Pregledni œlanki - Review Articles Proteini sladkega okusa kot alternativna sladila Sweet-tasting proteins as alternative sweeteners Aleĝ Berlec, Borut Ĝtrukelj Povzetek: Sladek okus zbuja pri ljudeh prijetne obœutke, zato se sladkim jedem v prehrani nismo pripravljeni odreœi. Namizni sladkor (saharoza) je najpogosteje uporabljeno sladilo, ki pa ga pogosto povezujemo z doloœenimi zdravstvenimi tveganji, zlasti debelostjo, diabetesom in kariesom. K zmanjĝanju uporabe namiznega sladkorja bi lahko pripomogla veœja uporaba alternativnih sladil. Nekatera od njih predstavljamo v œlanku. Poseben razred alternativnih sladil tvorijo proteini sladkega okusa. Zaenkrat jih poznamo sedem (taumatin, monelin, brazein, pentadin, mabinlin, kurkulin, mirakulin) in so od nekaj sto do veœ tisoœkrat bolj sladki od saharoze. Njihova prednost sta tudi varnost in naraven izvor. Kljuœne besede: sladkor, saharoza, alternativna sladila, proteini sladkega okusa, taumatin, monelin, brazein Abstract: Sweet taste elicits pleasant feelings in humans and for this reason sweet-tasting food still represents an important part of our diet. Table sugar (sucrose) is the most widely used sweetener. It is often related to certain health risks, such as obesity, diabetes and caries. Greater use of alternative sweeteners could contribute to reduced use of table sugar. Most common alternative sweeteners are presented in the article. Sweet-tasting proteins represent a distinct class of alternative sweeteners. Currently, there are seven sweet-tasting proteins known (thaumatin, monellin, brazzein, pentadin, mabinlin, curculin, miraculin), which are several hundred to several thousand times sweeter than sucrose. Their advantages are safety and natural origin. Keywords: sugar, sucrose, alternative sweeteners, sweet-tasting proteins, thaumatin, monellin, brazzein 1 Uvod V vsakdanjem ĉivljenju pogosto enaœimo besedo ğsladkoĞ z neœim negativnim, celo pregreĝnim. Sladkor povezujemo s prekomernim vnosom kalorij, znan je njegov vpliv na karies. Pri diabetesu se njegov vnos nadzoruje in omejuje. Uporabo sladkorja bi lahko omejili na raœun veœje rabe alternativnih sladil. Vendar pa se tudi alternativna sladila pogosto povezuje z zdravstvenim tveganjem, zlasti za razvoj rakavih obolenj. Namen tega œlanka je razĝiriti vpogled v alternativna sladila, ĝe posebej v nekoliko manj znana, kot so proteini sladkega okusa. V ĉivljenju se vsakodnevno sreœujemo z izrazi sladkor, sladkorji, ogljikovi hidrati, umetna sladila, alternativna sladila. Ker so izrazi nekoliko dvoumni in se pogosto uporabljajo nepravilno, jih bomo uvodoma nekoliko natanœneje definirali. Beseda sladkorji se v najĝirĝem pomenu pogosto uporablja na nepravilen naœin za opis ogljikovih hidratov. V oĉjem pomenu se beseda sladkorji uporablja za enostavne ogljikove hidrate, ki so sladkega okusa, t. j. monosaharide (glukoza, fruktoza, galaktoza) in disaharide (saharoza, maltoza, laktoza, trehaloza). Beseda sladkor je v vsakodnevnem ĉivljenju sinonim za namizni, jedilni sladkor ali saharozo. Poleg sladkorjev se za slajenje zlasti v industrijskem merilu pogosto uporabljajo tudi umetna ali alternativna sladila. Izraz alternativna je mogoœe ustreznejĝi, saj vsa niso sinteznega ali polsinteznega izvora. 1.1 Snovi sladkega okusa Ljudje smo sposobni loœevanja med petimi razliœnimi okusi: sladkim, grenkim, kislim, slanim in okusom glutamata (umami, iz jap. umai, kar pomeni slasten) (1, 2). Snovi sladkega okusa zbujajo pri œloveku prijetne obœutke, za razliko od grenkih snovi, ki œloveka odvraœajo od zauĉitja. To dejstvo je evolucijskega pomena, saj omogoœa loœevanje visokokaloriœnih virov hrane (sladek okus) od potencialno toksiœnih snovi, npr. alkaloidov, ki so obiœajno grenki. Ljudje lahko loœimo tudi razliœne kvalitete sladkega okusa, kar pomeni, da lahko sladek okus ĝe dodatno opiĝemo. Nabor snovi sladkega okusa je zelo ĝirok. Snovi sladkega okusa so lahko anorganskega, naravnega ali sinteznega izvora in se po kemijski sestavi moœno razlikujejo. Nekatere (reprezentativne) snovi sladkega okusa so prikazane v preglednici 1, ki je prirejena po (3, 4). 