ANNALES • Ser. hist. nat. • 12 ■ 2002 ■ 2
review	UDC 634.63:631.52(497.4-14)
rcceivecf: 2002-11-15
GENETSKE RAZISKAVE OLJKE
Dunja BANDEL!MAVSAR InStitut za sredozemsko kmetijstvo in oljkarstvo ZRS Koper, Sl-6000 Koper. Garibaldijeva 18 E-mail: Dunja.Bandelj@zrs-fcp.si
Jernej JAKŠE & Branka 1AVORNIK Center za rastUnsko biotehnologijo in žlahtnjenje, Oddelek za agronomijo, Biotehniška fakulteta, Univerza v ljubijani,
S!-1000 Ljubljana, jainnikarjeva 101
IZVLEČEK
Oljka fOlea europaea L.) že tisočletja uspeva v Sredozemskem bazenu, kje/ je ena pomembnejših gojenih sadnih vrst. K vse večjemu povpraševanju in porabi oljčnega olja prispeva spoznanje, da je oljčno olje vir zdravih maščob v primerjavi z drugimi rastlinskimi maščobami, posledično pa narašča poneha po vzgoji in žiahlnjcnju novih, sodobnih sort. Vtem pogledu je vrednotenje obstoječih genskih virov oljke zelo pomembno, saj so le ti vir lastnosti, ki jih lahko izkoristimo v programih izboljšanja genetskega materiala oljke. V primerjavi z drugimi hortikulturnimi rastlinami, kjer je bif narejen velik napredek v vzgoji novih sort z uporabo molekulsko genetskega znanja, so raziskave te vrste pri oljki razmeroma skromne. V zadnjem času je zaslediti pomembne premike na tem področju. Namen prispevka je prikazati trenutno stanje genetskih preučevanj oljke po svetu, vključno z domačim i raziskavami.
Ključne besede; oljka, Olea europaea, molekulski markerji, genetska raznolikost
STUDI CENETICI SUGLI OLIV!
SINTESI
Da millennr f'olivo (Olea europaea i.) prospera riel bacino Mediterráneo, dove viene considéralo uno dcgli p.lberí da frutta coltivati piü importanti. i sempre maggiori richiesta e consumo dell'olio d'oliva sono dovuti alia conoscenza del íatio che rale olio contiene grassi benefíci, a differenza di altri grassi vegetali. Di conseguenza cresce anche i! bisogno di coltivare e nobilitare nuove sorte contemporáneo.. In questo contesto risulta molto importante la vaiorizzazione deíle fonti genetiche esistenti, in quanto uniche fonti di caratteristíche che possono venir adoperate nei programen/ di miglioramento del materiah genetico del ¡'olivo, ¡n confronto ad altre piante orticulturali, per le quali é stato raggiunto un notevole progresso nella coltivazione di nuovi cultivar con l'aiuto delta conoscenza genética e molecolare, tal i ricerche sono relativamente modeste per quanto aguarda l'olivo. Negli ultimi tempr si sono pero registran importanti passi avanti in questo campo e scopo dell'articoío e quello di iIlustrare la presente situazione ncl campo della acerca genética dell'olivo nel mondo e nel campo di acerca sloveno.
Parole chiave: olivo, Olea europaea, rnarcatori molecolari, diversitá genettea
95
ANNALES • Ser. hist. nat. • 12 • 2002 • 2
Dunj.1 «ANDEL! MAVSAR ~ .'h CENITSKE RAZISKAVE OLIKt, 219-24?
UVOD
Glede na spoznanje, da je oskrba tradicionalnih nasadov ekonomsko neutemeljena, se pridelovalci že od sredine prejšnjega stoletja ukvarjajo z vprašanjem, kako povečali rodnost oljčnih nasadov in znižati stroške pridelovanja oljk. Vpeljava novih gojitvenih oblik v olje-nike je med prvimi ukrepi, ki so bistveno povečali hektarske pridelke oljk. Manjše sadilne razdalje so vplivale na povečanje gostote dreves na hektar in posledično tudi višino pridelka, izboljšana prehrana dreves z makro- m mikrohranili je pripomogla k rednejši in boljši rodnosti. 2 namakanjem oljk so se pridelki povečali za 40 do 70%. izbira ustreznih sort, prilagojenih intenzivni pridelavi, pa ostaja med pomembnejšimi dejavniki, ki vplivajo ne samo na višino pridelka, temveč tudi na njegovo kakovost.
Poraba oljčnega olja iz leta v leto narašča, potrošniki so glede kakovosti vse bolj zahtevni, zato je večina raziskav usmerjena ravno v preučevanje lastnosti oljčnega olja. Dosedanje raziskave so pokazale, da so sortno značilne kemične in organoieptične lastnosti tiste, ki s tehniko predelave plodov vplivajo na končno kakovost oljčnega olja. V procesih izboljšanja rastlinskega materiala oljke so največja ovira pomanjkljivi in nezadovoljivi podatki vrednotenja sort ali natančneje agronomskih lastnosti sort in sortne značilnosti oljčnega olja. To je tudi najpomembnejši razlog, zakaj je sistematična preučitev obstoječih genskih virov oljke potrebna. Velika genetska raznolikost oljke se kaže v množici najrazličnejših sort, klonov in divjih populacij, med katerimi lahko odberemo genotipe z najprimernejšo kombinacijo genov za intenzivno gojenje. Z namenom preučevanja genetske raznolikosti oljke ter odkrivanja najprimernejših genotipov, ki bodo poleg dobre prilagojenosti tehnologijam intenzivnega oijkarslva zagotovili še kakovosten pridelek, so v različnih državah ustanovili kolekcijske nasade, v katerih so zbrane sorte z določenega območja. Primerjalna študija med standardnimi in prinesenimi sortami v kolekciji je najhitrejša in najprimernejša pot pri iskanju alternativ za nezadovoljivo sortno strukturo nekega pridelovalnega območja. V ko-lekcijskih nasadili poteka sistematično vrednotenje agronomsko zanimivih lastnosti in lastnosti oljčnega olja posameznih sort. Na osnovi večletnih opazovanj se ocenjuje genetski potencial dreves in izvrednoti vpliv okolja na določene lastnosti, kar je nujno pred začetkom uresničevanja programov izboljšanja rastlinskega materiala. Agronomske lastnosti, ki se vrednotijo v kolekcijah, so dolžina mladostnega obdobja, rodnost, bujnost dreves, čas cvetenja, odpornost na bolezni in škodljivce ter tolerantnost na stresne dejavnike, kot so suša, nizke temperature, slana tla, itd. Vsebnost olja v plodovih (olje-vitost sorte) je skupaj z rodnostjo pomembnejši parameter ocene neke sorte. Teža plodu je precej odvisna od okolja, medtem ko je vsebnost olja, izražena v suhi
snovi, zelo odvisna od posameznega genotipa oz. sorte. Kakovost olja posameznih sort v kolekcijah določajo z analitskimi in senzoričnimi analizami, ki v splošnem vključujejo sestavo in razmerje maščobnih kislin ter parametre stabilnosti olja. Pri tem se ocenjuje tako komercialna kot hranilna vrednost olja. O razlikah v sestavi maščobnih kislin med sortami poročajo številni avtorji, Minorne sestavine dajejo olju posebno vrednost, med njimi so najpomembnejši antioksidanti (biofenoli in tokoferoli). Razlike v sestavi teh komponent v oljih so posledica različnih ekstrakcijskih postopkov in vpliva sorte. Pri preučevanju minornih sestavin bi bilo treba določiti, v kolikšni meri na njihov nastanek vplivata genotip in okolje.
