Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2, 121-130.
http://www.bf.uni-lj.si/aas
Agris category codes: Q01                                                                           COBISS Code             1.01
POLIMORFIZEM GENOV ZA ß-LAKTOGLOBULIN IN ?S1-KAZEIN PAŠKE OVCE *
Ante IVANKOVIĆ a) in Peter DOVČ b)
a) Univ. v Zagrebu, Agronomski fak., Odd. za živinorejo, Svetošimunska 25, HR-10000 Zagreb, Hrvatska, doc., dr.
b) Univ. v Ljubljani, Biotehniška fak., Odd. za zootehniko, Groblje 3, SI-1230 Domžale, Slovenija, prof., dr.
Delo je prispelo 12. januarja 2004, sprejeto 10. decembra 2004. Received January 12, 2004, accepted December 10, 2004.
IZVLEČEK
Polimorfizmi genov, ki kodirajo proteine mleka imajo pogosto pomembem vpliv na tehnološke lastnosti mleka. Čeprav so podatki o vplivu alelnih variant laktoproteinskih genov na tehnološke lastnosti mleka pogosto kontradiktorni, v selekcijske vse pogosteje vključujejo tudi informacije o genotipu na laktoproteinskih lokusih, da bi v populacijah povačali frekvenco alel z ugodnim učinkom na tehnološke lastnosti mleka. Glavni proizvod paške ovce je mleko, ki ga večinoma predelajo v paški sir. Izboljšanje tehnoloških lastnosti mleka te pasme bi bistveno pripomoglo k večji ekonomičnosti reje te pasme. Z namenom, da bi ugotovili frekvenco alelov laktoproteinskih genov, ki pomembno vplivajo na predelovalne lastnosti ovčjega mleka, smo v tej raziskavi tipizirali gena za ß-laktoglobulin in ?s1-kazein štiridesetih živali. Genotipizacijo smo izvedli s pomnoževanjem delov obeh genov z verižno reakcijo s polimerazo in estrikcijo amplifikatov z ustreznimi endonukleazami. Na lokusu za ß-laktoglobulina smo našli alela A in B (0,5375; 0,4625), na lokusu za ?s1-kazein pa smo določali aleli A in D (0,0875; 0,1340). Glede na podatke v literaturi lahko rečemo, da frekvence alel za ß-laktoglobulin in ?s1-kazein v populaciji paške ovce niso najugodnejše in da bi z uporabo molekularnih metod frekvenco alel z ugodnimi tehnološkimi lastnostmi lahko sorazmerno hitro povečali. To bi vodilo k izboljšanju ekonomičnosti reje te pasme, katere edini tržno uveljavljeni produkt je paški sir.
Ključne besede: ovce / pasme / paška ovca / mleko / laktoglobulini / kazein / molekularna genetika / polimorfizem genov / Hrvaška
POLYMORPHISMS OF ß-LACTOGLOBULIN AND ?S1-CASEIN GENES IN THE PAG
ISLAD SHEEP †
ABSTRACT
Polymorphisms of lactoprotein genes have a significant effect on technological properties of milk. In spite of the fact that literature data on the impact of lactoprotein variants on cheese making properties are sometimes contradictory, the information about the lactoprotein genotypes becomes important in selection programs in order to improve frequency of favourable alleles for technological properties of milk. The main product of the Pag Islad Sheep is milk, which is mainly used for manufacturinh of well known Pag Cheese. The improvement of cheese making properties of the Pag Island Sheep milk would contribute significantly to the rentability of the breed. In order to estimate the frequency of alleles contributing to technological properties of milk, we genotyped ß-lactoglobulin and ?s1-casein loci of 40 Pag Island Sheep. Genotyping was performed using PCR followed by restriction analysis. At the ß-lactoglobulin locus alleles A and B (0.5375; 0.4625) were found whereas at the ?s1-casein locus genotyping of alleles A in D
Prispevek je del doktorske disertacije (zagovor 16. marca 2001), mentor izr. prof.dr. Peter Dovč.
This paper is a part of a dissertation thesis (defense March 16, 2001) supervisor assoc.prof. Peter Dovč, Ph.D.
122    Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2.
(0.0875; 0.1340) was performed. According to the literaure data, we can conclude that allele frequencies at ß-lactoglobulin and as1-casein locus in the population of Pag Island Sheep are not optimal for cheese making properties of milk. Application of molecular techniques would enable relatively rapid improvement of allelic frequencies towards technologically favourable alleles. This would also improve economical parameters of milk production with Pag Island Sheep breed, which is only known for special Pag cheese.
Key words: sheep / breeds / Pag island sheep / milk / lactoglobulins / casein / molecular genetics / gene polymorphism / Croatia
UVOD
Mleko ovac predstavlja kakovosten vir energije in beljakovin. Ima znatno višjo vsebnost suhe snovi kot kravje mleko. Delež mlečne masti v suhi snovi ovčjega mleka znaša 38,6 %; beljakovin 31,2 %; laktoze 25,1 % in pepela 5,1 %. Kravje mleko ima v primerjavi z ovčjim manj mlečne maščobe (30,8 %), manj proteinov (25,7 %), več laktoze (37,8 %) in več pepela (5,7 %) (Anifantakis, 1985). Mleko ovac vsebuje znatno več (23 %) nižjih maščobnih kislin (kaprilna, kaprinska, laurinska) kot mleko krav (12 %), kar mu daje specifičen okus. Skupna količina belajkovin in njihovo razmerje, sta v mleku ovac bistveno drugačna kot v mleku krav. Delež kazeina v skupnih beljakovinah mleka znaša podobno kot pri kravjem mleku 75-80 %, delež serumskih proteinov pa 20-25 %, zaradi česar ovčje mleko opredelimo kot kazeinsko mleko. Zaradi relativno velikega deleža proteinov mlečnega seruma, pa sirotko uporabljamo tudi za proizvodnjo albuminskih sirov.
