UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA BIOLOGIJO Andrej BLEJEC ALTERNATIVNA STATISTIČNA METODA ZA ZASLEDOVANJE SPREMEMB AKTIVNOSTI SPONTANO AKTIVNIH VOHALNIH CELIC DOKTORSKA DISERTACIJA Ljubljana, 2001 UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA BIOLOGIJO Andrej BLEJEC ALTERNATIVNA STATISTIČNA METODA ZA ZASLEDOVANJE SPREMEMB AKTIVNOSTI SPONTANO AKTIVNIH VOHALNIH CELIC DOKTORSKA DISERTACIJA ALTERNATIVE STATISTICAL METHOD FOR DETECTING THE ACTIVITY CHANGES OF SPONTANEOUSLY ACTIVE OLFACTORY NEURONS DISSERTATION THESIS Ljubljana, 2001 \i IJ 524592 O lool OGofG Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 Doktorsko delo je bilo opravljeno na Katedri za nevroetologijo Oddelka za biologijo Uni¬ verze v Ljubljani. Poskusni podatki so bili zbrani in analizirani v laboratorijih prof. dr. P. W. Sorensen-a, University of Minnesota, Saint Paul, prof. dr. J. S. Kauer-ja, Tufts University, Boston in prof. dr. P. Zippel-a, Universitat Gottingen, Gottingen. Na temelju sklepa senata Biotehnike fakultete z dne 26.7.2000 je bil za mentorja doktorske disertacije imenovan prof. dr. Tine Valentinčič Komisija za zagovor: Datum zagovora: 9. 1. 2001 Naloga je rezultat lastnega raziskovalnega dela / /LA-< / Andrej Blejec Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 III KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Dd DK UDK 612.014.42:612.86:519.21/22:311.17(043.3)=863 KG čutilne celice / akcijski potenciali / voh / slučajnostni proces / statistična analiza / sprememba aktivnosti AV BLEJEC, Andrej SA VALENTINČIČ, Tine (mentor) KZ SI-1111 Ljubljana, Večna pot 111 ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo LI 2001 IN ALTERNATIVNA STATISTIČNA METODA ZA ZASLEDOVANJE SPRE¬ MEMB AKTIVNOSTI SPONTANO AKTIVNIH VOHALNIH CELIC TD doktorska disertacija OP VIII, 82 s., 48 sl., 73 ref. IJ sl JI sl / en Al Pri ribah je vohalna informacija kodirana na milijonih spontano aktivnih vohalnih čutilnih celicah, ki v času stimulacije povečajo (ekscitacija) ali zmanjšajo (supresija) aktivnost. Predvidevamo, da aktivnost vohalnih celic vzpodbuja aktivnost mitral- nih celic v vohalnem bulbusu. Za razumevanje kvantitativnih lastnosti vohalne kode moramo poznati aktivnost velikega števila vohalnih celic. Razvili smo me¬ todo in računalniški program za analizo naklonov kumulativne porazdelitve (CSA), ki omogoča hitro zaznavanje sprememb aktivnosti vohalnih celic. Metoda teme¬ lji na lastnostih obnovitvenih in Poissonovih slučajnostnih procesov. Spremembo aktivnosti vohalne celice zaznamo kot spremembo naklona porazdelitvene funkcije (kumulativne porazdelitve) akcijskih potencialov. V primeru ekscitacije se naklon porazdelitvene funkcije lokalno poveča, v primeru supresije pa lokalno zmanjša. Em¬ pirično porazdelitveno funkcijo posamezne vohalne celice aproksimiramo z lokalno linerano regresijo na okolicah, ki vsebujejo izbrano število akcijskih potencialov. Vsakemu akcijskemu potencialu pripišemo oceno lokalne hitrosti proženja akcijskih potencialov kot naklon pripadajoče lokalne regresijske premice. Iz porazdelitve ocen hitrosti proženja pred draženjem s centih določimo območje pričakovanih vredno¬ sti z zgornjo in spodnjo kritično mejo. S tako dobljenim območjem pričakovanih vrednosti za spontano aktivnost lahko na neparametričen način določimo značilna povečanja ali zmanjšanja hitrosti proženja akcijskih potencialov. V primeru odziva določimo tudi začetek in trajanje odziva ter jakost odziva. CSA metodo lahko upora¬ bimo tudi v primeru, ko predpostave o slučajnostnih lastnostih spontane aktivnosti ne veljajo. Program za analizo aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic CSA uporablja programsko okolje S-PLUS. Opisu odziva doda grafični prikaz osnovnih podatkov. Program je prirejen za paketno analizo velikega števila poskusov. Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 IV KEY WORDS DOCUMENTATION ND Dd DC 612.014.42:612.86:519.21/22:311.17(043.3)=863 CX receptor neurons / action potentials / olfaction / stochastic process / statistical analysis / change point, AU BLEJEC, Andrej AA VALENTINČIČ, Tine (supervisor) PP SI-1111 Ljubljana, Večna pot 111 PB University. of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Biology PY 2001 TI ALTERNATIVE STATISTICAL METHOD FOR DETECTING THE ACTIVITY CHANGES OF SPONTANEOUSLY ACTIVE OLFACTORY NEURONS DT Dissertation Thesis NO VIII, 82 p., 48 fig., 73 ref. LA sl AL sl / en AB 01factory information in fish and other vertebrates is initially encoded by sponta- neously active olfactory receptor neurons which express olfactory receptors on their apic.al dendrites and synapse onto mitral celiš located in glomeruli in the olfactory bulb. Depending on the identities of the olfactory receptors and their associated transduction processes, the spontaneous activity of specific olfactory receptor ne¬ urons can either be unaffected, exc,ited, or suppressed by exposure to particular odorants. To understand the quantit,ative properties of this complex coding scheme one needs to quantify changes in the spontaneous firing rates of the act.ivity of a large number of olfactory receptor neurons. This problem is particularly arduous because neuronal firing rates are naturally extremely variable and changes in them brief. I developed the statistical means of quantifying changes in the spontaneous firing rates of fish olfactory neurons and have written a Computer program so that this algorithm can be implemented. My approach employs cumulative slope ana- lysis (CSA) and is partly based on the properties of renewal and Poisson stochastic processes. Changes in olfactory receptor celi act,ivity are detected by calculating the cumulative distribution of activity before, and then during odor exposure. Excita- tion is seen as increase in the slope of the distribution function and suppression as a decrease in slope. Changes in slope are evaluated by calculating the empirical distri¬ bution function of the activity olfactory receptor neurons with time using local linear regression. Using estimates of the firing rate before stimulation I then determine the interval of expected values. This interval of expected values for the spontaneous activity enables detection of changes in firing rate using a non-parametric statistic. The onset, duration, and amplitude of the response are also determined. This novel method does not require one to make assumptions about the stochastic properties of spontaneous activity. My CSA program for analysis of neural activity is imple¬ mented in the S-PLUS programming environment and provides both a description of the response and graphical presentation of the data. The program is suitable for batch analysis of many experiments. Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 V Kazalo vsebine Ključna dokumentacijska informacija (KDI).III Key words documentation (KWD) .IV Kazalo vsebine. V Kazalo slik .VII 1 Uvod 1 2 Teoretične osnove 8 2.1 Točkovni slučajnostmi proces. 8 2.1.1 Grafični prikaz slučajnostnega procesa. 10 2.2 Spontana aktivnost vohalne celice kot slučajnostni proces. 16 2.2.1 Obnovitven proces. 17 2.2.2 Poissonov proces. 20 3 Metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti 25 3.1 Izbira osnovnih lastnosti metode. 28 3.1.1 Časovna opredelitev poskusa. 28 3.1.2 Opis poskusnih podatkov. 29 3.1.3 Izbira načina opisa aktivnosti vohalne celice. 29 3.1.4 Aproksimacija obnovitvene funkcije in gostote dogodkov.32 3.1.5 Časovne in dogodkovne okolice . 33 3.1.6 Porazdelitev ocen gostote akcijskih potencialov spontano aktivne vohalne celice. 37 3.1.7 Kontrolni pas gostote dogodkov. 40 3.1.8 Določitev vrste odziva. 42 3.1.9 Določitev začetka odziva. 42 3.1.10 Trajanje in jakost odziva. 44 3.1.11 Približna ocena odziva vohalne celice. 45 3.2 Pregledni grafični prikazi. 48 3.2.1 Časovni potek odzivov - ES graf . 48 3.2.2 Prostor parametrov končnih premic- ab graf.48 Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 4 Računalniški program za analizo aktivnosti vohalnih celic 50 4.1 Opis lastnosti in uporabe programa. 50 4.1.1 Predpriprava podatkov. 51 4.1.2 Ogled posnetka aktivnosti. 51 4.1.3 Določitev vrste, začetka, trajanja in jakosti odziva. 52 5 Primeri uporabe 53 5.1 Vohalne čutilne celice ameriškega somiča. 53 5.1.1 Opis poskusnih pogojev in podatkov. 53 5.2 Mitralne celice zlate ribice. 58 5.2.1 Opis poskusnih pogojev in podatkov. 58 5.3 Mitralne celice zlate ribice. 62 5.3.1 Opis poskusnih pogojev in podatkov. 62 5.4 Mitralne celice tigrastega aksolotla.. 66 5.4.1 Opis poskusnih pogojev in podatkov. 66 6 Razprava in sklepi 70 7 Povzetek 74 8 Summary 76 Zahvala 78 Literatura 79 Stvarno kazalo 82 Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 VII Kazalo slik 1.1 Časovni potek akcijskega potenciala. 