Kljub temu da je oljka genetsko bogata, oljkarji še nimajo na voljo sort, ki bi popolnoma ustrezale vsem zahtevam intenzivnega oljkarstva. Vzrok so skromnejši programi izboljšanja genetskega materiala oljke v preteklosti. Selekcija sort in klonska selekcija sta bili glavni dejavnosti, ki sta pripeljali do izboljšanja lastnosti obstoječih sort. Do sedaj je bilo v načrtovanih programih izboljšanja vzgojenih ie nekaj sort. V Izraelu so z masovno selekcijo vzgojili sorti 'barnea' in 'kadesh', v Italiji so nove izboljšane sorte v fazi preizkušanja, v Španiji pa v programih izboljšanja ni bila vzgojena še nobena nova sorta (Rallo, 1999). Cilj k Ionske selekcije je med večjim številom osebkov neke sorte izbrati genetsko in zdravstveno najboljše. Kionska selekcija oljk se opravlja v različnih državah, o komercialni vrednosti klonov poročajo te v nekaj primerih. Tako so v Italiji zaščitili dva klona (FS-17 in DA-12) {Fontanazza, 1996). V Španiji so odbrali 52 klonov sorte 'manzartilla di Sevilla' in 15 klonov sorte 'arbecjuina', ki so v fazi primerjalnih analiz s standardi. Tudi v Turčiji poročajo o prvih rezultatih klonske selekcije avtohtonih sort, katerih kloni imajo boljše lastnosti v primerjavi s standardi (Ftorino & Rallo, 1999). Z genetskega stališča se slabost klonske selekcije kaže predvsem v zmanjševanju genetske raznolikosti, saj je gojenje omejeno ie na določene genotipe.
Med pomembne strategije izboljšanja genetskega materiala oljke uvrščamo tudi križanja, katerih cii> je izboljšati kakovost plodov (povečanje oljevitosti, izboljšanje karakteristik plodov) in prilagojenost rastlin na intenzivne pridelovalne okoliščine ter stresne razmere. V Italiji so leta 1971 križali 17 različnih sort oljk, ki se uporabljajo za vlaganje m olje. Rezultati dolgoletnih opazovanj agronomskih lastnosti potomcev so pokazali, da lahko pri oljki s križanji vzgojimo nove, tržno zanimive sorte. Na Kitajskem so sistematična križanja sort oljk pričeli leta 1980 z namenom vzgoje novih sort, ki bodo bolje prilagojene na klimatske in talne razmere (Fontanazza, 1996). Z načrtovanimi križanji lahko izboljšamo splošne lastnosti sort, vnesemo pa tudi neželene gene, ki jih moramo s številnimi povratnimi križanji odstraniti. Majhen in počasnejši napredek pri vzgoji novih sort oljk s križanji v primerjavi z drugimi
96
ANNALES • Ser. hist. nat. • 12 • 2002 • 2
Olm ja ÖANDOU MAV5AR et .if.: CüNETSKE RAZISKAVE OiJKt. 239-246
rastlinskimi vrstami je zagotovo posledica izredno dolgega mladostnega obdobja oljke. Rezultati dosedanjih križanj oljk sicer odpirajo nove poti in možnosti k ustvarjanju tržno zanimivih sort, vendar pa so informacije o dedovanju pomembnih lastnosti se vedno omejene, saj so preučene le na nivoju fenotipa. Specifičnih raziskav glede povezave med genotipom in fenotipskimi lastnostmi ni na voljo, posledica tega pa so pomanjkljivi selekcijski kriteriji.
Pregled, ali t.i. inventarizacija obstoječih genskih virov oljke torej sodi med prioritetne dejavnosti intenzivnega oljkarstva, nam omogoča vpogled v genski bazen udomačene oljke in njene divje sorodnike, ki so lahko nosilci zanimivih in nadvse koristnih agronomskih lastnosti, kot so odpornost za bolezni, škodljivce in stres. Vse te lastnosti lahko uporabimo v programih izboljšanja genetskega meteriala oljke pri ustvarjanju novih sort.
Razvoj molekulskih metod je omogočil alternativne pristope v številnih genetskih raziskavah. Vsestranska uporabnost molekulskih markerjev omogoča hitrejše reševanje problemov, ki se pojavljajo pri žlahtnjenju rastlin, identifikaciji sort in klonov, ugotavljanju sorodstvenih odnosov med osebki, vrednotenju genetskega materiala in iskanju polirnorfizma itd. Pri vzgoji novih sort. s križanji lahko s pomočjo molekulskih markerjev identificiramo potomce z želenimi lastnostmi, saj je selekcijo sejancev mogoče opraviti že v mladostnem obdobju rastline, kar bistveno skrajša čas žlahtnjenja. Markerji so namreč v nekaterih primerili tesno vezani na gene, ki kontrolirajo agronomsko zanimive lastnosti, zato jih lahko uporabljamo za sledenje lastnosti po križanju. Pomembno mesto med genetskimi raziskavami z molekulskimi markerji imajo preučevanja genetske raznolikosti oijke in študije sortne strukture območij, kjer se uveljavlja zaščita geografskega porekla oljčnega olja. Sorodstveni odnosi med sortami omogočajo rešiti tudi nekatere domneve, kot je npr. avtohtonost sort. Poznavanje genetske variabilnosti oljke na nekem območju nam lahko zagotovi koristne informacije o selekciji, nastanku sort in geografskem izvoru. V zadnjem času je bilo veliko raziskav namenjenih tudi rekonstrukciji zgodovine udomačitve, izvoru in širjenju oljke.
Metode molekulske biologije so prispevale nekatere novosti tudi v diagostiki, pri ugotavljanju okuženosti rastlinskega materiala z virusi. Spremljanje zdravstvenega stanja sadik je pomembno pri vzgoji certificiranega materiala. Poleg klasični!-, imunoloških testov El.ISA 2a ugotavljanje virusov v rastlinah so na voljo tudi postopki, ki temeljijo na uporabi polimerazne verižne reakcije (PCR). Metode PCR omogočajo hitro in zanesljivo identifikacijo virusa. Molekulske metode za odkrivanje virusov oijke se že uporabljajo v Španiji in na Portugalskem (Ralio, 1999}. Med pomembnejše raziskave sodijo tudi poskusi vzgoje oljk s tkivnimi kulturami. Mikro-propagacija (razmnoževanje) in vitro je bistveno skraj-
šala čas razmnoževanja, ki je neodvisen od letnega časa, poleg tega pa omogoča vzgojo večjega števila rastlin na majhnem prostoru. Preliminarne rezultate vzgoje in razmnoževanja oljke in vitro so predstavili v Italiji (Standardi ef a/., 1998; Leva ef al., 2000). Vzgoja odpornih sort na bolezni in škodljivce ter stresne razmere sodi med najpomembnejše cilje sodobnega kmetijstva. Razvoj genskega inženirstva je omogočil vnašanje genov v genom rastline z natančnim zapisom za določeno lastnost. S postopkom neposrednega vnašanja želenih genov premostimo težave, kakršna je npr, nekompatibilnost pri križanju dveh genetsko oddaljenih vrst, izognemo se vnosu neželenih lastnosti, itd. O prvem poskusu genetske transformacije oljke poročajo v Italiji (Mencuceini et a/., 1998). Rezultati so spodbudni in perspektivni. Oljko namreč pridelovalci želijo gojiti v širšem arealu, zato je treba vzgojiti sorte, ki bodo dobro prenašale sušo, težka tla in nizke temperature. Raziskave bodo v prihodnosti usmerjene v iskanje in identifikacijo genov za odpornosl na biotski in abiotski stres. Zanimivi so tudi geni, ki so povezani s kakovostjo pridelka.
MOLEKULSKI MARKERJI V GENETSKIH ŠTUDIJAH
Rastline imajo tri avtonomne genorne. V jedru celice je jedrna DNA, celična organela (plastida), kloroplast in rnitohondrij, ki sta v celični citoplazmi, pa vsebujeta kloroplastno ONA (cpDNA) oz. rriitohondrijsko DNA (mtDNA). Za plastidm DNA je značilno nemendlovsko ali citoplazmatsko dedovanje, kar pomeni, da se od jedrne DNA neodvisno dedujeta, večinoma po materi. Variabilnost v molekulskih markerjih in sekvencah nekaterih genov kloropfastnega genoma se uporablja za karakterizacijo rastlinskih populacij ali divjih sorodnikov (javornik, 199G). Raznolikost mitohondrijskega genoma pri rastlinah je zanimiva za ugotavljanje pretoka genov in strukture populacije. Rastline z enako mtDNA imajo skupnega ženskega prednika, saj se pri dedovanju materina mtDNA prenese na vse potomce, zato lahko sledimo mateinalnem rodovniku. Ker se ne rekombinira, se mutacije v njej akumulirajo hitreje, tako da je mtDNA bolj polimorfna v primerjavi z jedrno DNA.
