427 STROKOVNI ČLANEK Inducirane pluripotentne matične celice in možnosti njihove uporabe pri zdravljenju dednih bolezni kože Avtorske pravice (c) 2023 Zdravniški Vestnik. To delo je licencirano pod Creative Commons Priznanje avtorstva-Nekomercialno 4.0 mednarodno licenco. Inducirane pluripotentne matične celice in možnosti njihove uporabe pri zdravljenju dednih bolezni kože Induced pluripotent stem cells and their potential for the development of therapeutic approaches for hereditary skin disorders Tjaša Sorčan,1 Bor Hrvatin Stančič,2,3 Špela Zemljič Jokhadar,4 Mirjana Liović3 Izvleček Leta 1962 je Gurdon odkril, da je specializacija celic reverzibilna; jedro v jajčni celici žabe je nadomestil z jedrom iz čre- vesne celice. Iz spremenjene jajčne celice se je razvil paglavec. Leta 2006 je Yamanaka odkril, kako je mogoče z uporabo le nekaj genov reprogramirati odrasle mišje celice v stanje, ki je podobno embrionalnim celicam. Tako pridobljene celice so poimenovali inducirane pluripotentne matične celice, ki se lahko razvijejo v vse vrste celic v telesu, zato so obetavno orodje za različne pristope zdravljenja, ki temeljijo na celični terapiji. Gurdon in Yamanaka sta za odkritje, da je mogoče dozorele celice reprogramirati v pluripotentno stanje, leta 2012 prejela Nobelovo nagrado za fiziologijo. V tem prispevku bomo prikazali kratek pregled dognanj na tem področju, pri čemer bomo poudarili področje skupine redkih dednih bolez- ni krhkosti kože. Abstract In 1962, Gurdon discovered that cell specialization is reversible; he replaced the nucleus in a frog egg cell with a nucleus from an intestinal cell, and the altered egg cell developed into a tadpole. In 2006, Yamanaka discovered how by using just a few genes, adult mouse cells could be reprogrammed into a state similar to embryonic cells. The cells obtained in this way were called induced pluripotent stem cells, which can develop into all types of cells in the body, thus being a prom- ising tool for various treatment approaches based on cell therapies. Gurdon and Yamanaka won the 2012 Nobel Prize in Physiology for discovering mature cells’ potential to be reprogrammed into a pluripotent state. In this paper, we will briefly review findings in this field, emphasizing the group of rare hereditary diseases of skin fragility. Zdravniški VestnikSlovenia Medical Journal 1 Medicinski center za molekularno biologijo, Inštitut za biokemijo in molekularno genetiko, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija 2 Dermatovenerološka klinika, Univerzitetni klinični center Ljubljana, Ljubljana, Slovenija 3 Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija 4 Inštitut za biofiziko, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija Korespondenca / Correspondence: Mirjana Liović, e: mirjana.liovic@mf.uni-lj.si Ključne besede: iPS celice; koža; celične terapije; bulozna epidermoliza Key words: iPSC; skin; cell therapies; epidermolysis bullosa Prispelo / Received: 21. 12. 2022 | Sprejeto / Accepted: 30. 5. 2023 Citirajte kot/Cite as: Sorčan T, Hrvatin Stančič B, Zemljič Jokhadar Š, Liović M. Inducirane pluripotentne matične celice in možnosti njihove uporabe pri zdravljenju dednih bolezni kože. Zdrav Vestn. 2023;92(9–10):427–34. DOI: https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3410 eng slo element sl article-lang 10.6016/ZdravVestn.3410 doi 21.12.2022 date-received 30.5.2023 date-accepted Dermatology, venereology Dermatologija, venerologija discipline Professional article Strokovni članek article-type Induced pluripotent stem cells and their potential for the development of therapeutic approaches for hereditary skin disorders Inducirane pluripotentne matične celice in možnosti njihove uporabe pri zdravljenju dednih bolezni kože article-title Induced pluripotent stem cells and their potential for the development of therapeutic approaches for hereditary skin disorders Inducirane pluripotentne matične celice in možnosti njihove uporabe pri zdravljenju dednih bolezni kože alt-title iPSC, skin, cell therapies, epidermolysis bullosa iPS celice, koža, celične terapije, bulozna epider- moliza kwd-group The authors declare that there are no conflicts of interest present. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo nobeni konkurenčni interesi. conflict year volume first month last month first page last page 2023 92 9 10 427 434 name surname aff email Mirjana Liović 3 mirjana.liovic@mf.uni-lj.si name surname aff Tjaša Sorčan 1 Bor Hrvatin Stančič 2,3 Špela Zemljič Jokhadar 4 eng slo aff-id Medical Center for Molecular Biology, Institute of Biochemistry and Molecular Genetics, Faculty of Medicine, University of Ljubljana, Ljubljana, Slovenia Medicinski center za molekularno biologijo, Inštitut za biokemijo in molekularno genetiko, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija 1 Department of Dermatovenereology, University Medical Centre Ljubljana, Ljubljana, Slovenia Dermatovenerološka klinika, Univerzitetni klinični center Ljubljana, Ljubljana, Slovenija 2 Faculty of Medicine, University of Ljubljana, Ljubljana, Slovenia Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija 3 Institute for Biophysics, Faculty of Medicine, University of Ljubljana, Ljubljana, Slovenia Inštitut za biofiziko, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija 4 428 DERMATOLOGIJA, VENEROLOGIJA Zdrav Vestn | september – oktober 2023 | Letnik 92 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3410 1 Uvod Diferencirane somatske celice je možno dediferen- cirati v stanje, podobno pluripotentnosti oziroma toti- potentnosti s prenosom jedrne vsebine somatskih celic v oocite (1) ali z zlitjem somatskih z embrionalnimi matičnimi celicami (angl. embryonal stem cells, ES-ce- lice) (2,3). Takahashi in Yamanaka (4) sta leta 2006 us- pešno inducirala stanje pluripotentnosti v mišjih odra- slih fibroblastih, gojenih v kulturi, pri pogojih rasti za ES-celice z izražanjem le 4 rastnih faktorjev, in sicer: Oct3/4, Sox2, c-Myc in Klf4. Nastale celice so imenovali inducirane pluripotentne matične celice oz. iPS-celice (angl. induced pluripotent stem cells). iPS-celice so ka- zale morfologijo in rastne lastnosti ES-celic, izražale pa so tudi tipične označevalce za ES-celice (Slika 1). Pod- kožna presaditev iPS-celic je v miškah sprožila nastanek tumorjev, ki so vsebovali celice različnih tkiv iz vseh treh zarodnih plasti (t.i. test teratoma). Po injiciranju mišjih iPS-celic v mišje blastociste so celice prispevale k razvo- ju mišjih zarodkov brez stranskih učinkov. Takahashi in sodelavci (5) so nato leta 2007 reprogramirali tudi hu- mane dermalne fibroblaste. Nastale humane iPS-celice so bile prav tako podobne ES-celicam: izražale so rastne Slika 1: Morfologija in izražanje nekaterih rastnih faktorjev pri iPS-celicah. (A) Vzpostavljanje iPS-celične linije s pomočjo fibroblastov kot t.i. “hranilnega sloja” (angl. feeder layer). Na sliki so vidni manjši otočki reprogramiranih celic, 10-kratna povečava. (B) Tipičen izgled iPS-celic, ki spominja na embrionalne celice. Celice so zelo majhne v primerjavi z odraslimi oz. diferencirane somatske celice, z velikimi jedri in tesno zbite, 40-kratna povečava. (C) Izgled večjega otočka iPS-celic pri 4-kratni povečavi. Celice rastejo tesno skupaj in so majhne. Zato se posamezne celice težko med seboj ločijo. (D) iPS-celice močno izražajo nekaj rastnih faktorjev, ki se izražajo v jedru in so značilni za embrionalne in pluripotentne matične celice, med katerimi sta tudi Nanog (D) in Oct (E). 429 STROKOVNI ČLANEK Inducirane pluripotentne matične celice in možnosti njihove uporabe pri zdravljenju dednih bolezni kože faktorje ES ter se v laboratorijskih pogojih lahko razvile v celice vseh 3 zarodnih plasti. Tehnologija pridobivanja iPS-celic omogoča nasta- nek celic, ki imajo nekatere lastnosti ES-celic, kot je plu- ripotentnost in, vsaj teoretično, neomejena proliferaci- ja. Hkrati ni etičnih pomislekov glede njihove uporabe za pridobivanje odraslih celic in tkiv. Tako se je začelo obdobje razvoja iPS-celičnih linij iz različnih humanih somatskih tkiv/celic ne le v smislu razvoja novih model- nih sistemov za preučevanje bolezni, za množično testi- ranje aktivnih učinkov in za nova zdravila, temveč tudi kot osnova za razvoj pristopov za celične terapije (Slika 2). Pri slednjem je izjemnega pomena imunski odgovor in možnost zavrnitve presadka, ko gre za presaditev alo- geno pridobljenih celic iz iPS-celičnih linij. Pri tem so najpomembnejši antigeni ABO, HLA razreda I (HLA-A, -B in –C) in II (HLA-DR, -DP in -DQ), manjši antigeni histokompatibilnosti in dejavniki, kot je KIR oziroma imunoglobulinom podobni receptorji celic ubijalk (angl. natural killer cells, NK). Slednji so družina visoko poli- morfnih receptorjev, ki uravnavajo delovanje človeških NK-celic. Ljudje nosimo podtipa HLA (par), katerih iz- ražanje je odvisno od etnične pripadnosti in geografske- ga porekla posameznika. Da bi preprečili zavrnitev pre- sadka, je potrebna sistemska imunosupresija z zdravili, kar vključuje resna dodatna tveganja za zdravje bolni- kov. Zato je za uvajanje tovrstnih iPS-celičnih terapij po- membna selekcija darovalcev tkiv za pripravo iPS-celic, ki so homozigotni za HLA haplotipe. S tem omogočijo ujemanje označevalcev HLA bolnikov, ki so heterozigoti za te haplotipe. Pred leti so izračunali, da bi npr. v ZDA 100 haplotipsko homozigotnih iPS-celičnih linij omogo- čalo visoko stopnjo ujemanja tkiv za potrebe alogenih celičnih terapij pri 78 % evropskih Američanov, 63 % Slika 2: Priprava avtolognih iPS-celic in možna uporaba za avtologno celično terapijo in iskanje novih zdravil. 