Mateja Cegnar1, Julijana Kristl2
Dostavni sistemi nanometrskih velikosti za vnos proteinov in genov
Nanosized Drug Delivery Systems for Proteins and Genes
IZVLEČEK
KLJUČNE BESEDE: zdravilo sprožanje sistemi, rekombinantne beljakovine, genetsko zdravljenje, nanotehnologija
V prispevku predstavljamo sisteme in možnosti vnosa proteinskih učinkovin in genov v telo. Dostavljanje učinkovin na mesto delovanja postaja vse bolj pomembno, saj so se z odkritjem genoma in s tem povezanim znanjem o gensko zasnovanih boleznih pojavile učinkovitejše in zelo specifične učinkovine. Novi sistemi so povečini nanometrskih velikosti (nanodelci, lipo-somi, nanokompleksi), zgrajeni iz določenih nosilnih snovi, in imajo širok spekter prednosti. Omogočijo ciljanje v tkivo/celico, povečajo biološko uporabnost učinkovine, ji podaljšajo delovanje na ciljnem mestu ter nudijo zaščito pred encimsko razgradnjo, še posebej proteinom in nukleinskim kislinam. Vektorji za vnos genskega materiala v celico so virusni in neviru-sni. Zaradi velikih pomanjkljivosti virusnih vektorjev postajajo zanimivejši nevirusni vektorji, ki vključujejo nosilec s kationskim značajem, kar omogoča povezovanje z negativno nabito molekulo DNK. Tvorba kompleksov pomeni zaščito genskega materiala in olajša vnos v celico. Za vodenje procesov v celici, kot so endocitoza, izstop iz lizosoma, razpad kompleksa, vstop v jedro in vključevanje v jedrno DNK, pripnejo na nosilni sistem specifične molekule, ki pove- 447" čajo ciljanje, zlitje z membranami, spremenijo mikrookolje v celici ali drugače vplivajo na celične funkcije, ki olajšajo vnos genskega materiala v jedro. S kombiniranjem virusnih in nevirusnih vektorjev so razvili hibridne vektorje, ki so varnejši od virusnih in učinkovitejši od nevirusnih.
ABSTRACT
KEY WORDS: drug delivery systems, recombinant proteins, gene therapy, nanotechnology
This article reviews most systems and approaches for delivery of protein drugs and therapeutic genes into the body. Issues in drug delivery are becoming more important as more potent and specific drugs become available, with knowledge about diseases available from the human genome project. To achieve optimal therapeutic efficacy, drug delivery systems should be customized and very innovative. Novel systems are often nanosized, prepared with the use of specific excipients, and they also have multifaceted advantages in drug delivery. These systems in general can be used to provide targeted (cellular/tissue) delivery of drugs, to improve oral bioavailability, to sustain drug/gene effect at target place, and to improve the stability of therapeutics agents against enzymatic degradation, especially of protein, peptide and nucleic acid drugs. Vectors for gene delivery can be divided into two major groups: viral and nonviral. Due to several limitations of viral vectors, nonviral vectors attract more attention; they consist of a carrier with cationic character that is able to associate with the negatively charged DNA molecule. Formation of this complex protects DNA against dena-turation and enables its entry into cells. For specific processes that must take place, such as
1	Asist. dr. Mateja Cegnar, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aškerčeva 7, 1000 Ljubljana.
2	Prof. dr. Julijana Kristl, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aškerčeva 7, 1000 Ljubljana.
cell recognition, endocytosis, cytosolic trafficking, endosomal escape, dissociation of the complex, efficient nuclear uptake and gene expression, several specific molecules are attached to gene delivery devices enabling targeting, fusion with the membrane and changes in the microenviroment, or other ways of affecting cellular function for successful transgenic expression. Combinations of viral and nonviral components are hybrid vectors, which are safer than viral vectors and more efficient than nonviral ones.
448
UVOD
Prelomnico v razvoju moderne biotehnologije je v 70-ih letih postavila rekombinantna tehnologija DNK, ki je vpeljala izdelavo protein-skih učinkovin celo v industrijsko proizvodnjo. Prvi rekombinantni protein, ki se je pred 25 leti pojavil na tržišču, je bil inzulin, s čimer je začrtal strm vzpon tovrstnih učinkovin v medicinski uporabi. Danes je na tržišču Evropske unije odobrenih okoli 90 takšnih izdelkov. Hiter razvoj je v 80-ih letih botroval novodobnim t. i. biofarmacevtskim izdelkom, med katere danes uvrščajo proteinske učinkovine, izdelane z rekombinantno tehnologijo DNK, ter monoklonska protitelesa, pridobljena s hibridoma tehnologijo. Vzporedno prištevajo k biofarmacevtskim izdelkom tudi novejša zdravila, ki vključujejo fragmente nukleinskih kislin. Raziskave na področju molekularne genetike so namreč v 90-ih letih omogočile sekvenciranje človeškega genoma, kar je razjasnilo nekatere gensko zasnovane bolezni in prispevalo k boljšemu razumevanju njihove patogeneze. S tega vidika so oblikovali nov način zdravljenja, ki posega v genski ustroj celice. Razvili so koncept genskega zdravljenja, ki cilja na bolezni, kot so rak, vnetja, okužbe, bolezni krvožilnega in živčnega sistema ter druge genske napake (1-3).
Prve učinkovine, ki delujejo na ravni nukleinskih kislin, so se pojavile v zdravljenju bakterijskih okužb, virusnih in rakavih obolenj. Delujejo tako, da onemogočijo delovanje ali sintezo nukleinskih kislin pri bakterijah ali hitrodelečih se virusih in rakavih celicah. Tovrstne učinkovine so kinoloni, alkilirajoči cistostatiki, antimetaboliti oz. analogi purinskih in pirimidinskih baz, antracinski antibiotiki, alkaloidi in druge spojine, ki delujejo bodisi kot kelatorji molekul DNK, zavirajo delovanje encimov ali drugače ustavijo procese celične delitve. Navedene učinkovine so predvsem v klasičnih farmacevtskih oblikah.
V peroralnih farmacevtskih oblikah (tabletah, kapsulah idr.) so največkrat majhne in stabilne molekule učinkovin, ki lahko difundirajo skozi biološke membrane, medtem ko so pri večjih molekulah pogostejše parenteral-ne oblike, kot so injekcije in infuzije. Ker so s parenteralnimi oblikami povezani večji stroški zdravljenja, manjša sprejemljivost pri bolnikih, sistemski toksični učinki, večkratno odmerjanje ter navsezadnje tržni interesi, razvijajo nove farmacevtske oblike, ki se vse bolj uveljavljajo.
Novejši nosilni sistemi za vnos učinkovin v telo imajo prednosti, kot so zaščita učinkovine v fizioloških pogojih, nadzorovano sproščanje učinkovine, zmanjšanje neželenih učinkov, manjše število odmerjanj ter pospešena dostava učinkovin s kratko razpolovno dobo (1,2). Med slednjimi so predvsem pro-teini in genski fragmenti s svojo značilno zgradbo (slika 1). Njihova biološka uporabnost je skoraj vedno omejena zaradi fizioloških ovir v organizmu. Mednje prištevamo fizikalne ovire, kjer celične membrane ovirajo prehod velikim in hidrofilnim molekulam, kot so pro-teini in nukleinske kisline, ter encimske ovire, kjer med množico najrazličnejših encimov lahko izpostavimo proteaze in RNK-aze oziroma DNK-aze (3-5).