Prvi markerji, ki so se uporabljali za vrednotenje raznolikosti pri rastlinah, so bili fenotipski (morfološki). Uporaba le-teli je bila povezana s številnimi metodološkimi težavami, kot so zamudno delo, omejeno Število razpoložljivih markerjev, odvisnost markerjev od razvojne stopnje rastline in okolja ter subjektivni pristop pri vrednotenju. Razvoj in uporaba izoencimskih markerjev sta genetsko analizo vodila na molekulski nivo, vendar je bila zaradi majhne številčnosti njihova uporaba omejena. Razvoj molekulskih markerjev je omogočil revolucionaren pristop preučevanja genomov. Marker je lahko katerokoli zaporedje DNA, ki ga Jahko brez večjih težav odkrijemo in spremljamo njegovo dedovanje. Danes imamo kar nekaj molekulskih markerjev, ki se
ANNALES • Ser. hist. nat. -12- 2002 • 2
DimjÄ t>AMDF.t.j MAV5AR e< al.i GFKTTSKF RA7JSKAVS OI.|KF, 239-24»
razlikujejo v svojih lastnostih, informativnosti, ceni razvoja markerskega sistema in zahtevnosti tehnike. Glede na namen preučevanja organizma lahko izbiramo med hibridizacijskimi {RFIP markerji) in PCR (RAPD, AFIP markerji, mikrosateliti) tehnikami.
Prvi razviti markerski sistem, ki je omogočil odkrivanje polimorfizma na nivoju DNA, so markerji RFI.P {po-limorfizem dolžin resirikcijskih fragmentov). Tehnologija RI LP temelji na razrezu genomske DNA z restrikcijskimi encimi, razrezani DNA fragmenti se nato elektroforeisko ločijo in prenesejo na membrano, sledi odkrivanje specifičnih fragmentov DNA s hibridizacijo z radioaktivno označeno sondo. Razlike med preučevanimi organizmi opazujemo kot spremenjene vzorce DNA restrikcijskih fragmentov. Pri študijah genetske raznolikosti organizmov se prednost tega markerskega sistema kaže v tem, da so rezultati dobro ponovljivi med različnimi laboratoriji, med slabosti pa lahko uvrstimo tehnično zahtevnost metode. Markerje RFLP so raziskovalci v oljkarstvu uporabili predvsem v študijah genetske raznolikosti kloroplastne in mttohondrijske DNA z namenom rekonstrukcije siljenja oljk v Sredozemlju, ugotavljanju izvora in sorodnosti divjih in kultiviranih oljk.
V zadnjih nekaj letih so bili markerji RAPD najpogosteje uporabljeni molekulski markerji za preučevanje genoma oljke. Naključno namnoženo polimorfno DNA (RAPD) so raziskovalci uporabili v obsežnih Študijah genetske sorodnosti oljk glede na geografski izvor in uporabo plodov (Fabbri ei al., 1995; Claros et al., 2000; Bela j ei al., 2001, 2002; Besnarcl et al., 2001; Sanz-Cortčs et al., 2001) in identifikaciji sort (Vergari et al., 1998; VViesman et al., 1998; Barranco et al., 2000; Bandelj el al., 2001). Markerji RAPD omogočajo odkrivanje in analizo polimorfizmov v celotnem genomu. Metoda temelji na namnoževanju neznanih predelov DNA. Razlike med analiziranimi osebki preučujemo s primerjavo DNA odtisa (profila) posameznega organizma. Velika prednost tehnike RAPD je v nizki razvojni ceni ter v njeni preprostosti, največji omejevalni dejavnik pa slaba ponovljivost rezultatov, kar preprečuje rnedlaboratorijsko primerjavo.
Markerji AFLP (dolžinski polimorfizem namnožeriih fragmentov) ravno tako kot RAPD omogočajo odkrivanje polimorfizmov iz naključnih regij genoma. Ker pokrivajo večji del genoma, se pogosto uporabljajo v različnih genetskih raziskavah, kot so genotipiziranje DNA, identifikacija, kartiranje in preučevanje genetske sorodnosti (Vos et al., 1995; Maughan et al., 1996; Sharma et al... 1996; Cervera et. al., 1998; Jakše et al., 2001). Informacije o uporabnosli markerje v AFLP v genetskih raziskavah oljke so omejene, saj je bila objavljena le študtja Angiollilo et al. (1999), v kateri so preučevali genetsko raznolikost znotraj in med populacijami rodu Olea.
Prvi rnikrosatelitni markerji oljke so bili znani v letu 2000 (Railo et al., 2000; Sefc et al., 2000). Informacije o
karakterizaciji izoliranih mikrosatelitov oljke so za zdaj še precej omejene. Mikrosateiiti združujejo lastnosti različnih markerjev, tako da jih v literaturi večkrat omenjajo kot idealen markerski sistem /a genetske študije. Odlikujejo jih možnost odkrivanja visoke stopnje polimorfizma in s tem velika informativnost (Morgante & Olivieri, 1993; Powell et al., 1996).
PREGLED GENETSKIH RAZISKAV OLJKE Študije izvora in domestikacije oljke
Arheološke izkopanine dobro ohranjenih karbonizi-ranih oljčnih koščic. pričajo o izjemni starosti oljke. Ocenjujejo, da se je oljka skupaj z žiti, stročnicami in datljem pojavila v Palestini okrog 4000 let pred našim štetjem. V srednji in pozni bronasti dobi sta biia olj-karstvo in proizvodnja oljčnega olja dobro razvita na širšem območju Sredozemlja, od Palestine in Sinje do Grčije. Kasneje, v obdobju kolonizacije, so oljko z Bližnjega vzhoda zanesli se v druga sredozemska območja. Oljka pripada kompleksu O. europaea (Green & Wickens, 1989), ki je glede na morfološke karakteristike oljk sestavljen iz 6 podvrst. Vsaka podvrsta je značilna za določeno geografsko območje. O. europaea subsp. europaea je poznana kol sredozemska oljka, O. e. subsp. maroccana (Greut. & Burd.) je endemtčria na območju južnega Maroka, O. e. subsp. laperrinei (Batt. & Trab.) uspeva v Saharskem gorovju, O. e. subsp. cerasiformis (Webb & Berth.) je endemična na Madeira otoku, O. e. subsp. guanchica je poznana na Kanarskih otokih, O. e. subsp. cuspidata (Wall.) pa je razširjena v južni Afriki in na Kitajskem. Podvrsta cuspidata je sestavljena iz več morfološko različnih tipov, ki so omejeni z geografskim območjem: Olea africana Mili. (od južne do vzhodne Afrike), O. chrysophy/la Lam. (od vzhodne Afrike do Arabije) in O. cuspidata Wall, (od Irana do Kitajske) (ßesnard et al., 2002).
