VeronikaCencen1,JernejKovač2,SimonHorvat3,PrimožKotnik4 Bio teh no loški pri sto pi k zdrav lje nju de be lo sti BiotechnologicalStrategiesinTreatmentofObesity IZvLEČEK KLJUČNEBESEDE:debelost,biotehnologija,rekombinantnazdravila,genskozdravljenje Debelostjeklasičnavečvzročnopogojenabolezen.Polegvplivaokoljaimapomembno vlogoprinjenemnastankutudidednost.Debelostjeleredkomonogenskopogojena,opre- deljenihpajebilotudiževeč100genovinmestvgenomu,kivsakvmajhnemdeležu sodelujejoprirazvojumnogopogostejšepoligenskedebelosti.Debelostpriotrocihinmla- dostnikihpredstavljakratko-indolgoročnoogroženostzazaplete.Običajninačinizdrav- ljenjasožalledelnoučinkoviti.Povečevanjepogostostidebelostipovečujepotrebopo izdelavinovihstrategijzdravljenja.Biotehnološkemetodepredstavljajopomembno orod- jezarazvojtehstrategij.Včlankusopredstavljenebiotehnološkemetode,kisotrenut- nožeuporabljenezapripravoučinkovininmetodzazdravljenjedebelosti.Razpravljamo onjihoviučinkovitostiinvarnostiteromožnostihzadodatnirazvoj.Predstavljamotudi novejšebiotehnološkemetode,kitrenutnošenisovuporabizazdravljenjedebelosti,aima- jotapotencial.Razpravljamotudiododatnihmožnostihuporabebiotehnološkihmetod zaopredelitevtarčnihgenovinmehanizmov,kivodijovdebelost. aBSTRaCT KEYWORDS:obesity,biotechnology,recombinantdrugtherapy,genetherapy Obesityisacomplexmultifactorialdisease.Bothgeneticsandenvironmentalfactorsplay amajorroleinthedevelopmentofobesity.Itisrarelymonogenicandseveral100ofge- nesandloci,eachhavingaminoreffect,havebeenassociatedwiththepolygenicform. Obesityinchildrenandadolescentspresentsashortandlong-termriskforobesity-re- lateddiseases.Classicalmethodsoftreatmentareunfortunatelyonlypartiallyeffecti- ve.Theeverincreasingprevalenceofobesitycasescallsfornoveltreatmentstrategies. Biotechnologyoffersseveralimportanttoolsforthedevelopmentofthesestrategies.Bio- technologicalmethodsalreadyusedforthepreparationofdrugtherapiesandothermet- hodsfortreatingobesityarepresentedinthearticle.Wediscusstheirefficacyandsafety, andpossibilitiesforfurtherimprovement.Novelbiotechnologicalapproachesthathave notyetbeenusedinthetreatmentofobesitybutshowpotentialarealsodiscussed.Furt- hermore,wealsoexplorethepossibilityofusingbiotechnologicalmethodstodetermi- nethemaintargetgenesandmechanismsofobesity. 1 VeronikaCencen,dipl.bioteh.,Oddelekzazootehniko,Biotehniškafakulteta,Univerzav Ljubljani,Groblje3,1230Domžale 2 Dr.JernejKovač,univ. dipl. biokem.,Službazaspecialnolaboratorijskodiagnostiko,Pediatričnaklinika,Univerzitetni kliničnicenterLjubljana,Bohoričevaulica20,1000Ljubljana 3 Prof. dr.SimonHorvat,Katedrazagenetiko,animalnobiotehnologijoinimunologijo,Oddelekzazootehniko, Biotehniškafakulteta,Univerzav Ljubljani,Groblje3,1230Domžale;Odsekzasinteznobiologijoinimunologijo, Kemijskiinštitut,Hajdrihovaulica19,1000Ljubljana 4 Doc. dr.PrimožKotnik,dr.med.,Kliničnioddelekzaendokrinologijo,diabetesinpresnovnebolezni,Pediatrična klinika,UniverzitetnikliničnicenterLjubljana,Bohoričevaulica20,1000Ljubljana;Katedrazapediatrijo,Medicinska fakulteta,Univerzav Ljubljani,Bohoričevaulica20,1000Ljubljana;primoz.kotnik@mf.uni-lj.si 3MedRazgl.2019;58(1):3–12 • Pregledni članek stavljenjeiz146aminokislin,kodiragagen LEP. Prekoreceptorjazaleptin,kigakodi- ragenLEPR,leptinposrednosprožitvor- boanoreksigeneganevropeptidaproopio- melanokortina(angl.proopiomelanocortin, POMC) in zaviraproizvodnjooreksigene agutipodobnebeljakovine(angl.agouti-re- latedprotein,AgRP).Leptinnajbideloval kotlipostat,sajsezvečanjemkoličinemaš- čobvmaščobnihcelicahsproščavkriin