Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije Slovenian Institute for Hop Research and Brewing Hmeljarski bilten Hop bulletin 12 (2005) @alec - Slovenija, 2005 ISSN 0350-0756 Hmeljarski bilten - Hop bulletin Izdaja Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije, Žalskega tabora 2, 3310 Žalec, Slovenija. Odgovorni urednik Doc. dr. Martin Pavlovič Uredniški odbor Prof. dr. Branka Javornik (Ljubljana), prof. dr. Anton Ivančič (Maribor), doc. dr. Milica Kač (Ljubljana), dr. Dušica Majer (Žalec), dr. Janko Rode (Žalec), dr. Elisabeth Seigner (Freising, Nemčija), dr. Gregory K. Lewis (Durham, NC, ZDA). Tisk Tiskarna Koštomaj Marjan s.p., Meškova ulica 6, 3000 Celje v 300 izvodih Naslov uredništva Žalskega tabora 2, SI-3310 Žalec, Slovenija martin.pavlovic@guest.arnes.si Domača stran http://www.ihps.si Naročnina Posamezna številka 4.000 SIT, za tujino 25 USD Transakcijski račun 06000-0006336339 Banka Celje d.d., Celje Bilten selektivno zajemajo COBISS, AGRIS, CAB Abstracts Dokumentacijska obdelava Mednarodna: Slovenski nacionalni center AGRIS Domača: INDOK Biotehniške fakultete v Ljubljani Publikacije v zameno za Hmeljarski bilten pošljite na naslov Knjižnica Inštituta za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije, 3310 Žalec, Slovenija Avtorska pravica Copyright © 2003 Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije Hop bulletin - Hmeljarski bilten Issued by Slovenian Institute for Hop Research and Brewing Žalskega tabora 2, SI - 3310 Žalec. Editor in Chief Assist. Prof. Martin Pavlovič, Ph.D. Editor Board Prof. Ph.D. Branka Javornik (Ljubljana), Prof. Ph.D. Anton Ivančič (Maribor), Assist. Prof. Ph.D. Milica Kač (Ljubljana), Ph.D. Dušica Majer (Žalec), Ph.D. Janko Rode (Žalec), Ph.D. Elisabeth Seigner (Freising, Germany), Ph.D. Gregory K. Lewis (Durham, NC, USA). Printed by Tiskarna Koštomaj Marjan s.p., Meškova ulica 6, 3000 Celje, Slovenia in 300 copies Address of Editor Žalskega tabora 2, SI-3310 Žalec, Slovenia martin.pavlovic@guest.arnes.si Home page http://www.ihps.si Subscription Individual issue 4.000 SIT, for foreign countries 25 USD Account 06000-0006336339 Banka Celje d.d., Celje Bulletin is indexed and abstracted by COBISS, AGRIS, CAB Abstracts Indexing, Classification and Networking International: Slovene National AGRIS Center National: INDOC of Biotehnical Faculty in Ljubljana Please, address exchange publication to Library of the Slovenian Institute For Hop Research and Brewing Žalskega tabora 2, SI-3310 Žalec, Slovenia Copyright © 2003 Slovenian Institute For Hop Research and Brewing HMELJARSKI BILTEN - HOP BULLETIN ISSN 0350-0756 VSEBINA/CONTENTS Dušica MAJER, Nada GOGALA MOŽNOST PROGNOZE NAMAKANJA HMELJA NA OSNOVI VSEBNOSTI PROLINA / THE POSSIBILITY OF IRRIGATION PROGNOSIS BASED ON PROLINE CONTENT................................................................................ 5 Sebastjan RADIŠEK, Jernej JAKŠE RAZVOJ NOVIH DIAGNOSTIČNIH METOD ZA IDENTIFIKACIJO POVZROČITELJEV HMELJEVE UVELOSTI. / DEVELOPMENT OF NEW DIAGNOSTICS METHODS FOR IDENTIFICATION OF HOP WILT INDUCERS........................... 15 Simona LUSKAR, IztokJože KOŠIR, Milica KAČ DEPOZIT BAKROVIH IONOV NA LISTIH VINSKE TRTE IN NJEGOV VPLIV NA BIOLOŠKO UČINKOVITOST UPORABLJENIH FITOFARMACEVTSKIH SREDSTEV ZA ZATIRANJE PERONOSPORE VINSKE TRTE: 1. BIOLOŠKA UČINKOVITOST / DEPOSIT OF COPPER IONS ON VINE LEAVES AND ITS EFFECT ON BIOLOGICAL EFFICACY OF DIFFERENT PLANT PROTECTION PRODUCTS AGAINST DOWNYMILDEW: 1. BIOLOGICAL EFFICACY................ 23 Simona LUSKAR, IztokJože KOŠIR, Milica KAČ DEPOZIT BAKROVIH IONOV NA LISTIH VINSKE TRTE IN NJEGOV VPLIV NA BIOLOŠKO UČINKOVITOST UPORABLJENIH FITOFARMACEVTSKIH SREDSTEV ZA ZATIRANJE PERONOSPORE VINSKE TRTE: 2. DEPOZIT BAKROVIH IONOV NA LISTIH VINSKE TRTE. / DEPOSIT OF COPPER IONS ON VINE LEAVES AND ITS EFFECT ON BIOLOGICAL EFFICACY OF DIFFERENT PLANT PROTECTION PRODUCTS AGAINST DOWNY MILDEW: 2. DEPOSIT OF COPPER IONS ON VINE LEAVES............................................................... 31 Andreja ČERENAK, Jernej JAKŠE IDENTIFIKACIJA SLOVENSKIH SORT HMELJA Z MIKROSATELITSKIMI MARKERJI. / IDENTIFICATION OF SLOVENE HOP VARIETIES USING MICROSATELLITE MARKERS.................................................................... 43 Jernej JAKŠE, Sebastjan RADIŠEK VZPOSTAVITEV IDENTIFIKACIJSKEGA SISTEMA ZA DOLOČEVANJE HMELJEVEGA LATENTNEGA VIROIDA. / REESTABLISHMENT OF THE IDENTIFICATION SYSTEM FOR DETECTION OF HOP LATENTVIROID............. 49 Suzana ŠKOF, Zlata LUTHAR REGENERACIJAIZ RAZLIČNIH IZSEČKOVPRI SORTI HMELJAAURORA. / REGENERATION EFFICIENCY OF DIFFERENT EXPLANT TYPES OF HOP CV. AURORA................................................................................................ 59 Suzana ŠKOF, Zlata LUTHAR DOLOČANJE TRANSGENOV V HMELJU PO TRANSFORMACIJI Z Agrobacterium tumefacien. / IDENTIFICATION OF TRANSGENES IN HOP AFTER Agrobacterium-MEDIATED TRANSFORMATION................................. 65 Branka JAVORNIK MOLEKULARNO GENETSKE RAZISKAVE HMELJA. / GENETIC RESEARCH ON HOPS........................................................................................................................................................................................................71 Martin PAVLOVIČ, Peter ŠTORMAN TEHNOLOŠKE RAZMERE PRIDELAVE HMELJA V RS PO STRUKTURNIH SPREMEMBAH V LETU 2000. /HOP PRODUCTION IN SLOVENIA AFTER STRUCTURAL CHANGES IN 2000.............................................................. 79 Elisabeth SEIGNER, Martin PAVLOVIČ IHGC SCIENTIFIC COMMISSION SUMMARY REPORT 2005. / POVZETEK PRISPEVKOV NAZNANSTVENI KOMISIJI MHZ V LETU 2005........................... 85 Marko ZUPAN, Matej KNAPIČ, Borut VRŠČAJ, Andrej SIMONČIČ, Metka SUHADOLC SOIL VULNERABILITY ASSESSMENT FOR PESTICIDE LEACHING IN SAVINJA VALEY. / OBČUTLJIVOSTI TAL ZA IZPIRANJE FITOFARMACEVSTSKIH SREDSTEV V SAVINJSKI DOLINI................................................................................................................................91 MOŽNOST PROGNOZE NAMAKANJA HMELJA NA OSNOVI VSEBNOSTI PROLINA Dušica MAJER1, Nada GOGALA2 UDK/UDC 633.791: 631.67 (045) izvirni znanstveni članek/original scientific article prispelo/received: 15. 09. 2005 sprejeto/accepted: 26. 10. 2005 IZVLEČEK Raziskali smo možnost prognoze namakanja na osnovi meritev vsebnosti prolina v listih hmeljnih rastlin. Raziskavo smo zasnovali kot poljski poskus v polnorodnem nasadu hmeljnih rastlin (Humulus lupulus L. cv. Savinjski golding). Preizkusili smo tri obravnavanja: nenamakano (kontrola), namakano in suho ter spremljali vpliv različnih obravnavanj na vsebnost prolina v listih rastlin in na vlago tal. Vsebnost prolina v listih je signifikantno narasla ob začetku vodnega stresa, vendar ni naraščala sorazmerno s stopnjo preskrbljenosti tal z vodo. Na osnovi vsebnosti prolina v listih hmeljnih rastlin lahko prognoziramo začetek namakanja, ne pa tudi stopnje vodnega stresa in stopnje preskrbljenosti tal z vodo. Tovrstna prognozase ne ujemastrenutnoveljavno metodo prognoziranja. Ključne besede: Humulus lupulus, prognoza namakanja, vodni stres, prolin, vlaga v tleh THE POSSIBILITY OF IRRIGATION PROGNOSIS BASED ON PROLINE CONTENT ABSTRACT The possibility of irrigation prognosis based on proline content in hop leaves was studied. The research was planned as the field experiment in a fully-developed hop garden (Humulus lupulus L. cv. Savinjski Golding). Three trials were tested: unirrigated (control), irrigated and dry. The effect of different trials on proline content and soil moisture was investigated. Proline content in leaves increased significantly at the beginning of water stress but it did not increase proportionally with the soil moisture supply level. Proline content in leaves of hop plants can be used to prognosticate the beginning of water stress and the beginning of irrigation, but it is not credible at prognosticating the level of water stress and the soil moisture supply level. There is no accordance between this prognosis and momentary available prognosis. Keywords: Humulus lupulus, irrigation prognosis, waterstress, proline, soil moisture 1 dr., Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije, Žalskega tabora 2, 3310 Žalec, Slovenija 2 prof.dr., Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo, Večna pot 111, 1000 Ljubljana, Slovenija 1 UVOD Pomanjkanje vode je eden glavnih dejavnikov, ki zavirajo rast in razvoj rastlin, saj so neposredno ali posredno prizadeti vsi procesi v rastlini [9]. Kadar so rastline izpostavljene preobilici ali pomanjkanju vode, govorimo o vodnem stresu. Stres kot posledica pomanjkanja vode se za razliko od ostalih stresnih faktorjev razvija počasi, vendar je običajno dolgotrajnejši, zato je prilagodljivost rastlin sušnim razmeram pomembna za njihovo preživetje [6]. Zmanjšanje občutljivosti kmetijskih rastlin na vodni stres je glavni cilj agronomov, fiziologov in žlahtniteljev [7]. Rastline razvijejo različne morfološke in fiziološke mehanizme za odpornost proti vodnemu stresu. Adaptacije rastlin so lahko usmerjene v maksimalno izkoriščanje razpoložljive vode v tleh, v razvoj organov za skladiščenje vode v rastlini in vzaščito celice in tkiva pred propadom preko biokemijskih prilagoditev [2]. Med najpomembnejše fiziološke mehanizme vsekakor sodita osmoregulacija in hormonalna regulacija. Ob pomanjkanju vode v okolju pride v celicah do kopičenja topljencev, ki močno povečajo osmotski potencial in stem tudi vodni potencial celic. Organski osmotiki so različni polioli, ogljikovi hidrati, amonijeve substance, proste aminokisline in organske kisline [13]. Eden najpomembnejših osmotikov je prolin [8]. Količina prolina naraste zelo hitro ob pojavu vodnega stresa in se povečuje sorazmerno s stopnjo stresa, zato ga nekateri raziskovalci uporabljajo za napoved namakanja in za selekcijo na vodni stres odpornejših rastlinskih vrst [1]. Tudi nas je zanimala možnost dopolnitve prognoze namakanja s spremljanjem količine osmotikov v rastlini. To možnost smo proučevali pri hmelju. Hmelj potrebuje za optimalni razvoj v rastnem obdobju najmanj 600 mm padavin. Za slovensko klimo je značilna precej velika letna količina padavin (1300 mm), vendar je razporeditev neustrezna za optimalni razvoj hmeljnih rastlin. Pogostokrat nastopijo sušna obdobja že v maju, skoraj vedno pa tudi v juniju in juliju. Zato je namakanje hmeljskih nasadov reden ukrep, ki temelji naprognozi namakanja. Sedanja prognoza namakanja temelji le na meritvah trenutne vlažnosti tal, desorbcijskih karakteristik tal, padavin in evapotranspiracije rastlin, ne vključuje pa spremljanja fizioloških procesov v rastlini. Prognozo namakanja smo želeli dopolniti s spremljanjem vsebnosti prolina v listih rastlin. Ugotavljali smo povezavo med stopnjo preskrbljenosti tal z vodo in stopnjo vodnega stresa v rastlini, ki smo ga ocenili na osnovi vsebnosti prolina v listih rastlin. Predvidevali smo, da bodo tudi hmeljne rastline odreagirale na manjšo stopnjo preskrbljenosti tal z vodo zvečjo vsebnostjo prolina. O vplivu vodnega stresa na fiziološke procese v hmeljni rastlini je znano, da fotosintetska aktivnost storžkov sovpada z izgubami vode iz storžkov pri različnih osvetlitvah. Izgube vode so posledica odzivnosti rež na storžkih [11]. Obvodnem stresu se zmanjšajo vodni potencial listov hmeljnih rastlin, stomatarna prevodnost, intenzivnost fotosinteze, rast in razvoj rastlin [10]. O osmoregulaciji obvodnem stresu oziroma osmotikih v hmeljnih rastlinah ni podatkov. Ugotavljanje stresne odzivnosti hmeljnih rastlin je pomembno za dopolnitev prognoze namakanja hmelja na področjih, kjer je razporeditev padavin neugodna za optimalni razvoj hmeljnih rastlin Raziskave v tej smeri so pomembne tudi za iskanje prilagodljivejših hmeljnih kultivarjev za premagovanje vodnega stresa. 2 MATERIAL IN METODE 2.1 Zasnova poskusa Poskus smo zasnovali na hmelju (Humuluslupulus L.)cv. Savinjski golding. Kultivar Savinjski golding je klasičen, aromatičen, srednje zgoden kultivar s plemenito grenčico in aromo. Storžki vsebujejo od 0,7 do 0,9 ml eteričnih olj/100 g. Razmerje med a-humulenom in p-kariofilenom je okrog 3,5, povprečno vsebujejo storžki 5,5% alfa kislin [5]. Poskus je potekal dve leti v polnorodnem nasadu hmelja na Inštitutu za hmeljarstvo in pivovarstvo v Žalcu v Savinjski dolini. Savinjska dolina leži v vlažno zmerno toplem pasu s povprečno 146 padavinskimi dnevi na leto in s povprečno letno količino padavin 1196 mm (povprečje zadnjih dvajset let). Razporeditev padavin na tem območju je pogosto neugodna za hmeljne rastline. Obdobja, ki so glede preskrbljenosti hmeljnih rastlin z vodo najbolj kritična, sovečinomavvseh letih sušna. Tla na poskusnem polju sodijo v skupino distričnih rjavih tal na produ in pesku. Poljski poskus je bil zastavljen v naključnih blokih stremi obravnavanji v treh ponovitvah: namakane parcele, nenamakane (kontrolne) parcele in suhe parcele. Namakane parcele smo zalivali na osnovi obstoječe prognoze namakanja, nenamakane parcele pa so bile izpostavljene naravnim razmeram in so dobile le toliko vode kot je bilo padavin v tem obdobju. Suhe parcele smo pokrili s streho iz nepropustne folije in tako rastlinam odvzeli vir meteorske vode. Rastline smo pokrili v začetku julija, ko je za Savinjski golding najbolj kritično obdobje glede pomanjkanja vode tako za količino pridelka (17. julij - 22. julij) kot za količino alfa kislin (25. junij -19. julij) [4]. V prvem letu smo pokrili parcele 17. julija, v drugem letu pa 09. julija. Površina osnovne parcele je bila 20,8 mx16,8 m. Medvrstna razdalja na parcelah je 2,4 m, razdalja med rastlinamivvrsti je 1,3 m. 2.2 Prognoza namakanja in vlažnosttal Prognoza namakanja je temeljila na izračunani stopnji preskrbljenosti tal z vodo, merjeni evapotranspiraciji, količini padavin, spremljanju trenutne vlažnosti tal ter določitvah desorbcijskih karakteristik tal. Stopnjo preskrbljenosti tal z vodo smo določili na osnovi trenutne vlažnosti tal, točke venenja in razpoložljive vode v tleh. Stopnja preskrbljenosti pod 50 % je kritična za hmeljne rastline in pomeni nujno namakanje. Za določanje poljske kapacitete in točke venenja smo uporabili standardne metode [12]. Meritve evapotranspiracije in količine padavin smo opravili vsakdan na evapotranspiracijski postaji na posestvu. Trenutno vlažnosttal smo ugotavljali vsaktretji dan po gravimetrični metodi [12]. Vzorčili smo s sondo iz globin 0-20 cm in 20-40 cm. 2.3 Vsebnost prolina v listih Vsebnost prolina smo merili v povprečnih vzorcih listov, ki smo jih nabirali v obdobju razraščanja in storžkanja rastlin. Vzorčili smo dvakrat tedensko z zgornje, srednje in spodnje tretjine rastlin, vedno na istih rastlinah. Količino prolina smo določili spektrofotometrično [1]. 2.4 Statistične analize Rezultate smo statistično vrednotili z analizo variance. Pri računanju F-testovsmo upoštevali 95 % verjetnost (p = 0,05) ter ustrezne stopnje prostosti. Najmanjšo značilno razliko smo ugotavljali s pomočjo LSD testa pri p = 0,05. Na slikah so prikazani rezultati, kjer je vsaka vrednost povprečje treh ponovitev s standardno napako (± standardna napaka). 3 REZULTATI Stopnja preskrbljenosti tal z vodo se je na pokritih parcelah v obeh letih opazno zmanjševala od prvega do zadnjega merjenja (slika 1 in 4). V avgustu se je vlažnost tal v obeh letih zmanjšala celo do točke venenja. Med namakanimi in kontrolnimi parcelami glede stopnje preskrbljenosti tal z vodo v nobenem letu ni bilo bistvenih razlik. Razlike so se izrazile v obdobju suše (druga polovica julija), ko je na kontrolnih parcelah (slika 2 in 5) stopnja preskrbljenosti tal z vodo padla pod minimalno stopnjo (50 %), na namakanih (slika 3 in 6) pa je ostala stopnja preskrbljenosti ves čas nad minimalno. Razlike v stopnji preskrbljenosti tal z vodo so bile pri zadnjem merjenju v obeh letih tudi statistično značilne. Najmanjša statistično značilna razlika je bila v prvem (29,156 %) in drugem letu (11,980 %) presežena med pokritimi in kontrolnimi parcelami ter med pokritimi in namakanimi parcelami. Dinamika vsebnosti prolina v hmeljnih rastlinah je bila precej podobna v obeh letih. Vsebnost prolina se je na pokritih parcelah takoj po začetku različnih obravnavanj opazno povečala, vendar se je že po nekaj dneh ponovno zmanjšala. Konec julija je bila na vseh obravnavanjih nižja kot ob prvem merjenju. Razlike ob zadnjem merjenju v avgustu so bile v obeh letih statistično neznačilne. V prvem letu smo maksimalne vsebnosti prolina (2,51 mg/g suhe snovi) ugotovili 20. julija pri pokritih rastlinah. Potem datumu je vsebnost prolina v listih pokritih rastlin močno upadla. Pri namakanih in kontrolnih rastlinah se je vsebnost prolina od začetka do konca julija ves čas zniževala.V avgustu se je nadaljevalo zmanjševanje količine prolina v listih rastlin na vseh obravnavanjih. Vsebnost prolina se je (kljub velikemu pomanjkanju vode v tleh) tudi v listih pokritih rastlin stabilizirala (slika 1). V juliju (razen 24. in 27. julija) so bile razlike med obravnavanji še statistično značilne. Minimalna statistično značilna razlika je bila 13. julija (LSD=0,131 mg/g) in 31. julija (LSD=0,058 mg/g) presežena pri vseh treh obravnavanjih. V ostalih terminih v juliju so bile razlike značilne le med pokritimi in kontrolnimi parcelami ter pokritimi in namakanimi parcelami. Statistično značilne razlike med vsemi obravnavanji (LSD=0,083 mg/g) smo ugotovili tudi še v začetku avgusta, ob zadnjem merjenju na koncu avgusta (24. avgust) pa razlike med obravnavanji niso bile več statističnoznačilne. Tudi v drugem letu so se po začetku različnih obravnavanj pojavile statistično značilne razlike. Maksimalne vsebnosti prolina (0,69 mg/g suhe snovi) smo namerili 11. julija na pokritih parcelah (slika 4). Na ta datum je bila minimalna statistično značilna razlika (0,113 mg/g) presežena med pokritimi in kontrolnimi ter pokritimi in namakanimi parcelami, med nenamakanimi in namakanimi parcelami ni bilo statistično značilnih razlik. Potem datumu se je vsebnost prolina v listih pokritih rastlin zmanjšala. Pri zadnjem merjenju v avgustu (22. avgust) so bile vsebnosti prolina v listih precej podobne po obravnavanjih in so se gibale med 0,28 mg/g suhe snovi pri kontrolnih rastlinah (slika 5) do 0,30 mg/g suhe snovi pri namakanih rastlinah (slika 6) in 0,31 mg/g suhe snovi pri pokritih rastlinah (slika 4). Tudi vtem letu so bile razlike na koncu statistično neznačilne. Slika 1: Stopnja preskrbljenosti tal z vodo in vsebnost prolina v listih hmeljnih rastlin na pokritih parcelah v prvem letu. Stolpci predstavljajo stopnjo preskrbljenosti tal z vlago, točke predstavljajo vsebnost prolina v listih hmeljnih rastlin. Vsaka vrednost je povprečje (± standardna napaka) treh ponovitev. Figure 1: Soil moisture supply level and proline content in leaves of hop plants on covered plots in the first year. Bars represent soil moisture supply level, points represent proline content in leaves of hop plants. Each value is the mean (± SE) of three replicates. July August Slika 2 : Stopnja preskrbljenosti tal z vodo in vsebnost prolina v listih hmeljnih rastlin na kontrolnih parcelah v prvem letu. Stolpci predstavljajo stopnjo preskrbljenosti tal z vlago, točke predstavljajo vsebnost prolina v listih hmeljnih rastlin. Vsaka vrednost je povprečje (± standardna napaka) treh ponovitev. Figure 2: Soil moisture supply level and proline content in leaves of hop plants on control plots in the first year. Bars represent soil moisture supply level, points represent proline content in leaves of hop plants. Each value is the mean (± SE) of three replicates. 13 18 20 24 27 31 3 7 10 14 17 21 24 Date July August Slika 3: Stopnja preskrbljenosti tal z vodo in vsebnost prolina v listih hmeljnih rastlin na namakanih parcelah v prvem letu. Stolpci predstavljajo stopnjo preskrbljenosti tal z vlago, točke predstavljajo vsebnost prolina v listih hmeljnih rastlin. Vsaka vrednost je povprečje (± standardna napaka) treh ponovitev. Figure 3: Soil moisture supply level and proline content in leaves of hop plants on irrigated plots in the first year. Bars represent soil moisture supply level, points represent proline content in leaves of hop plants. Each value is the mean (± SE) of three replicates. 4 11 18 25 1 8 22 Date July August Slika 4: Stopnja preskrbljenosti tal z vodo in vsebnost prolina v listih hmeljnih rastlin na pokritih parcelah v drugem letu. Stolpci predstavljajo stopnjo preskrbljenosti tal z vlago, točke predstavljajo vsebnost prolina v listih hmeljnih rastlin. Vsaka vrednost je povprečje (± standardna napaka) treh ponovitev. Figure 4: Soil moisture supply level and proline content in leaves of hop plants on covered plots in the second year. Bars represent soil moisture supply level, points represent proline content in leaves of hop plants. Each value is the mean (± SE) of three replicates. 0 _U-U-l_l-U-U-U-U-U-0.25 4 11 18 25 1 8 22 Date July August Slika 5: Stopnja preskrbljenosti tal z vodo in vsebnost prolina v listih hmeljnih rastlin na kontrolnih parcelah v drugem letu. Stolpci predstavljajo stopnjo preskrbljenosti tal z vlago, točke predstavljajo vsebnost prolina v listih hmeljnih rastlin. Vsaka vrednost je povprečje (± standardna napaka) treh ponovitev. Figure 5: Soil moisture supply level and proline content in leaves of hop plants on control plots in the second year. Bars represent soil moisture supply level, points represent proline content in leaves of hop plants. Each value is the mean (± SE) of three replicates. Slika 6: Stopnja preskrbljenosti tal z vodo in vsebnost prolina v listih hmeljnih rastlin na namakanih parcelah v drugem letu. Stolpci predstavljajo stopnjo preskrbljenosti tal z vlago, točke predstavljajo vsebnost prolina v listih hmeljnih rastlin. Vsaka vrednost je povprečje (± standardna napaka) treh ponovitev. Figure 6: Soil moisture supply level and proline content in leaves of hop plants on irrigated plots in the second year. Bars represent soil moisture supply level, points represent proline content in leaves of hop plants. Each value isthe mean (± SE) of three replicates. 