2 1.2 Aktivnost vohalne celice kot točkovni proces. 3 1.3 Post-stimulus time histogram (PSTH). 4 1.4 Interspike interval histogram (ISIH)in avtokorelacijska funkcija. 5 2.1 Dva načina zapisa slučajnostnega procesa: intervali med dogodki x in časi pojavljanja dogodkov t . 9 2.2 Rasterski graf pojavljanja dogodkov. 10 2.3 Kumulativna porazdelitev slučaj nostnega procesa. 11 2.4 Odkloni skupnega števila dogodkov F od pričakovanega števila dogodkov. . 12 2.5 PSTH za različne vrste procesov. 13 2.6 ISIH za različne vrste procesov. 14 2.7 Razsevni graf časov med dogodki. 15 2.8 Logaritem krivulje preživetja za različne procese. 16 2.9 Porazdelitve n-tih čakalnih (obnovitvenih) časov Poissonovega procesa. . . 21 3.1 Supresija. Posnetki odziva celice na dražljaj z različno koncentracijo. ... 26 3.2 Ekscitacija. Posnetki odziva celice na dražljaj z različno koncentracijo. . . 27 3.3 Časovna obdobja poskusa. 28 3.4 Kumulativna porazdelitev akcijskih potencialov, ko se celica odzove z ek- scitacijo . 31 3.5 Kumulativna porazdelitev akcijskih potencialov, ko se celica odzove s su- presijo . 31 3.6 Obnovitvena funkcija spontano aktivne celice s konstantno hitrostjo proženja dogodkov. 32 3.7 Odsekoma linearna aproksimacija obnovitvene funkcije M(t) . 33 3.8 Razdelitev opazovalnega obdobja na neprekrite časovne razrede z enako širino. 34 3.9 Simetrične časovne okolice. 35 3.10 Simetrične dogodkovne okolice s stalnim številom dogodkov.36 3.11 Ocene lokalne gostote dogodkov in njihiva porazdelitev.38 Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. \/TTT _Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani. Biotehniška fakulteta, 2001_ 3.12 Porazdelitve ocen gostote dogodkov m(t) za različno široke simetrične do¬ godkovne okolice. 39 3.13 Kontrolno območje pričakovanih ocen.40 3.14 Ocenjevanje ekscitacije. 41 3.15 Ocenjevanje supresije. 42 3.16 Klasifikacija vrst, odziva.43 3.17 Ekscitacija: končna premica leži nad začetno premico. 45 3.18 Supresija: končna premica leži pod začetno premico. 46 3.19 Začetna (b), končna (a) in vmesna premica (c) v primeru supresije, ki ji sledi ekscitacija. Končna hitrost proženja akcijskih potencialov je podobna začetni. 47 3.20 ES graf za časovne poteke skupine celic: supresiji sledi ekscitacija.49 3.21 Prostor parametrov končnih premic: b in a sta naklon in odrezek regresijske premice bx + a. Vsaka točka predstavlja odraz odziva celice na končni pre¬ mici. Ob točkah so na levi oznake vrste odziva (E: ekscitacija, S: supresija, N: ni odziva; ES, SE: kombiniran odziv) in identifikacijske oznake celic. . . 49 5.1 S - supresija. Oznaka dražilne snovi in poskusa: c99218a3. 54 5.2 N - ni odziva. Oznaka dražilne snovi in poskusa: c99210fn. 55 5.3 S - supresija. Oznaka dražilne snovi in poskusa: c99223a2.56 5.4 E - ekscitacija. Oznaka dražilne snovi in poskusa: c99223gn.57 5.5 E - ekscitacija. Oznaka dražilne snovi in poskusa: 0101ax82.58 5.6 E - ekscitacija. Oznaka dražilne snovi in poskusa: 1231aw52. 59 5.7 E - ekscitacija. Oznaka dražilne snovi in poskusa: 1231ayal.60 5.8 SE - supresija in ekscitacija. Oznaka dražilne snovi in poskusa: 1223aya3. 61 5.9 ES odziv in skupki akcijskih potencialov. Oznaka dražilne snovi in poskusa: 1311cv02/2/l. 63 5.10 E - ekscitacija. Oznaka dražilne snovi in poskusa: 1311cv02/2/2. 64 5.11 E - ekscitacija. Oznaka dražilne snovi in poskusa: 131cv02/2/3.65 5.12 SE - supresija in ekscitacija. Oznaka dražilne snovi in poskusa: 514a3/2. . 67 5.13 E - ekscitacija. Oznaka dražilne snovi in poskusa: 4174p5/2.68 5.14 Velika koncentracija akcijskih potencialov takoj po začetku draženja. Oznaka dražilne snovi in poskusa: 4173a5/0/3.69 Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. - P°kt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 _____ One man’s signal is another man’s noise E. M. Glaser, 1976 1 UVOD Vohalne čutilne celice rib spontano prožijo akcijske potenciale. V krajših časovnih inter¬ valih je spontano proženje akcijskih potencialov slučajnostno, saj so časi med akcijskimi potenciali variabilni. Ker so oblike akcijskih potencialov stalne in tipične za posamezno živčno celico, informacija ni kodirana z obliko (npr. amplitudo ali trajanjem) akcijskih Potencialov. Predpostavljamo, da sestavlja vohalno kodo vzorec sočasnih sprememb ak¬ tivnosti čutilnih celic. Aktivnost posamezne vohalne čutilne celice