Mleko ovac vsebuje, tako kot mleko drugih sesalcev, beljakovine, ki so deloma raztopljene v mleku, deloma pa so prisotne v obliki polidisperznih agregatov - micel. Proteine v ovčjem mleku razvrstimo v dve glavni skupini: kazeine (<xs1, as2, k, ß) in proteine sirotke (a-laktalbumin, ß-laktoglobulin). Razmerje med glavnimi kazeinskimi frakcijami v ovčjem mleku je: asx:ß = 30:47:7 (Manfredini in Massari, 1989). Razmerje kazeinov odloča o koagulacijskih lastnostih mleka, zaradi česar ovčje mleko koagulira 1,56 krat hitreje kot kravje mleko, čvrstost sirarskega zrna pa je dvakrat večja. Kazeini se v mleku nahajajo v obliki kazeinskih micel s premerom 20-600 nm, za ohranjanje micel pa je odgovoren k kazein. Za strukturo kazeinskih molekul so pomembne hidrofobne, vodikove, disulfidne in elektrostatične vezi. Primarna struktura kazeinov je definirana z aminokislinskim zaporedjem in s specifičnimi mesti za post translacijske modifikacije (predvesm fosforilacija in glikozilacija). Na velikost in čvrstost micel pomembno vplivajo polimorfizmi v aminokislinskem zaporedju k kazeina. Prisi in sod. (1999b) ob primerjavi alelnih variant D in C as1 CN opaža, da imajo največji premer micele mleka z genotipom DD, najmanjši pa micele mleka z genotipom CC.
V teku evolucije, se je v laktoproteinskih genih pojavilo večje število mutacij, ki danes opredeljujejo različne alelne variante laktoproteinskih genov. Pogostnost pojavljanja različnih alelnih tipov se med pasmami razlikuje in zato lahko frekvence alel laktoproteinskih genov uporabljamo kot genetski marker za razlikovenje med pasmami. Opažanja, da so nekatere alelne variante polimorfnih laktoproteinov povezane z boljšo izkoristljivostjo mleka v tehnoloških postopkih, še posebej pri proizvodnji sira, so spodbudila raziskovanje polimorfizma laktoproteinov pri ovcah (King, 1969; Shalichev in Tanev, 1972; Arave in sod., 1973; Chianese in sod, 1992). Za večino polimorfizmov so značilne razlike v aminokislinskem zaporedju (Kolde in Braunitzer, 1983; Ferranti in sod., 1995). Razvoj tehnologije rekombinantne DNA in uvedba verižne reakcije s polimerazo (PCR) pa sta omogočila hitro in enostavno genotipizacijo alelnih variant na ravni DNK (Schlee in sod., 1993; Ramunno in sod., 1997; Feligini in sod., 1998; Pilla in sod., 1998; Prinzenberg in Erhardt, 1999). Ti postopki niso odvisni od spola osebka, fiziološkega stanja in okoljskih dejavnikov, tako da danes alelne variante laktoproteinskih genov lahko identificiramo tudi pri moških živalih takoj po rojstvu.
Ivanković, A in Dovč, P. Polimorfizem genov za ß-laktoglobulin in ?s1-kazein paške ovce.                               123
Beta laktoglobulin (ß-LG), glavni protein sirotke, je sestavljen iz zaporedja 162 aminokislin. V mleku se nahaja v obliki stabilnega dimera. Za prežvekovalce je značilen en sam lokus, ki kodira rezlične alele ß-LG, medtem ko pri neprežvekovalcih lahko najdemo dva (konj), pri mačkah celo tri lokuse za ß-LG (ß-LG I, ß-LG II in ß-LG III). V ovčjem mleku lahko najdemo tri alelne variante ß-LG (A, B in C). Varianta A se od variante B razlikuje po aminokislinski substituciji Tyr20^His20 (Kolde in Braunitzer, 1983), razliko med variantama A in C pa opredeljuje aminokislinska substitucija Arg148^Gln148 (Erhardt in sod., 1989). Alel C so našli predvsem v nemški, madžarski in španski populaciji merino ovac (Erhardt in sod., 1989).