1.2 Alternativna sladila Alternativna sladila lahko pomagajo pri uravnavanju telesne teĉe, nadzoru krvne ravni glukoze in prepreœevanju kariesa. Razdelimo jih lahko na poliole in alternativna sladila brez hranilne vrednosti. Sladkorni polioli so derivati sladkorjev in izkazujejo tudi podobno sladkost. Ker se iz œrevesja ne absorbirajo v popolnosti, so slabĝe dostopni kot vir energije. Za razliko od poliolov, alternativna sladila brez hranilne vrednosti praktiœno ne prispevajo k vnosu energije, saj Aleĝ Berlec, mag. farm., Institut Joĉef Stefan, Jamova 39, 1000 Ljubljana, Slovenija prof. dr. Borut Ĝtrukelj, mag. farm., Fakulteta za farmacijo, Aĝkerœeva 7, 1000 Ljubljana, Slovenija in Institut Joĉef Stefan, Jamova 39, 1000 Ljubljana, Slovenija 292 farm vestn 2006; 57 Proteini sladkega okusa kot alternativna sladila Preglednica 1: Nekatere snovi sladkega okusa. Table 1: Some sweet-tasting compounds. ANORGANSKE NOVI BeCl2, BeSO4, Pb(OAc)2 Ogljikovi hidrati (mono-in disaharidi) Polioli D-aminokisline Proteini sladkega okusa Produkti sekundarnega metabolizma rastlin NARAVNE ORGANSKE SPOJINE saharoza glukoza fruktoza maltoza laktoza sorbitol manitol ksilitol eritritol glicin alanin (D- in L-) fenilalanin triptofan brazein taumatin monelin mabinlin mirakulin pentadin kurkulin steviozid rebaudiozid glicirizin mogrozid V abruzozidi A-D filodulcin neohesperidin dihidrohalkon heranandulcin seligueain Oksimi 3-nitroanilini Derivati sladkorjev a-anisaldoksim 6-kloro-3-nitroanilin sukraloza SINTEZNE ORGANSKE SPOJINE Sulfamati Aspartil dipeptidi Derivati gvanidinoocetne kisline saharin ciklamat acesulfam aspartam alitam neotam sukrononska kislina gvanidinoocetna kislina-1 gvanidinoocetna kislina-2 izkazujejo zelo intenziven sladek okus in jih je zato potrebno dodajati v minimalnih koliœinah (5). Pri alternativnih sladilih so pomembne predvsem naslednje lastnosti: • senzoriœna kakovost (ğœistĞ sladek okus, brez grenkobe, brez vonja) • varnost • kompatibilnost z ostalimi sestavinami hrane • stabilnost v razliœnih pogojih uporabe in priprave hrane (npr. termostabilnost) Od uveljavitve alternativnih sladil so se v medijih pojavljala poroœila o potencialnem kancerogenem delovanju, kar je zmanjĝevalo zaupanje javnosti. Sedaj prevladuje mnenje, da je tveganje za razvoj raka zanemarljivo (6). Alternativna sladila, ki jih odobrijo pristojne regulatorne agencije, so varna. Zanje je opredeljen dovoljen dnevni vnos, varnost pa je potrjena tudi pri veœjem vnosu. Vendar pa med regulatornimi agencijami prihaja do nekaterih neskladij, saj so nekatera alternativna sladila v doloœenih drĉavah dovoljena, v drugih pa prepovedana, kar ne prispeva k veœjemu zaupanju javnosti. Ameriĝka FDA tako dovoljuje uporabo naslednjih sladil brez hranilne vrednosti: acesulfam kalij, aspartam, neotam, saharin in sukraloza (5). V Evropski Uniji pa se lahko uporabljajo: acesulfam kalij (E950), aspartam (E951), sol aspartama-acesulfama (E962), ciklamat (E952), neohesperidin dihidrohalkon (E959), saharin (E954), sukraloza (E955) in taumatin (E957) (7). V nadaljevanju so naĝteta nekatera alternativna sladila, zraven pa opisani nekateri potencialni vplivi na zdravje (5, 8): • Polioli (sorbitol (E420), manitol (E421), ksilitol (E967), eritritol (E968)): Iz œrevesja se absorbirajo poœasi in le delno. Imajo laksativen uœinek in pri prekomernem vnosu (50 g/dan sorbitola, 20 g/dan manitola) lahko povzroœijo diarejo. Njihova intenziteta sladkega okusa ustreza od 50 do 90 % intenzitete saharoze, kaloriœna vrednost pa je pribliĉno enaka saharozi. • Acesulfam kalij (E950): Je 200-krat bolj sladek od saharoze. 