75 FTIR spektroskopija FTIR spektroskopija se uporablja za analize molekularne strukture in karakterizacijo materialov. Deluje na osnovi interakcije infrardeče (IR) svetlobe v povezavi z moleku- larnimi nihanji in rotacijami (Stuart 2004, 2). Skozi vzo- rec potujoča IR-svetloba povzroči različne vrste gibanj molekulskih vezi, kot so na primer simetrično in nesi- metrično raztezanje in krčenje, upogibanje v ravnini ter gugajoče upogibanje zunaj ravnine. Funkcionalne sku- pine (denimo C = E, CH 3 ) oz. njihove vezi absorbirajo IR-svetlobo pri različnih valovnih dolžinah in različno intenzivno. S tem v vzorcu ustvarijo edinstven moleku- larni spekter (Stuart 2004, 46). Na osnovi valovnih dol- žin in intenzitete absorpcijskih vrhov trakov v spektru je tako mogoče ugotoviti prisotne funkcionalne skupine (Smith 1999, 15–18). Ker je intenziteta absorpcijskega vrha traku proporcionalna koncentraciji funkcionalnih skupin, hkrati odraža količino skupine v vzorcu. Opozo- riti velja, da slednje drži za čiste, enomolekularne vzorce. Pri večmolekularnih vzorcih je intenzivnost pogojena z različnimi molekulami in funkcionalnimi skupinami. Ker se trakovi v spektru večmolekularnega vzorca prekriva- jo, je otežena jasna določitev koncentracij (Smith 1999, 19; Coates 2000, 3–6). Za interpretacijo spektra je lahko koristna tudi širina posameznega traku, saj je odvisna od jakosti medmolekularnih interakcij. Denimo močne vo- dikove vezi tvorijo široke trakove, medtem ko šibke van der Waalsove vezi tvorijo ozke trakove (Smith 1999, 21). Obstaja sicer več tehnik FTIR spektroskopije, vendar je v arheoloških kontekstih najpogosteje zaslediti tran- smisijsko tehniko z uporabo kalijevega bromida (KBr) Arheo 33, 2016, 75–93 Uporaba FTIR spektroskopije za analizo kosti iz arheoloških okolij Application of FTIR spectroscopy for analysing bones from archaeological contexts © Tamara Leskovar tamaraleskovar@gmail.com Izvleček: FTIR-ATR spektroskopija omogoča hitre in natančne kemične analize vzorcev. Zaradi možnosti izvedbe na majhnih vzorcih in izognitve uničenju le-teh je izredno uporabna kot del (osteo)arheoloških analiz. Nudi namreč vpogled v kemično sestavo vzorca, ki lahko predstavlja izhodišča za razumevanje stanja ohranjenosti vzorca ter vplivov okolja na zaznane spremembe. V nadaljevanju so predstavljene osnove FTIR spektroskopije, kemične sestave kosti in njenih sprememb po smrti organizma ter možnosti obdelave in interpretacije pridobljenih podatkov. Ključne besede: FTIR-ATR spektroskopija, kemična sestava kosti, tafonomija, kolagen, mineral, analiza FTIR spektra Abstract: FTIR-ATR spectroscopy enables fast and accurate chemical analyses of different materials. Small sample requirements and a potentially non-destructive nature render the technique a highly useful tool in (osteo)archaeological analyses. Offering an insight into the chemical composition, it can be employed in the study of the state of sample preservation or the influence of environment on the sample’s chemical structure. The contribution brings a brief presentation of the technique, the chemical structure of the bone, the changes in bone structure after death and the different possibilities for FTIR-ATR data manipulation and interpretation. Keywords: FTIR-ATR spectroscopy, chemical composition of bone, taphonomy, collagen, mineral, FTIR spectrum analysis Uvod Fourierjeva transformacijska infrardeča (FTIR) spektro- skopija predstavlja eno od hitrih in izredno informativnih tehnik kemične analize materialov. Uporablja se z name- nom določitve in primerjave kemične sestave vzorcev (Smith 1999, 1). Z vidika arheologije je tehnika izredno zanimiva, saj je primerna za analize različnih organskih in anorganskih materialov ter hkrati zahteva zgolj majh- ne vzorce (Margaris 2014, 2890). Zaradi svoje široke uporabnosti in možnosti izognitve uničenju analizira- nega vzorca je pogosto uporabljena tudi za analize člo- veških (ali živalskih) posmrtnih ostankov. FTIR analiza slednjih namreč omogoča vpogled v stanje kolagena in minerala v kosti. Pridobljeni rezultati tako nudijo izhodi- šče ali dopolnilo razumevanju tafonomskih sprememb v kosti po smrti organizma in vplivov fizičnega okolja na te spremembe. Namen članka je predstavitev FTIR spektroskopije, pred- vsem tehnike oslabljenega popolnega odboja (attenuated total reflection – ATR) in njene uporabnosti v primeru analiz kosti iz arheoloških okolij. Besedilo podaja osno- ve FTIR-ATR spektroskopije in kemične sestave kosti, glavne tafonomske spremembe v kosti po smrti organiz- ma ter izhodišča za interpretacijo pridobljenega spektra. Celoten postopek je prikazan tudi s primerom analize vzorcev kosti, izpostavljenih različnim tafonomskim spremembam. 1.02 Pregledni znanstveni članek 76 ter refleksijsko tehniko oslabljenega popolnega odboja (attenuated total reflection – ATR). V preteklosti je pre- vladovala uporaba prve, medtem ko je v zadnjem času opaziti prednjačenje druge. Razlogi za porast uporabe ATR tehnike so predvsem v boljši primerljivosti znotraj vzorcev in med njimi, v njeni stroškovni učinkovitosti ter možnosti analize tako uprašenih kot tudi trdnih vzorcev (Hollund et al. 2013; Beasley et al. 2014). Pri tem je tre- ba poudariti, da rezultati, pridobljeni z različnimi tehni- kami in na vzorcih v različnem stanju, niso neposredno primerljivi (Surovell, Stiner 2001; Hollund et al. 2013; Beasley et al. 2014; Leskovar 2016), kar velja upoštevati pri interpretacijah rezultatov različnih raziskav. Priprava vzorcev Priprava vzorcev za pridobitev FTIR spektra kosti je od- visna od uporabljene tehnike. Ob uporabi ATR tehnike je vzorce mogoče posneti v obliki prahu ali v trdni obliki. V prvem primeru je treba vzorce uprašiti, prah pa je posnet brez nadaljnjih priprav. Trdne vzorce je mogoče posneti neposredno, potrebna je le dovolj ravna površina, ki za- gotovi dober stik med napravo in vzorcem (Hollund et al. 2013, 18; Beasley et al. 2014, 508). Snemanje vzorcev s FTIR-ATR tehniko Pred snemanjem vzorcev s FTIR napravo je treba posneti ozadje. Korak je nujen zaradi atmosferskih plinov, pri- sotnih v okolju, ki absorbirajo IR-sevanje (CO 2 , vodna para). Spekter posnetega ozadja je shranjen in ob sne- manju vzorca samodejno odštet od spektra vzorca (Pavia et al. 2014, 25). Snemanje vzorca poteka s postavitvijo vzorca na kristal, nameščen v napravi (slika 1). Nasta- vitve snemanja so raznolike, odvisne od lastnosti vzorca in želene natančnosti. V primeru snemanja kosti se upo- rablja spekter srednjih valovnih dolžin med 4000 cm -1 in 400 cm -1 . Število ponovitev in ločljivost snemanja med raziskavami nihata med 8–64 ponovitvami pri ločljivo- sti 2–8 cm -1 (Thompson et al. 2009, 911; Hollund et al. 2013, 512; Lebon et al. 2016, 3). Njuna izbira temelji na potrebni natančnosti in časovni omejitvi. Večje šte- vilo ponovitev in visoka ločljivost omogočita pridobitev natančnejših podatkov, a sta tudi časovno bolj zahtevna. Pridobljeni spekter je nadalje obdelan z računalniško programsko opremo. Deloma je obdelava mogoča že s programom, pripadajočim napravi, deloma so zahtevani dodatni računalniški programi (Stuart 2004, 51–57). Izbi- ra programske opreme ter nadaljnja obdelava sta odvisni od skeniranega vzorca, kakovosti pridobljenega spektra ter zastavljenih vprašanj. Potrebno je namreč najti pravo mero med pridobitvijo največje možne količine kakovo- stnih informacij brez prevelikih izgub (slika 2). Kost Sestava Kost je kompozitni material s kompleksno hierarhično strukturo. 60 % teže kosti predstavlja anorganski del, 30 % organski del, medtem ko preostalih 10 % tvori voda (Gong et al. 1964, 329). Anorganski del zastopajo mine- ralni kristali, grajeni iz nestehiometričnega kalcijevega hidroksiapatita, poznanega kot bioapatit. Organski del kosti v 85–90 % zastopa kolagen tipa I, medtem ko preo- stanek sestavljajo nekolagenski proteini in lipidi (Millard 2001; Clarke 2008). Kolagen tvorijo tri levosučne alfa verige, povezane v trojno desnosučno vijačno molekulo (Ramachandran 1967, 225; Lodish et al. 2000, 217). Vijačnico vzdržu- jejo interakcije in vezi med aminokislinskimi ostanki so- sednjih stranskih verig (Brodsky, Ramshaw 1997, 546). Uporaba FTIR spektroskopije za analizo kosti iz arheoloških okolij Slika 1. Snemanje kostnega izseka s FTIR-ATR tehniko. Figure 1. Scanning a bone section using the FTIR-ATR technique. 