povzročaobčuteksitosti.Posledicapomanj- kanjaleptinaalimutacijavgenuzaleptin- skireceptorjezgodnjainizrazitadebelost spridruženimizdravstvenimizapleti.Zdrav- ljenjezrekombinantnimleptinomjeučin- kovitoprizdravljenjuredkihoblikdebelo- sti,kisoposledicapomanjkanjaleptina(4). Nasprotnopajezdravljenjezrekombinant- nimleptinomneučinkovitopripoligensko dedovanioz.najpogostejšioblikidebelosti, kjerjepridobljenaodpornostnaleptin eden glavnihmehanizmov,kivodijovpovečeva- njetelesnemaseoz.neučinkovitostzdrav- ljenjazleptinom(5). Odpornostnaleptinsoobšlizrazvojem zdravila, ki brez aktivacije receptorja za leptindelujenanjegoveefektorje.Ciliarni nevrotrofičnidejavnik (angl. recombinant neurotrophic factor, CNTF), ki ga kodira genCNTF,jepolipeptidnihormoninrast- ni dejavnikživčnihcelictervživčnemsi- stemuspodbujatvorboživčnihprenašalcev. PriživalskihmodelihseCNTFdokazano izogne učinkomodpornostinaleptin. Re- kombinantnarazličicaciliarneganefrotič- negadejavnika(angl.recombinanthuman variantciliaryneurotrophicfactor,rhvCNTF) zzaščitenimimenomAxokine®,imašeiz- boljšanoučinkovitostinfarmakološkelast- nosti.VežesenareceptorzaCNTFinakti- virapodobneznotrajceličnesignalnepoti kotleptintervplivanaspremembeapeti- taintelesnomaso(38).Kljubdokajveliki učinkovitostipaniprišelnatržišče,sajso preiskovancirazviliprotitelesaprotiCNTF. Tanisolezmanjšalaučinkovitostizdravlje- nja,temvečbilahkoškodljivovplivalatudi 4 VeronikaCencen,JernejKovač,SimonHorvat,PrimožKotnik Bio teh no loški pri sto pi k zdrav lje nju … UvOD Debelost je pomemben javnozdravstveni problemzaradipresnovnihinnepresnov- nihzapletov,skaterimijepovezana.Osno- vazdravljenjajespremembaživljenjskega sloga,kamorsodijozdravaprehrana,red- nainprimernointenzivnatelesnadejavnost teromejenčas,konismotelesnodejavni. Do sedajrazvitazdravilanisozeloučinkovita in imajo večinoma pomembne neželene učinke(1).Učinkovitejšisobariatričnipo- segi,asorelativnoinvazivni,izrednegapo- menapajetudidoživljenjskopooperativno sledenje,zatosotiposegiprimernileza manjšideležpopulacijedebelih(2).Zažele- nisonovipristopikzdravljenjudebelosti, kibibiliučinkovitiinvarni.Stegavidika v članku predstavljamo novejše bioteh- nološkemetode,skaterimibilahkoizbolj- šaliučinkovitostinvarnostžeuveljavljenih zdravilinmetodterrazvilinova. METODa REKOMBINaNTNE DEOKSIRIBONUKLEINSKE KISLINE Za IZDELavO UČINKOvIN Za ZNIŽaNJE TELESNE MaSE aLI PRESNOvNO UGODNO SPREMEMBO TELESNE SESTavE Vbiotehnologijisepogostouporabljameto- darekombinantneDNA,skateroseizboljša učinkovitostproduktainravenproizvodnje rekombinantnihbeljakovin.Splazmidom vnesemoDNA,kikodiraizbrano(človeško) beljakovino,vbakterijskogostiteljskoce- lico.Vcelicisesintetizirabeljakovina,kisi- cervnaravnemsevuneobstaja(3).Našte- tihjenekajprimerovuporabetemetodeza izdelavoučinkovin,kivplivajonatelesno masoinsestavotelesa. Lep tin, lep tin ski re ceptor in po stre cep tor ske sig nal ne poti Odkritjehormonaleptinajeenoprvihin največjihodkritij,kisovplivalanarazume- vanjegenetskihnagnjenostizauravnava- njetelesnemase.Leptinjebeljakovina,ki setvoriizključnovmaščobnemtkivu.Se- na nevrozaščitno delovanje endogenega CNTF(7).PodjetjeXencorzarazvojzdrav- ljenjazmonoklonskimiprotitelesidose- daj šenibilouspešno prirazvojuanalogov zmanjšoimunogenostjo.Teiščejozanalizo spremenjenihepitopovalelovpoglavitnega histokompatibilnostnegakompleksaII(8). Re kom bi nant ni člo veški rast ni hor mon Rastnihormonjepeptidnihormon,kispod- bujarast,delitevinobnavljanjecelic.Po- legtegaimapomembnefiziološkeučinke natelesnosestavo.Zmanjšujedeležmaščob- negatkivainpovečujedeležnemaščobnega tkiva(mišice).Takopriodraslihkotpriotro- cihsčezmernotelesnomasojezmanjšano