Metode in tehnologije, ki jih uporabljajo za izdelavo nosilnih sistemov za proteinske učinkovine in gene, so si v osnovi podobne, vendar se med seboj vseeno nekoliko razlikujejo. Proteini namreč obstajajo v nativni tridimenzionalni strukturi, ki pogojuje njihovo terapevtsko delovanje, zato proizvodnja njihovih nosilnih sistemov prvotno temelji na zagotovitvi najugodnejših pogojev izdelave, ki ohrani popolnost proteina. Denaturirani protein ima poleg neučinkovitosti še dodatne slabosti, kot so neželeni stranski učinki in imunski odziv.
Za razliko od proteinskih učinkovin zahtevajo geni za svoje delovanje le kemijsko
Struktura DNA
en zaključen zavoj 34 A
mala brazda
sladkorno-fosfatna veriga
osrednja os
Struktura proteina
aminokislina i aminokislina * < ■ ^ •• >a
molekula vode
■» * M 4* »*«
peptidna vez
_
V-'H *
aminokisline	I
peptidna vez ^^^^
A. Primarna struktura
B. Sekundarna D. Kvartarna
Slika 1. Strukturna zgradba DNA fragmenta in proteina je eden najpomembnejših dejavnikov, ki vpliva na izbiro ustrezne farmacevtske
celovitost fragmentov nukleinskih kislin, vendar je sposobnost za doseganje učinkovitega izražanja genskega materiala v celici pogojena s povsem drugačnimi dejavniki. Ce je mesto delovanja proteinskih učinkovin bodisi zunaj ali znotraj celice, je tarča genskih fragmentov vedno znotraj celice oz. še dlje - v samem jedru celice. Zato morajo sistemi za vnos genov premostiti mnogo več encimskih in fizikalnih ovir, preden dosežejo svojo tarčo. Sele po uspešni vključitvi gena v jedrno DNK pride do transgenskega izražanja in terapevtskega odziva, kar je odvisno predvsem od lastnosti genskega vektorja (npr. plazmida) ter stanja celice.
V prispevku bomo predstavili pristope in dostavne sisteme za vnos proteinskih učinkovin in genov, od katerih so slednji šele v eksperimentalni fazi, medtem ko sistemi s proteini že stopajo na tržno področje.
SISTEMI ZA VNOS REKOMBINANTNIH PROTEINSKIH UČINKOVIN
Prve proteinske učinkovine, ki so utrle pot v klinično uporabo, so uporabljali za nadomestno zdravljenje. Z razvojem biotehnoloških metod in sekvenciranja genov je postalo proteinsko inženirstvo učinkovito orodje za sintezo novih proteinskih učinkovin: rekombinantnih krvnih faktorjev, rekombinantnih hormonov, citokinov, cepiv, monoklonskih protiteles in terapevtskih encimov (1,2). Zaradi slabosti, ki jih imajo proteinske učinkovine v fiziološ-
kih pogojih, uveljavljajo različne pristope, s katerimi lahko izboljšajo biološko uporabnost proteinov, spremenijo njihovo imunogenost, razpolovno dobo, hitrost delovanja idr. V ta namen raziskujejo različne kemijske spremembe proteinov, ki zakrijejo njihove neželene lastnosti, ter nove možnosti dostave glede na mesto njihovega vnosa ali farmacevtsko obliko, ki jo vnesejo v organizem. Vse spremembe, ki jih izvajajo s proteini, so možne šele ob dobrem poznavanju fizikalno-kemijskih lastnosti proteinov (npr. velikosti, molekulske mase, konformacijske stabilnosti idr.), njegove farmakokinetike (razpolovne dobe) in far-makodinamike (farmakološkega delovanja, imunogenosti idr.) ter njegove klinične uporabe (želeni odmerek, mesto vnosa) (6). Klasične parenteralne oblike skušajo vse bolj nadomestiti z novimi pristopi, metodami in sistemi za dostavo proteinskih učinkovin, vendar je mnogokrat njihov prehod iz bazičnih raziskav v stopnjo razvoja še vedno omejen s ključnimi
Tabela 1. Ključni dejavniki pri oblikovanju nosilnih sistemov s proteinskimi učinkovinami (1).
Področje
Težave in slabosti
proizvodnja	stroški proizvodnje, prenos v večje merilo,
izkoristek
stabilnost	vpliv proizvodnje in nosilnega sistema
na proteinsko učinkovino biološka uporabnost delež učinkovine v sistemskem obtoku varnost/toksičnost vpliv nosilnega sistema na mesto aplikacije in njegova toksičnost
449
premer 20 A
aminokislina
par dušikovih baz
450
Slika 2. Aktivno tridimenzionalna zgradba proteinske učinkovine in dejavniki, ki vplivajo na konformacijsko stabilnost pri oblikovanju.
vprašanji o proizvodnji, stabilnosti proteina (slika 2), biološki uporabnosti, varnosti oz. toksičnosti končnega izdelka idr. (tabela 1) (1, 2).
Nanodelci za parenteralni vnos
Večino danes dostopnih proteinov na tržišču dajejo parenteralno. Proizvajalci so zato usmerili razvoj novejših farmacevtskih oblik ktak-šnim injektabilnim sistemom in pripomočkom, ki olajšajo vnos v organizem in povečajo sprejemljivost pri bolnikih. To so injekcije v ovoj-nini, ki si jih bolniki lahko dajejo kar sami, taki so npr. avtoinjektorji oz. injekcijske brizge v obliki peresa za inzulin, rekombinantni rastni hormon idr. (1, 7).
Ker ima večina proteinskih učinkovin kratko razpolovno dobo, jih je treba večkrat inji-cirati. Da bi se izognili pogostemu dajanju, že
razvijajo 'depo' oblike ali pa proteine kemijsko modificirajo. Med slednjimi postopki je pogosto pegiliranje oz. kovalentno vezanje polietilenglikolnih (PEG) verig na proteinsko učinkovino. Tako proteinu povečajo biološko uporabnost, podaljšajo razpolovno dobo, zmanjšajo imunogenost in proteolitsko razgradnjo ter obenem povečajo stabilnost ali topnost. Med pegiliranimi proteini najdemo na tržišču PEG-adenozin deaminazo (Adagen® - Enzon/NPS Pharmaceuticals), PEG-as-paraginazo (Oncaspar® - Rhone-Poulenc Rorer), PEG-interferon alfa-2b (PEG-INTRON® -Schering-Plough) in PEG-interferon alfa-2a (PEGASYS® - Roche) (7).
Druga možnost za podaljšanje delovanje proteinske učinkovine so depo oblike. V to skupino uvrščajo vsadke, mikrosfere, nanodel-ce ter injektabilne gele. Med vsadke uvrščajo tudi novejše osmotske črpalke, ki jih največkrat vstavijo podkožno s kirurškim posegom. Nekateri med temi sistemi omogočajo tudi ponovno polnjenje že vnesenih črpalk, s čimer lahko prilagodijo odmerjanje proteinske učinkovine za posameznega bolnika ali določeno zdravljenje (1, 7).