4 RAZPRAVA Različna obravnavanja so statistično značilno vplivala na stopnjo preskrbljenosti tal z vodo. Opazne so bile predvsem razlike med količino vode v tleh na pokritih in namakanih parcelah ter na pokritih in kontrolnih parcelah. Vsebnost prolina ni naraščala sorazmerno s stopnjo vodnega stresa oziroma z naraščajočo sušo, kot je znano iz podatkov v literaturi [1]. Hmeljne rastline so precej dobro prenašale vodni stres, saj je bila njihova odzivnost razmeroma šibka. Vsebnost prolina v listih pokritih rastlin se je kmalu po pokritju parcel statistično značilno povečala, vendar se je kmalu ponovno znižala in se v avgustu stabilizirala. Kljub nadaljevanju različnih obravnavanj, so bile vsebnosti na koncu poskusa podobne po obravnavanjih, razlike pa statistično neznačilne. Manjša stopnja preskrbljenosti tal z vodo ni več vplivala na povečano vsebnost prolina kot smo pričakovali. V prvem letu je bila v poljskem poskusu vsebnost prolina največja pri 55,3-odstotni stopnji preskrbljenosti tal z vodo, najmanjša pa pri 25-odstotni stopnji preskrbljenosti, ko se vlažnost tal bliža že točki venenja in je potrebno namakanje. V drugem letuje bila vsebnost prolina največja, ko je bila stopnja preskrbljenosti tal z vodo 46,8-odstotna, pri 10,2-odstotni preskrbljenosti tal z vodo pa je bila vsebnost prolina v listih najmanjša. V prvem letu se je vsebnost prolina v poljskem poskusu povečala za največ 1,7-krat, v drugem letu pa le za 1,2-krat. To je majhno povečanje v primerjavi z nekaterimi vrednostmi iz literature, kjer navajajo pri nekaterih rastlinskih vrstah tudi do 60-kratno povečanje [3]. Vzrok za razmeroma slabo odzivnost na stres je verjetno tudi v slabši možnosti kontrole razmer na polju. Parcele smo sicer pokrili in na ta način rastline umetno izpostavili suši, vendar učinek ni bil enak kot v primeru naravne suše. Rastline so nekaj vode lahko še vedno dobile s sosednjih površin in tudi izzraka. S povečanjem vsebnosti prolina so rastline reagirale na začetku poskusa ob nenadnem in hitrem zmanjšanju količine vodevtleh, kasneje pa so se količine prolina ponovno zmanjšale. Vsebnost prolina je bila dober pokazatelj začetka vodnega stresa ne pa tudi stopnje vodnega stresa in stopnje preskrbljenosti tal z vodo. Na osnovi teh rezultatov lahko ugotovimo, da lahko na osnovi vsebnosti prolina v listih hmeljnih rastlin prognoziramo začetek vodnega stresa in začetek namakanja, ne moremo pa prognozirati stopnje vodnega stresa in stopnje založenostitalzvodo. V drugem letu poskusa smo ugotovili tudi vpliv različnih obravnavanj v preteklem letu. Rastline na parcelah, ki so bile v prvem letu poskusa pokrite, so bile v drugem letu precej nižje in slabše razvite od rastlin na ostalih obravnavanjih. Kljub temu, daje Savinjski golding eden izmed najbolj občutljivih hmeljnih kultivarjevnasušo, je bila odzivnost rastlin na sušni stres, merjena z vsebnostjo prolina, razmeroma slaba. To pomeni, da so pri tem kultivarju za obrambo pred sušnim stresom verjetno pomembnejši drugi fiziološki patrametri. Zato bomo dobljene rezultate dopolnili z raziskavami ostalih fizioloških mehanizmov regulacije odpornosti na vodni oziroma sušni stres. Prihodnje raziskave bodo usmerjene predvsem v ugotavljanje hormonalne regulacije vpliva vodnega stresa pri hmeljnih rastlinah in osmoregulacije pri različnih kutivarjih hmelja. 5 LITERATURA 1. Bates, L.S., Waldren, R.P., Teare, I.D., Rapid determination of free proline for water- stress studies.- Plant and soil (1973)39, p. 205-207. 2. Fitter, A.H., Hay, R.K.M., The Water Relations of Plants and Soils. In: Environmental physiology of plants.-Academic Press, San Diego, (1987), p.124-184. 3. Girousse, C., Bournoville, R., Bonnemain, J.L., Water Deficit-Induced Changes in Concentrations in Proline and Some Other Amino Acids in the Phloem sap of Alfalfa.-PlantPhysiologie(1996)1, p. 109-113. 4. Hacin, J., Vpliv temperature in padavin na pridelek in vsebnost alfa kislin pri hmelju, in : Prispevek k poznavanju vpliva dejavnikov okolja na rast in razvoj ter na pridelek in vsebnost alfa kislin pri hmelju (Humulus lupulus L.).- Biotehniška fakulteta, Ljubljana, (1989), s.70-74. 5. Kralj, D., Žolnir, M., Zupanec, J., Dolinar, M., Oset, F., Značilnosti slovenskih hmeljnih kultivarjev.-Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Žalec, (1994), Žalec. 6. Larcher, W., Plants under stress, in : Physiological Plant Ecology.- Springer, Berlin, (1995), p.322-330. 7. Lawlor, D.W., Uprety, D.C., Effects of Water Stress on Photosynthesis of Crops and the Biochemical Mechanism, in: Abrol Y.P., Mohanty P., Govindjee (Eds.) Photosynthesis: Photoreactionsto Plant Productivity.- Dordrecht, Kluwer Academic Publishers, (1993), p.420-449. 8. Losch, R., Plant Water Relations.- Progress in Botany, Springer, Berlin, (1991), p.35- 54. 9. Miller, R.J., Bell, D.T., Koeppe, D.E., The Effects of Water Stress on Some Membrane Characteristics of Corn Mitochondria.-Plant Physiology (1971)48, p. 229-231. 10. Neve, R.A., Irrigation.-Chapmanand Hall, eds. Hops, (1991), p. 62-65. 11. Peat, W.E., Thomas G.G., The photosynthetic activity of the developing hop cone.- Annals of applied biology(1974)3, p. 319-324. 12. Resulovic, H., Metode istraživanja fizičkih svojstavazemljišta, in: Priručnikza ispitivanje zemljišta.- Jugoslovensko društvo za proučavanje zemljišta, Beograd, (1971), s. 28-30,55-57,92-95. 13. Yancey, P.H., Clark, M.E., Hand, S.C., Bowlus, R.D., Somero, G.N., Living with water stress: Evolution of osmolytesystems.-Science(1982)217, p. 1214-1222. RAZVOJ NOVIH DIAGNOSTIČNIH METOD ZA IDENTIFIKACIJO POVZROČITELJEV HMELJEVE UVELOSTI Sebastjan RADIŠEK1, Jernej JAKŠE2 UDK/UDC 633.791: 632.2 : 632.911 (045) izvirni znanstveni članek/original scientific article prispelo/received: 24. 10. 2005 sprejeto/accepted: 25. 11. 2005 IZVLEČEK Identifikacija povzročiteljev hmeljeve uvelosti je izrednega pomena pri odločanju o načinu izvajanja fitosanitarnih ukrepov in v procesu žlahtnjenja odpornih sort. Klasična diagnostika temelji predvsem na osnovi morfoloških lastnosti, uporabi selektivnih gojišč, patogenih testih in analizah vegetativne kompatibilnosti. Nekatere od teh metod so delovno zahtevne, dolgotrajne in podvržene vplivom okolja, kar otežuje zanesljivost identifikacije. V prispevku je predstavljen razvoj in vpeljava novih diagnostičnih metod z uporabo molekulskih tehnik, katerih vrednost se izraža predvsem v hitrosti, občutljivosti in zanesljivosti analize. Ključne besede: molekularni markerji, Verticilliumalbo-atrum, PCR DEVELOPMENT OF NEW DIAGNOSTICS METHODS FOR IDENTIFICATION OF HOP WILT INDUCERS ABSTRACT Identification of hop wilt inducers is very important for deciding how to carry out phytosanitary measures and for resistance breeding of new hop varieties. Traditional diagnostics is primary based on morphological features, selective media, pathogenicity tests and analysis of vegetative compatibility. Some of these methods are laborious, time consuming and influenced by environmental conditions that could hinder the reliability of identification. The article presents the development and introduction of new diagnostic methods using moleculartechniques, which enable faster, more sensitive and reliable analysis. Keywords: molecular markers, Verticillium albo-atrum, PCR 1 dr. znanosti, Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije, Oddelek za varstvo rastlin, Diagnostični laboratorij, Cesta Žalskega tabora 2,SI-3310Žalec 2doc.dr., Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo, Katedra za genetiko, rastlinsko biotehnologijo in žlahtnjenje, Jamnikarjeva 101, SI-1000 Ljubljana 1 UVOD Hitra in zanesljiva identifikacija povzročiteljev bolezni predstavlja osnovo pri preprečevanju širjenja bolezni, tako v humanem, živalskem kot v rastlinskem svetu. V Sloveniji smo na področju hmeljarstva s pojavom letalne oblike hmeljeve uvelosti v letu 1997 veliko pozornosti namenili identifikaciji izolatovtalnih gliv V. albo-atrum in V. dahliae. Omenjeni traheomikotični glivici spadata med povzročiteljici uvelosti mnogih rastlin, med katerimi v Evropi naredita največ škode na hmelju. Za hmeljevo uvelost sta značilna dva bolezenska sindroma in sicer blaga in letalna oblika, katerih bistvena razlika je vtem, da letalna oblika povzroča odmiranje rastlin, pri blagi pa se rastline opomorejo in naslednje leto normalno odženejo. Gliva V. dahliae je znana kot razmeroma redek povzročitelj blage oblike hmeljeve uvelosti, medtem ko V. albo-atrum povzroča večino okužb na hmelju vobeh bolezenskih oblikah. Razvoj blage ali letalne oblike je odvisen predvsem od virulence povzročitelja, velik vpliv na izražanje bolezni pa imajo tudi ekološki dejavniki in odpornost sort [10], kar otežuje zanesljivo določitev boleznina polju. Identifikacija povzročiteljic hmeljeve uvelosti je izrednega pomena pri odločanju o načinu izvajanja fitosanitarnih ukrepov in v procesu žlahtnjenja odpornih sort. Klasična diagnostika temelji predvsem na osnovi morfoloških lastnosti glivic, uporabi selektivnih gojišč, patogenih testih, analizah vegetativne kompatibilnosti in razlikah v biokemičnih lastnostih. Omenjene metode so večinoma delovno zahtevne, dolgotrajne in podvržene vplivom okolja, kar otežuje zanesljivost identifikacije. Za določitev vrste na osnovi morfoloških lastnosti je pri glivah V. albo-atrum in V. dahliae potrebna vsaj 2 tedenska inkubacija. Pravtako določanje patotipovs patogenimi testi časovno zahteva najmanj 2-3 mesečno analizo. Vpeljava molekulskih tehnik, ki omogočajo hitrejšo in neposredno analizo genoma proučevanega organizma, pomeni pomembno dopolnitev obstoječih analitičnih metod. Tako se pri molekulski identifikaciji posameznih vrst iz rodu Verticillium najpogosteje uporablja PCR tehnika z uporabo specifičnih začetnih oligonukletidov, ki zaznajo razlike v ITS regijah rDNA genov [5,8]. Poleg identifikacije pa imajo te tehnike veliko prednost pri omogočanju določanja prisotnosti omenjenih gliv neposredno v rastlinah, tleh in vodi. V Sloveniji smo pri proučevanju hmeljnih izolatov glive V. albo-atrum s pomočjo patogenih testov in molekulske tehnike AFLP (amplified fragment lenght polymorphism) dokazali prisotnost dveh različno virulentnih skupin izolatov oz. patotipov, od katerih PG1 povzroča blago obliko, PG2 pa letalno obliko hmeljeve uvelosti [6]. Z identifikacijo 17 patotipsko specifičnih fragmentov se je AFLP analiza izkazala kot izredno dobra tehnika za iskanje genetskih razlik med ozko sorodnimi izolati, vendar pa je zaradi delovne zahtevnosti manj primerna za rutinske analize. Iz omenjenega smo raziskavo nadaljevali s pretvorbo patotipsko specifičnih AFLP fragmentov v SCAR diagnostične markerje, ki bi omogočili enostavnejše in hitrejše določanje omenjenih hmeljnih patotipov. 2 MATERIAL IN METODE 2.1 Kulture izolatov V raziskavo smo skupno zajeli 92 izolatov gliv iz rodu Verticillium iz različnih gostiteljskih rastlin in geografskih območij Evrope in Severne Amerike, ter izolate nekaterih pogosteje zastopanih talnih gliv iz rodov Alternaria, Armillaria, Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Monillia, Penicillium in Trichoderma. Največji delež so predstavljali izolati V. albo-atrum iz hmelja od katerih smo jih 34 izolirali na območju Slovenije, medtem ko smo ostale izolate pridobili izAnglije (15), Nemčije (5) in Poljske (1). Od 34 slovenskih izolatov jih je 27 pripadalo letalnemu patotipu PG2, 7 pa blagemu patotipu PG1. Vsi izolati vtej raziskavi predstavljajo del mikološke zbirke Inštituta za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije (IHPS) in se hranijo v duplikatih monospornih kultur na krompirjevem dekstroznemu agarju (PDA-potato dextrose agar; Fluka, Švica) na temperaturi 4°C in v tekočem gojišču »General fungal medium« [13] z 20 % koncentracijo glicerola pri temperaturi -80°C. 2.2 Izolacija DNA Pred izolacijo DNA iz micelijasmo izolate najprej namnožili vže omenjenem tekočem gojišču. Kulture smo 4-5 dni inkubirali v temi pri sobni temperaturi na rotacijskem stresalniku (50 vrt./min). Po inkubaciji smo micelij iz gojišča odstranili z večkratnim centrifugiranjem (5 min pri 2500 x g) in sprotnim spiranjem s sterilno bidestilirano vodo. Sledila je izolacija DNA po vpeljanem SDS protokolu, ki sta ga razvila Lee in Taylor [3], z nekaterimi modifikacijami [7]. Za izolacijo DNA iz prevodnega tkiva rastlin smo uporabili CTAB metodo [2]. 2.3 Izolacija AFLPfragmentov in določanje nukleotidnega zaporedja Patotipsko specifične AFLP fragmente smo pri treh izolatih vsakega PG1 in PG2 patotipa namnožili z ustreznimi AFLP kombinacijami začetnih oligonukleotidov in jih nato ločili z denaturacijsko poliakrilamidno elektroforezo ter detektirali s srebrom. Sledil je takojšnji izrez fragmentov iz gela in ponovno namnoževanje z ustreznimi začetnimi oligonukleotidi. Reamplificirane PCR produkte smo nanesli na 1,2 % agarozni gel, ki je omogočil ločitev želenega fragmenta od nespecifičnih PCR produktov. Nadaljnje čiščenje fragmentov iz agaroznega gela smo izvedli po metodi, ki sta jo razvila Boyle in Lew [1]. Postopek smo nadaljevali s kloniranjem fragmentov v plazmidni vektor pPCR-Script™ Amp SK(+) (Stratagene, La Jolla, USA). Rekombinatne plazmide smo iz bakterijskih kultur izolirali s komercialnim kompletom NucleoSpin® Plasmid (Macherey Nagel) in jim na osnovi dideoksi sekvenčne reakcije (Thermo Sequenase Primer Cycle Sequencing Kit, Amersham Biosciences) ter avtomatske laserske naprave (ALFexpress II DNA Analysis System, Amersham Biosciences) določili nukleotidnozaporedje. 2.4 Izdelava SCAR markerjev in specifičnost PCR namnoževanja Za vsako nukleotidno zaporedje smo z uporabo programa Primer3 [9] izdelali dva para začetnih oligonukleotidov, od katerih je prvi par temeljil na terminalnem delu, drugi pa na notranjem delu sekvence. Pri določanju optimalnih pogojev PCR namnoževanja in v začetnem pregledu specifičnosti začetnih oligonukleotidov smo v analizo vključili genomsko DNA 4 izolatov vsakega od hmeljnih patotipov PG1 in PG2, dve negativni kontroli (voda in genomska DNA hmelja) in pozitivno kontrolo (plazmidna DNA z ustreznim fragmentom). Optimizacija je potekala s spreminjanjem temperature prileganja po 2°C (v območju od 50°C do 65°C) navzgor ali navzdol od teoretične temperature prileganja in v povečevanju ali zmanjševanju števila PCR ciklov (od 30 do 35 ciklov). Reakcijske mešanice (20 |jl) so vsebovale 1x PCR pufer, 0,2 mM vsakega dNTP-ja, 0,5 jM vsakega začetnega oligonukleotida, 1,5 mM MgCl2 in 0,6 enote encima Taq DNApolimeraze in 20 ng genomske DNA izolatov. V primeru kontrolnih reakcij smo namesto DNA izolatov, uporabili 2 jl sterilne vode, 20 ng genomske DNA hmelja in 1 ng plazmidne DNA. Reakcije smo izvajali v PCR napravi MWG Primus 96 po naslednjem temperaturnem profilu: začetna 4 minutna denaturacija pri 94°C, A št. ciklov [94°C (45 s), A temperatura prileganja začetnih oligonukleotidov (30 s) in 72°C (60)]. Vzorce smo ločevali z 1,6 % agarozno gelsko elektroforezo. Po določitvi optimalnih pogojev smo specifičnost SCAR markerjev preizkusili še na ostalih izolatih vključenih v raziskavo. 2.5 Multipleks PCR analiza Multipleks PCR analizo smo izvedli v 20 jl reakcijski mešanici, ki je vsebovala tri različne pare SCAR začetnih oligonukleotidov (Preglednica 1): 0.25 jM (9-2I-For/9-2I-Rev), 0.5 jM (9-1E-Rev/9-1I-For) in 0.5 jM (1I-For/1I-Rev), 1 PCR pufer, 0,2 mM vsakega dNTP-ja, 2,75 mM MgCl2, 0,6 enote encima Taq DNA polimeraze in 20 ng genomske DNA izolatov. Reakcija je potekala po naslednjem temperaturnem profilu: začetna 4-minutna denaturacija pri 94° C, ki ji sledi 30 ciklov pri 94°C (45 s), 60°C (30 s) in namnoževanje pri temperaturi 72°C (70 s). Vzorce smo ločevaliz2% agarozno gelsko elektroforezo. 2.6 Sidrna (nested) PCR analiza Sidrno PCR analizo smo uporabili za neposredno določanje letalnega patotipa PG2 v okuženem tkivu. Prvo PCR reakcijo smo izvedli z začetnimi oligonukleotidi 9-1E-For/9-1E-Rev, ki temeljijo na terminalnem delu fragmenta AFLP 9-1. Po namnoževanju smo PCR vzorce 10 x razredčili s sterilno vodo in 1jl razredčene raztopine preneslivnove mikrocentrifugirke, kjer je sledila druga PCR reakcija z notranjimi začetnimi oligonukleotidi 9-1I-For/9-1I-Rev fragmenta AFLP 9-1. Reakcijski pogoji so bili enaki kot za analizo izolatov (poglavje 2.4) z modifikacijo v zmanjšanju koncentracije začetnih oligonukleotidov na 0,25 jM in številu ciklov na 20 v prvi PCR reakciji. 3 REZULTATI IN DISKUSIJA 3.1 Razvoj SCAR markerjev Pretvorba specifičnih AFLP fragmentov v SCAR diagnostične markerje omogoča razširitev njihove uporabnosti v smeri hitrejše, delovno manjzahtevne in občutljive analize, kije lokusno specifična [14]. Od 17 namnoženih AFLP fragmentov smo uspešno reamplificirali 11 fragmentov, medtem ko smo pri ostalih dobili nespecifične PCR produkte, ki so onemogočali nadaljnje delo. Uspešno reamplificirane fragmente smo klonirali in jim določili nukleotidno zaporedje, pri čemer smo v primeru treh fragmentov dobili različne sekvence, ki so se razlikovale v razmerju velikosti od 0-2 nukleotidov. Vzrok za pojav različnih nukleotidnih zaporedij lahko iščemo v kontaminaciji med izolacijo fragmentov iz poliakrilamidnih gelov o čemer poročajo Xu in sod., [14] in v prisotnosti različnih sekvenc enakih velikosti v posameznem fragmentu na gelu, kar je posledica metodologije AFLP tehnike [12]. Skupno smo tako pri določanju nukleotidnega zaporedja iz 11 AFLP fragmentov dobili 16 različnih sekvenc, pri čemer so vse imele prisotna ustrezna nukleotidna zaporedja AFLP začetnih oligonukleotidov. Z namenom ohranitve specifičnosti smo za vsako izmed 16 nukleotidnih zaporedij izdelali po dva para začetnih oligonukleotidov. Prvi par smo izdelali iz terminalnega dela sekvence, ki je vključeval EcoRI/MspI prepoznavno mesto, selektivne nukleotide in naslednje nukleotide AFLP sekvence do dolžine 23 baznih parov (bp). Drugi par pa smo izdelali iz notranjega dela sekvence. Po začetni optimizaciji PCR namnoževanja z izdelanimi začetnimi oligonukleotidi smo njihovo specifičnost preizkusili na 92 izolatih rodu Verticillium in ostalih izolatih, ki so bili vključeni v raziskavo. Pri tem sta se med PG2 specifičnimi SCAR markerji, S-9-1INT in S-9-1EXT (Preglednica 1), ki izhajata iz fragmenta AFLP-9-1, namnožila samo pri izolatih PG2 patotipa, kar potrjuje predhodne rezultate AFLP analize o specifičnosti tega fragmenta. Visoko specifičnost za patotip PG2 so prav tako ohranili SCAR markerji S-9-2INT, S-11EXT in S-11INT (Preglednica 1). V primeru SCAR markerjev specifičnih za manj virulentni hmeljni patotip PG1 so ti izrazili manjšo stopnjo specifičnosti, saj so se poleg izolatov patotipa PG1 PCR produkti namnožili tudi pri nekaterih izolatih ostalih gostiteljskih rastlin V. albo-atrum in V. dahliae. Preglednica 1: Specifičnost, nukleotidno zaporedje, temperatura prileganja in dolžina produktov visoko specifičnih SCAR markerjev Table 1: Specificity, nucleotide sequences, annealing temperatures, and product length of highly specific SCAR markers Patotip SCAR marker SCAR začetni oligonukleotidi in nukleotidno zaporedje (5-3) Dolžina produkta Ta (°C) S-1EXT 1E-For ATTCGAGGCTCCGAGCATCC 241 bp 59 PG1 1E-Rev GGATAGGCCGCACCTTGAGAA S-1INT 1I-For CGAGCATCCGATGACACAG 175 bp 60 1I-Rev AAGAGATCAATAGTCGTTTGCC S-9-1EXT 9-1E-For GGTAAGACTCCTTACCGATGCTG 248 bp 9 PG2 9-1E-Rev ATTCACACGCTACATATCAAACA S-9-1INT 9-1I-For CGATGCTGGATCTGACCAATTAC 198 bp 65 9-1I-Rev ATAAGGGCAGGCAAGGCAC S-9-2EXT 9-2E-For ATTCACCATCAGCCTGTGC 190 bp 60 PG2 9-2E-Rev GGTAATCCTTGACAACAATATTC S-9-2INT 9-2I-For CAGCGATGCACCTTCAGTG 163 bp 60 9-2I-Rev TGACAACAATATTCTCGAAGCCA S-11EXT 11 E-For ATTCTCGCCGATCGTTACTC 216 bp 63 PG2 S-11INT 11 E-Rev GGTACAGCAGCAGTTCCTG 11 I-For GCCATCGCCAAAGTACCAT 169 bp 63 11I-Rev GCCAGATCATATACCCATTGTC 3.2 Uporaba SCAR markerjevv diagnostiki Z namenom razvitja zanesljivejšega diagnostičnega testa za identifikacijo PG1 in PG2 patotipov glive V. albo-atrum smo uporabili tehniko hkratnega namnoževanja več SCAR markerjev v eni PCR reakciji. Pri tem smo v metodo vključili tri pare SCAR začetnih oligonukleotidov 9-1E-Rev/9-1I-For, 9-2I-For/9-2I-Rev, 1I-For/1I-Rev. Prva dva para sta specifična za patotip PG2, pri čemer smo zaradi doseganja enotne temperature prileganja 60°C v PCR reakciji, sestavili prvi par iz kombinacije začetnih oligonukleotidov SCAR markerjev S-9-1EXE in S-9-1INT, ki namnožuje fragment dolžine 233 bp. V prvih analizah smo opazili slabše namnoževanje enega izmed PG2 specifičnih fragmentov, kar smo rešili z določitvijo razmerja koncentracij med pari začetnih oligonukleotidov in spreminjanjem koncentracije MgCl2. Po optimizaciji reakcijskih pogojev smo multipleks PCR tehniko preizkusili na različnih izolatih, kjer se je pokazala kot zelo učinkovito in zanesljivo orodje določanja obeh omenjenih patotipov. Metodo smo ocenili kot delovno manj zahtevno, primerno za testiranje večjega števila vzorcev in časovno izvedljivo v enem dnevu ob predhodni 3-4 dnevni inkubaciji izolatovvtekočem gojišču. Visoko specifična SCAR markerja S-9-1EXE in S-9-1INTsmo uporabili tudi pri neposrednem določanju patotipa PG2 v rastlinskem tkivu. Metodo smo razvijali na genomski DNA umetno okuženih hmeljnih rastlin z vpeljavo nested PCR tehnike, ki se zaradi visoke občutljivosti detekcije uporablja pri določanju prisotnosti organizmov v različnih medijih kot so tla, voda in rastline [11]. Nested PCR analizo smo vpeljali po postopku, ki so ga opisali Mercado-Blanco in sod., [4] in pri tem v prvi PCR reakciji uporabili začetne oligonukleotide 9-1E-For/9-1E-Rev, ki izhajajo iz terminalnega dela fragmenta AFLP-9-1, druga PCR reakcija pa je vključevala začetne oligonukleotide izdelane iz notranjega dela sekvence omenjenega fragmenta. Analiza je pokazala visok nivo detekcije pri vseh okuženih rastlinah ne glede na različno odporne sorte. Pri tem smo tehniko ocenili kot delovno zahtevno, občutljivo na kontaminacijo s tujo DNA, primerno za testiranje manjšega števila vzorcev in časovno izvedljivo v enem dnevu. 4 ZAKLJUČEK V raziskavi smo uspešno izkoristili predhodno identificirane AFLP fragmente specifične za hmeljna patotipa PG1 in PG2 glive V. albo-atrum in jih pretvorili v SCAR markerje, ki imajo višjo aplikativno vrednost v smislu hitrosti in enostavnosti analize. Izdelane SCAR markerje smo preizkusili na velikem številu izolatov rodu Verticillium in nekaterih pogosteje zastopanih saprofitskih glivah. Pri tem sta markerja S-9-1EXE in S-9-1INT ohranila specifičnost samo za določanje patotipa PG2, medtem ko so bili ostali markerji manj specifični. Visoko specifične markerje smo nadalje uporabili pri razvitju multipleks in nested PCR analize, ki predstavljata pomembno dopolnilo obstoječim diagnostičnim tehnikam. Poleg omenjenega imajo izdelani SCAR markerji potencialno vrednost pri nadalnjih genetskih analizah izolatov iz rodu Verticillum, predvsemvsmislu proučevanja virulence. ZAHVALA Testiranje diagnostičnih markerjev so z darovanimi izolati omogočili dr. Dez. J. Barbara, dr. Richard Cooper, dr. Graeme Down, dr. Jan-Kees Goud, dr. Jane Robb, dr. Elisabeth Seigner in dr. Ewa Solarska, za karse jim avtorja iskreno zahvaljujeva. 5 VIRI 1. Boyle, J.S., Lew, A.M., An inexpensive alternative to glassmilk for DNA purification.- Trends in Genetics, 11(1995)1, s. 8. 2. Kump, B., Javornik, B., Evaluation of genetic variability among common buckwheat (Fagopyrum esculentum) populations by RAPD markers.- Plant Science, 114(1996),s. 149-159. 3. Lee, S.B., Taylor, J.W., Isolation of DNA from fungal mycelia and single spores. V: PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications. Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, D.H., White, J.J., Eds. T.J. (ur).-San Diego, Academic Press, (1990), s. 282-287. 4. Mercado-Blanco, J., Rodriguez-Jurado, D., Peres-Artes, E., Jimenez-Diaz, R.M., Detection of the defoliating pathotype of Verticillium dahliae in infected olive plants by nested PCR.- European Journal of Plant Pathology, 108(2002), s. 1-13. 5. Nazar, R.N., Hu, X., Schmidt, J., Culham, D., Robb, J., Potential use of PCR-amplified detection and differentiation of Verticillium wilt pathogens.- Molecular Plant Pathology, 39(1991), s. 1-11. 6. Radišek, S., Jakše, J., Simončič, A., Javornik, B., Characterization of Verticillium albo- atrum field isolates using pathogenicity data and AFLP analysis.- Plant Disease, 87(2003), s. 633-638. 7. Radišek, S., Jakše, J., Javornik, B., Optimisation of amplified fragment length polymorphism (AFLP) analysis of hop wilt (Verticillium albo-atrum and Verticillium dahliae).-ZbornikBiotehniškefakultete, Kmetijstvo, 77(2001)2, s. 139-146. 8. Robb, J., Moukhamedov, R., Hu, X., Platt, H., Nazar, R.N., Putative subgroups of Verticillium albo-atrum distinguishable by PCR-based assays.- Physiological and Molecular Plant Pathology, 43(1993), s. 423-436. 9. Rozen, S., Skaletsky, H.J., Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. V: Bioinformatics methods and protocols: methods in molecular biology. Krawetz, S., Misener, S. (ur.).-Totowa, Humana Press (2000), s. 365-386 (program dostopen na: http://www-genome.wi.mit.edu/genome software/ other/primer3.html). 10. Talboys, P.W., Resistance to vascular wilt fungi.- Proceedings of the Royal Society (London) 181(1972), s. 319-333. 11. Volossiouk, T., Robb, E.J., Nazar, R.N., Direct DNA extraction for PCR mediated assays of soil organisms.-Applied and Environmental Microbiology, 11(1995), s. 39723976. 12. Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., Lee,T., Hornes, M., Frijters, A., Pot, F., Peleman, J., Kuiper, M., Zabeau, M., AFLP: a new technique for DNA fingerprinting.-Nucleic Acids Research, 21(1995), s. 4407-4414. 13. Weising, K., Nybom, H., Wolff, K., Meyer, K. Fingerprinting in Plants and Fungi.- London, CRCPress, Inc., (1995), s. 322. 14. Xu, M., Huaracha, E. Korban, S.S., Development of sequence-characterized amplified regions (SCARs) from amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers tightly linked to the Vf geneinapple.-Genome, 44(2001), s. 63-70. DEPOZIT BAKROVIH IONOV NA LISTIH VINSKE TRTE IN NJEGOV VPLIV NA BIOLOŠKO UČINKOVITOST UPORABLJENIH FITOFARMACEVTSKIH SREDSTEV ZA ZATIRANJE PERONOSPORE VINSKE TRTE: 1. BIOLOŠKA UČINKOVITOST Simona LUSKAR1, Iztok Jože KOŠIR2, Milica KAČ3 UDK/UDC 633.95 : 632.937 : 634.8 (045) izvirni znanstveni članek/original scientific article prispelo/received: 18. 10. 2005 sprejeto/accepted: 25. 11. 2005 IZVLEČEK Na vinski trti (Vitis vinifera) smo ocenjevali okuženost grozdov in listov s peronosporo vinske trte (Plasmopara viticola (Berk & Curt.) Berl. & de Toni) ter biološko učinkovitost različnih fitofarmacevtskih sredstev, ki se uporabljajo za zatiranje peronospore vinske trte. Peronos-pora vinske trte je glivična bolezen, ki se zagotovo pojavi vsako leto in povzroči škodovvseh razvojnih stadijih vinske trte na vseh zelenih nadzemnih delih vinske trte, vse od sredine maja do pozne jeseni. Ocenjevali smo vpliv obravnavanj na okužbo grozdov in listov vinske trte s peronosporo vinske trte. Med vsemi standardnimi obravnavanji ni bilo statistično značilnih razlik. Ključne besede: vinska trta, peronospora vinske trte, biološka učinkovitost, preventivni fungicidi. DEPOSIT OF COPPER IONS ON VINE LEAVES AND ITS EFFECT ON BIOLOGICAL EFFICACY OF DIFFERENT PLANT PROTECTION PRODUCTS AGAINST DOWNY MILDEW: 1. BIOLOGICAL EFFICACY ABSTRACT The infection of vine grapes and vine leaves with downy mildew (Plasmopara viticola (Berk & Curt.) Berl. & de Toni) and biological efficacy of different plant protection products against downy mildew were assessed. Downy mildew is a fungal disease which appears every year and can damage grapevine at every stage of development, and the fungus is able to attack every green part of the plant from the middle of May to the late autumn. We assessed the effect of treatments against downy mildew infection of vine grapes and vine leaves. There were no statistically significant differences between all standard treatments. Keywords: vine, downymildew, biological efficacy, preventive fungicides. 1 univ.dipl.inž.kmet., Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije, Cesta Žalskega tabora 2, SI-3310 Žalec, simona.luskar@guest.arnes.si 2 dr., Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije, Cesta Žalskega tabora 2, SI-3310 Žalec, iztok-joze.kosir @guest.arnes.si 3 doc. dr., Oddelekzaživilstvo, Biotehniška fakulteta, Jamnikarjeva 101, SI-1000 Ljubljana, milica.kac@bf.uni-lj.si 1 UVOD Peronospora vinske trte (Plasmopara viticola (Berk & Curt.) Berl. & de Toni) je ena izmed najpomembnejših glivičnih bolezni vinske trte, ki lahko v ugodnih vremenskih razmerah povzroči popolno uničenje grozdja in zelenih delov trte [4, 7]. Najbolj je nevarna okužba v začetku cvetenja, sicer pa lahko gliva okuži vinsko trto v kateri koli razvojni fazi. Največ okužb nastane v letih, ko je dovolj zaporednih padavin in ko so temperature ugodne za razvoj bolezni. Osnovna strategija zmanjšanja infekcijskega pritiska peronospore vinske trte je preventivna zaščita rastlin, torej ustrezna izbira sorte, pravilna izbira rastišča, orientacija vrst, vzgojna oblika, sanitarni ukrepi (odstranjevanje propadlih listov in grozdov), obdelava tal in zatiranje plevelov [4]. Ko ti ukrepi niso več dovolj učinkoviti, uporabimo za zatiranje peronospore vinske trte fungicide: kontaktne, lokalno-sistemičnealisistemične. 2 MATERIAL IN METODE V poskusu v vinogradu smo ugotavljali učinkovitost uporabljenih fitofarmacevtskih sredstev. Med njimi so bili štirje različni kontaktni fungicidi na osnovi bakrovega hidroksida. Opravljena so bila štiri zaporedna tretiranja v desetdnevnih razmakih, v času od 20. julija do 19. avgusta 2002. Obravnavanja, uporabljeni fungicidi, odmerki fungicidov in odmerki bakrovih ionov na površino ter poraba vode in koncentracija fungicidov uporabljenih v poskusu so navedeni v tabeli 1. Vinska trta je bila pri prvem tretiranju v razvojni fazi, ko so bile jagode velikosti graha (20. julija) pri zadnjem tretiranjuvzačetku barvanja jagod (19. avgusta). Poskus je bil opravljen v Slovenskih Konjicah, v 18 let starem vinogradu v gojitveni obliki dvokrakega guyota, na sorti Renski Rizling, ki velja za eno občutljivejših sort na peronosporo vinske trte (Plasmopara viticola (Berk&Curt.) Berl. &deToni). Izmed 80 ha razpoložljivih površin vinograda smo izbrali 3,5 ha veliko parcelo, na kateri smo imeli sedem obravnavanj v štirih ponovitvah. Izbrana parcela za poskus je bila izenačena po številu rastlin in strukturi vinske trte, kolikor je bilo mogoče. Sadilna razdalja med vrstami je bila 2,8 m in 1,0 m v vrsti, skupno 3571 trt na hektar. Dolžina vrst je bila 90 m. Eno obravnavanje je vključevalo 5 vrst, od katerih smo vzorčili le srednjo vrsto, ostale vrste pa so služile kotvarovalnipas[2]. Tabela 1: Obravnavanja, uporabljeni fungicidi, odmerki fungicidov na ha in odmerki bakrovih ionov na ha, poraba vode na ha in koncentracija fungicidov uporabljenih v poskusu Table 1: Treatment code, fungicides tested in the study, application rate of fungicides per ha, application rate of copper ions per ha, application rate of water per ha and concentration of fungicides used in field trial Odmerki Odmerki Poraba Koncentracije Obravnavanj Fungicidi fungicidov bakrovih ionov vode fungicidov (kg ha-1) (kg ha-1) (L ha-1) (%) CuZ Cuprablau Z 3,0 1,05 400 0,75 CuZU-1 Cuprablau Z Ultra 2,5 0,875 400 0,63 CuZU-2 Cuprablau Z Ultra 2,5 0,875 1000 0,25 RefS1 Referenčno sredstvo 1 2,5 1,25 400 0,63 RefS2 Referenčno sredstvo 2 2,0 0,8 400 0,50 RefS3 Referenčno sredstvo 3 2,0 1,0 400 0,50 RefS4 Referenčno sredstvo 4 2,5 1,0 400 0,63 Pred pričetkom tretiranj smo testirali vlečeni vinogradniški pršilnik tip Zupan ZM 600 E. Podatki o vrsti in številu šob, pritisku, vozni hitrosti in količini porabljene vode so navedeni v tabeli 2. Tabela 2: Vrsta, število šob in pritisk pršilnika ter vozna hitrost za različno porabo vode Table 2: Type, number of nozzles, pressure of sprayer, speed of sprayerfor different application rates of water Zupan ZM 600 E Volumen vode 400 L ha-1 1000 L ha-1 Vrsta šobe Albuz ATR rumena Albuz ATR rdeča Število šob 6+6 6+6 Pritisk (bar) 7 13 Vozna hitrost (km h-1) 5,4 5,4 Biološko oceno okuženosti listov in grozdov vinske trte [3] smo opravili prvič pred izvajanjem poskusa, 15. julija 2002. Drugič smo opravili biološko oceno okuženosti grozdov 8. avgusta 2002. Za eno obravnavanje v posamezni ponovitvi smo pregledali 150 grozdov. Da smo dobili odstotek okuženih grozdov, smo uporabili Townsend-Heubergerjevo enačbo, za oceno učinkovitosti pa enačbo po Abbottu [1]. Tretjo oceno biološke učinkovitosti smo opravili v začetku septembra (4. do 6. september 2002), ko so se na listih sekundarnih poganjkov pojavili znaki peronospore vinske trte. Za eno obravnavanje in eno ponovitev smo pogledali 1500 listov. Odstotek okuženosti listov in učinkovitost sredstev sta bila izračunana na isti način kot pri grozdih. Pred tretiranji s fitofarmacevtskimi sredstvi na osnovi bakrovih ionov, je bila vinska trta ustrezno zaščitena pred boleznimi, in sicer petkrat v 10 do 13-dnevnih razmakih, po škropilnem programu, kot so ga za to leto sestavili na Zlatem Griču. Po štirih tretiranjih s fitofarmacevtskimi sredstvi na osnovi bakrovih ionov, je bilo konec avgusta opravljeno še zadnje tretiranje po škropilnem programu. Skupaj je bilo v tej rastni sezoni opravljenih deset tretiranj. Vremenski podatki v času poskusa so bili zabeleženi v neposredni bližini poskusa in so podani v tabeli 3. Tabela 3: Meteorološki podatki v času poskusa Table 3: Meteorological conditions at the time of spraying Datum tretiranja 1 (20. julij) 2 (30. julij) 3 (9. avgust) 4 (19. avgust) Hitrost vetra (m s-1) 1,5 1 1,3 2,5 Relativna zračna vlaga (%) 72 71 81 73 Povprečna temperatura (°C) 20,5 22,5 18,8 22,1 Količina padavin do naslednjega tretiranja (mm) - 23,8 88,1 96,2 Prve padavine (mm) 9 38 14 0,6 Prve padavine (dnevi) 2 2 2 3 * prve padavine dve uri po tretiranju do naslednjega dne do 7 h zjutraj ** prve padavine dve uri po tretiranju V poskusu zbrane podatke smo uredili v programu Microsoft Excel XP. Tako urejene podatke smo statistično obdelali z računalniškim programom SAS [6] s proceduro GLM (General Linear Models). 3 REZULTATIZDISKUSIJO 3.1 Okuženosti grozdov vinske trte Okuženost grozdovvinske trte s peronosporo vinske trte in statistična obdelava podatkov so prikazani v tabelah 4 in 5 ter na sliki 1. Navedeni so osnovni statistični parametri, viri variabilnosti s statističnimi značilnostmi njihovega vpliva na parametre in vpliv obravnavanja na okuženost grozdovvinske trte. V tabeli 4 je prikazana okuženost grozdovvinske trte z izračunanimi osnovnimi statističnimi parametri. Podana je povprečna vrednost štirih ponovitev in sedmih obravnavanj, intervali oziroma najmanjša in največja vrednost, standardna deviacija in koeficienti variabilnosti. Tabela 4: Okuženost grozdovvinske trte z izračunanimi osnovnimi statističnimi parametri Table 4: Infection of vine grapes with calculated basic statistical parameters Parametri n x min max sd KV(%) Okuženost grozdov vinske trte (%) 28 1.4 0.5 2.1 0.5 33.4 n - število meritev; x - povprečna vrednost; min - minimalna vrednost; max - maksimalna vrednost; sd - standardna deviacija; KV (%) - koeficient variabilnosti Vtabeli 5 sta prikazana vira variabilnosti (obravnavanje in ponovitev), odgovorna za vrednost parametra. Izračunana P vrednost kaže, kako vpliven je posamezen vir variabilnosti oz. vpliv na okuženost grozdov. Statistična analiza podatkov je pokazala, da ni bilo statistično značilnih razlikv okuženosti grozdovvinske trte med posameznimi obravnavanji (P = 0,0790). Tabela 5: Viri variabilnosti in statistične značilnosti njihovega vpliva na okuženost grozdov vinske trte Table 5: Variability and significance of individual effects on the infection of vine grapes Viri variabilnosti (P vrednost) O PO Meritev (DF = 6) (DF = 3) Okuženost grozdov vinske trte 0.0790 0.0071 O-obravnavanja, PO-ponovitve; P<0,001 statistično zelo visoko značilna razlika; P<0,01 statistično visoko značilna razlika; P<0,05 statistično značilna razlika; P>0,05 statistično neznačilna razlika; DF - prostostne stopnje. Statistično značilne P vrednosti so označene z debelim tiskom. Slika 1 ponazarja odstotek okuženost grozdov vinske trte s peronosporo vinske trte in standardno deviacijo ločeno po posameznih obravnavanjih. Razlike v povprečni vrednosti okuženosti grozdov vinske trte s peronosporo vinske trte niso drastično odstopale med posameznimi obravnavanji (vrednosti se gibljejo od 1,1 do 1,8 odstotka). 2,5-i 2,0- 0,5 0,0 CuZ CuZU-1 CuZU-2 RefSI RefS2 RefS3 RefS4 Obravnavanje Slika 1: Okuženosti grozdov vinske trte s peronosporo vinske trte in standardna deviacija Figure 1: Infection of vine grapes with downy mildew with standard deviation Na podlagi dobljenih vrednosti v tabelah 4 in 5 ter s slike 1 lahko zaključimo, da smo imeli v tem vinogradu (8. avgust) opravka z 'zdravimi grozdi', če vzamemo za primerjavo podatke primerljive neškropljene parcele v isti rastni dobi, v podobnih klimatskih in rastnih pogojih v okolici Maribora, je bila okuženost grozdov vinske trte 13. avgusta 74,6 % [5]. Z upoštevanjem tega primerljivega podatka s stopnjo okužbe v našem poskusu, lahko zaključimo, daje bila učinkovitost uporabljenih fitofarmacevtskih sredstev približno 98 %. 3.2 Okuženost listov vinske trte Okuženost listov vinske trte s peronosporo vinske trte in statistična obdelava podatkov so prikazani v tabelah 6 in 7 ter na sliki 2. Navedeni so osnovni statistični parametri, viri variabilnosti s statističnimi značilnostmi njihovega vpliva na parametre in vpliv obravnavanja na okuženost listovvinsketrte. V tabeli 6 je prikazana okuženost listov vinske trte z izračunanimi osnovnimi statističnimi parametri. Podana je povprečna vrednost štirih ponovitev in sedmih obravnavanj, intervali oziroma najmanjša in največja vrednost, standardna deviacija in koeficienti variabilnosti. Tabela 6: Okuženost listovvinsketrte z izračunanimi osnovnimi statističnimi parametri Table 6: Infection of vine leaves with calculated basic statistical parameters Parametri n x min max sd KV(%) Okuženost grozdov vinske trte (%) 28 2.8 1.1 5.2 1.2 43.0 n - število meritev; x - povprečna vrednost; min - minimalna vrednost; max - maksimalna vrednost; sd - standardna deviacija; KV (%) - koeficient variabilnosti Vtabeli 7 sta prikazana vira variabilnosti (obravnavanje in ponovitev), odgovorna za vrednost parametra. Izračunana P vrednost kaže, kako vpliven je posamezen vir variabilnosti oz. vpliv na okuženost grozdov. Iz tabele 7 je jasno razvidno, da ni bilo statistično značilnih razlik v okuženosti listov vinske trte na sekundarnih poganjkih med posameznimi obravnavanji (P = 0,5360). Tabela 7: Viri variabilnosti in statistične značilnosti njihovega vpliva na okuženost listov vinske trte Table 7: Variability and significance of individual effects on the infection of vine leaves Viri variabilnosti (P vrednost) O PO Meritev (DF = 6) (DF = 3) Okuženost listov vinske trte 0.5360 <0.0001 O-obravnavanja, PO-ponovitve; P<0,001 statistično zelo visoko značilna razlika; P<0,01 statistično visoko značilna razlika; P<0,05 statistično značilna razlika; P>0,05 statistično neznačilna razlika; DF - prostostne stopnje. Statistično značilne P vrednosti so označene z debelim tiskom. Slika 2 prikazuje odstotek okuženost listov vinske trte s peronosporo vinske trte in standardno deviacijo ločeno po posameznih obravnavanjih. Okuženi so bili le listi vinske trte na sekundarnih poganjkih, medtem ko listi na primarnih poganjkih niso bili okuženi s peronosporo vinske trte. 6n 1 - CuZ CuZU-1 CuZU-2 RefSI RefS2 RefS3 RefS4 Obravnavanje Slika 2: Okuženosti listov vinske trte s peronosporo vinske trte na sekundarnih poganjkih in standardna deviacija. Figure 2: Infection of vine leaves with downy mildew on secondary shoots with standard deviation Na datum ocenjevanja (4. do 6. september) so bili znaki peronospore vinske trte ti. 'pozne peronospore' le na listih sekundarnih poganjkih vinske trte, ki so rasli visoko nad zadnjo žico nosilne armature, za katere ni tako pomembna izguba listov kot dejstvo, da iz njih izprane zoospore lahko okužijo pecljevino nižje ležečih grozdov [7]. Okuženost listov vinske trte je nihala od 2,2 do 3,3 %za različna obravnavanja, med njimi ni bilo statistično značilnih razlik. Če tudi v tem primeru vzamemo za primerjavo primerljivo neškropljeno parcelo v okolici Maribora, kjer so 13. avgusta ocenili 87,7 % okuženost listov vinske trte s peronosporo vinske trte [5] na primarnih poganjkih, lahko zaključimo, daje bila učinkovitost uporabljenih fitofarmacevtskih sredstev za zatiranje peronospore vinske trte v našem poskusu približno 97 %. 4 ZAKLJUČKA 1. Statistična analiza podatkov okuženosti grozdov in listov vinske trte s peronosporo vinske trte ni pokazala statistično značilnih razlik med posameznimi obravnavanji, P = 0,0790 za okuženost grozdja in P = 0,5360 za okuženost listja vinske trte. 2. Na podlagi odstotka okuženosti grozdov in listja vinske trte s peronosporo vinske trte lahko zaključimo, da je bilo varstvo vinske trte proti tej bolezni skozi celo rastno dobo ustrezno, kar kaže na zelo veliko učinkovitost uporabljenih sredstev. Z obravnavanimi fitofarmacevtskimi sredstvi smo pri grozdju dosegli 98 % učinkovitost, pri listju vinske trte pa 97% učinkovitost. ZAHVALA Zahvaljujemo se vsem sodelavcem iz Inštituta za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije, ki ste pri poskusu sodelovali, Zlatemu Griču iz Slovenskih Konjic, ki nam je omogočil izvedbo poskusa na terenu in Javni agenciji za raziskovalno dejavnost za sofinanciranje. 5 LITERATURA 1. Ciba-Geigy Documenta. Manual for Field Trials in Plant Protection. Second Edition, Revised and Enlarged, 1981, p. 33-34and p. 161-163. 2. European and Mediterranean Plant Protection Organization. Guideline for the efficacy evaluation of plant protection products. Design and analysis of efficacy evaluation trials. PP 1/152(2). Bulletin OEPP/EPPO 29(1999), p. 297-317. 3. European and Mediterranean Plant Protection Organization. Guideline for the efficacy evaluation of plant protection products. Plasmopara viticola. PP 1/31(3). Bulletin OEPP/EPPO31(2001), p. 313-317. 4. European and Mediterranean Plant Protection Organization. Good plant protection practice. Grapevine. PP 2/23(1). Bulletin OEPP/EPPO 32(2002), p. 371-392. 5. Matis, G. Poročilo o preizkušanju fungicidov proti peronospori vinske trte (Plasmopara viticola) v letu 2002.- Kmetijsko gozdarska zbornica Slovenije, Kmetijsko gozdarski zavod Maribor, Svetovalna služba za varstvo rastlin, 2002. 6. SAS/STATSoftware. Version8.01. Cary, SAS Institute Inc:software. 1999. 7. Vršič, S., Lešnik, M., Vinogradništvo.-ZaložbaKmečki glas, Ljubljana, 2001. DEPOZIT BAKROVIH IONOV NA LISTIH VINSKE TRTE IN NJEGOV VPLIV NA BIOLOŠKO UČINKOVITOST UPORABLJENIH FITOFARMACEVTSKIH SREDSTEV ZA ZATIRANJE PERONOSPORE VINSKE TRTE: 2. DEPOZIT BAKROVIH IONOV NA LISTIH VINSKE TRTE Simona LUSKAR1, Iztok Jože KOŠIR2, Milica KAČ3 UDK/UDC 633.95 : 632.937 : 634.8 (045) izvirni znanstveni članek/original scientific article prispelo/received: 18. 10. 2005 sprejeto/accepted: 25. 11. 2005 IZVLEČEK V poljskem poskusu v vinogradu smo testirali štiri bakrove fugicide, ki se uporabljajo za preventivna škropljenja proti peronospori vinske trte (Plasmopara viticola (Berk &Curt.) Berl. & de Toni). Vsi fungicidi so vsebovali aktivno snov bakrov hidroksid. Poskus je zajemal sedem različnih obravnavanj, pri katerih smo spreminjali odmerek fitofarmacevtskega sredstva in količino vode na hektar. Pršenje vinske trte smo izvedli štirikrat v desetdnevnih razmakih, s standardnim aksialnim vinogradniškim pršilnikom. Ocenjevali smo vpliv obravnavanj na depozit fitofarmacevtskih sredstev, ki smo ga določali kot depozit bakrovih ionov na naravnih kolektorjih. Določanje depozita so izvajali v Cinkarni Celje z uveljavljeno analizno metodo, z atomsko absorpcijsko spektroskopijo (AAS). Vsa tretiranja so bila ustrezna, ponekod smo opazili tudi statistično značilne razlike. Ključne besede: depozit, naravni kolektorji, fungicidi, bakrovhidroksid. DEPOSIT OF COPPER IONS ON VINE LEAVES AND ITS EFFECT ON BIOLOGICAL EFFICACY OF DIFFERENT PLANT PROTECTION PRODUCTS AGAINST DOWNY MILDEW: 2. DEPOSIT OF COPPER IONS ON VINE LEAVES ABSTRACT Four preventive fungicides against downy mildew (Plasmopara viticola (Berk & Curt.) Berl. & de Toni) were tested in field trial in a vineyard. All fungicides contained copper in the form of copper hydroxide as active ingredient, and they were used in seven treatments of vineyard at different application rates of plant protection products and different water volumes per hectare. The test was performed four times in 10-day intervals using a standard axial vineyard sprayer. We assessed the effect of treatments on the downy mildew infection of vine grapes and vine leaves, as well as the effect of treatments on the deposit of the active substance (determined as copper ion deposit) on natural collectors. Copper ion deposit was determined in Cinkarna Celje using a standard analytical procedure - atomic absorption spectroscopy (AAS). All treatments were completely satisfactory, some statistically significant differencesare reported. Keywords: spraydeposit, natural collectors, fungicides, copper hydroxide. 1 univ.dipl.inž.kmet., Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije, Cesta Žalskega tabora 2, SI-3310 Žalec, simona.luskar@guest.arnes.si 2 dr., Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije, Cesta Žalskega tabora 2, SI-3310 Žalec, iztok-joze.kosir @guest.arnes.si 3 doc. dr., Oddelekzaživilstvo, Biotehniška fakulteta, Jamnikarjeva 101, SI-1000 Ljubljana, milica.kac@bf.uni-lj.si 1 UVOD Depozit fitofarmacevtskih sredstev na rastlinah je odvisen od mnogih faktorjev kot so osnovne nastavitve pršilnika, vrste in število šob, klimatski pogoji (relativna zračna vlaga, temperatura, hitrost in smervetra, količine prvih padavin), geometrija in gostota krošnje, velikost kapljic in vozna hitrost [1, 2, 10]. Pravilna nastavitev pršilnika izboljša njegovo natančnost in učinkovitost terzagotavlja enakomeren nanos sredstva na rastline, ki omogoča zaščito rastlin pred boleznimi in škodljivci, zmanjša pojav odpornosti in izgube sredstva, časa in dela ter onesnaževanja okolja [4,8]. Za napoved biološke učinkovitosti je odločilna določitev razporeditve pršilne brozge znotraj krošnje [2]. Vta namen se uporabljajo standardne analitične metode, s katerimi kvantitativno določimo količino pršilne brozge oziromasledilca na ciljnih kolektorjih [5,6]. Kolektorji, ki jih uporabljamo v ta namen, so lahko naravnega izvora, torej listi rastline, poganjki oziroma veje ali plodovi rastlin, ali pa so umetni, kot so lahko filtrirni papir, bombažni trakovi, indikatorski lističi, ki so občutljivi na vodo ali olje, in drugi [3, 9, 12]. Vtem prispevku obravnavamo le naravne kolektorje, tj. liste vinske trte. 2 MATERIAL IN METODE V poskusu, ki je bil opravljen v vinogradu, smo ugotavljali nanos štirih različnih kontaktnih fungicidov: dveh različnih formulacij na osnovi bakrovega hidroksida na liste vinske trte. Ostali podatki o opravljenem poskusu so navedeni v Materialu in metodah v predhodnem članku iz te serije (1. del) [7], zato na tem mestu niso posebej navedeni. Tabela 1 se zaradi preglednosti obravnavanj pojavlja takov 1. delu kotvtemdelu, kjerso navedena obravnavanja, uporabljeni fungicidi, odmerki fungicidov in odmerki bakrovih ionov na površino ter poraba vode in koncentracija fungicidov uporabljenih v poskusu. Tabela 1: Obravnavanja, uporabljeni fungicidi, odmerki fungicidov na ha in odmerki bakrovih ionov na ha, poraba vode na ha in koncentracijafungicidov, uporabljenih v poskusu Table 1: Treatment code, fungicides tested in the study, application rate of fungicides per ha, application rate of copper ions per ha, application rate of water per ha and concentration of fungicides used in field trial Obravnavanja Fungicidi Odmerki fungicidov (kg ha-1) Odmerki bakrovih ionov (kg ha-1) Poraba vode (L ha-1) Koncentracije fungicidov (%) CuZ Cuprablau Z 3,0 1,05 400 0,75 CuZU-1 Cuprablau Z Ultra 2,5 0,875 400 0,63 CuZU-2 Cuprablau Z Ultra 2,5 0,875 1000 0,25 RefS1 Referenčno sredstvo 1 2,5 1,25 400 0,63 RefS2 Referenčno sredstvo 2 2,0 0,8 400 0,50 RefS3 Referenčno sredstvo 3 2,0 1,0 400 0,50 RefS4 Referenčno sredstvo 4 2,5 1,0 400 0,63 Kot sledilec smo uporabili bakrove ione fitofarmacevtskih sredstev (fungicidov na osnovi bakrovega hidroksida). Nekatera trgovska imena so navedena v tabeli 1. Uporabili smo več vrst kolektorjev (listi vinske trte, grozdi vinske trte, filtrirni papir in indikatorske lističe, občutljive na vodo). V nadaljevanju članka so prikazani le rezultati depozita bakrovih ionov na listih vinske trte. Liste vinske trte (po 60 listov) smo pobrali pred vsakim tretiranjem in takoj po njem. Nabrali smo jih naključno v srednji vzorčni vrsti, na obeh straneh vrste, na višini od 1,0 do 1,6 m ter jim določili listno maso in površino. Analizirali so jih v laboratoriju Cinkarne Celje, kjer so določili depozit bakrovih ionov po standardni metodi z atomsko absorpcijsko spektroskopijo. Dobljeni rezultati so bili podani v mg L-1 vzorca, in nato preračunani na kvadratni centimeter površine kolektorja (pg cm-2). Dobljene vrednosti smo nadalje preračunali na enoten odmerek bakrovih ionov, in sicer 1 kg ha-1. V poskusu zbrane podatke smo uredili v programu Microsoft Excel XP in tako urejene podatke statistično obdelali z računalniškim programom SAS [11] s proceduro GLM (General Linear Models). 