kratkim preminulim dr. Josefom Starkom brezhibno izpeljal strokovni del kongresa. Odlična izvedba kongresa, pa tudi njegova sposobnost, da se je pri pomembnih odločitvah odločal hitro, sta pripomogli, da je v začetku letošnjega leta postal član devetčlanske strokovne skupine za med pri evropski komisiji v Bruslju. Ob vsem tem pa je našel čas tudi za združevanje strokovnega in družabnega, saj je kot predsednik Slovenskega akademskega čebelarskega društva (SAČD) organiziral številna strokovna srečanja in ekskurzije. Kljub številnim obveznostim je ostal dostopen za vsakega čebelarja. Nikoli ni odrekel besede in njegova strokovna razlaga je pogosto pomagala pri reševanju problemov. Ker se je njegova življenjska pot končala veliko prehitro, se je v slovenskem čebelarskem prostoru pojavila velika praznina, ki je ne bo mogoče kmalu zapolniti. Od njega smo se poslovili 8. aprila 2004 v cerkvi v Naklem pri Kranju. Ohranili ga bomo v trajnem spominu. Peter KOZMUS, univ. dipl. inž. zoot. Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2, 97-107. http://www.bf.uni-lj.si/aas Agris category codes: L10 COBISS Code 1.02 TRANSKRIPCIJSKO URAVNAVANJE ADIPOGENEZE IN VLOGA KOAKTIVATORJA PGC-1? * Tamara MILOŠEVIČ BERLIČ a) in Peter DOVČ b) a) Krka, d. d., Dunajska 65, SI-1000 Ljubljana, dr., e-pošta: tamara.berlic@krka.biz. b) Univ. v Ljubljani, Biotehniška fak., Odd. za zootehniko, Groblje 3, SI-1230 Domžale, Slovenija, prof., dr., e-pošta: peter.dovc@bfro.uni-lj.si. Delo je prispelo 10. novembra 2004, sprejeto 03. decembra 2004. Received November 10, 2004, accepted December 03, 2004. IZVLEČEK Adipogeneza je kompleksen proces, na katerega vpliva veliko število genetskih in okoljskih faktorjev. Ker je posledica prekomernega nalaganja maščob debelost, pogosto pa tudi pojav diabetesa tipa 2, postaja proučevanje molekulskih osnov adipogeneze vse bolj pomembno tudi z vidika zdravja človeka. V živalski proizvodnji proces tvorbe maščobnega tkiva pomembno vpliva na kakovost prirasta, preko porabe krme pa na ekonomičnost proizvodnje. Poleg leptina in leptinskega receptorja, ki odločilno uravnavata nalaganje maščob, je bil v zadnjem času odkrit tudi mehanizem uravnavanja tvorbe maščobnega tkiva, ki vključuje adaptivno termogenezo in biosintezo mitohondrijev. Pomembna regulatorja teh procesov sta PPAR? in njegov koaktivator PGC-1?. V pričujočem prispevku opisujemo mehanizem uravnavanja adipogeneze in vlogo PPAR? in PGC-1? v njem. Prikazana je tudi medvrstna primerjava aminokislinskih zaporedij PGC-1? in možnosti za razvoj farmacevtskih učinkovin, ki bi vplivale na izražanje PGC-1?. Ključne besede: prašiči / adipogeneza / molekularna genetika / transkripcijsko uravnavanje / termogeni koaktivator PGC-1? TRANSCRIPTIONAL CONTROL OF ADIPOGENESIS AND ROLE OF THE COACTIVATOR PGC-1? † ABSTRACT Adipogenesis is a complex proces, depending on numerous genetic and environmental factors. Study of the molecular basis of adipogenesis becomes, due to its central role in obesity and diabetes type-2 in human, more and more important also in human medicine. Adipogenesis is of central importance also for animal production, due to its impact on carcass composition, meat quality and profitability of fattening. In addition to the role of leptin and leptin receptor in adipogenesis, a new regulatory mechanism was recently discovered, which includes adaptive thermogenesis and biosynthesis of mitochondria. Important regulators of these processes are PPAR? and his co-activator PGC-1?. In this article we describe the mechanism of adipogenesis regulation and the role of PPAR? and PGC-1? in it. The interspecies comparison of PGC-1? amino sequence and possibilities for development of drugs regulating PGC-1? are presented. Key words: pigs / adipogenesis / molecular genetics / transcriptional control / thermogenic coactivator PGC-1? * Prispevek je del doktorskega dela Tamare Miloševič Berlič z naslovom ´Molekulski mehanizmi uravnavanja tvorbe maščobnega tkiva pri prašiču (Sus scrofa)`, mentor prof. dr. Peter Dovč. † This article is part of a doctoral thesis ´Molecular background of fat tissue formation in pig (Sus scrofa)`, issued by Tamara Miloševič Berlič, supervisor prof. Peter Dovč, Ph.D. 98 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2. UVOD Maščobno tkivo je v zadnjih dvajsetih letih postalo predmet intenzivnih raziskav. Raziskave je spodbudila predvsem dostopnost nesmrtnih celičnih linij preadipocitov, ki je omogočila preučevanje lastnosti maščobnih celic (adipocitov) in vitro (v kulturi), pa tudi spoznanje, da ima maščobno tkivo odločilno vlogo pri vzdrževanju energetskega ravnovesja v telesu. Na intenzivnost raziskav sta v veliki meri vplivala tudi razširjenost debelosti in diabetesa tipa 2 pri človeku. Tvorba maščobnega tkiva (adipogeneza) je kompleksen proces, ki ga uravnavajo številni endogeni (genetski, nevroendokrini) in eksogeni (okoljski) dejavniki. Raziskave zadnjih let so usmerjene predvsem v iskanje genetskih dejavnikov, saj nam poznavanje le-teh omogoča boljši vpogled in razumevanje molekulskega ozadja nalaganja maščevja in posledične debelosti. Na molekulski ravni proces adipogeneze uravnava zapletena mreža celega niza transkripcijskih faktorjev, ki prispevajo k tvorbi in diferenciaciji maščobnih celic (Rosen in sod., 2000). Osrednjo vlogo ima PPAR? (angl. peroxisome proliferator-activated receptor ?), ki sodi v družino jedrnih hormonskih receptorjev (angl. nuclear hormone receptors). Ta protein ni pomemben le v adipogenezi, ampak tudi v drugih fizioloških in patoloških procesih v telesu. Uravnava namreč tudi diferenciacijo številnih drugih tipov celic (npr. hepatocitov, miocitov, fibroblastov, keratinocitov), zato so proteini PPAR? in ligandi, ki te proteine aktivirajo, pomembne terapevtske tarče za zdravljenje mnogih bolezni človeka. Sprememba v sintezi in/ali aktivnosti teh transkripcijskih faktorjev lahko namreč povzroči določene presnovne bolezni, za katere so značilne povečane ali zmanjšane zaloge maščobnega tkiva, zato je poznavanje podrobne strukture PPAR? in razumevanje mehanizma njegove aktivacije ključno za pridobivanje novih zdravil. Debelost je problem današnjega časa. Etiopatogeneza debelosti je večvzročna. Med eksogene vzroke spadajo: premalo gibanja, razmeroma lahka dostopnost hrane, stresi in anksiozna stanja. Tudi endogenih oz. genetskih vplivov je več: sestava organizma, energijske potrebe, osnovna presnova in termogeneza, ki jo povzročajo gibanje, uživanje hrane in toplotne spremembe. Pogostnost (incidenca) debelosti še vedno narašča in je v zadnjem času postala velik zdravstveni problem. Tudi število novo odkritih genov in drugih molekulskih označevalcev, ki jih povezujejo z debelostjo pri človeku, je vedno večje (trenutno preko 250). Pri tem je pomembna predvsem identifikacija tistih mutacij in kombinacij genov, ki bistveno prispevajo k dovzetnosti za razvoj debelosti, in okoljskih dejavnikov, ki omogočajo izražanje teh genov (Rankinen in sod., 2002). Zaradi izjemne podobnosti v fiziologiji in presnovi lipidov so prašiči odličen model za preučevanje debelosti, diabetesa in številnih drugih presnovnih bolezni človeka (Fajas in sod., 1998; Sundvold in sod., 2001). Z razumevanjem molekulskega ozadja nalaganja maščobe lahko bistveno prispevamo k zmanjšanju nastanka debelosti in zmanjšanju tveganja za razvoj z debelostjo povezanih bolezni. To znanje je pomembno tudi pri reji domačih živali, saj prekomerno nalaganje maščevja pri prašiču vpliva tako na gospodarnost reje kot na kakovost prašičjega mesa. Tvorba maščobnega tkiva (adipogeneza) Sesalci imajo dve vrsti maščobnega tkiva, belo (angl. white adipose tissue, WAT) in rjavo (angl. brown adipose tissue, BAT), ki se razlikujeta po presnovnih značilnostih. Rjavi in beli adipociti imajo različno vlogo pri vzdrževanju energetskega ravnovesja. Funkcija belih adipocitov je shranjevanje energije v obliki trigliceridov, funkcija rjavih pa poraba metaboličnih hraniv, pri čemer se sprošča toplota. Motnje v tem stanju dinamičnega ravnotežja med vnosom in porabo energije vodijo v povečanje ali zmanjšanje količine belega maščevja, npr. pri debelosti Miloševič Berlič, T. in Dovč, P. Transkripcijsko uravnavanje adipogeneze in vloga koaktivatorja PGC-1?. 99 oz. lipodistrofičnih sindromih (podhranjenost, nervozna anoreksija). V fiziološkem smislu je vloga rjavega maščevja adaptacija na mraz in zaščita pred debelostjo. Maso maščobnega tkiva v osnovi določa število adipocitov in ravnotežje med vnosom in porabo energije. Pri vzpostavljanju energetskega ravnovesja v telesu imajo pomembno vlogo geni, ki uravnavajo presnovo maščob in razgradnjo hranilnih snovi. Nalaganje maščevja je kvantitativna poligenska lastnost, kar pomeni, da je izražanje take lastnosti v večini primerov pod vplivom velikega števila genov. Prispevek posameznih genov k izoblikovanju lastnosti je lahko zelo različen - z delovanjem nekaterih genov lahko pojasnimo velik del fenotipske variance (Weller in sod., 1990). Masa maščobnega tkiva se lahko spremeni zaradi spremembe v številu, velikosti ali volumnu adipocitov. Povečano število celic je rezultat neprekinjene stimulacije procesa celične diferenciacije, zmanjšano število pa je posledica apoptoze in dediferenciacije adipocitov. Zanimivo je, da proces diferenciacije mezenhimskih zarodnih celic v adipocite poteka celo življenje (Fajas in sod., 1998). Molekulsko uravnavanje adipogeneze Diferenciacija celic je odraz sprememb v izražanju genov. Morfološke spremembe, ki spremljajo adipogenezo (npr. sprememba oblike celic, kopičenje maščobe), so posledica aktiviranja genov in sprememb v sintezi in delovanju adipogenih transkripcijskih faktorjev. Ti transkripcijski faktorji skupaj stimulirajo izražanje genov, specifičnih za adipocite, kar vodi v značilen fenotip zrelih adipocitov. Pomembna stopnja v diferenciaciji adipocitov je prekinitev rasti celic. Na tej stopnji se, po stimulaciji z ustreznimi hormoni, preadipociti začnejo diferencirati v adipocite. Proces uravnavajo medsebojno odvisni adipogeni transkripcijski faktorji PPARy (angl. peroxisome proliferator-activated receptor y\ C/EBP (angl. CCAAT/ enchancer-binding protein) in ADD/SREBP1 (angl. adipocyte determination and differentiation factor 1/sterol regulatory element binding protein-1). Ključno vlogo ima PPARy Ključno vlogo pri uravnavanju adipogeneze ima transkripcijski faktor PPARy. Je poglavitni koordinator diferenciacije adipocitov - aktivirani PPARy namreč sproži izhod iz celičnega cikla. PPARy se veže na promotorje genov, specifičnih za maščobne celice, in aktivira njihovo izražanje. Zato, da se lahko veže na DNA in aktivira transkripcijo, se mora povezati z jedrnim receptorjem RXR (angl. retinoid receptor X) v heterodimer. Heterodimeri PPARy/RXR se vežejo na specifične PPAR-odzivne elemente (angl. PPAR response elements, PPRE) v ciljnih genih (Spiegelman in sod., 2000). Dodatni adipogeni učinek PPARy je tudi zmanjšanje izražanja leptina (hormona, ki ga izločajo maščobne celice), kar povzroči povečan vnos energije v adipocite (Fajas in sod., 1998). Pri uravnavanju aktivnosti PPARy imajo osrednjo vlogo proteini C/EBP. Rezultati številnih poskusov kažejo na zaporedno aktivacijo celega niza transkripcijskih faktorjev, vpletenih v adipogenezo (slika 1). Najprej se pojavita proteina C/EBPß in C/EBPÔ, sledi PPARy, ki nadalje aktivira C/EBPa. C/EBPa vzajemno vzdržuje raven PPARy (pozitivna kontrola) in na ta način ohranja diferencirano stanje. Aktivacijo PPARy lahko s produkcijo endogenega liganda za PPARy sproži tudi ADD1/SREBP1C. Vsi omenjeni faktorji prispevajo k izražanju genov, ki so značilni za dokončno diferenciran fenotip maščobnih celic. Na pomen PPARy v patologiji debelosti kaže tudi polimorfizem v genu PPARy, ki je povezan z nižjimi koncentracijami leptina pri debelih ljudeh v primerjavi s kontrolno skupino, ki ima normalno obliko PPARy. 100 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2. Slika 1. Transkripcijsko uravnavanje adipogeneze – zaporedna aktivacija številnih družin transkripcijskih faktorjev (prirejeno po Rosen in sod., 2000). Figure 1. Transcriptional control of adipogenesis – sequential activation of several transcriptional factors (adapted from Rosen et al., 2000). V maščobnem tkivu prašiča sta prisotni dve izoformi proteina PPAR? (?1 in ?2), prevladuje pa PPAR?1. Zanimivo je, da PPAR?1 prevladuje tudi v podkožnem maščevju človeka, medtem ko je za uravnavanje adipogeneze pri glodalcih pomembnejša izoforma PPAR?2 (Tontonoz in sod., 1994). Houseknecht in sodelavci (1998) so klonirali cDNA za PPAR? prašiča in preiskovali uravnavanje izražanja gena PPAR? v podkožnem maščobnem tkivu prašiča. Ugotovili so, da gen PPAR? prašiča nosi zapis za 1,8 kb dolgo molekulo mRNA in da je na ravni aminokislinskega zaporedja 99, 96 oz. 97-odstotno identičen s PPAR? človeka, miši oz. krave. Z analizo northern so potrdili, da se mRNA za PPAR? v skeletni mišici ne izraža, medtem ko so z analizo western potrdili visoko raven proteina PPAR? v maščobnem tkivu prašiča v primerjavi z drugimi tkivi. Zmanjševanje kalorične vrednosti obrokov in stradanje prašičev sta povzročila znatno znižanje vsebnosti proteina PPAR?2 v podkožnem tkivu, ne pa tudi PPAR?1, v primerjavi s kontrolno skupino prašičev, hranjenih ad libitum. Mehanizem diferencialnega uravnavanja izražanja PPAR?2 in PPAR?1 še ni povsem jasen. Na osnovi teh rezultatov so Houseknecht in sodelavci (1998) sklepali, da na izražanje PPAR? med drugim vplivata tudi vrsta in kalorična vrednost hrane oz. endokrini dejavniki (hormoni). Miloševič Berlič, T. in Dovč, P. Transkripcijsko uravnavanje adipogeneze in vloga koaktivatorja PGC-1?. 101 Na aktivnost PPARy vplivajo tudi transkripcijski koaktivatorji Aktivacija transkripcije z jedrnimi receptorji vključuje delovanje mnogih dejavnikov, ki tvorijo komplekse, sestavljene iz več proteinov. Ti delujejo zaporedno (tj. ob različnem času) in/ali v kombinaciji in s tem poskrbijo za dodatno raven uravnavanja transkripcije. Da bi transkripcijski faktorji aktivirali izražanje tarčnih genov, morajo najprej razrahljati strukturo kromatina in zbrati elemente bazalnega transkripcijskega aparata. To opravijo proteini, imenovani koaktivatorji, ki v osnovi predstavljajo 'most' med jedrnimi receptorji in transkripcijskim aparatom. Koaktivatorski proteini olajšajo komunikacijo med jedrnimi receptorji, bazalnim transkripcijskim aparatom in kromatinskim okoljem in na ta način posredno olajšajo transkripcijo. Ti proteini torej niso neposredno vezani na DNA, ampak nanjo delujejo preko jedrnih receptorjev. Na aktivnost bazalnega transkripcijskega aparata vplivajo tudi neposredno preko interakcij s proteini. Za koaktivatorje jedrnih receptorjev so značilni visoko ohranjeni amfipatični motivi LXXLL (v katerih L prestavlja levcin, X pa katerokoli aminokislino), ki so pomembni pri interakcijah med koaktivatorji in jedrnimi receptorji. Ti motivi uravnavajo tudi interakcije med posameznimi koaktivatorji, za katere je značilna velika kombinatorna fleksibilnost. Poleg omenjenih so pomembna še druga aminokislinska zaporedja, ki prispevajo k specifičnosti vezave na PPARy (Rosenfeld in Glass, 2001). Termogeni koaktivator PGC-1a Koaktivatorji jedrnih receptorjev so precej raznolika skupina proteinov - uravnavajo lahko zelo specifične celične procese. Pri uravnavanju presnove in porabi energije ima ključno vlogo koaktivator PGC-1a (angl. PPARy coactivator-1 oc\ ki sproži biogenezo (tj. povečanje števila) mitohondrijev in podvajanje mtDNA ter uravnava adaptivno termogenezo in ß-oksidacijo maščobnih kislin (Knutti in Kralli, 2001; Wu in sod., 1999; Lin in sod., 2002; Lehman in sod., 2000). PGC-1a uravnava tudi determinacijo tipa mišičnih vlaken (Lin in sod., 2002) in glukoneogenezo (tj. encimsko sintezo glukoze), ki poteka v jetrih in je pomembna komponenta v patogenezi diabetesa tipa 2 (Herzig in sod., 2001). Koaktivator PGC-1a poveča učinkovitost aktivacije transkripcije s PPARy. Veže se na PPARy in številne druge jedrne receptorje in ima pomembno vlogo pri zbiranju drugih koaktivatorjev in njihovi vezavi na PPARy. PGC-1a je namreč istočasno v interakciji s številnimi transkripcijskimi faktorji, zbranimi na promotorju določenega gena, ki kumulativno učinkujejo na transkripcijsko aktivnost gena. Vezava koaktivatorja povzroči alosterično spremembo v transkripcijskem faktorju, ki temu omogoča vezavo na številna različna vezna mesta na DNA. Z vezavo na heterodimer PPARy/RXR pa PGC-1a ovira tudi vezavo korepresorjev in na ta način aktivira transkripcijo ciljnih genov (Puigserver in sod., 1998). Transkripcijski koaktivatorji niso stalno aktivni proteini, ki jih je treba le primerno 'namestiti' na genomsko DNA, da začnejo aktivirati gene. Raziskave Puigserverja in sodelavcev (1999) kažejo, da vezava transkripcijskih faktorjev aktivira PGC-1a. Neaktivno stanje koaktivatorja vzdržuje represor, medtem ko fosforilacija PGC-1a z MAPK (angl. mitogen-activated protein kinase) sprosti represor in s tem poveča aktivnost PGC-1a (Knutti in sod., 2001). Znano je, da koaktivator PGC-1a obstaja v treh stanjih, ki se razlikujejo po transkripcijski aktivnosti. PGC-1a, ki ni vezan na noben transkripcijski faktor, ima šibko transkripcijsko aktivnost in minimalno sposobnost vezave kompleksa SRC-1 in CBP/p300. Z vezavo na transkripcijski faktor se PGC-1a aktivira in konformacijsko spremeni, kar omogoči vezavo drugih kofaktorjev, ki aktivirajo transkripcijo tega lokusa (Puigserver in sod., 1999). Transkripcijski faktor nato zbere koaktivatorski kompleks, ki se delno veže tudi na PGC-1a, in vzdržuje kromatin v 'odprti' 102 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2. konfiguraciji. Transkripcijski faktorji aktivirajo PGC-1? tudi tako, da odmaknejo represorje, ki vzdržujejo neaktivno stanje PGC-1? (Knutti in sod., 2001). Model tri-stopenjske aktivacije PGC-1? je prikazan na sliki 2. Slika 2. Model tri-stopenjske aktivacije PGC-1a (prirejeno po Puigserver in sod., 1999). Figure 2. PGC-1 a is present in three different states (adapted from Puigserver et al., 1999). Uravnavanje aktivnosti PGC-1a poteka na več ravneh. S podhladitvijo organizma, stradanjem in fizično aktivnostjo se sinteza PGC-1a poveča, medtem ko je za vzdrževanje bazalne ravni PGC-1a potreben leptin (Kakuma in sod., 2000). Nadalje se raven PGC-1a uravnava s specifičnim izražanjem v tkivih, ki imajo velike zahteve po energiji (kot npr. rjavo maščevje, srce, ledvica, možgani) ali pomembno vlogo v adaptivni termogenezi (Wu in sod., 1999; Larrouy in sod., 1999; Esterbauer in sod., 1999). PGC-1a so prvotno izolirali iz knjižnice cDNA rjavega maščevja miške (Puigserver in sod., 1998). V začetku so menili, da izolirani protein nima bližnjih homologov, saj s pregledovanjem podatkovnih zbirk niso našli strukturno sorodnih proteinov. Pred kratkim pa so iz knjižnice cDNA rjavega maščevja miši klonirali nov koaktivator, ki je homologen PGC-1a, in ga poimenovali PGC-1ß (Lin in sod., 2002). PGC-1a in PGC-1ß se izražata v istih tkivih, predvsem v rjavem maščevju in v srcu, vendar uravnavanje njunih mRNA med izpostavljenostjo mrazu in med diferenciacijo rjavih maščobnih celic poteka različno. Od do sedaj znanih koaktivatorjev se PGC-1a razlikuje tudi po tem, da je njegova sinteza tkivno-specifična in odvisna od fiziološkega stanja živali. Dokazano je, da izpostavitev mrazu in delovanje ß-adrenergičnih agonistov inducira izražanje PGC-1 a (Puigserver in sod., 1998). Poleg PGC-1a miši so bili izolirani in karakterizirani tudi PGC-1a človeka (Esterbauer in sod., 1999; Larrouy in sod., 1999), podgane (Goto in sod., 2000) in prašiča (Miloševič Berlič, 2002; Miloševič Berlič in sod., v tisku). Gen PGC-1a obsega -67 kb v genomu človeka. Pri vseh omenjenih vrstah je sestavljen iz 13 eksonov, ki kodirajo 91-kDa protein, katerega aminokislinsko zaporedje je 95-odstotno identično s prašičjim in 94-odstotno identično z mišjim ortologom. Visok odstotek identičnosti aminokislinskih zaporedij PGC-1a med različnimi živalskimi vrstami kaže na evolucijski pomen tega gena. Tudi primerjava kodogenega zaporedja prašičjega PGC-1a s homolognimi regijami pri drugih vrstah (slika 3) kaže na visoko evolucijsko ohranjenost domen, ki predstavljajo potencialna vezna mesta za transkripcijske faktorje. Med njimi sta pomembni predvsem dve: domena, ki veže jedrne receptorje in domena, ki je v interakciji s PPARy. Miloševič Berlič, T. in Dovč, P. Transkripcijsko uravnavanje adipogeneze in vloga koaktivatorja PGC-1?. 103 prašič 1 MAWDMCNQDS--VWTDIECAALVGEDQPLCPDLPELDLSELDVNDLDTDSFLGGLKWCSD 58 človek 1 MAWDMCNQDSESVWSDIECAALVGEDQPLCPDLPELDLSELDVNDLDTDSFLGGLKWCSD 60 miš 1 MAWDMCSQDS--VWSDIECAALVGEDQPLCPDLPELDLSELDVNDLDTDSFLGGLKWCSD 58 ******.*** **:********************************************* prašič 59 QSEIISNQYNNEPSNIFEKIDEENEANLLAVLTETLDSLPVDEDGLPSFDALTDGDVTTE 118 človek 61 QSEIISNQYNNEPSNIFEKIDEENEANLLAVLTETLDSLPVDEDGLPSFDALTDGDVTTD 120 miš 59 QSEIISNQYNNEPANIFEKIDEENEANLLAVLTETLDSLPVDEDGLPSFDALTDGAVTTD 118 *************:***************************************** ***: prašič 119 NEASPSSMPDGTPPPQEAEEPSLLKKLLLAPANTQLSYNECSGLSTQNHAN-HNHRIRTN 177 človek 121 NEASPSSMPDGTPPPQEAEEPSLLKKLLLAPANTQLSYNECSGLSTQNHAN-HNHRIRTN 179 miš 119 NEASPSSMPDGTPPPQEAEEPSLLKKLLLAPANTQLSYNECSGLSTQNHAANHTHRIRTN 178 prašič 178 PAVVKTENSWSNKAKSICQQQKPQRRPCSELLKYLTTNDDPPHTKPTETRNSSRDKCTSK 237 človek 180 PAIVKTENSWSNKAKSICQQQKPQRRPCSELLKYLTTNDDPPHTKPTENRNSSRDKCTSK 239 miš 179 PAIVKTENSWSNKAKSICQQQKPQRRPCSELLKYLTTNDDPPHTKPTENRNSSRDKCASK 238 **:*********************************************.