Trenutno je razvoj na področju depo oblik usmerjen v uporabo biopolimerov, ki se v organizmu razgradijo na biološko skladne in razgradljive spojine. Izmed naravnih polimerov uporabljajo peptide (kolagen, želatino, albumin idr.) in polisaharide (hitosan, alginat, škrob, dekstran, celulozo, hialuronsko kislino idr.), od sinteznih pa najpogosteje poliestre (polilaktide (PLA), poliglikolide (PGA),
Tabela 2. Biorazgradljivi polimeri za nadzorovano sproščanje proteinov.
Polimeri
Mehanizem razgradnje
Naravni
proteini: albumin, globulin, želatino, kolagen, kazein polisaharidi: škrob, celuloza, hitosan, dekstran, alginat
Sintezni
poliortoestri polianhidridi poliamidi
polialkilcianoakrilati
poliestri (laktidi/glikolidi, polikaprolaktoni)
polifosfazeni
psevdopoliaminokisline
encimska razgradnja (proteaze, kolagenaze...) encimska razgradnja (amilaze, alginaze), kislinska hidroliza
esterska hidroliza, esteraze
hidroliza
hidroliza
hidroliza
esterska hidroliza, esteraze hidroliza, raztapljanje encimi, proteaze
polikaprolaktone), polianhidride, poliortoe-stre, polifosfazene ter poliaminokisline (tabela 2) (1,5, 7).
Pri naravnih polimerih najpogosteje uporabljajo metodo premreženja makromolekul v sisteme različnih geometrij. Vendar imajo tudi ti svoje pomanjkljivosti: slabo ohranjajo obliko zaradi nabrekanja, imajo majhno trdnost, njihova sestava niha in je slabše razložena, lahko so prisotni različni kontaminanti ali preostanki reagentov, dodanih pri izdelavi. Vse več uporabljajo sintezne polimere, ki so čistejši in imajo znano sestavo. S spreminjanjem njihove molekulske mase, stereokemije monomerov, razmerja komonomerov ter oblike polimernih verig lahko dobijo širok spekter polimerov z različnimi tehnološkimi lastnostmi in obnašanjem v in vitro ter in vivo p°g°jih (6).
Izdelava nosilnih sistemov iz sinteznih polimerov poteka največkrat z emulzijskimi metodami, ki vključujejo uporabo organskih topil in fizikalno tehnoloških postopkov. Oboje ima velik vpliv tako na lastnosti farmacevtske oblike, ki jo želijo izdelati, kot na celovitost oz. stabilnost proteinske učinkovine, ki jo med postopkom vgrajujejo (1, 6, 8, 9, 10). Uporabljajo organska topila, ki raztapljajo polimer, vendar minimalno vplivajo na stabilnost proteina in jih po izdelavi enostavno
odstranijo. Slika 3 prikazuje postopek za izdelavo mikrosfer ali nanodelcev. Tudi vsadke pogosto izdelujejo z emulzijskimi metodami, le da uporabijo drugačne tehnike vlitja v kalupe določenih geometrij (1, 6). Izbira večstopenjskega emulzijskega postopka je odvisna od stabilnosti proteina. Ce je protein v kristalni obliki stabilen tudi v organskem topilu, ga lahko dispergirajo v polimerno organsko fazo kar v suhi obliki (enoemulzijski postopek). V večini primerov pa protein najprej raztopijo v vodni fazi, ga šele nato emulgirajo v organsko fazo s polimerom in tvorijo predemulzijo (slika 3). Naslednje stopnje izvedejo pri obeh postopkih podobno. Z dodatkom zunanje vodne faze, ki vsebuje stabilizator, pripravijo emulzijo oz. dvojno emulzijo. Z velikostjo vnosa fizikalnih obremenitev med emulgiranjem definirajo sistem, bodisi mikrosfere ali nanodelce. V končni stopnji organsko topilo odstranijo iz nastalih mikrosfer ali nanodelcev pod znižanim tlakom ali z dodatkom zunanje vodne faze, ki povzroči difuzijo organskega topila iz nastalih delcev. Slednje je možno le v primeru, ko je organsko topilo delno topno v vodi in njegova topnost hitro narašča z večanjem deleža vodne faze (6, 8).
Za izdelavo večjih delcev, mikrosfer, pogosto uporabljajo tehnologijo sušenja z razprše-vanjem, kjer za razliko od zgoraj omenjenega
451
Dvoemulzijski postopek za izdelavo mikro- ali nanodelcev a) tvorba primarne emulzije

vodna raztopina proteina
■
raztopina polimera v organskem topilu
b) tvorba dvojne emulzije
primarna emulzija (v/o)
vodna raztopina s stabilizatorjem
mesan|e
primarna emulzija (v/o)
mešanje (emulzija v/o/v)
odstranjevanje organskega topila:
•	odparevanje (i p)
•	difuzija v vodno fdzo	disperzija polimernih
delcev s proteinom
•	spiranje
► • zbiranje delcev (ločevanje, centrifugiranje idr.)
•	liofiliziranje delcev (suho stabilno stanje)
Slika 3. Dvoemulzijski postopek za izdelavo mikrosfer ali nanodelcev. v - voda, o - olje.
452
postopka disperzijo polimera z učinkovino razpršijo v toku vročega zraka, ki sproti odstrani uporabljena topila (6). Novejši je postopek, kjer proteinsko učinkovino dispergirajo v raztopino polimera, nato pa disperzijo razpršijo v tekočem dušiku, ki od nastalih delcev odtegne topilo (7). Lupron Depot® je prvi dostavni sistem na tržišču, ki vsebuje učinkovino lev-prolid acetat, vgrajeno v mikrosfere PLGA, katerega dajanje je enkrat mesečno in je namenjen zdravljenju raka na prostati (11). Podobne oblike s proteinskimi učinkovinami, ki jih najdemo na tržišču, so predstavljene v tabeli 3 (6, 7, 12).
Omejitve pri izdelavi mikrosfer ali nanodel-cev sta kompleksnost proizvodnega postopka in delež oz. izguba učinkovine pri vgrajevanju (1). Alternativa omenjenim oblikam so injektabilni geli ali in situ parenteralni dostavni sistemi, ki so manj zahtevni za izdelavo in omogočajo vnos večjih koncentracij protein-ske učinkovine (1, 5). Vta namen uporabljajo tekočo obliko različnih polimerov, ki po injici-ranju v telesu ustvarijo depo sistem, v katerega je ujeta učinkovina. Med tovrstne sisteme uvrščajo: termoplastične polimere, ki so pri povišani temperaturi tekoči, po injiciranju se v telesu strdijo in tvorijo depo obliko; in situ premreževalne polimere, ki imajo pripete funkcionalne skupine za medsebojno premre-ženje v telesu; in situ obarjalne sisteme, kjer polimer raztopijo v organskem topilu, ki se po injiciranju zmeša s telesnimi tekočinami in zapusti polimer v trdni obliki; ter sisteme, ki pri telesni temperaturi gelirajo in nadzorovano sproščajo učinkovino (5, 13). Primer dostavnega sistema na tržišču je SABER™. To je dostavni sistem oz. biorazgradljivi gel, sestavljen iz polimera saharoza acetatizo-butirata v fiziološko sprejemljivem topilu (etanol, benil benzoat idr.), ki po injiciranju
difundira in zapusti polimer v poltrdnem stanju (1, 7).