3 REZULTATI Z DISKUSIJO Analiza bakrovih ionov na listih vinske trte in statistična obdelava podatkov so prikazani v tabelah 2 do 7, kjer so navedeni osnovni statistični parametri, viri variabilnosti s statističnimi značilnostmi njihovega vpliva na parametre; vpliv obravnavanja, vpliv datuma tretiranja, vpliv časa pobiranja na depozit bakrovih ionov na listih vinske trte ter na spiranje bakrovih ionov. V tabeli 2 je prikazan depozit bakrovih ionov na listih vinske trte. Podane so povprečne vrednosti štirih ponovitev in sedmih obravnavanj, intervali oziroma najmanjša in največja vrednost, standardna deviacija in koeficienti variabilnosti. Tabela 2: Depozit bakrovih ionov na listih vinske trte z izračunanimi osnovnimi statističnimi parametri Table 2: Deposit of copper ions on samples of vine leaves with calculated basic statistical parameters Parametri n x min max sd KV(%) Depozit bakrovih ionov (^g cm-2) 224 5,8 1,6 15,1 2,8 48,7 Depozit bakrovih ionov (^g cm-2) pred tretiranjem 112 3,7 1,6 11,5 1,4 39,6 Depozit bakrovih ionov (^g cm-2) po tretiranju 112 8,0 4,0 15,1 2,1 26,5 n - število meritev; x - povprečna vrednost; min - minimalna vrednost; max - maksimalna vrednost; sd - standardna deviacija; KV (%) - koeficient variabilnosti V nadaljevanju je v tabeli 3 prikazanih vseh pet virov variabilnosti (obravnavanje, ponovitev, datum tretiranja, čas pobiranja in interakcija obravnavanja, datuma tretiranja in časa pobiranja), ki vplivajo na vrednost parametrov. Izračunana P vrednost kaže, kako vpliven je posamezen vir variabilnosti oz. vpliv na depozit bakrovih ionov na listih vinske trte. Ker je vpliv interakcije med obravnavanjem, datumom tretiranja in časom pobiranja na depozit bakrovih ionov na listih vinske trte statistično značilen (P<0,001), je potrebno interpretirati vplive ločeno po obravnavanjih, po datumu tretiranja in po času pobiranja. Tabela 3: Viri variabilnosti in statistične značilnosti njihovega vpliva na depozit bakrovih ionov na listih vinske trte Table 3: Variability and significance of individual effects on the deposit of copper ions on vine leaves Viri variabilnosti (P vrednost) Parametri O PO DT ČP OxDTxČP Meritev (DF = 6) (DF = 3) (DF = 3) (DF=1) (DF = 45) Depozit Cu2+ (Mg cm-2) <0.0001 <0.0002 <0.0001 <0.0001 <0.0001 O-obravnavanja, PO-ponovitve, DT-datuma tretiranja, ČP - časa pobiranja, OxDTxČP-interakcija obravnavanja, datuma tretiranja in časa pobiranja, P<0,001 statistično zelo visoko značilna razlika; P<0,01 statistično visoko značilna razlika; P<0,05 statistično značilna razlika; P>0,05 statistično neznačilna razlika; DF - prostostne stopnje. Statistično značilne P vrednosti so označene z debelim tiskom. 3.1 Vpliv obravnavanja na depozit bakrovih ionov na listih vinske trte V tabeli 4 je podrobneje razčlenjen vpliv obravnavanja na depozit bakrovih ionov na listih vinske trte, posebej glede na datum tretiranja in čas pobiranja. Za vsa obravnavanja so podane povprečne vrednosti štirih ponovitev. Iz tabele 4 je razvidno, da so bile razlike v depozitu bakrovih ionov na listih vinske trte med posameznimi obravnavanji statistično značilne, razen pred prvim tretiranjem z bakrovimi ioni (20. julija). Med obravnavanji ni bilo statistično značilnih razlik(P = 0,0554), karje posledica uniformnostivzorčevanih listov. Tabela 4: Vpliv obravnavanja na depozit bakrovih ionov na listih vinske trte, srednje vrednosti s standardnim odklonom, (Duncanovtest, a=0,05) Table 4: Effect of treatment on the deposit of copper ions on samples of vine leaves, mean values with standard deviation, (Duncan'stest, a=0.05) _Depozit bakrovih ionov (Mgcm2)_ DT_1 (20. julij)_2 (30. julij)_ P pred po pred po O_ CuZ 2,941,1a 10,2±0,9a 4,6* 1,3a 9,1±0,7ab CuZU-1 2,4* 0,5ab 9,1* 1,5a 4,4* 1,0a 8,7* 1,8abc CuZU-2 2,2* 0,5ab 6,6* 0,5b 2,9*0,6bc 4,6*0,6e RefS1 2,5* 0,4a 10,3±1,4a 3,5* 0,7ab 7,5* 0,8cd RefS2 2,3* 0,4ab 4,6*0,2c 2,2*0,2c 6,2*0,7d RefS3 2,3* 0,3ab 6,2* 0,6b 2,4* 0,2bc 7,9* 1,0bc RefS4 1,8*0,1 b 6,3* 1,6b 3,3*0,6abc 9,9* 1,3a z. 0,0554 <0,0001 0,0027_<0,0001 DT_3 (9. avgust)_4 (19. avgust) ČP pred po pred po O_ CuZ 4,8* 0,8a 9,7* 2,4a 7,1*2,9a 12,0*2,5a CuZU-1 4,5* 0,6a 7,7* 1,5bcd 5,3* 0,7ab 9,0* 1,3b CuZU-2 3,8* 0,3abc 7,7* 1,5bcd 4,6* 0,7b 8,6* 1,0b RefS1 4,9* 1,3a 9,1* 2,2ab 4,8* 0,2b 9,1* 1,5b RefS2 3,2* 0,4bc 6,4*0,8d 4,0*0,6b 6,2*0,7c RefS3 2,9* 0,6c 7,2* 1,7cd 3,9* 0,6b 7,3* 1,5bc RefS4 4,1* 0,9ab 8,7* 2,9abc 5,0* 1,0b 8,7* 1,0b z. 0,0049 0,0019 0,0315_0,0004 DT- datum tretiranja (1 do 4); ČP - čas pobiranja (pred tretiranjem, po tretiranju); O - obravnavanje (1 do 7); z. značilnost vpliva (P vrednost); P0,001 statistično zelo visoko značilna razlika; P0,01 statistično visoko značilna razlika; P0,05 statistično značilna razlika; P>0,05 statistično neznačilna razlika; skupine vstolpcu z enako črko v eksponentu se med seboj statističnoznačilno ne razlikujejo. Statističnoznačilnerazlike so označene z debelim tiskom. DEPOZIT BAKROVIH IONOV NA LISTIH VINSKE TRTE IN NJEGOV VPLIV NA BIOLOŠKO UČINKOVITOST - 2. DEPOZIT BAKROVIH IONOV 35 V večini primerov je bil dosežen največji depozit bakrovih ionov za obravnavanje CuZ (4,9 |jg cm-2 za tretje in četrto tretiranje), kjer je bil uporabljen odmerek bakrovih ionov 1050 g na ha (glej tabelo 1). Pri obravnavanju z referenčnim sredstvom 1 (RefS1) je bil uporabljen za 19 % večji odmerek bakrovih ionov(1250 g na ha, glej tabelo 1), kot pri obravnavanju CuZ, vendar kljub večjemu odmerku bakrovih ionov ni bil dosežen večji depozit bakrovih ionov, razen pri prvem tretiranju (20. julija), kjer je bil dosežen depozit 7,8 jg cm-2. Pri drugem tretiranju je bil dosežen največji depozit pri obravnavanju z referenčnim sredstvom RefS4, in sicer 6,6 jg cm-2. Na sliki 1 je podan grafični prikaz depozita bakrovih ionov na listih vinske trte po posameznih obravnavanjih. 14i 12-CT 10! 1 6 5 4 I £ 2 0 14 1E 12 10 s 8 l 6 4 1 & o 2 14- <0 12-E CT 10- 1 8- l 6; £ 4- 'S S 2 0 14 .O 12 >- 10 Š 8 o t 4 2 L] 30. julij 9. avgust 19. avgust CuZ 30. julij 9. avgust 19. avgust CuZU-2 30. julij 9. avgust 19. avgust RefS2 n 30. julij 9. avgust 19. avgust CuZU-1 30. julij 9. avgust RefS1 30. julij 9. avgust RefS3 i/z/j pred tretiranjem ......po tretiranju Slika 1: Depozit bakrovih ionov na listih vinske trte ločeno po obravnavanjih Figure 1: Deposit of copper ions on vine leaves for different treatments 14- 20. julij 20. julij 20. julij 20. julij 19. avgust 20. julij 20. julij 19. avgust 20. julij 30. julij 19. avgust RefS4 36 Simona LUSKAR, Iztok Jože KOiIR, Milica KAČ Pri preračunanih vrednostih bakrovih ionov na enoten odmerek (slika 2) so bile dosežene največje vrednosti za obravnavanji CuZ (9,3 pg cm-2 po tretjem tretiranju, 6,8 pg cm-2 pred in 11,4 po četrtem tretiranju) in za CuZU-1 (10,4 pg cm-2 po prvem tretiranju, 5,0 pg cm-2 pred in 10,0 pg cm-2 po drugem tretiranju ter 5,1 pg cm-2 pred tretjem tretiranjem). Kljub temu, daje bil pri obravnavanju CuZU-1 uporabljen za 17 % nižji odmerek bakrovih ionov (875 g ha-1, glej tabelo 1) kot pri obravnavanju CuZ (1050 g ha-1, glej tabelo 1), je bil pri obravnavanju CuZU-1 dosežen večji depozit bakrovih ionov preračunano na enoten odmerek. 30. julij 9. avgust CuZ 30.julij 9. avgust CuZU-1 30. julij 9. avgust CuZU-2 30. julij 9. avgust RefSI 30. julij 9. avgust RefS2 30. julij 9. avgust RefS3 iwm pred tretiranjem ixxxi po tretiranju Slika 2: Depozit bakrovih ionov na listih vinske trte preračunano na enoten odmerek bakrovih ionov ločeno po obravnavanjih Figure 2: Deposit of copper ions on vine leaves normalized to the same application rate of copper ions fordifferenttreatments 14 4 12- 6- 20. julij 19. avgust 20. julij 12 10 = 6 14 4 12 4 4 2 2 20. julij 19. avgust 20. julij 7- 20. julij 30. julij 19. avgust RefS4 3.2 Vpliv datuma tretiranja na depozit bakrovih ionov na listih vinske trte V tabeli 5 je podrobneje razčlenjen vpliv datuma tretiranja na depozit bakrovih ionov na listih vinske trte, posebej po obravnavanjih in času pobiranja. Za vsa obravnavanja so podane povprečne vrednosti štirih ponovitev. Tabela 5 prikazuje, daje depozit bakrovih ionov na listih vinske trte naraščal od prvega do četrtega tretiranja, kar je bilo tudi pričakovati. Enaki rezultati glede datuma tretiranja so bili doseženi tudi pri preračunanih vrednostih bakrovih ionov na enoten odmerek. Tabela 5: Vplivdatumatretiranja na depozit bakrovih ionov na listih vinske trte, (Duncanovtest, a=0,05) Table 5: Effect of the date of application on the deposit of copper ions on samples of vine leaves, (Duncan's test, a=0.05) Depozit bakrovih ionov (m9 cm-2) Čas Datum tretiranja Značilnost Obravna- pobi- 1 2 3 4 vpliva vanje ranja (20. julij) (30. julij) (9. avgust) (19. avgust) (P vrednost) CuZ pred 2,9 b ,6 4, 4,8ab 7,1a 0,0199 po 10,2a 9,1 a 9,7a 12,0a 0,1751 CuZU-1 pred 2,4c 4,4 b 4,5b 5,3a <0,0001 po 9,1a 8,7 ab 7,7 b 9,0ab 0,1255 CuZU-2 pred 2,2d 2,9 c 3,8b 4,6a <0,0001 po 6,6 b 4,6 c 7,7ab 8,6a 0,0008 RefSI pred 2,5 c 3,5 b 4,9 a 4,8a 0,0011 po 10,3a 7,5 b 9,1 a 9,1a 0,0039 RefS2 pred 2,3 c 2,2 c 3,2b 4,0a 0,0002 po 4,6 b 6,2 a 6,4a 6,2a 0,0044 RefS3 pred 2,3 b 2,4 b 2,9b 3,9a 0,0043 po 6,2 b 7,9 a 7,2ab 7,3ab 0,1725 RefS4 pred 1,8 c 3,3 b 4,1 ab 5,0a 0,0003 po 6,3 b 9,9 a 8,7a 8,7a 0,0149 3.3 Spiranje bakrovih ionov Vtabeli 6 je prikazano spiranje bakrovih ionov med prvim in drugim tretiranjem, med drugim in tretjim tretiranjem ter med tretjim in četrtim tretiranjem za posamezna obravnavanja. Tabela 6: Delež spranih bakrovih ionovmed posameznimi tretiranji za različnaobravnavanja Table 6: Relative wash-off of copper ions between the applications for different treatments Odstotek izpiranja Obravnavanje 20. julij - 30. julij 30. julij - 9. avgust 9. avgust -19. avgust Povprečje ±SD CuZ 55% 47% 27 % 43% ± 14% CuZU-1 53% 49% 31 % 44% ± 12% CuZU-2 56% 20% 42% 39% ± 18% RefS1 66% 33% 48% 49% ± 17% RefS2 52% 48% 38% 46% ± 7% RefS3 61 % 63% 46% 57% ± 9% RefS4 47% 60% 43% 52% ± 9% Povprečje ±SD 65% ±6% 46% ±15% 39% ±8% SD, standardni odklon. Med prvim in drugim tretiranjem je padlo 23,8 mm padavin [7]. Vtem času je bilo doseženo minimalno spiranje fitofarmacevtskega sredstva pri referenčnem sredstvu 4 (RefS4), in sicer 47 %. Med drugim in tretjim tretiranjem je padlo 88,1 mm padavin [7] in bilo doseženo minimalno spiranje fitofarmacevtskega sredstva pri obravnavanju CuZU-2 (20 %). Med tretjim in četrtim tretiranjem je padlo 96,2 mm padavin [7] in bilo doseženo minimalno spiranje fitofarmacevtskega sredstva pri obravnavanju CuZ (27 %). Če primerjamo povprečne vrednosti med vsemi temi tretiranji, je bilo doseženega najmanj spiranja pri obravnavanju CuZU-2 (39 %), sledijo CuZ (43 %), CuZU-1 (44 %), RefS2 (46 %), RefS1 (49 %), RefS4 (52 %) in RefS3 (57 %). Najmanjše je bilo spiranje pri obravnavanju CuZU-2, kjer je bila uporabljena največja količina vode (1000 L ha-1, glej tabelo 1). Posledica tako majhnega spiranja med tretiranji je odtekanje pršilne brozge že takoj po tretiranju zaradi večje porabe vode kot pri ostalih obravnavanjih, kjer je bila poraba vode 400 L ha-1. 3.4 Vpliv časa pobiranja listov na depozit bakrovih ionov V tabeli 7 je podrobneje razčlenjen vpliv časa pobiranja na depozit bakrovih ionov na listih vinske trte, posebej po obravnavanjih in datumu tretiranja. Za vsa obravnavanja so podane povprečne vrednosti štirih ponovitev. Iz tabele 7 je razvidno, da so bile razlike v depozitu bakrovih ionov na listih vinske trte za vsa obravnavanja in za vse datume tretiranj statistično značilne z ozirom na čas pobiranja listov. Depozit bakrovih ionov na listih vinske trte po tretiranjih je bil pričakovano večji kot depozit bakrovih ionov pred tretiranji. Pri vplivu časa pobiranja listov na depozit bakrovih ionov preračunano na enoten odmerek bakrovih ionov so bili doseženi enaki rezultati. Tabela 7: Vpliv časa pobiranja na depozit bakrovih ionov na listih vinske trte, (Duncanovtest, a=0,05) Table 7: Effect of the time of sampling on the deposit of copper ions on samples of vine leaves, (Duncan'stest, a=0.05) Depozit bakrovih ionov (pg cm-2) _Čas pobiranja_ Značilnost Obravnavanje Datum vpliva _tretiranja_pred_po_(P vrednost) CuZ 1 (20. julij) 2,9b 10,2a 0,0033 2 (30. julij) 4,6b 9,1 a 0,0047 3 (9. avgust) 4,8b 9,7a 0,0122 4 (19. avgust) 7,1b 12,0a 0,0067 CuZU-1 1 (20. julij) 2^ 9Ta 0,0040 2 (30. julij) 4,4b 8,7a 0,0062 3 (9. avgust) 4,5b 7,7a 0,0303 4 (19. avgust) 5,3b 9,0a 0,0023 CuZU-2 1 (20. julij) 2^ 6,6^ 0,0030 2 (30. julij) 2,9b 4,6a 0,0030 3 (9. avgust) 3,8b 7,7a 0,0207 4 (19. avgust) 4,6b 8,6a 0,0034 RefS1 1 (20. julij) 2,5^ 10,3a 0,0017 2 (30. julij) 3,5b 7,5a <0,0001 3 (9. avgust) 4,9b 9,1 a 0,0261 _4 (19. avgust)_4,8^_9^_0,0121 Depozit bakrovih ionov (pg cm-2) _Čas pobiranja_ Značilnost Obravnavanje Datum vpliva _tretiranja_pred_po_(P vrednost) RefS2 1 (20. julij) 2,3b 4,6a 0,0008 2 (30. julij) 2,2b 6,2a 0,0009 3 (9. avgust) 3,2b 6,4a 0,0079 _4 (19. avgust)_4,0^_6,2^_0,0164 RefS3 1 (20. julij) 2,3^ 6,2® 0,0014 2 (30. julij) 2,4b 7,9a 0,0014 3 (9. avgust) 2,9b 7,2a 0,0130 _4 (19. avgust)_3,9^_7,3^_0,0151 RefS4 1 (20. julij) 1,8b 6,3a 0,0105 2 (30. julij) 3,3b 9,9a 0,0006 3 (9. avgust) 4,1 b 8,7a 0,0363 _4 (19. avgust)_5,0^_8il!_0,0280 P±0,001 statistično zelo visoko značilna razlika; P±0,01 statistično visoko značilna razlika; P±0,05 statistično značilna razlika; P>0,05 statistično neznačilna razlika; skupine v vrstici z različno črko v eksponentu se med seboj statistično značilno razlikujejo. Statističnoznačilne razlikeso označenezdebelimtiskom. 4 ZAKLJUČKI 1. Vpliv obravnavanja na depozit bakrovih ionov na listih vinske trte je bil statistično značilen. Največji depozit bakrovih ionov je bil dosežen pri obravnavanju CuZ. Statistično značilen je bil tudi vpliv obravnavanja na depozit bakrovih ionov na listih preračunano na enotni odmerek bakrovih ionov. Največje vrednosti bakrovih ionov preračunano na enotni odmerekso bile dosežene pri obravnavanju CuZ in CuZU-1. 2. Vpliv datuma tretiranja je pokazal, da so bile statistično značilne razlike v depozitu bakrovih ionov med posameznimi datumi tretiranj. Opazen je trend naraščanja v depozitu bakrovih ionov od prvega do četrtega tretiranja. Enaki rezultati so bili doseženi za depozit bakrovih ionov preračunano na enotni odmerek. 3. Spiranje uporabljenih fitofarmacevtskih sredstev, pri porabi vode 400L ha-1, je bilo najmanjše pri obravnavanju CuZ (43 %) in CuZU-1 (44 %). Pri referenčnih sredstvih je bilo spiranje večje (do 46 do 57 %). 4. Vpliv časa pobiranja zelenih listov vinske trte je pokazal, da je bil depozit bakrovih ionov pred vsemi tretiranji statistično značilno manjši glede na depozit bakrovih ionov na listih vinske trte po tretiranjih. Prav takšne so bile statistično značilne razlike pri depozitu bakrovih ionov preračunano na enotni odmerek. ZAHVALA Zahvaljujemo se vsem, ki so sodelovali pri tem projektu, predvsem Zlatemu Griču iz Slovenskih Konjic, ki nam je omogočil izvedbo poskusa na terenu in Cinkarni Celje, Metalurško kemični industriji Celje za opravljene laboratorijske analize in sofinanciranje ter vsem sodelavcem iz Inštituta za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije, ki ste nam pomagali. Zahvaljujemo se tudi Javni agenciji za raziskovalno dejavnost za sofinanciranje. 5 LITERATURA 1. Cross, J.V., Murray, R.A., Ridout, M.S., Walklate, P.J., Quantification of spray deposits and their variability on apple trees.-Aspects of Applied Biology, 48(1997), p. 217224. 2. De Moor, A., Langenakens, J., Vereecke, E., Jaeken, P., Lootens, P., Vandecasteele, P., Image analysis of water sensitive paper as a tool for the evaluation of spray distribution of orchard sprayers.-Aspects of Applied Biology, 57(2000), p. 329341. 3. Doruchowski, G., Labanowska, B., Goszczynski, W., Godyn, A., Holownicki, R., Spray deposit, spray loss and biological efficacy of chemicals applied with different spraying techniques in black currants.- Electronic journal of Polish Agricultural Universities, Agricultural Engineering, 5(2002)2. 4. Furness, G.O., Magarey, P.A., Miller, P.H., Drew, H.J., Fruit tree and vine sprayer calibration based on canopy size and length of row: unit canopy row method.-Crop protection, 17(1998)8, p. 639-644. 5. Kač, M., Comparison of various methods for determination of the deposit of pesticides on leaves of the treated plants. Zbornik biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani, 61(1993), p. 199-204. 6. Kač, M., Golhleb, S., Košir, I. J., Kdaj so podatki določanja depozita fitofarmacevtskega sredstva res povedni? Zbornik predavanj in referatov 6. slovenskega posvetovanja o varstvu rastlin. Power and pitfalls of deposit measurements of phytopharma-ceuticals. The 6th Slovenian Conference on Plant Protection. Zreče, 4.-6. marec 2003, s. 66-71. 7. Luskar, S., Košir, I. J., Kač, M., Depozit bakrovih ionov na listih vinske trte in njegovvplivna biološko učinkovitost uporabljenih fitofarmacevtskih sredstev za zatiranje peronospore vinske trte: 1. Biološka učinkovitost. - Vtisku. 8. Salyani, M., Fox, R. D., Performance of image analysis for assessment of simulated spray droplet distribution.-TransactionsoftheASAE 37(1994)4, p. 1083-1089. 9. Salyani, M., Methodologies for assessment of spray deposit in orchard applications.- ASAE Meeting Presentation, Milwaukee, Wisconsin, USA, July 9-12, 2000, Paper No. 00-1031. 10. Salyani, M., McCoy, C.W., Deposition of different spray volumes on citrus trees. Proc. Fla. State Hort. Soc. 102(1989), p. 32-36. 11. SAS/STAT Software. Version 8. 01. 1999. Cary, SAS Institute Inc:software. 12. Žolnir, M., Nekatere kvalitativne značilnosti nanosa škropiva v območju pršilnika pri pršenju hmeljišč. Zbornik predavanj in referatov 1. slovenskega posvetovanja o varstvu rastlin, 1993, s. 237-248. IDENTIFIKACIJA SLOVENSKIH SORT HMELJA Z MIKROSATELITSKIMI MARKERJI Andreja ČERENAK1, Jernej JAKŠE2 UDK/UDC 633.791 : 522.524 (497.4) (045) izvirni znanstveni članek/original scientific article prispelo/received: 17. 10. 2005 sprejeto/accepted: 25. 11. 2005 IZVLEČEK V članku je za identifikacijo slovenskih sort hmelja prikazana uporaba mikrosatelitskih markerjev. V molekulski analizi je bilo analiziranih šestnajst genotipov s tremi pari začetnih oligonukleotidov. Narejena je shema identifikacije sort na osnovi podatkov polimorfnih mikrosatelitov, uporabna za žlahtnitelje hmelja, trgovce in pivovarje. Ključne besede: hmelj, mikrosatelitski markerji, identifikacija sort IDENTIFICATION OF SLOVENE HOP VARIETIES USING MICROSATELLITE MARKERS ABSTRACT The article reports on the use of microsatellite markers for identification of Slovene varieties. Sixteen genotypes were analysed using three primer pairs for the molecular analysis. A scheme of cultivar identification based on polymorphic microsatellite data is provided which can be used by for hop breeders, merchants, and brewers. Keywords: hop, microsatellite markers, variety identification 1 dr. znanosti, Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije, Cesta Žalskega tabora 2, SI-3310 Žalec 2 doc., dr. znanosti, Katedra za genetiko, biotehnologijo in žlahtnjenje rastlin, Biotehniška Fakulteta, Jamnikarjeva 101, SI-1000 Ljubljana 1 UVOD Zanesljivo ločevanje sort hmelja in ugotavljanje sortne čistosti je v hmeljarstvu zelo pomembno. Nujno potrebno je na številnih področjih panoge, od pridelave, žlahtnjenja, trgovine hmelja do pivovarske industrije. Žlahtnitelji potrebujejo uporabno identifikacijsko orodje za ločevanje sort in posledično uveljavljanje svojih žlahtniteljskih pravic, hmeljarji pa želijo sortno čista hmeljišča za zagotavljanje optimalne pridelave hmelja. Identifikacija sort je pomembna v pivovarstvu, saj sta grenčica in aroma piva neposredno pogojeni z izvorom hmelja. Za potrjevanje identitete hmeljnih sort se uporablja več tradicionalnih metod na podlagi vrednotenja fenotipa rastline. Že v šestdesetih letih prejšnjega stoletja je Davis [4] predlagal sedem morfoloških značilnosti rastlin za ločevanje sort hmelja. Fenotipska vrednotenja so se v nadaljnjih letih izpopolnjevala in so postala zelo učinkovita, njihova glavna slabost je dolgotrajnost opazovanj. Poleg tega so fenotipske ocene močno pod vplivi okolja kot so rastni pogoji, področje gojenja in tudi čas opazovanj. Vzadnjih 40 letih je bil povečan interes v smeri razvoja identifikacijskih metod na podlagi kemijskih analiz eteričnih olj in grenčičnih komponent hmelja, sestava katerih je genetsko konrolirana [9, 13, 14, 16]. Proučevanje sestave eteričnih olj poteka na IHPS že od leta 1982. S primerjavo organoleptičnega ocenjevanja genotipov, vključenih v poskus v Žalcu in na sorodnem inštitutu v Nemčiji (Institut fur Hopfenforshung, Hull) so ugotovili, daje le-to precej subjektivno, saj so skladne rezultate dosegli le pri 62 % vzorcev. Variabilnost eteričnih olj je intenzivno proučevala Kraljeva s sod. [11], rezultat česar je med drugim razvit min-max model, sistem za klasifikacijo 95 hmeljnih kultivarjevv 14 skupin z uporabo 31 deskriptorjev. Vzadnjih letih so bile v model dodane 3 nove nemške sorte [8], ista avtorja pa sta določila 5 slovenskih komercialno najbolj zanimivih sort hmelja z vključitvijo 78 hmeljnih vzorcev iz različnih področij gojenja v Sloveniji [10]. Vsekakor je večina identifikacij narejenih z uporabo kemijskih analiz svežih ali procesiranih produktov hmelja, na drugi strani pa razvoj metod molekularne genetike vodi k novim alternativam in pristopom. Tehnika naključno nanožene polimorfne DNA (RAPD) [1, 7], sekvenčno označena mesta (STS) [2], polimorfizem dolžine pomnoženih restrikcijskih fragmentov (AFLP) [5, 15] in mikrosateliti oz. enostavne ponavljajoče se sekvence (SSR) [3, 6] so metode, ki so do neke mere že bile uporabljene za identifikacijo sort hmelja. Zaradi velike ponovljivosti in primerljivosti rezultatov med različnimi laboratoriji so najbolj obetavni mikrosatelitski markerji, predvsem zaradi robustnosti, enostavne izvedbe amplifikacije in visoke stopnje polimorfnosti. Mikrostelitska DNA sestoji iz zaporedja majhnih ponavljajočih se enot, običajno dolgih 1 do 6 baznih parov, ki so razpršene po celotnem eukariotskem genomu. Polimorfizem mikrosatelitov predstavlja dolžina osnovnega motiva ter število tandemskih ponovitev, ki se lahko enostavno določijo s pomnoževanjem v polimerazni verižni reakciji (PCR). Rezultat kombinacije podatkov več visoko polimorfnih mikrosatelitskih lokusov so individualni alelni profili, ki omogočajo ločevanje genotipov. Cilj našega dela je bilo zagotoviti sistem identifikacije slovenskih sort hmelja z mikrosatelitskimi markerji. Rezultati dela bodo lahko uporabni za identifikacijo sort ne glede na razvojno stopnjo rastline. 2 MATERIAL IN METODE 2.1 Material V analizo smo vključili vse slovenske sorte hmelja (Aurora, Ahil, Atlas, Apolon, Blisk, Buket, Bobek, Celeia, Cerera, Cicero, Cekin in Savinjski golding) ter štiri tetraploide, pridobljene s kolhicinskim tretiranjem sort Ahil, Apolon, Atlas in Savinjski golding. 