95 % zauĉitega acesulfam kalija se izloœi nespremenjenega z urinom. • Aspartam (E951): Je 160 do 220-krat bolj sladek od saharoze. V œrevesju ga esteraze razgradijo do asparaginske kisline, metanola in fenilalanina, ki so tudi pogoste sestavine normalne prehrane. Pri segrevanju se razgradi, zato za doloœene namene uporabe ni primeren. Vnos aspartama je lahko problematiœen pri bolnikih s fenilketonurijo. • Alitam: Je 2000-krat bolj sladek od saharoze in je brez grenkega ali kovinskega okusa. 77 % do 96 % se ga hidrolizira do asparaginske kisline in alanin amida, preostanek pa se izloœi v nespremenjeni obliki. Uporaba je dovoljena v Avstraliji in Novi Zelandiji. • Ciklamat (E952): Je 30-krat bolj sladek od saharoze. Leta 1969 je FDA prepovedala njegovo uporabo, ker naj bi povzroœal raka na laboratorijskih podganah (9). Kasnejĝe ĝtudije so ovrgle njegovo karcinogenost (10). Danes je v uporabi v veœ kot 50 drĉavah, v ZDA pa je ĝe vedno prepovedan. • Neohesperidin dihidrohalkon (E959): Je 1500-krat bolj sladek od saharoze. Hrani in pijaœi daje likorizen okus (po sladkem korenu). V ZDA je sploĝno priznan kot varen (status GRAS), vendar le kot sestavina okusa in ne kot sladilo. farm vestn 2006; 57 293 Pregledni œlanki - Review Articles • Neotam: Je 7000 do 13000-krat bolj sladek od saharoze in ima œist sladek okus brez kovinskega ali grenkega priokusa. Je tudi derivat dipeptida fenilalanina in asparaginske kisline, podobno kot aspartam in alitam. V œrevesju se delno absorbira, nato pa hitro metabolizira in izloœa z urinom in fecesom. Uporaba je dovoljena v ĝtevilnih drĉavah po svetu, v EU pa zaenkrat ĝe ne. • Saharin (E954): Je 200 do 700-krat bolj sladek od saharoze. V ljudeh se ne metabolizira. Kljub nekoliko zmanjĝani uporabi je ĝe vedno najpogosteje uporabljeno alternativno sladilo brez hranilne vrednosti in je v uporabi v veœ kot 100 drĉavah, vkljuœno z EU in ZDA. Leta 1977 je FDA predlagala prepoved njegove uporabe, ker naj bi povzroœal raka pri laboratorijskih ĉivalih (11), kar pa je bilo kasneje ovrĉeno (12). • Sukraloza (E955): Je 600-krat bolj sladka od saharoze in je disaharidne strukture. Absorbira se je le od 11 % do 27 % in ta se izloœi z urinom v nespremenjeni obliki. Je termostabilna in obstojna pri kuhanju in peœenju. • Steviozid: Je 200 do 300-krat bolj sladek od saharoze. Pridobiva se iz juĉnoameriĝke rastline Stevia rebaudiana. Njegova uporaba je prepovedana v EU, v ZDA pa se lahko uporablja kot prehranski dodatek. Ugotovljeno je, da metabolit steviozida povzroœa maligne spremembe pri ĉivalih, ni pa znano, ali lahko do tega pride tudi pri ljudeh (13). • Taumatin (E957) in proteini sladkega okusa: Alternativna sladila velike intenzitete in makromolekularne strukture, ki bodo podrobneje predstavljena v nadaljevanju. 2 Proteini sladkega okusa Proteine sladkega okusa so odkrili v plodovih nekaterih rastlin, ki rastejo v tropskem pasu (Afrika, Kitajska, Malezija). Domaœini plodove teh Preglednica 2: Primerjava lastnosti proteinov sladkega okusa. Table 2: Comparison of sweet-tasting proteins characteristics. Protein Taumatin Monelin Mabinlin sladkega okusa Vir Thaumato- Dioscore- Capparis coccus ophyllum masakai danielli cumminsii Levl Benth Diels Ĝtevilo 207 45 (ver. A) 33 (ver. A) aminokislin 50 (ver. B) 72 (ver. B) Molekulska 22200 10700 12400 masa Geografska Zahodna Zahodna Kitajska porazdelitev Afrika Afrika Faktor 3000 3000 100 sladkosti (m/m) Aktivna Monomer Dimer (A+B) Dimer (A+B) oblika rastlin uporabljajo za slajenje hrane ĉe stoletja. Danes poznamo ĝest sladkih in en okus spreminjajoœi