< m < cc O q_ 3 š O < z >o § LU <2 t cc ^ cc LU q_ 3 co co LU g < CC CO LU 2 o LU _I > N 2 CO 3 cc RASTLINSKI IZVLEČKI EKSTRAKCIJE S SUPERKRITIČNIMI TEKOČINAMI IN NJIHOVA UPORABA SUPERCRITICAL FLUID PLANT EXTRACTS AND THEIR USE AVTOR / AUTHOR: Asist. Katja Kramberger, mag. farm.1 Izr. prof. dr. Nina Kočevar Glavač, mag. farm.2 1 Univerza na Primorskem, Fakulteta za vede o zdravju, Katedra za prehransko svetovanje - dietetiko, Polje 42, 6310 Izola 2 Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Katedra za farmacevtsko biologijo, Aškerčeva 7, 1000 Ljubljana NASLOV ZA DOPISOVANJE / CORRESPONDENCE: E-mail: katja.kramberger@fvz.upr.si POVZETEK Metoda ekstrakcije s superkritičnimi tekočinami velja za relativno novo metodo pridobivanja rastlinskih izvlečkov. Je bolj učinkovita in selektivna ter okolju prijaznejša alternativa običajnim postopkom ekstrakcije. V članku navajamo postopek pridobivanja izvlečkov s superkritičnim CO2 in prednosti njihove uporabe na področju farmacije, prehrane in kozmetike, podkrepljene s praktičnimi primeri. KLJUČNE BESEDE: ekstrakcija s superkritičnim CO2, bioaktivne spojine rastlinski izvlečki, ABSTRACT Supercritical fluid extraction method is relatively new plant extraction method, which is more effective, selective and environment-friendlier alternative to conventional extraction procedures. In the article we present procedures for obtaining supercritical CO2 plant extracts and advantages of their use in the field of pharmacy, nutrition and cosmetics, illustrated by practical examples. KEY WORDS: supercritical CO2 extraction, plant extracts, bioactive compounds 1 UVOD Bioaktivne spojine so v rastlinah navadno prisotne v majhnih koncentracijah, zato se znanstveniki še danes intenzivno ukvarjajo z razvojem bolj učinkovitih in selektivnih ek-strakcijskih metod (1). Čeprav so tradicionalni postopki tehnološko večinoma enostavni in uveljavljeni, je z njimi povezanih nekaj pomembnih slabosti: velike količine odpadnih topil, ki so pogosto toksična in vnetljiva, ter uporaba toplote, ki lahko privede do razpada termolabilnih molekul (2, 3). »Zelena kemija« se je za namene ekstrakcije pojavila v devetdesetih letih prejšnjega stoletja, s ciljem zmanjšanja porabe energije in zamenjave običajnih topil z naravi manj škodljivimi alternativami. Metoda ekstrakcije s superkritičnimi tekočinami izpolnjuje oba navedena cilja (2). Ekstrakcija s superkritičnimi tekočinami se je najprej pojavila v prehranski industriji za pridobivanje brezkofeinske kave, 50 farm vestn 2019; 70 nato pa se je uveljavila tudi za pridobivanje rastlinskih izvlečkov za farmacevtsko uporabo (4). 2 SUPERKRITICNE TEKOČINE IN EKSTRAKCIJA 2.1. LASTNOSTI SUPERKRITICNIH TEKOČIN Superkritična tekočina nastane, kadar temperatura in tlak presežeta kritično točko spojine; slika 1 prikazuje primer ogljikovega dioksida (CO2). Nad kritično temperaturo tekoče stanje ni več mogoče, ne glede na tlak. Parni tlak snovi pri njeni kritični temperaturi imenujemo kritični tlak (2, 5). Temperatura Slika 1: Fazni diagram ogljikovega dioksida, prirejeno po (6). Figure 1: Phase diagram for carbon dioxide, adapted from (6). Superkritična tekočina je homogena faza z lastnostmi tekočine (možnost raztapljanja, zanemarljiva površinska napetost) kot tudi plina (prodiranje v material) (7). Fizikalne lastnosti superkritične tekočine so vmes med lastnostmi plina in