Domestikacija v današnjo kultivirano sredozemsko oljko (Olea europaea L subsp. europaea var. europaea) je potekala s selekcijo na večji plod in višjo vsebnost olja, spremenila je tudi reproduktivno biologijo drevesa. Kultivirane oljke se razmnožujejo nespolno (vegetativno) s kloni, tako da imajo fiksirane želene lastnosti. Divje oljke (oleastri) [Olea europaea L. subsp. europaea var. sylvestris (Mili.) Lehr] uvrščamo v dve skupini; divje oblike, ki uspevajo v primarnih nišah brez kultiviranja in sredozemskih gozdovih, ter podivjane tipe, ki so nastali s spontanim križanjem med oleastri in sortami v opuščenih nasadih (Zohary & Spiegel-Roy, 1975). Divjih (pravi oleastri) in podivjanih oblik (feral) na osnovi morfoloških znakov ni moč ločiti, ker so si fenotipsko izredno podobne, medtem ko so uspešno opravili identifikacijo oz. ločitev z molekulskimi markerji. Kultivirane, divje in podivjane oljke se lahko med seboj neovirano križajo. Križanja omogočajo vključitev genov
260
ANNALES • Ser. hist. nat. • 12 ■ 2002 ■ 2
Durij.i 6ANDEi.J MAVSAR «i al.: GENETSKE RAZISKAVE OLJKE, 229-248
iK divjih oljk v kultivirane, kar se navsezadnje kaže v veliki genetski raznolikosti današnjih oljk. Kompleksno genetsko ozadje oljke je velik izziv za različne raziskovalne skupine, ki poskušajo pojasniti njihov nastanek, geografski izvor, genetsko sorodnost ter preučiti in rekonstruirali zgodovino udomačitve oljke.
Izvor in domestikacijo kultivirane oljke sta preučevala Besnard in Berville (2000). Z raziskavo sta želela ugotoviti, ali imajo kultivirane oljke in oleastri skupen izvor v sredozemskem bazenu, zato sta v analizo vključila oljke, razširjene v Aziji, Afriki in Evropi. Analizirala sta 121 sort, 300 oleastrov, 27 populacij iz sredozemskega bazena in 74 dreves različnih podvrst iz Maroka (O. maroccana), Alžirije (O. laperrinei), Kanarskih otokov (O. c. spp. cerasiformis), Kenije, južnoafriške republike, Zlmbabveja (O. africana), jemna (O. chryso-phylia), Irana, Indije in Kitajske (O. cuspidata). Z molekulskimi markerji sta preučevala raznolikost jedrne, mitohondrijske in kloroplastne ONA. Na osnovi rezultatov citoplazmatskega DNA polimorfizma sta naredila rekonstrukcijo širitve sort ter podala distribucijo tipov citoplazme v lokalnih oleastrih. Oljke O. africana, O. chrysophylla in O. cuspidata imajo različno kloro-plastno DNA. O. maroccana in O. e. spp. cerasiformis imata tip kloroplasta, ki ga najdemo v večini sort in ofeastrov. Več polimorfizma so odkrtli v mitohondrijski DNA v primerjav} s kloroplastno DNA. V kompleksu O. europaea sta odkrila 12 različnih tipov mitohondrijske DNA (v nadaljevanju mitotip), vendar od teh le 4 take, ki obstajajo v sredozemskih oljkah. Oleastri in sorte vsebujejo mitotip MITI, kar nakazuje, da so današnje sorte nastale z domestikacijo oleastrov na Bližnjem vzhodu. Na zahodu se pojavlja mitotip MCK, ki pripada rodu Oiea iz terciarne dobe. Mitolip MOM so odkrili v oljkah iz Sahare in vzhodne Afrike, ME2 pa samo v določenih sortah. Raznolikost jedrne DNA oleastrov, odkrite z markerji RAPD, jc pokazala ločitev med vzhodnimi in zahodnimi oljkami, pri sortah pa ni bilo jasne meje, po vsej verjetnosti zaradi prenašanja rastlinskega materiala iz kraja v kraj in regionalne selekcije sort. V zaključkih sta avtorja zapisala, da obstaja več območij izvora in da je izvor oljke bistveno kompleksnejši, kot so pričakovali.
Študije genetske variabilnosti divjih in kultiviranih oljk
Med prve raziskave genetske variabilnosti oljke sodi delo Loukasa in Krimbasa (1983), ki sta analizirala 25 sort s petnajstimi izoenchnski sistemi. Na osnovi raznolikosti izoencimskih sistemov sta ugotovila, da je velikost plodov oljk pomembna pri ugotavljanju sorod-nostnih odnosov med sortami. Večjo genetsko sorodnost je možno odkriti pri sortah, ki so bile selekcionirane za namizne oljke (veliki plodovi). Podobno genetsko sorodnost sta odkrila tudi v skupini sort s srednje velikimi plodovi, ki se uporabljajo za olje.
V	letu 1999 je bila objavljena prva obsežnejša študija genetske variabilnosti znotraj in med populacijami rodu Oiea z markerji AFLP. Angiolillo et al. (1999) so z raziskavo želeli odgovoriti predvsem na dve vprašanji: iz katerih divjih oljk so se razvile današnje kultivirane oljke in katere populacije lahko v prihodnosti dodatno izboljšajo kultivirano oljko. V analizo so vključili 43 sort, 30 divjih oljk in 9 oljk, ki po klasifikaciji Groena iri VVickensa (1989) ne pripadajo vrsti O. europaea. Obseg polimorfizma je pokazal zelo jasno ločitev kultiviranih in divjih oljk v dve skupini. Avtorji so poskušali odkriti povezavo med večjo genetsko sorodnostjo sort glede na geografski izvor, vendar so med sortami večjo genetsko sorodnost odkrili le pri oljkah s Sicilije. Slednje ugotovitve potrjujejo kompleksnost domestikacije oljke. Kultivirane in divje oljke ter vrste iz severnozahodne Afrike so genetsko sorodnejše v primerjavi z vrstami iz vzhodne Afrike in Azije, Največja variabilnost je bila odkrita pri vrstah z otokov indijskega oceana in Avstralije. Avtorji so v nadaljevanju predvidevali, da sta kultivirana in divja oljka različni obliki iste vrste O. europaea, divji vrsti iz Maroka (O. maroccana) in iz Alžirije (O. laperrinei) pa sta verjetno vmesni obliki med O. europaea in azijskimi vrstami.
Amane et al. (1999) so z markerji RR.P preučevali polimorfizem kloroplastne DNA oljk iz sredozemskega bazena. Analizirali so 72 sort, 89 lokalnih, starih dreves in 101 oleastrov. Z analizo potomcev kontroliranega križanja so dokazali dedovanje kloroplastne DNA po materi. V celotni vrsti europaea so odkrili 5 različnih klorotipov. Klorotip t je bil najpogostejši v oleastri h in kultivirani oljki, drugi klorotipi (II, ¡11 in IV) pa so bili odkriti samo v oleastrih. Klorotip V so okarakterizirali s tremi mutacijami, ki jih najdemo v različnih predelih kloroplastne DNA (cpDNA), pojavil pa se je tako v kultiviranih kot divjih oljkah, vendar le v moško sterilnih drevesih s specifično anomalijo peloda. Predvidevajo, da je klorotip V povezan z večjo plodnostjo, ki je navadno opažena pri moško sterilnih drevesih.
V	Maroku so Amane et al. (2000) preučili polimorfizem markerjev RFLP kloroplastne DNA kultiviranih in divjih oljk. Z raziskavo so želeli ugotoviti sorodstvene odnose med kultiviranimi in divjimi oljkami v Maroku in med vrsto O. europaea ter endemično vrsto O. laper-rine i subsp. rnaroccana. Odkrili so 4 klorotipe: klorotip t je prevladoval v kultivirani (100%) in divji oljki (74%), kar kaže na tesno sorodstvo po materi, klorotipa 11 in III pa sta bila ugotovljena le v divjih maroških oljkah. Izvirnost taksona O. rnaroccana naj bi dokazoval klorotip IV, saj se je pojavil fe pri tej vrsti.