Za alfa-s1 kazein (ots1-CN) ovce je znanih pet alelnih variant, ki jih označujemo s črkami A, B, C, D (Ferranti in sod., 1995) in E (Chianese in sod., 1996). Slednjo so našli le pri italijanskih pasmah ovac. V ovčjem mleku je za as1-CN značilen dolžinski polimorfizem: dolgo varianto tvori 199 aminokislin in predstavlja « 80 % ots1-CN, krajšo pa tvori 191 aminokislin in se od dolge variante razlikuje po deleciji med aminokislinami 141 in 148 (Ferranti in sod., 1995). Varianta C se od variante A razlikuje po substituciji Ser13^Pro13 kar povzroča tudi izgubo fosforilacijskega mesta na poziciji 12 v proteinski verigi, SerP12^Ser12 (Ferranti in sod., 1995). Za varianto D je značilna substitucija SerP68^Asn68 kar povzroča eliminacijo fosforilacijskih mest na pozicijah Ser64 in Ser66, prav tako pri tej varianti Ser41 ni fosforiliran (Ferranti in sod., 1995). Varianta E, ki so jo odkrili pri nekaterih italjanskih pasmah ovac še ni podrobno proučena (Chianese in sod., 1996).
Navedbe o povezavi med različnimi alelnimi variantami ß-LG ter kakovostjo in količino mleka, učinkovitostjo proizvodnje sira in drugimi tehnološkimi lastnostmi, so pogosto kontradiktorne. Nekatere raziskave (Bolla in sod., 1989; Garzon in Martinez, 1992; Portolano in sod., 1996) kažejo na ugoden vpliv alelne variante ß-LG B na vsebnost proteinov v mleku, ne pa tudi na sirarski izplen. Anton s sod. (1998) ni ugotovil povezave med ß-LG B in prej navedenimi lastnostmi mleka. Prisi in sod. (1999a) so ugotovil, da ima mleko ovac z genotipom ß-LG AA več suhe snovi in masti kot mleko z genotipom ß-LG AB (P<0.01). Mleko genotipa AB ima primernejše razmerje med kazeinom in mlečno maščobo (P<0.01) kot varianta AA. Kukovics s sod. (1999b) je potrdil značilno povezavo med genotipom ß-LG in sestavo mleka. Prisi in sod. (1999a) so ugotovili, da je količina proizvedenega sira iz kilograma mleka največja pri genotipu AA (P<0.01), srednja pri genotipu BB (P<0.01), ter najmanjša pri genotipu AB. Moioli s sod. (1995) ugotavlja, da ima alelna varianta ß-LG A pozitiven učinek na tehnološke lastnosti mleka, medtem ko varianta ß-LG B pozitivno vpliva na količino mleka. Kukovics s sod. (1999a) je ugotovil, da je v sirarstvu najprimernejši genotip ß-LG BB. Kukovics s sod. (1999c) opaža močno povezavo genotipa ß-LG s številom somatskih celic v mleku, pomemben vpliv na to lastnost pa ima tudi pasma.
V številnih poskusih so proučevali povezavo med genetskimi variantami as1-CN in ß-LG ter kvantitativnimi in kvalitativnimi lastnostmi mleka, ki so pomembne v predelavi mleka, posebno v sirarski proizvodnji. Bolla in sod. (1989) je ugotovil da je varianta as1-CN D povezana z nižjo vsebnostjo mlečne maščobe in beljakovin v mleku, medtem ko je Piredda s sod. (1993) ugotovil povezavo iste variante z nizkim deležem kazeina v mleku ter slabimi koagulacijskimi sposobnostmi. Prisi in sod. (1999b) so ugotovili, da ima mleko z genotipom as1-CN CC večji delež kazeina kot mleko z genotipoma CD in DD. Alelna varianta CC ima širše razmerje med beljakovinami in mlečno maščobo ter manjši premer kazeinskih micel. Najpomembnejše so razlike med genotipi v procesu sirenja (Prisi in sod., 1995; Prisi in sod., 1999b); mleko z genotipom as1-CN CC je zaradi boljših tehnoloških lastnosti primernejše za predelavo (hitrost sirjenja, čvrstost sirarskega zrna, izplen pri proizvodnji sira) kot mleko genotipa DD, medtem ko je mleko genotipa CD po tehnoloških lastnostih med variantama CC in DD.
124    Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2.
Otok Pag, s površino 294 km2, je bil stoletja prebivališče posebne pasme ovac, ki se je odlikovala po dobri prilagojenosti okoljskim razmeram na tem otoku in je po njem dobila tudi ime 'paška ovca'. Klimatski in ekološki pogoji na otoku, skromna prehrana, pomanjkanje vode in zavetij pred vetrom, so oblikovali paško ovco v skromno, vzdržljivo in odporno žival. Do sredine XIX. stoletja paške ovce niso oplemenjevali z drugimi, produktivnejšimi pasmami. Merinizacija ovac na otoku Pagu se je pričela leta 1870 z uvozom 'Merino Negretti' ovnov in ustanovitvijo 'vzorčnih čred' ki so bile namenjene izboljšanju proizvodnih lastnosti (Pavlinić, 1936). Cilj križanja je bilo izboljšanje kakovosti volne in povečanje telesnega okvirja. Rezultat oplemenjevanja z Merino Negretti ovni, kasneje pa tudi z bergamaško ovco, se je odražal samo v izboljšani kvaliteti volne, medtem ko sta mlečnost in velikost telesnega okvirja ostali na prejšnji ravni (Jardas, 1951). Danes so na zunanjosti paške ovce opazni sledovi bergamaške kot tudi Merino Negretti pasme.