tekočine: gostota in stisljivost sta podobni kot pri tekočinah, plinom pa jo približata dobra difuzivnost in nizka viskoznost (preglednica I) (2, 5, 7). Posledica nizke viskoznosti in visoke difuzivnosti superkritičnih tekočin je dobra sposobnost raztapljanja. Lažje prodrejo v porozne snovi kot tekočine in hitrost prenosa mase je večja (1). S spreminjanjem temperature in tlaka spreminjamo njihovo gostoto - če tlak pri kritičnih pogojih povišamo štirikrat, se gostota približno podvoji in približa gostoti tekočin, difuzivnost in viskoznost pa ostaneta takšni, kot ju imajo plini (2). Možnost spreminjanja moči raztapljanja vodi do visoke selektivnosti v ekstrakciji ciljanih spojin, ki jo lahko dosežemo v precej krajšem času kot pri običajnih metodah ekstrakcije (1, 2). Sveža superkritična tekočina med dinamično ekstrakcijo nenehno teče skozi vzorec in s tem omogoča bolj kvantitativno in popolnejšo ekstrakcijo, zato so izkoristki zelo dobri. Zaostanka topil ni, saj superkritična tekočina enostavno preide v plinasto stanje ob znižanju tlaka, nastali izvlečki pa so tudi zelo koncentrirani (1). Zaradi popolne ločitve faz je uplinjeno topilo čisto in ga lahko ponovno uporabimo. Ekstrakcija poteka pri nizki temperaturi in je predvsem primerna za pridobivanje spojin, občutljivih na visoko temperaturo (1, 2). 2.2. SUPERKRITIČNI CO2 Izmed vseh topil najpogosteje uporabljamo CO2, saj ima ugodne kritične konstante (Tc = 31,1 °C in Pc = 73,8 bar), je brez vonja in okusa, visoke stopnje čistote, netoksičen, nevnetljiv in cenovno dostopen (7). Zaradi svoje nepolar-nosti zelo dobro raztaplja lipofilne snovi, kot so trigliceridi (rastlinska olja in masla), eterična olja in lipofilni vitamini. Večina bioaktivnih spojin v rastlinah je bolj polarnih od CO2, zato je za ekstrakcijo hidrofilnih snovi potrebno k superkri-tični fazi dodati polarne organske modifikatorje, kot sta etanol ali metanol (1, 4), ali tudi voda (7). Pri tem velja poudariti, da polarni modifikatorji spremenijo kvalitativno in kvantitativno sestavo izvlečka. Da se izognemo polarnim modifikatorjem, je smiselno namesto CO2 uporabiti bolj polarno superkritično tekočino. Voda kot topilo ne pride v poštev, saj je kritična točka pri veliko ostrejših pogojih (374 °C, 221 bar), pri katerih že nastopi korozivnost (7). Dovolj polarna snov z ugodnimi konstantami je npr. didušikov ok- 3 >o š! LU I z < z N O LU _I a LU cc Q_ Preglednica I: Primerjava gostote, difuzivnosti in viskoznosti plinov, superkritičnih tekočin in tekočin (5). Table I: Comparison of density, difussion coefficient and viscosity properties of gases, supercritical fluids and liquids (5). Fizikalna lastnost Faza Plin Superkritična tekočina Tekočina Gostota (g/cm3) (0,6-2) x 10-3 0,2-0,5 0,6-2 Difuzijski koeficient (cm2/s) (1-4) x 10-1 10-3-10-4 (0,2-2) x 10-5 Viskoznost (g-cm-1s-1) (1-3) x 10-4 (1-3) x 10-4 (0,2-3) x 10-2 51 farm vestn 2019; 70 < m < cc O q_ 3 š O < z >o § LU <2 t cc ^ cc LU q_ 3 co co LU g < CC CO LU 2 o LU _I > N 2 CO 3 cc sid (N2O), ki so ga uporabili za izolacijo paklitaksela. Njegova uporaba je omejena, saj lahko ob prisotnosti organskih spojin pride do eksplozij (1). 