Besnard et al. (2001) so zbrali 102 genotipa iz različnih območij Sredozemlja ter z analizo polimorfizma jedrne in mitohondrijske DNA preučili sorodstvene povezave sort. V raziskavi so uporabili markerje RAPD in RFLP. Na osnovi muitivariatne analize so izdelali dendrogram, v katerem so bile sorte
99
ANNALES • Ser. hist. riat. ■ 12 • 2002 • 2
Dim j s 8ANLULJ MAVSAR cl al.; GE^FTSkF RAZ S5 KAVE Ol.JKE. 239-21«
razdeljene v 22 skupin, ki so se ujemale tako z regijo gojenja kot z uporabo o!jk (olje/namizne oljke), iz dobljenih rezultatov so predpostavljali, da je selekcija sort potekala v različnih regijah kot rezultat kolonizacije v času rimske dobe in prenašanja rastlinskega materiala z vzhoda na zahod. Podobno so sklepali tudi iz poli-morfizma mitohondrijske DNA. Mitotipa MGM in MCK so odkrili samo v zahodnih sortah, ME1 mitotip pa v sortah iz Francije. Ker je MET mitotip značilen tudi za oleastre z vzhoda, menijo, da francoske sorte izhajajo prav z vzhoda. Njihovi rezultati potrjujejo tudi domnevo, da je selekcija v zahodem genskem bazenu potekala predvsem v smeri izboljšanja oljevitostt oljk.
Preučevanje polimorfizma jedrne in mitohondrijske DNA ostaja med najpogostejšimi raziskavami domesti-kacije oljke. Bronzini de Caraffa et a/. (2002) so z molekulskimi markerji RAPD in RFLP preučili poli-morfizem jedrne in mitohondrijske DNA kultiviranih in divjih oljk na Korziki in Sardiniji. Korzika in Sardinija sta zanimiv genski bazen oljk, saj v tem območju uspeva veliko sort in oleastrov. Oleastre je možno odkriti tudi v gozdovih. Sorte so bile večinoma prinesene iz Italije, nekaj pa jih je nastalo z lokalno selekcijo. V opuščenih nasadih uspevajo podivjane oljke, križanci ofeastrov in sort. Podivjane oljke so sicer fenotipsko podobne oleastrom, večjo genetsko sorodnost pa kažejo s sortami. Z raziskavo so želeli preučiti tudi vpliv vzhoda (Italije) in zahoda pri nastanku korziških in sardinijskih oljk. V analizo so vključili 32 sort in 99 oleastrov. Polimorfizem mitohondrijske DNA je ravno tako kot pri zgoraj navedenih študijah pokazal obstoj 4 mitotipov; MET, ME2, ki sta značilna za vzhodne oljke, MOM iri MCK, karakteristična za oljke iz zahodnega Sredozemskega bazena. Večina sort s Korzike in Sardinije trna vzhodni mitotip, kar potrjuje difuzijo sort z vzhoda proti zahodu, Na Korziki so odkrili dve skupini sort. Ena je v lesni sorodnosti z oleastri, druga pa je povezana z italijanskimi in sardinijskimi sortami,
Raziskave genetske variabilnosti oljk potekajo tudi v Avstraliji. V južno Avstralijo so od leta 1836 prinesli na stotine sort oljk. Navzkrižno oprasevanje dreves v 160 let starih in opuščenih nasadih se kaže v nastanku podivjanih populacij dreves, ki uspevajo v vseh regijah in so ekološki problem zaradi konkuriranja z naravno vegetacijo. Zaradi slednjega so ponekod lokalne oblasti oljčno drevo proglasile kot plevel in ga poskušale zatreli. 7, namenom, da bi preučili dinamiko širjenja podivjanih vrst oljk, so Mekuria et al. (2002) z markerji RAPD analizirali populacijo 45 dreves iz južne Avstralije. Na osnovi vizualnih opazovanj so drevesa razdelili v tri skupine: sorte, domnevne potomce nekontroliranih križanj sort in podivjane oljke. Med seboj so primerjali profile RAPD posameznih dreves. Znotraj posamezne skupine oljk so odkrili velik polimorfizem, pri primerjavi polimorfizma med skupinami pa ni bilo večjih odstopanj.
Belaj et al. (2002) so z markerji RAPD preučevali genetsko raznolikost večje skupine sort (103) iz genske banke v Cordobi. Med glavne cilje raziskave so uvrstili: opisati raznolikost sort v svetovni genski banki oljke z markerji RAPD, izvrednotiti sorodnost med sortami znotraj kolekcije, preučili vzorec raznolikosti sort z različnim geografskim poreklom, uporabiti dobljene informacije v žlahtniteljskih programih ter podati strategijo vzorčenja v kolekcijah genskih virov oljke. Združevanje v sorodnostne skupine sort iz sosednjih geografskih območij nakazuje, da imajo le te skupno genetsko ozadje. Veliko genetsko sorodnost kažejo francoske sorte in sorte iz vzhodnega in osrednjega Sredozemlja, kar pomeni, da imajo skupen izvor.
Molekulska karakterizacija in identifikacija kultivarjev oljk
Vegetativo razmnoževanje oljke je v preteklosti omogočilo intenzivno izmenjavo rastlinskega materiala v državah Sredozemlja, kar pa je povzročilo nejasnosti glede imenovanja sort in klonov. Številne in zelo različne sorte so nastale kot rezultat naravne selekcije ter selekcije sort in kfonov na regionalnem nivoju. Število sort oljke je danes ocenjeno na 2000, vendar je lahko zaradi pojavljanja homonimov in sinonimov precenjeno ali podcenjeno, kar pa povzroča večje težave pri vrednotenju genetskega materiala oljke. Mnoge sorte so bile opisane že v davni preteklosti, veliko pa je takih, ki so še vedno neklasificirane ali celo neznane (Fon-tanazza, 1996). Na območjih, kjer je oljkarstvo tradicionalno in ni bilo večjih tehnoloških napredkov, lahko še danes najdemo ekotipe, ki so poznani le na lokalnem nivoju. Z namenom, da ohranijo genske vire oljke, so leta 1971 v Cordobi (Španija) ustanovili svetovno gensko banko oljke Olive Vvorld Germplasm Bank (OVVGB). V genski banki je zbrano 328 sort iz različnih držav. Identifikacijska dela so pokazala, da je kar nekaj zbranih sort zastopanih večkrat, kar pa je posledica sinonimov (Cabal lero & del Rio, 1999). Zaradi boljšega kontroliranja rastlinskega materiala oljke v prometu in pravilne identifikacije sadik v drevesnicah moramo vzpostaviti sistem nedvoumne identifikacije sort in klonov, kar bo prispevalo tudi k hitrejšemu reševanju sinonimov in homonimov.
Prvi sistemi identifikacije oljk so temeljili na opisnih lastnostih rastline: vejice, socvetja, ploda, lista in endokarpa (Ctfferri ef a!., 1942). Primarno identifikacijo so v sklopu mednarodnega projekta RESGEN-C196/97, ki ga financirata EU in Mednarodni svet za oljčno olje, začeli opravljali v 10 državah z namenom ohranitve, karakterizacije in zbiranja genskih virov oljke (Cabailero & del Rio, 1999). Kvantitativni in kvalitativni deskriptorji oljke (Gregoriou, 19%; Cantini et al., 1999; t.evanič et al., 2000; Koprivnjak & Pribetič, 2000) pa niso rešili dejanskega problema identifikacije, saj so ti znaki v
212
ANNALES • Ser. hist. nat. • 12 ■ 2002 ■ 2
Dunt» 8ANCK.ll iMAVSAS ci »I : GENETSKE RAZISKAVE OUKE, 239-245
veliki meri odvisni od vplivov okolja, ekspresije genov, specifičnosti analiziranega tkiva in razvojnega obdobja rastline. Podobno velja tudi za izoencimske markerje, s katerimi so poskušali ločiti različne sorte v Španiji (Trujillo et al., 1995) in Maroku (Ouazzani et ai, 1996). Z razvojem molekulskih markerjev se je sistem identifikacije bistveno spremenil. Tradicionalno vrednotenje in identifikacijo na osnovi morfoloških markerjev bi bilo smiselno dopolniti z molekulskimi markerji, saj nam bodo le slednji dokončno omogočili rešiti probleme imenovanja sort.