endogenoinspodbujenoizločanjerastne- gahormona(9). Osebespomanjkanjemrast- negahormonapasonagnjenekdebelosti, posebejvisceralni(10). Rekombinantničloveškirastnihormon (angl.recombinanthumangrowthhormone, rhGH)seuporabljazazdravljenjebolezni, kisoposledicapomanjkanjarastnegahor- mona ali zmanjšane občutljivosti nanj. Poudarjamo,darhGHniindiciranzazdrav- ljenjedebelosti.SicerparhGHznižujede- ležmaščobnegatkivainpovečujemišično masobrezznatne izgubeskupne telesne mase(11).Zaraditehučinkovjeindiciran za zdravljenje redkega sindroma Prader- Willi,prikateremstapolegzmanjšanega izločanjarastnegahormonaprisotnihipo- talamičnaokvara,indebelost.Prizdravlje- njusindromaPrader-WillizrhGHje glavni pričakovaniučinekugodnaspremembate- lesnesestave(12). Zdravljenje z rhGH, predvsem v od- merkih,višjihodfizioloških,jepovezano spovišanjemravniinzulinaterrazvojem motenetolerancezaglukozoinsladkorne bolezni(13).Nedavnojebiloobjavljenopo- ročiloopovečanemtveganjuzamožgan- sko-žilnidogodektudipriosebah,kisobile zdravljene s fiziološkimi odmerki rhGH zaradinizkerasti(14). Navedenineželeni učinkizdravilazeloomejujejomožnoupo- raborhGHzazdravljenječezmerne telesne maseoz.zaizboljšanjetelesnesestave. Kom bi na cijsko zdrav lje nje Učinkovitostzdravljenjazzdravililahkopo- večamo z ustrezno kombinacijo zdravil. Vprimerudebelostijetokombinirana upo- rabaamilinskegaanalogapramlintina,ki povečasignalizacijozleptinom,inrekom- binantnegačloveškegaleptinametrelepti- na. Kombiniranauporabatehdvehzdravil je prestala klinične raziskave druge faze, vendarpasonadaljnjeraziskavetrenutno ustavljenezaradivarnostnihrazlogov(1). MetreleptinjevbakterijahEscherichiacoli proizvedenrekombinantenčloveškileptin- skianalog,kiseveženaleptinskireceptor ingaaktivira.Odnaravnoprisotnegačlo- veškegaleptinaserazlikujevdodatnemme- tioninskemostankunaaminskemkoncu. Uporabajezeloomejena,sajobstajanevar- nostrazvojaprotiteles,kibihkratidelova- latudinaendogenileptin,pravtakopase poveča tveganje za razvoj limfomov (15). Čepravznižujeravenkrvnegasladkorjain izboljšastanjeodpornostinainzulin,papri zniževanjutelesnemaseniučinkovit(16). BIOTEHNOLOšKE METODE ZDRavLJENJa Na RavNI GENOMa Ledo5%primerovdebelosti (predvsem izrazite)jepogojenihzmutacijamivenem samemgenu (t. i.monogenskadebelost). Nekajpomembnejšihjepovzetihvtabeli1. Pogostejejedebelostposledicaskupnega učinkavariabilnostivvečgenih,kijihjepo- trebnoupoštevati,t. i.oligo-alipoligenska debelost.Dosedajjebiloopredeljenihževeč 100genovinlokusov,kiprispevajoktejob- likidebelosti.Opredelilisojihspomočjo asociacijskihraziskavnacelotnemgenomu (angl.genome-wideassociationstudies,GWAS) invzadnjemčasussekvencioniranjem ce- lotnegagenoma(17,18). 5MedRazgl.2019;58(1): 6 VeronikaCencen,JernejKovač,SimonHorvat,PrimožKotnik Bio teh no loški pri sto pi k zdrav lje nju … Ta be la 1. Geni,povezaniz debelostjo(17). Gen an gleško ime gena Slo ven sko ime gena Lo ka cija Funk ci ja be lja ko vi ne ADRB2 β2-adrenoceptor, genzapovršinskiβ2- 5q31–q32 poraba surfacegene adrenergičnireceptor energije ADRB3 β3-adrenoceptor, genzaβ3-adrenergični 8p12–p11.2 surfacegene receptor UCP1 uncouplingprotein1 genzaodklopnobeljakovino1 – 4q28–q31 (mitochondrial,proton termogenin(mitohondrijski, carrier)gene protonskiprenašalec) UCP2 uncouplingprotein2 genzaodklopnobeljakovino2 11q13.3 (mitochondrial,proton (mitohondrijski,protonski carrier)gene prenašalec) UCP3 uncouplingprotein3 genzaodklopnobeljakovino3 11q13 (mitochondrial,proton (mitohondrijski,protonski carrier)gene prenašalec) CLOCK clockcircadianregulatorgene