Sproščanje proteinske učinkovine, ki se vključi v nastali sistem, je odvisno od njene difuzije skozi gelsko rešetko. Poglavitni dejavniki so velikost molekul proteinske učinkovine, količina vgrajenega proteina, njegova topnost in molekulska masa, sestava polimernega nosilca ter velikost in oblika nastalega ogrodja (11).
Novejši so dostavni sistemi, ki sproščajo učinkovino glede na spremembo v telesu oz. mikrookolju. Razvijajo jih z učinkovinami, ki ne zahtevajo konstantnih plazemskih koncentracij, temveč se sproščajo glede na dražljaje, bodisi notranje, ki so odvisni od potreb organizma (t. i. sistemi z zaprto zanko), ali zunanje, ki jih po potrebi izvajajo na sistem (t. i. sistemi z odprto zanko) (4, 14).
Sistemi z zaprto zanko so najbolj raziskani za zdravljenje sladkorne bolezni, kjer se inzulin sprošča glede na spremembe v koncentraciji glukoze. Taki so pH-odvisni sistemi in sistemi kompetitivne desorpcije. Pri prvem vgradijo v nosilni polimer inzulin in encim glukoza-oksidazo, ki pretvarja glukozo v glu-konsko kislino. Zaradi nastanka kisline se zniža pH v nosilcu, kar omogoči sproščanje inzu-lina. Do sproščanja pride zaradi povečane topnosti inzulina pri nizkem pH ali zaradi pH-odvisnega polimera, ki pri nizkem pH nabreka in omogoči sproščanje inzulina zaradi porušene strukture polimernega ogrodja. Pri kompetitivni desorpciji izkoriščajo večjo afiniteto glukoze za določen ligand, ki zato sprosti inzulin. Primera sta kompeticija glukoze, ki ima večjo afiniteto, in glikoziliranega inzulina s konkavalinom A, ali fazni prehod polimera premreženega s konkavalinom iz gel stanja v sol stanje, kjer se z vezavo glukoze na konkavalin zmanjša premreženost. Podobni
Tabela 3. Tržno dostopni polimerni dostavni sistemi sproteinskimi učinkovinami (odobreni od ameriške Agencije za hrano in zdravila-FDA). PLA- polimer mlečne kisline, PLGA- kopolimer mlečne in glikolne kisline, sc. (subkutano)- vpodkožje, im. (intramuskularno) - vmišico.
Zdravilo	Protein	Polimer	Vnos	Bolezenski znaki
Lupron Depot®	levprolid acetat	PLA	sc./im.	rak na prostati
Nutropin Depot®	rekomb. čl. rastni hormon	PLGA	sc./im.	pomanjkanje rastnega hormona
Zoladex®	goserelin acetat	PLA	sc.	rak na prostati
Sandostatin LAR®	okreotid acetat	PLGA	sc./im.	akromegalija, rak v prebavnem traktu
Trelstar Depo®	triptorelin pamoat	PLGA	sc./im.	agonist gonadoliberina
so sistemi, ki izrabljajo še druge interakcije, kot so antigen-protitelo, encim-substrat idr.
Sistemi z odprto zanko omogočijo sproščanje proteinske učinkovine glede na spremembe, ki jih povzročijo od zunaj. Na vnešeni sistem delujejo z magnetnim poljem, ultrazvokom, električnim poljem, temperaturo, svetlobo ali mehansko silo, zaradi česar nastanejo v njem fizikalne spremembe, ki povečajo sproščanje učinkovine iz nosilca (14).
Neparenteralne farmacevtske oblike
Vse več je raziskav, kjer kot alternativo parente-ralnim oblikam razvijajo neinvazivne dostavne sisteme. Najpogostejše poti vnosa neparente-ralnih oblik so skozi pljuča, skozi kožo ter skozi usta. Vsaka izmed njih ima svoje ovire, ki jih prikazuje tabela 4 (1).
Ker se biološka uporabnost proteinskih učinkovin po neparenteralnem vnosu zmanjša za več kot polovico, morajo pri sistemskem zdravljenju ob visokih koncentracijah proteina še vedno uporabljati parenteralno pot. Obratno pa je lahko lokalno zdravljenje z dostavo proteinske učinkovine na mesto delovanja veliko učinkovitejše že pri majhnih odmerkih v primerjavi s parenteralnim vnosom (1, 6).
Dostavni sistemi skozi pljuča
Pljuča predstavljajo obetajočo pot vnosa učinkovine v telo ne le za lokalno, temveč tudi sistemsko delovanje. Absorpcija je hitra zaradi velike specifične površine pljuč in tesnega stika med alveolarnim epitelijem in krvnim obtokom (1, 7, 15). Vendar so v študijah dokazali, da je sistemska absorpcija inzulina skozi pljuča le 10 do 15 % v primerjavi s podkož-
Tabela 4. Težave in slabosti pri neinvazivni dostavi proteinskih uänkovin.
Mesto dostave
Težave in slabosti
dostava skozi pljuča
dostava skozi kožo
dostava skozi usta
epitelijske celice, proteaze, alveolarni makrofagi, vpra{ljiva dostava učinkovine, definirani odmerki, hitra absorpcija rožena plast kože, proteaze, makrofagi, absorptivna povr{ina kože epitelijske celice prebavil (tesni stiki), proteaze, ekstremne vrednosti pH
no injekcijo, ki znaša 20 do 30 % intravenskega odmerka (1). Razliko pripisujejo množici encimov, ki so prisotni v pljučih in zato zmanjšajo biološko uporabnost inzulina. Druga težava je odziv pljuč. Odvisno od posamezne protein-ske učinkovine lahko ta izzove različne lokalne učinke na pljučno tkivo oz. je lahko njen odmerek za sistemsko delovanje prevelik, da bi jo vnesli skozi pljuča. Proizvajalci vse več uvajajo nove pristope in ovojnino, ki olajšajo in izboljšajo dostavo proteinske učinkovine v pljučne alveole, kjer je absorpcija najinten-zivnejša. Načrtujejo takšne oblike, ki tvorijo aerosole z želenimi lastnosti, bodisi disperzijo trdih delcev ali vodnih kapljic v zračnem toku. Najpomembnejša lastnost tovrstnih oblik, ki določa mesto dostave v pljučih, je povprečni masni aerodinamični premer delca. Ta parameter vključuje velikost, obliko in gostoto delca, ki naj bi za dostavo globoko v pljučni sistem znašal 1 do 3 |im (7, 15). Z vidika stabilnosti proteina so najprimernejša farmacevtska oblika praški za inhaliranje. Za izdelavo praškov, ki morajo imeti veliko disper-zibilnost in pretočnost, pogosto uporabljajo tehnologijo sušenja z razprševanjem ali novejšo tehnologijo z uporabo superkritičnih tekočin. Inhalacijske farmacevtske oblike imajo prednost, da ne zahtevajo sterilnosti, ki je za parenteralne oblike obvezna, pač pa natančno določeno največje število nepatogenih mikroorganizmov (17). Kljub temu izdelujejo tovrstne farmacevtske oblike večinoma v brezkužnih pogojih z nadzorovano vsebnostjo vlage v zraku. Pogosto dodajo proteinski učinkovini še spojine, ki ščitijo njeno strukturo med razpr-ševanjem ali preprečijo vezavo vlage na delce in tvorbo agregatov. Zaščito pred encimi lahko dosežejo z vključevanjem proteinske učinkovine v biorazgradljive nanodelce ali mikrosfere. Tovrstne sisteme lahko načrtujejo tudi tako, da zadržijo sproščanje proteina v pljučih daljše časovno obdobje. Namreč, poskusi na živalih so pokazali, da ima v porozne delce vgrajeni inzulin 12 ur daljše delovanje, kot če je v prosti obliki. Kljub potencialu omenjenih sistemov je dostava skozi pljuča omejena le na pro-teinske učinkovine, ki delujejo v nizkih oz. srednjih koncentracijah ter ne povzročajo stranskih učinkov niti lokalnega draženja pljučnega tkiva (1, 2, 7).