Markerji RAPD so bili do sedaj najpogosteje uporabljeni pri razločevanju sort. V Španiji so Belaj ef al. (2001) proučevali polimorfizern in sposobnost razločevanja sort oljk iz genske banke v Cordohi. Analizirali so 51 reprezentativnih sort. Avtorji poročajo o markerskem sistemu RAPD kot zelo uporabnem pri upravljanju genskih bank, saj omogoča natančno in hitro identifikacijo večjega števila sort. Na osnovi multivariatne analize so izdelali dendrogram, v katerem so bile sorte razvrščene v sorodnostne skupine glede na geografski izvor.
Za provinco Malaga (Andaluzija) v južni Španiji so značilna območja, ki se močno razlikujejo v pedokfi-matskih razmerah. Claros ef al. (2000) so predpostavljali, da je v tem območju genetska variabilnost oljk kot posledica adaptacij na okoljske razmere zelo velika. Zaradi izjemne ekonomske pomembnosti oljke v Andaluziji in zaradi nepoznavanja genetskega ozadja tamkajšnjih oljk so analizirali 56 sort iz različnih oljčnikov. Pri ugotavljanju genetske sorodnosti s pomočjo markerjev RAPD so odkrili 3 skupine, med katerimi je ena vključevala avtohtone andaluzijske oljke, kar nakazuje, da so le-te nastale v območju s selekcijo in imajo skupno genetsko ozadje.
V Argentini uspevajo številne sorte španskega in italijanskega izvora. Cavagnaro et al. (2001) so pričakovali, da obstaja možnost napačnih imenovanj sort, zato so preučili 10 najpogostejših sort v Argentini, ki jih hranijo v zbirki v Mendozi. V analizo RAPD so vključiti tudi nekatere istoimenske sotte iz genske banke v Cordobi. Pri primerjavi profilov RAPD sedmih sort iz svetovne kolekcije in kolekcije iz Argentine so odkrili, da ima le sorta 'manzanilla de Carmona' enak profil RAPD, vse druge pa se v profilu RAPD razlikujejo Cfarga', 'empeltre', 'frantoio', 'manzanilla española', 'arbequirta', 'arauc.o'}. Največ razlik v profilih RAPD so odkrili pri sortah 'frantoio' in 'farga'. Razlike v profilih RAPD istoimenskih sort so lahko posledica napačnega poimenovanja ali pa obstoja različnih klonov znotraj sort.
Zaradi negotovosti glede identifikacije ter opaženih fenotipskih razlik znotraj nekaterih lokalnih sort so Wiesman et al. (1998) v Izraelu z markerji RAPD ovrednotili tradicionalne in prinesene sorte. Ugotovili so, da so slednje genetsko homogene. Lokalna sorta 'souri' je prav tako homogena in dobro definirana sorta. Znotraj sorte 'nabali' so odkrili polimorfizern, kar je
verjetno posledica spontanih križanj različnih genotipov v preteklosti. Molekulska karakterizacija je raziskovalcem omogočila pojasniti, kako in kje se je lokalni material razmnoževal ter širil med pridelovalci v Izraelu.
V	Franciji poteka revitalizadjski program oljkarstva, katerega namen je narediti podatkovno bazo petdesetih referenčnih genotipov oljk, ki bo v pomoč drevesničar-jem pri identifikaciji in certifikaciji sadilnega materiala. Khadari ef al (2001) so z markerji RAPD opisali 32 sort. Da bi dobili res pravi referenčni profil sorte, so za vsako sorto analizirali najmanj 3 drevesa iz različnih lokacij. Pri 32 sortah so odkrili sortno specifičen profil RAPD, 2 do 3 različne profile RAPD na sorto pa so odkrili pri 9 sortah, zato so kot referenčni profil za identifikacijo avtorji izbrali tistega, ki je bil značilen za veČino dreves analizirane sorte. Razlike v profilih RAPD znotraj sorte pripisujejo napačnemu poimenovanju in označevanju dreves. Pri analizi različnih klonov znotraj sort 'grossane' (13), 'cailletier' (6) in 'picholine' (8) i markerji RAPD niso odkrili razlik. Vsi kloni so imeli enak profil RAPD. Podatkovno bazo referenčnih genotipov oljk bodo v Franciji dopolnili še z mikrosatelitnimi markerji.
V	Sloveniji se je v zadnjih štiridesetih letih sortna struktura precej spremenila, predvsem zaradi precep-Ijanja starih lokalnih sort s sorto 'istrska belica' in sajenja sort, prinešenih iz Italije. Zaradi pomanjkljivih informacij o sortni strukturi območja slovenske Istre smo v letu 1999 pričeli z inventarizacijo sort s pomočjo mednarodnih deskriptorjev (Levanič ei al, 2000). Morfološko karakterizacijo smo v nadaljevanju dopolnili z molekulsko. Polimorfizern 10 prinesenih in 5 lokalnih sort oljk, ki uspevajo v kofekcijskem nasadu, smo preučili z markerji RAPD (Bandelj ef al., 2001). Glede na nivo odkritega polimorfizma lahko sklepamo, da imamo v Sloveniji veliko genetsko raznolikost sort, kar je pričakovati glede na število sort, prinešenih iz tujine. Razvili smo sistem identifikacije sort z markerji RAPD ter izdelali podatkovno bazo referenčnih sortnih profilov RAPD. Molekulska analiza dreves v kolekciji je potrdita identičnost genotipov znotraj trinajstih sort, pri dveh sortah pa smo odkrili napačno označitev dreves, do katere je jjo vsej verjetnosti prišlo v času dosajevanja. Markerji RAPD so uporabni pri upravljanju kolekcij, saj nam omogočajo preverjanje identitete sadik in s tem zmanjšanje napak pri postavitvi nasadov ali kolekcij.
Mikrosatelitni markerji in njihova uporaba v oljkarstvu
V	letu 2000 sta dve raziskovalni skupini poročali o izolaciji prvih mikrosatelitnih markerjev oljke. Sefc etal. (2000) so objavili identifikacijo 15 mikrosatelitnih lo-kusov in predstavili njihovo karakterizacijo v izbranem setu oljk. Ralio et al. (2000) so izolirali 5 novih mikrosatelitnih markerjev oljke, preučili njihovo dedovanje na križancih družine 'leccino' in 'dolce agogia' ter jih uporabili v identifikacijske namene. Velika informa-
101
ANNALES • Ser. hist. nat. • 12 ■ 2002 ■ 2
Dimja BANDEIJ MAVSAR el il.: GLNEÏ5KE RAZt$KAV£ OLIKE, 235-240
tivno5t mikrosateîitnih markerjev je omogočila razločevanje med 42 sortami od 46 analiziranih. Cipnaní el al. {2002) ter Carriero et al- (2002) so objavili najnovejša dela o postopkih izolacije mikrosateîitnih markerjev oljke. Med vsemi danes razpoložljivimi markerji mikro-sateliti največ obetajo. Prednost lega rnarkerskega sistema je v dobri ponovljivosti rezultatov znotraj in med laboratoriji ter možnosti izmenjave rezultatov med različnimi raziskovalnimi skupinami. Med slabosti uvrščamo visoko razvojno ceno tehnike ter dolgotrajen in zahteven postopek izolacije mikrosatelitov. V zadnjih dveh letih je razvoj mikrosateîitnih markerjev oljke že omogočil nekaj aplikativnih raziskav, ki jih bomo v nadaljevanju na kratko predstavili.