********:** prašič 238 KKAHTQSQSQHLQAKPTSLSLPLTPESPNDPKGSPFENKTIERTLSVELSGTAGLTPPTT 297 človek 240 KKSHTQSQSQHLQAKPTTLSLPLTPESPNDPKGSPFENKTIERTLSVELSGTAGLTPPTT 299 miš 239 KKSHTQPQSQHAQAKPTTLSLPLTPESPNDPKGSPFENKTIERTLSVELSGTAGLTPPTT 298 **:***.**** *****:****************************************** prašič 298 PPHKANQDNPFRASPKLKPPCKTVVPPPSKKTRYSESSGTHGNNSTKKGPEQSELYAQLS 357 človek 300 PPHKANQDNPFRASPKLKSSCKTVVPPPSKKPRYSESSGTQGNNSTKKGPEQSELYAQLS 359 miš 299 PPHKANQDNPFKASPKLKPSCKTVVPPPTKRARYSECSGTQGSHSTKKGPEQSELYAQLS 358 prašič 358 KTSALGGGHEERKARRPSLRLFGDHDYCQSINSKAEILINISQELHDSRQLDSKDAASDW 417 človek 360 KSSVLTGGHEERKTKRPSLRLFGDHDYCQSINSKTEILINISQELQDSRQLENKDVSSDW 419 miš 359 KSSGLSRGHEERKTKRPSLRLFGDHDYCQSLNSKTDILINISQELQDSRQLDFKDASCDW 418 prašič 418 QRQMCSSTDSDQCYLTETSEASRQVSPGSARKQLQDQEIRAELNKHFGHPSQAVFDDEAD 477 človek 420 QGQICSSTDSDQCYLRETLEASKQVSPCSTRKQLQDQEIRAELNKHFGHPSQAVFDDEAD 479 miš 419 QGHICSSTDSGQCYLRETLEASKQVSPCSTRKQLQDQEIRAELNKHFGHPCQAVFDDKSD 478 * ::******.**** ** ***:**** *:********************.******: * prašič 478 KTSELRDSDFSNEQFSKLPMFINSGLAMDGLFDDSEDESDKLNSPWDGTQSYSLFDVSPS 537 človek 480 KTGELRDSDFSNEQFSKLPMFINSGLAMDGLFDDSEDESDKLSYPWDGTQSYSLFNVSPS 539 miš 479 KTSELRDGDFSNEQFSKLPVFINSGLAMDGLFDDSEDESDKLSYPWDGTQPYSLFDVSPS 538 **.****.:**********:******************.***. ******.****:**** prašič 538 CSSFNSPCRDSVSPPKSLFSQRPQRMRSRSRSFSQHRSCSRSPYSRSRSRSPGSRSSSRS 597 človek 540 CSSFNSPCRDSVSPPKSLFSQRPQRMRSRSRSFSRHRSCSRSPYSRSRSRSPGSRSSSRS 599 miš 539 CSSFNSPCRDSVSPPKSLFSQRPQRMRSRSRSFSRHRSCSRSPYSRSRSRSPGSRSSSRS 598 **********************************:************************* prašič 598 CYYSESGHCRHRTHRNSPLCARSRSRSPYSRRPRYDSYEEYQHERLKREEYRREYEKRES 657 človek 600 CYYYESSHYRHRTHRNSPLYVRSRSRSPYSRRPRYDSYEEYQHERLKREEYRREYEKRES 659 miš 599 CYYYESSHYRHRTHRNSPLYVRSRSRSPYSRRPRYDSYEAYEHERLKRDEYRKEHEKRES 658 *** **.* ********** .****************** :******:***:*:***** prašič 658 ERAKQRERQRQKAIEERRVIYVGKIRPDTTRTELRDRFEVFGEIEECTVNLRDDGDSYGF 717 človek 660 ERAKQRERQRQKAIEERRVIYVGKIRPDTTRTELRDRFEVFGEIEECTVNLRDDGDSYGF 719 miš 659 ERAKQRERQKQKAIEERRVIYVGKIRPDTTRTELRDRFEVFGEIEECTVNLRDDGDSYGF 718 *********:************************************************** prašič 718 ITYRYTCDAFAALENGYTLRRSNETDFELYFCGRKQFFKSNYADLDSNSDDFDPASTKSK 777 človek 720 ITYRYTCDAFAALENGYTLRRSNETDFELYFCGRKQFFKSNYADLDSNSDDFDPASTKSK 779 miš 719 ITYRYTCDAFAALENGYTLRRSNETDFELYFCGRKQFFKSNYADLDTNSDDFDPASTKSK 778 **********************************************:************* prašič 778 YDSLDFDSLLKEAQRSLRR 796 človek 780 YDSLDFDSLLKEAQRSLRR 798 miš 779 YDSLDFDSLLKEAQRSLRR 797 ******************* Slika 3. Aminokislinsko zaporedje prašičjega PGC-1? v primerjavi z zaporedjem človeškega (AAD51615) in mišjega (AAC13554) homologa. Zvezdice predstavljajo identične amino kisline, dvopičja in pike pa polimorfna mesta. Delecije amino kislin so predstavljene s črticami. Motiv LXXLL (ak 142-146), tri mesta za fosforilacijo s proteinsko kinazo A (ak 237-240, 372-375 in 652-657) ter interaktivna domena PPAR (ak 291-337) so označene z okvirji. Dve SR-bogati domeni (ak 564-597 in 619-631) in domena, ki veže RNA (RRM) (ak 675-751) so podčrtane. Zaporedje bipartitnega signala za nuklearno lokalizacijo (ak 649-666) in tetrapeptidni motiv DHDY (ak 380-383) sta poudarjena. Figure 3. The deduced amino acid sequence of the porcine PGC-1? is compared with human (AAD51615) and mouse (AAC13554) sequences. Asterisks represent identical amino acids, while colons and dots indicate polymorphic sites. Deletions of amino acids are shown by dashes. An LXXLL motif (aa 142-146), three consensus sites for phosphorylation by protein kinase A (aa 237-240, 372-375 and 652-657), PPAR interactive domain (aa 291-337) are boxed. Two SR-rich domains (aa 564-597 and 619-631), and an RNA binding domain (RRM) (aa 675-751) are underlined. A consensus sequence of bipartite nuclear localization signal (aa 649-666) and a tetrapeptide motif DHDY (aa 380-383) are shown in boldface type. 104 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2. Prisotnost številnih domen na PGC-1a, ki omogočajo vezavo različnih proteinov, ki se vežejo na DNA, odpira možnosti za usmerjanje delovanja PGC-1a na promotorje izbranih tarčnih genov in za razvoj zdravilnih učinkovin, ki bi selektivno delovale na posamezne skupine tarčnih genov. Adaptivna termogeneza Debelost je kronična presnovna bolezen, ki je posledica porušenega ravnotežja med vnosom in porabo energije. Energija se v organizmu porablja na različne načine, med drugim z bazalnim metabolizmom, s fizično aktivnostjo in z adaptivno oz. netresavo termogenezo. Adaptivna termogeneza je fiziološki proces, kjer se energija sprošča v obliki toplote. Porabo energije sprožijo spremenjene razmere v okolju, predvsem stres zaradi izpostavitve mrazu in prekomerno hranjenje (t.i. z dieto sprožena termogeneza). S podhladitvijo organizma se zaradi hipertrofije rjavega maščobnega tkiva, biogeneze mitohondrijev in povečane sinteze in aktivacije razklopnega proteina UCP-1 (angl. uncoupling protein-1) poveča oddajanje energije v obliki toplote (Puigserver in sod., 1998). Do energetskih izgub pride zaradi razklopa sinteze ATP in zgorevanja kisika ter uhajanja protonov skozi notranjo membrano mitohondrijev. Zaradi prekinitve vezave fosfata v oksidativni fosforilaciji teče dihalna veriga v prazno in prosta energija reakcije se sprosti v obliki toplote. Proces adaptivne termogeneze uravnavajo možgani (slika 4), ki zaznajo podhladitev organizma in sprožijo aktivacijo simpatičnega živčevja, sproščanje norepinefrina in posledično aktivacijo ß-adrenergičnih receptorjev na površini celic. V celicah rjavega maščevja se poveča koncentracija cAMP, sekundarnega prenašalca, ki aktivira lipolizo (tj. razgradnjo lipidov) in stimulira aktivacijo transkripcije UCP-1, hipertrofijo rjavega maščobnega tkiva in biogenezo mitohondrijev (Lowell in Spiegelman, 2000). Hkrati se poveča tudi koncentracija termogenega koaktivatorja PGC-1a, ki uravnava biogenezo mitohondrijev. PGC-1a prek indukcije proteina NRF-1 (angl. nuclear respiratory factor-1) aktivira sintezo encimov dihalne verige in mitohondrijskega transkripcijskega faktorja A (mtTFA), ki pa je ključen za aktivacijo transkripcije in podvajanje mtDNA (Puigserver in sod., 1998; Wu in sod., 1999). Zaradi možne vloge adaptivne termogeneze tako v patogenezi kot pri zdravljenju debelosti pri človeku, je zanimanje za ta proces precejšnje. Vlogo PGC-1a v adaptivni termogenezi kaže predvsem njegova povezava s ključnimi tkivi in hormoni, vključenimi v ta tkivno-specifični proces. Splošno sprejeto mnenje je, da imata pomembno vlogo predvsem skeletno mišičje in rjavo maščevje - s podhladitvijo organizma se namreč v skeletnem mišičju in rjavem maščevju, ne pa tudi v drugih tkivih, sproži izražanje PGC-1a (Puigserver in sod., 1998). Pri majhnih sesalcih, kot so npr. miši in podgane, poteka adaptivna termogeneza v glavnem v mitohondrijih rjavih maščobnih celic in skeletnega mišičja, medtem ko ima pri večjih živalih in človeku osnovno vlogo v termogenezi skeletno mišičje (Wu in sod., 1999). Znanih je veliko genov, ki so neposredno udeleženi v adaptivni termogenezi, transkripcijsko uravnavanje tega procesa pa do danes še ni docela znano. Obetaven pristop k rešitvi tega vprašanja je preučevanje diferenciacije in izražanja genov v celicah rjavega maščevja. Vlogo rjavega maščevja v obrambi organizma pred debelostjo so razjasnili z odstranitvijo tega tkiva pri miškah; miške brez rjavega maščevja so zelo debele in slabo odzivne na inzulin (angl. insulin resistance), poleg tega pa so zanje značilne tudi druge bolezenske spremembe, povezane z debelostjo (Lowell in sod., 1993; Lowell, 1998). Analiza vloge rjavega maščevja pri človeku in drugih velikih sesalcih je bolj kompleksna. Odrasli ljudje namreč nimajo definiranih področij rjavega maščobnega tkiva, pač pa so celice rjavega maščevja razpršene med celicami belega maščobnega tkiva (Krief in sod., 1993). Miloševič Berlič, T. in Dovč, P. Transkripcijsko uravnavanje adipogeneze in vloga koaktivatorja PGC-1?. 105 Slika 4. Uravnavanje biogeneze mitohondrijev s termogenim koaktivatorjem PGC-1a (prirejeno po Wu in sod., 1999). Figure 4. Pathway of mitochondrial biogenesis through PGC-1a (adapted from Wu et al, 1999). ZAKLJUČEK V zadnjih letih smo bili priča izjemnemu porastu znanja o molekulskih mehanizmih uravnavanja adipogeneze. Ta odkritja so vodila do novih vprašanj - zanimiva je predvsem vloga maščob v hrani, ki lahko služijo kot ligandi za PPARy. Na osnovi novejših rezultatov je realno pričakovanje, da bomo na to in podobna vprašanja kmalu znali odgovoriti. Molekulski mehanizmi, povezani s porabo energije in termogenezo pri prašiču, so podobni molekulskim mehanizmom pri človeku. Poznavanje teh presnovnih poti nudi obetavne možnosti za zdravljenje debelosti in diabetesa. Genetske raziskave adipogeneze so nujne za identifikacijo kombinacij genov in mutacij v kodogenih regijah teh genov, ki povečajo dovzetnost za debelost. Razmevanje procesa diferenciacije adipocitov nam omogoča razvoj strategij za spreminjanje aktivnosti transkripcijskih faktorjev s farmacevtskimi učinkovinami, zato so proteini iz družine PPAR vse bolj zanimivi za farmacevtsko industrijo. Glavni razlog je njihova vloga v presnovi maščob, in potencialna vloga v procesih, ki vodijo do ateroskleroze, vnetij, raka in motenj plodnosti. Sintetični ligandi za PPAR, vključno s fibrati in tiazolidindioni (TZD), so se pokazali kot zelo učinkoviti za zdravljenje diabetesa. Farmakološki pristop k povečevanju količine ali aktivnosti PGC-1a bi bil sprejemljiv, če ne bi imel neželenih učinkov. Za razvoj uspešnih aplikacij je potrebno še podrobnejše znanje o delovanju PGC-1a, ki v glavnem temelji na fizioloških raziskavah v celičnih kulturah. Novejše raziskave na transgenih miših so pokazale, da ima lahko čezmerno izražanje PGC-1a neželene učinke (pri transgenih miših so namreč opazili kardiomiopatije) in da je ustrezno uravnavanje 106 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2. izražanja PGC-1? ključno za nemoten razvoj. Nadaljnji študij živalskih modelov z izničenim genom za PGC-1? ali s specifičnimi aleli PGC-1? bo omogočil oceno pozitivnih in negativnih učinkov, ki jih povzroča spremenjena raven izražanja PGC-1?. CONCLUSION As outlined above, recent years have witnessed a phenomenal increase in knowledge regarding the molecular control of adipogenesis. These findings now lead to next level of questions. Of particular interest is the role of dietary fats to serve as precursors to PPAR? ligands. Based upon recent progress, it is likely that answers to these questions will be forthcoming. Molecular mechanisms related to energy expenditure and thermogenesis in pigs are similar with the molecular mechanisms in humans. These pathways can be used as novel therapeutic approaches for the treatment of obesity and diabetes. Genetic approaches are critical in identifying the combination of genes and mutations that predispose to obesity. Knowledge of adipocyte differentiation process (adipogenesis) permits us to devise strategies to modulate the activity of transcription factors by drugs. PPARs are now attracting the attention of pharmaceutical industry. They play a key role in lipid metabolism and have potential roles in atherosclerosis, inflammation, cancer and infertility. Synthetic PPAR ligands includig fibrates and tiazolidinediones (TZDs), have proven effective in the treatment of diabetes. Pharmacological strategies to increase the amount or activity of PGC-1? could also be useful, if this can be done without deleterious effect. Of course, the likelyhood of success depends upon better understanding of the function of PGC-1?. Physiologicl roles of PGC-1? in energy homeostasis have been tested for the most part in cell culture systems. Recent studies with transgenic mice have shown, that too much PGC-1? can be undesirable (transgenic mice develop cardiomyopathy) and that approopriate regulation of this coactivator is important. Future studies in animal models with loss of PGC-1? function and/or specific alleles of PGC-1? will be necessary to elucidate beneficial and adverse effects of PGC-1?. VIRI Esterbauer, H./ Oberkofler, H./ Krempler, F./ Patsch, W. Human peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator 1 (PPARGC1) gene: cDNA sequence, genomic organization, chromosomal localization, and tissue expression. Genomics, 62(1999), 98–102. Fajas, L./ Fruchart, J.C./ Auwerx, J. Transcriptional control of the adipogenesis. Curr Opin Cell Biol, 10(1998), 165–173. Goto, M./ Terada, S./ Kato, M./ Katoh, M./ Yokozeki, T./ Tabata, I./ Shimokawa, T. cDNA cloning and mRNA analysis of PGC-1 in epitrochlearis muscle swimming-exercised rats. Biochem. Biophys. Res. Commun., 274(2000), 350–354. Herzig, S./ Long, F./ Jhala, U.S./ Hedrick, S./ Quinn, R./ Bauer, A./ Rudolph, D./ Schutz, G./ Yoon, C./ Puigserver, P./ Spiegelman, B./ Montminy, M. CREB regulates hepatic gluconeogenesis through the coactivator PGC-1. Nature, 413(2001), 179–183. Houseknecht, K.L./ Bidwell, C.A./ Portocarrero, C.P./ Spurlock, M.E. Expression and cDNA cloning of porcine peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR?). Gene, 225(1998), 89–96. Kakuma, T./ Wang, Z.W./ Pan, W./ Unger, R.H./ Zhou, Y.T. Role of leptin in peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1 expression. Endocrinol., 141(2000)12, 4576–4582. Knutti, D./ Kralli, A. PGC-1, a versatile coactivator. Trends Endocrinol. Metabol., 12, 8(2001), 360–365. Knutti, D./ Kressler, D./ Kralli, A. Regulation of the transcriptional coactivator PGC-1 via MAPK-sensitive interaction with a repressor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(2001)17, 9713–9718. Miloševič Berlič, T. in Dovč, P. Transkripcijsko uravnavanje adipogeneze in vloga koaktivatorja PGC-1?. 107 Krief, S./ Lonnqvist, F./ Raimbault, S./ Baude, B./ Van Spronsen, A./ Arner, P./ Strosberg, A.D./ Ricquier, D./ Emorine, L.J. Tissue distribution of beta 3-adrenergic receptor mRNA in man. J. Clin. Invest., 91(1993), 344-349. Larrouy, D./ Vidal, H./ Andreelli, F./ Laville, M./ Langin, D. Cloning and mRNA tissue distribution of human PPAR-gamma coactivator-1. Int. J. Obesity, 23(1999), 1327-1332. Lehman, J.J./ Barger, P.M./ Kovacs, A./ Saffitz, J.E./ Medeiros, D.M./ Kelly, D.P. Peroxisome proliferator-activated receptor y coactivator-1 promotes cardiac mitochondrial biogenesis. J. Clin. Invest., 106(2000)7, 847-856. Lin, J./ Puigserver, P./ Donovan, J./ Tarr, P./ Spiegelman, B.M. Peroxisome proliferator-activated receptor y coactivator 1ß (PGC-1ß), a novel PGC-1-related transcriptional coactivator associated with host cell factor. J. Biol. Chem., 277(2002)3, 1645-1648. Lowell, B.B. Adaptive thermogenesis. Turning on the heat. Curr. Biol., 8(1998)15, R517-R520. Lowell, B.B./ Spiegelman, B.M. Towards a molecular understanding of adaptive thermogenesis. Nature, 404(2000), 652-660. Lowell, B.B./ Susulic, S./ Hamann, A./ Lawitts, J.A./ Himms-Hagen, J./ Boyer, B.B./ Kozak, L.P./ Flier, J.S. Development of obesity in transgenic mice after genetic ablation of brown adipose tissue. Nature, 366(1993), 740-742. Miloševič Berlič, T./ Kokalj-Vokac, N./ Anderson, S.I./ Archibald, A.L./ Dovc, P. Porcine Peroxisome Proliferator- Activated Receptor-Gamma Coactivator-1 (PPARGC1) gene: cDNA sequence, chromosomal localization and polymorphisms. Anim. Genet. In press. Miloševič Berlič, T. Molekulski mehanizmi uravnavanja tvorbe maščobnega tkiva pri prašiču (Sus scrofa). Doktorska disertacija, Biotehniška fakulteta, Interdisciplinani podiplomski študij botehnologije, 2002. Puigserver, P./ Adelmant, G./ Wu, Z./ Fan, M./ Xu, J./ O'Malley, B./ Spiegelman, B.M. Activation of PPAR-gamma coactivator-1 through transcription factor docking. Science, 286(1999), 1368-1371. Puigserver, P./ Wu, Z./ Park, C.W./ Graves, R./ Wright, M./ Spiegelman, B.M. A cold-inducible coactivator of nuclear receptors linked to adaptive thermogenesis. Cell, 92(1998), 829-839. Rankinen, T./ Perusse, L.,/ Weisnagel, S.J.,/ Snyder, E.E./ Chagnon, Y.C./ Bouchard, C. The Human Obesity Gene Map: The 2001 Update. Obesity Research, 10(2002)3, 196-225. Rosen, E.D./ Walkey, C.J./ Puigserver, P./ Spiegelman, B.M. Transcriptional regulation of adipogenesis. Genes Dev., 14(2000), 1293-1307. Rosenfeld, M.G./ Glass, CK. Coregulator codes of transcriptional regulation by nuclear receptors. J. Biol. Chem., 276(2001)40, 36965-36868. Spiegelman, B.M./ Puigserver, P./ Wu, Z. Regulation of adipogenesis and energy balance by PPARy and PGC-1. Int. J. Obesity, 24(2000)4, S8-S10. Sundvold, H./ Grindflek, E./ Lien S. Tissue distribution of porcine proxisome proliferator-activatd receptor a: detection of alternatively spliced mRNA. Gene, 273(2001), 105-113. Tontonoz, P./ Hu, E./ Spiegelman, B.M. Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPARy2, a lipid-activated transcription factor. Cell, 79(1994), 1147-1156. Weller, J.I./ Kashi, Y./ Soller, M. Power of daughter and granddaughter designs for determining linkage between marker loci and quantitative trait loci in dairy cattle. J. Dairy Sci., 73(1990)9, 2525-2537. Wu, Z./ Puigserver, P./ Andersson, U./ Zhang, C./ Adelmant, G./ Mootha, V./ Troy, A./ Cinti, S./ Lowell, B.B./ Scarpulla, R.C./ Spiegelman, B.M. Mechanisms controlling mitochondrial biogenesis and respiration through the thermogenic coactivator PGC-1. Cell, 98(1999), 115-124. Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2, 109-119. http://www.bf.uni-lj.si/aas Agris category codes: L10, Q01 COBISS Code 1.02 MILK PRODUCTION IN THE POST-GENOMIC ERA Polona FRAJMAN a) and Peter DOVČ b) a) Univ. of Ljubljana, Biotechnical Fac., Zootechnical Dept., Groblje3, SI-1230 Domžale, Slovenia. b) Same address, Prof., Ph.D. Received November 03, 2004, accepted December 10, 2004. Delo je prispelo 03. novembra 2004, sprejeto 10. decembra 2004. ABSTRACT Milk plays an important role in human nutrition. Nowadays, dairy industry is oriented in the production of increasing number of different milk products and technological properties of milk are gaining more and more attention. Introduction of recombinant DNA technology in the early 1970 and development of molecular genetics enabled studies of the organization of milk protein genes and mechanisms involved in their expression. Genome research in farm animals was oriented in production of low-density genetic maps with the emphasis on the genetic variation in some functionally important regions. In the public databases, 1598 cattle genes have already been mapped and partially sequenced by the end of 2003. In addition, numerous quantitative trait loci (QTL) were mapped for economically important traits. Typical examples include milk yield and milk composition in dairy cattle. The availability of genomic DNA sequences for a number of potential candidate genes with an impact on production traits allowed construction of cattle genome microarrays. Functional studies of milk protein genes revealed the impact of different genetic variants on technological properties of milk. Genomics approach thus offers an entirely new way to identify complex interactions among milk protein genes other genes involved in milk production and elucidation of the complex regulatory network allowing efficient milk production in the mammary gland. Key words: milk production / technological properties / lactoproteins / molecular genetics / quantitative trait loci / QTL / genomics / micro array PROIZVODNJA MLEKA V POST-GENOMSKI DOBI IZVLEČEK Sodobna mlekarska industrija se zaradi pomembnosti mleka v človeški prehrani usmerja v proizvodnjo vse večjega števila različnih mlečnih proizvodov, pri čemer v ospredje stopajo tehnološke lastnosti mleka. Uvajanje tehnik rekombinantne DNA v zgodnjih sedemdesetih in razvoj molekularno-genetskih tehnik sta omogočila raziskovanje organizacije mlečnoproteinskih genov ter mehanizmov, ki uravnavajo njihovo izražanje. Določanje nukleoticnega zaporedja celotnih genomov je postalo mogoče z razvojem zmogljivih orodij genomike. Raziskave genomov ekonomsko pomembnih domačih živali so bile usmerjene v proizvodnjo genskih kart z nizko gostoto in s poudarkom na genetskih variabilnosti funkcionalno pomembnih genov. V javno dostopnih podatkovnih zbirkah se je do konca leta 2003 nahajalo 1598 kartiranih in deloma sekvenciranih genov goveda. Kartiranih je bilo tudi mnogo kvantitativnih lokusiv (QTL) za ekonomsko pomembne lastnosti, kot so npr. količina in sestava mleka pri mlečnih pasmah goveda. Dostopnost genomskih zaporedij DNA za številne kandidatne gene z vplivom na proizvodne lastnosti je omogočila konstrukcijo genomskih mikromrež goveda. Funkcionalne študije mlečnoproteinskih genov so pokazale, da genetske variante vplivajo na tehnološke lastnosti mleka. Genomski pristop ponuja povsem novo pot pri proučevanju zapletenih interakcij 110 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2. med mlečnoproteinskimi