Paška ovca je skladne telesne zgradbe in srednje velikega formata. Večina ovac je bele barve, pojav črnih ali pigmentiranih živali je dokaj redek. Glava je srednje velika, ravnega nosnega profila, medtem ko je pri ovnih profil lahko rahlo konveksen. Ovce so praviloma brez rogov, medtem ko imajo ovni dobro razvite rogove. Greben je izražen, hrbtna linija je pravilna, rep je dolg. Paška ovca ima čvrste in močne noge s pravilnimi parklji. Telo ovce je pokrito z zaprtim do polzaprtim runom mešane volne, na kateri je opazna sled merinizacije. Velikost populacije paške ovce znaša okoli 25.000 živali. Stanje populacije je stabilno, ker je reja te pasme donosna, predvsem zaradi predelave mleka v sir (Paški sir) in prireje mesa (Paška jagnjetina).
Detekcija alelnih variant proteinov mleka
Alelne variante proteinov mleka so odkrili z visoko ločljivimi elektroforetskimi tehnikami, ob uporabi različnih metod za izolacijo proteinov iz mleka. Velika pomanjkljivost rutinske tipizacije na ravni beljakovin je bila nezmožnost direktnega tipiziranja plemenjakov, kar je oteževalo selekcijo. Razvoj PCR metodologije je omogočil določanje genotipov živali ne oziraje se na spol, starost in fiziološko stanje živali.
Schlee s sod. (1993) je opisal možnost za tipizacijo alelnih variant A in B ß-LG z uporabo PCR metodologije. Prvi korak je amplifikacija 236 bp dolge regije, ki vsebuje del introna I in ekson II gena za ß-LG pri ovci z uporabo ustreznih začetnih oligonukleotidov (OLG1, OLG2). Sledi restrikcija fragmenta z endonukleazo RsaI. Homozigote AA prepoznamo po fragmentih velikosti 148 in 66 bp, homozigote BB po fragmentu velikosti 214, heterozigote pa po treh fragmentih (214, 148 in 66 bp).
Feligini s sod. (1998) je za razlikovanje med variantama ß-LG A in B uporabil mutacijo (T<->C) znotraj eksona II. Z uporabo ustreznih začetnih oligonukleotidov (LBG1, LBG2) je amplificiral 120 bp dolgo zaporedje, znotraj katerega se nahaja mutacijsko mesto, ki je hkrati tudi restrikcijsko mesto za RsaI pri varianti A. Tako RsaI cepi PCR fragment alelne variante ß-LG A na tri fragmente (66, 37 in 17 bp), medtem ko da PCR fragment variante ß-LG B po cepitvi le dva fragmenta (103 in 17bp). Kratek fragment, dolg 17 bp, se pojavlja v obeh alelnih variantah, kar predstavlja kontrolo delovanja restrikcijskega encima. Razen dveh glavnih alelnih variant (ß-LG A in ß-LG B) se precej redkeje pojavlja še tretja alelna varianta ß-LG C. Prinzenberg in Erhardt (1999) sta uvedla metodo, ki omogoča PCR identifikacijo variante ß-LG C. Najprej je treba pomnožiti 245 bp dolg fragment, ki vsebuje ekson V in intron V (nukleotidno mesto 4589-4834), nakar sledi cepitev produkta z endonukleazama MspI ali AluI.
Tudi za identifikacijo alelnih variant as1-CN so na voljo postopki, ki temeljijo na uporabi PCR metodologije. Ramunno s sod. (1997) je prvi opisal možnost določanja 'Welsh' variante <xs1-CN ovac na ravni DNA. Način za določanje variant A in D as1-CN pri ovcah pa je opisal Pilla s sod. (1998). Identifikacija A variante as1-CN temelji na amplifikaciji 372 bp dolgega fragmenta
Ivanković, A in Dovč, P. Polimorfizem genov za ß-laktoglobulin in ?s1-kazein paške ovce.                               125
gena za ?s1-CN ki vsebuje polimorfni ekson III. Sledi restrikcija z MboII in določitev genotipa na elektroforeznem gelu. Za homozigote A/A so značilni trije fragmenti (160, 146 in 66 bp), za heterozigote A/ne-A štirje (306, 160, 146 in 66 bp), homozigot brez alelne variante A pa daje dva fragmenta (306 in 66 bp).
( ? - pomeni kateri koli alel razen A)           ( ? - pomeni kateri koli alel razen D)
Slika 1.    Identifikacija alelne variante as1-CN A in as1-CN D (Pilla in sod., 1998). Figure 1. Genotyping of the ovine as1-CN A and as1-CN D (Pilla et al, 1998).
Varianto as1-CN D lahko določimo s pomočjo 237 bp dolgega fragmenta, ki vsebuje polimorfni ekson IX. Amplificiran fragment gena je treba cepiti z MaeIII, nakar lahko elektroforetsko določimo genotipe. Homozigot D/D prepoznamo po dveh fragmentih (157 in 80 bp), heterozigot D/ne-D po štirih fragmentih (157, 80,53 in 27 bp), homozigot brez alelne variante D pa po treh fragmentih (157, 53 in 27 bp).