genzacirkadianiritem 4q12 INS insulingene genzainzulin 11p15.5 vnosenergije LEP leptingene genzaleptin(človeškihomolog 7q31.3 debelostnegagenav miših) MC4R melanocortin4receptorgene genzamelanokortinskireceptor4 18q22 NPY neuropeptideYgene genzanevropeptidY 7p15.3 POMC proopiomelanocortingene genzaproopiomelanokortin 2p23.3 AGRP agouti-relatedpeptidegene genzaagutipodobnobeljakovino 16q22 CARTPT cocaineandamphetamine genzaprepropeptidkokain 5q13.2 regulatedtranscript inamfetaminuravnavanega prepropeptidegene transkripta FTO fatmassandobesity genzabeljakovino,povezano 16q12.2 associatedgene z maščobnimtkivomindebelostjo LEPR leptinreceptorgene genzaleptinskireceptor 1p31 PPARγ2 peroxisomeproliferator- genzaγ-receptor,aktiviran 3p25 razvoj activatedreceptorγ gene s peroksisomproliferatorjem maščobnega CEBPA CCAATa/enhancerbinding genzabeljakovinozavezavo 19q13.11 tkiva proteinalphagene ojačevalcaCCAATa IL6 interleukin6gene genzainterlevkin6 7p21–p15 FABP4 fattyacidbindingprotein4, genzavezavomaščobnih 8q21.13 adipocytegene kislin PNPLA3 patatin-likephospholipase genzabeljakovinoz domeno 22q13.31 domaincontaininggene patatinupodobnefosfolipaze3 PLIN5 perilipin5gene genzabeljakovino,povezano 19p13.3 z maščobnimikapljicami5 a Zaporedjenukleotidov. Gensko zdravljenje Vsaj pri monogenski obliki debelosti bi zvnosomnormalnegagenavtkivo,kigen izraža, vsaj teoretično lahko spremenili okvarjenimehanizem,kivodivdebelost. Uporabimolahkovečmetod.Najpogoste- jejeuporabljenametodavnosagenazvi- rusnimvektorjem.Kerjevečgenov,pove- zanihzdebelostjo,izraženihvosrednjem živčnemsistemu,bibilzaželentarčnivnos vdoločendelmožganov.Zatobibilaupo- rabnaspecifičnavrstavirusnegavektorja – adeno-povezani virusni vektor. V labo- ratorijskihmodelihsotakospovečanjem izražanjagenalevkemije-zaviralnegadejav- nika(angl.leukemia-inhibitoryfactor,LIF) zvnosomprekorekombinantnegaadeno- -povezanegavirusnegavektorjazmanjšali telesnomaso,vnoshraneinstopnjomaš- čobnegatkivaprimiših (18). Žalsotiše vseenopovezanizmanjšostopnjoimunske- gaodziva.Pomanjkljivostiuporabevirusnih vektorjev so predvsemdolgotrajnost po- stopkovpriprave,možnostvnosalemajh- nihmolekulDNA,patudinevarnostnežele- nihspremembgenoma.Vtanameniščejo šedruge,sprejemljivejšesistemegenskega zdravljenja (19). Primerjecepljenjescepi- vom,kibivsebovalozaporednospecifične nukleazenaregijegenov,povezanihzde- belostjo(npr.genFTO)(20). Spre mi nja nje gen ske ga za pi sa z za po red no spe ci fičnimi nu klea za mi Vprimerjavisklasičnimimetodamigen- skegazdravljenja,kitemeljijonauporabi adeno-aliretrovirusnihvektorjev,sodobna literaturapripisujevečmožnostizaspre- membegenomazanamenezdravljenjame- todizaporednospecifičnihnukleaz.Velika prednostmetodeje,dauporabanitakoome- jenanadoločeneceličnetipe.Vprimerjavi zRNAi(angl.ribonucleicacidinterference), kijepotranskripcijskimehanizemrazgrad- nje informacijskih ribonukleinskihkislin (angl.messenger ribonucleic acid, mRNA) alizaviranjatranslacije,sčimerseprepreči oz.zavreizražanjespecifičnegagena,jeme- todafleksibilnejša,omogočapatudistabil- no in dolgotrajno spremembogena brez potrebepostalnihtransfekcijah.Principde- lovanjajepodobenzavsemetode,kispa- dajovtoskupino.SprvaDNArazcepimona specifičnemmestuzuporabopreoblikova- neendonukleaze.Dospremembvgenskiza- snovi(tukajsovključenetakodelecijekot insercijeinzamenjavegenov)pridezaradi prisotnostipopravljalnihmehanizmovpre- konehomolognegazdruževanjakoncevali homolognerekombinacije(21). Najstarejšametodavomenjeniskupi- nivključujeuporabonukleazcinkovihpr- stov(angl.zincfingernucleases,ZFN).Gaj