je del sporočila samo, če je vključena v celotno aktivnost sloja čutilnih celic. Ker je aktivnost posamezne celice del celotnega sporočila, je izredno pomembno da zasledimo spremembe v njeni aktivno¬ sti - frekvenci proženja akcijskih potencialov, saj sicer ne moremo identificirati delov, ki sestavljajo celoto. Na draženje se vohalne čutilne celice odzovejo s povečanjem ali zmanjšanjem frekvence proženja akcijskih potencialov. Metoda zaznavanja sprememb spontane aktivnosti živčne celice mora torej omogočiti raziskovalcu, da zazna značilna odstopanja frekvence akcijskih potencialov od spontane aktivnosti. Nastanek akcijskega potenciala v živčni celici je dobro opisan (Kandel s sod., 1991) in Pojasnjen s Hodgkin-Huxleyevim modelom (Holden, 1976). Oblika akcijskega potenciala (Slika 1. 1; iz Koce, 1999) je posledica električnih lastnosti živčne celice. Akcijski potencial traja nekaj milisekund, zato ga v primeru študija aktivnosti obravnavamo kot trenuten Pojav. Največjo vrednost, ki je določljiva in jo akcijski potencial doseže kmalu po začetku, vzamemo za trenutek nastanka akcijskega potenciala. Ge obravnavamo akcijske potenciale kot trenutne dogodke v času (Slika 1.2), lahko aktiv¬ nost živčne celice opišemo kot točkovni slučajnostni proces. Najenostavnejši je Poissonov Proces, na katerem temelji večina analitičnih pristopov analize aktivnosti živčnih celic (Cox in Lewis, 1968; Cox in Miller, 1972; Holden, 1976; Sampath in Srinivasan, 1977). r*ri bolj splošni obravnavi se izognemo privzetkom Poissonovega procesa in uporabimo splošnejši obnovitven proces (Cox in Miller, 1972; Glaser in Ruchkin, 1976). Cox in Mil¬ ler (I972)našt,evata vrsto lastnosti, ki nas zanimajo pri vsakem točkovnem procesu: število dogodkov v časovnem intervalu, pričakovano število dogodkov v časovnem intervalu, go- Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 _ Slika 1.1; Časovni potek akcijskega potenciala. Skupini akcijskih potencialov dveh celic (zgoraj). Zaradi različnih lastnosti (amplituda, potek) lahko v posnetku izberemo akcijske potenciale ene celice (spodaj) (iz Koce, 1999). stoto dogodkov, čas od prejšnjega in čas do naslednjega dogodka in čas, ki je potreben da se dogodek nekajkrat pojavi. Vse te lastnosti nas zanimajo tudi pri proučevanju aktivno¬ sti živčnih celic. Za določitev in opis teh lastnosti je opisanih več teoretičnih metod (Cox in Lewis, 1968; Glaser in Ruchkin, 1976; Tuckwell, 1988). Čeprav teoretične predpostave v dejanskih sistemih pogosto ne držijo (Johnson, 1996), nporabljajo raziskovalci vrsto metod, ki temeljijo na teoretičih metodah in so prilagojene eksperimentalnemu delu. Za analizo odzivnosti vohalnih živčnih celic vplivamo na celico z dražljajem, ki za nekaj časa spremeni okoliščine v katerih proces poteka. S tem pa se, v primeru odziva, spremeni tudi aktivnost celice. Tipičen poskusni posnetek je sestavljen iz vsaj treh delov: posnetkov pred, med in po draženju. V vsakem delu je aktivnost celice lahko drugačna in zaradi časovnih zamikov (npr. latenc draženja in latence odziva vohalne Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. ._ Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 _ Slika 1.2: Aktivnost vohalne celice kot točkovni proces. SS - snperpozicija časovnih pote¬ kov akcijskih potencialov; SP - osciloskopski posnetek zaporedja akcijskih potencialov; OP ' poenostavljeno zaporedje akcijskih potencialov, predstavljeno s črtami v časih največje amplitude; EOG - elektro -olfaktogram (iz Koce, 1999). celice po začetku draženja) delno prepletena. Metode skušajo raziskovalcu omogočiti primerjavo aktivnosti živčnih celic v posameznih delih. Večina statističnih metod analizira Posnetek kot celoto, posamezni deli so časovno označeni in omogočajo raziskovalcu zaznati korelacijo med dražljajem in odzivom. Metode so opisane v vrsti preglednih del (Gerstein m Kiang, 1960; Moore s sod., 1966; Perkel s sod., 1967a,b; Glaser in Ruchkin, 1976; ?; Yang in Chen, 1978; Tuckwell, 1988; Brillinger, 1992; Theunissen in Miller, 1995; Johnson, 1996; Awiszus, 1997). V analizi odzivov vohalnih živčnih celic najpogosteje uporabljajo post-stimulus ah peri- stimulus histogram (PSTH), ki je intuitiven in naraven način za povzemanje časovno razpršenega dogajanja (Slika 1.3). Aktivnost, ki jo zapišemo s časi pojavljanja zapo¬ rednih akcijskih potencialov tj, povzamemo s PSTH tako, da