77 Molekule z vzdolžnim, vodoravnim in radialnim razpo- rejanjem tvorijo fibrile (Hulmes 2002, 2), vzdrževane z mrežo kovalentnih navzkrižnih vezi znotraj molekul in med njimi (Fratzl, Weinkamer 2007, 1276). V mineralizi- ranem tkivu, kakršno je kost, so fibrile kolagena obdane z mineralom. Slednjega predstavljajo majhni in ploščati kristali kalcijevega fosfata, ki tvorijo slabo kristalinični, nestehiometrični kalcijev hidroksiapatit Ca 5 (PO 4 ) 3 OH (Landis et al. 1996, 206). Nestehiometričnost izvira iz zamenjav kalcijevih ionov ali fosfatnih in hidroksilnih skupin. Pri tem je najpogostejša zamenjava fosfatne s karbonatno skupino, ki tako lahko predstavlja 3–5 % bi- oapatita (Lowenstam et al. 1989, 17; Olszta et al. 2007, 82). Zamenjave povzročijo vgradnjo karbonata v struktu- ro kosti ter posledično popačenje in deformacije v mine- ralni mreži in omejitev velikost kristalov. Majhni kristali imajo veliko površino, kar poveča njihovo reaktivnost in topnost (Rey et al. 1990, 386; Currey 2002, 6). Reaktiv- nost je nadalje povečana z neapatitnim hidriranim slojem na površini kristala (slika 3), ki vsebuje labilne, lahko izmenljive ione, kot so denimo CO 3 , PO 4 in HPO 4 (Rey et al. 1990, 386; Cazalbou et al. 2004, 564). Mineralizirani fibrili predstavljajo osnovne gradnike ko- sti. Tvorijo namreč vlakna, nadalje zložena v snope, ki sestavljajo nezrelo in zrelo strukturo kosti (Currey 2002, 12; Clarke 2008, 137). Strukture so nadalje povezane ali v trdno in gosto kortikalno ali močno porozno (~ 80 %) trabekularno kost. Oba tipa skupaj tvorita skeletne elemente različnih velikosti in oblik (Fratzl,Weinkamer 2007, 1270–1273). Arheo 33, 2016, 75–93 Slika 2. Primerjava med originalnim, normaliziranim in zglajenim spektrom istega vzorca. Figure 2. Comparison between the original, normalised and tuned-up spectra of the same sample. Slika 3. Hidrirani sloj na površini kristala (Farlay et al. 2010, 334, sl. 1). Figure 3. Hydrated layer on the surface of the crystal (Farlay et al. 2010, 334, Fig. 1). 400 700 1000 1300 1600 1900 2200 2500 2800 3100 3400 3700 4000 Absorbance Wavenumbers (cm -1 ) originalni spekter normaliziran spekter zglajen spekter nejasen pr ičetektraku izguba trakov 78 Tafonomske spremembe v kosteh Po smrti organizma je skelet izpostavljen fiziokemičnim spremembam, ki vodijo v popoln propad ali fosilizaci- jo (Hedges 2002; Jans 2005; Nielsen-Marsh et al. 2007; Smith et al. 2007). Proces sprememb oz. njihovo prouče- vanje je poimenovano tafonomija (Efremov 1940) in je nadalje razdeljeno na biostratinomijo in diagenezo. Prva je vezana na makroskopske in mikroskopske spremembe pred odložitvijo posmrtnih ostankov, druga na spremem- be po njej. Celoten proces vpliva na ohranjenost kosti ter informacije, ki jih le-ta hrani (Smith 2002, 21–27). Zara- di odvisnosti številnih notranjih in zunanjih dejavnikov je proces izredno kompleksen (Hedges, Millard 1995; Hedges 2002; Tütken, Vennemann 2011). V osnovi vpli- va na spremembe minerala in kolagena v kosti. Oba sta lahko prizadeta zaradi delovanja mikroorganizmov, kar se največkrat zgodi v začetni fazi procesa (Hedges 2002, 321). Posledica delovanja organizmov je izguba organ- skega dela kosti ter reorganizacija minerala (Hedges 2002, 321–322; Jans et al. 2004, 87–88). Do propadanja kolagena lahko pride tudi s kemično hidrolizo peptidnih vezi. Proces zahteva svoj čas in je značilen za geokemič- no stabilna okolja, vendar je lahko močno pospešen v primeru visokih temperatur in okolij z izredno nizkimi ali visokimi pH vrednostmi (Collins et al. 2002, 387). Kemična hidroliza pripelje do denaturacije kolagena v želatino, ki se izluži iz kosti (Collins et al. 1995, 181; isti 2002, 387). Poleg mikroorganizmov spremembe v mine- ralu najpogosteje povzroča voda. Interakcija med kostjo in vodo namreč vodi v raztapljanje in rekristalizacijo mi- neralnih kristalov ter absorpcijo ionov iz okolja. Končni rezultat je ali popolno izginotje kosti ali njena poviša- na kristaliničnost (Hedges, Millard 1995; Smith 2002, 29–30). Omeniti velja, da tesen odnos med mineralom in kolagenom predstavlja njuno vzajemno zaščito, ključno za dolgoročno ohranitev kosti. Izguba enega ali drugega vodi v dodatno izpostavljenost tafonomskim spremem- bam ter hitrejši propad (Hedges, Millard 1995; Nielsen Marsh, Hedges 2000; Jackes et al. 2001; Collins et al. 2002; Trueman et al. 2004; Jans 2005). Poseben tafonomski proces predstavljajo izredne oko- liščine izpostavitve kosti visokim temperaturam. Izpo- stavitev v osnovi povzroči izgubo vode (100–600 °C), razgradnjo in izgubo organskih snovi (300–800 °C) ter povečanje kristaliničnosti (500–1100 °C). Končne posle- dice izpostavitve so vendarle lahko raznolike, odvisne od začetnega stanja kosti (prisotnost/odsotnost mehkega tki- va), višine temperatur ter načina in časa izpostavljenosti (Thompson 2004, 204; Koon 2006, 31). FTIR spektroskopija kosti Prepoznavanje funkcionalnih skupin v kosti V kosti so prisotne različne funkcionalne skupine, v glavnini vezane na mineral, kolagen in lipide. Skupini PO 4 in CO 3 predstavljata hidroksiapatit, prepoznaven pri valovnih dolžinah 500–700 cm -1 in 900–1500 cm -1 , ko- lagen je prek amidnih skupin I–III, A in B prepoznaven pri dolžinah 1200–1700 cm -1 in 3000–3700 cm -1 , medtem ko gre lipide s skupinami CH 2 , CH 3 in CO prepoznati pri dolžinah 700–1800 cm -1 in 2800–3000 cm -1 . Pri tem je treba omeniti nekaj prekrivanj. V območju med 500 in 700 cm -1 del trakov tvorijo tudi amidi IV–VII, v obmo- čju med 1300 in 1600 cm -1 so prisotne skupine minerala, amidov in lipidov, prekrivanje pa je prisotno tudi v sku- Uporaba FTIR spektroskopije za analizo kosti iz arheoloških okolij Tabela 1. Funkcionalne skupine v kosti. Table 1. Functional groups in bone. Valovna dolžina / Wavelenght (cm -1 ) Mineral / Mineral Kolagen / Collagen Lipidi / Lipids ~ 560 PO 4 Amide IV–VII ~ 600 PO 4 ~ 720 CH 2 ~ 870 CO 3 ~ 1016 PO 4 ~ 1175 CO ~ 1395 CH 2 + CH 3 ~ 1415 CO 3 ~ 1455 CO 3 CH 2 ~ 1465 CH 2 + CH 3 ~ 1245 Amide III (CN, NH) ~ 1550 Amide II (NH, CN) ~ 1650 Amide I (CO) ~ 1745 CO ~ 2850 CH 2 CH 2 ~ 2920 CH 2 CH 2 ~ 3080 Amide B ~ 3290 Amide A 79 pinah kolagena in lipidov 1 v območju med 2800 in 3000 cm -1 (tabela 1; sliki 4 in 5) (Figueiredo et al. 2014, 322; Prinsloo et al. 2014, 735). Pridobitev informacij Večina trakov kostnega spektra je sestavljena iz več funkcionalnih skupin. Njihova ločitev na posamezne komponente je z odvajanjem sicer mogoča, vendar zgolj na osnovi visoko kakovostnega spektra z nizkim šumom in dobrim razumevanjem v vzorcu prisotnih molekul (Pe- tibois et al. 2009, 510–511). Odvajanje je tako precej te- žavno, posebej v primeru kosti iz arheoloških kontekstov. Zaradi podvrženosti tafonomiji njihova sestava namreč ni povsem jasna. Tako pridobljeni spektri običajno niso uporabljeni v absolutnem smislu, temveč služijo kot iz- hodišče različnim primerjavam med vzorci in znotraj njih (Figueiredo et al. 2012, 324). Na osnovi primerjav je mogoče pridobiti informacije o kri- staliničnosti minerala (Weiner, Bar-Yosef 1990), vsebnosti karbonatov (Wright, Schwarcz 1996), vsebnosti organskih snovi (Trueman et al. 2004; Grecu et al. 2007) ter razmerju med organskimi in anorganskimi snovmi v kosti (Trueman et al. 2004; Thompson et al. 2009). Če je odvajanje ven- darle uporabljeno, FTIR spekter lahko poda natančnejše 1 Lipidi presegajo okvir tega članka in nadalje ne bodo obravnavani. informacije o strukturnih spremembah v mineralu in kola- genu (Trueman et al. 2004; Lebon et al. 2008; Chadefaux et al. 2009; Anastassopoulou et al. 2015). Kristaliničnost Kristaliničnost minerala je pogojena z velikostjo kristalov in urejenostjo kristalne mreže (Winer, Bar-Yosef 1990, 189–190). Tafonomija kosti vpliva na obe lastnosti, ki tako omogočita zaznavo sprememb. V FTIR spektru je kristaliničnost izražena z vrhovi trakov PO 4 pri ~ 560 in ~ 600 cm -1 in njunim delitvenim dejavnikom (splitting factor – SF) (Weiner, Bar-Yosef 1990, 189–190). Ra- ziskave poročajo o gibanju SF vrednosti moderne kosti med 2,5 in 4 (Wright, Schwarcz 1996; Berna et al. 2004; Thompson et al. 2009; Hollund et al. 2013; Beasley et al. 2014). Ker SF odraža rast kristalov, se njegova vred- nost s tafonomskimi spremembami v kosti viša (Wright, Schwarcz 1996, 936; Berna et al. 2004, 879). Urejenost mreže je mogoče ugotavljati z razmerjem med vrhovi trakov PO 4 pri valovni dolžini 1030 cm -1 in 1020 cm -1 . Razmerje 1030/1020 namreč odraža odnos med ne- stehiometričnimi in stehiometričnimi apatiti v mineralu (Paschalis et al. 1996, 482) ter apatitnimi in neapatitni- mi okolji kristalov (Farlay et al. 2010, 435). V moder- nih kosteh je vrednost razmerja okrog 1,12 (Lebon et al. Arheo 33, 2016, 75–93 Slika 4. FTIR spektri kortikalne kosti, hidroksiapatita in kolagena tipa I (Figueiredo et al. 2014, 321, sl. 4). Figure 4. FTIR spectra of the cortical bone, hydroxyapatite and type I collagen (Figueiredo et al. 2014, 321, Fig. 4). Slika 5. FTIR spekter maščobe (Prinsloo et al. 2014, 736, sl. 6c). Figure 5. FTIR spectrum of fat (Prinsloo et al. 2014, 736, Fig. 6c). 