protein. Proteini sladkega okusa so taumatin, monelin, mabinlin, pentadin, brazein in kurkulin. Mirakulin je okus spreminjajoœi protein. Povzroœa, da snovi, ki obiœajno izzovejo kisel okus (citronska, ocetna, askorbinska kislina), okusimo kot sladke (14). Proteini sladkega okusa so ob primerjavi iste mase od nekaj sto do nekaj tisoœkrat bolj sladki od saharoze. Aminokislinska zaporedja ĝestih proteinov sladkega okusa ne kaĉejo nobenih znaœilnih medsebojnih podobnosti. Enako velja tudi za tridimenzionalne strukture proteinov sladkega okusa, ki jih poznamo (taumatin, monelin, brazein), kar oteĉuje identifikacijo determinante za sladek okus. So pa nekateri proteini sladkega okusa po aminokislinskem zaporedju podobni proteinom iz drugih skupin, ki niso sladki (npr. obrambnim proteinom), kar kaĉe na to, da so ti proteini pridobili novo, evolucijsko zaĉeleno lastnost. Sladek okus plodov namreœ privablja ĉivali, ki nato razĝirjajo njihova semena (14). Veœina proteinov sladkega okusa je termiœno dokaj obstojna in kemijsko stabilna, kar je posledica disulfidnih vezi, ki omejujejo konformacijske spremembe in poruĝitev terciarne strukture, ki je nujna za sladek okus. Nekateri proteini sladkega okusa so sestavljeni iz veœ podenot, kar pa njihovo stabilnost zmanjĝuje. Nekatere lastnosti proteinov sladkega okusa so prikazane v preglednici 2 (14–16). Danes se komercialno uporablja samo taumatin, ki se pridobiva z izolacijo iz rastline Thaumatococcus danielli Benth. Pridobivanje proteinov sladkega okusa z izolacijo iz naravnih virov je lahko zelo kompleksno, saj je potrebno upoĝtevati, da rastline, v katerih se proteini sladkega okusa nahajajo, ne rodijo plodov izven svojega naravnega okolja. Edino moĉnost za masovno proizvodnjo proteinov sladkega okusa v koliœinah, ki bi lahko zadovoljile trĉiĝœe, predstavlja rekombinantna DNA tehnologija, ki je v nekaterih primerih ĉe razvita. Pentadin Brazein Kurkulin Mirakulin Pentadi- Pentadi- Curculigo Rachidella plandra plandra latifolia dulcifica brazzeana brazzeana Baillon Baillon ? 54 114 191 12000 6500 24900 98400 Zahodna Zahodna Malezija Zahodna Afrika Afrika Afrika 500 2000 550 - ? Monomer Dimer (A+A) Tetramer (A+A+A+A) farm vestn 2006; 57 Proteini sladkega okusa kot alternativna sladila 2.1 Taumatin Taumatin je najbolje poznan protein sladkega okusa. Izoliran je bil leta 1972 iz zahodnoafriĝke rastline Thaumatococcus daniellii Benth (17). Njegova varnost je bila dokazana na ĉivalih in na ljudeh (18). Taumatin predstavlja druĉino zelo podobnih proteinov, med katerimi prevladujeta taumatin I (molekulska masa 22209) in taumatin II (molekulska masa 22293). Terciarna struktura taumatina je bila doloœena. Sestavljata jo dve domeni z maloĝtevilnimi a-vijaœnicami in ĝtevilnimi b-verigami in b-pasovi (19). Elemente med seboj povezuje 8 disulfidnih vezi. Taumatin nad 70°C agregira (20), kar pa je odvisno od pH (21). Stabilnejĝi je v kislem okolju. Taumatin je visoko homologen (65%) s proteini druĉine PR-5, pri œemer je ohranjena postavitev vseh cisteinov. Ti ğtaumatinu-podobniĞ proteini so vkljuœeni v obrambnih mehanizmih rastlinskih tkiv pred glivnimi infekcijami. Taumatin je 100000-krat bolj sladek od saharoze na molarni ravni in 3000-krat na masni ravni. Sladek okus nastopi z zakasnitvijo in puĝœa rahel likorizen pookus. Taumatin so z razliœno uspeĝnostjo izrazili tudi v drugih organizmih: bakterijah (Escherichia coli (22), Bacillus subtilis (23), Streptomyces lividans (24)), glivah (Saccharomyces cerevisae (25), Kluyveromyces lactis (26), Penecillium roquefortii (27), Aspergillus niger (28), Pichia pastoris (29)) in rastlinah (krompir (Solanum tuberosum) (30), paradiĉnik (Lycopersiocon esculentum) (31)). 