geni drugimi geni, ki so vključeni v kompleksno regulacijo učinkovite sinteze mleka v mlečni žlezi. Ključne besede: mleko / prireja / tehnološke lastnosti / laktoproteini / molekularna genetika / kvantitativni lokusi / QTL / genomika / mikromreže INTRODUCTION Milk is a major source of energy, proteins, minerals and vitamins for young mammals during their first period of life. Milk of some farm animals plays an important role in human nutrition and milk production is one of the most important branches of animal production. Dairy industry in developed countries is nowadays oriented in the production of increasing number of different milk products therefore technological properties of milk are gaining more and more attention. The increasing cheese production, for example, prefers milk with higher content of proteins with favorable cheese making properties (Lodes at al., 1996; Buchberger and Dovč, 2000). Study of milk proteins started with the determination of primary structure of four major caseins (aS1-CN, CXS2-CN, ß-CN and k-CN) and two whey proteins, a-lactalbumin and ß-lactoglobulin (a-LA and ß-LG) (Aschaffenburg and Drewry, 1957, Grosclaude et al, 1973, Godovac-Zimmermann et al., 1985). Polymorphisms in amino acid sequence of aS1-CN, ß-CN and k-CN allowed classical linkage studies, revealing clustering of casein loci on bovine chromosome 6 (Grosclaude et al, 1973, Gupta et al, 1982). In this period, the early studies on the impact of casein variants on technological properties of milk were published (Mariani et al, 1976). Introduction of recombinant DNA technology in the early 1970 allowed determining of cDNA sequences for all four major caseins and two whey proteins (Stewart et al, 1984; Gorodetsky et al, 1988; Alexander et al, 1988). Based on DNA polymorphisms, rapid genotyping of casein loci has been introduced. Further development of molecular genetics enabled study of the exon-intron organization of casein genes as well as study of DNA sequences of non-coding regions of the casein gene cluster (Ferretti et al, 1990, Threadgill and Womack, 1990). These studies revealed an insight into molecular mechanisms involved into the regulation of casein gene expression (Rijnkels et al, 1997). Application of genomic tools combined with advanced statistical methods introduced the concept of QTL (quantitative trait loci) affecting complex milk production traits (Bovenhuis and Spelman, 2000). It became clear, that a huge number of genes are involved in this complex regulatory pathway, which is also influenced by numerous environmental factors (Schrooten et al, 2004). New genomic tools allow us to analyze expression of thousands of genes in one experiment and to compare gene expression profiles among different stages of lactation and different environmental treatments. Gradually growing understanding of complex genetic machinery regulating the quantity as well as quality of produced milk, represents a basis for efficient marker assisted selection in dairy cattle. THE COMPLEXITY OF ANIMAL GENOMES Development of recombinant DNA technology allowed researchers to move from analysis of cDNA sequences to the studies revealing genomic organization of larger chromosomal regions and finally to decipher the whole genome sequence of an organism. The most appealing goal was certainly sequencing of a human genome, one of the most complex endeavors of the modern science, which was accomplished in 2001 (Bork and Copley, 2001). However, on the way to the sequence of human genome a number of less complex genomes, mainly from model organisms were sequenced, including microorganisms as E.coli, and S. cerevisiae, fruit fly D. melanogaster worm C. elegans and zebra fish. After the human genome, comprising 3.6 billion nucleotides, the mouse and rat genomes which are of similar complexity were released in 2002 (Anon. 2002) Frajman, P and Dovč, P. Milk production in post-genomic era. 111 and 2003 (Bromberg et al., 2003). Just recently, the chicken genome sequence was completed, representing a vertebrate genome of a bit lower complexity, containing 1.1 billion base pairs (McPherson et al., 2004). The avaiability of whole genome sequences for a number of more or less related species opens a whole new avenue of comparative genomic approach for the identification of gene function and regulation of complex metabolic pathways. The disappointing conclusion from the analysis of the first sequenced genomes is that from about 30.000 putative genes which were identified within the genome, to only 30–40% can be assigned a function, whereas physiological role for about 60% of the genes remains unknown. The strategy of genome research in farm animals was a bit different from the strategy amployed by the human genome project. Since the available resources in farm animal genome research are incomparable with resources mobilized within the human genome project and large of species of interest further reduces the research inputs, the strategy had to adapt to this circumstances. Therefore, considerable effort has been spent in order to produce low density genetic maps of different species, which have enabled rough localization of selected loci into syntenic groups (Gellin et al., 2000). Synteny maps provided valuable information for practical animal breeding facilitating haplotype selection rather than simple selection for desired genotypes. For the practical animal breeding, the information about the genetic variation in some functionally important regions is far more important than entire nucleotide sequence from one animal. Therefore relative large population studies analyzing genetic polymorphisms within crucial genomic regions were performed. mRNA cDNA — a oocpoo oodboo oooooo oooooo oooooo oooooo DNA microarray •oooo« oooooo ÄOOO#0 o#©oo# ooo^o« o«oo®o Figure 1. Developoment of microarrays enabled large-scale analysis of gene expression. Slika 1. Razvoj mikromrež je omogočil sočasno analizo izražanja velikega števila genov. GENOMIC TOOLS DNA sequence analysis started with establishment of cDNA libraries, where relatively short DNA fragments (up to 2-3 kb) were cloned in the plasmid vectors. However, prerequisite for genomic research was the ability to handle large genomic sequences in the range of 0.1 – 1.0 112 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2. Mb. The discovery of the new generation of vectors as yeast and bacterial artificial chromosomes (YAC, BAC) enabled researchers to clone large stretches of genomic DNA and to produce genomic libraries (Eggen et al. 2001), covering the entire genome in a reasonable number of overlapping clones. Further development and automation of DNA sequencing procedures was another important milestone, making genomic research feasible. Organization of DNA sequences in public databases, allowing searching for DNA sequences from different species and bioinformatics tools for sequence analysis made analysis of complex genomic data accessible for a wider scientific community. The number of DNA sequence entries in the public databases was growing exponentially during the last 20 years. Finally, in addition to powerful technology which allowed sequencing of entire genomes, microarray technology enabled analysis of gene expression in the whole genome in a single experiment. A new term, transcriptomics, was coined describing a high throughput analytical approach for the study of transcriptional activity of the genome. This approach can provide information about differential gene expression in different developmental and physiological stages as well as reaction to different environmental stimuli. GENOMICS APPROACH IN FARM ANIMALS Historically, pedigree analyses and establishing of suitable mapping populations was an important goal of animal genetic research. In farm animals creation of special mapping populations is often too costly, therefore suitable statistical models (e.g. daughter design) were developed in order to extract genetic information from already available population structure (Mosig et al., 2001) . An important tool in genomic research in farm animals were radiation hybrid cell panels, which allowed physical assignment of gene loci to genetic map. The fluorescent in situ hybridization was also successfully applied for physical mapping. Further development of animal gene maps was reached by the introduction of highly polymorphic genetic markers as RFLPs, microsatellites and single nucleotide polymorphisms (SNPs) for the fine mapping using reference populations. Recombination studies enabled narrowing of the mapping interval for the localization of candidate genes to the interval shorter than 1 cM, and introduction of large-capacity vectors (BAC, YAC), made physical cloning of candidate gene regions feasible. Genomic libraries containing ordered collection of large genomic fragments (mostly BAC clones) represent one of the most important genomic resources for genomic research in every species. At present BAC libraries with several fold coverage of the genome are available for all farm animal species. However, some genomic regions are still poorly covered and significant gaps are present in most of such libraries. More recently, expression sequence tag (EST) libraries from different tissues were established, serving as an excellent tool for identification of expressed genes. Information from EST libraries has been also used for assignment of gene ontology, shedding a new light into the functional organization of the genome. Since polygenic traits are of crucial importance in animal breeding, statistical methods for identification of genomic regions with significant phenotypic impact on quantitative traits have been developed. The concept of quantitative trait loci (QTL) overruled the old infinitesimal model of gene action. Using different strategies, genomic regions explaining 10–15% of the phenotypical variance were identified. One of the most frequently used strategies based on genetic analysis of phenotypic tail of the population is presented on figure 2. Two approaches are mainly used in mapping of production trait genes in farm animals: 1. Candidate gene approach: the target gene can be identified via clinical symptoms or physiological changes from human or mouse. This approach is successful for monogenic traits as some inherited disorders and some simple traits as coat color etc. Frajman, P and Dovč, P. Milk production in post-genomic era. 113 2. Positional cloning approach: there is no clear candidate gene evident. Linkage analysis pinpoints chromosomal region with unknown gene and subsequent fine mapping of the region can identify candidate genes by positional cloning. Using this approach the inconsistency of QTLs across breeds is a serious problem, hampering reliable localisation of the target region. Figure 2. Association of marker gene polymorphisms and linked QTL locus with quantitative trais enables identification of genomic regions with QTL loci. Slika 2. Asociacija polimorfizmov genskega markerja in vezanega kvantitativnega lokusa (QTL) s fenotipskimi lastnostmi, omogoča identifikacijo regij genoma, kjer se nahajajo QTL. STATE OF THE ART IN CATTLE GENOME RESEARCH Improvement of farm animal's production traits started immediately after domestication, when people begun to breed animals for a certain purpose in adapted environment. Classic selection is based on phenotypic performance which can be recorded either directly on the individuum (performance test) or its relatives, mainly offspring (progeny test). However, in both cases the impact of genes affecting particular trait is blurred by a number of environmental factors. The development of recombinant DNA techniques in the last few decades enabled identification of genes that underlie genetic variation of production traits observed in livestock species. Identification of these genes is expected to contribute considerably to the development of more efficient selection procedures, which will employ genetic markers. This strategy, called marker assisted selection (MAS) will allow also better insight in the physiological background of corresponding traits (Davis and DeNise, 1998). In cattle, several national and international projects were focused on production of molecular markers and improvement of existing genetic maps. In addition to that, interest in whole genome sequencing was growing with the improvement of technical tools for such project. At present the main initiative for whole genome sequencing is shared between research institutes at Baylor, NHGRI/NIH and A&M in Texas, as well as Canadian and New Zealand groups. The plan was to achieve 5–7 fold genome coverage using the shot-gun sequencing by the end of 2004. In the public databases 1598 cattle genes have already been mapped and partially sequenced by the end of 2003. More than 322.000 EST sequences were determined and deposited in public databases. The most comprehensive information regarding cattle genome organization is available from genome databases such as ArkDB (http://www.thearkdb.org/browser?species=cow) and BOVMAP. Cattle linkage maps contained in 2003 more than 2000 mapped loci, which is 114 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2. comparable with about 2000 mapped loci on radiation hybrid maps. In addition, numerous QTLs were mapped for economically important traits. Typical examples include milk yield and composition in dairy cattle and growth and carcass characteristics in beef cattle. Two main strategies have been employed in order to identify genes underlying QTLs: - experimental crosses between two strains, breeds or subspecies were performed to identify the genes contributing to the differences observed for a trait of interest between these two strains (breeds, subspecies). - mapping of QTLs that are underlying the genetic variance, observed for a trait of interest in a commercial population, was carried out with a help of the outbred pedigrees. Mapping of QTL is in general not very straightforward procedure because of the large genome regions occupied by them. QTLs normally comprise about 20 to 40 millions of base pairs containing several hundreds of genes, representing 1/50 to 1/100 of the whole genome. In addition, quantitative traits are affected by different breeding methods, interactions between environment and genotype, epistatic effects and by genetic imprinting. The precision of QTL mapping is therefore significantly reduced compared with a single gene locus. Another problem, associated with QTL identification is, that even they are determined in one population (breed) their consistency between populations is often low. Projects attempting to map genes affecting milk production traits in dairy cattle populations demonstrate different experimental designs. The Bov MAS project is one of the largest initiatives dealing with QTLs affecting milk production. The aim of this EU funded project is mapping of genes, which have an impact on milk production in order to provide tools for successful marker assisted selection. Conservation of genome organization between cattle, sheep and goat was already demonstrated comparing mapping data from these species. The most advanced genome map in cattle can therefore serve as a model for sheep, goat and even deer genome mapping. The availability genomic DNA sequences for a number of potential candidate genes with an impact on different production traits allowed construction of cattle genome micro arrays, which can be applied for large scale expression profiling in different physiological states, during infection and at different production levels. Complex expression profiles can help by identification of co-expressed genes and genes being involved in the same physiological pathways. FUNCTIONAL STUDIES IN MILK PROTEIN GENES Linkage analysis revealed clustering of all four casein loci in the relative gene order as1-CN-ß-CN-as2-CN-K-CN (Grosclaude et al, 1973). In the 1980s as the cDNA- and genomic sequences for major bovine lactoproteins became available (Stewart et al, 1984; Stewart et al, 1987; Vilotte et al, 1991; Gorodetsky et al, 1988; Alexander et al, 1988; Bonsing and Mackinlay, 1987) the new era of casein research began. Exon intron organization and nucleotide sequences of regulatory regions were determined. In situ hybridisation studies revealed localisation of the casein gene cluster on the bovine chromosome 6 (Gupta et al, 1982). However, the molecular proof of linkage and gene order was provided later using the long-range restriction analysis of the casein gene cluster DNA (Ferretti et al, 1990; Threadgill and Womack, 1990), which occupies about 250 kb of genomic DNA. The transcriptional orientation of the ß-CN gene is opposite to the orientation of the other three genes in the cluster (Rijnkels et al, 1997). From the evolutionary point of view the three related calcium sensitive casein genes (as1-CN-ß-CN-as2-CN) arose from the common ancestor through intra- and intergenic duplication and exon shuffling. They also share regulatory motifs in the proximal 5’ flanking region (Groenen and Van der Poel, 1994). However, the kappa casein gene (k-CN), the last member of the casein gene cluster is not evolutionary related to the other casein genes, although Frajman, P and Dovč, P. Milk production in post-genomic era. 115 it follows the similar expression pattern and its protein product is essential for micelle formation and stability (Alexander et al, 1988). All casein genes are present in numerous genetic variants (ß-CN: 7, k-CN: 6, as1 -CN: 6, as2-CN: 4). Frequencies of casein genetic variants are breed-specific and, with exception of as2-CN, have an impact on milk composition and technological properties of milk. Their expression is hormonally regulated by lactogenic hormones prolactin, glucocorticoid and insulin. They act either directly by binding to DNA (like glucocorticoid hormone) or via different signal transduction pathways and transcription factors (TF) as activators of lactoprotein gene transcription by binding of TF on their binding sites in promoter regions of lactoprotein genes. Prolactin activates STAT5, which is a most important activator of lactoprotein gene expression (Doppler et al, 2001). Considering consensus sequences of different TFs, their potential binding sites within the promoter regions could be identified and than further analyzed for their functionality using functional studies on cell cultures or transgenic animals. Figure 3. Diagrammatic representation of putative transcription factor binding sites in 2250 bp of the bovine ?-casein promoter compared to distribution of the putative TF binding sites in the ?-casein gene promoters of some mammalian species. Putative transcription factor binding sites were identified using consensus transcription factor binding sequences. Slika 3. Shematska ponazoritev domnevnih vezavnih mest transkripcijskih faktorjev (TF) v 2250 bp ?-kazeinskem promotorju goveda, v primerjavi z razporeditvijo domnevnih vezavnih mest TF v ?-kazeinskih promotorjih pri nekaterih drugih živalskih vrstah. Ugotavljanje domnevnih vezavnih mest je potekalo s pomočjo konsenzus zaporedij transkripcijskih faktorjev. In the case of the bovine ?