430 DERMATOLOGIJA, VENEROLOGIJA Zdrav Vestn | september – oktober 2023 | Letnik 92 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3410 azijskih Američanov in 45 % Afroameričanov (6). Pred 10 leti so predlagali ustanovitev mednarodne mreže iPS-celičnih bank, skladno z GMP pogoji dela, v katerih bodo hranili celične linije, homozigotne za obi- čajne haplotipe HLA (7). Na svetovni ravni bi s tem dobili t.i. »haploknjižnico« linij iPS-celic, ki bi omogočala naj- večjo možno pokritost svetovnega prebivalstva za celične terapije. Global Alliance for iPSC Therapies (GaiT, http:// www.gait.global) je neprofitna svetovna organizacija, v kateri sodelujejo tako različne zdravstvene in raziskoval- ne ustanove kot tudi podjetja. Njen namen je omogočiti razvoj in dostop do kliničnih in haplotipiziranih iPS-celic za razvoj celičnih terapij. Leta 2020 je mreža GAiT imela že 500 članov iz 17 držav. Na ravni EU je pravkar začela delovati tudi akcija COST HAPLO-iPS, katere člani smo (https://www.cost.eu/actions/CA21151/ – Generation of human induced pluripotent stem cells from HAPLO-se- lected cord blood samples). Namen je ustanovitev celične banke darovalcev najbolj pogostih HLA haplotipov, s ka- terimi bi lahko pokrivali potrebe čim večjega dela evrop- ske populacije za celične terapije. Nato bi pripravili kli- ničnim aplikacijam namenjene povsem okarakterizirane celice iPS iz homozigotnih donorjev HLA. Mreža bi obe- nem skrbela za standardizacijo postopkov pridobivanja osnovnega materiala (tkiv), postopkov priprave, karakte- rizacije ter hranjenja iPS- celic in za potrebno infrastruk- turo. Med cilji je tudi poenotenje obstoječega znanja na ravni EU oziroma izenačenje na isto raven. Kratkoročni cilj je, da se v naslednjih 2 letih pripravi pregled možnih produktov, ki bi jih lahko razvili do predklinične ravni. V možne ciljne skupine so bili opredeljeni predvsem bolni- ki z rakom (T-celice, NK-celice in makrofage, ki so pri- dobljene iz iPS-celic iz banke celic HAPLO-iPS) ter tudi možne aplikacije v regenerativni medicini, pri presaditvi organov in pri avtoimunskih boleznih. Uredili bodo tudi register tako pripravljenih iPS-celic in njihovih deriva- tov. Sicer v evropskem okolju že obstaja register iPS-celic (https://hpscreg.eu/), ki so jih pridobili iz različnih tkiv oziroma diferenciranih celic, pri čemer so upoštevali določene standarde priprave in karakterizacije. Žal za- enkrat te celice niso namenjene terapevtskim namenom, vendar bi se v prihodnosti lahko našel klinični namen tudi za nekatere od njih. Pri uporabi alogenih iPS-celic in njihovih derivatov se je v zadnjih letih pojavila kot mož- nost genetske manipulacije genov HLA in znižanje ali popolno utišanje izražanja proteinov HLA, ki s tem ne bi aktivirali imunskega odziva v prejemniku – pri bolniku. Doslej so to s pristopi RNA interference in CrisprCas9 genskega preurejanja eksperimentalno dosegli tako pri različnih tipih primarnih celic kot tudi pri iPS-celicah in embrionalnih celicah (8-10). Po drugi plati je avtologne iPS celice teoretično mož- no pripraviti iz celic vsakega bolnika. Avtologni vir za- gotavlja, da bi terapije bile naravnane na vsakega bolnika posebej in brez potrebe po imunosupresiji. Kljub temu so se pojavili tudi primeri, ko so avtologni presadki izzvali imunski odgovor zaradi epigenetskih sprememb, somatskih mutacij ali zaradi genetske nestabilnosti iPS- -celic na splošno (11-13). Slaba plat avtolognih terapij so predvsem visoki stroški ter čas, ki je potreben za njiho- vo pripravo. Doslej so pri človeku opravili le 3 študije, ki so zajemale presaditev avtolognih somatskih celic, pridobljenih iz iPS-celic: pri zdravljenju degenerativnih procesov očesne makule (s pridobljenimi celicami iPS mrežničnega pigmentnega epitela), zdravljenju Parkin- sonove bolezni (z iPS pridobljenimi dopaminergičnimi nevroni) in zdravljenju trombocitopenije (z iPS pridob- ljenimi trombociti). V slednji 1 leto po presaditvi niso ugotovili stranskih učinkov (japonski register kliničnih študij jRCTa050190117), medtem ko v drugih dveh pri- merih niso zasledili stranskih učinkov tudi 4 leta po pre- saditvi (14-16). Veliko več kliničnih poskusov poteka/je potekalo z iPS celicami iz alogenih virov, okoli 15 (17). 2 Koža Terapije z iPS-celicami so zaradi dostopnosti kože ze- lo obetavne na področju genodermatoz tako za odvzem materiala bolnikov kot tudi za presaditev oziroma aplici- ranje možnih terapij. Koža je največji organ človeškega telesa, ki prekriva okoli 2 m2 površine in pri povprečni telesni masi zajema 6–8 kg. Njena glavna naloga je zaš- čita pred zunanjimi vplivi, kot so patogeni, UV sevanje, mehanske poškodbe in kemijski vplivi. iPS-celice imajo velik potencial tako za razvoj celičnih in tkivnih modelov bolezni kot tudi kot izvor keratinocitov in drugih kožnih celic. To je še posebej pomembno, ker je celični material bolnikov omejen. Širok obseg uporabnosti celičnih terapij v dermatolo- giji je posledica zgradbe kože ter funkcije