2.2 Izolacija DNA Za izolacijo celokupne genomske DNA hmelja smo uporabili metodo CTAB po uveljavljenem protokolu [12]. Iz svežih, mladih listov hmelja, ki smo jih nabrali v kolekcijskem nasadu na IHPS, smo vzeli približno 1-2 cm2 rastlinskega tkiva in gavterilnici dobro homogenizirali ob dodatku 1 ml CTAB ekstrakcijskega pufra [2 % (w/v) CTAB, 1,4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,2 % (v/v) -merkaptoetanol], predhodno segretega na 68oC. Vzorce smo ekstrahirali z mešanico fenola, kloroforma in izoamilalkohola v razmerju 25:24:1. DNA smo oborili z dodatkom 1/10 volumna 3 M Na-acetata (pH 5,2, uravnan z ocetno kislino) in z enim volumnom ledeno-hladnega izopropanola. Usedlino (zgoščeno DNA) smo sprali s 70 % etanolom in jo raztopili v TE pufru [10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA(pH 8,0)] in vzorce shranili pri 4oC. Koncentracijo DNAsmo izmerili s pomočjo mini fluorometraTK0100 (Hoefer Scientific, San Francisco, ZDA). 2.3 Namnoževanje mikrosatelitskih markerjev Za namnoževanje mikrosatelitskih lokusovsmo uporabili predhodno objavljene pare začetnih oligonukleotidov [3]. Lokusno specifični začetni oligonukleotidi so bili izdelani pri MWG-Biotech (Ebersberg, Nemčija). PCR reakcija je vsebovala 50 ng genomske DNA, 1 enoto Taq DNA polimeraze (Boehringer Mannheim, Nemčija), 1x PCR pufer (10 mM Tris-HCl, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, pH 8,3), 0,5 pM koncentracijo vsakega začetnega oligonukleotida in0,2 mM koncentracijo vsakega deoksinuklotidtrifosfata (Boehringer Mannheim, Nemčija). Po 3 minutni denaturaciji pri 94oC je sledilo 26 ciklovs ponavljanjem: ■ 45 sekund pri 94oC ■ 30 sekund pri 55oC ■ 90 sekund pri 72oC s končno inkubacijo vzorcev 7 minut pri 72oC v Perkin Elmer 480 cikličnem termostatu. 2.4 Zaznavanje namnožene DNA Namnožene mikrosatelitske markerje smo ločili z uporabo vertikalne denaturacijske poliakrilamidne gelske elektroforeze (S2; Life Technologies, Carlsbad, California). Po pravilnem tretiranju obeh plošč smo med plošči nanesli denaturacijski poliakrilamidni gel pripravljen iz 7,5 M uree, 1x TBE elektroforetskega pufra in 5% raztopine akrilamid: bisakrilamid, pripravljene iz 40% založne raztopine z razmerjem 19:1. Raztopino smo po filtraciji vakumirali, pred vlitjem gela pa smo dodali 0,5 pl TEMED-a in 2 pl 10% amonpersulfata. Elektroforeza in zaznavanje namnožene DNA po barvanju s srebrom sta potekala po protokolu Promega Silver Sequence™ z manjšimi modifikacijami [6]. Dolžina alelov je bila določena s primerjavo z dolžinskimi AFLP 10 bp dolgimi fragmenti. Najdaljši alel je bil označen s črko A, sledili so mu krajši aleli, označeni z naslednjimi črkami abecede. 3 REZULTATI IN DISKUSIJA Pri vseh namnožitvah smo dobili jasne in nedvoumne DNA produkte. Prisotnost dveh fragmentov na enem lokusu smo smatrali za heterozigoten genotip in namnožitev le enega fragmenta za homozigotno stanje (Slika 1). Prisotnosti treh alelov nismo zasledili, kar je v skladu s pričakovanji, saj triploidi niso bili vključeni v raziskavo. Preglednica 1: Dolžina alelov na mikrosatelitskih lokusih vbaznih parih Table 1: Length of alleles at microsatellite loci in base pairs Aleli Lokus A B C D E 5-2 184 182 180 178 166 11a59 196 194 184 3a88 198 194 Predstavljena raziskava je del širše zasnovanega proučevanja genotipov z več mikrosatelitskimi markerji. V članku je izpostavljena shema določevanja slovenskih sort hmelja v primeru, da je potrebno analizirati hmeljni vzorec neznanega porekla. Z uporabo lokusa 5-2, ki smo ga uvrstili na začetek določevanja sort, smo slovenske sorte razdelili na 7 enot. Sorte Atlas, Ahil, Blisk in Celeia so bile s specifičnim genotipom določene že v prvi fazi analize. Velika večina ostalih sort je bila ločenaz namnoževanjem na lokusu 11a59, pri čemer smo na tej stopnji uspešno določili sorte Aurora, Apolon, Buket, Bobek, Cekin, Cicero in Cerera. Slednjo sorto, Savinjski golding smo določili z lokusom 3a88. Vsi tetraploidni genotipi, dobljeni stretiranjem s kolhicinom so imeli elektroforetski profil enak diploidnemu donorju, zato v skladu s pričakovanji niso bili ločljivi. Njihovo ločevanje za samo panogo ni pomembno, saj setetraploidivslovenskih hmeljiščih ne pridelujejo. Zaključimo lahko, da so mikrosatelitski markerji uspešen markerski sistem za ločevanje slovenskih sort hmelja. Poudariti je potrebno, da je za analizo primeren katerikoli del rastline ne glede na stopnjo razvoja, na rezultat analize pa ne vpliva področje gojenja in drugi vplivi okolja. Slika 1: Shema identifikacije slovenskih sort hmelja z mikrosatelitskimi markerji. Krogi označujejo genotip (preglednica 1), romboidi palokuse, uporabljene vanalizi. Figure 1: Flowchart for the identification of Slovene varieties using microsatellite markers. Circles indicate obtained genotypes (Table 1) and rhomboids indicate loci used in analysis. 4 VIRI 1. Abbot, M.S., Fedele, M.J., A DNA-based varietal identification procedure from hop leaf tissue.-J. Inst. Brew. 100(1994),s. 283-285. 2. Araki, S., Tsuchiya, Y., Takashio, M., Tamaki, T., Shinotsuka, K., Identification of hop cultivars by DNA marker analysis.- J. Amer. Soc. Brew. Chem. 56 (1998), s. 81130. 3. Brady, J.L., Scott, N.S., Thomas, M.R., DNA typing of hops (Humulus lupulus) through application of RAPD and microsatellite marker sequences converted to sequence tagged sites (STS).-Euphytica91(1996), s. 277-284. 4. Davis, E.L., Variation in cultivated varieties of Humulus lupulus L. and its relation to the possible sources of these varieties. - Doct. Diss. Ser., Publ. no. 17(1956), Univ. microfilms, Ann Arbor, Michigan. 5. Hartl, L., Seefelder, S., Diversity of selected hop cultivars detected byfluorescentAFLPs.- Theor. Appl. Genet. 96(1998), s. 112-116. 6. Jakše, J., Kindlhofer, K., Javornik, B., Assessment of genetic variation and differentiation of hop (Humulus lupulus L.) genotypes by microsatellite and AFLP markers.-Genome 44(2001),s. 773-782. 7. Jakše, J., Šuštar-Vozlič, J., Javornik, B., Identification of hop cultivars by RAPD markers.- Proc. Int. Colloq. Impact Plant Biotech. Agric., Rogla, Slovenia, 5-7 December 1994. Ljubljana, Centre for Plant Biotechnology and Breeding, University of Ljubljana, Agronomy Department, s. 147-151. 8. Kač, M., Kovačevič, M., Solid phase microextraction of hop volatiles. Potential use for determination and verification of hop varieties.- J. Cromatogr. A 918 (2001), s. 159167. 9. Kenny, S.T., Identification of US-grown hop cultivars by hop acid and essential oil analysis.-J. Amer. Soc. Brew. Chem. 48(1988), s. 3-8. 10. Kovačevič, M., Kač, M., Determination and verification of hop varieties by analysis of essential oils.-Food Chem. 77(2002), s. 489-494. 11. Kralj, D., Zupanec, J., Vasilj, D., Kralj, S., Pšeničnik, J., Variability of essential oils of hops, Humulus lupulus L.-J.Inst.Brew.97(1991),s.197-206. 12. Kump B., Svetek S., Javornik B., Izolacija visokomolekularne DNK iz rastlinskih tkiv.- Zbornik Biotehniške Fakultete Univerze v Ljubljani, Kmetijstvo, 59(1992), s. 63-66. 13. Lemmens, G.W.C., The breeding and parentage of hop varieties.- Brew. Dig. May (1998), s. 16-26. 14. Perpete, P., Varietal Discrimination of hop pellets by essential oil analysis I. Comparison offreshsamples.- J.Amer. Soc. Brew. Chem. 56(1998),s. 104-108. 15. Townsend M.S., Henning J.A., Moore, D.L., AFLP analysis of DNA from Dried Hop Cones.-Crop Sci. 40(2000), s. 1383-1386. 16. Wagner, T., The quantity and composition of bitter resins chemotaxonomic characteristics of hop varieties.-Pharm. J. Slov. 34(1983), s. 77-83. VZPOSTAVITEV IDENTIFIKACIJSKEGA SISTEMA ZA DOLOČEVANJE HMELJEVEGA LATENTNEGA VIROIDA Jernej JAKŠE1 in Sebastjan RADIŠEK2 UDK/UDC 632.95 : 633.791 (045) izvirni znanstveni članek/original scientific article prispelo/received: 18. 10. 2005 sprejeto/accepted: 25. 11. 2005 IZVLEČEK Testiranje hmeljnih rastlin na okužbo s hmeljevim latentnim viroidom (HLVd) je Evropska organizacija za varstvo rastlin (EPPO) uvedla v certifikacijsko shemo produkcije sadilnega materiala, katero je prevzela tudi Slovenija. Rastline okužene s HLVd so ponavadi brez simptomov, se pa lahko občutno zniža pridelek alfa kislin. Identifikacija HLVd s klasičnimi morfološkimi metodami zaradi tega ni izvedljiva, imamo pa voljo sodobne molekulske tehnike, ki temeljijo na povratni poliakrilamidni elektroforezi, hibridizaciji in reverzni transkripciji z verižno reakcijo s polimerazo (RT-PCR). Slednji dve odlikujeta predvsem hitrost in zanesljivost obenem pa se tudi dopolnjujeta. Njihova razvoj in vpeljava v diagnostiko sta predstavljena v nadaljevanju. Ključne besede: HLVd, RT-PCR, hibridizacija, patogeni hmelja REESTABLISHMENT OF THE IDENTIFICATION SYSTEM FOR DETECTION OF HOP LATENT VIROID ABSTRACT Testing hop plants for HLVd infection is being considered under the European and Mediterranean Plant Protection Organisation (EPPO) certification scheme forthe production of planting material and it has been fully adopted by Slovenia. Plants infected by HLVd are usually symptomless, but decline in totalyield of alpha acids has been reported. Identification of HLVd by classical morphological methods is not possible due to the non-expressed symptoms, but novel moleculartechniquesare capable of detecting it. They are mainly based on reverse PAGE electrophoresis, hybridization and RT-PCR. The latter two are considered to be quick, reliable and complementary. Their development and utilization in HLVd diagnostics is presented in the paper. Keywords: HLVd, RT-PCR, hybridization, hop pathogens 1 doc. dr., Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo, Katedra za genetiko, rastlinsko biotehnologijo in žlahtnjenje, Jamnikarjeva 101, SI-1000 Ljubljana 2 dr. znanosti, Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije, Oddelek za varstvo rastlin, Diagnostični laboratorij, Cesta Žalskega tabora 2, SI-3310 Žalec 1 UVOD Viroidi so enoverižne, krožne, nizko molekularne RNA molekule, katerih obstoj in patogenost sta dokazana že v mnogih rastlinskih vrstah. Povzročajo mnogo pomembnih bolezni s simptomi, ki so navidez podobni virusnim obolenjem. Viroidne RNA molekule ponavadi niso daljše od 400 baznih parov (bp) in nimajo kodirajočih regij, ki bi se prepisale v protein. Značilna je njihova sekundarna struktura (Slika 1), ki je določena z medsebojnim parjenjem nukleotidnih baz molekule, zaradi česar ima viroid značilno paličasto strukturo. Ta se v denaturacijskih pogojih poruši in prevzame zaprto-krožno obliko. Za vse viroidne bolezni je značilno, da so popolnoma odvisne od metabolizma gostiteljske rastline, njihova replikacija in patogeneza pa je pogojena z viroidnimi strukturnimi lastnostmi in sposobnostjo interakcije s celičnimi faktorji. Dve ključni vprašanji, ki se vseskozi pojavljata pri viroidih, sta kako povzročajo bolezenske simptome brez kodirajočih proteinov in zakaj imajo značilno sekundarno strukturo. Nedavne študije so pokazale, da so viroidne molekule sposobne vključiti mehanizem RNA utišanja pomembnih fizioloških genov gostitelja [14]. Do sedaj sta bila pri hmelju opisana dva viroida: (1) hmeljev stunt viroid (HSVd, 297 bp) [13], ki je zaenkrat omejen le na Japonsko in okužuje tudi sadne vrste in (2) hmeljev latentni viroid (HLVd, 256 bp) [11], ki je vsesplošno razširjen v intenzivni pridelavi hmelja z neizrazitimi simptomi okužbe, vendar lahko pri nekaterih kultivarjih hmelja izredno škodljivo vpliva na pridelek [10]. Pri tem je treba izpostaviti kvantitativne spremembe nekaterih sekundarnih metabolitovlupulinske frakcije, prav tako pase lahko nekoliko zmanjšajo storžki hmelja rastlin okuženih s HLVd v primerjavi z neokuženimi rastlinami [1,2, 3]. Čeprav so morfološki znaki okužbe neizraziti, so biokemične spremembe storžkov v nasprotju z imenom bolezni, ki ga označuje za latentnega. Nedavno so tudi v Sloveniji povezali pojav kržljavosti hmelja s kombinacijo pomanjkljive preskrbe z borom, stresnih vremenskih razmer in hkratne izrazitejše navzočnosti HLVd [7]. 1 50 100 UG I I | U C AU A AA CC G U U A A AC UC U G AA G GG GA U GA GA C UC GA G CCA UCU GGGG CACU GUGA CU CUGUA GGU GC GG GCUC AAGAG AUCC CCGGG CC ACUC GC GG GGAGA GAGC GUUC UGCGCGG GAC UGA CGG U CCCC_GUGA CACU GA GACGU CCA CG CC CGAG UUCUC UAGG GGCCC GG UGAG CG CC CUUCU CUCG CAAG GUGCGUC CUG GCU GUU U U A A U A U U AG G A A U A A U GC A A A UC G C U CU A U U AC U A C I I AA I CA | 256 250 200 150 Slika 1: Nukleotidno zaporedje hmeljnega latentnega viroida (HLVd) v termodinamično optimizirani sekundarni strukturi. Mesti prileganja začetnih oligonukleotidov pri RT-PCR reakciji sta podčrtani. Povzeto po [11]. Figure 1: The nucleotide sequence of hop latend viroid (HLVd) arranged in a thermodynamically optimized secondary structure. Primer annealing sites employed in the RT-PCR reaction are underlined. According to [11]. Testiranje hmeljnih rastlin na okužbo s HLVd je Evropska organizacija za varstvo rastlin (European and Mediterranean Plant Protection Organisation - EPPO) uvedla v certifikacijsko shemo produkcije sadilnega materiala hmelja. Tega je tudi v celoti prevzela slovenska certifikacijska shema, zaradi česar se je pojavila potreba po razvoju in vpeljavi testov določanja za HLVd. Za vse teste določanja patogena velja, da morajo biti hitri, enostavi in zanesljivi. V preteklosti so bili pri nas izvedeni poskusi s povratno poliakrilamidno elektroforezo (R-PAGE) in obratno transkripcijo in verižno reakcijo s polimerazo (RT-PCR) za določevanje HLVd [8]. R-PAGE tehnika ni primerna za detektiranje viroida v večjem številu vzorcev. Zaradi tega smo se odločili za vpeljavo metode hibridizacije točkovnega odtisa (DOT-BLOT) v kombinaciji z uporabo RT-PCR metode, ki izpolnjujeta kriterije enostavnosti, hitrosti in zanesljivosti in se v metodološkem smislu medsebojno dopolnjujejta, saj prva temelji na tehniki hibridizacije nukleinskih kislin, druga pa na in vitro pomnoževanju RNAmolekule. V nadaljevanju bova predstavila vpeljavo obeh tehnik, ki se sedaj rutinsko uporabljata pri testiranju sadilnega in žlahniteljskega materiala hmelja. 2 MATERIAL IN METODE V primeru dela z RNA je potrebno paziti na morebitne kontaminacije z RNazami. Natančna navodila glede izogibanja kontaminacij z RNazami in uporabe inhibitorjev so na voljo v splošnih laboratorijskih priročnikih. 2.1 Rastlinski material Detekcijo viroida smo opravili na 20-ih sadikah hmelja, ki so bile certifikata A, gojenih v rastlinjaku Inštituta za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije (po pet različnih rastlin štirih kultivarjev hmelja'Aurora' 1-5, 'Savinjski Golding' 6-10, 'Celeia' 11-15 in 'Taurus' 16-20), in na dveh vzorcih hmeljnih storžkov ('Aurora'-21 in 'Savinjski Golding' - 22). V primeru rastlin smo izolirali celokupne nukleinske kisline (TNA) ali rastlinski sok (SAP) iz mladih listov (2-4 cm2 tkiva), pri storžkih pa smo uporabili za izolacijo ovršne lističe (približno tretjino celega storžka), kismojim odstranili lupulinske žleze. 2.2 Izolacija vzorcev Pri optimizaciji metode smo uporabili tri različne ekstrakcijske raztopine, dve za izolacijo celokupnih nukleinskih kislin (TNA), (CTAB [2 % CTAB, 0,1 M TRIS-HCl pH 8,0, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl, 1% Na-sulfit, 2 % PVP-40, 0,4 % p-merkaptoetanol] in AMES [3 % SDS, 20 % etanol, 1 M NaCl, 0,5 M Na-acetat, 10 mM MgCl2, pH 6,0]), [5] in raztopino za izolacijo rastlinskega soka (SAP) (HOP EXTRACTION raztopina [200 mM K2HPO4, 10 mM DIECA, 5 mM DTT, 0,1 %, TritonX-100]) [3]. CTAB izolacija. Postopek je identičen že objavljenemu postopku izolacije rastlinske DNA [9], na voljo je pri avtorjih. Vzorce smo shranjevali pri -20 oC. AMES izolacija. Postopekje bil identičen CTAB izolaciji, le ob uporabi AMES ekstrakcijskega pufra. Izolacija rastlinskega soka. Rastlinski vzorec smo homogenizirali ob dodatku 1 ml HOP EXTRACTION raztopine, centrifugirali 5 min pri 14.000 vrt/min in dobljeni supernatant takoj nanesli na membrano. Ostalo raztopinosmozavrgli. 2.3 RT-PCR reakcija Za RT-PCR reakcijo smo uporabili komercialni RT-PCR komplet (Access RT-PCR, Promega) po navodilih proizvajalca. V reakcijsko tubico smo zmešali 1,5 |jl redčene matrične DNA (preizkušali smo redčitve TNA vzorcev od 1:10 do 1:25000, SAP vzorcev pri RT-PCR nismo uporabili) in po 15 pmol HLVd 1P in 1M začetnega oligonukleotida (HLVd 1P: 5'-GGATACAACTCTTGAGCGCC-3', HLVd 1M: 5'-TAGTTTCCAACTCCGGCTGG-3') [6] (sl. 1). Mešanico smo denaturirali 5 min pri 94 oC, jo nato takoj ohladili na ledu in dodali komponente RT-PCR kompleta. Reakcijo smo inkubirali v cikličnem termostatu z naslednjim temperaturnim profilom: 48 oC 45 min, sledila je 2 min denaturacija pri 94 oC in nato 33 ciklov pomnoževanja: 94 oC 30 sec, 57 oC 1 min in 68 oC 2 min, kise je zaključilo s 7 min inkubacijo pri 68 oC in hlajenjem vzorca pri 12oC. Pomnožene vzorce smo analizirali na 1,5-odstotnem agaroznem gelu z dodanim etidijevim bromidom v koncentraciji 0,5 jg/mlgela. 2.4 IzdelavasondeHLVd Za izdelavo sonde smo uporabili plazmid pHLP121 [11,12], ki vsebuje dve kopiji (dimer, 2x256 bp) cDNA HLVd, vstavljeni v plazmid Bluescribe M13+ (Stratagene) v restrikcijsko mesto SmaI. 20 |jg plazmidne DNA smo linearizirali 16 ur pri 37oC s 60 U encima HindIII (Sigma) v volumnu 50 jl. Razrezan plazmid smo izolirali iz 0,8% agaroznega gela po postopku Boylea in Lewa [4] in mu spektrofotometrično določili koncentracijo. Sondo (1 jg linearizeranega plazmida) smo označili z digoksigeninom z uporabo DIG Northeren Strater Kit kompleta (Roche) po priporočilih proizvajalca kompleta. Koncentracijo sonde smo določili s primerjavo standarda po po priporočilih proizvajalca kompleta. 2.5 Priprava membrane in hibridizacija točkovnega odtisa Priprava membran. Vzorce TNAsmo pripravili vvolumnu 100 jlzredčenjemv4 * SSC [iz20x koncentrirane raztopine: 3M NaCl, 0,2M NaH2PO4]. Za vsak vzorec smo pripravili 3 redčitve: 0,1,1 in 5 jl vzorca TNA, kismogazmešaliv4 * SSC. Vprimeru SAP vzorcev smo pripravili 3 redčitve v 4 * SSC: 1, 10 in 100 jl (neredčeno) vzorca. Preverili smo nivo detekcije pri denaturiranih (5 min 95 oC) in nedenaturiranih TNA vzorcih. Za nanos vzorcev smo uporabili dot-blot vakuumsko napravo (Biometra- Whatman), ki omogoča nanos 96-ih vzorcev na membrano mikrotiterskega formata (8 * 12 cm). Po nanosu vzorcev na membrano smo napravo vakuumirali 5 min in membrane sparli z 200 jl 4 * SSC pufra. Membrane smo zračno posušili in fiksirali nukleinske kisline na UV transiluminatorju (312 nm) do 5 min. Membrane smo nato uporabili v postopku hibridizacije ali shranili pri -20 oC. Hibridizacija in detekcija. Membrane smo predhibridizirali do dve uri pri 68oCv8ml DIG Easy Hyb raztopine (komponenta kompleta, Roche), ki smo ga predhodno segreli na 68 oC. 450 ng sonde smo denaturirali 4 min pri 95 oC in zmešali s svežo hibridizacijsko raztopino (4 ml, DIG Easy Hyb) in hibridizirali preko noči pri 68 oC. Po hibridizaciji smo membrane spirali 20 min pri sobni temperaturi v 25 ml 2 * SSC in 0,01-odstoten SDS, 20 min pri 55 oC v 25 ml 2 * SSC in 0,01-odstoten SDS in dvakrat po 20 min pri 55 oC v25 ml 0,5 * SSC in 0,01-odstoten SDS. Takoj smo nadaljevali s postopkom detekcije po priporočilih proizvajalca kompleta. Po končani detekciji smo rentgenski film izpostavili membrani za 10 min in ga razvili v GBX razvijalcu, spralivvodi in fiksirali vGBXfiksirju (Kodak). 3 REZULTATI IN DISKUSIJA Zaradi vsesplošne razširjenosti HLVd pri gojenem hmelju smo predpostavljali okuženost vseh analiziranih vzorcev. 3.1 RT-PCR Pri občutljivosti RT-PCR reakcije smo ugotovili, da še vedno z gotovostjo detektiramoviroidno RNA v vzorcu, ki smo ga redčili 1:2000 (1 pl TNA vzorca v 2 ml vode) (slika 2). Slabotno pomnožen fragment pričakovane dolžine 250 bp pa je bil delno opazen še vvzorcih redčenih 1:5000 in 1:10000. Glede na rezultate priporočamo pripravo RT-PCR reakcije v redčitvenem območju od 1:100 do 1:1000. V nekaterih primerih smo pri manj redčenih vzorcih opazili tudi 500 in 750 bp dolge fragmente, ki so bili posledica večkratne krožnega prepisa RNA molekule zaradi prevelike koncentracije matrične RNA. Slika 2: Občutljivost RT-PCR reakcije pri različnih redčenjih vzorca, M dolžinski marker 100 bp lestvica (Fermentas) Figure 2: Sensitivity of RT-PCR reaction at different dilution levels, M molecular weight marker 100 bp ladder(Fermentas) Pri primerjavi različnih izolacijskih raztopin za TNA, se je CTAB raztopina izkazala za boljšo izbiro kot AMES raztopina. V vseh primerih smo pri vzorcih izoliranih s CTAB raztopino brez težav pomnožili viroidno RNA, medtem ko smo pri AMES vzorcih detektirali do 70% izpad RT-PCR reakcije (slika 3). Slika 3: RT-PCR rezultati 10-ih vzorcev hmelja izoliranih z AMES in CTAB ekstrakcijsko raztopino. Predviden HLVd fragment dolžine 250 bp smo pomnožili pri vseh 10-ih CTAB vzorcih. Pri AMES ekstrakcijski raztopini smo zasledili močno inhibicijo, saj smo le v dveh vzorcih (7 in 21) pomnožili HLVd fragment; a vzorec brez TNA (slepi vzorec), b kontrolna RNA pomnožitev (323 bp, kontrola RT-PCR kompleta). Figure 3: RT-PCR results of 10 hop samples extracted with AMES and CTAB buffer. Predicted 250 bp HLVd fragment is amplified in all ten CTAB samples. Strong inhibition of reaction in AMES samples is detected, since the HLVd band was amplified in only two samples (7 and 21); a - blank sample (no nucleic acids added), b-control RNAamplification(323bp, control from RT-PCR kit). Pri RT-PCR analizi s CTAB ekstrakcijsko raztopino smo dokazali predpostavljeno domnevo, da so vsi analizirani vzorci hmelja okuženi s HLVd (rezultati niso prikazani). CTAB ekstrakcijska raztopina se je izkazala za boljšo pri RT-PCR analizi v primerjavi z AMES raztopino, zato za nadaljne delo priporočamo njeno uporabo pri izolaciji TNA. Nivo detekcije RT-PCR reakcije se kljub zmanjšanemu volumnu za 70% od priporočenega ni spremenil, smo pa s tem občutno zmanjšali stroške analize. 