Načrtovanje in karakterizacija peptidnih ligandov za vezavo regije Fc imunoglobulinov - Bozovičar, Krištof (visokošolska dela, 2021)
Monoklonska protitelesa (mAb) izotipa IgG uporabljamo kot biološke učinkovine za zdravljenje rakavih obolenj, , avtoimunih in kroničnih vnetnih, infekcijskih in številnih drugih bolezni. mAb široko uporabljamo tudi v diagnostiki v različnih formatih predvsem zaradi njihove izjemne specifičnosti in visoke afinitete do raznolikih antigenov. Ligandi protiteles predstavljajo pomemben element v proizvodnji mAb. Večinoma temeljijo na bakterijskih immunoglobulin-vezavnih proteinih - stafilokoknem proteinu A in streptokoknem proteinu G, a so taki ligandi navadno dragi in podvrženi denaturaciji in odpuščanju iz afinitetnih kolon. Peptidi so preprostejši in cenovno dostopnejši od proteinskih ligandov, s kemijsko sintezo pa jih lahko proizvedemo v velikih količinah. Imajo ugodnejši toksikološki in imunogeni profil, in navadno vežejo tarčne proteine z zmerno afiniteto, zato lahko elucijo izvedemo pri relativno milih pogojih. V okviru preteklih raziskav smo identificirali peptidni ligand min19Fc-Q6D (GSYWYDVWF) in na njem osnovali usmerjeno peptidno knjižnico, predstavljeno na bakteriofagu. Izbrane položaje nonapeptida, ki niso esencialni za vezavo, smo delno ali popolnoma randomizirali do teoretične diverzitete 64000 klonov na aminokislinskem nivoju. Fagmid pIT2 smo priredili tako, da smo skrajšali distančnik, ki povezuje predstavljen polipeptid s fagnim proteinom p3, saj je znano, da dolgi fleksibilni distančniki negativno vplivajo na navidezne afinitete peptidnih ligandov. V prirejen fagmid subklonirali knjižnični insert DNA in generirali bakteriofagno knjižnico. V eni sami selekcijski stopnji smo knjižnico izpostavili tarči (zmesi človeških imunoglobulinov G), vezalce pa eluirali v več korakih s pufri s padajočimi vrednostmi pH. Izhodiščno knjižnico (pred selekcijo) in elucijske frakcije smo sekvencirali s tehnologijo sekvenciranja naslednje generacije (NGS) in v testu fagna ELISA primerjali relativno afiniteto najbolj obogatenih klonov. Najvišjo afiniteto je izkazoval peptid A (GSYWYNVWF), katerega smo kasneje uporabili za konstrukcijo afinitetnih matric z distančnimi ročicami različnih dolžin in rigidnosti. Matrica z razvejanim distančnikom tris(2-aminoetil)amin je izkazovala največjo statično vezavno kapaciteto, kar smo pripisali gostoti liganda oz. avidnostnemu učinku in učinkoviti izpostavitvi liganda topilu. Končni cilj doktorske naloge je bila konstrukcija afinitetne kromatografske kolone z najbolj ugodno distančno ročico (tris(2-aminoetil)amin) in peptidom A z izboljšanimi lastnostmi (v primerjavi z vodnico min19Fc-Q6D). Kolona je izkazovala primerljivo dinamično vezavno kapaciteto (~43 mg protiteles IgG1 /mL nosilca) in specifičnost kot komercialna kolona na osnovi proteina A, izkazovala pa je večjo stabilnostjo (tj. odpornost proti 0,5 M NaOH). Peptid min19Fc-Q6D smo poskušali kokristalizirati s fragmentom Fc (pridobljenim s fragmentacijo monoklonskega IgG1 s papainom). Difrakcijski vzorec pridobljenih monokristalov (ki so se formirali pri zelo različnih pogojih) smo posneli z visokoresolucijsko rentgensko difrakcijo na sinhrotronu (Elettra, Trst). Pridobili smo podatke v resoluciji 2,2 A in razrešili strukturo z umeščanjem modela v elektronsko gostoto. Pri eni izmed domen CH2 je bila elektronska gostota razpršena, elektronske gostote peptida pa ni bilo zaznati. Tako nismo uspeli dobiti vpogleda v vezavno mesto za peptidni ligand na fragmentu Fc in naravo interakcije. Predpostavljamo, da nejasno definirana elektronska gostota v območju domen CH2 nakazuje konformacijsko spremembo v določenem deležu molekul Fc v kristalu, ki jo sproži interakcija s peptidom.
Keywords: afinitetna kromatografija; disertacije; Imunoglobulini; imunoglobulini IgG; Laboratorijska kemija; monoklonska protitelesa; peptidni ligandi; predstavitev na bakteriofagu; usmerjena knjižnica