celic in protei- nov, ki pri tem sodelujejo. Koža je sestavljena iz 3 plasti. Spodnjo plast imenujemo hipodermis oz. podkožje, sledi ji dermis oz. usnjica, zgornjo plast, ki je neposredno iz- postavljena zunanjemu okolju in njegovim vplivom, ime- nujemo epidermis oz. povrhnjica (Slika 3). Hipodermis je najgloblja plast kože, sestavljena iz ve- zivnega in maščobnega tkiva. Njegova glavna naloga je toplotna izolacija telesa in shranjevanje energije ter varo- vanje organov, kosti in mišic pred poškodbami. Dermis je vezivno tkivo, ki je prepleteno s številnimi živci in žilami ter kožnimi priveski. Nudi strukturno in prehransko podporo koži, saj jo oskrbuje s kisikom in 431 STROKOVNI ČLANEK Inducirane pluripotentne matične celice in možnosti njihove uporabe pri zdravljenju dednih bolezni kože hranilnimi snovmi ter odvaja odpadne snovi. Razdeljen je na papilarni (zgornji) in retikularni (spodnji) dermis. Glavna sestavina dermisa je zunajcelični matriks, ki vse- buje pretežno kolagenska in elastinska vlakna. V člove- škem telesu je 28 različnih tipov kolagenov. Kolagenska vlakna imajo izredno kompleksno strukturo. V osnovi gre za dozorevanje osnovne molekule proteina kolagena, ki tvori superheliks na strukturo iz treh α-verig. Vsaka ve- riga vsebuje 1.400 aminokislin, vsak zavoj pa vsebuje le 3 aminokisline. Nastajanje superheliksa omogoča pono- vitev 3 aminokislin: Gly-X-Pro ali Gly-X-Hyp, od katerih je hydroksi prolin (Hyp) zelo pomembna aminokislina, ki nastane s hidroksilacijo prolina. Za to je potreben vitamin C, ki deluje kot reducent za encim prolin hidroksilazo. Pomankanje vitamina C povzroča skorbut, ki povzro- či krvavenje dlesni, izpadanje zob, degeneracijo kosti in slabo celjenje ran. Verige kolagena v superheliksu so zelo tesno ovite druga okoli druge, kar omogoča majhna ami- nokislina glicin. Tako nastane t.i. tropokolagen, ki se nato povezuje z drugimi molekulami tropokolagena. Za nasta- nek posameznega kolagenskega vlakna oziroma fibrile jih je potrebnih do 1.000 (Slika 4, A in B). Kolagen zajema skoraj četrtino vseh proteinov v telesu. Kolagene najdemo v vseh človeških tkivih, še posebej v kitah in koži. Odgo- voren je za zagotavljanje oblike in opore kože. Kolagena tipa I in III sta v največji meri prisotna v dermisu odraslih. Papilarni dermis vsebuje predvsem kolagen tipa III, ki je razporejen v tanka, slabo organizirana vlakna, medtem ko retikularni dermis vsebuje predvsem kolagen tipa I, ki je razporejen v velika, debela in dobro organizirana vlakna. Dermis vsebuje štiri glavne vrste celic: fibroblaste, dermal- ne dendritične celice, makrofage in mastocite. Fibroblasti so metabolno zelo aktivne celice, ki skrbijo za vzdrževanje in preoblikovanje vezivnega tkiva tako, da sintetizirajo ko- lagen in komponente zunajceličnega matriksa. Dermalne dendritične celice in makrofagi igrajo pomembno vlo- go pri prirojeni in pridobljeni imunosti, mastociti pa pri sprožitvi imunskega in vnetnega odziva. Vse 3 vrste celic izvirajo iz kostnega mozga. Poleg njih najdemo v dermisu tudi krvne in limfne žile, živčne končiče, čutilna telesca in lasne korenine ter žleze lojnice in znojnice (18). Epidermis je zgornja, večslojna plast celic kože, ki jo večinoma sestavljajo celice keratinociti, ki so izredno bo- gati s strukturnim proteinom keratinom. Keratini so kom- pleksni polimerni proteini, ki se tkivno in celično speci- fično izražajo v različnih tkivih. Epidermalnih keratinov je več kot 40. Keratine po aminokislinskem zaporedju in strukturi uvrščamo v veliko družino proteinov, ki tvorijo intermediarne filamente (IF) celičnega citoskeleta. Ti so razdeljeni v 2 od 6 skupin proteinov IF, v tip I, t.i. kisli keratini, in v tip II, t.i. bazični keratini. Za razliko od osta- lih proteinov IF so keratini obvezni heterodimeri določe- nega keratina tipa I z določenim keratinom tipa II. He- terodimeri se nato združujejo v kompleksnem zaporedju in gradijo posamezne keratinske filamente, debeline okoli 10 nm, ki lahko vsebujejo tudi do 40.000 dimernih pode- not. Keratinski citoskelet je precej razvejan in spominja na mrežo (Slika 4, C in D). Keratini zagotavljajo ne le mehan- sko odpornost, temveč so vključeni tudi v številne funkci- je celic in tkiv, kot so rast celic, proliferacija, celjenje ran itd. (19). Približno 800 mutacij, ki prizadenejo keratinske gene, je doslej že bilo povezanih z različnimi keratinopati- jami oziroma redkimi dednimi bolezni krhkosti celic (20). V to skupino se uvrščajo tudi številne dedne bolezni krh- kosti kože, patološke spremembe nohtov in las, distrofija roženice pa tudi možne patologije, kot so kronično vnetje čreves, različne bolezni jeter, ciroza jeter, pankreatitis itd. (21). V različnih slojih epidermisa se izražajo različni ke- ratini in epidermalni proteini (keratini 5, 14, 1, 10, 9, 2e, filagrin, involukrin, lorikrin, transglutaminaze). Keratino- citi v