insodelavcižepreizkušajotometodone- posrednegautišanjagenov,povezanihzde- belostjo,kibiomogočalatudiuporabopri ljudeh(22).Vprimerjaviznovejšimimeto- dami je zahtevnejša tudi priprava, poleg tegapaneobstajajo cinkoviprsti zavse možnetripletenukleotidov.Novejša,poten- cialnouporabnejšametodanatempodročju je poznana kot nukleaze za transkripcij- skemuaktivatorjupodobneefektorje(angl. transcriptionactivator-likeeffectornucleases, TALEN)(21).Tosoumetnoproizvedenire- strikcijskiencimi,pridobljenizzdruževa- njem vezavnih mest transkripcijskemu aktivatorjupodobnegaefektorja(angl.trans- criptionactivator-likeeffectors,TALE)sce- pitvenodomeno.TALEsoizoliraniizsevov bakterijXanthomonas.Temsebiotehnološko odstraniaktivatorskadomenanakarbok- silnemkoncu,nanjenomestopasedoda nukleazaFokI.PrednosttemetodepredZFN je,daprepoznapoennukleotidintakoomo- gočaprepoznavanjekateregakolizaporedja DNA.Polegtegajevezavnadomenasestav- ljena iz tandemskoponovljenihmotivov, dolgihmed11in24baznihparov,zatoomo- gočavečjospecifičnost.Ševednopasi zme- todoZFNdelipomanjkljivost,dazahteva izdelavospecifičnihbeljakovinzavsakocilj- nozaporedjeDNA.To težavoodpravimo 7MedRazgl.2019;58(1): zuvedbousmerjevalnihRNAprimetodi CRISPR/Cas9(21). MetodaCRISPR/Cas9jemedomenjeni- minajnovejša,čepravsezaspreminjanjeza- poredijvgenomualiizražanjagenovvčlo- veškihceličnihkulturah,patudiinvivo pri različnihvrstahživali,uporabljažeodleta 2012.Nakopičenerednorazmaknjenekrat- kepalindromneponovitve(angl.clustered regularly interspaced short palindromic re- peats,CRISPR)solokusiDNA,kivsebuje- jokratkeponovitvebaznihzaporedij.Prisot- nesopredvsemvarhejah,insicerpri90% vsehsekvenciranihgenomov.Prvidelse- stavljaRNAsamostojneganukleotida,kise veženakomplementarno,ciljnozaporedje DNA.Drugidelsestavljaznakopičenimi rednorazmaknjenimikratkimipalindrom- nimi ponovitvami povezana beljakovina (angl. clustered regularly interspaced short palindromicrepeatsassociatedprotein,Cas) 9nukleazazarazrez.Zvnosomplazmida zdomenoCasterspecifičnoustvarjenimi CRISPRselahkogenomorganizmapreureja naželenemmestu.Nekateriposkusigenske terapijezmetodoTALENinCRISPR/Cas9 načloveškihcelicahsoobetavni.Naspod- bujenihmatičnihcelicahbolnikazdedno oblikomišičnedistrofijesoLiinsodelavci leta2015uspelipopravitimutacijovgenu zadistrofininpokazalifunkcionalnostpo- pravljenegagena.Pomanjkljivostmetode je sicernezanesljivaspecifičnost,pa tudi potreba po prisotnosti zaporedja proto- presledkovnegasosednjegamotiva(angl. protospaceradjacentmotif, PAM).Prednost tenajnovejšemetodeje,daomogočaraz- rezvečciljnihmolekulhkrati. Obetavennov možninačinzdravljenjajetudiuporabaraz- ličice encima CRISPR povezane beljako- vine 9,kiimainaktiviranonukleaznoak- tivnost(angl.CRISPRassociatedprotein9 endonucleasedead,dCas9)injelahkovpo- vezavizaktivatorjemalirepresorjem.Taka beljakovina ohrani DNA-vezavno aktiv- nostinlahkopovzročivečjealimanjšeizra- žanjeciljnegagenabrezpovzročanjaspre- membvsamiDNA(21).Slednjalastnostje zagenskozdravljenjesprejemljivejšatudi zetičnegavidika,sajnegrezaspreminja- njedednegamateriala. Metode bi bile uporabne predvsem vprimerunatančnoidentificiranihgenov, npr.navedenivtabeli2,kižesamiznatno prispevajokrazvojudebelosti.Zuporabo primernihvektorjevzavnostopredstavlja zelougodnorešitevzatežavociljanjaspeci- fičnihzaporedijvcelicahosrednjegaživčevja inperiferije.Potrebnajeizdelavaustreznih knjižnicciljnihzaporedij.Uporabametode CRISPR/Cas9bibila še posebejkoristnaza zdravljenje poligenske oblike debelosti, predvsem zaradi možnosti spreminjanja patogenihmutacijalinepravilnegaprofila