V okolici Gardskega jezera obstajajo 3 geografsko zaščitena porekla oljčnega olja: Garda Bresciano, Garda Orientale in Garda Trentino. Za vsako območje je natančno določeno, katero sorto lahko pridelovalci gojijo v oljčnikih in kolikšna količina določene sorte, izražena v odstotkih, srne biti zastopana v oljčnem olju. Zato je pomembno, da se sortna struktura preuči, preden se zakonsko določi, katera sorta sme biti v oljčnem olju določenega geografskega porekla in katera ne. Nekatera olja, ki so zaščitena z geografskim poreklom, smejo biti pridelana le iz avtohtonih ali lokalnih sort, medtem ko so lahko prinesene sorte v olju zastopane v zelo majhnem deležu. Sorta 'casaliva' naj bi bila lokalna in značilna za Gardo, vendar fenotipsko spominja na sorto 'frantoio', podobno velja za sorti 'les' in 'leccino'. Zaradi nejasnosti, ali gre za popolnoma različne sorte ali sorte s sinonimi, so Testolin et al. (2000) z mikrosatelitnimi markerji opisali 8 lokalnih sort fcasa-liva', 'favarol', 'fort', 'grtgnan', les', 'raza', 'rossanel', 'trep') ter nekaj širše razširjenih italijanskih sort 'coratina', 'frantoio', 'leccino', 'maurino' in 'pendoiino'. Opis DNA sort z mikrosatelitnimi markerji (genotipi-¿ i ra nje DNA) je pokazal, da imajo rastline iste sorte, ki uspevajo v različnih oljčnikih, večinoma enak genotip. Razlike, ki so jih odkrili znotraj nekaterih sort, pri-
pisujejo akumuliranju mutacij v daljšem časovnem obdobju. Na osnovi primerjave genotipov sorte 'casaliva' in 'frantoio' menijo, da 'casaliva' pripada sortni populaciji 'frantoio', vendar gre za dve različni sorti. Enako velja tudi za sorti 'leccino' in 'les'.
Sorta 'oblonga' izvira iz Kalifornije (Corning), kjer so jo kot spontani sejanec odkrili okrog Seta 1940. Glavna lastnost sorte je dobra odpornost proti VerticMium dahltae. Iz Kalifornije so jo prinesli v gensko banko v Cordobi. 'Frantoio' je znana kot pomembnejša sorta v osrednji Ital iji, kjer jo gojijo Že več sto let. Zaradi izredne kakovosti oljčnega olja je bita prenesena v številne države, vkjučno z Argentino, južnoafriško republiko, Avstralijo in ZDA. V genski banki so odkrili, da sta sorti 'oblonga' in 'frantoio' fersotipsko identični, zato so preučili njune morfološke, agronomske lastnosti ter primerjali njuno DNA z mikrosatelitnimi markerji in markerji RAPD. Sorti 'oblonga' in 'frantoio' imata enake profile RAPD, enake alele na vseh mikrosateîitnih lokusih, razlik niso odkrili tudi pri primerjavi 15 morfoloških znakov (list, plod, endokarp) in 8 agronomskih lastnosti. Na osnovi molekulskih in morfoloških analiz avtorji domnevajo, da gre za isto sorto (Barranco et al., 2000).
V Sloveniji smo s predhodno izoliranimi mikrosatelitnimi markerji (Sefc ef a/., 2000) natančneje preučili 19 sort iz kolekdjskega nasada. Visoka informativnost mikrosatelitov je omogočila razločevanje med vsemi analiziranimi sortami. Pri primerjanju posameznih genotipov sort srno odkrili določeno podobnost med slovenskimi in toskanskimi sortami, kar lahko nakazuje, da so slovenske sorte z lokalno selekcijo na regionalni ravni nastale ravno iz italijanskih. Rezultati raziskave nam bodo omogočili identifikacijo sort, kontrolo izvora vegetativno razmnoženega rastlinskega materiala oljke in sadik ter pripomogli k boljšemu poznavanju in nastanku sortne strukture oljk v slovenski Istri. Predstavljeno opisovanje DNA sort z mikrosatelitnimi markerji je med prvimi tovrstnimi študijami na področju oljkarstva (Ban-delj et al., 2002).
GENETIC STUDIES IN OLIVES
Dunja BANDELJ MAVSAR Institute for Mediterranean agriculture and olive growing, Science and Research Centre of tin? Republic of Slovenia,
Koper, 51-6000 Koper, Garibaldijc-va 16 E-mail: Dunja.Bandelj@zrs-kp.si
Jernej JAKSE & Branka JAVORNIK Cenlre for Plant Biotechnology and Breeding, Department of Agronomy, Biotecbnical Faculty, University of Ljubljana,
SI-1000 Ljubljana, Jamnlkarjeva 10?
SUMMARY
The olive tree has been cultivated for millennia in the Mediterranean basin, where it happens to be one of the most: important crops. The recognition of olive oil as a healthy source of fats in relation to other vegetable fats
102
ANNALES • Ser. hist. nat. -12- 2002 • 2
OuHjd BANOUll MAVSAR «(.». I -.¡-NtTS« RAZISKAVE OIJKF. J 39-246 ~	"
increases its de/nanc/ and consequently the need for more trail oriented breeding to develop new cultivars. In this respect, evaluation of olive germplasnis has been recognized as very important; since collected germplasms can he a useful source of traits, not traditionally accounted for in olive selection in the past, but important for modem olive growing. In comparison to other horticultural plants with which significant improvements have been achieved using molecular genetic knowledge, relatively limited molecular research has been carried out in olives. Current genetic research and future orientations in relation to gennplasm evaluation, genetic diversity studies and cultivar typing, including our own results, are discussed in this review.
Key words: olive, Olea europaea, molecular markers, genetic diversity
LITERATURA
Amane, M-, R, Lumaret, V. Hany, N. Ouazzani, C. Debain, G. Vrvter & M. F. Degurlloux (1999): Chlo-ropiast-DNA variation in cultivated and wild olive (Olea europaea U. Theor. Appl. Genet., 99, 133-139. Amane, M., N. Ouazzani, R. Lumaret & C. Debain (2000): Chloroplast DNA variation in cultivated and wild olive (Olea europaea L.) of Marocco. Euphytica, 116,59-64.
Angiolillo, A., M. Mencuccint & L. Baldoni (1999):
Olive genetic diversity assessed using amplified fragment length polymorphisms. Theor. Appl. Genet., 98, 411-421.
Bandeij, D., J. Jakse & B. Javornik (2001): identification of olive (Olea europaea L) cultivars by molecular markers. Res. Reports. Biotechnical faculty, University of Ljubljana, Agricultural Issue 77, 11-17. Bandeij, D., j. Jakse & B. Javornik (2002): DNA fingerprinting of olive varieties by microsatellite markers! Food Techno!. Biotechnol., 40, 191-197. Barranco, D., I Trujillo & P. Rallo (2000): Are Oblonga' and 'Frantoio' olives the same cultivar? Hort Science, 35, 1323-1325.
Belaj, A., I. Trujiifo, R. dc la Rosa, L. Rallo & M. J. Gimenez (2001): Polymorphism and discrimination capacity of randomly amplified polymorphic markers in an olive germplasm bank. J. Amer. Soc. Hort. Sd-, 126, 6471.
Belaj, A., Z. Satovic, L. Rallo & I. Trujillo (2002):
Genetic diversity and relationships in olive (Olea europaea L.) germplasm collections as determined by randomly amplified polymorphic DNA. Theor. Appl. Genet., 105, 638-644.
Besnard, G. & A. Berville (2000): Multiple origin for Mediterranean olive (Olea europeae L ssp. europaea) based upon mitochondrial DNA polymorphism. Acad. Sci. Paris/Life Sci., 323, 173-181. Besnard, G., P. Baradat & A. Berville (2001): Genetic relationships in the olive (Olea europaea I.) reflect multilocal selection of cultivars. Theor. Appl. Genet., 102, 251-258.
Besnard, G., B. Khadari, P. Baradat & A. Berville (2002): Olea europaea (Oleaceae) phylogeography
based on chloroplast DNA polymorphism. Teor. Appl. Genet., 104, 1353-1361.
Bronzini de Caraffa, V., J. Maury, C. Gambotti, C. Breton, A. Berville & J. Giannettmi (2002): Mitochondrial DNA variation and RAPD mark oleasters, olive and feral olive from Western and Eastern Mediterranean. Theor. Appl. Genet., 104, 1209-1216. Caballero, M. & C. del Rio (1999): Conservazione delle risorse genetiche dell' oltvo. Zhornik mednarodnega seminaija "Genetic resources". Firence, Italija, s. 120.
Cantini, C., A. Cimato & G. Sani (1999): Morphological
evaluation of olive germplasm present in Tuscany
region. Euphytica, 109, 173-181.