MATERIAL IN METODE DELA
V juniju 1999 leta smo zbrali 40 krvnih vzorcev paške ovce. Jedrno DNA smo izolirali po standardni metodi (Ausubel in sod.,1987). V reagenčno posodico z 200 \u krvi smo dodali 800 Hl TE pufra, pretresli, centrifugirali 30 s pri 20.000 x g, odlili supernatant ter postopek še dvakrat ponovili. V reagenčno posodico smo dodali 200 |ul pufra za lizo celic in 8 |ul proteinaze K, sledila je inkubacija v vodni kopeli na 58 °C (dve uri). Po inkubaciji je sledila ekstrakcija z 220 Hl PCl (fenol:kloroform:izoamilalkohol v razmerju 25:24:1), centrifugiranje pri 20000 x g (10 min), nato smo odpipetirali zgornjo fazo v novo reagenčno posodico. Dodali smo 150 nl mešanice kloroforma in izoamilalkohola (razmerje 24:1), centrifugirali pri 20000 x g 10 min in zgornjo fazo odpipetirali v novo reagenčno posodico. Po dodatku 2,5 volumna 96 % etanola (ohlajenega na -20 °C) smo vzorce shranili čez noč na -20 °C. Nato smo vzorce centrifugirali pri 20000 x g (10 min), odlili supernatant, dodali 100 \u 70 % etanola (ohlajenega na -20 °C) ter centrifugirali (1 min/20000xg). Postopek smo ponovili. Nato smo odpipetirali etanol, posušili pelet do voskaste konzistence ter ga raztopili v 30 \u Milli Q vode in shranili na 4 °C.
Uspešnost izolacije DNK smo preverili na 1 % gelu v 1xTBE puferu (20 minut / 120V). Na gel smo nanesli 2\u aplikacijskega pufra in 1,5 ^ raztopljene DNK.
PCR-RFLP analiza polimorfizmov genov za a-s1 kazein in ß-laktoglobulin
Z ustreznimi začetnimi oligonukleotidi, ki smo jih uporabili v verižni reakciji s polimerazo smo pomnožili fragmente kodogenih regij laktoproteinskih genov ki kodirajo as1-CN in ß-LG.
126    Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2.
Začetni oligonukleotidi so navedeni v preglednici 1, prav tako tudi temperatura prileganja (TA °C) in koncentracija MgCl2.
Tako dobljene PCR produkte smo cepili z ustreznimi restrikcijskimi endonukleazami. V preglednici 2 so navedeni uporabljeni restrikcijski encimi in njihova cepitvena mesta.
Preglednica 1.  Začetni oligonukleotidi, uporabljeni za amplifikacijo dela genov ?s1-CN in ß-LG
paške ovce Table 1.            The primers used for amplification of ?s1-CN and ß-LG gene fragments in Pag
island sheep
Začetni oligonukleotidi Primers		Nukleotidna zaporedja zečetnih oligonukleotidov Nucleotide sequence primers	TA °C	MgCl2	Referenca Reference
ß-LG	LBG 1 LBG 2	5'-CAACTCAAGGTCCCTCTCCA-3 ' 5'-CTTCAGCTCCTCCACGTACA-3 '	54 °C	2,0 mM	(Feligini in sod., 1998)
as1-CN	AS1-1 AS 1-2 AS 1-3 AS 1-4	5'-GGTGTCAAATTTAGCTGTTAAA-3 ' 5'-GCCCTCTTCTCTAAAAAGGTTT-3 ' 5'-CAACATATTTTAAATAAATTGACAAT-3‘ 5'-AATTAACATAAAAATGGCATACGTC-3‘	53 °C	1,5 mM	(Pilla in sod., 1998)
Pri določanju variant ß-LG smo inkubirali 15 ul PCR produkta 3 ure, na 37 °C s 25 enotami restrikcijske endonukleaze RsaI. Pri določanju variant as1-CN smo inkubirali 15 ul PCR produkta 3 ure, na 37 °C z restrikcijsko endonukleazo MboII (alel A) in z restrikcijsko endonukleazo MaeIII (alel D). Rezultate encimatske cepitve smo analizirali na 3 % agaroznem gelu, skupaj z velikostnim standardom (100 bp DNA Ladder, Gibco BRL).
Preglednica 2.  Restrikcijske endonukleaze uporabljene za detekcijo alel ?s1-CN in ß-LG Table 2.            The restriction enzime used for detection of ?s1-CN and ß-LG alleles
Restrikcijska endonukleaza Restriction enzime		Cepitveno mesto Restriction site
MaeIII	BOEHRINGER MANNHEIM GmbH	;GTNAC CANTGt
MboII	PROMEGA	GAAGA^s1 CTTCT(N) 7t
RsaI	PROMEGA	GTˇAC CA^TG
Frekvence alelnih variant, opaženo (Ho) in pričakovano heterozigotnost (He), informativno vrednost lokusa (PIC), verjetnost izključitve napačnega roditelja (Ep) in oceno frekvenc ničelnih alelov (Fe) smo izračunali s programskim paketom CERVUS (Marshall in sod., 1998).
REZULTATI IN DISKUSIJA
Z metodo PCR-RFLP smo izvedli genotipizacijo 40 ovac na lokusih za ß-LG i ?s1-CN. Rezultati analize obeh lokusov so prikazani v preglednici 3.
V našem sistemu smo identificirali dve alelni varianti ß-LG, A in B. Našli smo devet homozigotov AA, 25 heterozigotov AB in šest homozigotov BB. Alelne variante ß-LG C nismo
Ivanković, A in Dovč, P. Polimorfizem genov za ß-laktoglobulin in ?s1-kazein paške ovce.