453
454
Dostavni sistemi skozi kožo
Največja ovira pri dostavi proteinske učinkovine skozi kožo je rožena plast. Sele motnja v oviralni funkciji kože privede do absorpcije večjih molekul ali delcev skozi njo (liposomi, nanodelci idr.). Povečan prehod delcev v kožo dosežejo z iontoforezo, elektroporacijo, z uporabo ultrazvoka ali pospeševalca toka delcev v kožo.
Pri iontoforezi uporabljajo obližem podobne sisteme, ki jih po namestitvi na kožo priključijo na električni tok majhne jakosti (go-tota toka = 500 |iA/cm2). Transport molekul v kožo omogočata elektromigracijski (tok ionov v električnem polju) in elektroosmozni tok. Slednji nastopi pri uporabi električnega toka na negativno nabiti biološki membrani, kjer protiioni ustvarjajo dodaten pretok molekul od anode h katodi. Zaradi tega lahko z iontoforezo dostavljajo v kožo tudi nenabite in večje molekule, npr. proteine (16,18, 21). Med testi-ranimi proteini (kot so inzulin, kalcitonin, paratireoidni hormon, vazopresin, somatostatin idr.) (16) so le redki primerni za dostavljanje z iontoforezo glede na odmerek, ki je potreben za dosego farmakološkega delovanja, in fizikalno-kemijske lastnosti proteina. Največjo uporabnost je iontoforeza dosegla z razvojem neinvazivnega diagnostičnega orodja, ki na podlagi nasprotnega elektroosmotskega toka iz kože izloči nenabite molekule, kot je glukoza. Sistem Glucowatch® (Cygnus Inc., ZDA), ki je namenjen bolnikom s sladkorno boleznijo, omogoča hitro in neinvazivno spremljanje ravni glukoze v krvi (slika 4). Sistem ima v stiku s kožo dve identični hidrogelni ploščici z elektrodama, ki zbirata glukozo, ki jo nato prek encimsko katalizirane reakcije zazna bio-senzor in pretvori v čitljiv signal. Z razvojem bioinženirstva in mikroelektronike je sistem v obliki ročne ure zelo priročen za uporabo; signalna opozorila še dodatno opomnijo bolnika na nastop kritičnih vrednosti glukoze v krvi (18, 19).
Pri elektroporaciji povečajo vnos učinkovin v kožo tako, da nanjo dovajajo kratke električne impulze, ki lokalno povzročijo spremembe v membranah. Prenos molekul je odvisen od napetosti, trajanja, obsega in števila povzročenih impulzov (20). Kot učinkovito so dokazali kombinacijo elektroporacije in iontoforeze, ki sinergistično poveča vnos
g = glukoza ii= negativni ion 3= pozitivni ion
Slika 4. Sistem Glucowatch® (Cygnus Inc., ZDA).
molekul v kožo. Z uporabo ultrazvočnih sond zmanjšajo barierno funkcijo kože zaradi kavi-tacije (velike lokalne tlačne razlike), ki moti urejenost lipidov med keratinociti v roženi plasti. Pri vseh naštetih pristopih lahko povečajo prehod molekul skozi kožo tudi s pospeševalci absorpcije, surfaktanti.
Slabost omenjenih pristopov je, da kožo poškodujejo, jo dražijo ali izzovejo imunski odgovor. Prav tako je vprašljiva tudi stabilnost proteinske učinkovine ob prisotnosti tako fizikalnih kot kemijskih pospeševalcev. Kljub povečani prepustnosti kože je dostava protein-skih učinkovin skozi njo z omenjenimi pristopi primerna le za primere, ki zahtevajo majhne odmerke. Namreč, absorptivna površina kože je omejena na majhen predel, protein pa po prehodu skozi roženo plast pričakajo tudi makrofagi in celice imunskega odziva, ki dodatno zmanjšajo njegovo biološko uporabnost (1, 2).
Dostavni sistemi skozi usta
Jemanje zdravila skozi usta je najbolj zaželena pot vnosa učinkovine v telo, vendar je za
proteine skoraj nemogoče zaradi majhne biološke uporabnosti. Vendar so raziskovalci na področju dostavnih sistemov za proteinske učinkovine odkrili možnosti, s katerimi bi lahko vnašali proteine v telo tudi peroralno. Med omenjenimi pristopi so dostavni sistemi, ki zaščitijo proteinsko učinkovino pred agresivnim biološkim okoljem (pH, encimi ipd.), podaljšajo čas zadrževanja na sluznici prebavil in s tem povečajo možnost absorpcije. Eden zanimivejših pristopov so biorazgradljivi nanodelci, ki zaradi majhnih velikosti prehajajo v Peyerjevo pot, limfni sistem, kjer se absorbirajo skozi t. i. celice M. Zaradi tarčne-ga mesta se zdi tovrstna dostava z nanodelci primerna tudi za vnos cepiv (1, 5). Peroral-ni vnos nanodelcev obeta veliko pri lokalnem zdravljenju v prebavilih, npr. pri Cronovi bolezni, saj lahko delci zaradi nanometrskih velikosti prodirajo globoko v obolelo tkivo in se tam zadržijo dalj časa.
NANOSISTEMI ZA VNOS TERAPEVTSKIH GENOV
Gensko zdravljenje je nova metoda, s katero bi lahko popravljali napake v genskem zapisu celic ali povečali izražanje genov, ki kodirajo določene terapevtske proteine. V gensko zdravljenje štejemo vsak poseg v genski zapis celice ob uporabi polinukleotidov oz. različnih fragmentov nukleinskih kislin. V to skupino uvrščajo protismiselne oligonukleotide, ki z vezavo onemogočijo izražanje določenega gena, in ribocime, molekule RNK z encimsko aktivnostjo (3, 22).
Vektorji so sistemi za vnos terapevtskih genov v telo. Zanje velja, da morajo biti varni, netoksični, neimunogeni, omogočiti morajo zaščito genskega materiala, prenos do tarčnih celic, ciljanje, ter vstop v celice in sprostitev genskega materiala. Drugi vidiki, ki zadevajo vključevanje gena, transgeno izražanje in terapevtski odziv, so odvisni predvsem od učinkovitosti genskega fragmenta in njegove vloge v patogenezi določene bolezni.