80 2010, 2269). Ker tafonomski procesi vodijo v nižjo raven nestehiometričnih apatitov in neapatitnih okolij, naraslo razmerje 1030/1020 odraža izboljšano urejenost mineral- ne mreže (Lebon et al. 2010, 2267–2268). Vsebnost karbonatov Vsebnost karbonatov v mineralni strukturi kosti se spre- minja s tafonomskimi procesi. Ocena njihove vsebnosti je podana z razmerjem med vrhom traku CO 3 pri ~ 1035 cm -1 in vrhom traku PO 4 pri ~ 1415 cm -1 (Wright, Sch- warcz 1996, 936). Raziskave poročajo o vrednosti mo- derne kosti med 0,22 in 0,4 (Wright, Schwarcz 1996; Nielsen Marsh, Hedges 2000; Garvie Lok et al. 2004). Nižje razmerje C/P nakazuje na raztapljanje in obarjanje fosfatov ali na raztapljanje in obarjanje strukturnih kar- bonatov. Višje razmerje C/P je vezano na zamenjavo fos- fatov s karbonati ali na raztapljanje in obarjanje fosfatov (Thomas et al. 2007, 1536). Pri interpretaciji je potrebne nekaj pazljivosti, saj sočasni pojav več omenjenih proce- sov lahko pripelje do na videz nespremenjenih vrednosti razmerja C/P in s tem prikrije spremembe (Nielsen Mar- sh, Hedges 2000, 1144). Strukturne spremembe minerala Spremembe v mineralni mreži so opazne tudi prek vrha traku PO 4 , ki je v modernih vzorcih viden pri valovni dolžini ~ 960 cm -1 (Pasteris et al. 2004, 232; Lebon et al. 2010, 2268). Izmenjave ionov v mineralni mreži pov- zročijo premik vrha na druge valovne dolžine. Pozitivni premik tako odraža izgubo karbonatov in/ali vključeva- nje fluora v mrežo, ki je posledično bolj urejena (Lebon et al. 2010, 2273). Vsebnost kolagena Ocena vsebnosti kolagena je izražena z razmerjem med vrhom traku amida I pri ~ 1660 cm -1 ter vrhom trakov PO 4 pri ~ 1035 cm -1 (Am/P) in CO 3 pri ~ 1415 cm -1 (Am/C). Značilne vrednosti AmI/P modernih kosti nihajo med 0,1 in 0,3 (Trueman et al. 2004, 726; Hollund et al. 2013, 516–519; Lebon et al. 2016, 14), medtem ko se vrednosti AmI/C gibljejo okrog ~ 1,1 (Thompson et al. 2013, 420). Izguba kolagena se odraža v manj intenzivnem vrhu ami- dnega traku in s tem v nižjem razmerju Am/P oz. Am/C (Trueman 2004, 726; Thompson et al. 2013, 419–420). Strukturne spremembe kolagena Strukturne anomalije kolagenskih proteinov so vidne v razmerju med amidom I in amidom II, ki je v moder- ni kosti med 0,6 in 1,1. Ker je slednji bolj občutljiv v primerjavi s prvim (Anastassopoulou et al. 2015, 93), se njuno razmerje s tafonomskimi procesi niža (Leskovar 2016, 77). Odvajanje traku amida I (tabela 2) in III raz- Uporaba FTIR spektroskopije za analizo kosti iz arheoloških okolij Tabela 2. Posamezne komponente traku amida I. Table 2. Components of the Amide I band. Valovna dolžina / Wavelenght (cm -1 ) Posamezne komponente / Components ~ 1610 Denaturirani kolagen / Denatured collagen ~ 1630 Denaturirani kolagen / Denatured collagen ~ 1643 Upogibanje molekule H 2 O / H 2 O bending ~ 1650 Denaturirani kolagen Denatured collagen ~ 1660 α vijačnice / α helix ~ 1668 Nepripisano / Non attributed ~ 1674 Karbonske skupine lateralnih verig / Carbonyl groups from collagen lateral groups ~ 1681 Denaturirani kolagen / Denatured collagen ~ 1690 Vijačnice kolagenu podobnih peptidov / Helices of aggregated collagen-like peptides ~ 1697 Nepripisano / Non attributed Tabela 3. Zamenjave v mineralni mreži ob izpostavitvi kosti visokim temperaturam. Table 3. Substitutions in the bone mineral matrix due to high temperature exposure. Valovna dolžina / Wavelenght (cm -1 ) Zamenjava / Substitution ~ 880 Karbonat zamenja OH skupino – enojni trak / Carbonate substitution of the OH group – single band ~ 1450, ~ 1545 Karbonat zamenja OH skupino – dvojni trak / Carbonate substitution of the OH group – double band ~ 875, ~ 1410, ~ 1455 Karbonat zamenja fosfatno skupino – enojni trak / Carbonate substitution of the phosphate group – single band 81 deli osnovni absorpcijski trak na posamezne komponen- te (Payne, Veis 1988; Renugopalakrishnan et al. 1989; Prystupa, Donald 1996; Chang, Tanaka 2002; Habermehl et al. 2005; Barth 2007; Chadefaux et al. 2009) (tabela 2). Pri tafonomskih procesih običajno pride do denatura- cije kolagena, ki jo je mogoče opaziti v razmerju med komponento ~ 1660 in ~ 1630 cm -1 (60/30) znotraj amida I ter komponento ~ 1237 in 1270 cm -1 (37/70) znotraj amida III (Habermehl et al. 2015, 825–826; Leskovar 2016, 78). Komponenti ~ 1660 in ~ 1270 cm -1 namreč odražata α vijačnice, zatorej njuna izguba nakazuje dena- turacijo kolagena (Chi et al. 1998, 2858; Chang, Tanaka 2002, 4817; Habermehl et al. 2005, 824–825). Do opaznih sprememb v strukturi kosti pride tudi ob iz- postavitvi kosti visokim temperaturam. Pri valovnih dol- žinah 880, 1450 in 1545 cm -1 je OH skupina v mineralu nadomeščena s karbonatno skupino, pri valovnih dolži- nah 1455, 1410 in 875 cm -1 pa karbonat zamenja fosfatno skupino (tabela 3). Poleg tega temperature pod 400 °C močneje vplivajo na razmerja C/P, AmI/C in AmI/P ter na širino PO 4 traku pri valovni dolžini ~ 1035 cm -1 , tempera- ture med 400 in 700 °C na SF in širino PO 4 traku pri va- lovni dolžini ~ 1035 cm -1 , temperature nad 700 °C pa na razmerje C/P ter razmerje med vrhovoma traku pri 625 in 610 cm -1 . Omeniti velja še, da se slednja dva trakova po- javita šele pri izpostavitvi kosti nad 700 °C (Thompson et al. 2013, 418–419). Primer analize Z namenom prikaza uporabnosti FTIR spektroskopije za vpogled v stanje ohranjenosti kosti so bila opravljena FTIR skeniranja različnih vzorcev. Skenirani so bili vzo- rec sveže kosti ter vzorci kosti, izpostavljenih različnim tafonomskim procesom (Leskovar 2016, 27–28). Metodologija Vzorci Analizirani vzorci (tabela 4) izvirajo iz raziskav z na- mensko, nadzorovano izpostavitvijo vzorcev agresivnim Arheo 33, 2016, 75–93 Vzorec / Sample Kost / Bone Izpostavljenost / Exposure F1 moderna ovčja brez / none F1D moderna ovčja visok hidravlični potencial / high hydraulic conductivity (D) F1pH moderna ovčja pH 3 (pH) A1 arheološka ovčja arheološko okolje / archaeological context A2 arheološka človeška kremacija / cremation Tabela 4. Analizirani vzorci. Table 4. Analysed samples. Slika 6. Sveža ovčja dolga kost. Figure 6. Fresh long bone of a sheep. Slika 7. Arheološka ovčja dolga kost. Figure 7. Archaeological long bone of a sheep. Slika 8. Žgana človeška kost. Figure 8. Cremated human bone. 82 okoljem ter z arheoloških najdišč. V primeru prvih gre za svežo kost ovce (slika 6), izpostavljeno okolju z viso- kim hidravličnim potencialom (D) in okolju z nizko pH vrednostjo (pH). Arheološka vzorca predstavljata dobro ohranjeno ovčjo kost (sliki 7, 9) z rimskodobnega najdi- šča (A1) ter del človeške žganine (slika 8) s prazgodovin- skega najdišča (A2). Deblo moderne ovčje kosti je bilo razrezano na 3 mm debele preseke. Dva izmed presekov sta bila šest tednov izpostavljena okolju z visokim hidravličnim potencia- lom in okolju s pH vrednostjo 3. Po izpostavitvi sta bila oba preseka očiščena z deionizirano vodo ter posušena na zraku. FTIR snemanje je bilo brez dodatnih priprav opravljeno na enem neizpostavljenem preseku ter obeh izpostavljenih presekih. Uporaba FTIR spektroskopije za analizo kosti iz arheoloških okolij Slika 9. Preseki arheološke ovčje kosti. Figure 9. Cross-sections of the archaeological sheep bone. 1220 1240 1260 1280 1300 1320 0,00 0,01 0,02 1267,7 1237,3 -1 F1N Valovna dolžina / Wavelength (cm ) Absorbanca / Absorbance Valovna dolžina / Wavelength (cm ) 2nd Deriv Absorbanca / Absorbance Slika 10. Izmera višin vrhov trakov pri ~ 1237 in ~ 1270 cm -1 . Figure 10. Measuring peak heights at ~ 1237 and ~ 1270 cm -1 . Slika 11. Odvajanje in pridobitev posameznih komponent traku amida I. Figure 11. Differentiation and determination of the Amide I band components. 