-CN promoter, potential TF binding sites were determined on the basis of sequence similarity with consensus sequences (Adachi et al.; 1996; Debeljak et al., 2000,). Four potential STAT5 binding sites were selected for further functional analysis using EMSA. Two promoter fragments of different length (925bp and 2064bp) were used for 116 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2. luciferase reporter gene expression study in bovine mammary epithelial cell line BME-UV1. The expression experiment revealed important positive regulatory elements in the distal part of the bovine k-CN promoter (Debeljak et al, 2004, in press). The 3’ region of the mRNA can also have an impact on gene expression level, mostly by its effect on the length of polyA tail. It has been shown, that the length of polyA tail in the ß-CN is affected by lactogenic hormones prolactin and glucocorticoid and is therefore changing during the different stages of lactation. In the fourth and fifth exon of the k-CN gene, several polymorphisms were found, which could potentially influence the length of the polyA tail in different genetic variants of K-casein (Debeljak, 2000). Studies on the bovine ß-lactoglobulin gene showed the importance of a transcription factor AP-2 binding site for a high level of ß-lactoglobulin expression (Lum et al, 1997). A single point mutation in the promoter region, binding AP-2 caused significant reduction of ß-lactoglobulin/luciferase reporter gene in the HC11 cell line (Folch et al, 1999). Recently this polymorphism has been confirmed as a first known genetic polymorphism in lactoprotein genes with clear quantitative effect (Kuss et al, 2003). DESIGNER MILK The tissue specific expression of milk proteins offers a safe and renewable source for production of recombinant human proteins, useful for pharmaceutical industry, in the milk of transgenic farm animals. The capacity of the mammary gland to produce relatively high amounts of protein in milk and availability of efficient protein purification methods make production of biologically active proteins for pharmaceutical use also economically attractive. The human transferin from transgenic cattle, anti-thrombin III from transgenic goats, a1-antitripsin from transgenic sheep and a-glucosidase from transgenic rabbits are examples of successful introduction and expression of human genes in the farm animal mammary gland (Rudolph et al, 1999). More than 20 recombinant proteins have been produced using transgenic technology in five species (cow, goat, pig, rabbit and sheep). The efficacy of recombinant protein production in the mammary gland of transgenic animals is best illustrated by the fact that only four transgenic pigs producing factor IX could produce 2 kg of this protein which represent yearly demand for this protein worldwide. Another attractive field of research represent manipulation of milk composition in order to improve technological and dietary properties of milk. An example for a model for production of milk with reduced level of lactose are transgenic animals, which produce intestinal lactase -phlorizin hydrolase in the mammary gland, producing milk, suitable for people with pronounced lactose intolerance (Jost et al, 1999). Insertion of additional copies of lactoprotein genes under transcriptional control of different mammary gland specific promoters could alter protein concentration and influence micelle size and stability (Baranyi et al, 2004). Such modified milk could have interesting cheese making properties. The high proportion of saturated fatty acids in bovine milk fat raised nutritional concerns related with development of arteriosclerosis. Selection of dairy cattle for more effective desaturases could increase the proportion of unsaturated fatty acids in bovine milk. In addition, increased activity of stearoyl-CoA-desaturase could lead to higher proportion of conjugated linoleic acid (CLA) in milk, which would considerably improve dietary value of bovine milk fat (Bauman and Perfield, 2002). The content of CLA in milk is mostly influenced by nutrition and also by physiological factors such as breed, fertility, stage of lactation, level of the CLA desaturase. With changing of nutrition the level of CLA in milk could be up to five folds higher. In cattle, breed differences in CLA content in milk were observed, influenced by index of CLA-desaturase. Differences in CLA content in the milk fat could be up to three fold among individuals with the same nutrition with no remarkable Frajman, P and Dovč, P. Milk production in post-genomic era. 117 influence of the breed, parity or stage of lactation. Physiological and genetic background of individual differences in CLA content in milk still remains to be defined. MASTITIS Mastitis is most prevalent disease in dairy cattle, affecting around 40% of dairy cow population. Mastitis is a disease with low heritability and therefore selection attempts has little success. In sheep, but not in cows, genetic correlation between somatic cell count in milk and quantity of milk, was observed (Barillet et al., 2001). Clinical forms of mastitis in sheep are rare but it seems that it would be possible to lower even subclinical forms of mastitis with selection for mastitis resistance using somatic cell count. Recent research is oriented in identification of relevant genes and mechanisms controlling the pathogen specific immune defence in the mammary gland of ruminant dairy species. State-of-the-art functional genomics techniques are used to analyse specimens from udders of cows and goats, which have been experimentally infected with different pathogens. Genes with relevance for pathogen-specific immune defence can be characterized by comparative transcriptome analyses. Hierarchical clustering of the data is the next step in identification of relevant genes involved in immune response. Characterization of their genetic variants in relationship to relevant QTL will help dairy cattle breeders to improve dairy cows’ genetics for mastitis resistance. CONCLUSION Genomics approach to identification of important genes with an impact on the milk quantity, quality and composition offers an entirely new way to identify complex interactions among genes and their physiological role for milk production. For the first time we can anaylse complex relationship among genes within the entire genome and perform complex expression experiments, which were not feasible without high throughput genomic tools. As a consequence, the faster and more efficient selection for higher productivity, and even more interesting, for milk characteristics, influencing technological properties of milk or having better impact on human health will be possible. For example, selection on certain favorable haplotypes (?-CN B and ß-lactoglobulin B) will contribute to better technological properties of milk, especially cheese making properties. In the future, more robust QTLs have to be defined and search for appropriate markers for MAS needs to be continued. Functional polymorphisms within genes influencing production traits have to be evaluated in vitro and in vivo in order to enable selection for alleles with positive effects. And finally, gene expression patterns, revealed in micro array experiments will allow identification of new candidate genes involved in the expression of production traits. REFERENCES Adachi, T./ Ahn, J. Y./ Yamamoto, K./ Aoki, N./ Nakamura, R./ Matsuda, T. Characterisation of the bovine ?-casein gene promoter. Biosci. Biotech. Biochem., 60(1996), 1937–1940. Alexander, L.J./ Stewart, A.F./ Mackinlay, A.G./ Kapelinskaya, T.V./ Tkach, T.M./ Gorodetsky, S.I. Isolation and characterization of the bovine kappa-casein gene. Eur J Biochem., 178(1988)2, 395–401. [Anon.] The mouse genome. Nature, 420(2002)6915, 520–562. Aschaffenburg, R./ Drewry, J. Genetics of the beta-lactoglobulins of cow's milk. Nature. 180(1957)4582, 376–378. Baranyi, M./ Gocza, E./ Lemos, A.P.C./ Hiripi, L./ Carstea, B.V./ Whitelaw, B./ Boesze, Zs. Production of kappa-casein knock-out mouse chimera. Annual Meeting of the European Association for Animal Production, 2004. Barillet, F./ Rupp, R./ Mignon-Grasteau, S./ Astruc, J.M./ Jacquin, M. Genetic analysis for mastitis resistance and milk somatic cell score in French Lacaune dairy sheep. Genet Sel Evol., 33(2001)4, 397–415. 118 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2. Bauman, D.E./ Perfield, J.W. CLA – the milk fat wonder. Pro-Dairy, Northeast DairyBusiness, 4(2002)6, 21. Bonsing, J./ Mackinlay, A.G. Recent studies on nucleotide sequences encoding the caseins. J Dairy Res., 54(1987)3, 447–61. Bork, P./ Copley, R. The draft sequences. Filling in the gaps. Nature, 409(2001)6822, 818–820. Bovenhuis, H./ Spelman, R.J. Selective genotyping to detect quantitative trait loci for multiple traits in outbred populations. J Dairy Sci., 83(2000)1, 173–180. Bromberg, S./ Twigger, S./ Nigam, R./ Hughes, A./ Mathis, J./ Lu, J./ Shimoyama, M./ Pasko, D./ Chen, C.F./ Gopinathrao, G./ Dela Cruz, N./ Ginster, J./ Ramachandran, H./ Maglott, D./ Eppig, J./ Stahl, F./ Tonellato, P. Rat genome database: A comparative genomics platform for rat, mouse and human. Faseb J. 17(2003)4, Part1 suppl., A491–A492. Buchberger, J./ Dovč, P. Lactoprotein genetic variants in cattle. Food technol. Biotechnol., 38(2000)2, 91–98. Davis, G.P./ DeNise, S.K. The impact of genetic markers on selection. J Anim Sci., 76(1998)9, 2331–2339. Debeljak, M./ Sušnik, S./ Miloševič-Berlič, T./ Medrano, J.F./ Dovč, P. GeneTechnology and milk production. Food technol. biotechnol., 38(2000)2, 83–89. Debeljak, M. Regulation of the bovine kappa casein (?-CN) gene expression. Doctoral thesis, Univ. of Ljubljana, Medical Fac., 2002. Debeljak M./ Frajman P./ Lenasi V./ Narat M./ Baldi A./ Dovč P. Bovine mammary gland cell based functional analysis of bovine beta- and kappa casein promoters. Archiv tierzucht, in press. Doppler, W./ Windegger, M./ Soratroi, C./ Tomasi, J./ Lechner, J./ Rusconi, S./ Cato, A.C.B./ Almlöf, T./ Liden, J./ Okret, S./ Gustafsson, J./ Richard-Foy, H./ Starr, D.B./ Klocker, H./ Edwards, D./ Geymayer, S. Expression level-dependent contribution of glucocrticoid receptor domains for functional interaction with STAT5. Molecular and cellular biology, 21(2001), 3266–6279. Eggen, A./ Gautier, M./ Billaut, A./ Petit, E./ Hayes, H./ Laurent, P./ Urban, C./ Pfister-Genskow, M./ Eilertsen, K./ Bishop, M.D. Construction and characterization of a bovine BAC library with four genome-equivalent coverage. Genet Sel Evol, 33(2001)5, 543–548. Ferretti, L./ Leone, P./ Sgaramella, V. Long range restriction analysis of the bovine casein genes. Nucleic Acids Res., 18(1990)23, 6829–6833. Folch, J.M./ Dovc, P./ Medrano, J.F. Differential expression of bovine beta-lactoglobulin A and B promoter variants in transiently transfected HC11 cells. J Dairy Res., 66(1999)4, 537–544. Gellin, J./ Brown, S./ Marshall Graves, J.A./ Rothschild, M./ Schook, L./ Womack, J./ Yerle, M. Comparative gene mapping workshop: progress in agriculturally important animals. Mamm Genome, 11(2000)2, 140–144. Godovac-Zimmermann, J./ Conti, A./ Liberatori, J./ Braunitzer, G. Homology between the primary structures of beta-lactoglobulins and human retinol-binding protein: evidence for a similar biological function? Biol Chem Hoppe Seyler, 366(1985)4, 431-434. Gorodetsky, S.I./ Tkach, T.M./ Kapelinskaya, T.V. Isolation and characterization of the Bos taurus beta-casein gene. Gene, 66(1988)1, 87–96. Grosclaude, F./ Mercier, J.C./ Ribadeau-Dumas, B. Genetic aspects of cattle casein research. Neth. Milk Dairy J., 27(1973), 328. Groenen, M.A.M./ Van der Poel, J.J. Regulation of expression of milk protein genes: a review. Livestock Production Science, 38(1994), 61–78. Gupta, P./ Rosen, J.M./ D'Eustachio, P./ Ruddle, F.H. Localization of the casein gene family to a single mouse chromosome.J Cell Biol., 93(1982)1, 199–204. Jost, E./ Vilotte J.L./ Duluc, I./ Rodeau, J.L./ Freund, J.N. Production of low-lactose milk by ectopic expression of intestinal lactase in the mouse mammary gland. Nat Biotechnol., 17(1999)2, 160–164. Kuss, A.W./ Gogol, J./ Geidermann, H. Associations of a polymorphic AP-2 binding site in the 5'-flanking region of the bovine beta-lactoglobulin gene with milk proteins. J Dairy Sci., 86(2003)6, 2213–2218. Lodes, A./ Buchberger, J./ Krause, I./ Aumann, J./ Klostermeyer, H. The influence of genetic variants of milk proteins on the compositional and technological properties of milk. 1. Casein micelle size and the content of non-glycosylated ?-CN. Milchwissenschaft, 52(1996), 3–8. Lum, L.S./ Dovč, P./ Medrano, J.F. Polymorphisms of bovine beta-lactoglobulin promoter and differences in the binding affinity of activator protein-2 transcription factor. J Dairy Sci., 80(1997)7, 1389–1397. Mariani, P./ Losi, G./ Russo, V./ Castagnetti, L./ Grazia, L./ Morini, D./ Fossa, E. Caseification tests made with milk characterized by variants A and B of ?-casein in the production Parmigiano-Reggiano cheese. Scienza e Tecnica Lattiero-Casearia, 27(1976), 208–227. McPherson, J.D./ Dodgson, J./ Krumlauf, R./ Pourquié, O. Proposal to sequence the genome of the chicken. 2004. http://www.genome.gov/11510730. Mosig, M.O./ Lipkin, E./ Khutoreskaya, G./ Tchourzyna, E./ Soller, M./ Friedmann, A. A whole genome scan for quantitative trait loci affecting milk protein percentage in Israeli-Holstein cattle, by means of selective milk DNA pooling in a daughter design, using an adjusted false discovery rate criterion. Genetics, 157(2001)4, 1683–1698. Frajman, P and Dovč, P. Milk production in post-genomic era. 119 Rijnkels, M./ Kooiman, P.M./ De Boer, H.A./ Pieper, F.R. Organization of the bovine casein gene locus. Mamm Genome, 8(1997), 148–152. Rudolph, N.S. Biopharmaceutical production in transgenic livestock. Trends Biotechnol., 17(1999)9, 367–374. Schrooten, C./ Bink, M.C./ Bovenhuis, H. Whole genome scan to detect chromosomal regions affecting multiple traits in dairy cattle. J Dairy Sci., 87(2004)10, 3550–3560. Stewart, A.F./ Bonsing, J./ Beattie, C.W./ Shah, F./ Willis, I.M./ Mackinlay, A.G. Complete nucleotide sequences of bovine alpha S2- and beta-casein cDNAs: comparisons with related sequences in other species. Mol Biol Evol., 4(1987)3, 231–241. Stewart, A.F./ Willis, I.M./ Mackinlay, A.G. Nucleotide sequences of bovine alpha S1- and kappa-casein cDNAs. Nucleic Acids Res., 12(1984)9, 3895–3907. Threadgill, D.W./ Womack, J.E. Genomic analysis of the major bovine milk protein genes. Nucleic Acids Res., 18(1990)23, 6935–6942. Vilotte, J.L./ Soulier, S./ Printz, C./ Mercier, J.C. Sequence of the goat alpha-lactalbumin-encoding gene - comparison with the bovine gene and evidence of related sequences in the goat genome. Gene, 98(1991)2, 271–276. Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2, 121-130. http://www.bf.uni-lj.si/aas Agris category codes: Q01 COBISS Code 1.01 POLIMORFIZEM GENOV ZA ß-LAKTOGLOBULIN IN ?S1-KAZEIN PAŠKE OVCE * Ante IVANKOVIĆ a) in Peter DOVČ b) a) Univ. v Zagrebu, Agronomski fak., Odd. za živinorejo, Svetošimunska 25, HR-10000 Zagreb, Hrvatska, doc., dr. b) Univ. v Ljubljani, Biotehniška fak., Odd. za zootehniko, Groblje 3, SI-1230 Domžale, Slovenija, prof., dr. Delo je prispelo 12. januarja 2004, sprejeto 10. decembra 2004. Received January 12, 2004, accepted December 10, 2004. IZVLEČEK Polimorfizmi genov, ki kodirajo proteine mleka imajo pogosto pomembem vpliv na tehnološke lastnosti mleka. Čeprav so podatki o vplivu alelnih variant laktoproteinskih genov na tehnološke lastnosti mleka pogosto kontradiktorni, v selekcijske vse pogosteje vključujejo tudi informacije o genotipu na laktoproteinskih lokusih, da bi v populacijah povačali frekvenco alel z ugodnim učinkom na tehnološke lastnosti mleka. Glavni proizvod paške ovce je mleko, ki ga večinoma predelajo v paški sir. Izboljšanje tehnoloških lastnosti mleka te pasme bi bistveno pripomoglo k večji ekonomičnosti reje te pasme. Z namenom, da bi ugotovili frekvenco alelov laktoproteinskih genov, ki pomembno vplivajo na predelovalne lastnosti ovčjega mleka, smo v tej raziskavi tipizirali gena za ß-laktoglobulin in ?s1-kazein štiridesetih živali. Genotipizacijo smo izvedli s pomnoževanjem delov obeh genov z verižno reakcijo s polimerazo in estrikcijo amplifikatov z ustreznimi endonukleazami. Na lokusu za ß-laktoglobulina smo našli alela A in B (0,5375; 0,4625), na lokusu za ?s1-kazein pa smo določali aleli A in D (0,0875; 0,1340). Glede na podatke v literaturi lahko rečemo, da frekvence alel za ß-laktoglobulin in ?s1-kazein v populaciji paške ovce niso najugodnejše in da bi z uporabo molekularnih metod frekvenco alel z ugodnimi tehnološkimi lastnostmi lahko sorazmerno hitro povečali. To bi vodilo k izboljšanju ekonomičnosti reje te pasme, katere edini tržno uveljavljeni produkt je paški sir. Ključne besede: ovce / pasme / paška ovca / mleko / laktoglobulini / kazein / molekularna genetika / polimorfizem genov / Hrvaška POLYMORPHISMS OF ß-LACTOGLOBULIN AND ?S1-CASEIN GENES IN THE PAG ISLAD SHEEP † ABSTRACT Polymorphisms of lactoprotein genes have a significant effect on technological properties of milk. In spite of the fact that literature data on the impact of lactoprotein variants on cheese making properties are sometimes contradictory, the information about the lactoprotein genotypes becomes important in selection programs in order to improve frequency of favourable alleles for technological properties of milk. The main product of the Pag Islad Sheep is milk, which is mainly used for manufacturinh of well known Pag Cheese. The improvement of cheese making properties of the Pag Island Sheep milk would contribute significantly to the rentability of the breed. In order to estimate the frequency of alleles contributing to technological properties of milk, we genotyped ß-lactoglobulin and ?s1-casein loci of 40 Pag Island Sheep. Genotyping was performed using PCR followed by restriction analysis. At the ß-lactoglobulin locus alleles A and B (0.5375; 0.4625) were found whereas at the ?s1-casein locus genotyping of alleles A in D Prispevek je del doktorske disertacije (zagovor 16. marca 2001), mentor izr. prof.dr. Peter Dovč. This paper is a part of a dissertation thesis (defense March 16, 2001) supervisor assoc.prof. Peter Dovč, Ph.D. 122 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2. (0.0875; 0.1340) was performed. According to the literaure data, we can conclude that allele frequencies at ß-lactoglobulin and as1-casein locus in the population of Pag Island Sheep are not optimal for cheese making properties of milk. Application of molecular techniques would enable relatively rapid improvement of allelic frequencies towards technologically favourable alleles. This would also improve economical parameters of milk production with Pag Island Sheep breed, which is only known for special Pag cheese. Key words: sheep / breeds / Pag island sheep / milk / lactoglobulins / casein / molecular genetics / gene polymorphism / Croatia UVOD Mleko ovac predstavlja kakovosten vir energije in beljakovin. Ima znatno višjo vsebnost suhe snovi kot kravje mleko. Delež mlečne masti v suhi snovi ovčjega mleka znaša 38,6 %; beljakovin 31,2 %; laktoze 25,1 % in pepela 5,1 %. Kravje mleko ima v primerjavi z ovčjim manj mlečne maščobe (30,8 %), manj proteinov (25,7 %), več laktoze (37,8 %) in več pepela (5,7 %) (Anifantakis, 1985). Mleko ovac vsebuje znatno več (23 %) nižjih maščobnih kislin (kaprilna, kaprinska, laurinska) kot mleko krav (12 %), kar mu daje specifičen okus. Skupna količina belajkovin in njihovo razmerje, sta v mleku ovac bistveno drugačna kot v mleku krav. Delež kazeina v skupnih beljakovinah mleka znaša podobno kot pri kravjem mleku 75-80 %, delež serumskih proteinov pa 20-25 %, zaradi česar ovčje mleko opredelimo kot kazeinsko mleko. Zaradi relativno velikega deleža proteinov mlečnega seruma, pa sirotko uporabljamo tudi za proizvodnjo albuminskih sirov. Mleko ovac vsebuje, tako kot mleko drugih sesalcev, beljakovine, ki so deloma raztopljene v mleku, deloma pa so prisotne v obliki polidisperznih agregatov - micel. Proteine v ovčjem mleku razvrstimo v dve glavni skupini: kazeine (C) znotraj eksona II. Z uporabo ustreznih začetnih oligonukleotidov (LBG1, LBG2) je amplificiral 120 bp dolgo zaporedje, znotraj katerega se nahaja mutacijsko mesto, ki je hkrati tudi restrikcijsko mesto za RsaI pri varianti A. Tako RsaI cepi PCR fragment alelne variante ß-LG A na tri fragmente (66, 37 in 17 bp), medtem ko da PCR fragment variante ß-LG B po cepitvi le dva fragmenta (103 in 17bp). Kratek fragment, dolg 17 bp, se pojavlja v obeh alelnih variantah, kar predstavlja kontrolo delovanja restrikcijskega encima. Razen dveh glavnih alelnih variant (ß-LG A in ß-LG B) se precej redkeje pojavlja še tretja alelna varianta ß-LG C. Prinzenberg in Erhardt (1999) sta uvedla metodo, ki omogoča PCR identifikacijo variante ß-LG C. Najprej je treba pomnožiti 245 bp dolg fragment, ki vsebuje ekson V in intron V (nukleotidno mesto 4589-4834), nakar sledi cepitev produkta z endonukleazama MspI ali AluI. Tudi za identifikacijo alelnih variant as1-CN so na voljo postopki, ki temeljijo na uporabi PCR metodologije. Ramunno s sod. (1997) je prvi opisal možnost določanja 'Welsh' variante < a> a> 8* t a. o g" a S: Haplotip 3 CO CO —»¦MCOCO^^OOCDCDCDOOO->-—>-—^CO^.Ü1Ü10)0)00-ifOMJiSNlSNlSOOO->-—»-rororO 0)NOWN^.^4i.ü1U10K)W TATTCAACGAATCTGAATCAATGATCCGGACCCTACCAACTAA ATCCCCTTTCAA C...........T.......G......A.............G .C 136 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2. 