2.3. POSTOPEK EKSTRAKCIJE Ekstrakcija s superkritičnimi tekočinami je petstopenjski proces. Tekoči CO2 s pomočjo visokotlačne črpalke črpamo skozi izmenjevalec toplote v ekstrakcijsko posodo (slika 2). V izmenjevalcu toplote zaradi vpliva tlaka in temperature CO2 preide v superkritično stanje. Superkritični CO2 nato preide v ekstrakcijsko posodo, kjer se nahaja suh in zdrobljen rastlinski material. Med ekstrakcijo super-kritično topilo prehaja skozi rastlinski material in raztaplja topne spojine. Tlak v ekstrakcijski posodi vzdržuje regulator tlaka. Zmes topljenca in superkritične tekočine vodimo v odstavne posode, kjer tlak postopoma popuščamo. Zaradi nižanja tlaka postopoma pada tudi moč raztapljanja in to-pljenec izpade iz topila. Na koncu tlak zmanjšamo do te mere, da CO2 preide v plin, ki nima več moči raztapljanja. Nato ga ponovno shladimo in utekočinimo v sistemu recikliranja plina ali pa ga s pomočjo plinskih »boosterjev« in črpalke neposredno vrnemo v sistem (7). 2.4. PREDNOSTI IN SLABOSTI EKSTRAKCIJE Nekaj pozitivnih lastnosti ekstrakcije s superkritičnimi tekočinami smo že izpostavili, vendar ima metoda tudi druge prednosti, ki so bolj operativnega značaja (preglednica II). Napravo je mogoče sklopiti s kromatografskimi metodami, kot so HPLC in GC ter njuni sklopitvi z MS. Ekstrakcijo je mogoče izvesti v različnih obsegih: od analitskih (nekaj gramov), preparativnih (nekaj sto gramov) do velikih industrijskih (tone rastlinske droge). Posebnost metode je tudi ta, da daje več informacij o postopku ekstrakcije in njenem mehanizmu, saj ekstrakcijske razmere zelo natančno nadzorujemo. Na podlagi teh podatkov je mogoče oceniti učinkovitost ekstrakcije in jo ustrezno nadalje optimizirati (1). Kot vsaka metoda pa ima tudi metoda superkritične ek-strakcije slabosti (preglednica II). Najpomembnejša je zagotovo cena, saj je investicijski strošek zelo visok (2, 8). 3 UPORABA V FARMACIJI, KOZMETIKI IN PREHRANI Z razvojem sodobnih kromatografskih in spektroskopskih metod se je izboljšalo razumevanje kemije snovi rastlinskega izvora, s tem pa se je povečalo tudi zanimanje za raziskovanje teh snovi za uporabo npr. kot zdravila, pre-hranska dopolnila, kozmetični izdelki ali pesticidi. Najbolj zanimivo in aktivno področje raziskav je ravno farmacevtsko, predvsem z vidika odkrivanja in proučevanja novih spojin kot potencialnih zdravilnih učinkovin (1). Podroben pregled uporabnosti ekstrakcije s superkritičnimi tekočinami podajamo v preglednici III. LEGENDA: T - rezervoar P - črpalka H - izmenjevalec toplote E - ekstrakcijska posoda S1-S2 - ločevalne celice Co - rezervoar za sotopilo C - kondenzator Slika 2: Shema naprave za ekstrakcijo s superkritičnimi tekočinami (7). Figure 2: Supercritical fluid extraction apparatus scheme (7). 52 farm vestn 2019; 70 Preglednica II: Prednosti in slabosti ekstrakcije s superkritičnimi tekočinami. Table II: Advantages and disadvantages of supercritical fluid extraction. PREDNOSTI SLABOSTI Selektivnost Visok investicijski strošek Učinkovitost Velikost naprave Kratek čas ekstrakcije Potreba po organskih sotopilih Energetsko varčna in okolju prijazna metoda (majhna poraba energije med delovanjem, netoksična topila in možnost ponovne uporabe topila) Zahtevnost rokovanja z napravo (visoko usposobljen kader) Dobljeni izvlečki so koncentrirani (ločitev topila z uplinjenjem oz. odparevanjem) Primernost za termolabilne spojine Možnost sklopitve s kromatografskimi metodami Možnost natančne prilagoditve dejavnikov ekstrakcije in optimizacije postopka 3.1. IZOLACIJA SPOJIN ZA RAZISKOVALNE NAMENE Ekstrakcijo s superkritičnimi tekočinami