3.2 Hibridizacija Pri hibridizaciji točkovnega odtisa smo primerjali rezultate dobljene pri uporabi SAP ali TNA vzorcev in različne redčitve teh vzorcev. Izolacija SAP vzorcev je hitrejša (15 min) v primerjavi z izolacijo TNA (3 ure). Iz dobljenih rezultatov lahko potrdimo neuporabnost vzorcev soka (SAP), saj je bil signal hibridizacije neizrazit in je bilo težko določiti ali je vzorec pozitiven ali negativen (slika 4). Pri 1 pl vzorcih soka smo dobili hibridizacijske signale šibke intenzitete, pri večjih volumnih (10 in 100 pl) pa so bili signali izredno neizraziti. Le pri vzorcih hmeljnih storžkov (vzorca 21 in 22) so bili signali močnejši, kar potrjuje večjo koncentracijo viroida v storžkih. Zmanjšano intenziteto signalov nekateri avtorji razlagajo z aktivnimi RNazami v rastlinskem soku [3]. Pri uporabi TNA vzorcev smo dobili signale močne intenzitete pri 1 pl vzorcu. Čeprav je postopek izolacije TNA v primerjavi z izolacijo rastlinskega soka daljši, pa priporočamo prav uporabo teh vzorcev, saj dobimo zanesljive hibridizacijske signale. CTAB in AMES vzorci so pri hibridizaciji dali identične rezultate (rezultati niso prikazani). Vzorci 'l SAP 10 100 1 TNA 1 1 9 17 2 10 18 3 11 19 4 12 20 5 13 21 6 14 22 7 15 8 16 t • * • • w >• • • • iL vOO (") CC 0 C O too 1 o# o® oo ooo o oo ooo ooo. Q# oo ::: • ti • •• Slika 4: Rezultati hibridizacije 22-ih vzorcev soka (SAP) in celokupnih nukleinskih kislin (TNA) (izoliranih s CTAB ekstrakcijsko raztopino) Figure 4: Hybridization results of 22 sap (SAP) and total nucleic acids (TNA) samples (CTAB isolation) V našem primeru smo za določitev signala ozadja uporabljali TNA ostalih kmetijskih rastlin (koruza, sončnica, lucerna), kjer nismo zasledili hibridizacijskega signala. Kot pozitivno kontrolo pasmo uporabili pozitivno RT-PCR reakcija (0,5 pl), ki smo jo predhodno denaturirali. Stem smo potrdili tudi identičnost RT-PCR vzorcev in naše sonde. Za kontrolo pa odsvetujemo uporabo plazmida, ker smo opazili slabe in neponovljive hibridizacijske signale pri uporabi različnih, relativno visokih koncentracij plazmida (10 ng in navzdol) (slika 5). Identičnost HLVd RT-PCR produktov smo potrdili tudi s sekvenčno analizo in s primerjavo z objavljenim GenBank zaporedjem (rezultati niso prikazani). TNA vzorcev ni potrebno denaturirati, ker nismo opazili razlik med jakostjo hibridizacijskih signalov denaturiranih in nedenaturiranih TNA vzorcev (rezultati niso prikazani). RT-PCRvzorci 1-10 I_I I_I I_II_ HLVdplazmid M S A Slika 5: Pri desetih hmeljnih vzorcih smo napravili dot-blot detekcijo RT-PCR vzorcev pri zaostrenih pogojih in pri vseh dobili jasne hibridizacijske signale. Pri hibridizaciji na nekatere rastlinske TNA vzorce (M - koruza, S - sončnica, A - lucerna) nismo zasledili hibridizacijskih signalov. Pri hibridizaciji na plazmidno pHLP121 DNA smo zasledili jasen hibridizacijski signal le pri 10 ng DNA(HLVd: 10,1 in 0,1 ng). Figure 5: Identity of 10 amplified RT-PCR products was confirmed by stringent DOT-BLOT hybridization, in which strong hybridisation signals were observed. Hybridisation to other plant TNA samples (maize - M, sunflower - S and alfalfa - A) revealed no sequence homology to the HLVd probe used. Plazmid DNApHLP121 revealed a strong hybridization signal only at 10 ng DNA (HLVd: 10,1 and0.1 ng). S pomočjo RT-PCR produkta smo določili tudi domnevni nivo detekcije hibridizacije. Iz gela smo izolirali RT-PCR produkt, mu določili koncentracijo spektrofotometrično in pripravili njegove redčitve z znanim številom molekul RT-PCR produkta. Določili smo, da je spodnji nivo detekcije metode okrog 108 molekul RT-PCR produkta, kar odgovarja približno 28 pg RT-PCR produkta oz. molekul HLVd. 4 ZAKLJUČEK Kombinacija hibridizacije in RT-PCR reakcije se je pokazala za optimalno izbiro tehnik za določanje hmeljnega latentnega viroida. Metodološko se tehniki razlikujeta, saj prva temelji na hibridizaciji in druga na in vitro pomnoževanju DNA. S tem smo še dodatno izboljšali zanesljivosttestiranja. Glede na dobljene rezultate priporočamo uporabo ekstrakcijske raztopine CTAB za izolacijo celokupnih nukleinskih kislin, ker smo dobili najboljše rezultate tako pri hibridizaciji kot pri RT-PCR določanju viroida. Ekstrakcijska raztopina AMES je dala pri hibridizaciji enake rezultate kot CTAB, medtem ko smo zasledili velik izpad pomnoževanja vzorcev pri RT-PCR določanju. Uporabo hmeljnega rastlinskega soka odsvetujemo, ker v našem primeru vzorci niso dali jasnih hibridizacijskih signalov in so tudi neprimerni za RT-PCR reakcijo. Obe tehniki smo uspešno vpeljali za rutinsko testiranje matičnih rastlin in rastlin, ki sov procesu eliminacije hmeljevegalatentenegaviroida. Pri tem v sistemu testiranja najprej uporabimo tehniko hibridizacije, ki omogoča hkratno testiranje velikega števila vzorcev. V primeru odsotnosti hibridizacijskih signalov oz. negativnih vzorcev analizo nadaljujemo z občutlivejšo RT-PCR analizo, ki dokončno ovrže ali potrdi prisotnost HLVd. 5 VIRI 1. Adams, A.N., Morton, A., Barbara, D.J., Ridout, M.S., The distribution and spread of hop latent viroid within two commercial plantings of hop (Humulus lupulus).-Annals of Applied Biology, 121(1992)3,s. 585-592. 2. Adams, A.N., Barbara, D.J., Morton, A., Effects of hop latent viroid on weight and quality of the cones of the hop cultivar Wye Challenger.- Annals of AppliedBiology, 118(1991)(Suppl.),s. 126-127. 3. Barbara, D.J., Morton, A., Adams, A.N., Green, C.P., Some effects of hop latent viroid on two cultivars of hop (Humulus lupulus) in the UK.-Annals of AppliedBiology, 117(1990)2,s.359-366. 4. Boyle J.S., Lew A.M., An inexpensive alternative to glassmilk for DNA purification.-Trends in Genetics, 11(1995)1, s. 8. 5. EPPO. Diagnostic protocols for regulatetd pests: Chrysanthemum stunt viroid.- PM, 7/6(2001)1. 6. Hataya, T., Hikage, K., Suda, N., Nagata, T., Li, S., Itoga, Y., Tanikoshi, T., Shikata E., Detection of hop latent viroid (HLVd) using reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-PCR).-Annals of Phytopathological Society of Japan, 58(1992)5, s. 677-684. 7. Knapič, V., Vpliv okužbe z viroidno latentno boleznijo in stresnih vremenskih razmerna hmelj.-Hmeljarski bilten, 10(2003),s. 39-53. 8. Knapič, V., Javornik, B., Viroidivslovenskih kultivarjih hmelja (Humuluslupulus L.).-V: Maček, Jože (ur.). Zbornik predavanj in referatov 4. slovenskega posvetovanja o varstvu rastlin v Portorožu od 3. do 4. marca 1999. Ljubljana: Društvo za varstvo rastlin Slovenije, (1999), s. 311-318. 9. Kump, B., Javornik, B., Evaluation of genetic variability among common buckwheat (Fagopyrum esculentum) populations by RAPD markers.-PlantScience, 114(1996)2,s. 149-159. 10.Matoušek, J., Patzak, J., Orctova, L., Schubert, J., Vrba, L., Steger, G., Riesner, D., The variability of hop latent viroid as induced upon heat treatment.-Virology, 287(2001)2,s.349-58. 11. Puchta, H., Ramm, K., Saenger, H.L., The molecular structure of hop latent viroid (HLVd), a new viroid occuring worldwide in hops.- Nucleic Acids Research, 16(1988)10,s. 149-158. 12. Puchta, H., Sanger, H.L., An improved procedure for the rapid one-step- cloning of full-length viroid cDNA.-Archives of Virology, 101(1988)1-2, s. 137-140. 13. Sano,T., Shikata, E., Hop stuntviroid disease.-Proceedings Int. Workshop on Hop Virus Diseases Rauischholzhausen 1988, A. Eppler Edt., Deutsche PhytomedizinischeGesellschaft, (1989), s. 159-164. 14. Wang, M.B, Bian, X.Y., Wu, L.M., Liu, L.X., Smith, N.A., Isenegger, D., Wu, R.M., Masuta, C., Vance, V.B., Watson, J.M., Rezaian, A., Dennis, E.S., Waterhouse, P.M., On the role of RNA silencing in the pathogenicity and evolution of viroids and viral satellites.- Proceedings of the National AcadademyofSciencesUSA, 101(2004)9, s.3275-3280. REGENERACIJA IZ RAZLIČNIH IZSEČKOV PRI SORTI HMELJA AURORA Suzana ŠKOF1, Zlata LUTHAR2 UDK/UDC 633.791:57.084/.085 (045) izvirni znanstveni članek/original scientific article prispelo/received: 17. 10. 2005 sprejeto/accepted: 25. 11. 2005 IZVLEČEK Proučevali smo odzivnost treh vrst izsečkov: internodijev, listnih pecljev (petiol) in listnih diskov ter odstotek regeneracije pri sorti hmelja Aurora na treh gojiščih z različno vsebnostjo citokininov. Uspelo nam je dvigniti uspešnost regeneracije na gojišču z visoko vsebnostjo citokinina in s selekcijo odzivnejšega genotipa. Najvišji odstotek regeneracije (17,7 %) smo dosegli z odzivnejšim genotipom Aurore na internodijih na gojišču z 2iP (N6-(2-izopentenil) adenin) 6 mg/l. Listni peclji so imeli najboljšo regeneracijo na istem gojišču (8,6 %), vendar so bili manj regenerativni kot internodiji. Listni diski so imeli najnižji odstotek regeneracije, vendar je bila regeneracija najbolj učinkovita na gojiščih z zeatin ribozidom 2 in 3 mg/l (4,2%). Ključne besede: hmelj, regeneracija, tkivna kultura, citokinin REGENERATION EFFICIENCY OF DIFFERENT EXPLANT TYPES OF HOP CV. AURORA ABSTRACT The regeneration capacity of different types of hop cv. Aurora explants (internodes, petioles and leaf disks) on three media with different cytokinines contents was tested. We managed to increase the regeneration efficiency on medium with a high cytokinin content and by the selection of a more responsive genotype. The highest rate of regeneration of internodal explants (17.7 %) was achieved with a more responsive genotype of cv. Aurora on medium supplemented with 2iP (N6-(2-isopentenyl) adenine) 6 mg/l. A lower efficiency of regeneration was observed with petioles as explants, with the best regeneration rate on the same medium (8.6 %). Leaf disks were the least responsive, with the highest rate of explants with shoots on medium with zeatin riboside 2 and 3 mg/l (4.2 %). Key words: hop, regeneration, tissue culture, cytokinin 1 asist., univ. dipl. ing. agr., Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Katedra za genetiko, biotehnologijo in žlahtnjenje rastlin, Jamnikarjeva 101, 1000 Ljubljana, Slovenija 2 izr. prof., dr., ibid 1 UVOD Učinkovita in vitro regeneracija je osnovni predpogoj za genske transformacije. Hmelj je za regeneracijo v tkivni kuturi težavna rastlina in le omejeno število avtorjev poroča o učinkoviti regeneraciji hmelja, največkrat preko oblikovanja kalusa na izsečkih. Objavljeni so postopki regeneracije bodisi pri divjih varietetah [1, 2], bodisi pri nekaj komercialnih sortah hmelja [9, 3, 7, 6, 12, 8]. Direktno regeneracijo dveh čeških kultivarjev hmelja sta dosegla Rakouskyin Matoušek[11]. O izboljšanju regeneracije slovenskega kultivarja Aurora poročajo tudi Ferant in sod. [5]. Različni izsečki (internodiji, listni peclji in listni diski) so bili različno odzivni, največjo sposobnost regeneracije so imeli večinoma internodiji in samo v enem primeru listni peclji [2]. Najpogosteje proučevani rastni hormoni za indukcijo regeneracije so bili indol-3-ocetna kislina (IAA), indole-3-maslena kislina (IBA), kinetin, 6-benzilaminopurin (BAP), zeatin ter tidiazuron (TDZ). Citokinini so najbolj vplivali na sposobnost regeneracije [12]. Vrsta in koncentracija uporabljenega citokinina je bila bistvena za organogeno sposobnost in vitro gojenih tkiv tudi pri drugih rastlinskih vrstah [4]. Uspešnost regeneracije pri hmelju je močno odvisna od genotipa [6], zato je potrebno prilagoditi protokol regeneracije za vsako sorto/kultivar posebej. Z visoko koncentracijo citokinina v regeneracijskem gojišču in selekcijo odzivnega genotipa smo poskušali zvišati odstotek regeneracije pri najbolj razširjeni slovenski sorti hmelja Aurora, ki se je že v prejšnjih raziskavah izkazala za slabo regenerativno sorto zzelo nihajočim odstotkom regeneracije [12, 5]. 2 MATERIAL IN METODE 2.1 Rastlinski material Uporabili smo rastline slovenske sorte hmelja Aurora iz kolekcije Inštituta za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije. Poganjke hmelja smo gojili in vitro na mikropropagacijskem gojišču v steklenih kozarčkih [5]. Vsake 6-8 tednov smo narezali hmelj na izsečke z nodiji in jih subkultivirali na sveže mikropropagacijsko gojišče in jih tako razmnožili. Rastline smo gojili v rastni komori pri 16/8 h (svetloba/tema) fotoperiodi in temperaturi 24±1°Cter osvetlitvi 40 |jmol m-2s-1. 2.2 Regeneracija Za učinkovitost regeneracije smo uporabili tri tipe izsečkov: internodije, listne peclje in listne diske sorte hmelja Aurora. Izsečke smo gojili v petrijevkah na treh različnih gojiščih pod istimi pogoji kot pri mikropropagaciji hmelja. Gojišča za regeneracijo so bila sestavljena kot je opisano v Okada in sod. [10] z izjemo vsebnosti citokinina, ki je bil pri gojišču A 2iP (N6-(2-izopentenil) adenin) v koncentraciji 6 mg/l, pri gojiščih B in C pa zeatin ribozid v koncentracijah 2 oz. 3 mg/l. Frekvenco regeneracije smo ocenjevali v dvo tedenskih intervalih do treh mesecev po inokulaciji izsečkov. Na vsako gojišče smo inokulirali vsaj 100 izsečkov vsakega tipa in poskus vsaj dvakrat ponovili in izračunali skupni odstotek regeneracije. Kot regenerativni izseček smo upoštevali tistega, ki je imel vsaj 1 cm velik regenerant oz. regenerante. Regenerante smo nato prestavili na gojišče za izdolževanje in koreninjenje poganjkov, enake sestave kot gojišče za mikropropagacijo, le namesto citokinina BAP smo dodali avksin IBA 0,1 mg/l. 3 REZULTATI Kalusno tkivo se je začelo formirati na koncih oz. reznih ploskvah internodijev v 8-10 dneh po inokulaciji. Na listnih pecljih se je formiralo zelo veliko kalusnega tkiva, več kot na internodijih, medtem ko je na listnih diskih nastalo le malo kalusa ob robovih listne oz. rezne ploskve. Prve organogene strukture - globule (slika 1a) so se začele pojavljati na kalusu že po 10-14 dneh po inokulaciji in prvi regeneranti (slika 1b) že po 8 dneh po inokulaciji na gojišču B in C ter po 20 dneh na gojišču A. Večina regenerantov je nastala v enem do dveh mesecih, največ v petem tednu po inokulaciji (slika 2 in 3). Slika 1: Regeneracija sorte hmelja Aurora na internodijih na gojišču A: a - organogene strukture na kalusu; b-regeneranti na kalusu Figure 1: Shoots of hop cv. Aurora emerging on internodal explants on medium A: a - organogenic structures on callus; b-shoots on callus 12 3 10 >w 2 0 - Internodiji - Listi Petiole 5 7 9 11 Tedni po inokulaciji Slika 2: Regeneracija sorte hmelja Aurora na internodijih, listnih pecljih in listnih diskih na gojišču A v dvotedenskih intervalih Figure 2: Regeneration of hop cv. Aurora from internodes, petioles and leaf disks explants on medium A in two weeks intervals 8 6 4 'P ro ca o a en > T3 O C ^ a C xn 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Gojišče A > Gojišče B —A— Gojišče C 7 9 11 Tedni po inokulaciji Slika 3: Regeneracija hmelja cv. Aurora na internodijih na gojiščih A, B in C v dvotedenskih intervalih Figure 3: Regeneration of hop cv. Aurora from internodes on media A, B in C in two weeks intervals Tri mesece po inokulaciji izsečkov na gojiščih za regeneracijo smo prešteli samo tiste izsečke, na katerih so nastali vsaj 1 cm dolgi poganjki (preglednica 1). Preglednica 1: Učinkovitost regeneracije iz internodijev, listnih pecljev in listnih diskov sorte hmelja Aurora na različnih gojiščih Table 1: Regeneration efficiency from internodes, petioles and leaf disks of hop cv. Aurora on different culture media Internodiji s poganjki* (%) Petiole s Listni diski s Gojišče Genotip Ostali poganjki* (%) poganjki* (%) RN/330 genotipi genotip RN/330 genotip RN/330 A 17,7 11,1 8,6 3,7 B 5,8 2,9 0 4,2 C 7,2 4,2 7,3 4,2 * Upoštevali smo samo izsečke z vsaj 1 cm velikimi poganjki Ugotovili smo, da je specifičen genotip Aurore, ki smo ga poimenovali RN/330, bolj odziven kot preostali genotipi, saj smo dobili višje odstotke internodijev s poganjki na vseh gojiščih in sicer 17,7 % na gojišču A, 5,8 % na gojišču B in 7,2 % na gojišču C (preglednica 1) v primerjavi s preostalimi genotipi, ki so imeli 11,1 %, 2,9 % oz. 4,2 % regenerativnih internodijev na gojiščih A, Boz. C. Odstotek regeneracije pri listnih pecljih je bil najvišji 8,6 % na gojišču A, 7,3% na gojišču C, na gojišču B pa regenerantov ni bilo (preglednica 1). Regeneracija poganjkov na listnih diskih je bila najboljša 4,2 % na gojiščih B in C, nekoliko nižja 3,7 % pa na gojišču A. 4 RAZPRAVAINSKLEPI Proučevali smo uspešnost regeneracije v tkivni kulturi sorte hmelja Aurora. Preizkusili smo odzivnost treh vrst izsečkov: internodijev, listnih pecljev in listnih diskov na treh gojiščih z različnovsebnostjocitokininov(2iP 6 mg/l; zeatin ribozid 2 in 3 mg/l). Regeneracija pri hmelju je močno odvisna od genotipa [6], zato smo poskušali dvigniti odstotek regeneracije s selekcijo odzivnejšega genotipa. Tudi drugi avtorji [1, 5] poročajo o razlikah v regeneracijski sposobnosti med različnimi genotipi in o problemih stabilne regeneracije. Sorta Aurora se je že v prejšnjih raziskavah izkazala za slabo odzivno sorto [12] z nizko regenerativno sposobnostjo. S predhodno regeneracijo in vitro iz internodijev (podatki niso prikazani) nam je uspelo pridobiti odzivnejši genotip (RN/330) Aurore, ki je pokazal na vseh preizkušenih gojiščih višji odstotek regeneracije kot preostali genotipi Aurore. Pri odzivnejšem genotipu RN/330 je bila dosežena stabilna regeneracija, ki je zelo malo variirala med ponovitvami, medtem ko je pri ostalih genotipih znotraj sorte Aurora odstotek regeneracije zelo nihal. Najvišji odstotek regeneracije (17,7 % internodijev s poganjki) smo dosegli na internodijih odzivnejšega genotipa na gojišču A z 2iP 6 mg/l v primerjavi s preostalimi genotipi, ki so na istem gojišču imeli le 11,1 % regeneracijo. Naš najvišji odstotek regeneracije je višji od doslej objavljenih rezultatov pri sorti Aurora. Ferant in sod. [5] poročajo o najboljši regeneraciji (12,5 %) pri Aurori na gojišču z dodatkom 3,5 mg/l citokinina BAP. Šuštar-Vozlič in sod. [12] so dosegli enak najvišji odstotek regeneriranih izsečkov (12,5 %) na gojišču z dodatkom 5 mg/l kinetina. Oboji poročajo, da so najbolj odzivni tip izsečkov internodiji, medtem ko so bili listni peclji manj odzivni, listi pa sploh ne. Tudi večina drugih avtorjev poroča o internodijih kot najprimernejših izsečkih za regeneracijo [11, 1, 6, 12, 8]. V našem primeru so imeli listni peclji najboljšo regeneracijo (8,6 %) na istem gojišču kot internodiji (gojišče Az 2iP 6 mg/l), vendar so bili manj regenerativni kot internodiji (17,7 %). Listni diski so imeli najnižji odstotek regeneracije, vendar je bila regeneracija najbolj učinkovita na gojiščih z zeatin ribozidom 2 in 3 mg/l (4,2 %). Listni peclji so bili najbolj regenerativni pri varieteti hmelja Eroica [2], nihče pa ne poroča o uspešni regeneraciji iz listnih diskov. Rezultati naše študije nam bodo služili kot osnova za novejše biotehnološke metode vnosa genov z namenom izboljšati agronomsko pomembne lastnosti (npr. odpornost na bolezni) v najbolj razširjeno slovensko sorto hmelja. 5 LITERATURA 1. Batista, D., Sousa, M.J., Pais, M.S., Plant regeneration from stem and petiole-derived callus of Humulus lupulus L. (hop) clone Braganga and var. Brewers's Gold.- In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant, 32(1996) s. 37-41. 2. Batista, D., Ascensao, L., Sousa, M.J., Pais, M.S., Adventitious shoot mass production of hop (Humulus lupulus L.) var. Eroica in liquid medium from organogenic nodule cultures.- Plant Science, 151(2000) s. 47-57. 3. Connell, S.A., Heale, J.B., Development of an in vitro selection system for novel sources of resistance to Verticillium wilt in hops.- V: Withers, L., Anderson, P.G. (ur.) Plant tissue culture and its agricultural applications. Butterworth, London, (1986) s. 451-459. 4. D'Onofrio, C., Morini, S., Development of adventitious shoots from in vitro grown Cydonia oblonga leaves as influenced by different cytokinins and treatment duration.- Biologia Plantarum, 49(2005) s. 17-21. 5. Ferant, N., Javornik, B., Luthar, Z., Regeneracija hmelja (Humulus lupulus L.) pri cv. Aurora.- Hmeljarski bilten, 8(2001) s. 19-25. 6. Gurriaran, M.J., Revilla, M.A., Tames, R.S., Adventitious shoot regeneration in cultures of Humulus lupulus L. (hop) cvs. Brevers Gold and Nugget.- Plant Cell Reports, 18(1999) s. 1007-1011. 7. Heale. J.B., Legg, T., Connell, S., Humulus lupulus L. (Hop): in vitro culture; attempted production of bittering components and novel disease resistance.- V: Bajaj, Y.P.S. (ur.) Biotechnology in agriculture and forestry. Springer, Berlin Heidelberg New York, (1989) s. 264-285. 8. Horlemann, C., Schwekendiek, A., Hohnle, M., Weber, G., Regeneration and Agrobacterium-mediated transformation of hop (Humulus lupulus L.).- Plant Cell Reports, 22(2003) s. 210-217. 9. Motegi, T., Differentiation of shoots from hop stem callus culture.- Kyoyubo kenkyu Neupo Iwate Ika Daigaku, 14(1979) s. 15-17. 10. Okada, Y., Saeki, K., Inaba, A., Suda, N., Kaneko, T., Ito, K., Construction of a gene expression system in hop (Humulus lupulus) lupulin gland using valerophenone synthase promoter.- Journal of Plant Physiology, 160(2003) s.1101-1108. 11. Rakousky, S., Matoušek, J., Direct organogenesis in hop-a prerequisite for the application of A. tumefaciens-mediated transformation.- Biologia Plantarum, 36(1994) s. 191-200. 12. Šuštar-Vozlič, J., Javornik, B., Bohanec, B., Studies of Somaclonal Variation in Hop (Humulus lupulus L.). Phyton-Annales Reis Botanica, 39(1999) s. 283-287. DOLOČANJE TRANSGENOV V HMELJU PO TRANSFORMACIJI Z Agrobacterium tumefaciens Suzana ŠKOF, Zlata LUTHAR2 UDK/UDC 633.791:579.64:57.084/.085 (045) izvirni znanstveni članek/original scientific article prispelo/received: 17. 10. 2005 sprejeto/accepted: 25. 11. 2005 IZVLEČEK V nodije hmelja sorte Aurora smo s posredno transformacijo z Agrobacterium tumefaciens vnesli testni gus (uidA) gen in rastlinski selekcijski nptIl gen. Izražanje testnega gus gena smo preverjali z metodo histokemičnega GUS testa aktivnosti p-glukuronidaze v poganjkih nastalih na transformiranih izsečkih. Na podlagi GUS testa je bilo 10,7 % nastalih regenerantov uspešno transformiranih. Z molekulsko analizo modro obarvanih regenerantov (GUS pozitivnih regenerantov) smo s PCR metodo (polimerazno verižno reakcijo) preverili vključenost testnega in selekcijskega gena v rastlinski genom in v večini primerov potrdili vključenost obeh transgenov. Ključne besede: hmelj, transformacija, Agrobacterium tumefaciens, gus gen, nptII gen IDENTIFICATION OF TRANSGENES IN HOP AFTER Agrobacterium-MEDIATED TRANSFORMATION ABSTRACT Agrobacterium-mediated transformation of hop nodal explants was used forthe introduction of a gus (uidA) marker gene and nptII plant selection gene into commercial hop cv. Aurora. Expression of the gus gene was evaluated by histochemical analysis of p-glucoronidase (GUS) activity in shoots that emerged on transformed hop explants. GUS staining revealed a relatively high transformation efficiency (10.7 % of all regenerants). Molecular analysis of blue coloured plants (GUS positive regenerants) by the PCR method (polymerase chain reaction) was used to detect integration of marker and selection genes into the hop genome and in the majority of cases confirmed the integration of both transgenes. Key words: hop, transformation, Agrobacterium tumefaciens, gus gene, nptII gene asist., univ. dipl. ing. agr., Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Katedra za genetiko, biotehnologijo in žlahtnjenje rastlin, Jamnikarjeva 101, 1000 Ljubljana, Slovenija 2 izr. prof., dr., ibid 1 UVOD Novejše biotehnološke metode genskih transformacij predstavljajo dopolnitev in privlačno alternativo klasičnemu žlahnjenju hmelja, ki je dolgotrajen postopek tudi zaradi specifičnih lastnosti (dvodomna trajnica). Genske transformacije omogočajo relativno hitro vključitev željenih lastnosti v genom že obstoječih sort hmelja ne da bi spremenili njihove kvalitativne agronomsko pomembne lastnosti. Predpogoj za učinkovit vnos željenih genov je visok odstotek regeneracije in vitro. Le nekaj avtorjev poroča o uspešni regeneraciji hmelja, največkrat preko oblikovanja kalusa na izsečkih, bodisi divjih varietet [1, 2] ali komercialnih sort hmelja [3]. O direktni regeneraciji dveh čeških kultivarjev hmelja poročata Rakousky in Matoušek [13]. Le nekaj objav poroča o začetkih transformacij pri hmelju. Dosedaj so dosegli le prehodno izražanje gus testnega gena v kalusnem tkivu [12] in stabilno izražanje gus testnega gena in to samo pri dveh tesno sorodnih genotipih hmelja Tettnanger in Saaz [5, 11]. Ker je regeneracija pri hmelju močno odvisna od genotipa [3], je potrebno razviti modificiran protokol regeneracije in posledično transformacije za vsako sorto/kultivar posebej. Do sedaj ni poročil o uspešni regeneraciji in transformaciji katerekoli slovenske sorte oz. divje oblike hmelja. V raziskavi smo poskušali vzpostaviti učinkovit transformacijski sistem s pomočjo posrednega vnosa genov z bakterijo Agrobacterium tumefaciens pri najbolj razširjeni slovenski sorti hmelja Aurora. Izražanje vnešenega testnega gus (p-glukuronidaza) gena smo preverili s histokemičnim GUS testom, vključitevtestnega in selekcijskega nptII (odpornost na antibiotik kanamicin) gena v rastlinski genom s PCR analizo. 2 MATERIAL IN METODE 2.1 Rastlinski material, kokultivacija z Agrobacterium in regeneracija transformiranih rastlin Iz in vitro gojenih rastin sorte hmelja Aurora smo narezali nodije in jih gojili tri dni na regeneracijskem gojišču z MS [10] makro in mikroelementi ter vitamini z dodanim inozitolom 100 mg/l, glukozo 20 g/l, TDZ 1 mg/l, IAA0,025 mg/l, acetosiringonom 100 mM inagarjem 8 g/l; pH 5,8. V tekočem YEB gojišču smo gojili do logaritemske faze rasti Agrobacterium tumefaciens sev LBA4404 z vnešenim pCAMBIA2201 plazmidom, ki je vključeval testni gus gen z intronom in selekcijski nptII gen, oba pod kontrolo CaMV 35S promotorja. Izsečke hmelja - nodije smo potopili v suspenzijo z Agrobacterium (10 min), izpostavili ultrazvoku (60 s) in vakuumu (10 min) ter nato še pustili v bakterijski suspenziji (10 min), posušili na sterilnem filterskem papirju in prestavili na regeneracijsko gojišče s 100 mM acetosiringonom. Po treh dneh kokultivacije smo izsečke sprali z raztopino antibiotika timentin [100:1 tikarcilin : klavulonska kislina] 200 mg/l, osušili na sterilnem filtrskem papirju in prestavili na regeneracijsko gojišče s timentinom 150 mg/l, da bi preprečili rast Agrobacterium. Gojili smo jih v rastni komori pri 16/8 h (svetloba/tema) fotoperiodi, temperaturi 24±1°Cinosvetlitvi 40 jmol m-2s-1. 