2.2 Monelin Monelin so odkrili v zahodnoafriĝki rastlini Dioscoreophyllum cumminsii Diels . Monelin je 100000-krat bolj sladek od saharoze na molarni ravni in 3000-krat na masni ravni. Protein sestavljata dve nekovalentno povezani polipeptidni verigi: veriga A (45 aminokislin) in veriga B (50 aminokislin). Tridimenzionalno strukturo monelina tvori 5 antiparalelnih b-povrĝin (tri na verigi A, dve na verigi B) in a-vijaœnica (na verigi B). V molekuli ni nobene disulfidne vezi (33). Monelin izgubi sladek okus pri inkubaciji na 50°C v kislem pH-ju. Da bi zveœali stabilnost, so pripravili enoveriĉni analog z zdruĉitvijo N-terminalnega konca verige A in C-terminalnega konca verige B, ki sta v strukturi blizu skupaj. Enoveriĉni monelin je ohranil sladek okus, pridobil pa je veœjo pH- in termostabilnost (34). Monelin so izrazili v bakterijah (Escherichia coli (34, 35)), glivah (Candida utilis, Saccharomyces cerevisiae (36)) in rastlinah (paradiĉnik (Lycopersiocon esculentum), zelena solata (Lactuca sativa) (37)). 2.3 Brazein in pentadin Leta 1994 so v zahodnoafriĝki rastlini Penatadiplandra brazzeana Baillon odkrili nov protein sladkega okusa in ga po rastlini poimenovali brazein (38). Iz iste rastline so izolirali ĝe en protein sladkega okusa, pentadin (39), za katerega pa domnevajo, da je premreĉena, nenaravna oblika brazeina. Brazein je monomer, molekulo pa sestavlja 54 aminokislinskih preostankov. Molekulska masa brazeina znaĝa 6473 in je najmanjĝi do sedaj odkriti protein sladkega okusa. V molekuli je osem cisteinov, ki so med seboj povezani s ĝtirimi disulfidnimi vezmi. Te so odgovorne za visoko termo- in pH-stabilnost molekule (pri inkubaciji na 80 °C za 4 ure ali na 98 °C za 2 uri se ohrani sladek okus) (40). Z doloœitvijo tridimenzionalne strukture so ugotovili, da brazein sestavljajo ena a-vijaœnica in tri antiparalelne b-povrĝine (41). Brazein je homologen nekaterim obrambnim proteinom (strupi ĝkorpijonov, defenzini ĉuĉelk, rastlinski g-tionini). Brazein je 2000-krat bolj sladek od saharoze na masni ravni. Njegov profil sladkosti je v primerjavi z drugimi proteini sladkega okusa bolj podoben saharoznemu. Glavnina brazeina (80 %), izoliranega iz naravnega vira vsebuje piroglutaminsko kislino (pGlu) na N-terminalnem delu. Preostanek brazeina (20 %) ne vsebuje piroglutaminske kisline (des-pGlu brazein). Ugotovljeno je, da je des-pGlu brazein dvakrat bolj sladek od starĝevskega proteina. Njegova topnost v vodi znaĝa 50 mg/ml (veœ kot 7,7 mol/l) in je med proteini sladkega okusa najbolje topen v vodi. Na podlagi mutageneze so ugotovili, kateri aminokislinski preostanki odloœilno prispevajo k sladkemu okusu. Pri tem so pripravili tudi bolj sladke analoge brazeina (42, 43). Brazein so uspeĝno izrazili v bakteriji E. coli (44), mleœnokislinski bakteriji Lactococcus lactis (45) in koruzi (Zea mays) (46). 2.4 Mabinlin V Kitajski rastlini Capparis masikai Levl so leta 1993 odkrili protein sladkega okusa mabinlin (47). V rastlini se nahajajo vsaj ĝtirje proteini iz druĉine mabinlinov: mabinlin I-1, mabinlin II, mabinlin III in mabinlin IV. Najbolj prouœevan je mabinlin II, ki je sestavljen iz dveh polipeptidnih verig (33 in 72 aminokislin), medsebojno povezanih s ĝtirimi disulfidnimi vezmi. Termostabilnost mabinlinov se med seboj precej razlikuje, za kar naj bi bil odgovoren samo en aminokislinski preostanek. Mabinlini so stabilni 1 uro pri 80 °C z izjemo mabinlina 1-I, ki pri teh pogojih izgubi sladek okus (48). Mabinlin II pa naj bi ohranil sladek okus celo po inkubaciji na 100 °C za 48 ur. Mabinlin II je visoko homologen skladiĝœnim proteinom 2S. Mabinlin je na zaœetku grenek in adstringenten, sladek okus nastopi z zakasnitvijo. Je 400-krat bolj sladek od saharoze (49). O rekombinantnem izraĉanju mabinlina ni poroœil. 