najnižji plasti epidermisa, v bazalnem sloju, se delijo in razvijajo oziroma diferencirajo s procesom terminalne diferenciacije. Pri tem se premikajo navzgor do najvišjega oziroma mrtvega in poroženelega sloja ploščatih ostan- kov keratinocitov, ki je v neposrednem stiku z zunanjim svetom in se nenehno lušči in nadomešča. Med procesom terminalne diferenciacije keratinociti spreminjajo obliko in izražanje strukturnih proteinov ter na koncu odmrejo. Za obnovo epidermisa so potrebni približno 4 tedni. Pri tem igrajo pomembno vlogo različice proteina p63, člana Slika 3: Histologija kože. Debelina epidermisa, dermisa in hipodermisa se razlikuje glede na dele telesa, na katerem se nahaja; npr. na podplatih in dlaneh je zadebeljena, medtem ko je na obrazu tanka. 432 DERMATOLOGIJA, VENEROLOGIJA Zdrav Vestn | september – oktober 2023 | Letnik 92 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3410 družine transkripcijskih dejavnikov p53 (22). V epider- misu najdemo tudi Merklove in Langerhansove celice ter melanocite. Slednji so specializirane dendritične celice, ki proizvajajo melaninske pigmentne granule. Merklove celi- ce so mehanoreceptorji, medtem ko so Langerhansove ce- lice epidermalne dendritične celice, ki so del adaptivnega imunskega odziva (23) . Epidermis (bazalni sloj) in der- mis sta fizično povezana preko bazalne membrane, ki je kompleks številnih strukturnih proteinov, kot so kolagen 7, kolagen 17, integrina α6 in β4 ter laminin. 3 Dedna bulozna epidermoliza in razvoj celičnih terapij Enako kot pri keratinih tudi mutacije v proteinih ba- zalne membrane povzročajo različne bolezni krhkosti kože, med katerimi se daleč najbolj preučuje dedna bu- lozna epidermoliza (BE). BE je skupina redkih genetsko heterogenih kožnih bolezni, za katere je značilna krh- kost kože, mehurji in poškodbe na sluznicah. Mutacije najdemo na kar 21 različnih genih, ki kodirajo zunajce- lične in znotrajcelične proteine, ki se izražajo v epider- misu, dermalno-epidermalnem stiku (DEJ) in dermisu (24). BE razdelimo v različne podtipe glede na raven na- stajanja mehurjev oziroma bullae, v BE simpleks (vezana je predvsem na mutacije v keratinih 5 in 14), junkcijsko BE ( povezana je z mutacijami laminina (proteina zunaj- celičnega matriksa (ECM)) ali strukturnih komponent hemidesmosomov (HD), tj. integrinskih podenot (α6 ali β4) ali kolagena XVII (180-kDa bulozni pemfigoidni antigen, BP180), distrofično BE (vezana je na mutacije v kolagenu VII) in Kindlerjev sindrom (povzročajo ga mutacije kindlina 1, ki je del celičnih struktur, imeno- vanih fokalne adhezije (FA)) (25). Standardna terapija za BE je uporaba ustreznih sodobnih oblog za rane ali v redkih primerih presaditev kože v predelih razjed, re- dno spremljanje in preprečevanje možnih zapletov ter pogoste kontrole za zgodnje odkrivanje kožnega raka. Bolniki z BE imajo skrajšano življenjsko dobo in zmanj- šano kakovost življenja, resnost je odvisna od kliničnih in genetskih podtipov. Kljub velikemu napredku na po- dročju zdravljenja BE uspešne terapije še ni na voljo. Teh- nologija iPS-celic je zanimiv vir možnih celičnih terapij tovrstnih genodermatoz, saj je iPS-celice možno pripra- viti iz fibroblastov ali keratinocitov pacientov, izoliranih iz biopsije kože (26-29). iPS-celice, pridobljene iz celic bolnikov, je nato treba še gensko popraviti, diferencira- ti v želeno vrsto celic in presaditi istemu darovalcu kot avtotransplantat. Posledica ponavljajočih se mehurjev – bullae, ki vklju- čujejo kožo, sluznice in prebavila in se pogosto celijo z brazgotinami, je visoka smrtnost v mladosti, predvsem zaradi agresivnega metastatskega ploščatoceličnega kar- cinoma. Zaradi teh zapletov, ki imajo znaten družbeno- ekonomski vpliv, se velik del raziskav usmerja predvsem v recesivno distrofično bulozno epidermolizo (RDBE). Vzrok za RDBE so mutacije v genu COL7A1 oz. belja- kovini tipa VII kolagena (C7), ki jo običajno proizvajajo keratinociti in v manjši meri fibroblasti. Igra pomembno vlogo v fibrilnem sidrnem kompleksu (angl. anchoring fibrils) v bazalni membrani. Razvoj orodij za urejanje genov (angl. gene editing) in njihova uporaba pri bolniku avtolognih iPS-celicah sta pokazala obetavne rezultate. Gensko urejanje je omo- gočilo natančnejšo korekcijo mutacij pri bolnikih z EB. Izvedljivost so dokazali z uporabo inženiranih nukleaz, kot so meganukleaze, cinkovi prsti (ZFN), TALEN in nazadnje s tehnologijo CRISPR/Cas9, ki je izboljšala hit- rost in učinkovitost pri popravilu mutacij v keratinocitih in fibroblastih za RDBE (30-34). V teh pristopih gre za popravilo genetskega zapisa, ki temelji na dvojnoverižni Slika 4: Najbolj pogosti strukturni proteini kože. (A) Struktura posameznih kolagenskih vlaken po negativnem senčenju na transmisijskem elektronskem mikroskopu (TEM), 60.000-kratna povečava. Vidne so tipične in ponavljajoče se temnejše proge (glej puščico), ki nastanejo zaradi tesnega pakiranja posameznih kolagenskih fibril. (B) Kolagenska vlakna v tkivu, histološki preparat (puščica), 16-kratna povečava. (C) Izgled keratinskega intermediarnega citoskeleta keratinocitov na TEM pri negativnem senčenju (številne vidne svetle proge, ki se povezujejo druga na drugo, glej asterisk), pri 30.000-kratni povečavi. (D) Pod UV svetlobo (keratin 14 je označen s fluorokromom), kjer kaže izredno mrežasto strukturo (100-kratna povečava). 