1, stolpec C, vrstica Gidrane). Konji s haplotipom Y zato v rod Gidrane ne spadajo in bi jih bilo potrebno uvrstiti v nov rod. V rod Gidrane prav tako ne spadajo lipicanci s haplotipom Capriola. V rodu Deflorata je situacija nekoliko drugačna. Za ta rod je zelo verjetno značilen haplotip Capriola, zato lipicanci z drugačnimi haplotipi v ta rod ne sodijo. V primeru vzorcev s haplotipi Betalka je do pomote prišlo le pri razvrščanju po rodovih kobil v Rodovni knjigi. Vzorci s haplotipom Betalka se po rodovniških podatkih uvrščajo v klasičen rod Capriola in ne v rod Deflorata. Rodovniške podatke potrjujejo tudi genetski. Za rod Capriola je namreč značilen prav haplotip Betalka (Kavar, 2000). Predvidevamo, da je do napake v Rodovni knjigi prišlo zaradi podobnih imen, ki se pojavljajo v rodovih Capriola in Deflorata. Predlagamo, da se lipicance s haplotipom Betalka iz rodu Deflorata uvrsti v klasičen rod Capriola. Tretji primer neskladij med genetskimi in rodovniškimi podatki smo opazili znotraj rodu Munja, kjer je bil za eno linijo značilen haplotip Strana, za drugo pa haplotip Gaetana. Ker je haplotip Gaetana značilen za rod Gidrane, bi bil za rod Munja lahko značilen haplotip Strana. Še posebej, ker haplotipa Strana v drugih lipicanskih rodovih ne zasledimo. Predlagamo, da se lipicance s haplotipom Gaetana uvrsti v rod Gidrane, lipicanci s haplotipom Strana pa naj ostanejo v rodu Munja. Nadaljnja tri neskladja smo opazili v rodovih Sardinia, Argentina in Europa, ko smo haplotipe, ki smo jih našli pri lipicancih slovenske reje, primerjali s haplotipi lipicancev iz osmih evropskih lipicanskih kobilarn (Piber, Monterotondo, Đakovo, Szilvasvarad, Topolcianky, Beclean in Fagaras). Vsi lipicanci slovenske reje iz rodu Sardinia se uvrščajo v isto izmed treh že dalj časa ločenih vej znotraj rodu Sardinia, in za vse lipicance iz te veje je značilen haplotip Betalka. Lipicanci iz drugih evropskih kobilarn se v glavnem uvrščajo v preostali dve veji, in imajo haplotip Capriola. Kakšen haplotip je imela začetnica rodu Sardinia ne vemo zanesljivo, ker možnosti, da je bilo v rodovniku roda Sardinia več napak, ne moremo izključiti. V primeru, da je v tem rodu res prišlo samo do ene napake, je Sardinia imela haplotip Capriola, torej najpogostejši haplotip pri lipicancih, značilen za več kot četrtino lipicancev (Kavar in sod., 2002). Za oba haplotipa (Capriola in Betalka) velja, da so jih imeli lipicanci že vsaj pred dvestotimi leti, in da zato oba nedvomno spadata med haplotipe, značilne za klasične lipicanske rodove. Znotraj rodu Argentina je za vejo, v katero se uvrščajo vsi lipicanci slovenske reje, značilen haplotip Capriola. Torej haplotip, ki je značilen še za nekaj drugih lipicanskih rodov. Pri vzorcih iz druge linije smo našli, bodisi haplotip Capriola, bodisi haplotip X. Ker je bil haplotip X značilen za vzorce iz italijanske kobilarne Monterotondo, v kateri naj bi bili bolj ali manj le lipicanci, ki izvirajo iz stare lipicanske črede, menimo, da je haplotip X tudi eden od haplotipov, značilnih za klasične rodove kobil. Zato je možno, da v Sloveniji ni lipicancev iz klasičnega rodu kobil z značilnim haplotipom X. Tretje neskladje smo opazili v rodu Europa, kjer so vsi lipicanci slovenske reje imeli haplotip Trompeta, medtem ko so lipicanci iz istega rodu v drugih državah imeli haplotip U. Ime Trompeta je bilo pogosto tako pri prednicah lipicancev s haplotipom Trompeta, kot pri lipicancih s haplotipom U. Rodovniki lipicancev s haplotipom U so znani do začetka 19. st. in vemo tudi, da so lipicance s haplotipom U imeli že v stari Lipici. Haplotip U zato lahko brez večjega tveganja uvrstimo med haplotipe, značilne za klasične rodove, česar pa za haplotip Trompeta ne moremo reči. Rodovniki lipicancev s haplotipom Trompeta so znani samo do Triglave, roj. leta 1916. Njeni potomci so živeli v kobilarnah v Stančič in Seleš, in so v Lipico prišli šele po 2. svetovni vojni. Haplotip Trompeta se zato verjetno uvršča med haplotipe, značilne za rodove kobil hrvaškega izvora. Predlagamo tudi, da se lipicance s haplotipom Trompeta uvrsti v nov rod, in ne več v rod Europa. V primeru vzorcev iz rodu Margit, kjer smo prav tako opazili dva različna haplotipa (C in D) gre lahko spet za napako v rodovnikih, možno pa je tudi, da je prišlo do nove mutacije znotraj istega rodu. Razlika med haplotipoma C in D je namreč na enem samem nukleotidnem mestu. Kavar, T. in sod. Rodovi lipicancev slovenske reje glede na haplotip mitohondrijske DNK. 137 Na splošno lahko rečemo, da število napak ni veliko, in da bi bilo zaradi tega smiselno narediti nekaj popravkov, s katerimi bi uskladili rodovniške podatke o rodu kobil z genetskimi podatki (haplotipi). V nasprotnem primeru se bodo vse napake ohranjale tudi v naslednjih generacijah lipicancev. Naj omenimo še, da neskladje genetskih in rodovniških podatkov ni specifičen problem lipicanske pasme. Do zelo podobnih ugotovitev so prišli tudi s preverjanjem arabskih rodov kobil (Bowling in sod., 2000) in rodov kobil pri angleških polnokrvnih konjih (Hill in sod., 2002). Izvor lipicanskih haplotipov Lipicanski haplotipi se uvrščajo v štiri glavne skupine haplotipov: C1, C2, C3 in C4 (slika 1). Vsako skupino haplotipov povezujejo iste skupne mutacije. Npr. haplotipe iz skupine C4 povezujejo mutacije na mestih 15494, 15496, 15534, 15603, 15635, 16407 in 16563a (preglednica 2), ki so se zgodile in fiksirale pri skupnih prednikih po materini strani današnjih konj s haplotipi iz skupine C4. Kaže, da imajo lipicanci skupne bližnje prednike z drugimi domačimi konji, saj je primerjava lipicanskih haplotipov s haplotipi drugih pasem konj pokazala, da so lipicanski haplotipi zelo podobni, večkrat tudi enaki haplotipom, ki so jih našli pri drugih pasmah konj. Ti skupni bližnji predniki domačih konj so bili verjetno udomačeni v obdobju pred okrog 6000 do 4000 leti (Clutton-Brock, 1999). Genetski podatki kažejo, da je bilo udomačenih veliko število konj iz več različnih populacij divjih konj (Vila in sod., 2001; Jansen in sod., 2002) Ker so se v preteklosti verjetno dogajale številne migracije konj, je danes skupine haplotipov zelo težko povezati z določeno fenotipsko skupino konj (poniji, orientalski konji, težki hladnokrvni konji, itd.). Običajno namreč v večini pasem ugotovijo haplotipe iz vseh štirih glavnih skupin haplotipov (C1-C4), tako kot smo to ugotovili tudi pri lipicancih. Do nedavnega je zato prevladovalo mnenje, da vsi domači konji izvirajo iz ene večje populacije divjih konj. Ta naj bi vsebovala konje s haplotipi iz vseh štirih glavnih skupin (Lister, 1998); pri čemer naj bi različne fenotipske skupine nastale šele po udomačitvi konj s kombinacijo umetne in naravne selekcije (prilagoditev na okoljske dejavnike) (Clutton-Brock, 1999). Zadnja raziskava (Jansen in sod., 2002) pa kaže, da nekaj povezav med skupinami haplotipov in geografskim izvorom oz. fenotipsko skupino le obstoji. Tako naj bi bila skupina haplotipov C3a (slika 1) značilna predvsem za konje iz srednje Evrope, Britanskega otočja, Skandinavije in Islandije, oz. za »exmoor«, fjordske, islandske in škotske »highland« ponije (Jansen in sod., 2002). V to skupino se uvrščata tudi dva haplotipa lipicancev slovenske reje. Haplotip Strana, ki je značilen za hrvaški rod Munja, ter haplotip Gratiosa, ki je značilen za arabski rod Mercurio. Jansen in sod. (2002) to skupino imenujejo C1, skupino, ki jo bomo omenjali v naslednjem odstavku pa D1. Ker naj bi pri nastanku lipicancev sodelovali tudi španski konji, je za nas zanimiva ugotovitev, da naj bi bila za iberijske (andaluzijske in lusitano konje) ter severno-afriške konje berbere značilna skupina haplotipov C4 oz. predvsem haplotipa Allegra in Monteaura (Jansen in sod., 2002). Oba haplotipa smo našli tudi pri lipicancih slovenske reje. Haplotip Allegra je bil značilen za pet rodov, med drugim tudi za klasična rodova Englanderia in Stornella, ki izvirata iz češke kobilarne Kladruby (preglednica 1). Ker naj bi v tej kobilarni imeli predvsem konje španskega porekla, haplotip Allegra v rodovih Englanderia in Stornella ne preseneča. Haplotip Monteaura, ki naj bi bil prav tako značilen za španske oz. severno-afriške konje, smo našli v kraškem rodu Spadigla. To lahko pomeni, da rod Spadigla izvira iz španskih konj, ki naj bi jih v 16., 17., ali 18. stoletju uvozili iz Španije. Skoraj enako verjetna se nam zdi tudi možnost po kateri naj bi haplotip Monteaura sicer izhajal iz konj, ki so bili udomačeni na področju severne Afrike, vendar naj bi konji s tem haplotipom v naše kraje prišli že prej, lahko tudi pred več tisoč leti. Haplotip Monteaura namreč sodi med tiste haplotipe, ki so pri domačih konjih zelo pogosti. 138 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2. Znanih je vsaj okrog 17 takih zelo pogostih haplotipov (Jansen in sod., 2002). Od lipicanskih haplotipov, poleg haplotipa Monteaura, mednje lahko uvrstimo vsaj še haplotipe Gaetana, Allegra, Capriola in Dubovina. Za te zelo pogoste haplotipe velja, da jih lahko najdemo v fenotipsko zelo različnih pasmah. Menimo, da so take haplotipe imeli že vsaj prvi udomačeni konji. Gre torej za »starejše« haplotipe, iz katerih so kasneje, z novimi mutacijami, nastajali »novejši« haplotipi. Dva taka tipična primera »novejših« haplotipov zasledimo tudi pri lipicancih slovenske reje. Tako naj bi haplotip Betalka nastal iz haplotipa Monteaura, haplotip X pa iz tudi zelo pogostega haplotipa Dubovina, ki je tudi zelo pogost pri domačih konjih. Tako haplotip Betalka kot haplotip X sodita med bolj redke haplotipe. Haplotip Betalka smo našli samo pri lipicancih, haplotip X pa še pri konju z oznako PO2 (Mirol in sod., 2003). Menimo, da nam bodo prav taki novejši haplotipi, zaradi večje specifičnosti, v prihodnosti v pomoč pri ugotavljanju migracij in povezav med pasmami. Trompeta A Capriola C1 Thais C3b Betalka /^ Monteaura 92 93V. 81J .50 63 O Allegra/ Wera P Q C C4 C2 0.01 Slika 1. Odnosi med 39 lipicanskimi haplotipi mitohondrijske DNK predstavljeni z NJ drevesom. Sedemnajst haplotipov lipicancev slovenske reje je označenih s črnimi krogci. Figure 1. Relationship among 39 Lipizzan mitochondrial DNA haplotypes presented by NJ tree. The circles representing 17 haplotypes of Slovenian Lipizzan are black. Opazili smo tudi nekaj povezav med haplotipi in pasmo, iz katere naj bi izvirali lipicanski rodovi. Tako je bil najbolj pogost haplotip v populaciji arabskih konj, registriranih v ZDA s 16 % prav haplotip, ki smo ga pri lipicancih poimenovali Gaetana (Bowling in sod., 2000). Kavar, T. in sod. Rodovi lipicancev slovenske reje glede na haplotip mitohondrijske DNK. 139 Značilen je za lipicanski rod arabskega izvora Gidrane (preglednica 1). Po rodovniških podatkih naj bi bila začetnica tega rodu polnokrvna arabka OX Gidrane. Zato ta povezava med lipicansko in arabsko pasmo verjetno ni zgolj naključna. Verjetno tudi ni naključje, da smo pri kladrubskih konjih zasledili haplotipa Batosta in Slavina. Torej enaka haplotipa kot v klasičnih lipicanskih rodovih kladrubskega porekla: Africa in Almerina (preglednica 1). Da gre za naključje je malo verjetno še posebej zato, ker oba haplotipa spadata med zelo redke haplotipe, in jih razen pri kladrubskih in lipicanskih konjih še niso našli. O izvoru v lipicanski pasmi najbolj pogostega haplotipa Capriola, ki je značilen za več lipicanskih rodov kobil, med drugimi tudi za kraški rod Argentina, danski rod Deflorata in kladrubski rod Presciana, lahko samo ugibamo, saj tudi haplotip Capriola spada med zelo pogoste haplotipe pri domačih konjih. Našli so ga denimo pri Connemara ponijih, trakencih, fjordskih ponijih, dülmenerskih konjih, holštajncih, arabcih in berberih. VIRI Bowling, A.T./ Del Valle, A./ Bowling, M. A pedigree-based study of mitochondrial D-loop DNA sequence variation among Arabian horses. Anim. Genet., 31(2000)1, 1–7. Clutton-Brock, J. A natural history of domesticated mammals, 2nd edn. Cambridge, New York, Melbourne, Cambridge University Press, 1999, 238 s. Dolenc, M. Lipica. Ljubljana, Mladinska knjiga, Lipica: kobilarna, 1980, 96 s. Felsenstein, J. PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version 3.5c., Univ. of Washington, Dept. of Genetics, Seattle, 1993. Hill, E.W./ Bradley, D.G./ Al-Barody, M./ Ertugrul, O./ Splan, R.K./ Zakharov, I./ Cunningham, E.P. History and integrity of thoroughbred dam lines revealed in equine mtDNA variation. Animal Genetics, 33(2002), 287–294. Jansen, T./ Forster, P./ Levine, M.A./ Oelke, H./ Hurles, M./ Renfrew, C./ Weber, J./ Olek, K. Mitochondrial DNA and the origins of the domestic horse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(2002)16, 10905–10910. Kavar, T. Ocena genetske raznolikosti v populaciji konj lipicanske pasme. Doktorska disertacija. Domžale, Univ. v Ljubljani, 2001, 118 s. Kavar, T./ Brem, G./ Habe, F./ Sölkner, J./ Dovč, P. History of Lipizzan horse maternal lines as revealed by mtDNA analysis. Genet. Sel. Evol. 34(2002), 635–548. Kavar, T./ Habe, F./ Brem, G./ Dovč, P. Mitochondrial D-loop sequence variation among the 16 maternal lines of the Lipizzan horse breed. Anim. Genet. 30(1999), 423–430. Lister, A.M./ Kadwell, M./ Kaagan, L.M./ Jordan, W.C./ Richards, M.B./ Stanley, H.E. Ancient and modern DNA in a study of horse domestication. Ancient Biomolecules, 2(1998), 267–280. Mirol, P.M./ Peral García, P./ Vega-Pla, J.L./ Dulout, F.N. Phylogenetic relationship of Argentinean Creole horses and other South American and Spanish breeds inferred from mitochondrial DNA sequences. Anim. Genet., 33(2002), 356–363. Ouhlela, J. Züchterische Standards in der Lipizzanerpferde-population. Habilitationsarbeit Brno – Piber, Fachtierarzt für Pferde und Tierzucht, 1996, 120 s. Page, R.D.M. Treeview (Win32), University of Glasgow, Division of Environmental and Evolutionary biology Institute of Biomedical and Life Sciences, Glasgow, 1998. Pangos, J. Rodovna knjiga lipicancev slovenske reje. Lipica, Kobilarna Lipica, 1999, 254 s. Vila, C./ Leonard, J.A./ Gotherstrom, A./ Marklund, S./ Sandberg, K./ Liden, K./ Wayne, R.K./ Ellegren, H. Widespread origins of domestic horse lineages. Science, 291(2001), 474–477. Xu, X./ Arnason, U. The complete mitochondrial DNA sequence of the horse, Equus caballus: extensive heteroplasmy of the control region. Gene, 148(1994), 357–362. Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2, 141-151. http://www.bf.uni-lj.si/aas Agris category codes: L20, L51 COBISS Code 1.01 RAZGRADNJA KSILANA Z RAZLIČNIMI KSILANAZAMI VAMPNE BAKTERIJE Pseudobutyrivibrio xylanivorans Mz5T Tadej ČEPELJNIK a), Katarina FIDLER b) in Romana MARINŠEK-LOGAR c) a) Univ. v Ljubljani, Biotehniška Fak., Odd. za zootehniko, Groblje 3, SI-1230 Domžale, Slovenija, mag., e-pošta: tadej.cepeljnik@bfro.uni-lj.si. b) Volčji Potok 30, SI-1240 Kamnik, Slovenija. c) Isti naslov kot a), doc., dr., mag. Delo je prispelo 31. oktobra 2004, sprejeto 10. decembra 2004. Received October 31, 2004, accepted December 10, 2004. IZVLEČEK Uporaba ksilanaz kot krmnih dodatkov je pri monogastričnih živalih zelo obetavna, saj so njihov ugoden učinek na zdravstveno stanje in prirast živali potrdile številne raziskave. Pred kratkim je bila opisana nova vrsta vampne bakterije P. xylanivorans s tipskim sevom Mz5T, ki je močno ksilanolitična. Nekaj njenih ksilanolitičnih encimov je že opisanih, preiskati pa želimo še ostale, da bi ugotovili vzrok visoke ksilanolitične aktivnosti in možnosti uporabe bakterije kot probiotika pri monogastričnih živalih (prašiči, perutnina) ali encimov kot krmnih dodatkov. Iz celičnega izvlečka smo uspeli delno očistiti ksilanazi, veliki 44 kDa in 81 kDa in delno proučiti njuno encimsko delovanje. Primerjali smo tudi encimsko delovanje na celično površino vezanih ksilanaz s ksilanazami celičnega izvlečka. 44 kDa ksilanaza je eksoksilanaza brez ß-ksilozidazne aktivnosti, pri ksilanazi velikosti 81 kDa predvidevamo, da gre za endoksilanazo. Ksilanolitični encimi celične površine učinkovito razgrajujejo ksilan, vendar niso sposobni cepiti ksilobioze. Le-to razgradijo ksilanolitični encimi v notranjosti celice. Ključne besede: mikrobiologija / anaerobne bakterije / Pseudobutyrivibrio xylanivorans / ksilanaze / ksilan / vamp XYLAN DEGRADATION BY DIFFERENT XYLANASES OF RUMEN BACTERIUM Pseudobutyrivibrio xylanivorans Mz5T ABSTRACT The use of xylanases as feed additives for monogastric animals is very promising. Many experiments have proved their beneficial effect on animal health and performance. A new rumen bacterium species has recently been isolated: P. xylanivorans, type strain Mz5T, which has a very high xylanolytic activity. Some of its xylanolytic enzymes have already been described. We want to analyse the rest of them to find the reason for its high xylanolytic activity and to assess the possibilities of using this bacterium as a probiotic for monogastric animals (pigs, poultry) or its enzymes as feed additives. We have partially isolated two xylanases from the cell extract: 44 kDa and 81 kDa and examined their properties. We also compared enzyme activities of cell surface xylanases with xylanases in cell extract. The 44 kDa xylanase is an exoxylanase without ß-xylosidase activity. We assume that the 81 kDa xylanase is an endoxylanase. Xylanolytic enzymes on the cell surface are efficient xylan degraders, but they are unable to degrade xylobiose. Xylobiose is degraded by xylanolytic enzymes inside the cell. Key words: microbiology / anaerobic bacteria / Pseudobutyrivibrio xylanivorans / xylanases / xylan / rumen 142 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2. UVOD Rastlinojede živali so popolnoma odvisne od mikrobne razgradnje rastlinskih polisaharidov, saj nimajo lastnih encimov za razgradnjo le-teh (Hobson, 1997). V ta namen so se razvile številne prilagoditve prebavil, ki omogočajo mikrobno fermentacijo. Predželodčna fermentacija poleg izrabe kratkoverižnih maščobnih kislin in vitaminov rastlinojedim živalim omogoča tudi izrabo mikrobne biomase kot vir proteinov. Najbolj razvito obliko predželodčne fermentacije najdemo pri prežvekovalcih: razvil se je poseben del prebavil – vamp (Flint, 1997). Največji delež krme prežvekovalcev predstavljajo ogljikovi hidrati, najpogosteje celuloza, hemiceluloze, škrob in pektin, (Chesson in Forsberg, 1997). Poglavitna sestavina rastlinskih hemiceluloz so ksilani – za celulozo drugi najpogostejši obnovljivi polisaharidi v naravi (Biely, 1985). Struktura ksilanov je variabilna, od linearnih 1,4-ß glikozidno vezanih verig poliksiloze do močno razvejanih heteropolisaharidov, pri katerih se na osnovno verigo D-ksiloznih ostankov vežejo različne substituente (Biely, 1985). Substituente se lahko na ksilozne ostanke vežejo z glikozidnimi vezmi (L-arabinoza, glukuronska kislina ali 4-O-metil glukoronska kislina), z estrsko vezjo (ocetna kislina) ali z etrskimi vezmi prek L-arabinoze (ferulna kislina, p-kumarna kislina) (Puls in Poutanen, 1989; Kulkarni in sod., 1999). Ferulna in p-kumarna kislina lahko med dvema fenolnima kislinama tvorita mostič, kar je ključno za povezovanje ksilanskih verig med seboj (Malburg in sod., 1992). Ksilan trav in žitaric, ki predstavlja pomemben delež v krmi prežvekovalcev, je arabinoksilan. Njegov delež pri travah je 20-40 % snovi celične stene (Hespell in Whitehead, 1990). Zaradi zapletene sestave ksilana je za njegovo učinkovito razgradnjo potrebno sinergistično delovanje več različnih encimov. Ena od strategij mikroorganizma za razgradnjo tako heterogenega substrata je produkcija več oblik encimov s specializiranimi funkcijami. Multiple oblike ksilanaz (običajno tri do pet ksilanaz na mikroorganizem) so prisotne pri mnogih mikroorganizmih, tudi pri vampnih bakterijah (Wong in sod., 1988). Mikrobne encime, ki hidrolizirajo ksilan, delimo v dve skupini. Prva zajema encime, ki cepijo osnovno verigo ksilana, druga encime, ki odcepljajo stranske skupine. Te imenujemo tudi pomožni ksilanolitični encimi (Bajpai, 1997). Osnovno verigo ksilana cepijo endo-1,4-ß-ksilanaze, ß-ksilozidaze in eksoksilanaze. Endo-1,4-ß-ksilanaze katalizirajo hidrolizo 1,4-ß-D-glikozidnih vezi v glavni verigi ksilana (Hespell in Whitehead, 1990). ß-ksilozidaze hidrolizirajo krajše ksilooligosaharide, največkrat ksilobiozo do ksiloze (Bajpai, 1997). Eksoksilanaze odcepljajo ksilozilne ostanke od konca verige ksilooligomerov (Reilly, 1981). Mikrobne ksilanaze so na osnovi sorodnosti aminokislinskih zaporedij uvrščene v družini 10 in 11 glikozidnih hidrolaz. Ti dve skupini med seboj nista sorodni. Ksilanaze iz družine 10 so večje in kompleksnejše in hidrolizirajo tako ksilan, neredko tudi celulozo in ostale polisaharide. Ksilanaze iz družine 11 hidrolizirajo le ksilan. Ksilanaze obeh družin imajo ohranitveni mehanizem delovanja: glikozidno vez hidrolizirajo tako, da se konfiguracija anomernega atoma C1 ohrani (Davies in Henrissat, 1995). Mikrobni ksilanolitični encimi so že prodrli v marsikatero industrijsko panogo. Zelo obetavno področje uporabe je papirna industrija, kjer v postopku beljenja celulozne kaše ksilanaze lahko učinkovito nadomestijo toplotno obdelavo in kemijske oksidante za prekinitev vezi med celulozo in ligninom. V prehrambeni industriji uporabljajo ksilanaze skupaj s celulazami in pektinazami za bistrenje piva, mošta in sadnih sokov ter za utekočinjenje sadnih in zelenjavnih kaš (Kulkarni in sod., 1999, Beg in sod., 2001). Ksilanolitični mikroorganizmi (oz. encimi) bi lahko pripomogli k biokonverziji rastlinskih odpadkov v dostopnejše oligo- in monosaharide. Le-te bi lahko izkoristili kot substrat za namnoževanje industrijsko zanimivih mikroorganizmov (Vazquez in sod., 2000). V raziskovalne namene ksilanaze uporabljajo za odstranjevanje rastlinske celične stene pri pridobivanju protoplastov (Beg in sod., 2001). Čepeljnik, T. in sod. Razgradnja ksilana z različnimi ksilanazami … Pseudobutyrivibrio xylanivorans Mz5T. 143 Zelo obetavno je tudi področje uporabe ksilanaz kot krmnih dodatkov. Krmljenje živali z žiti zaradi prisotnosti hemiceluloznih sestavin pogosto vodi do povečane viskoznosti črevesne vsebine, kar zmanjšuje dostopnost hrane za prebavne encime, zmanjšuje možnost absorpcije prebavljene hrane ter omogoča nastanek primernega okolja za patogene mikroorganizme. To je predvsem težava neprežvekovalcev, saj nimajo indigene mikroflore, ki bi bila sposobna razgraditi vlaknine iz krme. Encimski krmni dodatki (pogosto tudi ksilanaze) lahko zmanjšajo zdravstvene težave (driska, ki je posledica naselitve patogenih mikroorganizmov) (Bedford, 2000). Omogočajo tudi boljšo izrabo krme z nizko hranilno vrednostjo in zmanjšujejo variacije v prirastu živali. Tako je kombinacija uporabe ksilanaze in fitaze pri brojlerjih privedla do hitrejše izpostavitve fitata hidrolizi in s tem povečala prirast (Bedford, 2000). Dodatek ksilanaz in ß-glukanaz v rženo krmo brojlerjev je prav tako zmanjšal viskoznost črevesne vsebine in povečal povprečen dnevni prirast živali (Lázaro in sod., 2004). Tudi dodatek ksilanaz v krmo rac, ki je vsebovala velik delež vlaknin, je znatno izboljšal energetsko izrabo krme (Adeola in Bedford, 2004). Dodajanje fibrolitičnih encimov pa ima ugodne učinke tudi pri prežvekovalcih. Dodatek fibrolitičnih encimov (celulaze, ksilanaze) v krmo krav mlekaric je povečal število vampnih bakterij, ki razgrajujejo hemiceluloze in sekundarne produkte razgradnje celuloze (Nsereko in sod., 2002). MATERIAL IN METODE Priprava encimskih vzorcev 44 kDa in 81 kDa ksilanaze 44 kDa ksilanazo in celični izvleček smo pripravili kot smo predhodno opisali (Čepeljnik in sod., 2002). 