pogosto uporabljamo v raziskovalne namene, torej za pridobivanje rastlinskih izvlečkov kot vzorcev za nadaljnjo fitokemijsko karak-terizacijo (npr. s kromatografskimi, spektrometričnimi in gravimetričnimi metodami) (9). Bioaktivne spojine so razširjenje v zdravilnih rastlinah, sadju, zelenjavi in tudi v odpadu, nastalem po pridelavi hrane (10). Prvi primer predstavljajo polifenoli, ki so spojine z antioksidativnim delovanjem. V primerjavi z običajnimi postopki ekstrakcije so imeli izvlečki, pridobljeni s superkritičnim CO2, v večini primerov, kljub nižjim izkoristkom, podobne ali boljše antioksidativne lastnosti (11). Razlog je v izoliranem širšem spektru spojin, ki navadno delujejo sinergistično (11, 12). Izolacija antioksi-dantov je bolj učinkovita, če se poslužimo zaporedne ek-strakcije: v prvi stopnji se pod milejšimi razmerami ekstra-hirajo hlapne spojine (eterična olja), nato pa v drugi stopnji z višanjem tlaka in dodajanjem organskega modifikatorja ekstrahiramo še bolj polarne spojine (polifenoli) (11). Primer tovrstne uporabe ekstrakcije s superkritičnim CO2 je optimizacija ekstrakcijskih razmer pri ekstrakciji zeli šentjanževke (Hypericum perforatum L.), kjer so raziskovalci poskušali povečati delež hiperforina v izvlečkih. Ta je zaradi svoje li-pofilnosti v običajnih etanolno-vodnih izvlečkih prisoten le v manjšem obsegu, medtem ko je njegov delež v rastlini precej večji. Z optimizacijo ekstrakcijskih razmer so povečali delež hiperforina v izvlečku do 35 % (4). 3.2. IZOLACIJA ZDRAVILNIH UČINKOVIN Metoda ekstrakcije s superkritičnimi tekočinami je uporabna za izolacijo redkih spojin, ki so v rastlinah prisotne v majhni količini, ravno zaradi velike selektivnosti in učinkovitosti. Čeprav je ekstrakcija redkih spojin s superkritičnimi tekočinami učinkovita, pa za pridobivanje zdravilnih učinkovin v industrijskem merilu pogosto ni primerna. Viri rastlinskega materiala so namreč omejeni, zato je velikokrat potrebno spojine pripraviti sintezno. Tak primer je izolacija protirakave učinkovine paklitaksela, ki se nahaja v lubju pacifiške tise (Taxus brevifolia L.) v zelo majhnih količinah (50-100 mg/kg skorje) in bi za zdravljenje enega bolnika potrebovali dve do tri 60-letna drevesa (13). Drugače je z rastlinami, ki jih lahko širše umetno gojimo za namene izolacije spojin. Čeprav je možna totalna sinteza antimalarika artemizinina, je izolacija iz listov (gojenega) enoletnega pelina (Artemisia annua L.) cenovno ugodnejša, kljub temu, da so izkoristki zgolj okoli 1 % mase suhe rastline (14). Ekstrakcija s superkritičnim CO2 omogoča kvantitativno izolacijo artemizinina in preprečuje njegov termični razpad (14, 15). 3.3. IZOLACIJA HLAPNIH SPOJIN Hlapne spojine v aromatičnih rastlinah poznamo kot eterična olja. Kemijsko gre za zmesi mono- in seskviterpenov ter njihovih oksigeniranih derivatov (alkoholi, aldehidi, ketoni, kisline, fenoli, oksidi, laktoni, estri in etri) ali fenilpropanoidov. Poudariti moramo, da so prava eterična olja le tiste hlapne 3 0 š! LU 1 z < z N O LU _I O LU cc Q_ 53 farm vestn 2019; 70 < m < cc O q_ 3 š O < z >o § LU <2 t cc ^ cc LU q_ 3 co co LU g < CC CO LU 2 o LU _I > N 2 CO 3 cc spojine, ki jih pridobimo z destilacijo in stiskanjem. Izraz eterično olje za izvlečke, pridobljene z ekstrakcijo s super-kritičnimi tekočinami, zato ni najbolj primeren, čeprav vsebujejo po kemizmu enak oz. podoben