83 Arheološka ovčja kost je bila razrezana na 3 mm debele preseke (slika 9). Snemanje je bilo opravljeno brez na- daljnjih priprav. Arheološka žgana kost je bila posneta brez predhodnih priprav. Snemanje in obdelava podatkov FTIR snemanje je bilo opravljeno s tehniko ATR. Upora- bljen je bil spektrometer PerkinElmer s pripadajočo pro- gramsko opremo. Vsi vzorci so bili skenirani v območju 4000–400 cm -1 . Opravljenih je bilo 32 skeniranj vsakega vzorca z resolucijo 4 cm -1 in intervalom 0,1 cm -1 . Ske- niranje posameznega vzorca je bilo ponovljeno trikrat. Za nadaljnje analize je bilo uporabljeno povprečje vseh treh skeniranj. Pridobljeni podatki so bili nato obdelani s programsko opremo Origin Pro 2016, s katero so bili opravljeni odvajanje in izmere višin vrhov (slika 10) ter površin komponent (slika 11). Na osnovi enačb (tabela 5) je bil za izračun razmerij uporabljen program Microsoft Office Excel. Rezultati Spekter Izpostavitev vzorcev tafonomskim procesom je povzročila številne spremembe (priloga 1). V pH okolju so vidne iz - gube PO 4 in CO 3 trakov na valovnih dolžinah med 500 in 1200 cm -1 . V okolju pH je opazna izguba dihotomije trakov amida III in CO 3 na valovnih dolžinah med 1200 in 1500 cm -1 ter izguba CH 2 in CO trakov med 700 in 1800 cm - 1 . Arheološki vzorec A1 kaže dobro ohranjenost z rahlim nižanjem in izgubo dihotomije vrhov amidov. Vzorec A2, izpostavljen visokim temperaturam, odraža predvsem izgu- bo trakov organskega dela kosti ter večjo izrazitost trakov minerala. Opaziti gre tudi dodaten vrh pri ~ 620 cm -1 . PO 4 trak z vrhom pri ~ 960 cm -1 Valovna dolžina vrha traku pri 960 cm -1 modernega neiz- postavljenega vzorca je bila 960 cm -1 . Z izpostavitvijo vzorca okolju D se ni spremenila. Z izpostavitvijo okolju pH se je vrh premaknil na 937 cm -1 . Valovna dolžina vrha v arheološki kosti je bila rahlo nižja od tiste v sveži kosti, medtem ko je bila v žganem vzorcu rahlo višja (tabela 6). Razmerja V primerjavi s svežim vzorcem je bil SF v vseh preosta- lih vzorcih povišan, najočitneje v žgani kosti. Razmerje 1030/1020 je bilo opazno spremenjeno v vzorcu, izposta- vljenem okolju pH, ter v žganem vzorcu. Razmerje C/P se je v okolju D in pH povišalo, izrazito v slednjem. V arheoloških vzorcih je razmerje v primerjavi s svežo ko- stjo nižje. Podoben trend je zaslediti v AmI/P in AmI/C, z izjemo AmI/C v vzorcu A1, ki je bilo povišano. Raz- merji AmI/AmII in AmI/AmIII sta bili v vseh primerih povišani v primerjavi s svežo kostjo, medtem ko sta bili razmerji 37/70 in 60/30 nižji. Izjemi sta le razmerje 60/30 v vzorcu A1, ki je bilo povišano, ter žgan vzorec A2, pri katerem vrhovi, potrebni za izmere, niso bili več razpo- znavni (tabela 7). Arheo 33, 2016, 75–93 Tabela 5. Uporabljene enačbe za izračun razmerij. H = največja višina vrha traku, A = površina komponente traku. Table 5. Equations for the ratio calculations. H = maximum band height, A = area of the band component. Razmerje / Ratio Vrhovi / Peaks Enačba / Equation SF ~ 560, ~ 600 in vmesni minimum ~ 590 cm -1 H ~ 600 + H ~ 560 H ~ 590 P/P 1020 in 1030 cm -1 H 1030 /H 1020 C/P ~ 1016 in ~ 1415 cm -1 H 1415 /H 1016 AmI/P ~ 1016 in ~ 1650 cm -1 H 1650 /H 1016 AmI/C ~ 1415 in ~ 1650 cm -1 H 1650 /H 1415 AmI/AmII ~ 1550 in ~ 1650 cm -1 H 1650 /H 1550 AmI/AmIII ~ 1237 in ~ 1650 cm -1 H 1650 /H 1237 37/70 ~ 1237 in ~ 1270 cm -1 H 1237 /H 1270 60/30 ~ 1660 in ~ 1630 cm -1 A 1660 /A 1630 Tabela 6. Točne valovne dolžine vrha traku ~ 960 cm -1 analiziranih vzorcev. Table 6. Exact wavelengths of the analysed ~ 960 cm -1 band samples. VZOREC / SAMPLE TOČNA V ALOVNA DOLŽINA PO 4 PRI ~ 960 cm -1 / EXACT WA VELENGTH OF THE PO 4 AT ~ 960 cm -1 F1N 960 F1D 960 F1pH 937 A1 958,5 A2 961 84 Diskusija Primerjava med svežo kostjo in kostmi, izpostavljenimi različnim tafonomskim procesom, izraža jasne razlike v ohranjenosti kolagena in minerala. Neposredna primer- java pridobljenih spektrov je nekoliko otežena zaradi raznolike absorpcije vsakega izmed vzorcev. Tako kaže zgolj grob vpogled v spremembe, ki ga je treba podpreti z izračunanimi razmerji. Spremembe v mineralu Spremembe v mineralu so najočitnejše v vzorcu, izpo- stavljenem okolju z nizko pH vrednostjo. Kislo okolje je namreč povzročilo izgubo trakov funkcionalnih skupin minerala, kar kaže na raztapljanje le-tega (Smith 1999, 19). Slednje je mogoče potrditi s primerjavo pridoblje- nega spektra s primerom spektra vzorca čistega kolagena ter vzorca kolagena z manj kot 50 % kalcijevega fosfata (sliki 12–13). SF vzorca, izpostavljenega kislemu okolju, ni bilo moč izračunati zaradi izgube vrhov trakov, med- tem ko razmerja med mineralom in kolagenom kažejo izrazito povečanje koncentracij slednjega. Natančnejši vpogled v razmerja razkriva izgubo neapatitnih okolij in večje koncentracije strukturnih karbonatov. Vzorec s tem odraža raztapljanje vseh vrst mineralnih kristalov, tudi osnovnih fosfatnih gradnikov. Porast karbonatov je namreč moč obrazložiti zgolj z raztapljanjem fosfata (Thomas et al. 2007, 1536). Pridobljeni rezultati se tako ujemajo z drugimi raziskavami vpliva kislih okolij na strukturo kosti (Figueiredo et al. 2011; El-Bassyouni et al. 2013). Spekter vzorca, izpostavljenega okolju z visokim hidrav- ličnim potencialom, ne kaže primerljivo izrazitih razlik kot vzorec izpostavljen kislemu okolju. Tako je upora- ba razmerij toliko bolj potrebna. Razmerja prikazujejo pričakovano rast velikosti kristalov (Wright, Schwarcz 1996, 936; Berna et al. 2004, 879), zanemarljive razlike v neapatitinih okoljih ter dvig koncentracij strukturnih karbonatov. Slednje je mogoče razložiti ali z zamenjavo fosfatov s karbonati ali z raztapljanjem in izgubo prvih (Thomas et al. 2007, 1536). Glede na to, da je govora o okolju z visokim hidravličnim potencialom, je verjet- nejša druga možnost. Hiter pretok vode bi namreč težko Tabela 7. Rezultati izračunanih razmerij za posnete vzorce. Table 7. Results of the analysed sample ratios. Slika 12. FTIR spekter čistega kolagena (a), kolagena s 50 % kalcijevega fosfata (b) ter kolagena s 70 % kalcijevega fosfata (c) (Zhang et al. 2003, 1053, Fig. 3). Figure 12. FTIR spectra of pure collagen (a), collagen with 50 % of calcium phosphate (b), and collagen with 70 % of calcium phosphate (c) (Zhang et al. 2003, 1053, Fig. 3). Uporaba FTIR spektroskopije za analizo kosti iz arheoloških okolij VZOREC / SAMPLE SF 1030/1020 C/P AmI/P AmI/C AmI/AmII AmI/AmIII 37/70 60/30 F1N 3.62 0.93 0.27 0.21 0.76 0.61 1.54 0.78 0.59 F1D 4.28 0.92 0.31 0.39 1.23 0.76 4.36 0.48 0.29 F1pH NO 1.24 0.56 3.27 5.80 0.66 3.12 0.287 0.24 A1 5.62 0.90 0.23 0.19 0.84 0.71 3.95 0.4211 1.12 A2 6.05 1.02 0.07 0.03 0.47 / / / / 85 dopuščal rekristalizacijo. Veliko bolj verjetna je možnost raztapljanja in odnašanja mineralnih kristalov iz kosti. Primerjava med svežo in arheološko kostjo A1 prikazuje dobro ohranjenost slednje z zanemarljivimi sprememba- mi v trakovih minerala. Boljšo sliko predstavijo razmerja, ki kažejo pričakovano rast kristalov (Wright, Schwarcz 1996, 936; Berna et al. 2004, 879) in izgubo karbona- tov. Slednja odraža arheološko okolje, ki ni dopuščalo izrazite izgube fosfatnih ionov na račun raztapljanja ali izmenjave s karbonatnimi ioni iz okolja (Nielsen-Marsh, Hedges 2000, 1144; Thomas et al. 2007, 1536). Vzorec, izpostavljen visokim temperaturam, prikazuje izrazite PO 4 trakove in