81 kDa ksilanazo smo očistili po sledečem postopku: bakterijo Pseudobutyrivibrio xylanivorans Mz5T smo gojili pri 37 °C v anaerobnih razmerah v 700 ml delno spremenjenega gojišča M330 (DSM Catalogue of strains, medium 330). Glukozo, maltozo, celobiozo in topni škrob smo nadomestili s ksilanom ovsenih plev v koncentraciji 5 g/l. Po 48 urah gojenja smo celice ločili od gojišča s centrifugiranjem pri 4 °C, 4000 × g, 15 minut. Bakterijske celice smo dvakrat sprali v 50 mM natrij fosfatnem pufru, pH = 6,5 (NaFP). Nato smo pelet resuspendirali v 70 ml bidestilirane vode, ga dvakrat zamrznili (–20 °C) in odmrznili ter nazadnje izpostavili ultrazvoku v ultrazvočni kopeli za 10 minut. Po centrifugiranju (4 °C, 12500 × g, 30 minut) smo pelet zavrgli. Iz supernatanta (celični izvleček) smo z dodajanjem amonijevega sulfata (AS) postopno oborili proteine. Tiste, ki so se oborili med 40- in 60-odstotno nasičenostjo, smo ponovno raztopili v NaFP in razsolili z dializo. Tako pripravljen vzorec smo nanesli na uravnoteženo kolono CIM® DEAE-8 (BIA Separations, Slovenija), ki omogoča ločevanje proteinov glede na njihov naboj. Vezane proteine smo nato spirali z linearno naraščajočo koncentracijo NaCl od 0 do 1 M v 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 v 50 ml pri pretoku 4 ml/min. Sprane proteine smo zbirali v frakcijah po 1,5 ml. S presejalnim testom (Marinšek Logar, 1999) smo določili pet ksilanolitično aktivnih frakcij, jih združili in jih razsolili z dializo. Celoten razsoljen vzorec (7,5 ml) smo ponovno nanesli na predhodno uravnoteženo kolono CIM® DEAE-8 in ponovili kromatografijo pri istih pogojih, le da je ta pufer imel pH 6,8. Vzorec površinskih proteinov smo pripravili po rahlo spremenjenem postopku, kot so ga opisali Rincón in sod. (2004). Po 24 urah gojenja smo celice s centrifugiranjem pri 4 °C, 10000 × g, 15 minut, ločili od gojišča. Pelet smo dvakrat sprali v 25 mM pufru Tris-HCl, pH 7,0 s 150 mM NaCl in ga nato resuspendirali v 35 ml 25 mM Tris-HCl, pH 7,0, 150 mM NaCl, 2 % (m/v) N-lauril sarkozin, 1 mM PMSF (fenilmetansulfonil fluorid) in mešanico eno uro inkubirali na ledu, jo na hitro premešali in centrifugirali pri 4 °C, 10000 × g, 15 minut in nato še 30 minut pri 12500 × g . Supernatant je predstavljal pripravek površinskih proteinov. Pred analizo vzorca 144 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2. z NaDS-PAGE (poliakrilamidna gelska elektroforeza z natrijevim dodecilsulfatom) smo del pripravka skoncentrirali z ultrafiltracijo. Uporabili smo mikrocentrifugirke (Vivascience, VS0101) z vgrajenim ultrafiltrom z velikostjo por 10 kDa in centrifugirali 5 minut pri 12000 × g in 4 °C. Koncentriran vzorec smo uporabili za encimogram, nekoncentriranega za barvanje proteinov s koloidnim srebrom. Encimski testi Encimsko aktivnost izolirane ksilanaze smo določili z metodo redukcijskih sladkorjev (Lever, 1977) in jo izrazili kot nkat/mg (količina sproščenih redukcijskih koncev na sekundo in mg proteinov. Osnovni test je bil izveden v NaFP, pri 37 °C in ksilanom ovsenih plev (1 % (m/v)) kot substratom. Za določanje pH optimuma smo vzorce inkubirali s substratom v 50 mM NaFP (pH 4,08; 4,59; 5,07; 5,53; 6,04; 6,53; 6,92) ali pa v 20 mM TRIS pufrih (pH 7,09; 7,28; 7,44; 7,5; 8,0; 8,54; 9,0). Za določanje temperaturnega optimuma smo vzorce inkubirali s substratom pri temperaturah 8 °C, 26 °C, 30 °C, 37 °C, 39 °C, 42 °C, 55 °C, 65 °C in 75 °C. Ostale razmere so ostale nespremenjene. Vse encimske teste smo naredili v štirih ponovitvah. Sledenje produktov encimskega delovanja Vzorce encimov smo inkubirali 24 ur s substratom (1 % (m/v) ksilanom ovsenih plev, ksilobiozo, ksilotriozo, ksilotetraozo oz. ksilopentaozo). Po 20 µl vzorcev smo nanesli na stekleno ploščo, ki je bila prekrita s silikagelom (Merck) in razgradne produkte ločili s tankoplastno kromatografijo (Christov in sod., 2000). Ksilanogrami Proteine smo ločili z denaturirajočo elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecil sulfata v reducirajočih razmerah (Laemmli, 1970) na 10 % (m/v) poliakrilamidnih gelih, v katere smo predhodno vključili ksilan ovsenih plev. Kot proteine znanih molekulskih mas (MW) smo uporabili Protein Ladder 10–200 kDa (Fermentas #SM0661). Aktivne ksilanaze smo vizualizirali po renaturacji elektroforetskih gelov, inkubaciji 4 ure pri 37 °C in barvanju z barvilom kongo rdeče (Wood, 1980). Kadar smo želeli zaznati vse prisotne proteine, gelov nismo razvili kot ksilanogram, temveč smo jih pobarvali s koloidnim srebrom (Merril in sod., 1981). REZULTATI IN RAZPRAVA Bakterija Pseudobutyrivibrio xylanivorans Mz5T ima vsaj 7 elektroforetsko različnih ksilanaz, ki ta sev uvrščajo med najaktivnejše bakterijske razgrajevalce ksilana v vampu (Marinšek-Logar in sod., 2000). Namen naše raziskave je bil proučiti delovanje posamičnih encimov. Zato smo se lotili izolacije posamičnih ksilanaz. 44 kDa encim smo predhodno opisali (Čepeljnik in sod. 2002) kot 50 kDa ksilanazo, vendar smo tokrat uporabili standardno mešanico več proteinov z znanimi molekulskimi masami in tako točneje izračunali novo MW. Izolacijo pa smo ponovili po istem postopku. Izolirani ksilanazi smo določili tudi optimalno temperaturno in pH območje delovanja. Največjo aktivnost (100 %) smo izmerili pri temperaturi 37 °C. V območju med 30 °C in 42 °C kaže več kot 80-odstotno aktivnost, že pri 26 °C pa je aktivnost le še 60-odstotna. Pri nižjih temperaturah (8 °C) je aktivnost okoli 20-odstotna in pri 55 °C okoli 10-odstotna. Pri 85 °C ksilanaza skoraj popolnoma izgubi aktivnost (0,7 %). Pri določanju optimalnega pH smo največjo aktivnost 44 kDa ksilanaze izmerili pri pH 6,04 (= 100 %), pri pH 6,53 je aktivnost 99-odstotna. Med pH 5,53 in 7,09 je aktivnost okoli 80- Čepeljnik, T. in sod. Razgradnja ksilana z različnimi ksilanazami … Pseudobutyrivibrio xylanivorans Mz5T. 145 odstotna in v območju med pH 5,07 in 7,80 več kot 60-odstotna. Pri pH vrednostih manj od 5,07 in nad 8,50 aktivnost močno upade. Pri pH 4,59 zaznamo 30 % aktivnost in pri pH 4,08 le še 2 % aktivnost. Pri pH 8,50 je aktivnost 30 %, pri pH 9,00 pa le še okoli 5-odstotna. Izolacije novih ksilanaz smo se lotili s postopnim obarjanjem proteinov iz celičnega izvlečka 48-urne kulture. Pri 20-odstotni nasičenosti z AS smo iz celičnega izvlečka 48-urne kulture oborili velik del proteinov, vključno z večino ksilanaz. V naslednji stopnji, od 20 do 40 % nasičenosti, je bilo prisotnih mnogo manj proteinov in le ena ksilanaza (44 kDa). Obarjanje smo nadaljevali do 60 % nasičenosti in skupaj z vsaj 5 ksilanazami (120 kDa, 100 kDa, 81 kDa, 44 kDa in 30 kDa) ponovno oborili precejšen del proteinov. Pri 80 % nasičenosti je bilo ponovno prisotnih manj proteinov in dve ksilanazi: že opisana ksilanaza velikosti 30 kDa (Čepeljnik in sod., 2004) in 44 kDa ksilanaza (slika 1). ST 2 3 4 5 6 7 8 Slika 1. NaDS-PAGE analiza oborjenih proteinov iz celičnega izvlečka pri različnih stopnjah nasičenosti z AS. V žepke koncentrirnega NaDS-PAGE gela smo nanesli po 50 µl vzorcev. Po elektroforezi smo polovico 10 % ločevalnega gela pobarvali s koloidnim srebrom, drugo polovico pa smo razvili kot encimogram. Na progi ST so ločeni proteinski standardi z označenimi MW, na progi 5 proteini, ki so se oborili pri 20 % nasičenosti z AS. Sledijo proteini, oborjeni med 20-40 % nasičenostjo (progi 2 in 6), 40-60 % nasičenostjo (progi 3 in 7) in 60-80 % nasičenostjo (progi 4 in 8). S puščico na desni strani je označeno mesto na gelu, ki ustreza potovanju proteina z molekulsko maso 44 kDa. Proteine, ki so se oborili med 40- in 60-odstotno nasičenostjo, smo ponovno raztopili v Na-fosfatnem pufru in razsolili z dializo. Razsoljen vzorec smo nanesli na kolono z nosilcem za šibko anionsko izmenjavo (CIM® DEAE-8) in vezane proteine spirali z naraščajočo koncentracijo NaCl v elucijskem pufru s pH vrednostjo 7,5 (slika 2). Preverili smo prisotnost ksilanolitične aktivnosti v zbranih frakcijah in proteine v najaktivnejših vzorcih ločili z elektroforezo. Barvanje s koloidnim srebrom je pokazalo, da je v frakcijah prisotnih mnogo različnih proteinov, na encimogramu pa smo ugotovili, da so v ksilanolitično aktivnih frakcijah prisotne močno aktivna ksilanaza velikosti 81 kDa in dve zelo šibko aktivni ksilanazi (100 kDa, 120 kDa) (slika 3). Pet ksilanolitično aktivnih frakcij, od tiste nanešene na progi 9 pa do vključno tiste s proge 10 (slika 3), smo združili in jih razsolili z dializo. Celoten razsoljen vzorec (7,5 ml) smo ponovno nanesli na kolono CIM® DEAE-8. Ker so se ksilanolitični encimi v prvi kromatografiji razmeroma pozno sprali s kolone (med 70 in 80 % elucijskega pufra, kar pomeni med 0,7 M in 0,8 M NaCl), smo predvidevali, da so v takih razmerah ti proteini močno nabiti in se zato močno vežejo na nosilec. Glede na te rezultate smo predvidevali, da imajo izoelektrične točke v kislem območju pH. Zato smo v nadaljevanju izbrali elucijski pufer z nižjo pH vrednostjo, to je 6,8. 146 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2. Pričakovali smo, da se bomo tako v naslednjem koraku znebili več ostalih neksilanolitičnih proteinov. Ponovili smo kromatografijo (slika 4) in ksilanolitične frakcije ponovno proučili na encimogramih (slika 5). Slika 2. Ločevanje proteinov s tekočinsko kromatografijo na koloni z nosilcem za šibko anionsko izmenjavo (CIM® DEAE-8). Na kolono smo nanesli 6 ml vzorca oborjenih proteinov iz celičnega izvlečka in nevezane proteine sprali s 50 ml pufra A (20 mM Tris, pH 7,5). Vezane proteine smo postopno spirali z naraščajočim gradientom od 0 % do 100 % pufra B v 50 ml pri pretoku 4 ml/min (debelejša črta). Koncentracijo spranih proteinov v frakcijah po 1,5 ml smo sledili z merjenjem absorbance pri 280 nm (tanjša črta). Puščici označujeta območje, v katerem smo na ksilanogramu zaznali ksilanolitično aktivnost (slika 3). A ST 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B 11 2a 3a 4a 5a 6a 7a 8a 9a 10a 200 kDa ! 100 kDa ! 50 kDa -» 40 kDa -» 30 kDa -» <-81 kDa Slika 3. NaDS-PAGE analiza vzorcev po prvem ločevanju oborjenih proteinov na koloni z nosilcem za šibko anionsko izmenjavo (CIM® DEAE-8). V žepke koncentrirnega NaDS-PAGE gela smo nanesli po 50 µl vzorcev. Po elektroforezi smo en 10 % ločevalni gel pobarvali s koloidnim srebrom (A) ter drugega razvili kot encimogram (B). Proga ST: proteinski standardi z označenimi MW; Proga 11: proteini, oborjeni v območju med 40 in 60 % nasičenosti z AS; proge 9,10 in 9a,10a: encimsko aktivni frakciji iz tekočinske kromatografije, proge 2-8 in 2a-8a: encimsko neaktivne ali slabo aktivne frakcije iz tekočinske kromatografije. S puščico na desni strani je označeno mesto na gelu, ki ustreza potovanju proteina z molekulsko maso 81 kDa. Tokrat je bila ksilanolitična aktivnost v zbranih frakcijah veliko manjša, na encimogramu pa smo uspeli vizualizirati le eno ksilanazo z molekulsko maso 81 kDa. Na proteinskih gelih smo poleg ksilanaze zaznali še več drugih, neidentificiranih proteinov, ki pa niso razgrajevali ksilana (ena sama lisa na progi 1a, slika 5). Kljub temu je prisotnih precej manj ostalih proteinskih lis v primerjavi s prvo stopnjo čiščenja (proga 9, slika 3). Postopek izolacije bi lahko nadaljevali s kromatografijo na drugih nosilcih ali izbiro drugačnih pufrov, vendar smo opazili, da so Čepeljnik, T. in sod. Razgradnja ksilana z različnimi ksilanazami … Pseudobutyrivibrio xylanivorans Mz5T. 147 kvalitativno vidni izkoristki vedno manjši in je zaznana ksilanolitična aktivnost v gelih vedno šibkejša. Zato smo se zadovoljili z delno očiščenim encimskim pripravkom, ki smo ga uporabili za proučevanje cepitve ksilana z 81 kDa ksilanazo. Slika 4. Nadaljevanje ločevanja proteinov s tekočinsko kromatografijo na koloni z nosilcem za šibko anionsko izmenjavo (CIM® DEAE-8). Na kolono smo nanesli 7,5 ml vzorca razsoljenih združenih frakcij iz predhodne kromatografije. Nevezane proteine smo sprali s 50 ml pufra A (20 mM Tris, pH 6,8). Vezane proteine smo postopno spirali z naraščajočim gradientom od 0 % do 100 % pufra B v 50 ml pri pretoku 4 ml/min (debelejša črta na grafikonu). Koncentracijo spranih proteinov v frakcijah po 1,5 ml smo sledili z merjenjem absorbance pri 280 nm (tanjša črta na grafikonu). Puščica označuje frakcijo, pri kateri smo na encimogramu zaznali ksilanolitično aktivnost. ST 1 1a 200 kDa ^ 1 V 100 kDa ^ 1 F — ;= M — 50 kDa ^ | - 40 kDa -» - '• 30 kDa -» ^ J~~ /¦— " J~- fe » _; <- 81 kDa Slika 5. NaDS-PAGE analiza vzorcev po drugem ločevanju na koloni z nosilcem za šibko anionsko izmenjavo (CIM® DEAE-8). V žepke koncentrirnega NaDS-PAGE gela smo nanesli po 50 µl vzorcev frakcij iz tekočinske kromatografije (slika 4). Po elektroforezi smo polovico 10 % ločevalnega gela pobarvali s koloidnim srebrom in drugo polovico razvili kot encimogram. Proga ST: proteinski standardi; progi 1 in 1a: le pri eni frakciji smo zaznali ksilanolitično aktivnost (1a), v njej je še vedno prisotnih precej različnih proteinov (1). Ostale proge: encimske aktivnosti v ostalih frakcijah nismo zaznali. S puščico na desni strani je označeno mesto na gelu, ki ustreza potovanju proteina z molekulsko maso 81 kDa. Pripravek površinskih proteinov, pripravljen po postopku, ki so ga opisali Rincon in sod. (2004), iz 24-urne kulture P. xylanivorans Mz5T, je na ksilanogramu pokazal enak vzorec ksilanolitičnih encimov, kot je to običajno za pripravek vseh celičnih proteinov (slika 6). Vse tri vzorce encimskih pripravkov smo uporabili za študij razgradnje ksilana in ksilooligosaharidov. Razgradne produkte smo ločili s tankoplastno kromatografijo (sliki 7 in 8). 148 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2. A ST SIL B ENC 200 kDa ! 100 kDa ! 50 kDa ! 40 kDa ! 30 kDa ! Slika 6. NaDS-PAGE analiza pripravka površinskih proteinov. V žepke koncentrirnega NaDS-PAGE gela smo nanesli po 50 µl vzorcev. Po elektroforezi smo en 10 % ločevalni gel pobarvali s koloidnim srebrom (A) ter drugega razvili kot encimogram (B). Proga ST: proteinski standardi z označenimi MW. Proga SIL: pripravek površinskih proteinov, barvano s koloidnim srebrom. Proga ENC: pripravek površinskih proteinov - encimogram. Izolirana 44 kDa ksilanaza je učinkovito cepila ksilan ovsenih plev vse do najmanjših gradnikov (proga 5, slika 7). Sposobna je bila cepiti tudi ksilotri-, -tetra- (progi 3 in 4, slika 8) in -pentaozo (proga 4, slika 7) do ksilobioze in ksiloze, ne pa tudi ksilobioze do ksiloze (proga 3, slika 7). Glede na te rezultate sklepamo, da prepozna zaporedje vsaj treh zaporednih ksiloz, ki se prilega aktivnemu mestu tega encima, in zaporedoma od substrata odceplja ksilobiozne enote, gre torej za eksoksilanazo brez ß-ksilozidazne aktivnosti. Encimi s podobnim delovanjem imajo ponavadi aktivno mesto oblikovano kot žep (Davies in Henrissat, 1995). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 xyl xyl5 Slika 7. Analiza produktov razgradnje ksilana s ksilanazama (44 kDa, 81 kDa), površinskimi proteini in celičnim izvlečkom. Vzorce smo s substratom inkubirali v razmerju 1 : 1 (v/v) preko noči pri temperaturi 37 °C. Razgradne produkte smo naslednji dan ločili s tankoplastno kromatografijo. Na progi 1 in 2 smo nanesli mono- in oligosaharidne standarde (proga 1: ksiloza, ksilotrioza in ksilopentaoza; proga 2: ksilobioza, ksilotetraoza). Na proge 3-5 smo nanesli razgradne produkte, ki so bili posledica hidrolize z izolirano 44 kDa ksilanazo: vzorci, inkubirani s ksilobiozo (proga 3), ksilopentaozo (proga 4) in topnim ksilanom ovsenih plev (proga 5). Na proge 5-8 smo nanesli razgradne produkte, ki so bili posledica hidrolize z delno izolirano 81 kDa ksilanazo: vzorci, inkubirani s ksilobiozo (proga 6), ksilopentaozo (proga 7) in topnim ksilanom ovsenih plev (proga 8). Na progah 9-11 so nanešeni razgradni produkti, ki so bili posledica hidrolize s ksilanolitičnimi encimi s celične površine (površinski proteini): vzorci, inkubirani s ksilobiozo (proga 9), ksilopentaozo (proga 10) in topnim ksilanom ovsenih plev (proga 11). Na zadnjo progo smo nanesli razgradne produkte, ki so bili posledica hidrolize ksilobioze s celičnim izvlečkom (proga 12). Čepeljnik, T. in sod. Razgradnja ksilana z različnimi ksilanazami … Pseudobutyrivibrio xylanivorans Mz5T. 149 1 2 3 4 5 6 xyl xyk xyl3 l • xyl4 xyl5 Slika 8. Analiza produktov razgradnje ksilooligosaharidov s 44 kDa ksilanazo in površinskimi proteini. Vzorce smo s substratom inkubirali v razmerju 1 : 1 (v/v) preko noči pri temperaturi 37 °C. Razgradne produkte smo naslednji dan ločili s tankoplastno kromatografijo. Na progi 1 in 2 smo nanesli mono- in oligosaharidne standarde (proga 1: ksiloza, ksilotrioza in ksilopentaoza; proga 2: ksilobioza, ksilotetraoza). Na progi 3 in 4 smo nanesli razgradne produkte, ki so bili posledica hidrolize s 44 kDa ksilanazo: vzorci, inkubirani s ksilotriozo (proga 3) in ksilotetraozo (proga 4). Na progi 5 in 6 smo nanesli razgradne produkte, ki so bili posledica hidrolize s ksilanolitičnimi encimi celične površine (površinski proteini): vzorci, inkubirani s ksilotriozo (proga 5), ksilotetraozo (proga 6). Delno izolirana 81 kDa ksilanaza je razgrajevala ksilan ovsenih plev le do večjih ksilooligosaharidov, največ do ksilopentaoz (proga 8, slika 7). Prav tako ni uspela cepiti ne ksilobioze ne ksilopentaoze (progi 6 in 7, slika 7). Predvidevamo, da je ta encim endoksilanaza, ki za razpoznavo substrata potrebuje daljše verige oligosaharidov. Pri podobnih encimih je aktivno mesto oblikovano kot reža (Davies in Henrissat, 1995). Med proteini, ki so vezani na celično površino, je tudi več ksilanaz, ki učinkovito razgrajujejo ksilan, kot tudi ksilotri-, -tetra- (progi 5 in 6, slika 8) in -pentaozo (proga 10, slika 7) do manjših gradnikov. Prav tako ti encimi ne morejo razgraditi ksilobioze do ksiloze (proga 9, slika 7). Tako aktivnost smo zaznali v celičnem izvlečku, kjer je bila očitno prisotna tudi ß-ksilozidaza, ki je lahko katalizirala gornjo reakcijo (proga 12 , slika 7). Predhodne raziskave in v tem delu opisani rezultati predpostavljajo naslednji mehanizem razgradnje ksilana pri vampni bakteriji P. xylanivorans Mz5T: - dve ksilanazi (145 kDa in 44 kDa) se izražata stalno (konstitutivno) in, če je prisoten ksilan, začneta z njegovo razgradnjo: večji encim je aktivnejši, kot smo to lahko opazili na ksilanogramu (Zorec in sod., 2000), - razgradni produkti močno inducirajo izražanje tudi drugih ksilanaz (Zorec in sod., 2000), ki se vse prenesejo skozi celično membrano in steno ter imajo tako dostop do zelo zapletene, velike molekule substrata ksilana, - ksilan nato načnejo encimi, ki cepijo substrat znotraj verige: to so XynT (Čepeljnik in sod., 2004), 81 kDa ksilanaza in njim podobni encimi, ki tvorijo večje ksilooligosaharide, - nato te krajše substrate cepijo 44 kDa ksilanaza in njej podobni encimi, rezultat njihovega delovanja so oligosaharidi ksiloza in predvsem ksilobioza, ki se prenesejo v notranjost bakterijske celice, - tam pa nastopijo ß-ksilozidaze, ki razgradijo gornji substrat do monomerov. To je ksiloza, ki jo bakterija lahko uporabi kot vir energije in ogljika po Embden-Meyerhofovi glikolizi, ali pa v kombinaciji s potjo pentoze fosfata, kot so ugotovili za sev CE 51 (Marounek in Petr, 1995). Zadnji način je manj verjeten, glede na enako učinkovito uporabo tako različnih heksoz kot tudi pentoz (Zorec, 2002). 