razdelimo časovno os na primerno majhne časovne razrede At in v obliki histograma prikažemo frekvenco poja¬ vljanja dogodkov / v razredih (Gerstein in Kiang, 1960; ?). Pogosto prikažemo s stolpci gostoto frekvence //At, ki izraža hitrost proženja dogodkov na časovno enoto v izbranem Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. - Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 _ 4 0 100 200 300 400 time (ms) 500 time (ms) Slika 1.3: Post-stimulus time histogram (PSTH) (spodaj) in s točkami predstavljeni časi pojavljanja akcijskih potencialov glede na začetek draženja v ponovljenih poskusih (zgo¬ raj) (iz Reike s sod., 1999). intervalu At. PSTH je po svoji naravi povprečna mera aktivnosti in je močno odvisen od subjektivne izbire časovnega razreda At. Z uporabo PSTH lahko spregledamo pomembno informacijo o zaporedni odvisnosti intervalov med dogodki, podatke o trajanju in zamiku (latenci) odziva in podobno (Moore s sod., 1966; Schild, 1987). Kljub temu so z uporabo PSTH raziskovalci, ki ga (Reike s sod., 1999) uporabljajo od začetnih raziskav pred sedem¬ desetimi leti (Adrian, 1926), dognali mnoge funkcionalne odvisnosti porazdelitve odzivov od frekvence, jakosti in trajanja dražljajev in podobno (Moore s sod., 1966). Analiza s Pomočjo PSTH največkrat le vizualno primerja porazdelitev po draženju s porazdelitvijo Pred draženjem in ne zahteva posebnih predpostav o spontani aktivnosti. Drug sklop metod obravnava aktivnost živčnih celic s pomočjo časovnih intervalov med dogodki, in je primeren za analizo stacionarnih (časovno nespremenljivih) procesov (Mo¬ ore s sod., 1966; Yang in Chen, 1978; Johnson, 1996). Osnova teh analiz je razdalja med zaporednimi dogodki Xi — U + 1 — U (ISI - interspike interval), lahko pa tudi razda- Ija fc-tega reda, t.j. razdalja do poljubnega /c-tega naslednjega dogodka x\ = t i+ k — U. Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. •—Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 Množico razdalj povzamemo z ISI histogramom (ISIH), iz katerega lahko razberemo ne¬ katere sumarične lastnosti pojavljanja akcijskih potencialov (Slika 1.4).ISIH podaja ver- -100 -50 0 50 1 00 At (ms) At (ms) Slika 1.4: Interspike interval histogram (ISIH, spodaj) in avtokorelacijska funkcija (sre¬ dina) . Za pripravo teh diagramov poravnamo vse dogodke enega poskusa glede na posa¬ mezne dogodke (zgoraj) (iz Reike s sod., 1999). jetnost, da se bo naslednji dogodek pojavil nekaj časa za poljubnim opaženim dogodkom. Pri običajnih predpostavkah obnovitvenega procesa daje porazdelitev razdalj prvega reda popoln opis procesa (Perkel s sod., 1967a; Glaser in Ruchkin, 1976), saj je ISIH ocena gostote porazdelitve obnovitvenega časa (Cox in Lewis, 1968; Cox in Miller, 1972). Za posebne vrste obnovitvenih procesov (najpogosteje Poissonovih), ima ISIH pričakovano obliko (eksponentno). Odstopanja od pričakovanih lastnosti - npr. koeficienta variacije (Cox in Miller, 1972; Johnson, 1996; Feng in Brown, 1999, 2000) - pripišemo odstopanjem Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. — Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 ___ opazovanega pojava od stacionarnega procesa: odzivu živčne celice na draženje, pojavlja¬ nju skupkov akcijskih potencialov (bursts), zaporedni odvisnosti dogodkov, periodičnosti proženja dogodkov in podobno (Dayhoff in Gerstein, 1983; Kaneoke in Vitek, 1996). V primeru predpostavljenih lastnosti slučajnostnega procesa lahko opišemo njegove lastnosti z ocenami parametrov porazdelitve obnovitvenega časa (Fienberg, 1974; Iyengar in Liao, 1997; Suzuki s sod., 2000). Awiszus (1988)predlaga opis s pomočjo funkcije intervalov med dogodki IIF (interspike interval function). Različne posebnosti zaporedij dogodkov učinkovito prikaže sklopljena porazdelitev inter¬ valov med dogodki (joint interval distribution, JID), ki jo grafično prikažemo kot JIS (joint interval scattergram) ali pa kot JIH (joint interval histogram) (Rodieck s sod., 1962). JID prikaže odvisnost dolžin zaporednih intervalov med dogodki. Pri različnih oblikah za¬ poredne odvisnosti pojavljanja (skupki, periodičnost) opazimo v grafih vzorce, ki jih pri neodvisnosti dogodkov ni (Siebler s sod., 1992; Kaluzny in Tarnecki, 1993; Rhoades s sod., 1996; Longtin in Racicot, 1997; Tam, 1998, 1999; Fitzurka in Tam, 1999). Statistično tendenco periodičnega proženja akcijskih potencialov