pridobitev traku z vrhom pri ~ 620 cm -1 . Razmerja odražajo pričakovano rast kristalov (Wright, Schwarcz 1996, 936; Berna et al. 2004, 879) ter bolje urejeno kristalno mrežo zaradi izgube neapatit- nih okolij in karbonatov (Lebon et al. 2010, 2267–2270). Omenjeni trak ~ 620 cm -1 nadalje nakazuje na izpostavl- jenost kosti temperaturam, višjim od 700 °C (Thompson et al. 2013, 418–419). Nekoliko bolj kompleksen je premik vrha traku pri ~ 960 cm -1 . Lebon et al. (2010) govorijo o pozitivnem premiku vrha z vse bolj urejeno kristalno mrežo. Pri tem za dovolj pomembno označijo spremembo, večjo od 1 cm -1 . V pri- čujoči raziskavi se je vrh traku vzorca, izpostavljenega kislemu okolju, izrazito premaknil na nižjo valovno dol- žino. Premik tako lahko odraža že prikazano raztapljanje minerala in s tem manj urejeno kristalno mrežo. Premik v žganem vzorcu A2 je skladen z Lebnovo teorijo, saj se je vrh premaknil v pozitivno smer. Neskladen pa je negativen premik vrha dobro ohranjenega arheološkega vzorca A1. Po teoriji bi bilo namreč pričakovati pozitiven premik. Razlago gre morda iskati v vzpostavitvi Lebno- ve teorije zgolj na osnovi kosti, izpostavljenih visokim temperaturam, ter kosti pleistocenske starosti. Seveda je vzorec premajhen za oprijemljive zaključke. Vendar vel- ja omeniti, da je bil trend negativnega premika opazen tudi na drugih rimskodobnih arheoloških vzorcih (Les- kovar 2016, 56). Morda gre za odraz različnega vpliva tafonomskih sprememb na kosteh, pogojenega bodisi z okoljem bodisi s časom. Spremembe v kolagenu V vzorcu, izpostavljenem kislem okolju, so trakovi ami- dov narasli, kar odraža izgubo minerala s posledično po- višanimi koncentracijami kolagena (Zhang et al. 2003). Večje koncentracije kolagena so bile nadalje potrjene s povišanimi razmerji med mineralom in amidi. Podrob- nejši vpogled v razmerja med amidi in njihovimi kom- ponentami vendarle kaže na strukturne spremembe v ko- lagenu oz. njegovo denaturacijo (Chi et al. 1998, 2858; Chang and Tanaka 2002, 4817; Habermehl et al. 2005, 824–825; Anastassopoulou et al. 2015, 93). Visoko hi- dravlično okolje je povzročilo izpiranje kolagena iz kosti, kar je vidno tako v izgubi trakov spektra kot v razmerjih med posameznimi amidi. Podobno kot v kislem okolju so tudi v visoko hidravličnem okolju opazne strukturne spremembe kolagena. V kolagenu opazne spremembe gre povezati z že omenjenim izpiranjem minerala, saj po- trjuje teorije o medsebojni odvisnosti minerala in kolage- na v kontekstu njune ohranitve (Hedges, Millard 1995; Nielsen-Marsh, Hedges 2000; Jackes et al. 2001; Collins et al. 2002; Trueman et al. 2004; Jans 2005). V arheološkem vzorcu A1 gre sicer opaziti nekaj izgub amidov, vendar so te majhne, najočitnejše v traku amida III. Primerjava vrhov trakov amidov z vrhovi trakov mi- neralov je skladna z dobro ohranjenimi fosfatnimi funk- cionalnimi skupinami ter nekaj izgubami karbonatov. Opaziti gre tudi izrazite spremembe v komponentah ami- da II, ki kažejo denaturacijo kolagena. Težavo predstavlja nepričakovano visoko razmerje 60/30 med komponenta- mi amida I. Denaturacija kolagena bi namreč morala po- Arheo 33, 2016, 75–93 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 Absorbanca / Absorbance Valovna dolžina / Wavenumbers (cm -1 ) F1pH Slika 13. FTIR spekter moderne ovčje kosti, izpostavljene kislemu okolju. Figure 13. FTIR spectrum of a modern sheep bone exposed to an acidic environment. 86 kazati nizko razmerje, ne visokega. Najverjetneje gre za težavo, nastalo pri procesu odvajanja. Kot že omenjeno, so kompozitni (arheološki) vzorci lahko precej težavni za odvajanje, saj njihova struktura ni povsem jasna. Po- sebej težavna je prisotnost vode, ki lahko močno popači komponente, pridobljene z odvajanjem (Chadefaux et al. 2009, 324; Figueiredo et al. 2012, 134–135). Izpostavitev kosti visokim temperaturam je pričakovano povzročila popolno izgubo kolagena (Thompson 2004, 204), videno v številnih raziskavah (Lebon et al. 2008; Thompson et al. 2009; Lebon et al. 2010). Uporaba FTIR spektroskopije za analizo kosti iz arheoloških okolij Zaključki Namen članka je predstavitev uporabnosti FTIR spek- troskopije kot dopolnitve (osteo)arheoloških analiz. Opozoriti velja, da prikazani vzorci predstavljajo le ne- kaj primerov sprememb v pridobljenem spektru. Podane interpretacije tako ne temeljijo zgolj na predstavljenih vzorcih, temveč so osnovane na širšem ozadju teorij in predvsem drugih, večjih raziskav. Primerjave med spektri kosti različnega izvora jasno kažejo na možnosti, ki jih FTIR-ATR analize ponujajo. Prepoznati gre namreč številne kemične spremembe v mineralu in kolagenu, do katerih pride zaradi tafonom- skih procesov. Z dovolj dobrim zajemom podatkov je tako moč prepoznati izgube gradnikov kosti ali njihove strukturne spremembe. Tehnika s tem odpira številne možnosti prepoznavanja stanja ohranjenosti kosti in nji- hovega potenciala za nadaljnje analize (denimo analize izotopov ali aDNK), razumevanja vpliva tafonomije na kemično sestavo kosti ter vpliva okolja na tafonomski proces. Slednje nudi tudi možnost raziskave z nasprotne perspektive, torej interpretacije okolja, v katerem se je kost nahajala. Priloga 1. Spektri analiziranih kosti. Appendix 1. Spectra of the analysed bones. 87 Arheo 33, 2016, 75–93 Application of FTIR spectroscopy for analysing bones from archaeological contexts (Summary) be scanned in order to eliminate the IR absorbing atmos- pheric gases (CO 2 , water vapour) (Pavia et al. 2014, 25). Sample scanning is conducted by placing the sample onto the machine’s diamond crystal (Figure 1) and mak- ing sure that there is good contact between the sample and the crystal (Hollund et al. 2013; Beasley et al. 2014). Scanning setting differs based on sample properties and desired accuracy. For bone, scanning uses the middle wavelength spectrum between 4000 cm -1 and 400 cm -1 . The number of scans varies between 8 and 64, with a 2–8 cm -1 accuracy (Thompson et al. 2009, 911; Hollund et al. 2013, 512; Lebon et al. 2016, 3). The obtained spectrum is then processed using computer programs that allow for normalisation, baseline correction and noise cleaning (Figure 2). Bone composition and taphonomy Bone is a composite material with a complex hierarchi- cal structure. On the weight basis, 60% is represented by the inorganic phase, 30% by organic phase, while the re- maining 10% is water. The inorganic phase is composed of mineral crystals, formed by a non-stoichiometric calci- um hydroxyapatite, also known as bioapatite. The organ- ic phase corresponds to the proteins, mainly (85–90%) type I collagen, and a series of non-collagenous proteins (NCP) and lipids (Millard 2001; Clarke 2008). The collagen is made up of amino acids, forming left-hand- ed alpha chains/the amino acids forming left-handed alpha chains. They are folded into a right-handed tri- ple helical macromolecule (Ramachandran 1967, 225; Lodish et al. 2000, 217), maintained by the interaction and bonds between the amino acid residues of the ad- jacent side chains (Brodsky, Ramshaw 1997, 546). In the mineralised tissues, collagen is coated by the min- eral crystals (Fratzl, Weinkamer 2007, 1276). The small, flat plate calcium phosphate crystals form the poorly crystalline, non-stoichiometric calcium hydroxyapatite Ca 5 (PO 4 ) 3 OH (Landis et al. 1996, 206). The crystallites have a high surface area, making them very soluble and reactive (LeGeros, LeGeros 1984; Rey et al. 1990, 386; Currey 2002, 6). The reactivity is further increased by a non-apatitic hydrated layer on their surface (Figure 3), containing labile and easily exchangeable ions such as CO 3 , PO 4 and HPO 4 (Rey et al. 1990, 386; Cazalbou et al. 2004, 564). The contribution’s aim is to present FTIR-ATR spectros- copy and its applicability in osteoarchaeological analy- ses. It brings basic data on the technique, on the chemical composition of bone, the main taphonomic changes in bone and the methodology for obtaining and interpreting the obtained spectra. Fourier transformative infrared (FTIR) spectroscopy is a fast and informative technique for