127
našli v proučevanem vzorcu. Testiranje distribucije genotipov (?2 = 1,71) kaže, da opazovane frekvence ne odstopajo značilno od pričakovanih frekvenc.
Genotip AA smo identificirali po fragmentih dolžine 66, 37 in 17 bp, genotip AB po fragmentih 103, 66, 37 in 17 bp, genotip BB pa po fragmentih 103 in 17 bp. Na sliki 2 je prikazanih nekaj genotipov vzorcev paške ovce.
Preglednica 3.
Table 3.
Porazdelitev frekvrnc genotipova i alela laktoproteina ß-LG i ?s1-CN paške ovce (opazovana heterozigotnost, Ho; pričakovana heterozigotnost, He; informativna vrednost lokusov, PIC; verjetnost izključitve, Ep; ocena frekvence ničelnih alel, Fe)
Distribution of ß-LG and ?s1 CN genotypes and gene frequencies of Pag sheep (observed heterozygosity, Ho; expected heterozygosity, He; polymorphism information content, PIC; exclusion probability, Ep; estimate null allele frequency, Fe)
	Genotip Genotyp		Alel Alelle		Ho	He	PIC	Ep	Fe
ß-LG	AA AB BB	9 25 6	A B	0,5375 ± 0,0557 0,4625	0,625	0,503	0,374	0,187	-0,1139
ots1-CN	AA AD A-D-	1 1 4 9 25	A D -	0,0875 ± 0,0447 0,1250 ± 0,0523 0,7875 ± 0,0647	0,350	0,361	0,327	0,185	+0,0119
‘–‘ = alelne variante B, C in E na lokusu za ?s1-CN / ‘–‘ = alellic variants B, C and E at ?s1-CN locus
Z metodo PCR-RFLP smo določili frekvence alelnih variant ?s1-CN A in D v populaciji paške ovce. Pri 15 od 40 testiranih ovac smo našli alelne variante ?s1-CN (A in D), v preostalih 25 vzorcih pa ti dve varianti nista bili navzoči. V vzorcu smo našli 14 heterozigotnih živali in eno homozigotno AA žival. Najpogosteje zastopan heterozigot je genotip D-ki se je pojavil pri devetih vzorcih, sledi mu Apri štirih vzorcih (- pomeni kateri koli drug alel ?s1-CN, razen že prisotnega). Med preiskanmi živalmi smo našli le eno heterozigotno žival z genotipom AD. Test distribucije genotipov (?2 = 2,7916) kaže, da odstopanje opazovanih frekvenc genotipov od pričakovanih ni signifikantno.
Ocenjene frekvence alelov skupaj z rezultati predhodnih raziskav o korelaciji med alelnimi variantami in kvalitativnimi in kvantitativnimi lastnostmi mleka odpirajo možnosti za selekcijo v smeri izboljšanja proizvodih parametrov mleka za proizvodnjo "paškega sira", ki je edini tržno uveljavljen proizvod paške ovce. Določene frekvence alelnih variant ß-LG A in B paške ovce (0,5375; 0,4625) kažejo na odstopanje od frekvenc nekaterih izrazito mlečnih pasem ovac. Frekvence ß-LG variant "British Milksheep" in "Hungarian Merino" ki jih je ocenil Anton s sod. (1999) imajo znatno višjo frekvenco alela A (0,6857; 0,6767). Pasma "Awasi" ima nižjo frekvenco alela A (0,3478), medtem ko imata
vzorcev
Slika 2.    Genotipi   ß-LG   štirih
paške ovce. Figure 2. Genotypes at the ß-LG locus of
the four Pag island sheep.
128    Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2.
madžarski populaciji pasem Tsigai in Lacaune (0,5650; 0,4730) podobne frekvence ß-LG A kot paška ovca. Zastopanost frekvenc alel ß-LG je prikazana na sliki 3.
Nekatere raziskave kažejo (Moioli in sod., 1995; Prisi in sod., 1999a), da je v sirarstvu bolj zaželena alelna varianta ß-LG A, ker vpliva na boljšo izkoristljivost mleka in boljšo kakovost sira. Glede na to, da se večina mleka paške ovce predela v "paški sir", bi bila bolj zaželena večja zastopanost alelne variante ß-LG A. Mlečni pasmi ovac "British Milksheep" in "Hungarian Merino" (Anton in sod., 1999) imata mleko, ki je zaradi visoke frekvence alela A primernejše za sirarsko proizvodnjo, mleko paške ovce pa ima zaradi nizke frekvence tega ugodnega alela po vsej verjetnosti manj ugodne tehnološke lastnosti.

1.0
0.9 -
0.8 -
0.7
0.6
0.5 -
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
Awassi
D ß-LG A
1111
Q ß-LG B
Lacaune
Paška ovca
Tsigai
Hungarian Merino
British Milksheep
Slika 3.    Frekvence alelnih variant ß-LG nekaterih populacij ovac. Figure 3. Frequencies ß-LG alleles of different breeds sheep.