2.5 Kurkulin Kurkulin so izolirali iz rastline Curculigo latifolia, ki raste v nekaterih predelih Malezije. Med proteini sladkega okusa je svojevrsten posebneĉ. Poleg sladkega okusa (je 550-krat bolj sladek od saharoze na masni ravni) namreœ izkazuje tudi lastnost modificiranja okusa in zato mu lahko reœemo tudi okus spreminjajoœi protein. To pomeni, da kisle snovi po ali ob zauĉitju kurkulina zaznamo kot sladke (50). Kurkulin ima molekulsko maso 12491 in je sestavljen iz 114 aminokislin. Kurkulin je dimer, sestavljen iz dveh identiœnih podenot, ki sta povezani z dvema disulfidnima vezema. Kurkulin je homologen (65 %) lektinu GNA iz zvonœka (Galanthus nivalis), na podlagi katerega so naredili model tridimenzionalne strukture (51). Kurkulin je stabilen 1 uro na 50 °C v obmoœju pH od 3 do 11. Rekombinantno izraĉanje kurkulina v funkcionalni obliki ni bilo uspeĝno. Nedavno so odkrili izoobliko kurkulina, ki so jo poimenovali neokulin in je visoko homologna podenoti kurkulina. Ugotovili so, da v Escherichii coli nastane funkcionalen protein sladkega okusa samo v farm vestn 2006; 57 Pregledni œlanki - Review Articles obliki heterodimera med podenoto kurkulina in neokulinom (52, 53). Verjetno je, da se protein v tej obliki nahaja tudi v rastlini. 2.6 Mirakulin Mirakulin je edini predstavnik skupine okus spreminjajoœih proteinov. Sam po sebi ni sladek, povzroœi pa, da po zauĉitju okuĝamo kisle snovi kot sladke. Odkrili so ga v zahodnoafriĝki rastlini Richadella dulcifera. Mirakulin je glikoprotein iz 191 aminokislin z molekulsko maso 24600 (13,9 % predstavljajo ogljikovi hidrati). Sestavljen je iz ĝtirih podenot, ki so med sabo povezane z disulfidnimi vezmi (54, 55). Mirakulin so pred kratkim izrazili v funkcionalni obliki v rekombinantni zeleni solati (Lactuca sativa) (56). 3 Sklep Sladke jedi ostajajo pomembna sestavina œloveĝke prehrane. Namizni sladkor, ki ga najpogosteje uporabljamo za slajenje, povezujejo z doloœenimi zdravstvenimi tveganji, najbolj nedvoumno s kariesom. Na pomenu pridobivajo alternativna sladila, ki pa so pogosto umetno pridobljena in jim javno mnenje zato ni naklonjeno. Zanimiv razred alternativnih sladil predstavljajo proteini sladkega okusa, ki so varni in naravnega izvora in bi z rekombinantno proizvodnjo v prihodnosti lahko igrali pomembnejĝo vlogo. 4 Literatura 1. Lindemann B. Taste reception. Physiol Rev 1996; 76: 718-766. 2. Lindemann B. Receptors and transduction in taste. Nature 2001; 413: 219-225. 3. Ellis JW. Overview of Sweeteners. Journal of Chemical Education 1995; 72: 671-675. 4. Kinghorn AD, Kennelly EJ. Discovery of Highly Sweet Compounds from Natural Sources. Journal of Chemical Education 1995; 72: 676-680. 5. Position of the American Dietetic Association: use of nutritive and nonnutritive sweeteners. J Am Diet Assoc 2004; 104: 255-275. 6. Weihrauch MR, Diehl V. Artificial sweeteners--do they bear a carcinogenic risk? Ann Oncol 2004; 15: 1460-1465. 7. Directive 2003/115/EC of the european parliament and of the council of 22 December 2003 amending Directive 94/35/EC on sweeteners for use in foodstuffs. Official Journal of the European Union 2004; L 24: 65-71. 8. Ahmed Z, Banu H, Akhter F et al. Concept on Sugar- A Review. OnLine Journal of Biological Sciences 2001; 1: 883-894. 9. Price JM, Biava CG, Oser BL et al. Bladder tumors in rats fed cyclohexylamine or high doses of a mixture of cyclamate and saccharin. Science 1970; 167: 1131-1132. 10. Bopp BA, Sonders RC, Kesterson JW. Toxicological aspects of cyclamate and cyclohexylamine. Crit Rev Toxicol 1986; 16: 213-306. 11. Hicks RM, Chowaniec J. The importance of synergy between weak carcinogens in the induction of bladder cancer in experimental animals and humans. Cancer Res 1977; 37: 2943-2949. 12. Saccharin. Review of safety issues. Council on Scientific Affairs. Jama 1985; 254: 2622-2624. 