150 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2. SKLEPI 44 kDa ksilanaza kaže lastnosti eksoksilanaze brez ß-ksilozidazne aktivnosti, pri ksilanazi velikosti 81 kDa pa predvidevamo, da gre za endoksilanazo. Primerjava encimskega delovanja ksilanaz s celične površine s ksilanazami celičnega izvlečka je pokazala, da površinski proteini nimajo ß-ksilozidazne aktivnosti. Na osnovi dobljenih rezultatov in rezultatov predhodnih raziskav smo predpostavili mehanizem razgradnje ksilana vampne bakterije P. xylanivorans Mz5T: dve ksilanazi se konstitutivno izražata in ob prisotnosti ksilana razgradni produkti močno inducirajo izražanje tudi drugih ksilanaz. Razgradnjo začnejo ksilanaze, ki cepijo substrat znotraj verige (XynT, 81 kDa ksilanaza in njim podobni encimi, ki tvorijo večje ksilooligosaharide), nato krajše substrate cepijo 44 kDa ksilanaza in njej podobni encimi, rezultat njihovega delovanja so ksiloza in predvsem ksilobioza, ki se prenese v notranjost bakterijske celice. Tam pa nastopijo ß-ksilozidaze, ki razgradijo dimerni substrat do monomera, to je ksiloza, ki jo bakterija lahko uporabi kot vir energije in ogljika. SUMMARY 44 kDa xylanase seems to be an exoxylanase without ß-xylosidase activity. We assume that the 81 kDa xylanase is an endoxylanase. The comparisson of cell surface and cell extract enzyme activities showed that surface proteins have no ß-xylosidase activity. Based on these results and prior research work the possible mechanism of P. xylanivorans Mz5T xylan degradation is: two xylanases are constitutive and in the presence of xylan the products of degradation strongly induce expression of other xylanases. Degradation is started by enzymes that act as endo enzymes (XynT, 81 kDa xylanase and similar enzymes that produce larger xylooligosaccharides), than shorter substrates are degraded by 44 kDa xylanase and similar enzymes. The result is xylose and, in the first place, xylobiose, that is transfered inside the cell. ß-xyilosidases inside the cell degrade dimers to monomers – xylose, which can be used as energy and carbon source. VIRI Adeola, O./ Bedford, M.R. Exogenous dietary xylanase ameliorates viscosity-induced anti-nutritional effects in wheat-based diets for White Pekin ducks (Anas platyrinchos domesticus). British Journal of Nutrition, 92(2004), 87–94. Bajpai, P. Microbial xylanolytic enzyme system: Properties and applications. Advances in Applied Microbiology, 43(1997), 141–194. Bedford, M.R. Exogenous enzymes in monogastric nutrition – their current value and future benefits. Animal Feed Science and Technology, 86(2000), 1–13. Beg, Q.K./ Kapoor, M./ Mahajan, L./ Hoondal, G.S. Microbial xylanases and their industrial applications: a review. Applied Microbiology and Biotechnology, 56(2001), 326–338. Biely, P. Microbial xylanolytic systems. Trends in biotechnology, 3(1985)11, 286–290. Chesson, A./ Forsberg, C.W. Polysaccharide degradation by rumen microorganisms. V: The rumen microbial ecosystem (Eds.: Hobson, P.N./ Stewart, C.S.). London, Thomas Science, 1997, 329–381. Christov, L./ Biely, P./ Kalogeris, E./ Christakopoulos, P./ Prior, B.A./ Bhat, M.K. Effects of purified endo-ß-1,4-xylanases of family 10 and 11 and acetyl xylan esterases on eucalypt sulfite dissolving pulp. Journal of Biotechnology, 83(2000), 231–244. Čepeljnik, T./ Zorec, M./ Nekrep, F.V./ Marinšek-Logar, R. Isolation of endoxylanases from anaerobic bacterium Butyrivibrio sp. Mz5 is possible by anion exchange chromatography on CIM® DEAE-8 monolythic column. Acta Chimica Slovenica, 49(2002), 401–408. Čepeljnik, T./ Križaj, I./ Marinšek-Logar, R. Isolation and characterization of the Pseudobutyrivibrio xylanivorans Mz5T xylanase XynT––the first family 11 endoxylanase from rumen Butyrivibrio-related bacteria. Enzyme Microb. Technol., 34(2004), 219–227. Davies, G./ Henrissat, B. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure, 3(1995), 853–859. Čepeljnik, T. in sod. Razgradnja ksilana z različnimi ksilanazami … Pseudobutyrivibrio xylanivorans Mz5T. 151 DSM Catalogue of strains. Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Nemčija, 1993, http://www.dsmz.de/media/med330.htm (1. sept. 2004). Flint, H.J. The rumen microbial ecosystem - some recent developments. Trends in Microbiology, 5(1997)12, 483-488. Hespell, R.B./ Whitehead, T.R. Physiology and genetics of xylan degradation by gastrointestinal tract bacteria. Journal of Dairy Science, 73(1990), 3013-3022. Hobson, P.N. Introduction. V: The rumen microbial ecosystem (Eds.: Hobson, P.N./ Stewart, CS.). London, Thomas Science, 1997, 1-9. Kulkarni, N./ Shendye, A./ Rao, M. Molecular and biotechnological aspects of xylanases. FEMS Microbiology Reviews, 23(1999), 411-456. Lázaro, R./ Latorre, M.A./ Medel, P./ Gracia, M./ Mateos, G.G. Feeding regimen and enzyme supplementation to rye-based diets for broilers. Poultry Science, 83(2004), 152-160. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227(1970), 680-685. Lever, M. Carbohydrate determination with 4-hydroxybenzoic acid hydrazide (P AHB AH): Effect of bismuth on the reaction. Analytical Biochemistry, 81(1977), 21-27. Malburg, L.M./ Lee, J.M./ Forsberg, C. Degradation of cellulose and hemicelluloses by rumen microorganisms. V: Microbial degradation of natural products (Ed.: Winkelmann G.). Weinheim, VCH, 1992, 126-156. Marinšek-Logar, R. Opis ksilanolitičnega encimskega sistema vampne bakterije Prevotella bryantii B14. Doktorska disertacija. Ljubljana, Biotehniška fak., 1999, 120 str. Marinšek-Logar, R./ Zorec, M./ Nekrep, F.V. Isolation and characterisation of Butyrivibrio-like rumen bacteria posessing high xylanolytic activity. Reprod. Nutr. Dev., 40(2000), 191-192. Marounek, M./ Petr, O. Fermentation of glucose and xylose in ruminal strains of Butyrivibrio fibrisolvens. Lett. Appl. Microbiol., 21(1995)4, 272-276. Merril, C.R./ Goldman, D./ Sedman, S./ Ebert, H. Ultrasensitive stain for proteins in poly-acrylamide gels show regional variation in cerebrospinal fluid proteins. Science, 211(1981), 1437-1438. Nsereko, V.L./ Beauchemin, K.A./ Morgavi, D.P./ Rode, L.M./ Furtado, A.F./ McAllister, T.A./ Iwaasa, T.A./ Yang, W.Z./ Wang, Y. Effect of a fibrolytic enzyme preparation from Trichoderma longibrachiatum on the rumen microbial population of dairy cows. Can. J. Microbiol., 48(2002), 14-20. Puls, J./ Poutanen, K. Mechanisms of enzymatic hydrolysis of hemicelluloses (xylans) and procedures for determination of the enzyme activities involved. V: Enzyme systems for lignocellulose degradation (Ed.: Coughlan, M.P.). London, Elsevier Applied Science, 1989, 151-165. Reilly, P.J. Xylanases: structure and function. Basic Life Science, 18(1981), 111-129. Rincon, M.T./ Martin, J.C./ Aurilia, V./ McCrae, S.I./ Rucklidge, G.J./ Reid, M.D./ Bayer, E.A./ Lamed, R./ Flint, H.J. ScaC, an adaptor protein carrying a novel cohesin that expands the dockerin-binding repertoire of the Ruminococcus flavefaciens 17 cellulosome. Journal of Bacteriology, 186(2004)9, 2576-2585. Vazquez, M.J./ Alonso, J.L./ Dominguez, H./ Parajo, J.C. Xylooligosaccharides: manufacture and applications. Trends Food Sci. Technol., 11(2000), 387-393. Wong, K.K.Y./ Tan, L.U.L./ Saddler, J.N. Multiplicity of ß-1,4-xylanase in microorganisms: Functions and applications. Microbiological Reviews, 52(1988)3, 305-317. Wood, P.J. Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides. Carbohydrate Research, 85(1980), 271-287. Zorec, M./ Marinšek-Logar, R./ Čepeljnik, T./ Nekrep, F.V. The influence of substrate concentration and growth phase on expression of Butyrivibrio sp. Mz5 endoxylanases. Zb. Bioteh. Fak. Univ. Ljublj., Kmet. Zooteh., 76(2000)2, 199-206. Zorec, M. Izolacija vampne bakterije z močno ksilanolitično aktivnostjo in opis njenega encimskega sistema za razgradnjo ksilana. Magistrska naloga. Ljubljana, Medicinska fak., 2002, 79 str. Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2, 153-159. http://www.bf.uni-lj.si/aas Agris category codes: Q01, Q04 COBISS Code 1.01 DISTRIBUTION OF TISSUES IN THE CARCASS OF TUROPOLJE PIG, AN AUTOCHTONOUS CROATIAN BREED Marija ĐIKIĆ a), Krešimir SALAJPAL b), Danijel KAROLYI c), Ivan JURIĆ a) and Vlatko RUPIĆ a) a) Univ. of Zagreb, Fac. of Agriculture, Dept. of Animal Science, Svetošimunska c. 25, HR-10000 Zagreb, Croatia, Prof., Ph.D., M.Sc. b) Same address. c) Same address: M.Sc. Received September 01, 2004, accepted December 10, 2004. Delo je prispelo 01. septembra 2004, sprejeto 10. decembra 2004. ABSTRACT Carcass composition and distribution of tissues in the carcass of Turopolje pig were established by analysing the share of muscle (M), fat (F) and bone (B) tissue in the carcass and each of this tissues from parts leg, shoulder, loin, neck and belly-rib part (BRP) in the carcass as well as the same tissue in the parts. Investigation was caried out in two groups of fattened pigs at different age and live weight at slaughtering (TI n = 10, age 584 ± 20 days and 81.9 kg ± 6.1 kg; TII n = 9, age 679 ± 20 days and 100.3 kg ± 4.9 kg). Pigs were fattened in the outdoor system of flood forests and marsh meadows biocenosis (Quercus robur and Deschampsietum caespitosae) according to traditional Croatian technology of low input feed (0.5 kg/day/animal). On the slaughter line the animals and carcasses were separetly weighted and cut according to Weniger method and by total dissection. In the groups TI and TII the percentages of muscle (38.2% and 40.5%, respectively) and bone tissue (10.6% and 9.7%, respectively) were significantly different in the carcass, while the share of fat (34.2% and 33.8%, respectively) was not significantly different. In the groups TI and TII the distribution of muscle, fat and bone tissue in the body parts leg, shoulder, loin, neck and belly-rib part (BRP) were estimated. Key words: pigs / autochthonous breeds / Turopolje pig / carcass / muscles / fat / bones / Croatia PORAZDELIZEV TKIV V KLAVNIH TRUPIH AUTOHTONE HRVAŠKE PASME TUROPOLJSKI PRAŠIČ IZVLEČEK Sestavo klavnih trupov in porazdelitev tkiv v klavnih trupih turopoljskega prašiča smo določili z analizo deleža mišičnega, maščobnega in kostnega tkiva v klavnih trupih in v delih noge, pleča, ledja, vrat in trebuh. Raziskavo smo opravili v dveh skupinah pitancev pri dveh različnih starostih in telesnih masah ob klanju (TI n = 10, starost 584 ± 20 dni in 81.9 kg ± 6.1 kg; TII n = 9, starost 679 ± 20 dni in 100.3 kg ± 4.9 kg). Prašiče smo pitali po klasični tehnologiji, ki vključuje pašo v gozdovih in na travnikih, ki ju označujeta biocenozi Quercus robur in Deschampsietum caespitose ob nizki porabi krme (0.5 kg/dan/žival). Na liniji klanja so bile živali posamično stehtane in razkosane po metodi popolne disekcije po Wenigerju. Skupini TI in TII sta se statistično značilno razlikovali po odstotku mišičnega tkiva (38.2 % in 40.5 %) in kosti v trupih (10.6% in 9.7%), medtem ko razlike v deležu maščobe niso bile statistično značilne (34.2 % in 33.8 %). V obeh skupinah smo določili tudi deleže mišičnega, maščobnega in kostnega tkiva v telesnih delih: noge, pleča, ledja, vrat in trebuh. Ključne besede: prašiči / avtohtone pasme / turopoljski prašič / klavne polovice / mišice / maščoba / kosti / Hrvaška 154 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2. INTRODUCTION Turopolje pig breed is Croatian autochtonous breed, belonging to older European pig breeds (Grunenfelder, 1994 and Robić et al., 1996). A number of scientific and professional papers were published about the origin, historical and economic importance and about the factors, which brought this breed into the FAO list of endangered and disappearing breeds (World Watch List for Domestic Animal Diversity, Loftus and Scherf, 1993). This list was formed after signing the Convention on Biological Diversity (CBD) in Rio de Janeiro in June 1992. The Republic of Croatia signed CBD on January 5, 1997 and in 1999.Croatia passes the strategy of biological diversity which includes also Turopolje pig (Radović, 1999). Table 1 gives the size of breeding population registered in the herdbook of Turopolje pig breed in the years 1996 (the start of the programme of re-establishment and preservation) and 2003 as reported in annual reports of Croatian Livestock Center (CLC, 1997 and 2004). Table 1. Breeding population of Turopolje pig breed in Croatia Preglednica 1. Populacija turopoljskega prašiča na Hrvaškem Year / Leto Sows / Svinje Boars Merjasci Gilts Mladice Y. boar Mladi merjasci Piglets Pujski 1996 12 3 - - - 2003 99 6 76 3 180 Source: Annual report – pig breeding, CLC (1997, 2004). The number of sows and boars (Table 1), in addition to the state subsidies, indicates the state of critical endangerment of this breed according to the FAO standards (Loftus and Scherf, 1993), but number of gilts and piglets gives the opportunity to change the present state. The breeding population is owned by family farms and by organization Universitas Communitas Nobilium Campi Turopolia (UCNCT, V. Gorica) which owns the majority of the population. The UCNCT started first in 1996 with preservation by opening herdbook at CLC. This organization, a farmer land community, established in 13th century and legally suppressed in 1947 (Đikić et al., 2002), renewed its activities and included them into the project of re-establishment and preservation of Turopolje pig as cultural and biological value, as well as its natural habitat of origin and in – situ survival. It is important to emphasize that the traditional Croatian technology of low input pig production in the outdoor ecosystem of flood forests and marsh meadows, typical for Turopolje pig, is a part of Croatian cultural heritage. Existing research results about characteristics of Turopolje pig are mostly published in the monography “Turopolje pig – autochtonous Croatian breed – turopolka” (Đikić et al., 2002). In 2002 in V. Gorica the 1st symposium with a round table discussion on Turopolje pig was held. There was concluded that UCNCT and Faculty of Agriculture should define a program which would support the re-establishment of the population of Turopolje pig on the economical base. Following this conclusion and based in the current knowledge about characteristics of Turopolje pig, the objective of this study was to establish slaughtering properties, carcass composition as well as distribution of muscle, fat and bone tissues in parts of carcass of Turopolje pig. Results of this study will be used as a base for defining the characteristics (standards) of today’s Turopolje pig breed, as well as a starting point for breeding and economical program for re-establishment, preservation and definition of production type of this breed. Đikić, M. et al. Distribution of tissues in the carcass of Turopolje pig, an autochtonous Croatian breed. 155 MATERIAL AND METHODS Investigation was carried out on two groups of Turopolje breed hogs (TI n = 10 and TII n = 9). Pigs were fattened in the outdoor production system. The whole production cycle took place in the outdoor system of forest biocenosis (Quercus robur, Fraxinus excelsior and Fagus sylvatica) and marsh meadows (Deschampsietum caespitosae) in the Turopolje area (about 40 km from Zagreb). Traditional Croatian technology of low feed input (0,5 kg of corn seed/animal/day) in the ecosystem was implemented in the extensive management. Natural resources (acorn, soil, pasture) were utilized, but having in mind the environmental balance as well. No industrial feed, vitamins or minerals were used neighter for piglet rearing nor later in the fattening period. The average age of fattened pigs in group TI was 584 ± 20 days, and in TII 679 ± 20 days. In the abattoir for each hog the live weight and warm carcass weight were taken.The averages for TI group were 81.9 ± 6.1 kg and 65.6 ± 4.8 kg, respectively and for TII group100.3 ± 4.9 kg and 80.1 ± 4.6 kg, respectively. After chilling for 24 hours at + 4 oC the weights of cold carcass and of single of halves (the halve on which the tail remained during the cutting of carcass) for the dissection were recorded. The Weniger method (Weninger et al., 1963) was used for cutting the halves into the parts: leg, shoulder, loin, neck, belly-rib part (BRP), less value part (LVP), double chin (DC) and kidney fat (KF). By the method of total dissection each part was dissected into muscle, fat and bone tissues and weights of tissues were recorded. The lard and double chain were weighted separately. On the basis of mass of each tissue in the parts and the mass of halves, the percentage of parts in the carcass and the percentage of tissues in the carcass as well as in the parts of the carcass were established. The descriptive statistics within groups and differences between groups (t-test) were analysed (SAS, 1999). RESULTS AND DISSCUSION Carcass composition According to the results (Table 2) of the experimental groups (TI and TII), the established values of slaughtering weight indicate very low daily gain in fattened Turopolje pig produced in the outdoor system with technology of low feed input and dependency on capability of each individual animal to utilize the natural resources of the ecosystem. Obtained statistically significant differences between groups (TI and TII) for slaughtering weight and for cold and warm carcass weights were expected, due to the difference in age. However, high variability of slaughtering weights found within each group indicates an interaction between genotype and environment, in relation to the outdoor production system. Analysis of carcass composition (Table 2) within both groups shows that muscle : fat ratio in the carcass without lard is in favour of muscle tissue. If both, fat tissue and lard are included into calculation, than the ratio is 1:1. Pigs in the TI group had significantly lower share of muscle tissue (P < 0.05) and higher share of bone tissue lard and double chain (P < 0.01) than animals in the group TII, what could be explained, according to Lawrie (1998), by different age and slaughtering weights. However, statistically significant differences were not found for percentage of fat tissue in the carcass. This indicates that there is a need for the investigation of growth and gain dynamics, and for the relation between body weight and body protein and fat in pigs at different age, which is, according to Reeds et al., (1993), important for regulation of growth processes which are defined as dimensional, compositional and functional changes in pigs. Regarding muscle : fat tissue ratio in carcass, according to older references (Vukina, 1961, Belić et al., 1961), Turopolje pig is a late-mature fat producting type of pig, together with Mangalitza and Bagun. On the contrary, Horvat (1939), based on own research, concluded that fattened pigs with the average body 156 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2. weight of 101.7 kg and 81.6 kg of cold carcass weight were too fatty for production of fresh meat and not enough fatty for production of fat (which was important at that time). However, if the recorded differences (Table 2) for muscle : fat tissue ratio between groups TI and TII were compared with the recent data on breeds Mangalitza and Black Slavonian (Kralik and Petričević, 2001; Uremović et al., 2000), than present population of Turopolje pig can be defined as a late mature, combined meatness – fatty type of pig for production in low feed input technology in ecosystem of biocenosis marsh meadows and flood forests (Deschampsietum caespitosae – Quercetum roboris). In addition, obtained results (Table 2) indicate that Turopolje pig was not affected by trends in pig selection directed by changes in demand for muscle and fat tissue on pig meat market, which resulted in very high share of muscle tissue in carcass, in relation to the share of fat tissue, in selected breeds. (Đikić and Jurić, 2003). Reeds et al., (1993) reported that in commercial fattened pigs of Landrace and Large White breeds at 210 days and body weight of 90 kg, in the year 1940 muscle : fat tissue ratio was 0.87:1, while in 1980 it was 1:1. If these figures are compared to the fattened Turopolje pigs, the status of selection according to carcass quality in the remaining population can be illustrated. Table 2. Carcass (cold) weights and carcass composition of the two groups of Turopolje hogs Pregladnica 2. Masa (hladnih) trupov in sestava trupov dveh skupin merjascev turipoljske pasme Group Skupina Carcass Trup Tissue, % Tkivo, % LVP MVD+ KF and DC Ledvična maščoba in podbradek kg M F B % % x± SD x± SD x± SD x± SD x± SD x± SD T I 63.9 ± 5.7** 38.2 ± 2.98* 34.2 ± 2.91 10.6 ± 0.94** 8.9 ± 0.88 3.2 ±0.40** 4.9 ±0.53** T II 79.7 ± 4.4** 40.5 ± 1.39* 33.8 ±1.29 9.7 ± 0.74** 8.8 ± 0.84 4.0 ±0.65** 3.2 ±0.82** P < 0.01, * = P < 0.05; + = manj vredni deli Tissue distribution in the carcass In the fattened pigs of Turopolje breed, regarding the share of parts in carcass, the leg is in the first place, followed by BRP, shoulder, loin, and neck. Statistically significant difference (P < 0.01) is established between groups for the share of BRP, which could be explained by development of gastrointestinal system in pigs at different age (Reeds et al., 1993). Analysis of the results (Table 3) shows that Turopolje pig has a higher share of shoulder’s and neck (TI 24.0% and TII 24.3%) and lower share of loin and BRP in carcass, than modern pig genotypes (Đikić and Jurić, 2003, Kralik and Petričević, 2001). Although the data of carcass length are not given, Turopolje pig has relatively short carcass (os pubis – atlas 87.0 cm and os pubis – first rib 68.4 cm) compared to modern pig genotypes (98.5 cm and 88.3 cm, respectively) (Đikić et al., 2002). Within the groups the percentage (Table 3) of muscle tissue in the carcass and in the leg, shoulder loin, neck and BRP is low, while percentage of fat tissue is relatively high, when compared to the ratio in selected pigs. However, percentage of muscle tissue in carcass was higher than fat in all parts of the carcass, except for BRP in both groups. Đikić, M. et al. Distribution of tissues in the carcass of Turopolje pig, an autochtonous Croatian breed. 