2.2 Histokemični test aktivnosti gus gena S histokemičnim GUS testom smo testirali aktivnost gus gena v listih novo nastalih poganjkov na kalusnem tkivu. Obarvanje z raztopino X-Gluc (5-bromo-4-kloro-3-indolil glukoronid) smo izvedli 110 dni pookuževanju izsečkovzAgrobacterium [6,4]. Celice, v katerih se izraža gus gen, se obarvajo modro. 2.3 Molekulska analiza rastlinskega materiala s PCR metodo Celokupno genomsko DNA smo izolirali iztransfomiranih poganjkov z izraženim gus genom in kontrolnih netransformiranih rastlin po protokolu s CTAB detergentom [7]. Koncentracijo izolirane DNAsmo določili z mini DNAfluorometrom(TKO 100) in jo razredčili na 20 ng/jl. S PCR analizo smo preverili vključitev testnega in selekcijskega gena. Uporabljeni specifični začetni oligonukleotidi (GUS3for/GUS3rev, NPTIIa/NPTIIb) so bili narejeni za pomnožitev fragmenta 408 bp pri gus oz. fragmenta 650 bp pri nptII genu. PCR reakcijska mešanica je vsebovala 1xPCR pufer, 0,1 mM vsakega deoksinukleotid trifosfata, 0,5 mM ustreznega začetnega oligonukleotida (GUS ali NPT), 1 enoto Taq DNA polimeraze in ustrezen volumen DNA vzorca. Namnoževanje DNA je potekalo v cikličnem termostatu (Thermal Cycler 480) po modificiranem temperaturnem profilu [8]: začetna denaturacija DNA pri 94 °C 5 min, nato 35 ciklov: 1 min pri 94 °C, 1 min pri 58 °C in 1,5 min pri 72 °C ter končno izdolževanje fragmentov 5 min pri 72 °C. Namnožene fragmente smo ločevali na 1,4 %agaroznem gelu in vizualiziralizetidijevim bromidom pod UV svetlobo. 3 REZULTATI 110 dni po okužbi izsečkov z Agrobacterium tumefaciens smo z GUS testom preverili izražanje testnega gus genavregeneriranih poganjkih nastalih na kalusnem tkivu. Med 475 testiranimi poganjki jih je imelo 51 vsaj eno modro točko (preglednica 1) in od teh 14 intenzivnejše modro obarvanje. Preglednica 1: GUS test na listih poganjkov, nastalih na izsečkih sorte hmelja Aurora 110 dni po okužbi z Agrobacterium Table 1: GUS-assay of shoots's leaves formed on explants of hop cv. Aurora performed 110 days afterAgrobacterium-mediated transformation Testirani poganjki GUS pozitivni* poganjki Odstotek transformacije (%) 475 51 10,7 *Vsaj ena modra točka Pri 47 GUS pozitivnih poganjkih jih je bilo 14 intenzivneje modro obarvanih in 33 z vsaj eno modro točko. Pri teh smo preverili vključitev testnega gus in selekcijskega nptII gena v rastlinski genom s PCR metodo (slika 1). Rezultati so prikazani v preglednici 2. Preglednica 2: PCR analiza 47 z GUS testom pozitivnih regenerantov hmelja Table2: PCR analysis of 47 with GUS-assay positive hop regenerants Štev. regenerantov Vgrajeni transgeni z vgrajenimi transgeni gus in nptII samo gus samo nptII brez obeh 14 intenzivno modro obarvanih 10 1 1 2 regenerantov 33 regenerantov z le nekaj modrimi 22 3 3 5 točkami Od 14 analiziranih poganjkov, ki so bili intenzivneje modro obarvani z GUS testom, jih je imela večina, kar 71,4 % vgrajen tako testni (gus) kot selekcijski (nptII) gen, 7,1 % samo gus ali samo nptII gen in 14,3 % nobenega od transgenov. Podobno smo pri 33 poganjkih z le nekaj modrimi točkami zaznali večinoma prisotnost obeh transgenov (66,7 %), 9,1 % jih je vsebovalo le enega od obeh transgenovter 15,1 % nobenega. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 K P M Slika 1: PCR analiza vključitve testnega gus (a) in selekcijskega nptII (b) gena v genom 21 transformiranih regenerantov hmelja. 1 do21 -transformirane rastline, K-netransformirana rastlina, P-plazmid pCAMBIA2201, M - markerGeneRuler 100bp DNA Ladder(Fermentas) Figure 1: PCR analysis of marker gus (a) and selection nptII (b) gene integration into genome of 21 transformant hop regenerants. 1 to 21 - trasformed hops; K - control plant, P - pCAMBIA2201; M -markerGeneRuler 100bp DNA Ladder(Fermentas) Iz slike 1 je razvidno, da se pri transformantih št. 2 in 14 ni namnožil DNA fragment pribl. dolžine 408 bp (gus gen) (slika 1a), medtem ko se je namnožil DNA fragment pribl. dolžine 650 bp, ki potrjujejo vključenost nptIl gena (slika 1b). Pri transformantu št. 21 pase je ravno obratno namnožil DNA fragment, ki potrjuje vključenost gus gena (slika 1a), ni pa fragmenta nptIl gena (slika 1b). 4 RAZPRAVA IN SKLEPI GUS test smo izvedli več kot tri mesece po okužbi izsečkov hmelja z A. tumefaciens, zato je modro obarvanje testiranih regeneriranih poganjkov pokazalo ne le prehodno temveč stabilno izražanje testnega gus gena. Testirani listi nekaterih transgenih regenerantov so imeli večja intenzivno modra področja, drugi le nekaj modrih točk. Opazili smo tudi modro obarvanje pretežno v žilnem tkivu, kar so opazili tudi pri drugih rastlinskih vrstah [9]. Intenzivnost in vzorec modrega obarvanja sta odvisna od mesta vključitve in števila kopij gus gena, ki se naključno vgradi v rastlinski genom in od opremeljenosti gena s promotorjem. Na podlagi GUS testa smo dobili relativno visokodstotek uspešnosti transformacije (10,7% vseh na izsečkih nastalih regenerantov). Horlemann in sod. [5] poročajo o 2,9 % GUS pozitivnih organogenih skupkih. PCR se lahko uporablja kot rutinsko analitično orodje za hitro analizo prisotnosti transgenov v transformiranih rastlinah. Ker je bil gus gen v našem primeru opremljen z intronom, kateri onemogoča izražanje gena v bakteriji, so bili preprečeni PCR lažno pozitivni rezultati zaradi možne kontaminacije rastlinskega materiala z Agrobacterium, ki lahko ostane v kulturi. Od testiranih 47 GUS pozitivnih regenerantov jih je imela večina, kar 70% vgrajena tako testni kot selekcijski gen, manjši del 8 % le enega od obeh in 14 % nobenega od obeh (pregledica 2). Pri transformaciji se vgradi v rastlinski genom celotni genski konstrukt (v našem primeru gus in nptll gen). V primerih, ko smo detektirali le enega od obeh transgenov, je lahko prišlo do mutacij/delecij ali modifikacij samo v enem delu genskega konstrukta, še posebej je to verjetneje za nptll gen, kerv gojišču za regeneracijo ni bilo selekcijskega antibiotika. Lahko je šlo tudi za himerno tkivo (samo del celic je bil uspešno tranformiran) in je sčasoma netransformirano tkivo preraslo transgeno tkivo, kar se je najverjetneje zgodilo tudi v primerih, ko v predhodno GUS pozitivnih regenerantih nismo detektirali nobenega od transgenov. Horlemann in sod. [5] so s PCR preverili vključitev le selekcijskega nptll gena in ugotovili, da so imeli vsi GUS pozitivni organogeni skupki, ki so rasli na selekciji tudi vključen selekcijski (nptll) gen. V primeru, če se genski konstrukt vgradi na mesto v genom, ki ni kodirajoče se ga lahko dokaže z molekulskimi analizami, vendar se gen ne izraža, ni funkcionalen in ne zasledimo produkt oz. lastnost. Stabilnost transgena je potrebno testirati tako na DNA nivoju, kot njegov produkt oz. produkte tudi na potomcih. Vzpostavljeni transformacijski protokol je prvi objavljeni pri slovenski sorti hmelja Aurora in nam bo služil kot osnova za vnos agronomsko pomembnih lastnosti (npr. odpornost na bolezni) v najbolj razširjeno slovensko sorto. 5 LITERATURA 1. Batista, D., Sousa, M.J., Pais, M.S., Plant regeneration from stem and petiole-derived callus of Humuluslupulus L. (hop) clone Bragangaand var. Brewers's Gold.-In Vitro Cellularand Developmental Biology- Plant, 32(1996)s. 37-41. 2. Batista, D., Ascensao, L., Sousa, M.J., Pais, M.S., Adventitious shoot mass production of hop (Humulus lupulus L.) var. Eroica in liquid medium from organogenic nodule cultures.- Plant Science, 151(2000) s. 47-57. 3. Gurriaran, M.J., Revilla, M.A., Tames, R.S., Adventitious shoot regeneration in cultures of Humulus lupulus L. (hop) cvs. Brevers Gold and Nugget.- Plant Cell Reports, 18(1999)s. 1007-1011. 4. Hiei, Y., Ohta, S., Komari,T., Kumashiro, T., Efficient transformation of rice (Oryzasativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.-The Plant Journal, 6(1994)2,s. 271-282. 5. Horlemann, C., Schwekendiek, A., Hohnle, M., Weber, G., Regeneration and Agrobacterium-mediated transformation of hop (Humulus lupulus L.).- Plant Cell Reports, 22(2003)s. 210-217. 6. Jefferson, R.A., Kavanagh, T.A., Bewan, M.W., GUS fusions: a-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.- The EMBO Journal, 6(1987) s. 3901-3907. 7. Kump, B., Svetek, S., Javornik, B., Izolacija visokomolekularne DNA iz rastlinskih tkiv.- Zbornik Biotehniške fakultete UniverzevLjubljani, Kmetijstvo, 59(1992)s. 63-66. 8. Lakshmi, S.G., Sreenivas, G.L., Bhattacharya, A., Agrobacterium mediated transformation of sandalwood (Santalum album L.) a tropical forest tree.- Plant TissueCultureandBiotechnology, 4(1998)s. 189-195. 9. Mercuri, A., De Benedetti, L., Burchi, G., Schiva, T., Agrobacterium-mediated transformation of African violet.- Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 60(2000) s. 39-46. 10. Murashige, T., Skoog, F., A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.-PhysiologiaPlantarum, 15(1962) s. 473-497. 11. Okada, Y., Saeki, K., Inaba, A, Suda, N., Kaneko, T., Ito, K., Construction of a gene expression system in hop (Humulus lupulus) lupulin gland using valerophenone synthase promoter.-Journal of Plant Physiology, 160(2003)s. 1101-1108. 12. Oriniakova, P., Pavingerova, D., Matoušek, J., Methodical aspects of hop Humulus lupulus L.) genetic transformation.-RostlinnaVyroba, 45(1999) s. 219-227. 13. Rakousky, S., Matoušek, J., Direct organogenesis in hop-a prerequisite for the application of A. tumefaciens-mediated transformation.- Biologia Plantarum, 36(1994)s.191-200. MOLEKULARNO GENETSKE RAZISKAVE HMELJA Branka JAVORNIK1 UDC/UDK 633.791 : 631.522/.524 (045) review article/pregledni znanstveni članek prispelo/received: 24. 10. 2005 sprejeto/accepted: 15. 11. 2005 IZVLEČEK V članku so predstavljene molekularno genetske raziskave hmelja, ki so bile opravljene z namenom prispevati k učinkovitejšemu žlahtnjenju novih sort hmelja. Kratko bodo opisane metode molekulskih markerjev, razvite za proučevanje hmelja ter rezultati vrednotenja genske variabilnosti kolekcije hmeljnih genotipov in akcesij v genski banki. Predstavljeni bodo rezultati kartiranja genoma hmelja za natančnejšo opredelitev genskih dejavnikov, ki pogojujejo visoko vsebnost alfa kislin ter odpornost na hmeljevouvelost. Ključne besede: hmelj, Humulus lupulus L., molekulski markerji, genetska variabilnost, kartiranje genoma GENETIC RESEARCH ON HOPS ABSTRACT Hop growing has a tradition of more than 100 years in Slovenia, and there is significant agricultural production oriented towards export. The Slovenian Institute for Hop Research and Brewing (SIHRB) has released eleven hop varieties, four of which occupythe majority of hop fields in Slovenia. Such a varietal structure emphasizes the importance of "regional" hop breeding and the adaptation of hop varieties to specific growing conditions. Hop genetic studies have been set up in orderto assist the hop breeding program at the SIHRB. The main approach of genetic research is rational use of the genetic diversity available from the hop germplasm collection, and gene incorporation or introgression by means of hop genome mapping, marker-assisted selection and/or cloning. Major effort is directed towards improving hop quality (resin content) and resistance to biotic stresses (Verticillium wilt and hop Damson aphid). We present a review on our research work on the development of the hop molecular markers, on the assessment of genetic variability and genome mapping and analysis of QTL markers. Key words: hop, Humulus lupulus L., molecular markers, genetic variability, genome mapping Dr. Branka Javornik, redna profesorica za genetiko in biotehnologijo, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Jamnikarjeva 101, 1000 Ljubljana. 1 UVOD Hmelj v Sloveniji pridelujemo že več kot 100 let in je pomemben kmetijski pridelek, ki je večinoma namenjen izvozu. Vse sorte hmelja so bile požlahtnjene na Inštitutu za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije v Žalcu (IHPS) pod vodstvom žlahtniteljice dr. Dragice Kralj. Danes pridelujejo na 1462 ha hmeljišč (in 416 ha premene) pretežno slovenske sorte. Največ je sorte Aurora na več kot 60% hmeljskih površin, sledijo ji Savinjski golding (15%), Bobek (10%), Celeia (5%) in ostale. Moderna introducirana nemška sorta Magnum se prideluje samo na 5% površin. Ta sortna sestava poudarja pomen regionalnega žlahtnjenja hmelja zaradi prilagoditve kulture na specifične rastne razmere. Zadnje nove sorte hmelja so bile potrjene leta 1990 in v preteklem obdobju se je pokazala potreba po novih kultivarjih, zato je žlahtniteljski program ponovno oživel. Sedanji žlahtniteljski program je usmerjen k razvoju sort hmelja z izboljšano kvaliteto (visoka vsebnost alfa kislin), z odpornostjo na pomembnejše povzročitelje glivičnih bolezni (Verticillium spp., Pseudoperonospora humuli, Sphaero-theca humuli) in škodljivce (Phorodon humuli) ter združuje klasično žlahtnjenje z molekulskimi metodami. S pojavom zeloviruletnega patotipa (PG2) glive V. albo-atrum v letu 1997, ki povzroča letalno obliko hmeljeve uvelosti in posledično propadanje hmeljišč, ta bolezen predstavlja resno grožnjo vsem hmeljarskim območjem Slovenije. Najuspešnejši način ohranjanja in obnovitve proizvodnje hmelja na okuženih območjih predstavlja vzgoja odpornih oz. tolerantnih sort, saj za zatiranje hmeljeve uvelosti ni na voljo ustreznih fitofarmacevtskih pripravkov. Ker do nedavnega bolezen ni bila gospodarsko pomembna tudi ni bila vključena v predhodne žlahniteljske programe, kar je glavni razlog za neodpornost večine slovenskih sort, ki so komercialno zanimive. Tako sedaj ta bolezen narekuje smeri pri žlahtnjenju novih sort hmelja, saj je potrebno poleg drugih lastnosti (npr. visoka vsebnost alfa kislin) vključiti v sorte tudi dejavnike odpornosti na Verticillium. Težava pri žlahtnjenju hmelja je njegova dolgotrajnost, saj traja vzgoja novih sort najmanj 10 let. Splošni interes panoge je čimhitrejši odziv žlahtnjenja na potrebe pridelovalcev in na zahteve industrije. Pri razširjenih poljščinah in hortikulturnih rastlinah seje izkazalo, da lahko sodobni molekulsko genetski pristopi bistveno prispevajo k učinkovitejši vzgoji izboljšanih novih kultivarjev. Zatosmotudi pri hmelju zastavili molekulsko genetski program, ki naj bi prispeval k boljšemu poznavanju lastnosti pomembnih za ekonomsko opravičeno pridelovanje hmelja ter za razvoj molekulskih orodij, ki bi lahko neposredno služila v žlahtnjenju hmelja. Program je sestavljen iz posameznih med seboj dopolnjujočih sklopov in sicer: - Razvoj molekulskih markerjev hmelja. - Vrednotenje genetske variabilnosti hmelja. - Izdelava genskih kart za identifikacijo markerjevvezanih zvisoko vsebnostjo alfa kislin, odpornostjo na Verticillium in za določevanje kandidatnih genov. - Uporaba genetskih informacij vžlahtnjenju s pomočjo markerjevali pri eventualnih genskih transformacijah. 1. 1 Razvoj molekulskih markerjev hmelja Molekulski markerji izpolnjujejoveliko lastnosti, ki so želene pri vrednotenju genetske variabilnosti naravnih ali selekcioniranih populacij, za DNAtipiziranje v identifikacijskih namenih ali za kartiranje genomov. Te lastnosti so predvsem visok polimorfizem, velika pogostnost v genomu, neodvisnost od vplivov okolja, visoka informativnost, relativno preproste tehnike in visoka ponovljivost določevanja, možnost izmenjave podatkov med laboratoriji itd. Karakterizacija genetske variabilnosti ali polimorfizma populacije (kultivar, klon, linija, akcesija) rastlin je pomembna, ker genetska raznolikost znotraj populacije ali vrste določa nivo prilagajanja na modifikacije in širino odzivnosti za izboljšanje kulturnih rastlin. S pričetkom raziskovalnega dela pri hmelju smo razpolagali predvsem z metodološko preprostejšimi molekulskimi metodami kot je na primer RAPD metoda (naključno namnožena polimorfna DNA; RAPD markerji). Z RAPD markerji, ki so se izkazali ustrezni pokazatelji polimorfizma, smo vrednotili raznolikosti in sorodstvene odnose tako med domačimi sortami [7] kot tudi med genotipi zbranimi v obsežni kolekciji hmeljnih kultivarjev [25]. Zaradi večje informacijske vrednosti drugih molekulskih markerjev smo pričeli najprej z uporabo mikrosatelitov (SSR markerji), ki so jih razvili za hmelj avstralski raziskovalci [10] in nato z razvojem in karakterizacijo lastnih mikrosatelitskih lokusov pri hmelju [9, 19, 24]. Vpeljan je bil tudi AFLP (polimorfizem dolžine pomnoženih restrikcijskih fragmentov) markerski sistem, najprej z barvanjem s srebrom [10] in nato z avtomatsko fluorescenčno detekcijo [23], ki omogoča relativno hitro analizo genoma brez predhodnega poznavanja nukleotidnih zaporedij. Za uporabo AFLP markerjev pri različnih organizmih pa so bile potrebne posamezne optimizacije postopkov [17]. Za izvajanje tovrstnih analiz smo morali v laboratoriju uvesti nove molekulske metode in ustrezno opremiti laboratorij za učinkovito delo. Izolacija in karakterizacija mikrosatelitskih markerjev se je izkazala kot delovno in finančno obsežna naloga, vendar nadaljujemo z izdelavo novih SSR markerjev hmelja, ker so se glede na naše in tuje izkušnje ravno ti markerji izkazali kot nepogrešljivi in visoko informativni predvsem pri kartiranju genoma heterozigotnih rastlin kot je hmelj. Sedaj razpolagamo z okoli 40 uporabnimi SSR markerji hmelja, sekvenciranih pa je že večje število klonov iz obogatenih SSR knjižnic, pripravljenih za optimizacijske postopke genotipizacije hmelja. Zaključimo lahko, da smo v preteklem obdobju naredili dober metodološki napredek ter da razpolagamo z zadovoljivo opremo in znanjem tudi za zahtevnejše molekulske analize rastlin in rastlinskih patogenov. Molekulske metode so bile tudi praktično uporabljane za identifikacijske namene pri določanju pristnosti hmeljnih kultivarjev [3], določevanju spola [1], iskanju markerjev povezanih z odpornostjo na hmeljevo uš [2], pri nejasnostih označb akcesij divjega hmelja v genski banki [8] in pri identifikaciji hmeljnih patotipov glive V. albo-atrum [18,19]. 1.2 Vrednotenje genetske variabilnosti hmelja Sodobni hmeljni kultivarji so vzgojeni s križanji, ki so omogočila vnos in kombiniranje lastnosti, kot so pridelek, hmeljna grenčica in aroma ter za odpornosti na bolezni in škodljivce. Sedanja žlahniteljska praksa uporablja pri ustvarjanju novih kombinacij različnih lastnosti kot izhodiščni žlahniteljski material hmeljne kultivarje, žlahniteljske linije in divje hmelje, ki izražajoželjene lastnosti, običajno ocenjene sfenotipskimi znaki. Današnji osnovni žlahnteljski material se vzdržuje v kolekcijah hmeljne dednine s katerimi razpolagajo največji žlahniteljski centri hmelja med njimi tudi IHPS. V teh kolekcijah je ohranjena biodiverziteta hmelja, ki se je generirala skozi daljša obdobja načrtne selekcije in žlahtnjenja ter z zbiranjem divjih akcesij hmelja. Za učinkovitejšo uporabo ohranjene biodiverzitete za vzgojo novih sort hmelja pa je potrebno natančno poznavanje obsega in porazdelitve obstoječe genetske variabilnosti ter genetskih odnosov med razpoložljivimi hmeljnimi genotipi. Za opis kolekcij hmelja in vrednotenje genetske diverzitete hmelja so se največ uporabljali morfološki in kemijski podatki. Posebnega pomena so kemijski parametri, ker so neposredno povezani s kakovostjo hmelja. Te vrste raziskav so nedvoumno opredelile razdelitev hmeljnih akcsesij v geografsko ločene skupine [21, 22] ter hmeljne kultivarje v skupine, ki so odražali njihovo geografsko poreklo in njihove kakovostne lastnosti [13, 6]. Te raziskave so razdelile hmelj na dve osnovni veliki, geografsko ločeni skupini, ameriški grenčični hmelj in evropski aromatični hmelj, ter na skupino sodobnih, hibridnih hmeljnih kultivarjev. Prva vrednotenja genetske diverzitete hmeljnih akcesij z molekulskimi markerji je izvedlanašaskupinainpozneješedrugeštudije[25, 20,10,16]. RAPD in AFLP analize so nedvoumno potrdile ločitev hmeljne dednine v dve geografski skupini, evropsko in severno-ameriško, ter znotraj evropske skupine genetsko opredelile grupiranje hmeljnih kultivarjev v podskupine, ki so odražale preteklo žlahniteljsko prakso v posameznih regijah (Anglija, Bavarska, Češka) ali značilnosti žlahniteljskih programov (Slovenija, ZDA, Anglija, Japonska, Nova Zelandija, Avstralija). Molekulsko genetske študije so relativno dobro opredelile raznolikosti in variabilnosti ženskih kultiviranih akcesij v hmeljnih kolekcijah. Manj raziskav pa je bilo opravljenih na divjih hmeljih ter moških akcesijah. Med temi raziskavami je zanimiva molekulska analiza diverzitete geografsko raznolikih divjih hmeljev[15,16], ki predvideva, da sta se ameriški in evropski hmelj ločila pred 1.05 do 1.27 milijoni let ter, da so zaznavne tudi variabilnost znotraj teh dveh geografskih skupin. Za žlahnitelje pa je lahko zanimiv podatek o stopnji raznolikosti med kultiviranim in divjim hmeljem, kar je analizirala naša skupina [12]. Za evropski hmelj je bilo ugotovljeno, da se divji in kultiviran hmelj sicer signifikantno razlikujeta, vendar se nahaja vsa diverziteta znotraj obeh skupin, ki izkazujeta približno enako stopnjo variabilnosti. Ali povedano drugače, variabilnost med hmeljnimi kultivarji je enako velika kot variabilnost med divjimi akcesijami, vendar se obe dve variabilnosti razlikujeta, s čimer se nakazuje, da divje akcesije vsebujejo še neuporabljen vir genetske variabilnosti. Dosedanja proučevanja genetske raznolikosti hmelja so prinesla znanja in rezultate, ki so potencialno uporabni v žlahtnjenju hmelja. Vendar je za efektivno uporabo diverzitete s pomočjoasocijacijskih študij, posebnoza obvladovanje kompleksnih, ekonomsko pomembnih lastnosti, kot je vsebnost alfa kislin, potrebno natančno poznavanje populacijske strukture znotraj kolekcij genskih virov za identifikacijo in pravilno interpretacijo povezav med funkcijsko in molekulsko diverziteto. To je eden izmed možnih načinov kako genetsko definirati kompleksno lastnostvendarsozato potrebne nadaljnje študije. 