izražanjavečgenovhkrati.Predenlahkome- todapridevuporabovmedicinskename- ne,bibilopotrebnozagotovitinjenopopol- no varnost in zanesljivost. Predvsem bi moraliposkrbeti,dasometoderesspecifične gledenaciljnozaporedjeindanepovzro- čajoimunogenostialirakotvornosti.Poleg tegaseiščejotudialternativnivektorjiza prenosvbolnika,kibinadomestiliviruse. Po sred ne me to de spre mi nja nja izražanja ge nov z in ter fe renčnimi ribonukleinskimi kislinami Vzadnjemdesetletjujebilovelikoraziskav usmerjenihvrazvojtehnologijzuporabo interferenčnihmolekulRNA.Maleinterfe- renčneribonukleinskekisline(angl.small interferingribonucleicacid,siRNA)senamreč lahkovežejonamRNAinvplivajonaizra- žanjegenov.Utišanjegenovlahkodeluje prekodvehmehanizmov:utišanjegenovpo prepisu(angl.post-transcriptionalgenesilen- cing,PTGS)aliutišanjegenovmedprepi- som.PTGSlahkonadaljedelimošenane- posrednozaporednospecifičnorazcepljanje inzaviranjeprevajanjazaporedjaterrazkroj RNA.Genelahkociljamozeksogenimvno- somsiRNA,kipanatoizkoristiendogeni mehanizemPTGS.Zaradivelikostiinnega- tivnenabitostipastežavoprehajajoskozi 8 VeronikaCencen,JernejKovač,SimonHorvat,PrimožKotnik Bio teh no loški pri sto pi k zdrav lje nju … celičnemembrane(19). Kljubtemusosto metodo izvedli že veliko uspešnih razi- skavzdravljenjadebelostiprilaboratorijskih živalih.ZuporabointerferenčnihRNAso prikuncihuspeliutišatigenApobec1,po- vezanzabsorpcijomaščobevčrevesju,in takozmanjšalivnosenergijetermožnost razvojadebelosti(22).MetodeRNAitrenutno šenisopovsemvarnezakliničnouporabo. Težavesosepojavileprikopičenjuprena- šalnihdejavnikovindelovanjunaneciljne geneternezaželenemaktiviranjuceličnega imunskegasistema(19). UPORaBa BIOTEHNOLOšKIH METOD Za OPREDELITEv TaRČNIH GENOv IN MEHaNIZMOv PRI ZDRavLJENJU DEBELOSTI aso cia cij ske ra zi ska ve na ce lot nem ge no mu RaziskaveGWASomogočajohkratnoana- lizoveč1.000polimorfizmov,kisenatoupo- rabijo za proučevanje interakcijmedge- netskimiinokoljskimidejavniki.Njihova največjauporabnostjevtem,dalahko iden- tificirajogenezrelativnomajhnimvplivom, karjesklasičnogenetikokartiranjavdru- žinahpraktičnonemogoče.Pridebelostiso pomembnipredvsemgeni,povezanispre- snovnimsindromom,maščobnimtkivomin obsegompasu.Zupoštevanjemokoljskih vplivovinvariabilnostigenovskozigene- racijesoposameznikomomogočeneved- no natančnejšeocenetveganja.ZGWASso leta 2007identificiralitudigenFTO,prvi polimorfizem posameznega nukleotida zrobustnopovezavozdebelostjo(23). Upo ra ba raz ličic v šte vi lu ko pij pri is ka nju cilj nih ge nov Kotprinekaterihdrugihtipihkompleksnih bolezni(zlastipsihiatričnih,avtoimunskih in nevrodegenerativnih), imajo tudi pri etiologijidebelostipomembnovlogoraz- ličicevštevilukopijgenov(RŠK).Grezaob- likogenomskevariabilnosti,vezanenado nekajmegabazdolgazaporedjaDNA,kiso vgenomuprisotnavraznovrstnemštevi- lukopij.Frekvencamutacijjemnogovečja kotpripolimorfizmuposameznihnukleo- tidov.Skartiranjemvisokeločljivostipre- kinitvenihtočkjemožnoocenitivelikost, vplivnageneinregulatorneelementeter možneposlediceRŠK(24).Spregledompo- datkovnihbazjebiloopredeljenihvečRŠK, kivplivajonadebelost.Mednovejšaodkrit- jasodizmanjšanaprisotnostRŠKvgenu AMY1,kikodiraamilazovslini,katerepo- manjkanje posredno prispeva k razvoju debelosti(25). ZuporaboRŠKjemožnopro- učevatinatančnejševzrokenelemonoge- nih,temvečtudisindromskihinpoligenskih oblikdebelosti.Tobovprihodnostiomo- gočiloiskanjenačinovposeganjavgeneoz. presnovnepoti,kidotebolezniprivedejo. Patološkespremembebibilomogočeod- pravitizuvedbogenskegazdravljenja(26). Upo ra ba ap ta me rov pri is ka nju biooznačevalcev ter raz vo ju zdrav lje nja