Carriero, F., G. Fontanazza, F. Cellini & G. Giorro
(2002): Identification of simple sequence repeats (SSRs)
in olive (Olea europaea L.). Theor. Appl. Genet., 104,
301-307.
Cavagnaro, P., J. Juarez, M. Bauza & R. W. Masuelli (2001): Discriminación de variedades de olivo a través del uso de caracteres morfológicos y de marcadores moleculares. AgriScientia, 18, 27-35. Cervera, M. T., J. A. Cabezas, J. C. Sancha, F. Martinez de Toda & J. M. Martinez-Zapater (1998): Application of AFLPs to the characterization of grapevine Vitis vini-fera L. genetic resources. A case study with accessions from Rioja (Spain). Theor. Appl. Genet., 97, S1-59. Ciferri, R., M. Marinucci & A. Morettini (1942): Dati preliminari per una sistemática della razze di olivo in co'tura. L' Olivicolture, 1, 3-7.
Cipriani, G., M, T. Marrazzo, R. Marconi, A. Cimato & R. Testolin (2002): Microsatellite markers isolated in olive (Olea europaea L.) are suitable for induvidual fingerprinting and revealing polymorphism with ancient cultivars. Theor. Appl. Genet., 104, 223-228. Claros, M. G., R. Crespilla, M. L. Aguilar & F. M, Cánovas (2000): DNA fingerprinting and classification of geographically related genotypes of olive-tree (Olea europaea I.). Euphytica, 116, 131-142. Fabbri, A., J. I. Hormaza & V. S. Polito (1995): Random amplified polymorphic DNA analysis of olive (Olea europaea L.) cultivars. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 120, 538-542,
247
ANNALES • Ser. hist. nat. -12- 2002 • 2
DitJija UANDFLI MAVSAfi el CfKFTSKE RAZISKAVt OlJKt. .>39-248
Fiorino, P, & L. Raito (1999): Migliorarnento genetico in olivo (Olea europaea L.). Zbornik mednarodnega seminarja "Genetic resources". Firence, Italija, s. 1-24. Fontanazza, G. (1996): Genetic aspects and propagation techniques tor intensive cultivation. In: CO!, World Olive Encyclopaedia, l-GEDSA. Sabadell, Španija, 5. 122-134.
Green, P. S. & G. E. Wickens (1989): The Olea europaea complex. In: Kit Tan fed.): The Davis & Hedge Festschrift Edinburgh University Press, Edin burg, s. 287299.
Gregoriou, C. (1996): Assesment of variation of land-races of olive tree in Cyprus. Fuphytica, 07, 173-176. Jakše, J., K. Kindlhofer & B. Javornik (2001): Assessment of genetic variation and differentiation of hop genotypes by microsatellite and AFLP markers. Genome, 44, 773782.
javornik, B. (199f>): Specifične metode genske tehnologije pri rastlinah - analiza genoma. V: Raspor, P. (ur.): Biotehnologija. BIA d.0.0., Ljubljana, 292 str. Khadari, B., N. Moutier & F. Dosba (2001): Molecular characterisation of French olive varieties: Construction of a database of reference genotypes. Olivae, 87, 29-32. Kuprivnjak, O. & O. Pribetic (2000): Autochthonous olive cultivate in ¡stria - quality and morphological characteristics of oil: Preliminary results. Zbornik konference "Perspectives for horticulture and viticulture in the alpine region in the third millentum". Udine, Italija , s. 216-220.
Leva, A. R., G. Montagni & R. Petruccelli (2000):
Risposta agronomics di olivi micropropagati. Zbornik strokovnega posveta "Sredozemsko kmetijstvo in oijkar-stvo". 11. november 1999, Izola, Slovenija, s. 101-104, Levanič, T., V. Vesel & D. Bandelj (2000): Poizkus razlikovanja sort oljk v slovenski Istri na osnovi morfoloških znakov endokarpa. Zbornik strokovnega posveta "Sredozemsko kmetijstvo in oijkarstvo". 11. november 1999, Izola, Slovenija, s. 93-99.
Loukas, M. & C. B. Krimbas (1983): History of olive cultivars based on their genetic distances. Journ. of Hort. Sci., 58, 121-127.
Maughan, P.J., M. A. Sanghai Maroof, G. R. Buss & G. M. Huestis (1996): Amplified fragment length polymorphism (AFLP) in soyabean: Species diversity, inheritance, and near-isogenic line analysis. Theor. Appl. Genet., 93, 392-401.
Mekuria, G. T., G. Collins & M. Sedgley (2002): Genetic diversity within an isolated olive (Olea europaea L.) population in relation to feral spread. Scientia Horti-culturaea, 94, 91-105.
Mencuccini, M., M. Michcli, A. Angiolillo & L. Baldoni (1998): Primi risultati netla transforrnazione genetica dell' olivo median te I' impiego di agrobatteri. Olivo & Olio, 4, 61-64.
Morgante, M. & A. M. Olivieri (1993): PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics. Plant J., 3, i 75-182.
Ouazzani, N., R. Lumaret & P. Villemur (1996):
Genetic variation in the olive tree (Olea europaea i.J cultivated in Marocco. Euphytica, 91, 9-20. Powell, wv M. Morgante, C. Andre, M. Hanafey, j. Vogel, S. Tingey & A. Rafalski (1996): The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis. Mol. Breed., 2, 225-238. Rallo, l. (1999): Miglioramento delie risorse genetiche. Zbornik mednarodnega seminarja "Genetic resources". Firence, Haiija, s. 1-28.
Rallo, P., G. Dorado & A. Martin (2000): Development of simple sequence repeats (SSRs) in oiive tree (Olea europaea I.). Theor. Appl. Genet., 101, 984-989. Sanz-Cortes, F.r M. L. Badenes, S. Paz, A. iniguez & G. ilacer (2001): Molecular characterization of olive cuitivars using RAPD markers. I. Amer. Soc. Hort. Sci., 126,7-12.
Sefc, K. M., M. S. lopes, D. Mendon^a, M. Rodrigues Dos Santos, M. Laimer Da Camaia Machado & A, Da Camara Machado (2000): Identification of microsatellite loci in olive (Olea europaea L.) and their characterization in Italian and Iberian olive trees. Mol. Eco!.r 9, 1171-1173.
Sharma, S. K., M. R. Knox & T. H. N. Ellis (1996): AFLP analysis of the diversity and phytogeny of Lens and its comparison with RAPD analysis. Theor. Appl. Genet., 93,751-758.
Standard), A., M. Micheli & e. Pkcioni (1998):
Propagazione 'in vitro' dell' otivo: acquisizione e prospective. Rivista di frutticoltura e di ortofloricoltura, 7/8, 19-23.
TestoSin, R., G. Cipriani, T. Marazzo, R, Marconi & A. Cimato (2000): identificazione genetica delie variefe di olivodel Garda. L' Informatore Agrario, 34, 1-6. Trujillo, I., L. Ratio & P. Anis (1995): Identifying olive cuitivars by isozyme analysis, j. Amer. Soc. Hort. Sci., 120,318-324.
Vergari, g., m. Patumi, F. Battolozzi & g. Fontanazza (1998): Ulilizzo di marcatori RAPD per !a di scrim i-nazione di varied di olivo appartenenti alia popo-lazione varietaledi 'Frantoio'. Olivae, 73, 31-36. Vos, P., K. Rogers, m. Sleeker, m. Reijans, T. Van de Lee, m. Homes, A. Frijters, J. Pot, J. Pelentan, m. Kuiper & m. Zaheau (1995): AFLP: a new technique for DNA fingerprinting- Nucleic Acids Res., 23, 4407-4414. Wiesman, Z,, N, Avidan, S. Lavee & B. Quebedeaux (1998): Molecular characterization of common olive varieties in Israel and the West Bank using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) markers. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 123, 837-841.
Zohary, D. & P. Spiegel-Roy (1975): Beginnings of fruit growing in the Old World. Science, 187, 319-327.
260