Oceni frekvenc alelnih variant as1-CN A in D ne odstopata znatno od frekvenc populacij, navedenih v literaturi. Frekvenca alele A je nizka pri vseh proučevanih pasmah, pri paški ovci pa je nekoliko višja. Varianta D je v populaciji paške ovce zastopana z nižjo frekvenco kot pri sardinijski ovci, kar je ugodno, saj je varianta D v sirarstvu nezaželena. Frekvence alelnih variant as1-CN nekaterih populacij ovac so prikazane v preglednici 4. Varianta D je povezana z nižjo vsebnostjo mlečne masti in proteinov (Bolla in sod., 1989), nižjo vsebnostjo kazeina in s slabšimi lastnostmi sirarskega zrna (Piredda in sod., 1993). Prisi s sod. (1999b) meni, da je najprimernejši genotip za proizvodnjo sira genotip CC.
Preglednica 4.   Frekvenca alelnih variant as1 CN nekaterih populacij ovac Table 4.            Frequencies of as1 CN alleles in different sheep breeds
Populacije Breeds	Frekvence alelov / Alele frequencies					Avtorji Authors
	A	B	C	D	E	
Paška ovca Pag Island Sheep	0,087	?	?	0,130	?	ta študija / this study
Manchega	0,055	0,345	0,600	-	-	López Gálvanez in sod., 1999
Segurena	0,020	0,090	0,890	-	-	López Gálvanez in sod., 1999
Sarda sheep	0,070	0,175	0,485	0,250	0,020	Prisi in sod., 1999
Ivanković, A in Dovč, P. Polimorfizem genov za ß-laktoglobulin in ?s1-kazein paške ovce.
129
Na osnovi ugotovljenih frekvenc lahko rečemo, da v populaciji paške ovce po vsej verjetnosti razmerje alelnih variant proučevanih laktoproteinov ni najugodnejše za tehnološke lastnosti mleka. Ker uporaba PCR-RFLP metodologije omogoča identifikacijo polimorfnih variant tudi pri moških živalih, bi z učinkovito selekcijo na ugodne genotipe laktoproteinskih genov dokaj hitro spremenili frekvence alelov laktoproteinskih genov v korist genotipov z ugodnimi lastnostmi na tehnološke lastnosti mleka. Uporaba opisane metodologije, bi v okviru ustreznega rejskega programa, lahko kmalu pokazala tudi ekonomsko korist zaradi pričakovanega izboljšanja kvalitete osnovne surovine za proizvodnjo paškega sira.
LITERATURA
Anifantakis, E.M. Comparison of the physico-chemical properties of ewes and cows milk. Bulletin International
Dairy Federation, 202(1985), 42-53. Anton, I./ Zsolnai, A./ Kukovics, S./ Molnár, A./ Fésüs, L. Genetic polymorphisms of milk proteins in Hungarian
dairy sheep breeds and crosses. V: FAO Proceedings of the workshop, Budapest, 1997-11/12-29/02. Rome, REU
Technical Series, 1998, 224-226. Anton, I./ Zsolnai, A./ Fésüs, L./ Kukovics, S./ Molnár, A. Survey of ß-lactoglobulin and as1-casein polymorphism
in Hungarian dairy sheep breeds and crosses at DNA level. Archiv für Tierzucht, 42(1999), 387-392. Arave, C.W./ Gillet, T. A./ Price, D.A./ Matthews, D.H. Polymorphisms in caseins of sheep milk. Journal of Animal
Science, 36(1973), 241-244. Ausubel, F.M./ Brent, R./ Kingston, R.E./ Moore, D.D./ Seidman, G.G./ Smith, J.A./ Struhl, R. Current protocols in
molecular biology. Green Publishin Associates and Wiley-Interscience, New York, 1987. Bolla, P./ Caroli, A./ Mezzelani, A./ Rizzi, R./ Pagnacco, G./ Fraghi, A./ Casu, S. Milk protein markers and
production in sheep. Animal Genetics, 20(1989)Suppl. 1, 78. Chianese, L./ Mauriello, R./ Moio, L./ Intorcia, N./ Addeo, F. Determination of ovine casein heterogeneity using gel
electrophoresis and immunochemical techniques. Journal of Dairy Research, 59(1992), 39-47. Chianese, L./ Garro, G./ Mauriello, R./ Laezza, P./ Ferranti, P./ Addeo, F. Occurrence of five as1-casein variants in
ovine milk. Journal of Dairy Research, 63(1996), 49-59. Erhardt, G. Evidence for a third allele at the ß-Lg lokus of sheep and its occurrence in different breeds. Animal
Genetics, 20(1989), 197-204. Feligini, M./ Parma, P./ Aleandri, R./ Greppi, G.F./ Enne, G. PCR-RFLP test for direct determination of ß-
lactoglobulin genotype in sheep. Animal Genetics, 29(1998), 473-474. Ferranti, P./ Malorni, A./ Nitti, G./ Laezza P./ Pizzano, R./ Chianese, L./ Addeo, F. Primary structure of ovine as1-
caseins: localization of phosphorylation sites and characterization of genetic variants A, C and D. Journal of
Dairy Research, 62(1995), 281-296. Garzon,   A.I./  Martinez,   J.  Beta-lactoglobulins  (ß-Lg)  in Manchega  sheep breed:  Relationship  with milk