učinkovito razkrijemo z avtokorelogramom (Gerstein in Kiang, 1960; Perkel s sod., 1967a). Avtokorelacijski histogram je v primeru točkovnih procesov vsota ISI histogramov poljubnega reda (Slika 1-4). Avtokorelacijska funkcija izraža hitrost proženja v času t + A t, pri pogoju, da se je nek dogodek pojavil v času t (Reike s sod., 1999). Limitna vrednost avtokorelacijske funkcije je enaka povprečni hitrosti proženja dogodkov, vrhovi pa kažejo periodičnost zaporedja dogodkov t.j. pogost interval med dogodki ali skupinami dogodkov (Perkel s s od., 1967a). Periodičnost proženja dogodkov proučujejo tudi s spektralno in Fourierjevo analizo (Glaser in Ruchkin, 1976; Lange in Hartline, 1979; Tsau in Chen, 1989). Sočasnost proženja akcijskih potencialov dveh ali več živčnih celic in odzivov celice na zaporedno draženje opisujemo z navzkrižno korelacijo (cross-correlation). Metoda je po¬ dobna avtokorelacijski, le da v tem primeru izražamo hitrost proženja drugega pojava (odziv) v času t + At, če se je v prvem pojavu (draženje) dogodek pojavil v času t (Perkel s sod., 1967b; Glaser in Ruchkin, 1976; glej tudi Shao in Chen, 1987; Osborn in Poppele, 1988, 1989; Tsau in Chen, 1989; Amjad s sod., 1989; Balis s sod., 1994). Na probleme pri interpretaciji navzkrižnih korelogramov opozarja Brody (1999a,b). Koreliranost odzivov opisujejo tudi z JPSTH (joint post stimulus histogram) (Palm s sod., 1988; Ito in Tsuji, 1997), ki združuje časovne poteke dveh primerjanih pojavov. Awiszus v svojem pregledu (Awiszus, 1997) komentira uporabnost kumulativne vsote PSTH (CUSUM) (Ellaway, 1978; Davey s sod., 1986). CUSUM je kumulativna vsota PST histograma, ki jo primerjamo z neko vnaprej pričakovano kumulativno vsoto. Na¬ vadno uporabljamo vsoto enakomerne porazdelitve, ki ima gostoto enako povprečni fre- Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. — Dokt, disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001__ 7 kvenci spontanega proženja dogodkov. CUSUM diagram omogoča, da iz odklonov od pričakovane vrednosti sklepamo na spremembo hitrosti proženja akcijskih potencialov v vnaprej izbranih časovnih razredih PST histograma. IISP (interspike superposition plot; Awiszus, 1988, 1989) primerja porazdelitev aktivnosti med draženjem s pričakovano po¬ razdelitvijo določeno iz spontane aktivnosti pred draženjem (Awiszus, 1993a,b). CUSUM uporabijo tudi za določanje skupkov (Lindsey s sod., 1994; Xu s sod., 1999). Aktivnost posamezne živčne celice lahko ocenimo na podlagi enega poskusa. Povprečne hi¬ trosti proženja v majhni časovni okolici ocenimo tako, da z uporabo primernih uteži (kon- volucija točkovnega procesa s pravokotnim, Gaussovim ali trikotnim jedrom) preštejemo dogodke (Sziics, 1998; Nawrot s sod., 1999). Sorodna metoda RIPP (rate of inhomogenous Poisson process) uporablja časovno spremenljive okolice z vnaprej določenim številom do¬ godkov (Awiszus, 1992). Za ugotavljanje sprememb spontane aktivnosti vohalnih živčnih celic imajo zgornje me¬ tode omejeno uporabnost. Zaradi lastnosti pojava imamo navadno opravka z eno ponovi¬ tvijo poskusa na isti celici. Skupno število akcijskih potencialov je navadno premajhno za uporabo PSTH s primerno majhnim časovnim razredom. Ker ne poznamo začetka odziva, se pri postavljanju mej razredov lahko zgodi, da se v razredu, ki vsebuje trenutek začetka odziva, združijo akcijski potenciali spontane aktivnosti in odziva. S tem se zabrišeta tako trenutek začetka odziva kot tudi jakost odziva, ki je vsaj deloma kodirana s frekvenco proženja. To onemogoči uporabo metod, ki temeljijo na PSTH, npr. CUSUM, v njihovi izvirni obliki. Naš cilj je bil sestaviti enostavno metodo, ki bo omogočala določiti bistvene lastnosti od¬ ziva vohalne živčne celice: vrsto odziva (ekscitacija/supresija), zamik (latenco) odziva ter jakost in trajanje odziva. Metoda temelji na analizi naklona kumulativne porazdelitvene funkcije. Iz okolic z izbranim številom akcijskih potencialov določamo krivuljo trenutne hitrosti proženja v času posameznega akcijskega potenciala. Na podlagi porazdelitve oce¬ njenih hitrosti proženja pred draženjem določimo pričakovan interval hitrosti proženja. Za vsak akcijski potencial po začetku draženja lahko preverimo, ali je ocenjena hitrost Proženja nepričakovano velika ali majhna - iz odstopanja od pričakovanih vrednosti tudi določimo vrsto odziva in njegove parametre. Grafično podprta analiza povezuje analitične rezultate z osnovnimi podatki. Predlagamo tudi nekaj grafičnih prikazov, s katerimi lahko grafično povzamemo odzive večjega števila vohalnih celic na dražljaje. Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. - Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 8 Matematiki so kot Francozi: karkoli jim poveš, prevedejo v svoj jezik in potem to pomeni nekaj čisto drugega J. W. von Gothe, 1749-1832 2 TEORETIČNE OSNOVE V odzivu čutilnih celic na kemične dražljaje je najpomembnejša informacija skrita v časovnem pojavljanju akcijskih potencialov. Dogodki - akcijski potenciali - se med spon¬ tano aktivnostjo čutilnih celic pojavljajo v času slučajno, zato lahko delovanje takih celic opišemo kot točkovni slučajnostni proces. Najenostavnejši točkovni slučajnostni proces, ki predpostavlja neodvisnost in enakomernost pojavljanja dogodkov, je Poissonov proces. Med draženjem se spremeni pogostost pojavljanja dogodkov, predpostavimo pa lahko, da so tudi ti dogodki med seboj časovno neodvisni. Take sisteme lahko opišemo z regular¬ nimi obnovitvenimi procesi - slučajnostnimi procesi, ki imajo lahko časovno spremenljivo pogostost pojavljanja dogodkov. 2-1 TOČKOVNI SLUČAJNOSTNI PROCES Točkovni slučajnostni procesi obravnavajo pojavljanje slučajnih dogodkov v prostoru in času v primeru, ko dogodke lahko ločimo med seboj glede na prostorsko ali časovno ko¬ ordinato pojavljanja dogodka. V našem primeru imamo opravka s časovnim točkovnim slučajnostnim procesom. Ne zanima nas časovni potek napetostnih sprememb v posa¬ meznem akcijskem potencialu, ampak le trenutek, v katerem se akcijski potencial pojavi (Slika 1.2). Kot trenutek pojavljanja vzamemo največjo vrednost akcijskega potenciala. Časovni slučajnostni proces opišemo lahko na dva enakovredna načina (Slika 2 . 1 ): 1. kot zaporedje časov pojavljanja dogodkov t\ < < ... < t jv, 2. kot zaporedje časovnih intervalov med zaporednimi dogodki x\,x^, ■ ■ ■ pri čemer je Xi = U+i — U za i = 1,2,... , N — 1. Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. — Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 ____ X\ X 2 Xs X/i X$ Xq x 7 1 1 -—K t 2 — -—-—k h -- ti -- t 5 -- te -_ t-j -*. ts Slika 2.1: Dva načina zapisa slučajnostnega procesa: intervali med dogodki x in časi Pojavljanja dogodkov t. Ble jec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. ■— Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 10 o 5 10 čas 15 20 25 0 5 10 15 20 25 čas 0 5 10 15 20 25 čas Slika 2.2: Rasterski graf s črtami nakazuje čase pojavljanja dogodkov: a) proces brez opa¬ zne spremembe aktivnosti, b) povečana aktivnost se odraža na zgoščini črt, c) zmanjšana aktivnost se odraža v razredčini črt. 2-1.1 Grafični prikaz slučajnostnega procesa Slučaj nostne procese lahko grafično prikažemo na različne načine. 2-1.1.1 Prikaz časovnega poteka Najenostavnejši je osnovni prikaz s sliko časovnega pojavljanja dogodkov ali rasterski graf, ki je enak poenostavljenemu digitaliziranemu zapisu akcijskih potencialov na celici (Slika 2-2, OP). Gostota črt, ki prikazujejo čase pojavljanja dogodkov, je neposredno povezana s hitrostjo proženja dogodkov, ki jo lahko za poljubno obdobje opazovanja t ocenimo kot razmerje števila dogodkov N v opazovanem časovnem intervalu in trajanjem opazovanja t. Na sliki 2.2 so z rasterskim grafom prikazane tri vrste procesov, ki se pojavljajo v ana¬ lizi odzivov vohalnih celic: pojav s časovno ne preveč različno aktivnostjo (a), pojav s Povečano aktivnostjo v času 5-10 (b) in pojav z zmanjšano aktivnostjo v času 5-10 (c). Rasterski graf pogosto dodamo drugim vrstam grafov, saj neposredno prikazuje dogajanje. Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. — Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 11 2-1.1.2 Kumulativna porazdelitev ali empirična porazdelitvena funkcija Slučajnostni proces pogosto prikažemo s kumulativno porazdelitvijo, ki ustreza empirični porazdelitveni funkciji F (Slika 2.3). V graf vnesemo število dogodkov, ki so se zgodili Slika 2.3: Kumulativna porazdelitev slučajnost,nega procesa, a) proces brez opazne spre¬ membe aktivnosti. Povečana aktivnost se odraža v večji strmini grafa (b), zmanjšana aktivnost pa v zmanjšani strmini grafa porazdelitvene funkcije (c). F - skupno število dogodkov do časa t. Pred določenim časom t. Na ordinato rišemo rang ali zaporedno