Za uspešno gensko zdravljenje se mora v celici odviti vrsta zapletenih bioloških procesov: vnos vektorja z genskim materialom v telo bodisi lokalno v tkivo ali sistemsko v krvni obtok, prenos vektorja do tarčnega tkiva oz. celice in prepoznavnost receptorja, vstop vektorja v celico, njegov transport do celičnega jedra in sproščanje genskega materiala iz vektorja v jedro celice, prepisovanje genske informacije v jedru, prevajanje informacij iz nastale mRNK v ustrezen protein v citoplazmi, vezava in delovanje proteina na receptor, ki je lahko znotraj celice (intrakri-ni mehanizem) ali na njeni površini (avtokrini mehanizem) ali na sosednji tarčni celici (pa-rakrini mehanizem). V nekaterih primerih protein vstopi v sistemski krvni obtok in deluje na oddaljene celice in tkiva (endokrini mehanizem) (npr. rastni faktor, eritropoetin, koagulacijski faktorji itd.), kjer prek receptor-jev povzroča biološki učinek (3, 22).
Vektorji za vnos terapevtskih genov
K sistemom za vnos genov prištevamo virusne, nevirusne in hibridne vektorje ter ex vivo
455
Tabela 5. Gensko zdravljenje na stopnji kliniinih testiranj vsvetovnem merilu (26).
Vektor	Število kliničnih testiranj	Bolezen
Virusni vektorji		
retrovirus	161	rak, aids, hemofilija idr.
adenovirus	135	rak, cistična fibroza, krvožilne bolezni idr.
poksvirus	37	rak
adenoasociacijski virus	9	cistična fibroza, hemofilija, rak na prostati
drugi virusi	6	rak
Nevirusni vektorji		
kompleks liposom-DNA	57	rak, cistična fibroza, bolezni koronark idr.
prosta DNA	59	rak, bolezni arterij idr.
vnos RNA	6	rak
pištola za vnos genov	5	kožni rak
456
spremenjene presajene celice (3, 8, 23-25). Najpogosteje uporabljani vektorji, ki so na stopnji kliničnih testiranj, so prikazani v tabeli 5 (26).
Virusni vektorji
Na področju sistemov za vnos terapevtskih genov so kot prve razvili virusne vektorje. Virusi že v osnovi vključujejo princip prenosa genskega materiala. Vektorje izdelajo tako, da v virusu določene gene, ki kodirajo za virusne proteine, zamenjajo s terapevtskimi geni. V ta namen najpogosteje uporabljajo retroviru-se in adenoviruse, sledijo jim herpes simpleks virus, adenoasociacijski virusi ter poksvirusi. Virusi se razlikujejo po velikosti, obliki verige DNK/RNK (enovijačna ali dvovijačna), kapaciteti dednega materiala ter učinkovitosti oku-ženja celic, ki so bodisi v stanju mirovanja ali celične delitve. Vsak virusni vektor ima svoje prednosti in slabosti. Npr. retrovirusi so neučinkoviti pri nedelečih se celicah, kar bi celo pomenilo ciljanje na hitrodeleče se rakave celice, vendar so tudi slednje lahko v stanju mirovanja. Obratno so adenovirusi učinkoviti pri delečih in nedelečih se celicah. Ker so le-ti tudi človeški naravni patogeni, fiziološko prisotna protitelesa v organizmu zmanjšajo njihovo učinkovitost. Poksviruse uporabljajo za cepljenje, ker so manj toksični in imajo veliko
zmožnost za vnos tujega genskega materiala (3, 23, 24).
Raziskave s tovrstnimi sistemi vse bolj upadajo zaradi slabih izidov nekaterih kliničnih testiranj. Sistemi so namreč problematični zaradi svoje varnosti, neželene virulence, muta-geneze in kancerogeneze, lahko izzovejo imunske reakcije, zahteven je izbor ustrezne celične linije za razmnoževanje virusa in s tem povezano težavno čiščenje. Zato iz omenjenih razlogov vse bolj razvijajo nevirusne vektorje (3, 25).
Nevirusni vektorji
Prednosti, ki jih imajo nevirusni vektorji pred virusnimi, so enostavnejša izdelava in prenos proizvodnje v večje merilo, večja prilagodljivost pri izdelavi in obsežnost dednega materiala, so varnejši in manj imunogeni v in vivo pogojih. Njihova slaba stran je manjša učinkovitost pri okuženju celic z dednim materialom (25).
Pri oblikovanju tovrstnih nevirusnih vektorjev je mogoče najti skupna izhodišča s sistemi za vnos proteinskih učinkovin v telo. Tako pro-teini kot geni so hidrofilni, pomembno razliko pa predstavlja struktura omenjenih spojin. Ker proteini zahtevajo za svoje delovanje nativ-no tridimenzionalno konformacijo, morajo ves čas izdelave ohraniti strukturo nespremenjeno. Obratno pa geni za svoje delovanje potre-
Slika 5: Vnos dednega materiala z nevirusnimi vektorji v celico: združevanje kationskega nosilca in liganda z molekulo DNA, vezava kompleksa na receptor celice, vstop kompleksa v celico - endocitoza, razpad endo/lizosoma z nabrekljivimi-endosomolitičnimi polimeri, izstop kompleksa iz vezikla in vstop molekule DNK v celično jedro.
bujejo le kemijsko celovitost fragmentov (8). Zato je možno tehnologijo izdelave sistemov za vnos proteinskih učinkovin z vidika stabilnosti prenesti tudi na tiste za vnos genov. Izbira najustreznejših pogojev izdelave je namreč že prilagojena za nestabilne učinkovine, bodisi proteine ali gene. Večji problem za vnos genov v celico je izbor pomožnih spojin. V ta namen so razvili ustrezne nosilce, ki omogočajo vgradnjo in zaščito DNK, jo ciljano dostavijo do celice in v celico ter jo na tarčnem mestu tudi sprostijo (slika 5). Nosilci, ki jih uporabljajo za vnos DNK v telo, imajo kationski značaj in so bodisi polimeri, lipidi ali peptidi (3, 24, 30-33).
Polimerni nanodelci z DNK - polipleksi
Od naravnih kationskih polimerov sta najpogostejša kolagen in hitosan, med sinteznimi pa so največkrat polilizin, polietilenimin, polia-midoamin in polimetakrilati, ki z DNK tvorijo komplekse, imenovane polipleksi. Polimeri so lahko linearni ali razvejani, dendrimeri, (slika 6), ki tvorijo različne komplekse z DNK.
Ugodna lastnost kationskih polimerov je velika pufrska kapaciteta, saj po vstopu v celico pride polimerni vektor v endosom ali lizo-som. Zaradi nizkega pH veže polimer veliko protonov, pri čemer nabreka in destabilizira membrano lizosoma, ki posledično razpade.
Slika 6. Struktura kationskega dendrimera poliamidoamina.
Slednje omogoči sproščanje genskega materiala iz endosoma ali lizosoma, kar je ključno za ohranjanje njegove stabilnosti v neugodnem okolju in prenos v citoplazmo ter nadalje v celično jedro. Drugi način, ki vektorju omogoča destabilizacijo lizosomskih in endo-somskih membran, je vključevanje fuzoge-nih peptidov v polimer. S pripetjem tarčnih ligandov na polimerno ogrodje lahko vektor usmerijo do ciljnih celic, obloga iz polietilen-glikolov (PEG) pa lahko dodatno stabilizira sistem v obtoku in zmanjša možnost, da bi
457
2. stopnja
enostopenjski postopek
JU
+ + +
ligand-PEG-PEI
+ + +
PEI-PEG
+ + +
PEI
Slika 7. Različne strategije tvorbe pegiliranih (PEG) kompleksov molekule DNA skationskim polimerom polietileniminom (PEI) ter dodanim ligandom.