433 STROKOVNI ČLANEK Inducirane pluripotentne matične celice in možnosti njihove uporabe pri zdravljenju dednih bolezni kože prekinitvi DNK, kar je lahko hkrati tudi tvegano. Nedav- no so razvili tudi pristope urejanja posameznih nuklein- skih baz (angl. base editing), ki omogočajo spremembo C v T (CBE) ali A v G (AGE), saj je velika večina mutacij vezana na posamezne spremembe nukleotidov v DNK. Urejanje baz zaenkrat kaže izjemno stopnjo uspešnosti in odsotnost možnih neželenih zapletov, ki nastanejo pri dvojnoverižnih prekinitvah genskega urejanja (35-37). Uporabo tega pristopa za RDEB so testirali na primarnih fibroblastih in iPS-celicah (38). Veliko naporov se usmer- ja tudi v protokole diferenciacije iPS-celic v keratinocite in fibroblaste, ki bi bili nato primerni za zdravljenje BE (39-41). Keratinociti, ki so jih zaenkrat pridobili iz iPS- -celic, imajo podobne morfološke in biološke lastnosti kot primarne celice ter tvorijo epidermalne plahte celic, ki izražajo kolagen 7 (33,42). Gensko popravljeni kerati- nociti, pridobljeni z diferenciacijo JBE in RDBE iPS-ce- lic, lahko tvorijo tudi 3D ekvivalente kože (26,40,43-45). V zadnjem času so iPS-celice pripravili tudi iz T-celic bolnikov z RDEB (46), iz bolnikov z bulozno epidermo- lizo simpleks (28) ter iz zdrave osebe z največjim mo- žnim številom ponovitev za gen filagrin, kar je idealna kontrolna celična linija za študije kožne pregrade (47). 4 Zaključek Metodologija uporabe iPS-celic je kot osnova za ru- tinsko zdravljenje redkih bolezni zaradi genomske ne- stabilnosti samih iPS-celic in možnega spontanega ra- zvoja teratomov še vedno vprašljiva (48,49). V povezavi s pristopi genetskega urejanja se odpirajo možnosti za nastanek dodatnih nezaželenih sprememb. Keratino- citi, pridobljeni iz iPS-celic, npr. hitro dosežejo stanje senescence, kar pomeni, da bi bilo treba selekcionirati celice, ki so po genetskem statusu ustrezne za nadaljnje namnoževanje in zdravljenje. Vse naštete ovire predsta- vljajo velik izziv za naslednjo stopnjo razvoja pristopov celične terapije, ki temeljijo na iPS-celicah. Vsekakor pa te težave niso nerešljive. Je le vprašanje časa, kdaj bodo tovrstne terapije postale rutinske. Izjava o navzkrižju interesov Avtorji nimamo navzkrižja interesov. Literatura 1. Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ, Campbell KH. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature. 1997;385(6619):810-3. DOI: 10.1038/385810a0 PMID: 9039911 2. Cowan CA, Atienza J, Melton DA, Eggan K. Nuclear reprogramming of somatic cells after fusion with human embryonic stem cells. Science. 2005;309(5739):1369-73. DOI: 10.1126/science.1116447 PMID: 16123299 3. Tada M, Takahama Y, Abe K, Nakatsuji N, Tada T. Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells. Curr Biol. 2001;11(19):1553-8. DOI: 10.1016/S0960-9822(01)00459-6 PMID: 11591326 4. Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast culturesby defined factors. Cell. 2006;126(4):663-76. DOI: 10.1016/j.cell.2006.07.024 PMID: 16904174 5. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 2007;131(5):861-72. DOI: 10.1016/j.cell.2007.11.019 PMID: 18035408 6. Gourraud PA, Gilson L, Girard M, Peschanski M. The role of human leukocyte antigen matching in the development of multiethnic “haplobank” of induced pluripotent stem cell lines. Stem Cells. 2012;30(2):180-6. DOI: 10.1002/stem.772 PMID: 22045598 7. Turner M, Leslie S, Martin NG, Peschanski M, Rao M, Taylor CJ, et al. Toward the development of a global induced pluripotent stem cell library. Cell Stem Cell. 2013;13(4):382-4. DOI: 10.1016/j.stem.2013.08.003 PMID: 24094319 8. Börger AK, Eicke D, Wolf C, Gras C, Aufderbeck S, Schulze K, et al. Generation of HLA-Universal iPSC-Derived Megakaryocytes and Platelets for SurvivalUnder Refractoriness Conditions. Mol Med. 2016;22(1):274-85. DOI: 10.2119/molmed.2015.00235 PMID: 27262025 9. Deuse T, Seifert M, Tyan D, Tsao PS, Hua X, Velden J, et al. Immunobiology of naïve and genetically modified HLA-class-I-knockdown human embryonicstem cells. J Cell Sci. 2011;124(Pt 17):3029-37. DOI: 10.1242/ jcs.087718 PMID: 21878509 10. Figueiredo C, Oldhafer F, Wittauer EM, Carvalho-Oliveira M, Akhdar A, Beetz O, et al. Silencing of HLA class I on primary human hepatocytes as a novel strategy for reductionin alloreactivity. J Cell Mol Med. 2019;23(8):5705-14. DOI: 10.1111/jcmm.14484 PMID: 31180181 11. Araki R, Uda M, Hoki Y, Sunayama M, Nakamura M, Ando S, et al. Negligible immunogenicity of terminally differentiated cells derived from inducedpluripotent or embryonic stem cells. Nature. 