1.3 Kartiranje genoma hmelja Za kartiranje genoma hmelja smo se odločili, ker želimo poiskati markerje vezane za kvantativne lokuse, ki so povezani z visoko vsebnostjo alfa kislin ter za določitev markerjev vezanih za odpornost na Verticillium. Identifikacija obeh vrst markerjev bi služila neposredno v žlahnjenju hmelja in bi lahko bistveno doprinesla k učinkovitosti in krajšemu času vzgoje novih sort hmelja. Poleg tega želimo poiskati gen(e), ki pogojujejo odpornost na Verticillium in tako proučiti molekularne mehanizme patogeneze, ker bi le poznavanje in razumevanje teh mehanizmov omogočilo dolgoročnejše reševanje hmeljeve uvelosti. Genske karte, dobljene s primerjavo rekombinacijskih frekvenc med pari markerjev, omogočajo proučevanje dedovanja kromosomskih regij pri kontroliranem križanju. Z razvojem molekularnih tehnikse je število markerjev zelo povečalo, kar je omogočilo izdelavo genskih kart vezanih markerjev pri večini agronomsko pomembnih rastlinah, kot so ječmen, koruza, riž, soja, solata, krompir, paradižnik itd. Saturirane karte so uporabne za kartiranje monogenih lastnosti kot tudi za razčlenitev kvantitativnih lastnosti. Osnovni princip kartiranja za obe vrsti lastnosti je podoben, to je tesna vezanost med markerjem in fenotipom ter skupna segregacija pri kontroliranem križanju. Tako določeni vezani markerji nam nato lahko služijo v žlahtnjenju s pomočjo markerjev (MAS, marker assissted selection). Monogene lastnosti z lahko določljivim fenotipom, kot na primer nekatere bolezni, je relativno enostavno vključiti v gensko karto. Kartiranje kvantitativnih lastnosti (QTL) je bolj kompleksno, ker jih pogojuje več genov, katerih ekspresija je večkrat odvisna od zunanjih dejavnikov. S pomočjo saturiranih genskih kart je možno tudi izolirati gene na osnovi njihove lokacije na kromosomu brez poznavanja njihovega produkta in sicer z metodo pozicijskega kloniranja, kjer z identifikacijo tesno vezanih markerjev na obeh straneh željenega gena določimo segment DNAz genom. Za kartiranje kvantitativnih lokusov za vsebnost alfa kislin smo uporabili F1 družino potomcev križanja Magnum x 2/1 ter AFLP in SSR markerje. Ta družina je segregirala kvantitativno glede vsebnosti alfa kislin določene v letih 2002, 2003, in 2004. Najprej smo izdelali moško in žensko gensko karto vezanih markerjev, nato pa smo z analizo kvantitativnih lastnosti določili štiri (alphal, alpha2, alpha3 in alpha4) kvantitativne markerje kot pokazatelje vsebnosti alfa kislin. Najbolj obetaven za uporabo v žlahtnjenju je marker alpha2, ker se nahaja na genski karti skupaj z enim izmed AFLP markerjev [4, 5]. Pri tem kartiranju smo dobili zelo dobre prve rezultate in bomo z delom nadaljevali z nanašanjem večjega števila SSR markerjev na regije kvantitativnih markerjev ter s testiranjem njihove stabilnosti tako da pričakujemo neposredno uporabne rezultate v bližnji prihodnost. Za kartiranje genov za odpornost na hmeljevo uvelost je bila vzgojena družina križancev iz odporne sorte Wye Target in domačega občutljivega moškega hmelja 2/1. Izdelava genske karte in iskanje vezanih markerjev je relativno zahteven projekt zaradi obsežnosti dela pri multiplikaciji križancev v družini in ocenjevanju bolezenskih znakov. Družina je posajena na poskusnem polju in razmnoženi so bili potaknjenci za testiranje na odpornost na hmeljevo uvelost. Opravljena so bila predhodna testiranja na testnih kultivarjih za ocenjevanje stopnje okuženosti hmelja z letalnim patotipom Verticillium albo-atrum v rastnih komorah in pripravljena je shema okuževanja in ocenjevanja bolezenskih znakov za 90 križancev družine. V laboratoriju pa se izvaja genotipizacija 156 križancev z novimi SSR markerji. Oprejemljivejši rezultati bodo v prihodnjem letu, v prvi fazi pa pričakujemo identifikacijo vezanih markerjev za odpornost na Verticillium. 2 ZAKLJUČEK V prispevku so prikazani rezultati in tekoče delo programa genetskih raziskav hmelja z namenom seznaniti širši krog zainteresiranih za tovrstne raziskave, ki naj bi prispevale k boljšemu poznavanju lastnosti pomembnih za ekonomsko opravičeno pridelovanje hmelja terza razvoj molekulskih orodij, ki bi lahko neposredno služila v žlahtnjenju hmelja. V prikazu niso zajete raziskave, ki se nanašajo na iskanje analognih sekvenc rezistentnih genov v hmelju ter proteomske raziskave odpornosti hmelja na hmeljevo uvelost. Z dosedanjimi rezultati smo lahko delno zadovoljni predvsem zaradi tega, ker bi želeli povečati obseg in učinkovitost dela. Ta pa žal v veliki meri zavisi od razpoložljivih kadrovskih in finančnih zmožnosti. Vsekakor pa je program genetskih raziskav hmelja primer uspešnega medinštitutskega sodelovanja med Inštitutom za hmeljarsvo in pivovarstvo Slovenije in Biotehniško fakulteto ter dobrega dela mnogih sodelavcev programa. ZAHVALA Za navedene rezultate v prispevku so zaslužni dr. Andreja Čerenak, dr. Jernej Jakše, dr. Sebastjan Radišek, Branka Juvančič, dr. Zlatko Šatovič, dr. Jelka Šuštar-Vozlič ter številni drugi sodelavci z IHPSinKatedrezagenetiko, biotehnologijo in žlahtnjenje rastlin, BF. 3 VIRI 1. Čerenak, A., Jakše, J., Javornik, B., Application of sex-linked marker in hop (Humulus lupulus L.) breeding.-V: Glavač Damjan (ur.), Ravnik-Glavač (ur.). 2nd Congress of Genetic Society of Slovenia with International Participation, Bled, September 1317, 2000. Congress proceedings, Ljubljana: Slovensko genetsko društvo, 2000, p. 371-372. 2. Čerenak, A., Javornik, B., Analysis of DNA markers for damson hop aphid resistance in hop.-Zbornik Biotehniške fakultete, Kmetijstvo, 79(2001)2,p. 361-369. 3. Čerenak, A., Jakše, J., Javornik, B. Identification and differentiation of hop varieties using simple sequence repeat markers.-J. Am. Soc. Brew. Chem., 62(2003)1, p. 1-7. 4. Čerenak, A., Kartiranje genoma hmelja (Humulus lupulus L.) z AFLP markerji. Ljubljana, Doktorske disertacije, Biotehniška fakulteta, 2004, pp. 114. 5. Čerenak, A., Šatovic, Z., Javornik, B., Genetic mapping of hop (Humulus lupulus L.) applied to the detection of QTLs for alpha-acid content.-Genome, 2005, (sprejeto v tisk). 6. Henning, J.A., Steiner, J.J., Hummer, K.E., Genetic diversity among world hop accessionsgrownintheUSA.-CropScience, 44(2003)2, p. 411-417. 7. Jakše, J., Šuštar-Vozlič, J., Javornik, B., Identification of hop cultivars by RAPD markers.- In: Javornik, B., B. Bohanec, and I. Kreft (Eds.), Proc. of IPBA, 5-7 Dec, 1994, Rogla, Slovenia, p. 147-151. 8. Jakše, J., Čerenak, A., Javornik, B., Molekularni markerji pri proučevanju genskih virov hmelja (Humulus lupulus L.).-V: Tajnšek, A., (ur.), Šantavec, I., (ur.). Novi izzivi v poljedelstvu 2000: zbornik simpozija : proceedings of symposium, [Moravske Toplice, 14. in 15. december 2000], (Novi izzivi v poljedelstvu). Ljubljana: Slovensko agronomsko društvo, 2000, p. 144-148. 9. Jakše, J., Javornik, B., High throughput isolation of microsatellites in hop (Humulus lupulus L.).-PlantMol. Biol. Report, 19(2001), p. 217-226. 10. Jakše, J., Kindlhofer, K., Javornik, B., Assesment of genetic variation and differentation of hopgenotypesbymicrosatelliteandAFLPmarkers.-Genome, 44(2001), p. 773782. 11. Jakše, J., Bandelj-Mavsar, D., Javornik, B., Eleven new microsatellites for hop (HumuluslupulusL.).-Mol. ecol. notes(Print), 2(2002)4, p. 544-546. 12. Jakše, J., Šatovič, Z., Javornik, B., Microsatellite variability among wild and cultivated hops(HumululupulusL).-Genome, 47(2004),p.889-899. 13. Kralj, D., Zupanec, J., Vasilj, B., Kralj, S., Pšeničnik, J., Variability of essential oils of hops(HumuluslupulusL.).-J. Inst. Brew. 97(1991), p. 197-206. 14. Murakami, A., Darby, P., Javornik, B., Pais, M.S., Seigner, E., Lutz, A., Svoboda, P., Molecular evolution of hops, Humulus lupulus.- In Proceedings of the Scientific Commission, I.H.G.C., held 24-27 June 2003, Dobrna, Slovenia. Edited by E. Seigner. By Bayerische Landesanstalt fur Bodenkultur und Pflanzenbau, Hull, Germany, 2003, p. 92-96. 15. Murakami, A., Darby, P., Javornik, B., Pais, M.S., Seigner, E., Lutz, A., Svoboda, P., Microsatellite DNA analysis of wild hops, Humulus lupulus L.- Genetic Resources and Crop Evoltion, 2005, (vtisku). 16. Patzak, J., Comparison of RAPD, STS, ISSR and AFLP molecular methods used for assessment of genetic diversity in hop (Humulus lupulus L.).- Euphytica 121(2001, p. 9-18. 17. Radišek, S., Jakše, J., Javornik, B., Optimisation of amplified fragment lenght polymorphism (AFLP) analysis of hop wilt (Verticllium alboatrum and Verticillium dahliae).-ZbornikBiotehniškefakultete, Kmetijstvo, 77(2001)2, p. 139-146. 18. Radišek, S., Jakše, J., Simončič, A., Javornik, B., Characterization of Verticillium albo- atrum field isolates using pathogenicity data and AFLP analysis.- Plant Disease, 87(2003)6, p. 633-638. 19. Radišek, S., Jakše, J., Javornik, B. Development of pathotype-specific SCAR markers for detection of Verticillium albo-atrum isolates from hop.- Plant Disease 88(2004)10, p. 1115-1122. 20. Seefelder, S., Ehrmaier, H., Schweizer, G., Seigner, E., Genetic diversity and phylogenetic relationships among accessions of hops, Humulus lupulus, as determined byamplification fragment length polymorphism fingerprinting compared withpedigreedata.- PlantBreeding,119(2001), p. 257-233. 21. Small, E., A numerical and nomenclatural analysis of morpho-geographic taxa of Humulus.-Systematic Botany 3(1978), p. 37-76. 22. Stevens, J.F., Taylor, A.W., Nickerson, G.B., Ivancic, M., Henning, J., Hanunold, A., Deinzer, M.L., Prenylflavonoid variation in Humulus lupulus: distribution and taxonomic significance of xanthogalenol and 4'-O-methylxanthohumol.-Phytochemistry, 53(2000), p. 759-775. 23. Štajner, N., Javornik, B., Bandelj-Mavsar, D., Protocol used for AFLP by automatic laser flourescence analysis.- Zbornik Biotehniške fakultete, Kmetijstvo, 81(2003)1, p. 39-45. 24. Štajner, N., Jakše, J., Kozjak, P., Javornik, B., The isolation and characterisation of microsatellites in hop (Humulus lupulus L.).- Plant Science, Limerick, 168(2004)1, p. 213-221. 25. Šuštar-Vozlič, J., Javornik, B., Genetic relationships in cultivars of hop, Humulus lupulus L., determined by RAPD analysis.- Plant Breeding, 118(1999), p. 75-181. TEHNOLOŠKE RAZMERE PRIDELAVE HMELJA V RS PO STRUKTURNIH SPREMEMBAH V LETU 2000 Martin PAVLOVIČ1, Peter ŠTORMAN2 UDK/UDC 633.791 : 631.55 (497.4) (045) izvirni znanstveni članek/original scientific article prispelo/received: 23. 09. 2005 sprejeto/accepted: 24. 10. 2005 IZVLEČEK V letu 2000 beležimo izrazite spremembe v lastnini in strukturi pridelave hmelja v RS. Za osvetlitev razmerje bila v letu 2003 opravljena anketa o tehnološko-ekonomskih razmerah na hmeljarskih posestvih vSloveniji. Vzorec je zajel 30 naključno izbranih hmeljarskih posestevz obsegom pridelave nad 5 ha. Povprečna velikost vzorčnih hmeljarskih posestev je bila 29 ha, povprečna površina hmeljišč na posestvo pa 16 ha. 75% hmeljišč vzorca je bilo v najemu. V povprečju so imela posestva po 9 parcel velikosti med 0,8 in 4,9 ha. Povprečna hektarska poraba delovnih ur na anketiranih posestvih je znašala 70 strojnih ur, 65 traktorskih ur in 354 ročnih ur. Anketni podatki so služili tudi za dopolnitev verzije simulacijskega modela SIMAHOP 3.0. Rezultati aplikacij modela potrjujejo njegovo uporabnost za nadaljnje raziskave na podjetniški ravni. Ključne besede: struktura pridelave hmelja, anketna analiza, območje Savinjske doline HOP PRODUCTION IN SLOVENIA AFTER STRUCTURAL CHANGES IN 2000 ABSTRACT In 2000 there were structural changes in a Slovenian hop industry. An opinion poll survey was carried out in 2003 that aimed at analysing a production structure and an economic situation of the Slovenian hop industry, for which 30 hop farmers (15%) with more than 5 ha of hop production were randomly selected. An average size of the farms analysed was 29 ha where their average hop area was 16 ha. 75 % of hop area included was rented. An average plot number of hop fields was 9, where their sizes range between 0,8 and 4,9 ha. A hop production per hectare on a sample farms required 70 machine hours, 65 tractor hours and 354 hand hours. The questionnaire results were used also for an updated version of the SIMAHOP 3.0 simulation model. The results validate the application of the model for further research. Keywords: hop production structure, opinion poll survey, Savinja valley region 1 doc., dr. agr., IHPS, Žalskega tabora 2, 3310 Žalec, Slovenija 2 univ. dipl. ing. agr., prav tam 1 UVOD Pri analizah gospodarske konkurenčnosti izvozno usmerjene hmeljarske pridelave v RS je potrebno dinamično spremljati tehnološke in ekonomske razmere te kmetijske panoge, kamor se v letu 2005 s 3% svetovnih površin uvršča tudi slovenska pridelava [3, 4]. Obseg površin, podjetniška organiziranost pridelave ter optimalna izkoriščenost kapacitet strojev in opreme na posestvih odločilno vpliva v segmentu pridelovalnih stroškov na dosežen finančni rezultat posameznega hmeljarskega posestva. Zaradi stečaja nekoč največjega pridelovalca hmelja v RS - Hmezad kmetijstvo Žalec, d.d. v letu 1999 z okoli 1000 ha površin hmeljišč se je poletu 2000 velikostna spremenila struktura pridelave na preostalih hmeljarskih posestvih. Priložnost povečanja površin pridelave hmelja je omogočila približno petini pridelovalcev (17%), da so na različne načine postopno investirali v svoje dodatne kapacitete pridelave in predelave hmelja. Za pridobitev jasnejše slike o tehnološko-ekonomskih razmerah na hmeljarskih posestvih v Sloveniji v prvih 3 letih po strukturni spremembah pa je bila na Inštitutu za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije (IHPS) v okviru diplomske naloge na Fakulteti za kmetijstvo Maribor opravljena anketna raziskava [5]. V članku je predstavljen del rezultatov omenjene ankete analize iz leta 2003 dopolnjen s podatki o površinah in sortni sestavi pridelave v letu 2005. 2 METODADELA V vzorec anketiranih je bilo v letu 2003 vključenih 30 hmeljarskih posestev Spodnje Savinjske doline. Vsa so imela več kot 5 ha hmeljišč in so v letu 2000 povečala svoje obdelovalne površine hmelja. Vzorec je predstavljal 15% vseh posestev v RS. Anketa je bila sestavljena iz štirih sklopov vprašanj (2.1-2.4): 2.1 Podatki o posestvu (število družinskih članov, skupno število domačih delavnih ur, velikost kmetijskih površin, zavarovanje pridelkov, obseg rastlinske pridelave, obseg živinorejske proizvodnje, število parcel hmelja, oddaljenost od hmeljišč, trend pridelave hmelja in trend kmetijske proizvodnje). 2.2 Podatki o osnovnih sredstvih za hmeljarsko pridelavo (a) hmeljišča z žičnicami -velikost v ha, povprečen pridelek hmelja v kg/ha za leto 2002 in povprečen pridelek hmelja za preteklih 10 let, (b) stroji in oprema - posebna poslopja, oprema, stroji in priključki (tip, lastnosti, letnik, delež uporabe v hmeljarstvu (%) in tržna vrednost). 2.3 Podatki o porabi časa po posameznih fazah obdelave hmelja na ha (število domačih oz. najetih traktorskih, strojnih in ročnih ur). 2.4 Podatki o porabljenem materialu pri pridelavi hmelja (gnojila, vodila, sredstva za varstvo hmelja). Pretežni del podatkov anonimne ankete je bil v šifriran. Za obdelavo podatkov je služil tabelarični generator MS Excel. 3 DEL REZULTATOV ANKETE HMELJARSKIH POSESTEV V LETU 2003 3.1 Splošne značilnosti analiziranega vzorca Razpon števila družinskih članov na analiziranih hmeljarskih posestvih je bil med 2 in največ 10. Povprečje pa je bilo 4,9. 60% je bilo odraslih družinskih članov (od 18 do 65 let), 28% mlajših od 18 let in 12% starejših od 65 let. V vzorcu ni bilo izključno hmeljarskih posestev. Na vzorčnih posestvih predstavljajo druga kmetijska zemljišča - kmetijska zemljišča brez hmeljišč - 44,5% površin. Ostala kmetijska zemljišča na vzorčnih posestvih predstavljajo njive (61%), travniki (37%) in sadovnjaki in vinogradi (2%). Ob hmeljarstvu se ukvarjajo pridelovalci predvsem in živinorejo, največ z govedorejo. V povprečju je bilo 24,4 GVŽ goveda na vzorčno posestvo. Povprečno je bilo na vsakem posestvu tudi 7 prašičev-predvsem za lastno rabo. Največ posestevje imelovstrukturi pridelave 50 do 60% hmeljišč. Brez premene hmeljišč pa je imelo največji - 40% delež posestev med 40 in 50% hmeljišč na posestvo. Število razpoložljivih domačih delovnih ur na dan je na različno velikih analiziranih posestvih znašalo od najmanj 12 do največ 52 delovnih ur na dan na posestvo. Povprečje razpoložljivih delovnih ur je 26 ur na dan na posestvo. 3.2 Struktura pridelovalnih površin hmeljišč V vzorcu so bila namenoma zajeta le posestva z več kot 5 ha hmeljišč. Najmanjša površina hmeljišč na vzorčno posestvo je bila 5,3 ha, največja pa 42,0 ha (primer pridelovalne skupnosti 3 hmeljarjev). Povprečna velikost vzorčnih hmeljarskih posestev je bila 28,8, povprečna površina hmeljišč na posestvo pa 16,0 ha. Površine vzorčnih posestev so predstavljale 73% rodnih nasadov, 7% novih nasadov oziroma prvih letnikov in 20% hmeljišč v premeni pretežno karantenskega značaja. S postopnim prenosom lastništva hmeljišč Hmezada Kmetijstvo d.d. v stečaju na posamezne pridelovalce v letu 2000 so hmeljarji odkupili hmeljske žičnice, zemljišča pa so ostala last Zemljiškega sklada in so jih v letu 2003 imeli hmeljarji v najemu. Zato so ta hmeljišča obravnavana kot zemljišča v najemu. Na vzorčnih posestvih je bilo 75,4% hmeljišč v najemu, ostalih 24,6% hmeljišč je v lasti hmeljarjev. Velikost najmanjših parcel hmelja na posestvih se je gibala od 0,05 ha do 8,56 ha. Velikost največjih parcel hmelja je bila v razponu od 2,06 ha do 10,20 ha. Povprečna velikost najmanjših parcel hmelja na posestvih je bila 0,78 hektarja, povprečna velikost največjih parcel pa 4,95 hektarja. Rezultati o prostorske razpršenosti pridelave kažejo, daje bilo povprečno 9,1 parcel hmelja na posamezno posestvo. Eno od posestev pa je imelo celotna hmeljišča v enem kompleksu. Najmanjša oddaljenost od dvorišča posestva do hmeljišč je znašala od 0,01 km do 4,5 km (v povprečju 0,5 km). Največja oddaljenost do hmeljišč pa se je gibala med 0,5 km in 6,0 km (povprečno 2,5 km). Površine vzorčnih posestev so predstavljale 73% rodnih nasadov, 7% novih nasadov oziroma 1. letnikov in 20% hmeljišč v premeni pretežno karantenskega značaja. Povprečni hektarski pridelki hmelja na 30 vzorčnih posestvih v letu 2002 so bili 1.582 kg/ha. Povprečni hektarski pridelki za obdobje zadnjih 10 let pa 1.865 kg/ha. Pri vseh anketiranih so se njihovi povprečni pridelki občutno zmanjšali v obdobju, odkar so obdelovali tudi hmeljišča firme Hmezad kmetijstvo, d.d. 35,00 30,00 ta 25,00 .C <5 20,00 > 70 Medium and fine textured soil (SCL, CL, L, SiL, Si, SiCL, SiC, SC, C) High OM 4-10 5 Fine textured soil (heavy) (SiCL, SiC, SC, C) Very high OM >10 9 Wide range Wide range Wide range * S - sand, LS - loamy sand, SL - sandy loam, L - loam, SiL - silt loam, Si - silt, SCL - sandy clay loam, CL - clay loam, SiCL - silty clay loam, SC - sandy clay, SiC - silty clay, C - clay Figure 1: Simplified process of structuring soil vulnerability maps Slika 1: Shema izdelave karte ranljivosti tal 3 RESULTS AND DISCUSISION PHC was integrated into relative numeric value for each SSU at pilot area. The value of PHC ranging from 3 to 40, according to validation with PELMO model, five main categories of the interpretation scale from minimum (negligible) to very high concern for ground water contamination by pesticides were established. Each category was split into subclasses of sensibility with general recommendation of pesticide use (Table 2). Table 2: Interpretation scale for the SSU according to calculated PHC expressed as soil sensibility for pesticide use or risk of pesticide leaching through soil profile Tabela 2: Interpretacijski ključ za razvrstitev pedosistematskih enot (PSE) v kategorije tveganja izpiranja FFSiztal glede na izračunano vrednost zadževanja pesticida vtleh PHC Soil Sensibility Risk of leaching pesticide from soil value Class Characteristics Level of concern Category Label in map < 7 8-10 1 2 Inappropriate for pesticide use Inappropriate for pesticide use Very high risk I Crosshatch 11-12 13-14 3 4 Inappropriate for pesticide use Sensitive soil for pesticide use High risk II Simple hatch 15-17 18-20 5 6 Limited use of pesticide Limited use of pesticide Medium risk III Dot net 21-25 26-30 7 8 Proper pesticide use is not problematic Proper pesticide use is not problematic Low risk IV Horizontal line 33-35 36-40 9 10 Very high capability of pesticide adsorption Very high capability of pesticide adsorption Negligible risk V Solid grey Pilot area for testing soil vulnerability model for pesticide use was set in Žalec and Celje community. Testing area occupied 21200 ha of which 9018 ha is agricultural land (Table 3, Fig.2). Results of PHC assessment shows that high risk for pesticide use (Fig. 2) represents soil units developed on following soil classes according to FAO classification: Fluvisol, Regosol, Rendzinas and shallow forms of Cambisols. Main characteristics of soil units classified in first category regarding safe use of pesticides are low depth of soil profile and lower organic matter content. On the pilot area those units are mostly situated in the vicinity of Savinja river. Soil units of Rendzinas and Rankers could be found in hills on calcareous parent material (Pirešica, Liboje) and on Miocene sand and sandstone (Pirešica, Štore). In this category were classify 941 ha of agriculture land which represent 10% of all agriculture area (Table 3). In the second category where risk for pesticide leaching is still high, mostly cambisols (usually Eutric cambisol) with medium depth were classified. These units are represented in part of Savinja valley. However some other soil units of Dystric cambisol could be found on other parts of testing area. Area of this category represents 28% of agriculture area under investigation (Table 3). Soils classified in third category represent medium risk for pesticides leaching. In this category many soil units of eutric and dystric cambisol with different parent material (marl, non sandy alluvial deposit, etc.) are included and also same soil units of Gleysols. It is the largest category where more than 5200 ha (58 %) of agriculture land were included (Table 3). Only 1% of all area is covered by soil classified as a low risk for pesticide use. Deep soil units developed on alluvial deposit were classified in this category. On tested area no soil units were classified in category of negligible riskfor pesticide leaching (Table 3). Table 3: Area of different category of risk assessmentfor pesticide leaching Tabela 3: Površina in delež različnih kategorij glede na ugotovljeno tveganje za izpiranje pesticidov Category Area (ha) Area (%) 1 - Very high risk 941 10 2 - High risk 2524 28 3 - Medium risk 5224 58 4 - Low risk 56 1 5 - Negligible risk - - Errror* 273 3 Total 9018 100 Differences arise due to lower accuracy of urban zones in Slovenian soil map Figure 2: Soil vulnerability map for pesticide leaching Slika 2: Karta ranljivosti tal zaradi izpiranja fitofarmacevtskih sredstev 4 CONCLUSIONS Transformation of general (available) soil data into maps of soil vulnerability leaching using simple model with main attribute data for SSU has shown reasonable results on test area. More precise classification and description of soil vulnerability could be done using particular pesticide or pesticide groups according to their persistence and mobility data. Additional site characteristics and management practice in combination with climatic data could contribute to detail scale of thematic maps in the future. ACKNOWLEDGMENTS Authors acknowledge to the Slovenian Ministry of Science and Technology and Ministry of Agriculture, Food and Forestry for financial support according to the contracts V4-0460, V1-0798 and V4-0885. 5 REFERENCES 1. Brena, S., Pampaluna, M., Riparbelli, C., Auteri, D., Azimonti, G., Bernardinelli, I., Mammone, T., Maroni, M., Capri, E., Trevisan, M., Montanarella, L.,. 1999. Supplying Local Authorities and Farmers With an Innovative Tool to Support a Sustainable Agricultural Production. XI Symposium Pesticide Chemistry - Human and Environmental Exposure ofXenobiotics, Cremona 1215 Sept. 1999. 2. Directive 2000/60/EC of the European Parliament and of the Council of 23 October 2000 establishing a framework for community action in the field of water policy Official Journal L 327, 22/12/2000 P. 00010073. 3. Li, H., Sheng, G., Teppen, B.J., Johnston, C.T., Boyd, S.A., Sorption and Desorption of Pesticides by Clay Minerals and Humic Acid-Clay Complexes. - Soil. Sci. Soc. Am. J. 67 (2003), p.122-131 4. Landon, M., Jacobsen, J., Johnson, G., 1994. Pesticide Management for Water Quality Protection. Montana State University, Extension Service, Bozeman, Montana, 19 p. 5. http://eco.wiz.uni-kassel.de/model_db/mdb/pelmo.html (20. sept. 2005) 6. Knapič, M., Bukovec, P. 2004. Fate and behavior evaluation of pesticides in pesticide registration scheme with emphasis on groundwater. Book of abstracts: 9th International Conference Life Sciences 2004, Nova Gorica, 18th22th of Sept., p. 226. 7. Vrščaj, B., Prus, T., LobnikF:, 2005. Soil Information and Soil Data Use in Slovenia. In: Soil Resources of Europe (Eds. Jones, R. A.., Houškova, B., Bullock, P., Montanarella, L.), European Soil Bureau, Institute for Environment & Sustainability, JRC, Ispra., pp. 331-344.