458
celice imunskega odziva prepoznale vektor (slika 7) (24, 27, 31).
Liposomi in lipidni kompleksi z DNK - lipopleksi
Najbolj znani lipidni nosilni sistemi so liposomi, ki so se tudi prvi pojavili v genskem zdravljenju (28, 34, 35). Razvili so nove lipidne nosilce, in sicer so anionske in nevtralne lipide, ki jih pogosto uporabljajo za izdelavo liposoma, zamenjali s kationskimi. Z vključevanjem kationskih skupin v lipide liposomov so dosegli ustrezno združevanje z molekulami DNK. Kationski lipidi so amfifilne molekule z dvema lipofilnima repoma in kationsko glavo. Pogosti kationski lipidi so DOTAP (1,2-diole-oil-3-trimetilamonijev propan), DOTMA (N-[ 1 -(2,3-dioleil) propil]-N,N,N-trimetila-monijev klorid), ter drugi, ki lahko imajo v hidrofobnem delu holesterolski ostanek (24, 26, 32, 35). Njihova struktura je pomembna zato, ker tvorijo ustrezne lamelarne vezikle značilne za liposome (slika 8, 9).
Lipopleksi so kompleksi iz liposomov in DNK, kjer je molekula DNK ujeta med več liposomi (slika 10, A). Tvorijo jih s postopkom hidratacije suhega lipidnega filma. Zaradi slabe stabilnosti in agregacije je treba tovrstne sisteme uporabiti takoj po njihovem nastanku. Za izboljšanje vnosa genov so liposomom dodali še nevtralne kolipide (holesterol, DOPE - dioleilfosfatidiletanolamin idr.), ki vplivajo na konformacijske spremembe oz.
fluidnost membranskih sistemov in olajšajo vnos liposomov v celico oz. izstop DNK iz membrane lizosoma. Razvili so še novejše sisteme, kjer je DNK vključena v notranjost liposoma (slika 10, B). Sistem izdelajo tako, da molekulo DNK najprej vežejo na pozitivno nabiti protamin in šele nato združijo v kompleks z liposomi. Zaradi preureditve liposomskih lipidov nastane kompakten sistem spontano (kompleks LPD). Tovrstni sistemi imajo večji učinek najverjetneje zaradi manjše velikosti kot navadni lipopleksi (22, 24, 32, 35, 36).
Nadalje so ugotovili, da lipidne komplekse z DNK lahko tvorijo tudi v odsotnosti membranskih lamelarnih struktur, značilnih za liposome. Tako so razvili lipidne nanodelce z DNK. Najprej naredijo mešane micele kationskih lipidov in površinsko aktivnih spojin. Ko dodajo molekule DNK, spontano nastajajo kompleksi med lipidi in DNK, po čiščenju pa se lipidi in površinsko aktivne molekule prerazporedijo in tvorijo strukture v obliki polža, kamor se ujame molekula DNK. Dokazali so, da je vnašanje tuje DNK v celico s tovrstnimi sistemi boljše, kljub temu pa zelo pogojeno z velikostjo nastalih delcev, razmerjem nabojev med kationski lipidi in molekulami DNK, koncentracijo površinsko aktivne snovi, prisotnostjo kolipidov ter sestavo pufra, kjer nastajajo omenjeni delci (22).
Fosfolipid	Spontano asociiranje molekul
nasi~ena in nenasi~ena ma{~obna kislina
Slika 8. Molekula fosfolipida in strukture, ki lahko nastanejo po spontanem organiziranju tovrstnih molekul.
Slika 9. Kemijski strukturi kationskega in nevtralnega lipida in okrajšani imeni (26).
Peptidni nanodelci
S posnemanjem naravnih mehanizmov, ki jih izkoriščajo celice same, uporabljajo kot nosilce za DNK tudi kationske peptide, polilizin, protamin, histon in druge (24). Z vezavo različnih peptidov oz. ligandov na vektor so dokazali učinkovito ciljanje v različne celice ali tkiva, ki bolj ali manj specifično izražajo določene receptorje. Med naštetimi so recep-torji za integrin, transferin, nevrotenzin, inzulin, manozo, laktozo, rastni faktor ter druge hormone. Tudi z monoklonskimi protitelesi ali določenimi fragmenti protiteles lahko učinkovito usmerijo vektor do tarče (37).
Nadalje uporabljajo domene določenih para-zitnih peptidov, ki imajo fuzogene lastnosti in izboljšajo vključitev vektorja v celično membrano (ali zlitje vektorja s celično membrano). Ugotovili so tudi, da pri vnosu dednega materiala v jedro sodelujejo kratke peptidne molekule (t. i. NLSs-nuclear localisation signals), ki jih prepozna regulacijski sistem za prenos genskega materiala v jedro. Proteinsko inženirstvo je odprlo novo pot ideji o sintezi takega protei-na, ki bi združeval različne vektorjeve lastnosti, potrebne za vsako fazo vnosa DNK v celično jedro. Razvili so t. i. multifunkcionalne proteine; dva sta prikazana na sliki 11. Proteini so kombinirani tako, da imajo domeno s kationskim
459
Slika 10. Primerjava različnih kompleksov molekule DNK s kationskimi liposomi. A: tvorba lipopleksa, kjer je DNK ujeta med kationskimi liposomi. B: predhodno združevanje molekule DNK s kationskim protaminom in naknadno vgrajevanje v liposome (kompleks LPD).
Slika 11. Multifukcionalna proteina GD5 in NLSCt kot vektorja za vnos genskega materiala v celico.
460
značajem za učinkovito vezanje DNK (pri GD5: Gal4 in Lys; pri NLSCt: Lys), domeno za ciljanje do tarčnih celic (pri GD5: fragment protitelesa scFV; pri NLSCt: ligand za receptor-integrin: FMDV RGD fragment) ter določeno domeno za vstop v celico oz. izstop iz lizosoma (pri GD5: fuzogeni peptid toksina difterije); ali prenos v jedro (pri NLSCt: SV40NLSs) (37).
Hibridni vektorji
Hibridni vektorji so kombinacija nevirusnih vektorjev in določenih virusnih komponent. Sled-
nje so dodane zato, da bolje posnemajo lastnosti virusov, ki omogočajo učinkovitejšo trans-fekcijo kot nevirusni vektorji (slika 12) (25).
Vnos terapevtskih genov z ex vivo spremenjenimi celicami
Presajanje tkiv je že dolgo znana strategija nadomeščanja ali popravljanja bioloških nepravilnosti v organizmu (transfuzija krvi, presaditev kostnega mozga idr.). Gensko inže-nirstvo in celična biologija sta odprli možnost vnosa terapevtskega gena v odvzete celice in
Slika 12. Tvorba kompleksa med molekulo DNK in transferin-polilizinom (PLL). Transferin omogoča vezavo na receptor tarčne celice, dodani inaktivirani virusni delci pa olajšajo vstop v celico.
njihovo gojenje ex vivo, ki jih nato ponovno vnesejo v organizem. Najustreznejše so hemato-poetične in endotelijske celice, celice kostnega mozga in živčevja. Nekatere že testirajo za zdravljenje angiogeneze, Parkinsonove bolezni in aidsa (3, 8).