2013;494(7435):100- 4. DOI: 10.1038/nature11807 PMID: 23302801 12. Todorova D, Kim J, Hamzeinejad S, He J, Xu Y. Brief Report: Immune Microenvironment Determines the Immunogenicity of Induced PluripotentStem Cell Derivatives. Stem Cells. 2016;34(2):510-5. DOI: 10.1002/stem.2227 PMID: 26439188 13. Deuse T, Hu X, Agbor-Enoh S, Koch M, Spitzer MH, Gravina A, et al. De novo mutations in mitochondrial DNA of iPSCs produce immunogenic neoepitopes inmice and humans. Nat Biotechnol. 2019;37(10):1137-44. DOI: 10.1038/s41587-019-0227-7 PMID: 31427818 14. Mandai M, Watanabe A, Kurimoto Y, Hirami Y, Morinaga C, Daimon T, et al. Autologous Induced Stem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration. N Engl J Med. 2017;376(11):1038-46. DOI: 10.1056/ NEJMoa1608368 PMID: 28296613 15. Schweitzer JS, Song B, Herrington TM, Park TY, Lee N, Ko S, et al. Personalized iPSC-Derived Dopamine Progenitor Cells for Parkinson’s Disease. N Engl J Med. 2020;382(20):1926-32. DOI: 10.1056/ NEJMoa1915872 PMID: 32402162 16. Takagi S, Mandai M, Gocho K, Hirami Y, Yamamoto M, Fujihara M, et al. Evaluation of Transplanted Autologous Induced Pluripotent Stem Cell- Derived RetinalPigment Epithelium in Exudative Age-Related Macular Degeneration. Ophthalmol Retina. 2019;3(10):850-9. DOI: 10.1016/j. oret.2019.04.021 PMID: 31248784 17. Flahou C, Morishima T, Takizawa H, Sugimoto N. Fit-For-All iPSC- Derived Cell Therapies and Their Evaluation in Humanized Mice WithNK Cell Immunity. Front Immunol. 2021;12:662360. DOI: 10.3389/ fimmu.2021.662360 PMID: 33897711 434 DERMATOLOGIJA, VENEROLOGIJA Zdrav Vestn | september – oktober 2023 | Letnik 92 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3410 18. Kretzschmar K, Watt FM. Markers of epidermal stem cell subpopulations in adult mammalian skin. Cold Spring Harb Perspect Med. 2014;4(10):a013631. DOI: 10.1101/cshperspect.a013631 PMID: 24993676 19. Alam H, Sehgal L, Kundu ST, Dalal SN, Vaidya MM. Novel function of keratins 5 and 14 in proliferation and differentiation of stratifiedepithelial cells. Mol Biol Cell. 2011;22(21):4068-78. DOI: 10.1091/mbc.e10-08-0703 PMID: 21900500 20. Chamcheu JC, Siddiqui IA, Syed DN, Adhami VM, Liovic M, Mukhtar H. Keratin gene mutations in disorders of human skin and its appendages. Arch Biochem Biophys. 2011;508(2):123-37. DOI: 10.1016/j. abb.2010.12.019 PMID: 21176769 21. Toivola DM, Boor P, Alam C, Strnad P. Keratins in health and disease. Curr Opin Cell Biol. 2015;32:73-81. DOI: 10.1016/j.ceb.2014.12.008 PMID: 25599598 22. Hu MS, Borrelli MR, Hong WX, Malhotra S, Cheung AT, Ransom RC, et al. Embryonic skin development and repair. Organogenesis. 2018;14(1):46- 63. DOI: 10.1080/15476278.2017.1421882 PMID: 29420124 23. Fuchs E. Scratching the surface of skin development. Nature. 2007;445(7130):834-42. DOI: 10.1038/nature05659 PMID: 17314969 24. Has C, Liu L, Bolling MC, Charlesworth AV, El Hachem M, Escámez MJ, et al. Clinical practice guidelines for laboratory diagnosis of epidermolysis bullosa. Br J Dermatol. 2020;182(3):574-92. DOI: 10.1111/bjd.18128 PMID: 31090061 25. Fine JD, Johnson LB, Weiner M, Suchindran C. Cause-specific risks of childhood death in inherited epidermolysis bullosa. J Pediatr. 2008;152(2):276-80. DOI: 10.1016/j.jpeds.2007.06.039 PMID: 18206702 26. Tolar J, Xia L, Riddle MJ, Lees CJ, Eide CR, McElmurry RT, et al. Induced pluripotent stem cells from individuals with recessive dystrophic epidermolysisbullosa. J Invest Dermatol. 2011;131(4):848-56. DOI: 10.1038/jid.2010.346 PMID: 21124339 27. Matsumura W, Fujita Y, Nakayama C, Shinkuma S, Suzuki S, Nomura T, et al. Establishment of integration-free induced pluripotent stem cells from human recessivedystrophic epidermolysis bullosa keratinocytes. J Dermatol Sci. 2018;89(3):263-71. DOI: 10.1016/j.jdermsci.2017.11.017 PMID: 29229433 28. Kolundzic N, Khurana P, Hobbs C, Rogar M, Ropret S, Törmä H, et al. Induced pluripotent stem cell (iPSC) line from an epidermolysis bullosa simplex patientheterozygous for keratin 5 E475G mutation and with the Dowling Meara phenotype. Stem Cell Res (Amst). 2019;37:101424. DOI: 10.1016/j.scr.2019.101424 PMID: 30933721 29. Ropret S, Jeriha J, Sorčan T, Rogar M, Zemljič Jokhadar Š, McGrath JA, et al. Induced pluripotent stem cell (iPSC) line MLi-004A derived from a patient with recessivedystrophic epidermolysis bullosa (RDEB). Stem Cell Res (Amst). 