performing chemical analyses of different materials (Smith 1999, 1). From the archaeological standpoint, the technique is extremely in- teresting: it requires only small samples and is suitable for both organic and inorganic materials (Magaris 2014, 2890). Because of its wide applicability and the possibil- ity of avoiding sample destruction, the technique is often used for analysing human or/and animal osteological re- mains. As it offers an insight into the state of collagen and mineral in the sample, the obtained results shed light on the taphonomic changes in bone and the influences the environment has on these changes. FTIR spectroscopy It is used for analysing the structure of the molecules and material characterisation. It examines the interaction be- tween a molecule’s nuclear vibrations and electromag- netic radiation – the infrared light. The infrared radiation passing through the sample is either absorbed or trans- mitted, creating the sample’s unique molecular spectrum. The position, height and width of the peaks in the ob- tained spectra provide information on the presence and concentrations of the functional groups (e.g. C = O, CH 3 ) of molecules in the sample (Smith 1999, 15–18; Coates 2000, 3–6; Stuart 2004, 2). There are numerous techniques of FTIR spectroscopy, of which the transmission KBr and attenuated total re- flection or ATR are the most commonly used ones when dealing with archaeological finds. The former dominat- ed in the past, while the latter is being increasingly em- ployed today because of the possibility to analyse pow- dered or solid samples, the cost-effectiveness, as well as the readily comparable inter- and intra-sample results (Hollund et al. 2013; Beasley et al. 2014). Sample preparation for the FTIR-ATR technique is rel- atively simple. Solid samples can be analysed directly, while for the powder analysis samples need to be grind- ed. Before analysing the sample, the background has to 88 After the death of an organism, skeletal elements are ex- posed to taphonomic changes that result either in com- plete degradation or in fossilisation of the bones (Hedges 2002; Jans 2005; Nielsen-Marsh et al. 2007; Smith et al. 2007). The process is highly variable and complex, con- trolled by the bone’s intrinsic and environmental extrin- sic factors (Hedges, Millard 1995; Hedges 2002; Tütken, Vennemann 2011). In general, it involves changes to the mineral and the protein phase of the bone. Both can be altered due to microbial attack, causing a loss of organic matter and a reorganisation of the mineral (Hedges 2002, 321). Alteration and loss of collagen can also occur due to the chemical hydrolysis of the peptide bonds. The pro- cess depends upon time, water availability, temperature and the pH of the surrounding environment. Usually it is slow, characteristic of geochemically stable environments (Collins et al. 2002, 387). Regardless of the mechanism, the collagen is reduced to soluble gelatine and leached out of the bone (Collins et al. 1995, 181). Consequently, the bone’s physical and chemical integrity is severely af- fected and the bone is more vulnerable to other diagenetic processes (Hedges, Millard 1995; Jackes et al. 2001; Jans 2005). The alterations to the mineral occur because the bioapatite crystals are thermodynamically unstable and liable to change. Even though the microbial action can affect the mineral, most significant changes are caused by the interaction of the bone with the groundwater. The interaction causes dissolution, recrystallisation and exog- enous ion absorption (Hedges, Millard 1995). Distinctive taphonomic changes can be caused by the ex- posure of the bones to high temperatures. The exposure causes dehydration (100–600°C), the breakdown and loss of organic matter (300–800°C), followed by the al- teration and decomposition of the mineral (500–1100°C). The changes mainly depend on the initial state (e.g. fleshed or defleshed), the method of heating, tempera- tures and the time of exposure (Thompson 2004, 204; Koon 2006, 31). It is also worth knowing that collagen and mineral have an intimate relationship, providing their mutual protec- tion, essential for long-term survival. The mineral stabi- lises and protects the collagen against gelatinisation and microbial attack (Nielsen-Marsh et al. 2000b; Collins et al. 2002). On the other hand, degradation and loss of the collagen cause increased porosity (Nielsen-Marsh, Hedg- es 1999, 2000), exposing crystals to the dissolution and recrystallisation (Person et al. 1995; Trueman et al. 2004). Analysis of the bone FTIR spectra When analysing bone FTIR spectra, the PO 4 and CO 3 peaks of the hydroxyapatite are identifiable in the 500– 700 and 900–1500 cm -1 regions, the peaks corresponding to Amides I–III, A and B in the 1200–1700 and 3000– 3700 cm -1 regions, and the peaks characteristic of the lipids 2 in the 700–1800 and 2800–3000 cm -1 regions. Ad- ditionally, some overlapping has to be considered. In the 500–700 cm -1 region of the hydroxyapatite, a minor con- tribution from Amides IV–VII is present. Also, the peaks between 1300 and 1600 cm -1 result from a combination of the mineral, Amides and lipids (Table 1, Figures 4–5) (Figueiredo et al. 2014, 322; Prinsloo et al. 2014, 735). In the context of archaeological bones and their chemical composition, FTIR spectroscopy provides information on the crystallinity of the apatite (Weiner and Bar-Yosef 1990), the amount of carbonate (Wright, Schwarcz 1996), the amount of the organic matrix (Grecu et al. 2007) and the ratio of organic to inorganic components (Trueman et al. 2004; Thompson et al. 2009). Furthermore, a clos- er look at the peaks can reveal structural changes of the mineral and collagen (Trueman et al. 2004; Lebon et al. 2008; Chadefaux et al. 2009; Anastassopoulou et al. 2015). Example With the intention of presenting the usefulness of FTIR spectroscopy, fresh and archaeological sheep bone sam- ples and bone samples exposed to different taphonomic factors were analysed; the fresh bones derived from the butcher, the archaeological bones from an archaeological site. The exposed samples were subjected to aggressive environments with a high hydrological conductivity and a low pH. For the samples altered due to high tempera- tures, cremated human remains from an archaeological site were used (Table 4; Figures 6–9). The FTIR analysis of all the samples was performed in the Attenuated Total Reflectance (ATR) mode. Each sam- 2 Lipids were recognized using FTIR-ATR spectroscopy but will not be discussed further as they are beyond the scope of this contribution. Uporaba FTIR spektroskopije za analizo kosti iz arheoloških okolij 89 ple was scanned 32 times. Infrared spectra were obtained between 400 cm -1 and 4000 cm -1 , with a spectral reso- lution of 4 cm -1 and data interval of 0.1 cm -1 . For each sample, the scanning procedure was repeated three times. The obtained spectra were exported into OriginPro 2016 in order to analyse and measure the heights of the peaks (Figures 10–11). Based on the peak positions, the pres- ence of specific functional groups was determined. Peak position, height and width were examined. For more ob- jective analyses, ratios (Table 5) were calculated. Comparing the results obtained from the fresh samples and from the samples exposed to different taphonomic processes revealed clear differences in the collagen and mineral preservation. Due to the different absorption of the samples, the comparison of the spectra (Appendix 1) only offers a rough indication of the changes and is fur- ther examined using calculated rations (Table 7). Changes in the mineral show extreme losses in the low pH environment. The obtained spectrum is actually closely comparable to that of pure collagen and colla- gen with less than 50% of calcium phosphate (Figures 12–13). The mineral changes in the environment with a high hydraulic conductivity presented high losses of phosphates. The losses were caused by dissolution and removal of the crystals from the bone, combined with a lack of recrystallization due to water