profil spojin. Med postopkom destilacije lahko poleg izgube hlapnih spojin pride tudi do kemijskih sprememb (oksidacija, hidroliza) in raztapljanja bolj polarnih hlapnih spojin v vodni fazi (hidrolat). Pri ekstrakciji s superkritičnimi tekočinami topil ni potrebno odparevati, zato hlapne spojine v izvlečku ohranimo (7). Izvlečki s hlapnimi spojinami, pridobljeni s superkritičnim CO2, so po sestavi najbolj podobni esenci rastline (16). So torej boljše kakovosti, predvsem v smislu aromatičnosti, na katero vplivamo s spreminjanjem ekstrakcijskih razmer (temperature, tlaka, pretoka, vrste in deleža organskega modifikatorja) (7). Izvlečki s hlapnimi spojinami rožmarina (Rosmarinus officinalis L.), kumine (Cuminum cyminum L.), janeža (Pimpinella anisum L.) in timijana (Thymus serpyllum L.) so imeli boljše antioksidativno delovanje, ko so jih pridobili z ekstrakcijo s superkritičnim CO2 (17). Tovrstni rastlinski izvlečki oz. v njih prisotne hlapne spojine so izkazovali tudi dobro protibakterijsko (npr. karvakrol, a-pinen in germakrolid), protiglivno (npr. 1,8-cineol, kariofilenoksid in kafra) in insekticidno aktivnost (npr. skvalen in kampesterol) (7). 3.4. IZOLACIJA TRIGLICERIDOV (RASTLINSKIH OLJ) IN VITAMINOV Metoda ekstrakcije s superkritičnimi tekočinami je uporabna tudi za izolacijo, frakcioniranje lipidov in njihovo predelavo do industrijskih izdelkov (6). Nerafinirana trigliceridna olja, izolirana s superkritičnimi tekočinami, veljajo za bolj kakovostna, saj vsebujejo več antioksidantov (polifenolov in to-koferolov), ki zavirajo oksidativno kvarjenje olj. V primerjavi z običajnim pridobivanjem rastlinskih olj in masel poteka postopek ekstrakcije pri nizki temperaturi in v okolju z omejenim dostopom kisika, kar prav tako pripomore k ohranjanju njihove oksidativne stabilnosti (18). Tak način ek-strakcije je pomemben predvsem za izolacijo nestabilnih olj kot je laneno olje (19). Pogosto optimiziramo ekstrakcij-ske razmere za povečanje izkoristka olja in vsebnosti to-koferolov. Tokoferole lahko ekstrahiramo tudi neposredno iz rastlinskega materiala - npr. iz semen vinske trte (Vitis vinifera L.) ali iz listov oljke (Olea europaea L.) (20). Preglednica III: Primeri uporabe ekstrakcije s superkritičnimi tekočinami na področjih farmacije, prehrane in kozmetike. Table III: Examples of supercritical fluid extraction use in the fields of pharmacy, food and cosmetics. Področje uporabe Opis postopka ekstrakcije Vrsta spojine Namen/pomen ekstrakcije Optimizacija izolacije partenolida iz listov belega vratiča (Tanacetum parthenium L.) Seskviterpenski laktoni Proučevanje protimigrenskega delovanja partenolida (16) Odstranjevanje nečistot v pomožnih snoveh Različne spojine Pridobivanje pomožnih snovi visoke stopnje čistosti (8) Farmacija Odstranjevanje pesticidov iz rastlinskih zdravil kitajske tradicionalne medicine Kloroalkani Razvoj metode za detekcijo pesticidov (21) Izolacija faradiola iz cvetov ognjiča (Calendula officinalis L.) Triterpenski alkoholi Povečevanje deleža spojine s protivnetnim delovanjem (16) Ekstrakcija česna (Allium sativum L.) Žveplove spojine Izolacija spojin s protimikrobnim delovanjem (7) Izolacija bioaktivnih spojin rozmanola in karnozola iz rožmarina (Rosmarinus officinalis L.) in žajblja (Salvia officinalis L.) Diterpeni Odstranjevanje hlapnih substanc z neprijetnim vonjem od bioaktivnih spojin (16) Farmacija/ prehrana Izolacija p-karotena iz sladkega krompirja (Ipomoea batatas L.) Karotenoidi Optimizacija ekstrakcijske metode (9) Izolacija absintina iz pelina (Artemisia absinthium L.) Seskviterpenski lakton Izolacija grenčine brez prisotnosti P-tujona (16) 54 farm vestn 2019; 70 Izolacija flavonoidov iz eksokarpa pomela (Citrus grandis L.) Flavonoidi Testiranje metode za ekstrakcijo (22) Ekstrakcija konopljinega olja (Cannabis sativa L.) Trigliceridi/ tokoferoli Pridobljeno olje s povečano vsebnostjo tokoferolov (23) Prehrana Odstranjevanje holesterola iz mleka Steroli Zmanjševanje deleža holesterola (9) Izolacija grenčin iz hmelja (Humulus lupulus L.) Fluoroglucinoli Za ojačevanje arome piva (7) Izolacija hlapnih spojin z antioksidativnim potencialom iz črnega popra (Piper nigrum L.) Oleorezin Primerjava metod za pridobivanje izvlečkov za zaviranje kvarjenja mlete svinjine (24) Prehrana/ kozmetika Optimizacija metode za pridobivanje ričkovega olja (Camelina sativa L.) Trigliceridi Pridobivanje bolj kakovostnega deviškega olja v primerjavi z ekstrakcijo s topili (25) Kozmetika Izolacija aromatične spojine sklareola iz muškatne kadulje (Salvia sclarea L.) Diterpeni Uporaba v parfumih, ojačevalcih vonja hrane (16) Pridobivanje izvlečka arnike (Arnica montana L.) Seskviterpenski laktoni Odstranjeni seskviterpenski laktoni, ki povzročajo kontaktni dermatitis (16) 3 >o š! LU £ Z < z N O LU _I O LU cc Q_ 4 SKLEP Z metodo ekstrakcije s superkritičnimi tekočinami lahko pripravimo izvlečke z različno sestavo in iz raznolikega rastlinskega materiala. Metoda ima številne tehnološke prednosti, med katerimi izstopata selektivnost in prilagodljivost ekstrakcijskih razmer. Kljub številnim raziskavam možnosti uporabe te »zelene« metode, je prostora za izboljšave še veliko, zlasti na področju odkrivanja zdravilnih učinkovin (7). Predvsem je pomembna uveljavitev ekstrak-cije s superkritičnimi tekočinami kot metode izbora z vidika ekološke trajnosti. 4 5. 5 LITERATURA 1. Lang Q, Wai CM. Supercritical fluid extraction in herbal and natural product studies - a practical review. Talanta. 2001 Jan;53(4):771-82. 2. Khaw K-Y, Parat M-O, Shaw PN, Falconer JR. Solvent Supercritical Fluid Technologies to Extract Bioactive Compounds from Natural Sources: A Review. Mol Basel Switz. 2017 Jul;22(7). 3. Kočevar Glavač N. Pridobivanje in vrednotenje rastlinskih izvlečkov. Farm Vestn. 2018 Oct; 69(4):259-64. Römpp H, Seger C, Kaiser CS, Haslinger E, Schmidt PC. Enrichment of hyperforin from St. John's wort (Hypericum perforatum) by pilot-scale supercritical carbon dioxide extraction. Eur J Pharm Sci Off J Eur Fed Pharm Sci. 2004 Mar;21 (4):443-51. Skoog DA, Holler FJ, Crouch SR. Supercritical Fluid Chromatography and Extraction. In: Principles of Instrumental Analysis. 6 edition. Belmont, CA: Brooks Cole; 2006. p. 85666. 6. J. W K. Supercritical Fluid Technology for Lipid Extraction, Fractionation, and Reactions. In: Lipid Biotechnology. New York, Basel: Marcel Dekker, Inc.; 2002. p. 663-687. 7. Capuzzo A, Maffei ME, Occhipinti A. Supercritical fluid extraction of plant flavors and fragrances. Mol Basel Switz. 2013 Jun; 18(6):7194-238. Girotra P, Singh SK, Nagpal K. Supercritical fluid technology: a promising approach in pharmaceutical research. Pharm Dev Technol. 2013 Feb;18(1):22-38. 