13. Pezzuto JM, Compadre CM, Swanson SM et al. Metabolically activated steviol, the aglycone of stevioside, is mutagenic. Proc Natl Acad Sci U S A 1985; 82: 2478-2482. 14. Faus I. Recent developments in the characterization and biotechnological production of sweet-tasting proteins. Appl Microbiol Biotechnol 2000; 53: 145-151. 15. Gibbs BF, Alli I, Mulligan C. Sweet and taste-modifying proteins: A review. Nutrition Research 1996; 16: 1619-1630. 16. Kant R. Sweet proteins--potential replacement for artificial low calorie sweeteners. Nutr J 2005; 4: 5. 17. van der Wel H, Loeve K. Isolation and characterization of thaumatin I and II, the sweet-tasting proteins from Thaumatococcus daniellii Benth. Eur J Biochem 1972; 31: 221-225. 18. Higginbotham JD, Snodin DJ, Eaton KK et al. Safety evaluation of thaumatin (Talin protein). Food Chem Toxicol 1983; 21: 815-823. 19. Ogata CM, Gordon PF, de Vos AM et al. Crystal structure of a sweet tasting protein thaumatin I, at 1.65 A resolution. J Mol Biol 1992; 228: 893-908. 20. Kaneko R, Kitabatake N. Heat-induced formation of intermolecular disulfide linkages between thaumatin molecules that do not contain cysteine residues. J Agric Food Chem 1999; 47: 4950-4955. 21. Kaneko R, Kitabatake N. Sweetness of sweet protein thaumatin is more thermoresistant under acid conditions than under neutral or alkaline conditions. Biosci Biotechnol Biochem 2001; 65: 409-413. 22. Edens L, Heslinga L, Klok R et al. Cloning of cDNA encoding the sweet-tasting plant protein thaumatin and its expression in Escherichia coli. Gene 1982; 18: 1-12. 23. Illingworth C, Larson G, Hellekant G. Secretion of the Sweet-Tasting Plant Protein Thaumatin by Bacillus-Subtilis. Biotechnology Letters 1988; 10: 587-592. 24. Illingworth C, Larson G, Hellekant G. Secretion of the Sweet-Tasting Plant Protein Thaumatin by Streptomyces-Lividans. Journal of Industrial Microbiology 1989; 4: 37-42. 25. Lee JH, Weickmann JL, Koduri RK et al. Expression of synthetic thaumatin genes in yeast. Biochemistry 1988; 27: 5101-5107. 26. Edens L, Vanderwel H. Microbial Synthesis of the Sweet-Tasting Plant Protein Thaumatin. Trends in Biotechnology 1985; 3: 61-64. 27. Faus I, Patino C, del Rio JL et al. Expression of a synthetic gene encoding the sweet-tasting protein thaumatin in the filamentous fungus Penicillium roquefortii. Biotechnology Letters 1997; 19: 1185-1191. 28. Faus I, del Moral C, Adroer N et al. Secretion of the sweet-tasting protein thaumatin by recombinant strains of Aspergillus niger var. awamori. Applied Microbiology and Biotechnology 1998; 49: 393-398. 29. Masuda T, Tamaki S, Kaneko R et al. Cloning, expression and characterization of recombinant sweet-protein thaumatin II using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Biotechnol Bioeng 2004; 85: 761-769. 30. Witty M, Harvey WJ. Sensory Evaluation of Transgenic Solanum-Tuberosum Producing R-Thaumatin-Ii. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science 1990; 18: 77-80. 31. Bartoszewski G, Niedziela A, Szwacka M et al. Modification of tomato taste in transgenic plants carrying a thaumatin gene from farm vestn 2006; 57 Proteini sladkega okusa kot alternativna sladila Thaumatococcus daniellii Benth. Plant Breeding 2003; 122: 347-351. 32. Morris JA, Cagan RH. Purification of monellin, the sweet principle of Dioscoreophyllum cumminsii. Biochim Biophys Acta 1972; 261: 114-122. 33. Ogata C, Hatada M, Tomlinson G et al. Crystal structure of the intensely sweet protein monellin. Nature 1987; 328: 739-742. 34. Kim SH, Kang CH, Kim R et al. Redesigning a sweet protein: increased stability and renaturability. Protein Eng 1989; 2: 571-575. 