2021;55:102463. DOI: 10.1016/j.scr.2021.102463 PMID: 34284275 30. Osborn MJ, Starker CG, McElroy AN, Webber BR, Riddle MJ, Xia L, et al. TALEN-based gene correction for epidermolysis bullosa. Mol Ther. 2013;21(6):1151-9. DOI: 10.1038/mt.2013.56 PMID: 23546300 31. Webber BR, Osborn MJ, McElroy AN, Twaroski K, Lonetree CL, DeFeo AP, et al. CRISPR/Cas9-based genetic correction for recessive dystrophic epidermolysis bullosa. NPJ Regen Med. 2016;1(1):16014. DOI: 10.1038/ npjregenmed.2016.14 PMID: 28250968 32. Sebastiano V, Zhen HH, Haddad B, Bashkirova E, Melo SP, Wang P, et al. Human COL7A1-corrected induced pluripotent stem cells for the treatment of recessivedystrophic epidermolysis bullosa. Sci Transl Med. 2014;6(264). DOI: 10.1126/scitranslmed.3009540 PMID: 25429056 33. Jacków J, Guo Z, Hansen C, Abaci HE, Doucet YS, Shin JU, et al. CRISPR/ Cas9-based targeted genome editing for correction of recessive dystrophic epidermolysisbullosa using iPS cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2019;116(52):26846-52. DOI: 10.1073/pnas.1907081116 PMID: 31818947 34. Itoh M, Kawagoe S, Tamai K, Nakagawa H, Asahina A, Okano HJ. Footprint-free gene mutation correction in induced pluripotent stem cell (iPSC) derivedfrom recessive dystrophic epidermolysis bullosa (RDEB) using the CRISPR/Cas9 and piggyBactransposon system. J Dermatol Sci. 2020;98(3):163-72. DOI: 10.1016/j.jdermsci.2020.04.004 PMID: 32376152 35. Komor AC, Kim YB, Packer MS, Zuris JA, Liu DR. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 2016;533(7603):420-4. DOI: 10.1038/nature17946 PMID: 27096365 36. Komor AC, Badran AH, Liu DR. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 2017;168(1-2):20-36. DOI: 10.1016/j.cell.2016.10.044 PMID: 27866654 37. Gaudelli NM, Komor AC, Rees HA, Packer MS, Badran AH, Bryson DI, et al. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature. 2017;551(7681):464-71. DOI: 10.1038/nature24644 PMID: 29160308 38. Osborn MJ, Newby GA, McElroy AN, Knipping F, Nielsen SC, Riddle MJ, et al. Base Editor Correction of COL7A1 in Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa Patient-DerivedFibroblasts and iPSCs. J Invest Dermatol. 2020;140(2):338-347.e5. DOI: 10.1016/j.jid.2019.07.701 PMID: 31437443 39. Bilousova G, Chen J, Roop DR. Differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into a multipotent keratinocytelineage. J Invest Dermatol. 2011;131(4):857-64. DOI: 10.1038/jid.2010.364 PMID: 21150926 40. Umegaki-Arao N, Pasmooij AM, Itoh M, Cerise JE, Guo Z, Levy B, et al. Induced pluripotent stem cells from human revertant keratinocytes for the treatmentof epidermolysis bullosa. Sci Transl Med. 2014;6(264). DOI: 10.1126/scitranslmed.3009342 PMID: 25429057 41. Itoh M, Umegaki-Arao N, Guo Z, Liu L, Higgins CA, Christiano AM. Generation of 3D skin equivalents fully reconstituted from human induced pluripotentstem cells (iPSCs). PLoS One. 2013;8(10):e77673. DOI: 10.1371/journal.pone.0077673 PMID: 24147053 42. Shinkuma S, Guo Z, Christiano AM. Site-specific genome editing for correction of induced pluripotent stem cells derivedfrom dominant dystrophic epidermolysis bullosa. Proc Natl Acad Sci USA. 2016;113(20):5676-81. DOI: 10.1073/pnas.1512028113 PMID: 27143720 43. Itoh M, Kiuru M, Cairo MS, Christiano AM. Generation of keratinocytes from normal and recessive dystrophic epidermolysis bullosa- inducedpluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2011;108(21):8797- 802. DOI: 10.1073/pnas.1100332108 PMID: 21555586 44. Gostyński A, Llames S, García M, Escamez MJ, Martinez-Santamaria L, Nijenhuis M, et al. Long-term survival of type XVII collagen revertant cells in an animal model of revertantcell therapy. J Invest Dermatol. 2014;134(2):571-4. DOI: 10.1038/jid.2013.308 PMID: 23884316 45. Tolar J, McGrath JA, Xia L, Riddle MJ, Lees CJ, Eide C, et al. Patient- specific naturally gene-reverted induced pluripotent stem cells in recessivedystrophic epidermolysis bullosa. J Invest Dermatol. 2014;134(5):1246-54. DOI: 10.1038/jid.2013.523 PMID: 24317394 46. Itoh M, Kawagoe S, Tamai K, Okano HJ, Nakagawa H. Integration-free T cell-derived human induced pluripotent stem cells (iPSCs) froma patient with recessive dystrophic epidermolysis bullosa (RDEB) carrying two compoundheterozygous mutations in the COL7A1 gene. Stem Cell Res (Amst). 2016;17(1):32-5. DOI: 10.1016/j.scr.2016.05.003 PMID: 27558600 47. Khurana P, Kolundzic N, Rogar M, Hobbs C, Wong XF, Common JE, et al. Stem Cell Research Lab Resource: stem Cell LineInduced pluripotent stem cell (iPSC)line MLi-003A derived from an individual with the maximum number of filaggrin (FLG)tandem repeats. Stem Cell Res (Amst). 2020;45:101827. DOI: 10.1016/j.scr.2020.101827 PMID: 32361315 48. Miura K, Okada Y, Aoi T, Okada A, Takahashi K, Okita K, et al. Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines. Nat Biotechnol. 2009;27(8):743-5. DOI: 10.1038/nbt.1554 PMID: 19590502 49. Hewitt KJ, Shamis Y, Hayman RB, Margvelashvili M, Dong S, Carlson MW, et al. Epigenetic and phenotypic profile of fibroblasts derived from induced pluripotentstem cells. PLoS One. 2011;6(2):e17128. DOI: 10.1371/journal.pone.0017128 PMID: 21386890