9. Modey WK, Mulholland DA, Raynor MW. Analytical Supercritical Fluid Extraction of Natural Products. Phytochem Anal. 1996 Jan;7(1):1-15. Putnik P, Lorenzo J, Barba F, Roohinejad S, Režek Jambrak A, Granato D, et al. Novel Food Processing and Extraction Technologies of High-Added Value Compounds from Plant Materials. Foods. 2018 Jul;7(7):106. 8. 10. 55 farm vestn 2019; 70 < m < cc O cl 3 O x < z >o § lu <2 h cc ^ cc LU CL 3 C0 CO LU g < CC te LU 2 >o LU _I > N 2 CO 13. 14. 11. Díaz-Reinoso B, Moure A, Domínguez H, Parajó JC. Supercritical CO2 extraction and purification of compounds with antioxidant activity. J Agric Food Chem. 2006 Apr;54(7):2441-69. 12. Vági E, Rapavi E, Hadolin M, Vásárhelyiné Perédi K, Balázs A, Blázovics A, et al. Phenolic and triterpenoid antioxidants from Origanum majorana L. herb and extracts obtained with different solvents. J Agric Food Chem. 2005 Jan;53(1):17-21. Jennings DW, Deutsch HM, Zalkow LH, Teja AS. Supercritical extraction of taxol from the bark of Taxus brevifolia. J Supercrit Fluids. 1992 Mar;5(1):1-6. Kohler M, Haerdi W, Christen P, Veuthey JL. Extraction of artemisinin and artemisinic acid from Artemisia annua L. using supercritical carbon dioxide. J Chromatogr A. 1997 Oct;785(1-2):353-60. 15. Su X, Miller LH. The discovery of artemisinin and Nobel Prize in Physiology or Medicine. Sci China Life Sci. 2015 Nov;58(11):1175-9. 16. Simándi B, Kéry Á. Supercritical Fluid Extraction of Terpenoids and Steroids from Plants. [internet] Available from: https://pdfs.semanticscholar.org/f0b3/ca05f3828b68ae7a28b7 608638247aefe461.pdf Topal U, Sasaki M, Goto M, Otles S. Chemical compositions and antioxidant properties of essential oils from nine species of Turkish plants obtained by supercritical carbon dioxide extraction and steam distillation. Int J Food Sci Nutr. 2008 Dec;59(7-8):619-34. Khattab RY, Zeitoun MA. Quality evaluation of flaxseed oil obtained by different extraction techniques. LWT - Food Sci Technol. 2013 Sep;53(1):338-45. 17. 18. 21 22. 19. Kramberger K. Vpliv izbranih izvlečkov ekstrakcije s superkritičnem ogljikovim dioksidom, dodanih lanenemu olju, na njegovo peroksidno in anizidinsko število. Ljubljana: Univeza v Ljubljani; 2018. 68 p. 20. Malekbala MR, Soltani SM, Hosseini S, Eghbali Babadi F, Malekbala R. Current technologies in the extraction, enrichment and analytical detection of tocopherols and tocotrienols: A review. Crit Rev Food Sci Nutr. 2017 Sep;57(14):2935-42. Ling YC, Teng HC, Cartwright C. Supercritical fluid extraction and clean-up of organochlorine pesticides in Chinese herbal medicine. J Chromatogr A. 1999 Mar;835(1-2):145-57. He J-Z, Shao P, Liu J-H, Ru Q-M. Supercritical carbon dioxide extraction of flavonoids from pomelo (Citrus grandis (L.) Osbeck) peel and their antioxidant activity. Int J Mol Sci. 2012 0ct;13(10): 13065-78. 23. Aladič K, Jarni K, Barbir T, Vidovič S, Vladič J, Bilič M, in sod. Supercritical CO2 extraction of hemp (Cannabis sativa L.) seed oil. Ind Crops Prod. 2015 Dec;76:472-8. 24. Tipsrisukond N, Fernando LN, Clarke AD. Antioxidant Effects of Essential Oil and Oleoresin of Black Pepper from Supercritical Carbon Dioxide Extractions in Ground Pork. J Agric Food Chem. 1998 0ct;46(10):4329-33. Belayneh HD, Wehling RL, Cahoon E, Ciftci ON. Extraction of omega-3-rich oil from Camelina sativa seed using supercritical carbon dioxide. J Supercrit Fluids. 2015 Sep;104:153-9. 25. S2 cc 56 farm vestn 2019; 70