technological idnexes in handcraft manufacture of Manchego cheese. Animal Genetics, 23(1992)Suppl. 1, 106. Jardas, F. Dosadašnji rad i iskustva oko merinizacije u NR Hrvatskoj. Stočarstvo, 5(1951), 97-114. King, J.W.B. The distribution of sheep ß-lactoglobulins. Animal Production, 11(1969), 53. Kolde, H.J./ Braunitzer, G. The primary ctructure of ovine ß-Lg. Milchwissenschaft, 38(1983), 70-72. Kukovics, S./ Daróczi, L./ Kovács, P./ Molnár, A./ Anton, I./ Zsolnai, A./ Fésüs, L./ Ábrahám, M. The effect of ß-
lactoglobulin genotype on cheese yield. V: Proceedings of the Sixth International Symposium on the Milking of
Small Ruminants, Athens, 1998-09/10-26/01. Wageningen, EAAP Publication, 95(1999a), 524-527. Kukovics, S./ Molnár, A./ Anton, I./ Zsolnai, A./ Fésüs, L./ Ábrahám, M. The effect of ß-lactoglobulin genotypes on
milk composition of various sheep breeds. V: Proceedings of the Sixth International Symposium on the Milking
of Small Ruminants, Athens, 1998-09/10-26/01. Wageningen, EAAP Publication, 95(1999b), 539-542. Kukovics, S./ Molnár, A./ Ábrahám, M./ Anton, I./ Zsolnai, A./ Fésüs, L. The effect of sheep genotype on the
somatic cell counts of milk. V: Proceedings of the Sixth International Symposium on the Milking of Small
Ruminants, Athens, 1998-09/10-26/01. Wageningen, EAAP Publication, 95(1999c), 443-446. López Gálvanez, G./ Chianese, L./ Addeo, F./ Amigo, L./ Ramos, M. Polymorphism of as-caseins ina the of two
Spanish ovine breeds. Milchwissenschaft, 54(1999), 17-19. Manfredini, M./ Massari, M.  Small ruminant milk.  Technological aspects:  storage and processing. Option
Mediteraneennes, 6(1989), 191-198. Marshall, T.C./ Slate, J./ Kruuk, L./ Pemberton, J.M. Statistical confidence for likelihood based paternity inference
in natural populations. Molecular Ecology, 7(1998), 639-655.
130    Acta agriculturae slovenica, 84(december 2004)2.
Moioli, B./ Pilla, F./ Rando, A./ Tripaldi, C. Possible exploitation of DNA polymorphisms as genetic markers to
improve milk production traits in sheep and goats. V: Proceedings of the 46th Annual meeting of European
Association for Animal Production, Prague, 1995-09-04/07. Wageningen, Wageningen Pers, 1995, 229. Pavlinić, P. Paška ovca. Veterinarski arhiv, 6(1936), 276-296. Pilla, F./ Bevilacqua, C/ Leroux, C/ Fraghi, A./ Martin, P. Genotyping of a-s1 casein in sheep. Animal Genetics,
29(1998), 472-473. Piredda, G./ Papoff, CM./ Sanna, S.R./ Campus, R.L. Influence of as1-casein genotype on the physicochemical and
lactodynamographic characteristics of milk. Scienza e Tecnica Lattiero-Casearia, 44(1993), 135-143. Portolano, B./ Giaccone, P./ Todaro, M./ Di Stasio, L./ Fiandra, P. Effect of ß-lactoglobulin on milk composition
and cheese yield in sheep. Animal Genetics, 27(1996)Suppl. 2, 119. Prinzenberg, E.M./ Erhardt, G. Molecular genetic characterization of ovine ß-lactoglobulin C allele and detection by
PCR-RFLP. Journal of Animal Breeding and Genetics, 116(1999), 9-14. Prisi, A./ Fraghi, G./ Piredda, G./ Leone. P. Influence of sheep AA, AB and BB ß-lactoglobulin genotypes on milk
composition and cheese yield. V: Proceedings of the Sixth International Symposium on the Milking of Small
Ruminants, Athens, 1998-09/10-26/01. Wageningen, EAAP Publication, 95(1999a), 553-555. Prisi, A./ Piredda, G./ Di Salvo, R./ Papoff, CM./ Pintus, S. Influence of ovine as1-casein genotype on milk
composition and cheeseyielding capacity. V: Proceedings of the IDF/ CIRVAL Seminar: Production and
utilization of ewe and goat milk, Crete,  1995-10-19/21. Brusseles, International Dairy Federation,  1995,
179-183. Prisi, A./ Piredda, G./ Papoff, CM./ Di Salvo, R./ Pintus, S./ Garro, G./ Ferranti, P./ Chianese, L. Effects of sheep
as1-casein CC, CD and DD genotypes on milk composition and cheesemaking properties. Journal of Dairy
Research, 66(1999b), 409-419. Ramunno, L./ Cosenza, G./ Rando, A./ Macciotta, N.P.P./ Pappalardo, L./ Masina, P. Identification of Carriers of the
Welsh CASA1 variant using an allele-specific PCR method. Animal Genetics, 28(1997), 154-155. Schlee, P./ Krause, I./ Rottmann, O. Genotyping of ovine ß-lactoglobulin alleles A and B using the polymerase
chain reaction. Archiv für Tierzucht, 36(1993), 519-523. Shalichev, J./ Tanev, G. Isolation, Purification and Determination of Some Chemical and Physicochemical
Characteristics of Sheep Alpha s-Casein. Journal of Dairy Science, 56(1972), 171-176.