SKLEP
V prispevku smo predstavili najnovejše smernice na področju novih dostavnih sistemov, ki še zdaleč niso dosegli vrha svojih zmož-
nosti (38). Rezultati naših študij in drugih avtorjev kažejo, da novodobne učinkovine zahtevajo specifično izpopolnjene farmacevtske oblike in ovojnino za ciljani vnos v telo in prirejeno sproščanje. Vzporedno z razvojem biotehnologije, genskega inženiringa in nanotehnologije je treba razvijati in dograjevati tudi znanje iz farmacevtske tehnologije, edinega orodja, ki dejansko oblikuje veliko molekulo učinkovine v učinkovito in varno zdravilo. Začete raziskave kažejo, da je pomembno zlivanje izkušenj iz različnih področij.
LITERATURA
1.	Cleland JL, Daugherty A, Mrsny R. Emerging protein delivery methods. Curr Opin Biotech 2001; 12: 212-9.
2.	Walsh G. Pharmaceutical biotechnology products approved within European Union. Eur J Pharm Biopharm 2003; 55: 3-10.
3.	Rubanyi GM. The future of human gene therapy. Mol Asp Med 2001; 22: 113-42.
4.	Gantar M, Štrukelj B. Mehanizmi delovanja in oblikovanje biotehnoloških produktov. Farm Vest 2000; 51: 491-8.
5.	Planinšek O, Srčič S. Kritične fizikalno-kemijske lastnosti peptidov in proteinov za načrtovanje farmacevtskih oblik. Farmacevtska tehnologija na prelomu tisočletja. Ljubljana: Slovensko farmacevtsko društvo 1998: 33-44.
6.	Sinha VR, Trehan A. Biodegradable microspheres for protein delivery. J Control Rel 2003; 90: 216-80.
7.	Banga AK. Delivery of protein thrapeutics. World Markets Series Business Briefing, Pharma Tech 2003, p. 198-202.
8.	Whittlesey KJ, Shea LD. Delivery systems for small molecule drugs, proteins, and DNA: the neuroscience/bio-material interface. Exp Neurol 2004; 190: 1-16.
9.	Cegnar M, Kos J, Kristl J. Cystatin incorporated in poly(lactide-co-glycolide) nanoparticles: development and fundamental studies on preservation of its activity. Eur J Pharm Sci 2004; 22 (5): 357-64.	46]
10.	Cegnar M, Premzl A, Zavašnik - Bergant V, et al. Poly(lactide-co-glycolide) nanoparticles as a carrier system for delivering cysteine protease inhibitor cystatin into tumor cells. Exp Cell Res 2004; 301 (2): 223-31.
11.	Dai C, Wang B, Zhao H. Microencapsulation peptide and protein drugs delivery system. Colloid Surface: Biointerface 2005; 41: 117-20.
12.	Chaubal MV. Role of excipients in parenteral sustained-release formulations. Drug Del Tech 2003; 7.
13.	Packhaeuser CB, Schnieders J, Oster CG, et al. In situ forming parenteral drug delivery systems: an overview. Eur J Pharm Biopharm 2004; 58: 445-55.
14.	Sershen S, West J. Implantable, polymeric systems for modulated drug delivery, Adv Drug Del Rev 2002; 54(9): 1225-35.
15.	Kristl J, Zajc N, Gašperlin M. Inhalacijski aerosoli za lokalno in sistemsko dostavo učinkovin. Med Razgl 2001; 40 (4): 401-14.
16.	Kalia YN, Naik A, Garrison J, et al. Iontophoretic drug delivery. Adv Drug Del Rev 2004; 56: 619-58.
17.	European Pharmacopoeia 5th edition. Council of Europe, Strasbourg. Liguge: Aubin; 2004.
18.	Panchagnula R, Pillai O, Nair VB, et al. Transdermal iontophoresis revisited. Current Opin Chem Biol 2000; 4: 468-73.
19.	Tierney MJ, Tamada JA, Potts RO, et al. Clinical evaluation of the GlucoWatch biographer: a continual, noninvasive glucose monitor for patients with diabetes. Biosenzor & Bioelectronics 2001; 16: 621-9.
20.	Maček Lebar A, Serša G, Čemžar M, et al. Elektroporacija. Med Razgl 1998; 37: 339-54.
21.	Wang Y, Thakur R, Fan Q, et al. Transdermal iontophoresis: combination strategies to improve transdermal iontophoretic drug delivery. Eur J Pharm Biopharm 2005 (v tisku).
22.	Bally MB, Harvie P, Wong FMP, et al. Biological barriers to cellular delivery of lipid-based DNA carriers. Adv Drug Del Rew 1999; 38: 291-315.
23.	Pannier AK, Shea LD. Controlled release systems for DNA delivery. Mol Ther 2004; 10: 19-26.
24.	El-Aneed A. An overview of current delivery systems in cancer gene therapy. J Control Rel 2004; 94: 1-14.
25.	Schmidt-Wolf GD, Schmidt-Wolf GH. Non-viral and hybrid vectors in human gene therapy: an update. Trend Mol Med 2003; 9: 67-72.
26.	Ewert K, Slack NL, Ahmad A, et al. Cationic lipid-DNA complexes for gene therapy: understanding the relationship between complex structure and gene delivery pathways at the molecular level. Curr Med Chem 2004; 11: 133-49.
27.	Brannon-Peppas L, Blanchette JO. Nanoparticle and targeted systems for cancer therapy. Adv Drug Del Rev 2004; 56(11): 1649-59.
28.	Torchilin VP. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers. Nature Rev Drug Discov 2005; 4: 145-65.
29.	Spack EG, Sorgi FL. Developing non-viral DNA delivery systems for cancer and infectious disease. Drug Discov Today 2001; 6: 186-97.
30.	Montier T, Delepine P, Pichon C, et al. Non-viral vectors in cystic fibrosis gene therapy: progress and challenges. Trend Biotech 2004; 22: 586-92.
31.	Ogris M, Walker G, Blessing T, et al. Tumor-targeted gene therapy: strategies for the preparation of ligand-pol-yethylene glycol-polyethylenimine/DNA complexes. J Control Rel 2003; 91:173-81.
32.	Liu F, Huang L. Development of non-viral vectors for systemic gene delivery. J Control Rel 2002; 78: 259-66.
33.	Podlogar F, Kristl J. Dendrimeri in njihova farmacevtska uporabnost vprihodnosti. Farm Vestn 2004; 55 (2): 197-205.
34.	Kočevar N, Kristl J. Ciljana dostava učinkovin v tumorske celice z liposomi. Farm Vestn 2005 ; 56 (3): 202-6.
35.	Abramovič Z, Kristl J. Inteligentni hidrogeli za dostavo zdravilnih učinkovin. Farm Vestn 2004; 55 (4): 555-63.
36.	Lasic DD. Liposomes in gene therapy. In Petraria P, Unger CL, editors. Liposomes in gene therapy. Boca Raton - Florida: CRC Press; 1996.
37.	Aris A, Villaverde. Modular protein engineering for non-viral gene therapy. Trend Biotech 2004; 22: 371-7.
38.	Cegnar M, Kristl J, Kos J. Nanoscale polymer carriers to deliver chemotherapeutics to tumours. Exp Opin Biol Ther 2005; 5(12): 1557-69.
Prispelo 24. 5. 2005
462