flow. The mineral in the archaeological sample was barely affected, pre- senting only slightly increased crystal size. Thus, a stable archaeological environment with minimal influences on the mineral dissolution and ion exchange was deduced. The spectrum of the samples exposed to high tempera- tures proved an exposure to temperatures above 700°C and a purification of the mineral lattice. Furthermore, the ~ 960 cm -1 peak positions (Table 6) in- dicated different effects of the bone mineral, determined by the environmental factors and/or time of exposure. Due to the loss of the mineral in the sample from the acidic environment, the collagen concentrations increased. How- ever, the structural components of the Amide I peak pre- sented collagen denaturation. High hydraulic conductivity caused a loss of collagen and its denaturation, which is in agreement with the loss of mineral and an interdependence between the mineral and collagen in the bone. A similar pattern is seen in the archaeological sample, where limited loss of collagen occurred. This is in accordance with only slightly affected mineral, offering further protection to the collagen. As expected, the exposure to high temperatures caused a complete loss of collagen. Conclusions The contribution presents the basic methodological pro- cedures for the FTIR-ATR spectroscopy in osteoarchaeo- logical analyses. Even though the included examples are limited, the usefulness of the technique is clear. It offers an insight into the chemical changes in the mineral and collagen caused by different taphonomic processes. The FTIR-ATR spectroscopy is thus opening up new possibil- ities for studying the preservation state of the bones and their potential for further analyses (e.g. isotopic aDNA). Furthermore, understanding the taphonomic processes, FTIR-ATR spectroscopy can provide means for deduc- ing the characteristics of the environment surrounding the bones in the past. Arheo 33, 2016, 75–93 90 Literatura / References ANASTASSOPOULOU, J., M. KYRIAKIDOU, S. KYRIAZIS, T. H. KORMAS, A. F. MA VROGENIS, V . DRITAS, P. KOLOVOU, T. THEOPHANIDES 2015, An FT-IR Spectroscopic Study of Metastatic Cancerous Bones. – V/In: T. Theophanides (ur. / ed.), Infrared Spec- troscopy - Anharmonicity of Biomolecules, Crosslinking of Biopolymers, Food Quality and Medical Applications, Rijeka, 89–100. BARTH, A. 2007, Infrared spectroscopy of proteins. – Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics 1767 (9), 1073–1101. BEASLEY , M. M., E. J. BARTELINK, L. TAYLOR, R. M. MILLER 2014, Comparison of transmission FTIR, ATR, and DRIFT spectra: implications for assessment of bone bioapatite diagenesis. – Journal of Archaeological Science 46, 16–22. BERNA, F., A. MATTHEWS, S. WEINER 2004, So- lubilities of bone mineral from archaeological sites: the recrystallization window. – Journal of Archaeological Science 31, 867–882. BESHAH, K., C. REY , M. J. GLIMCHER, M. SCHI- MIZU, R. G. GRIFFIN 1990, Solid state carbon-13 and proton NMR studies of carbonate-containing calcium phosphates and enamel. – Journal of Solid State Chemi- stry 84 (1), 71–81. BRODSKY , B., J. A. M. AMSHAW 1997a, The collagen triple-helix structure. – Matrix Biology 15, 545–554. BRODSKY , B., J. A. M. RAMSHAW 1997b, The colla- gen triple-helix structure. Germany. CAZALBOU, S., D. EICHERT, C. DROUET, C. COM- BES, C. REY 2004, Minéralisations biologiques à base de phosphate de calcium. – Comptes Rendus Palevol 3, 563–572. CHADEFAUX, C., A. S. LE HÔ, L. BELLOT-GURLET, I. REICHE 2009, Curve-fitting Micro-ATR-FTIR studies of the amide I and II bands of type I collagen in archae- ological bone materials. – e-PRESERVATION Science 6, 129–137; (http://www.morana-rtd.com/e-preservation- science/2009/Chadefaux-04-07-2008.pdf). CHANG, M. C., J. TANAKA 2002, FT-IR study for hy- droxyapatite/collagen nanocomposite cross-linked by glutaraldehyde. – Biomaterials 23, 4811–4818. CHI, Z., X. G. CHEN, J. S. W. HOLTZ, S. A. ASHER 1998, UV Resonance Raman-Selective Amide Vibratio- nal Enhancement: Quantitative Methodology for Deter- mining Protein Secondary Structure. – Biochemistry 37, 2854–2864. CLARKE, B. 2008, Normal Bone Anatomy and Physi- ology. – Clinical Journal of the American Society of Nephrology 3, 131–139. COATES, J. 2000, Interpretation of Infrared Spec- tra, A Practical Approach. – V/In: R. A. Meyers (ur./ ed.), Encyclopedia of Analytical Chemistry, Chichester, 10815–10837. COLLINS, M. J., C. M. NIELSENMARSH, J. HILLER, C. I. SMITH, J. P. ROBERTS, R. V . PRIGODICH, T. J. WESS, J. CSAPÒ, A. R. MILLARD, G. TURNER WALKER 2002, The survival of organic matter in bone: a review. – Archaeometry 44, 383–394. COLLINS, M. J., M. S. RILEY , A. M. CHILD, G. TUR- NER WALKER 1995, A Basic Mathematical Simulation of the Chemical Degradation of Ancient Collagen. – Journal of Archaeological Science 22, 175–183. CURREY , J. D. 2002, Bones: Structure and Mechanics. New Jersey. EFREMOV , I. 1940, Taphonomy: new branch of paleon- tology. – Pan-American Geologist 74, 81–93. EL-BASSYOUNI, G. T., O. W. GUIRGUIS, W. I. AB- DEL-FATTAH 2013, Morphological and macrostructural studies of dog cranial bone demineralized with different acids. – Current Applied Physics 13, 864–874. FARLAY , D., G. PANCZER, C. REY , P. D. DELMAS, G. BOIVIN 2010, Mineral maturity and crystallinity in- dex are distinct characteristics of bone mineral. – Journal of Bone and Mineral Metabolism 28, 433–445. FIGUEIREDO, M., S. CUNHA, G. MARTINS, J. FREI- TAS, F. JUDAS, H. FIGUEIREDO 2011, Influence of hydrochloric acid concentration on the demineralization of cortical bone. – Chemical Engineering Research and Design 89, 116–124. Uporaba FTIR spektroskopije za analizo kosti iz arheoloških okolij 91 FIGUEIREDO, M. M., J. A. F. GAMELAS, A. G. MAR- TINS 2012, Characterization of Bone and Bone-Based Graft Materials Using FTIR Spectroscopy. – V/In: T. Theophile, (ur./ed.), Infrared Spectroscopy - Life and Biomedical Sciences, Rijeka, 315–338. FRATZL, P., R. WEINKAMER 2007, Nature’s hierar- chical materials. – Progress in Materials Science 52, 1263–1334. GARVIE-LOK, S. J., T. L. V ARNEY , M. A. KATZEN- BERG 2004, Preparation of bone carbonate for stable isotope analysis: the effects of treatment time and acid concentration. – Journal of Archaeological Science 31, 763–776. GONG, J. K., J. S. ARNOLD, S. H. COHN 1964, Com- position of trabecular and cortical bone. – The Anatomi- cal Record 149, 325–331. GRECU, R., V . COMAN, V . A VRAM, M, BĂCIUŢ, G. BĂCIUŢ 2007, Bone Matrices of Different Origins Stu- died by FTIR Spectroscopy. – V/In: S. Vlad, R. V . Ciupa (ur./eds.), Proceedings of the 1st International Conferen- ce on Advancements of Medicine and Health Care throu- gh Technology, Cluj-Napoca, 429–432. HABERMEHL, J., J. SKOPINSKA, F. BOCCAFOSCHI, A. SIONKOWSKA, H. KACZMAREK, G. LAROCHE, D. MANTOV ANI 2005, Preparation of Ready-to-use, Stockable and Reconstituted Collagen. – Macromolecu- lar Bioscience 5, 821–828. HACKETT, C. J. 1981, Microscopical Focal Destruction (Tunnels) in Exhumed Human Bones. – Medicine, Scien- ce and the Law 21, 243–265. HEDGES, R. E. M. 2002, Bone diagenesis: an overview of processes. – Archaeometry 44-3, 319–328. HEDGES, R. E. M., A. R. MILLARD 1995, Bones and Groundwater: Towards the Modelling of Diagenetic Pro- cesses. – Journal of Archaeological Science 22, 155–164. HEDGES, R. E. M., A. R. MILLARD 1995, Measure- ments and Relationships of Diagenetic Alteration of Bone from Three Archaeological Sites. – Journal of Ar- chaeological Science 22, 201–209. HOLLUND, H. I., F. ARIESE, R. FERNANDES, M. M. E. JANS, H. KARS 2013, Testing an Alternative High-throughput Tool for Investigating bone Diagenesis: FTIR in Attenuated Total Reflection (ATR) Mode. – Ar- chaeometry 55, 507–532. HULMES, D. J. 2002, Building Collagen Molecules, Fibrils, and Suprafibrillar Structures. – Journal of Stru- ctural Biology 137, 2–10. JACKES, M., R. SHERBURNE, D. LUBELL, C. BAR- KER, M. WAYMAN 2001, Destruction of microstructure in archaeological bone: a case study from Portugal. – In- ternational Journal of Osteoarchaeology 11, 415–432. JANS, M. M. E. 