157 Table 3. The tissues distribution and share of parts in the carcass of two groups of Turopolje hogs Preglednica 3. Porazdelitev tkiv in delež telesnih delov v trupih dveh skupin turopoljskih prašičev Parts of carcass Deli trupa Tissue in carcass Tkiva v trupu Percentage of parts and tissues of these parts in the carcass Odstotek telesnih delov in tkiv v trupu Group / Skupina T I x± SD T II x± SD Leg / Noge Muscle / Mišice 12.9 ± 0.55 12.7 ± 0.77 Fat / Maščobno tkivo 10.1 ± 0.70 10.6 ± 0.95 Bone / Kosti 3.0 ± 0.62** 2.4 ± 0.26** Total / Skupaj 26.0 ± 0.85 25.7 ± 0.53 Shoulder / Pleča Muscle / Mišice 7.8 ± 0.19* 8.2 ± 0.52* Fat / Maščobno tkivo 5.3 ± 0.78 5.7 ± 0.58 Bone / Kosti 2.0 ± 0.19* 1.6 ± 0.48* Total / Skupaj 15.1 ± 0.75 15.5 ± 0.20 Loin / Ledja Muscle / Mišice 5.5 ± 0.46* 6.6 ± 0.57* Fat / Maščobno tkivo 5.3 ± 0.81 5.8 ± 0.47 Bone / Kosti 2.4 ± 0.36 2.4 ± 0.60 Total / Skupaj 13.2 ± 0.99 14.8 ± 0.63 Neck / Vrat Muscle / Mišice 4.5 ± 0.44** 5.2 ± 0.44** Fat / Maščobno tkivo 2.9 ± 0.39** 2.3 ± 0.33** Bone / Kosti 1.5 ± 0.27 1.3 ± 0.13 Total / Skupaj 8.9 ± 0.20 8.8 ± 0.48 BRP Potrebušina z rebri Muscle / Mišice 6.9 ± 0.71** 7.9 ± 0.37** Fat / Maščobno tkivo 11.1 ± 0.83** 9.6 ± 0.79** Bone / Kosti 2.2 ± 0.16 1.7 ± 0.15 Total / Skupaj 20.2 ± 0.68** 19.2 ± 0.54** = P < 0.01, = P < 0.05. Testing of differences between groups TI and TII showed that heavier and older animals have significantly higher share of muscle tissue in carcass in shoulder (P < 0.05), as well as in the neck and BRP (P < 0.01), while the share of fat tissue from neck and BRP is significantly lower (P < 0.01). Analysis of figures for bone tissue from different body parts shows that younger and lighter Turopolje breed hogs have a higher share of bones from leg (P < 0.01), shoulder and BRP (P < 0.05) than the older and heavier ones. Records (Table 2 and 3) obtained in fattened Turopolje pigs of present population do not suggest that breeding and selection processes in modern pig production had any influence on this population in the sense of increasing muscle : fat tissue ratio in carcass, or in the increase of the ratio between back (leg + back) and front (loin + neck) part of carcass. The percentage of tissues in some parts of the carcass in two groups of Turopolje hogs are showen in Table 4. The ratio between muscle and fat tissue in the parts within groups as well as the differences between groups are more than 1 : 1, what indicates the possibilities for utilization for some kind of pork product processsing (dry ham, dry loin or various sausages). Obtained values, in addition to the recent results (Grunenfelder, 1994; Robić et al., 1996; Đikić et al., 1999, 2002) confirm 158 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2. that Turopolje pig is, because of its specific origin (Ritzoffy, 1931 and 1933), as well as biological characteristics, a valuable cultural and biological resource. Assuming that statements of Sellier (1998), Hammond (1998), Jurić and Đikić (2001) and Grunenfelder (1994) are accepted, this breed could also have an economical value. Table 4. Percentage of tissues in the parts of the carcass Pregladnica 4. Odstotek tkiv v delih trupa Parts of carcass Deli trupa Tissue in carcass Tkiva v trupu Group / Skupina TI x± SD Tii x± SD Leg / Noge Muscle / Mišice 49.2 ± 2.63 49.6 ± 2.90 Fat / Maščobno tkivo 38.6 ± 2.23 39.7 ± 2.61 Bone / Kosti 12.2 ± 2.35** 10.5 ± 1.45** Shoulder / Pleča Muscle / Mišice 52.8 ± 5.15* 54.1 ± 4.39* Fat / Maščobno tkivo 34.3 ± 6.37 35.3 ± 4.97 Bone / Kosti 12.9 ± 1.59* 10.6 ± 0.84* Loin / Ledja Muscle / Mišice 42.1 ± 4.32* 44.5 ± 2.80* Fat / Maščobno tkivo 40.3 ± 4.21 39.7 ± 2.06 Bone / Kosti 17.6 ± 2.99 15.8 ± 1.88 Neck / Vrat Muscle / Mišice 51.5 ± 4.89** 58.6 ± 3.81** Fat / Maščobno tkivo 32.7 ± 5.24** 26.4 ± 3.37** Bone / Kosti 15.8 ± 2.37 14.9 ± 1.20 BRP Potrebušina z rebri Muscle / Mišice 37.2 ± 5.83** 40.8 ± 3.04** Fat / Maščobno tkivo 52.9 ± .89** 50.7 ± 3.15** Bone / Kosti 9.9 ± 1.6* 8.5 ± 0.98* P < 0.01, * = P < 0.05. CONCLUSIONS Turopolje pig breed is in the state of critical endangerment (by FAO standard), but number of gilts and piglets suggests the improvement of that state. Present population of Turopolje pig breed is with regard to muscle:fat tissue ratio in the carcass and in each parts of the carcass (1.0–1.2 : 1) late – mature type, what is a consequence of specific historical conditions of selection and production in specific environment of the outdoor system. The carcass composition and the distribution of tissue in single parts of carcass give the opportunity to set up a program which would support re-establishment of the population on the economic base. REFERENCES Belić, J./ Ognjanović, A./ Šterk, V. Modern pig production. Beograd, Ed. Zadružna knjiga, 1961, 69–73. Croatian Livestock Center. Annual report – pig breeding. Zagreb, 1997, 64 p. Croatian Livestock Center. Annual report – pig breeding. Zagreb, 2004, 63 p. Đikić, M./ Jurić, I. Relation and distribution of tissues in pigs as factor of competitiveness on pig meat market. Agronomski glasnik, 65(2003)3–4, 88–96. Đikić, M./ Jurić, I./ Kos, F. Turopolje pig – autochtonous Croatian breed – turopolka. Velika Gorica, Plemenita opčina turopoljska, 2002, 181 p. Đikić, M./ Jurić, I./ Robić, Z./ Henc, Z./ Gugić, G. Litter size and weight of piglets of Turopolje pig breed in suckling period. Poljoprivredna znanstvena smotra, 64(1999), 97–102. Đikić, M. et al. Distribution of tissues in the carcass of Turopolje pig, an autochtonous Croatian breed. 159 Grunenfelder, H.P. Saving the Turopolje pig. – An international pilot project in Croatia in collaboration with Euronatur. Proc 3rd International Dagene – Symposium on gene conservation, Zagreb – Pag, Croatia, pp 27–30. Stočarstvo, 48(1994), 361–364. Hammond, K./ Leitch, H.W. Genetic resources and Global Programme for their menagement. In: Genetics of the pig (Eds.: Rothschild, M.F./ Ruvinsky, A.). Wallingford, CAB, 1998, 405–427. Horvat, B. Results of controlled fatening of pigs of Turopolje and Bagun breeds. Arhiv Ministarstva poljoprivrede – Smotra naučnih radova, 6(1939), 55–76. Jurić, I./ Đikić, M. Breeding methods and changes of gene frequences in population. Proceedings: Biological diversity in animal production of Republic of Croatia. HAZU, Zagreb, 2001, 39–50. Kralik, G./ Petričević, A. Production traits of Black Slavonian pig. Proceedings: Biological diversity in animal production of Republic of Croatia, Zagreb, Hrvatska, 2001, 115–122. Loftus, R./ Scherf, B. World Watch List for Domestic Animal Diversity. 1st Edit. Rome, FAO UNEP, 1993. Lawrie, R.A. Lawrie’s meat science. Abingdon Hall, Abingdon, Woodhead Publishing limited, 1998, 336. Radović, J. Overview of condition of biological and landscape diversity of Croatia with strategy and action plan for protection. (Pregled stanja biološke I krajobrazne raznolikosti Hrvatske sa strategijom I akcijskim planovima zaštite). Zagreb, Državna uprava za zaštitu prirode i okoliša, 1999, 151 p. Reeds, P.Y./ Burrin, D.G./ Davis, T.A./ Fiorotto, M.A./ Meremann, H.J./ Pond, W.G. Growth regulation Particular Reference to the Pig. In: Growth of the Pig (Ed.: Hollis, G.R.). Walingford, CAB International, 1993, 1–32. Ritzoffy, N. Contribution to knowledge on Turopolje pig. Veterinarski arhiv. 1(1931), 83–134. Ritzoffy, N. About inbreeding in general, especially within Turopolje pig breed. Veterinarski arhiv. 12(1933), 533–571. Robić, Z./ Đikić, M./ Jurić, I./ Stipić, N./ Rupić, V./ Mužic, S./ Božac, R:/ Liker, B. The Turopolje pig one of the oldest European races: It is saving and Renewal. In: Proceedings 4th International Symposium Animal Science Days, Kaposvar, Hungary, 1996, 90–94. SAS Institute. SAS Online Doc® Release 8. SAS Institute Inc., Cary NC. USA, 1999. Sellier, P. Genetic of meat and carcass traits. In: Genetic of the pig (Eds.: Rothschild, M.F./ Ruvinsky, A.). Wallingford, CAB, 1998, 463–510. Uremović, M./ Uremović, Z./ Luković, Z. Production properties of the black Slavonian pig breed. Zb. Bioteh. Fak. Univ. Ljubl., Kmet. Zooteh., 76(2000), 131–134. Vukina, R. Practical pig production. Zagreb, Znanje, 1961, 191 p. Weniger, H.J./ Steinkanf, D./ Pahl, G. Musculare topography of carcass BLV. München, Verlagsgaselleschaft München, 1963. Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2, 161. http://www.bf.uni-lj.si/aas UDK 636 / 637 ISSN 1581-9175 Acta agriculturae slovenica Letnik 84 Ljubljana, december 2004 Številka 2 SUBJECT INDEX BY AGROVOC DESCRIPTORS PREDMETNO KAZALO PO DESKRIPTORJIH AGROVOC Tomaž BARTOL a) Univ. of Ljubljana, Biotechnical Fac., Agronomy Dept., Jamnikarjeva 101, SI-1000 Ljubljana, Slovenia, Ass.Prof., Ph.D., M.Sc., e-mail: tomaz.bartol@bf.uni-lj.si. adipose tissues: 97–107, 153–159 anaerobiosis: 141–151 animal fats: 97–107 bacteria: 141–151 body condition: 153–159 body parts: 153–159 breeds (animals): 121–130, 131–139, 153–159 carcass composition: 97–107, 153–159 carcasses: 153–159 casein: 121–130 croatia: 121–130, 153–159 dairy cattle: 109–119 designation of origin: 131–139 enzymic activity: 141–151 fattening: 97–107 gene expression: 109–119 genetic polymorphism: 121–130 genomes: 109–119 horses: 131–139 lactoglobulins: 121–130 land races: 121–130, 131–139, 153–159 mares: 131–139 meat: 97–107 microbial flora: 141–151 milk: 121–130 milk production: 109–119 milk protein: 109–119 milk yield: 109–119 mitochondrial genetics: 131–139 molecular genetics: 97–107, 109–119, 121–130, 131–139, provenance: 131–139 proximate composition: 109–119 quality: 97–107 rumen: 141–151 rumen microorganisms: 141–151 sheep: 121–130 swine: 153–159, 97–107 xylanolytic microorganisms: 141–151 xylans: 141–151 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2, 163. http://www.bf.uni-lj.si/aas UDK 636 / 637 ISSN 1581-9175 Acta agriculturae slovenica Letnik 84 Ljubljana, december 2004 Številka 2 SUBJECT INDEX BY AGRIS CATEGORY CODES VSEBINSKO KAZALO PO PREDMETNIH KATEGORIJAH AGRIS Nataša SIARD a) a) Univ. of Ljubljana, Biotechnical Fac., Zootechnical Dept., Groblje 3, SI-1230 Domžale, Slovenia, Ph.D., M.Sc., e-mail: natasa.siard@bfro.uni-lj.si. Animal genetics and breeding – L10 97–107, 109–119, 131–139 Animal ecology – L20 141–151 Animal physiology - Nutrition – L51 141–151 Food science and technology – Q01 109–119, 121–130, 153–159 Food composition – Q04 153–159 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2, 165. http://www.bf.uni-lj.si/aas UDK 636 / 637 ISSN 1581-9175 Acta agriculturae slovenica Letnik 84 Ljubljana, december 2004 Številka 2 ABECEDNO KAZALO AVTORJEV AUTHOR'S INDEX Št. No. Avtor Author Stran primarnega prispevka Page of the primary source 1. BARTOL Tomaž 161 2. ČEPELJNIK Tadej 141-151 3. DOVČ Peter 97-107, 109-119, 121-130, 131-139 4. ĐIKIĆ Marija 153-159 5. FIDLER Katarina 141-151 6. FRAJMAN Polona 109-119 7. HABE Franc 131-139 8. IVANKOVIĆ Ante 121-130 9. JURIĆ Ivan 153-159 10. KAROLYI Danijel 153-159 11. KAVAR Tatjana 131-139 12. KOZMUS Peter 95-96 13. MARINŠEK-LOGAR Romana 141-151 14. MILOŠEVIČ BERLIČ Tamara 97-107 15. POKLUKAR Janez 93-94 16. RUPIĆ Vlatko 153-159 17. SALAJPAL Krešimir 153-159 18. SIARD Nataša 163 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2, 167–168. http://www.bf.uni-lj.si/aas NAVODILA AVTORJEM Prispevki Sprejemamo izvirne znanstvene članke, predhodne objave in raziskovalne notice s področja zootehnike v slovenskem in angleškem jeziku, znanstveno pregledne članke samo po poprejšnjem dogovoru. Objavljamo tudi prispevke, podane na simpozijih, ki niso bili v celoti objavljeni v zborniku simpozija. Če je prispevek del diplomskega, magistrskega ali doktorskega dela, navedemo to in tudi mentorja na dnu prve strani. Navedbe morajo biti v slovenskem in angleškem jeziku. Pri prispevkih v slovenskem jeziku morajo biti preglednice, grafikoni, slike in priloge dvojezični, povsod je slovenščina na prvem mestu. Naslovi grafikonov in slik so pod njimi. Slike in grafikoni so v besedilu. Priloženi morajo biti tudi jasno označeni izvirniki slik (fotografije ali ločene grafične datoteke). Na avtorjevo željo jih vračamo. Grafikoni morajo biti črno-beli, brez rastrov. Dovoljeni so vzorci v črno-beli kombinaciji. Latinske izraze pišemo ležeče. V slovenščini uporabljamo decimalno vejico, v angleščini decimalno piko. Prispevki v angleščini morajo imeti povzetek v slovenščini in obratno. Prispevki naj bodo strnjeni, kratki, največ 12 strani. Uporabljamo Microsoft Word 97 ali novejšo verzijo (Windows); pisava v besedilu in preglednicah je Times New Roman, velikost črk 12, v obsežnih preglednicah je lahko 10, pisava v grafikonih in slikah je Ariel, velikost črk najmanj 9, pisava za primerjave nukleotidnih in aminokislinskih zaporedij je Courier; zunanji rob 2,0 cm, notranji 2,5 cm, zgoraj živa pagina v eni vrstici, velikost črk 10 z avtorjem oz. avtorji in naslovom prispevka, zaključenim s piko. Če je naslov daljši, ga smiselno okrajšamo. Primera: Štuhec, I. in Siard, N. Obnašanje prašičev. Stibilj, V. in sod. Določitev maščobno-kislinske sestave … vzorcev mleka v Sloveniji. Prva stran Na prvi strani prispevka na desni strani označimo vrsto prispevka v slovenščini in angleščini, sledi naslov prispevka, pod njim avtorji. Ime avtorjev navedemo v polni obliki (ime in priimek). Vsak avtor naj bo označen z indeksom, ki ga navedemo takoj pod avtorji, in vsebuje polni naslov ustanove ter znanstveni in akademski naslov; vse v jeziku prispevka. Navedemo sedež ustanove, kjer avtor dela. Če je raziskava opravljena drugje, avtor navede tudi sedež te inštitucije. Na željo avtorjev bomo navedli naslov elektronske pošte. Pod naslovi avtorjev je datum prispetja in datum sprejetja prispevka, ki ostaneta odprta. Sledi razumljiv in poveden izvleček z do 250 besedami. Vsebuje namen in metode dela, rezultate, razpravo in sklepe. Sledijo ključne besede. Izvlečku v jeziku objave sledi naslov in izvleček s ključnimi besedami v drugem jeziku. Predlogo za pomoč pri oblikovanju prve strani prispevka najdejo avtorji na domači strani: http://www.bf.uni-lj.si/aas. Viri V besedilu navajamo v oklepaju avtorja in leto objave: (priimek, leto). Če sta avtorja dva, pišemo: (priimek in priimek, leto), če je avtorjev več, pišemo: (priimek in sod., leto). Sekundarni vir označimo z »navedeno v« ali »cv.«. Seznam virov je na koncu prispevka, neoštevilčen in v abecednem redu. Vire istega avtorja, objavljene v istem letu, razvrstimo kronološko z a, b, c. Primer: 1997a. Navajanje literature naj bo popolno: pri revijah letnik, leto, številka, strani; pri knjigah kraj, založba, leto, strani. Za naslove revij je dovoljena uradna okrajšava, za okrajšanimi besedami naj bodo vedno pike. Navedbo zaključimo s piko. Nekaj primerov: 168 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2. Fraser, A.F./ Broom, D.M. Farm animal behaviour and welfare. London, Bailliere Tindall, 1990, 437 str. Hvelplund, T. Protein evaluation of treated straws. V: Evaluation of straws in ruminant feeding (ur.: Chenost, M./ Reiniger, A.). London, Elsevier Applied Science, 1989, 66–74. Stekar, J.M.A. Vsebnost makro elementov v slovenski mrvi. V: Posvetovanje o prehrani domačih živali »Zadravčevi-Erjavčevi dnevi«, Radenci, 1997-10-27/28. Murska Sobota, Živinorejsko-veterinarski zavod za Pomurje, 1997, 105–117. Stekar, J.M.A./ Golob, A./ Stibilj, V./ Koman Rajšp, M. Sestava in hranilna vrednost voluminozne krme v letu 1990. Zb. Bioteh. Fak. Univ. Ljubl., Kmet. Živin., 58(1991), 149–155. Stekar, J.M.A./ Pen, A. Sadržaj natriuma, cinka i mangana u stočnoj hrani sa travnatih površina. Agrohemija, 21(1980)1–2, 7–15. Oddaja Avtorji prispevke oddajo v dveh izvodih, enega z dvojnim razmikom med vrsticami in največ 35 vrstic na strani, in na disketi. Priložijo tudi izjavo s podpisi vseh avtorjev, da avtorske pravice v celoti odstopajo reviji. Prispevke recenziramo in lektoriramo. Praviloma pošljemo mnenje prvemu avtorju, po želji lahko tudi drugače. Če urednik ali recenzenti predlagajo spremembe oz. izboljšave, vrne avtor popravljeno besedilo v 10 dneh v dveh izvodih, enega z dvojnim razmikom. Ko prvi avtor vnese še lektorjeve pripombe, odda popravljeno besedilo v enem izvodu in na disketi ter vrne izvod z lektorjevimi popravki. Prispevke sprejemamo vse leto. Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2, 169–170. http://www.bf.uni-lj.si/aas NOTES FOR AUTHORS Papers We publish original scientific papers, preliminary communications and research statements on the subject of zootechny in Slovenian and English languages while scientific reviews are published only upon agreement. Reports presented on conferences that were not published entirely in the conference reports can be published. If the paper is a part of diploma thesis, master of science thesis or dissertation, it should be indicated at the bottom of the front page as well as the name of mentor. All notes should be written in Slovenian and English language. Papers in Slovenian language should have tables, graphs, figures and appendices in both languages, Slovenian language being the first. Titles of graphs and figures are below them. Figures and graphs are part of the text. Clearly marked original figures should be added (photographs or separate graphic files); they can be returned upon request. Latin expressions are written in italics. Decimal coma is used in Slovenian and decimal point in English. Papers in English should contain abstract in Slovenian and vice versa. The papers should be condensed, short and should not exceed 12 pages. Microsoft Word 97 or later version (Windows) should be used, fonts Times New Roman, size 12 in text and tables (in large tables size 10 is allowed), Ariel for graphs and figures (letter size at least 9) and Courier for nucleic- and amino acid sequence alignments should be used; right margin 2.0 cm, left margin 2.5 cm; pagina viva in one line, size 10, author(s) and abbreviated title of the paper ending with a full stop. Examples: Štuhec, I. and Siard, N. Pig Behaviour. Stibilj, V. et al. Determination of fatty acids composition ... milk samples in Slovenia. First page The type of the paper should be indicated on the first page on the right side in Slovenian and English language following by title of the paper and authors. Full names of authors are used (first name and surname). Each name of the author should have been added an index, which is put immediately after the author(s), and contains address of the institution and academic degree of the author, in the language of the paper. The address of the institution in which the author works is indicated. If the research was realised elsewhere, the author should name the headquarters of the institution. E-mail is optional. Under the address of the authors some space for dates of arrival and acceptance for publishing should be left. A comprehensive and explicit abstract up to 250 words follows indicating the objective and methods of work, results, discussion and conclusions. Key words follow the abstract. The abstract in the language of the paper is followed by the title, abstract and key words in another language. Help instructions for first page design can be found on home page: http://www.bf.uni-lj.si/aas. References References should be indicated in the text by giving author's name, with the year of publication in parentheses, e.g. (surname, year). If authors are two, the following form is used: (surname and surname, year). If authors are several, we use (surname et al., year). Secondary literary sources should be quoted in the form "cited in". The references should be listed at the end of the paper in the alphabetical order and not numbered. If several papers by the same author and from the year are cited, a, b, c, etc. should be put after the year of the publication: e.g. 1997a. 170 Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2. The following form of citation is used: for journals volume, year, number, page; for books place of publication, publisher, year, pages. For journals official abbreviated forms can be used. A full stop should be put after the abbreviated words. Each reference is also closed by a full stop. Examples: Fliegerová, K./ Pažoutová, S./ Hodrová, B. Molecular genotyping of rumen fungi based on RFLP analysis. Zb. Bioteh. Fak. Univ. Ljubl., Kmet. Zooteh., 72(1998), 95–98. Fraser, A.F./ Broom, D.M. Farm animal behaviour and welfare. London, Bailliere Tindall, 1990, 437 p. Hvelplund, T. Protein evaluation of treated straws. In: Evaluation of straws in ruminant feeding (Eds.: Chenost, M./ Reiniger, A.). London, Elsevier Applied Science, 1989, 66–74. Ristič, M./ Klein, F.W. Schlachtkoerperwert von Broilern verschiedener Herkunfte. Mitteilungsblatt der Bundesanstalt fuer Fleischforschung, Kulmbach, 101(1988), 8045–8051. Stekar, J.M.A. Silage effluent and water pollution. In: 6th International Symposium "Animal Sciences Days", Portorož, 1998-09-16/18, Slovenia. Zb. Bioteh. Fak. Univ. Ljubl., Kmet. Supl., 30(1998), 321–325. Delivery Papers should be delivered in two hard copies, one with double-spacing and not more than 35 lines per page and on a floppy disc. A statement signed by all authors transfers copyrights on the published article to the Journal. Papers are reviewed and edited. First author receives a review. If reviewers suggest some corrections, the author should forward them in 10 days and in two copies, one of them with double space. After the first author considers the editor’s notes, the corrected paper should be sent in one copy and on a floppy disc. Papers are accepted all year.