35. Chen Z, Cai H, Lu F et al. High-level Expression of a Synthetic Gene Encoding a Sweet Protein, Monellin, in Escherichia coli. Biotechnol Lett 2005; 27: 1745-1749. 36. Kondo K, Miura Y, Sone H et al. High-level expression of a sweet protein, monellin, in the food yeast Candida utilis. Nat Biotechnol 1997; 15: 453-457. 37. Penarrubia l, Kim R, Giovanoni J et al. Production of the sweet protein monellin in transgenic plants. Biotechnol 1992; 10: 561-564. 38. Ming D, Hellekant G. Brazzein, a new high-potency thermostable sweet protein from Pentadiplandra brazzeana B. FEBS Lett 1994; 355: 106-108. 39. Vanderwel H, Larson G, Hladik A et al. Isolation and Characterization of Pentadin, the Sweet Principle of Pentadiplandra-Brazzeana Baillon. Chemical Senses 1989; 14: 75-79. 40. Izawa H, Ota M, Kohmura M et al. Synthesis and characterization of the sweet protein brazzein. Biopolymers 1996; 39: 95-101. 41. Caldwell JE, Abildgaard F, Dzakula Z et al. Solution structure of the thermostable sweet-tasting protein brazzein. Nat Struct Biol 1998; 5: 427-431. 42. Assadi-Porter FM, Aceti DJ, Markley JL. Sweetness determinant sites of brazzein, a small, heat-stable, sweet-tasting protein. Arch Biochem Biophys 2000; 376: 259-265. 43. Jin Z, Danilova V, Assadi-Porter FM et al. Critical regions for the sweetness of brazzein. FEBS Lett 2003; 544: 33-37. 44. Assadi-Porter FM, Aceti DJ, Cheng H et al. Efficient production of recombinant brazzein, a small, heat-stable, sweet-tasting protein of plant origin. Arch Biochem Biophys 2000; 376: 252-258. 45. Berlec A, Jevnikar Z, Majhenic AC et al. Expression of the sweet- tasting plant protein brazzein in Escherichia coli and Lactococcus lactis: a path toward sweet lactic acid bacteria. Appl Microbiol Biotechnol 2006. 46. Lamphear BJ, Barker DK, Brooks CA et al. Expression of the sweet protein brazzein in maize for production of a new commercial sweetener. Plant Biotechnology Journal 2005; 3: 103-114. 47. Liu X, Maeda S, Hu Z et al. Purification, complete amino acid sequence and structural characterization of the heat-stable sweet protein, mabinlin II. Eur J Biochem 1993; 211: 281-287. 48. Nirasawa S, Nishino T, Katahira M et al. Structures of heat-stable and unstable homologues of the sweet protein mabinlin. The difference in the heat stability is due to replacement of a single amino acid residue. Eur J Biochem 1994; 223: 989-995. 49. Guan RJ, Zheng JM, Hu Z et al. Crystallization and preliminary X-ray analysis of the thermostable sweet protein mabinlin II. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 2000; 56 (Pt 7): 918-919. 50. Yamashita H, Theerasilp S, Aiuchi T et al. Purification and complete amino acid sequence of a new type of sweet protein taste-modifying activity, curculin. J Biol Chem 1990; 265: 15770-15775. 51. Barre A, Van Damme EJ, Peumans WJ et al. Curculin, a sweet-tasting and taste-modifying protein, is a non-functional mannose-binding lectin. Plant Mol Biol 1997; 33: 691-698. 52. Shirasuka Y, Nakajima K, Asakura T et al. Neoculin as a new taste-modifying protein occurring in the fruit of Curculigo latifolia. Biosci Biotechnol Biochem 2004; 68: 1403-1407. 53. Suzuki M, Kurimoto E, Nirasawa S et al. Recombinant curculin heterodimer exhibits taste-modifying and sweet-tasting activities. FEBS Lett 2004; 573: 135-138. 54. Theerasilp S, Hitotsuya H, Nakajo S et al. Complete amino acid sequence and structure characterization of the taste-modifying protein, miraculin. J Biol Chem 1989; 264: 6655-6659. 55. Theerasilp S, Kurihara Y. Complete purification and characterization of the taste-modifying protein, miraculin, from miracle fruit. J Biol Chem 1988; 263: 11536-11539. 56. Sun HJ, Cui ML, Ma B et al. Functional expression of the taste-modifying protein, miraculin, in transgenic lettuce. FEBS Lett 2006; 580: 620-626. farm vestn 2006; 57