AptameriRNAsomajhnemolekuleoligo- -RNA,kiselahkovežejonaspecifičnociljno molekulo.Pridobitijihjemogočezizbo- rom izvečjihnaborovnaključnihzaporedij prekoinvitro selekcijskegapostopka,ime- novanegasistematskaevolucija ligandov skoziposkusnoobogatitev(angl.systematic evolutionofligandsbyexponentialenrichment, SELEX). Aptameri, pridobljeni z metodo SELEX,omogočajoalternativninačinodkri- vanjabiooznačevalcevzaspecifičnoprepoz- navo celičnepovršine.Zaradiboljšespe- cifičnostiodprotitelesbibiliprimerniza uporabovobstoječihmetodahdiagnostike, kotso encimskaimunoadsorpcijskapreiska- va(angl.enzyme-linkedimmunosorbentas- say,ELISA)aliprenoswestern (26). Nata načinjebiloodkritihževečaptamerov,ki specifičnoprepoznavajoodraslemaščobne celice,inmedkaterespadajoMA-33in91 (specifičnazaodraslebelemaščobneceli- ce)teradipo-1inadipo-8(27,28). 9MedRazgl.2019;58(1): Si stem ska me di ci na: raz voj pre snov nih mo de lov Prinovejšihpristopihkodkrivanjunovih načinovzdravljenjadebelostijelahkoučin- kovitatudiuporabapresnovnihmodelovna ravnigenoma(angl.genome-scalemetabolic models,GEM)posameznikovinposledična prilagoditev zdravljenja. GEM vsebujejo podatkeoencimskihreakcijah,specifičnih zaposameznovrstocelic,tkivoaliorgani- zem,inomogočajoanalizospecifičnihreak- cij in presnovnih poti ter njihovo vlogo vceličnifiziologiji.ZGEMjemogočepri- dobitiinformacije,povezane(29): • spresnovo, • zobdelavopodatkovogenihinokolju, • sceličnimipostopki, • sčloveškimiboleznimiin • zrazvojemučinkovin. Zaboljšerazumevanjedebelostiinnjenepo- vezavespresnovnimsindromomterpove- zanimiboleznimisoseraziskovalciosre- dotočili na glukozno-inzulinski sistem nadzoratervzpostavilimaksimalneinmi- nimalne modele presnove. Maksimalni modeli presnove uporabljajo velike ko- ličineparametrovzavzpostavljanjeznanja opresnovnemuravnavanju,minimalnipa opisujejoglavnekomponentesistemskega delovanja(29).Tovrstnauspešnapovezava bioinformatike,biotehnologijeinmedicine bi znatno prispevala k iskanju novih biooznačevalcevterkrazvojunapodročju farmakogenomikeinnovihtarčzdravil. ZaKLJUČEK Čezmerenvnosinnezadostnaporabaener- gijestaosnovnamehanizma,kivodita vpo- večanje telesnemase oz. debelost. Učin- kovitost in varnost zdravljenja debelosti (predvsem izrazite) trenutno še nista na zaželeniravni.Stegavidikapredstavljaza- pletenogenetskoozadjedebelostiinzaple- teneinterakcijemedgenetskozasnovoter okoljemvelikooviro.Biotehnološkemeto- dežeuporabljamozaopredelitevvzrokov debelostiinpriizdelavizdravilnihučinko- vinterstrategijzdravljenja.Zrazvojemteh metodbomovprihodnostilahkorazviliše boljšaorodjatakozaopredelitevvzrokov, kivodijovdebelost,kotzanačrtovanjeučin- kovitegainvarnegazdravljenja.Včlanku smoopredelilivečbiotehnološkihrešitev, kipažalvkratkemšenebodonavoljo. Predenbodotinačinizdravljenjauspešno vključenivzdravljenjedebelosti,jihjepo- trebnošeoptimiziratiinobsežnopreizku- sitivvsehfazahkliničnihraziskav. 10 VeronikaCencen,JernejKovač,SimonHorvat,PrimožKotnik Bio teh no loški pri sto pi k zdrav lje nju … LITERaTURa 1. MisraM.Obesitypharmacotherapy:currentperspectivesandfuturedirections.CurrCardiolRev.2013;9(1): 33–54. 2. YanovskiSZ,YanovskiJA.Long-termdrugtreatmentforobesity:a systematicandclinicalreview.JAMA.2014; 311(1):74–86. 3. CooperGM.Thecell:a molecularapproach.2nded.Sunderland:SinauerAssociatesInc;2000. 4. FarooqiSI.Genetic,molecularandphysiologicalmechanismsinvolvedinhumanobesity:SocietyforEndocri- nologyMedalLecture2012.ClinicalEndocrinol(Oxf).2015;82(1):23–8. 5. FogtelooAJ,PijlH,FrölichM,etal.Effectsofrecombinanthumanleptintreatmentasanadjunctofmoderate energyrestrictiononbodyweight,restingenergyexpenditureandenergyintakeinobesehumans.Diabetes NutrMetab.2003;16(2):109–14. 