2005, Histological characterisati- on of diagenetic alteration of archaeological bone. Amsterdam. JANS, M. M. E., C. M. NIELSEN-MARSH, C. I. SMITH, M. J. COLLINS, H. KARS 2004, Characterisa- tion of microbial attack on archaeological bone. – Jour- nal of Archaeological Science 31, 87–95. KOON, H. E. C. 2006, Detecting cooked bone in the ar- chaeological record: a study of the thermal stability and deterioration of bone collagen. Doktorska disertacija. Univerza v Yorku, York (neobjavljeno/unpublished). LANDIS, W. J. 1996, Mineral characterization in cal- cifying tissues: atomic, molecular and macromolecular perspectives. – Connective Tissue Research 34, 239–246. LANDIS, W. J., K. J. HODGENS, J. ARENA, M. J. SONG, B. F. McEWEN 1996, Structural relations bet- ween collagen and mineral in bone as determined by high voltage electron microscopic tomography. – Microsc Res Tech 33, 192–202. LEBON, M., I. REICHE, J. J. BAHAIN, C. CHADEFA- UX, A. M. MOIGNE, F. FRÖHLICH, F. Sé MAH, H. P. SCHWARCZ, C. FALGUÈRES 2010, New parameters for the characterization of diagenetic alterations and he- at-induced changes of fossil bone mineral using Fourier transform infrared spectrometry. – Journal of Archaeolo- gical Science 37, 2265–2276. LEBON, M., I. REICHE, F. FRÖHLICH, J. J. BAHAIN, C. FALGUÈRES 2008, Characterization of archaeologi- cal burnt bones: contribution of a new analytical protocol based on derivative FTIR spectroscopy and curve fitting of the ν 1 ν 3 PO4 domain. – Analytical and Bioanalyti- cal Chemistry 392, 1479–1488. Arheo 33, 2016, 75–93 92 LEBON, M., I. REICHE, X. GALLET, L. BELLOT- -GURLET, A. ZAZZO 2016, Rapid Quantification of Bone Collagen Content by ATR-FTIR Spectroscopy. – Radiocarbon 58, 131–145. LEGEROS, R. Z., J. P. LEGEROS 1984, Phosphate Mi- nerals in Human Tissues. – V/In: J. O. Nriagu, P. B. Mo- ore (ur./ed.), Phosphate Minerals, Berlin, 351–385. LESKOV AR, T. 2016, Insight into the Diagenesis of Fre- sh and Archaeological Sheep bone in Three Controlled Burial Environments. Master of Science, Univerza v Bra- dordu, Bradford (neobjavljeno/unpublished). LODISH, H., A. BERK, S. L. ZIPURSKY , P. MATSU- DAIRA, P. BALTIMORE, J. DARNELL 2000, Colla- gen: The Fibrous Proteins of the Matrix. New York. LOWENSTAM, H. A., S. WEINER, I. EBRARY 1989, On biomineralization. New York. MARGARIS, A. V . 2014, Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR): Applications in Archaeology. – V/ In: C. Smith (ur./ed.), Encyclopedia of Global Archaeo- logy, New York, 2890–2893. MILLARD, A. R. 2001, Deterioration of bone. – V/In: D. Brothwell, M. Pollard (ur./ed.), Handbook of Archaeolo- gical Sciences, Chichester, 633–643. NIELSEN-MARSH, C. M., R. E. M. HEDGES 2000, Patterns of Diagenesis in Bone I: The Effects of Site Environments. – Journal of Archaeological Science 27, 1139–1150. NIELSEN-MARSH, C. M., R. E. M. HEDGES, T. MANN, M. J. COLLINS 2000, A preliminary investiga- tion of the application of differential scanning calorimet- ry to the study of collagen degradation in archaeological bone. – Thermochimica Acta 365, 129–139. NIELSEN-MARSH, C. M., C. I. SMITH, M. M. E. JANS, A. NORD, H. KARS, M. J. COLLINS 2007, Bone diagenesis in the European Holocene II: taphonomic and environmental considerations. – Journal of Archaeologi- cal Science 34-9, 1523–1531. OLSZTA, M. J., X. CHENG, S. S. JEE, R. KUMAR, Y . Y . KIM, M. J. KAUFMAN, E. P. DOUGLAS, L. B. GOWER 2007, Bone structure and formation: A new perspective. – Materials Science and Engineering: Re- ports 58, 77–116. PASCHALIS, E. P., E. DiCARLO, F. BETTS, P. SHER- MAN, R. MENDELSOHN, A. L. BOSKEY 1996, FTIR microspectroscopic analysis of human osteonal bone. – Calcified Tissue International 59, 480–487. PASTERIS, J. D., B. WOPENKA, J. J. FREEMAN, K. ROGERS, E. V ALSAMI-JONES, J. A. M. V AN DER HOUWEN, M. J. SILV A 2004, Lack of OH in nanocry- stalline apatite as a function of degree of atomic order: implications for bone and biomaterials. – Biomaterials 25, 229–238. PA VIA, D. L., G. M. LAMPMAN, G. S. KRIZ, J. R. VYVYAN 2014, Introduction to Spectroscopy. Stamford. PAYNE, K. J., A. VEIS 1988, Fourier transform ir spec- troscopy of collagen and gelatin solutions: Deconvoluti- on of the amide I band for conformational studies. – Bio- polymers 27, 1749–1760. PETIBOIS, C., K. WEHBE, K. BELBACHIR, R. NO- REEN, G. Dé Lé RIS 2009, Current trends in the deve- lopment of FTIR imaging for the quantitative analysis of biological samples. – Acta Physica Polonica-Series A General Physics 115, 507–512. PRYSTUPA, D. A., A. M. DONALD 1996, Infrared stu- dy of gelatin conformations in the gel and sol states. – Polymer Gels and Networks 4, 87–110. RAMACHANDRAN, G. N. 1967, Treatise on collagen. London. RENUGOPALAKRISHNAN, V ., G. CHANDRAKA- SAN, S. MOORE, T. B. HUTSON, C. V . BERNEY , R. S. BHATNAGAR 1989, Bound water in collagen: evidence from Fourier transform infrared and Fourier transform infrared photoacoustic spectroscopic study. – Macromo- lecules 22, 4121–4124. REY , C., J. L. MIQUEL, L. FACCHINI, A. P. LE- GRAND, M. J. GLIMCHER 1995, Hydroxyl groups in bone mineral. – Bone 16, 583–586. REY , C., M. SHIMIZU, B. COLLINS, M. J. GLIMCHER 1990, Resolution-enhanced fourier transform infrared spectroscopy study of the environment of phosphate ions in the early deposits of a solid phase of calcium-phospha- Uporaba FTIR spektroskopije za analizo kosti iz arheoloških okolij 93 te in bone and enamel, and their evolution with age. I: Investigations in thev 4 PO 4 domain. – Calcified Tissue International 46, 384–394. SMITH, B. C. 1999, Infrared Spectral Interpretation: A Systematic Approach. Florida. SMITH, C. I. 2002, Modelling Diagenesis in Archaeolo- gical Bone. Newcastle. SMITH, C. I., C. M. NIELSEN-MARSH, M. M. E. JANS, M. J. COLLINS 2007, Bone diagenesis in the Eu- ropean Holocene I: patterns and mechanisms. – Journal of Archaeological Science 34, 1485–1493. STUART, B. H. 2004, Infrared Spectroscopy: Funda- mentals and Applications. Hoboken. SUROVELL, T. A., M. C. STINER 2001, Standardi- zing Infra-red Measures of Bone Mineral Crystallinity: an Experimental Approach. – Journal of Archaeological Science 28, 633–642. THOMAS, D. B., R. E. FORDYCE, R. D. FREW, K. C. GORDON 2007, A rapid, non-destructive method of detecting diagenetic alteration in fossil bone using Ra- man spectroscopy. – Journal of Raman Spectroscopy 38, 1533–1537. THOMPSON, T. J. U. 2004, Recent advances in the study of burned bone and their implications for foren- sic anthropology. – Forensic Science International 146, S203–S205. THOMPSON, T. J. U., M. GAUTHIER, M. ISLAM 2009, The application of a new method of Fourier Trans- form Infrared Spectroscopy to the analysis of burned bone. – Journal of Archaeological Science 36, 910–914. THOMPSON, T. J. U., M. ISLAM, M. BONNIERE 2013, A new statistical approach for determining the cry- stallinity of heat-altered bone mineral from FTIR spectra. – Journal of Archaeological Science 40, 416–422. TRUEMAN, C. N. G., A. K. BEHRENSMEYER, N. TUROSS, S. WEINER 2004, Mineralogical and com- positional changes in bones exposed on soil surfaces in Amboseli National Park, Kenya: diagenetic mechanisms and the role of sediment pore fluids. – Journal of Archa- eological Science 31, 721–739. TÜTKEN, T., T. W. VENNEMANN 2011, Fossil bones and teeth: Preservation or alteration of biogenic compo- sitions? – Palaeogeography, Palaeoclimatology, Palaeo- ecology 310, 1–8. WEINER, S., O. BAR-YOSEF 1990, States of preserva- tion of bones from prehistoric sites in the Near East: A su- rvey. – Journal of Archaeological Science 17, 187–196. WEINER, S., W. TRAUB 1992, Bone structure: from angstroms to microns. – The F ASEB Journal 6, 879–885. WRIGHT, L. E., H. P. SCHWARCZ 1996, Infrared and Isotopic Evidence for Diagenesis of Bone Apatite at Dos Pilas, Guatemala: Palaeodietary Implications. – Journal of Archaeological Science 23, 933–944. ZHANG, W., Z. L. HUANG, S. S. LIAO, F. Z. CUI 2003, Nucleation Sites of Calcium Phosphate Crystals during Collagen Mineralization. – Journal of the American Ce- ramic Society 86, 1052–1054. Arheo 33, 2016, 75–93