6. LambertPD,AndersonKD,SleemanMW,etal.Ciliaryneurotrophicfactoractivatesleptin-likepathwaysand reducesbodyfat,withoutcachexiaorreboundweightgain,eveninleptin-resistantobesity.ProcNatlAcad SciUS A.2001;98(8):4652–7. 7. MarshallS,BarbosaM;XencorInc.Ciliaryneurotrophicfactorvariants.UnitedStatesPatentUS2005064555. 2005Mar24. 8. Pipeline[internet].Xencor;c2014[citirano2014Apr13].Dosegljivona:http://www.xencor.com/pipeline/ 9. RussellM,BredellaM,TsaiP,etal.Relativegrowthhormonedeficiencyandcortisolexcessareassociated withincreasedcardiovascularriskmarkersinobeseadolescentgirls.JClinEndocrinolMetab.2009;94(8): 2864–71. 10. MisraM,BredellaMA,TsaiP,etal.Lowergrowthhormoneandhighercortisolareassociatedwithgreater visceraladiposity,intramyocellularlipids,andinsulinresistanceinoverweightgirls.AmJPhysiolEndocrinol Metab.2008;295(2):E385–E92. 11. MekalaKC,TritosNA.Effectsofrecombinanthumangrowthhormonetherapyinobesityinadults:a meta analysis.JClinEndocrinolMetab.2009;94(1):130–7. 12. DealCL,TonyM,HöybyeC,etal.Growthhormoneresearchsocietyworkshopsummary:consensusguidelines forrecombinanthumangrowthhormonetherapyinPrader-Willisyndrome.JClinEndocrinolMetab.2013;98 (6):E1072–E87. 13. ChildCJ,ZimmermannAG,ScottRS,etal.PrevalenceandincidenceofdiabetesmellitusinGH-treatedchildren andadolescents:analysisfromtheGeNeSISobservationalresearchprogram.JClinEndocrinolMetab.2011; 96(6):E1025–E34. 14. PoidvinA,TouzéE,EcosseE,etal.Growthhormonetreatmentforchildhoodshortstatureandriskofstroke inearlyadulthood.Neurology.2014;83(9):780–6. 15. Myalept[internet].RxList;c2014[citirano2014Apr5].Dosegljivona:http://www.rxlist.com/myalept-drug.htm 16. MoonHS,MatareseG,BrennanAM,etal.Efficacyofmetreleptininobesepatientswithtype2diabetes:cellular andmolecularpathwaysunderlyingleptintolerance.Diabetes.2011;60(6):1647–56. 17. MoleresA,MartinezJA,MartiA.Geneticsofobesity.CurrObesRep.2013;(2):23–31. 18. HuvenneH,DubernB,ClémentK,etal.Raregeneticformsofobesity:clinicalapproachandcurrenttreatments in2016.ObesFacts.2016;9(3):158–73. 19. CastanottoD,RossiJJ.ThepromisesandpitfallsofRNA-interference-basedtherapeutics.Nature.2009;457 (7228):426–33. 20. LaberS,CoxRD.Commentary:FTOobesityvariantcircuitryandadipocytebrowninginhumans.FrontGenet. 2015;6:318. 21. GajT,GersbachCA,BarbasCF3rd.ZFN,TALEN,andCRISPR/Cas-basedmethodsforgenomeengineering. TrendsBiotechnol.2013;31(7):397–405. 22. JolivetG,BraudS,DaSilvaB,etal.InductionofbodyweightlossthroughRNAi-knockdownofAPOBEC1 gene expressionintransgenicrabbits.PLoSOne.2014;9(9):e106655. 23. FallT,IngelssonE.Genome-wideassociationstudiesofobesityandmetabolicsyndrome.MolCellEndocrinol. 2014;382(1):740–57. 24. CooperDN,ChenJM,BallEV,etal.Genes,mutations,andhumaninheriteddiseaseatthedawnoftheage ofpersonalizedgenomics.HumMutat.2010;31(6):631–55. 25. GreenhillC.Obesity.CopynumbervariantsinAMY1connectedwithobesityviacarbohydratemetabolism. NatRevEndocrinol.2014;10(6):312. 11MedRazgl.2019;58(1): 26. KangKN,LeeYS.RNAaptamers:a reviewofrecenttrendsandapplications.AdvBiochemEngBiotechnol. 2013;131:153–69. 27. KimEY,KimJW,KimWK,etal.SelectionofaptamersformaturewhiteadipocytesbycellSELEXusingflow cytometry.PLoSOne.2014;9(5):e97747. 28. LiuJ,LiuH,SefahK,etal.Selectionofaptamersspecificforadiposetissue.PLoSOne.2012;7(5):e37789. 29. MardinogluA,NielsenJ.Systemsmedicineandmetabolicmodeling.JIntMed.2012;271(2):142–54. Prispelo14. 10. 2016 12 VeronikaCencen,JernejKovač,SimonHorvat,PrimožKotnik Bio teh no loški pri sto pi k zdrav lje nju …