številko i, ki ustreza do¬ godku v času tj. Na ta način dobimo stopničasto funkcijo, ki se ob vsakem dogodku dvigne Za 1. Če je porazdelitev dogodkov enakomerna, je porazdelitvena funkcija linearna. Raz¬ dalje med dogodki so približno enake, ob vsakem dogodku pa se pomaknemo v grafu za 1 više. Smerni koeficient porazdelitvene funkcije je enak hitrosti proženja dogodkov in ga lahko ocenimo zb — N/t , pri čemer je N število dogodkov v časovnem intervalu t. Spre¬ membo hitrosti proženja opazimo kot odmik krivulje empirične porazdelitvene funkcije °d pričakovane linearne porazdelitvene funkcije. Krivulja je v primeru povečane hitrosti Proženja odmaknjena navzgor, v primeru zmanjšane hitrosti proženja pa je odmaknjena navzdol. Sprememba strmine grafa pokaže tudi majhne spremembe hitrosti proženja do¬ godkov v času opazovanja. Približno linearni odseki krivulje kažejo na konstantno hitrost Proženja. Naklon premice, ki povezuje dve sosednji točki, je povprečno število dogodkov v enoti časa za to obdobje (Cox in Lewis, 1968). Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. -P°kt, disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 12 2.1.1.3 Odkloni kumulativne porazdelitve Grafični prikaz, ki je enakovreden prikazu empirične porazdelitvene funkcije, prikazuje razliko empirične kumulativne porazdelitve in pričakovane linearne porazdelitve z naklo¬ nom b (Slika 2.4, str. 12). Spremembo hitrosti proženja opazimo kot odmik od vodoravne črte, ki predstavlja pričakovano hitrost proženja b. Za konstrukcijo grafičnega prikaza moramo predvideti pričakovano vrednost hitrosti proženja. 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25 čas čas čas Slika 2.4: Odkloni skupnega števila dogodkov F od pričakovanega števila dogodkov, (a) Proces brez opazne spremembe aktivnosti. Povečana aktivnost se odraža na dvigu grafa (b), zmanjšana aktivnost pa na spustu grafa (c) glede na pričakovano aktivnost (vodoravna črta). 2-1.1.4 Post stimulus histogram - PSTH Gostoto dogodkov lahko prikažemo s PSTH (post stimulus histogram), ki prikazuje število dogodkov v časovno določenih razredih (Slika 2.5, str. 13). Z njim skušamo povzeti dogajanje in iz podrobne slike posameznih dogodkov izluščiti splošnejši vzorec. Kljub vrsti Pomanjkljivosti so PSTH enostavno razumljivi in v nevrobiologiji splošno uporabljani. PSTH združi vse dogodke v časovnih razredih in s tem zabriše nekatere lastnosti podatkov. Ker je število dogodkov, ki padejo v posamezen razred odvisno od izbrane širine razreda, Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. — Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 13 b 30 30 30 iiliilnilii. ilillliiiiih " «'f i" "r" ' mi , miI'I' "II V '■ 1 U' 'l 1 : il U L.J-—1—h VJ < ' 0 lil ■lallllll 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25 0 5 10 . 15 20 25 čas cas cas Slika 2.5: PSTH prikaz pojavov z enakomerno (a), začasno povečano (b) in začasno zmanjšano (c) aktivnostjo. Na ordinatno os nanašamo število dogodkov /, ki sodijo v Posamezen razred. ima izbira širine razreda velik vpliv na končno obliko histograma. Če so razredi preozki, se pojavi vrsta praznih razredov, če so preširoki, pa je slika pregroba in ne pokaže majhnih razlik v gostoti dogodkov. 2-1.1.5 Histogram intervalov med dogodki - ISIH Histogram ISIH (inter-spike interval histogram) je prikaz porazdelitve intervalov med zaporednimi dogodki (Slika 2.6, str. 14). Histogram primerjamo s pričakovanim histogramom, ki je odvisen od naših predpostavk. Najpogosteje privzamemo, da je proces Poissonov, pri čemer je pričakovana porazdeli¬ tev intervalov med dogodki eksponentna. Odvisnost pričakovane oblike histograma od Privzetih vrednosti otežuje interpretacijo oblike opazovanega ISI histograma. Pri zelo ve¬ likih povečanjih hitrosti proženja dogodkov opazimo presenetljivo veliko kratkih intervalov (Slika 2.6b). V primeru zmanjšane hitrosti proženja dogodkov opazimo nekaj presenetljivo dolgih intervalov (Slika 2.6c). 2.l.l.6 Prikaz parov zaporednih intervalov med dogodki Pogosto nas zanima, ali sta čas od prejšnjega dogodka in čas do naslednjega dogodka neodvisna V takem primeru narišemo razsevni grafikon, pri čemer za dogodek v času U rišemo čas do naslednjega dogodka * j+1 = t i+ . - U glede na čas do prejšnjega dogodka Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. — Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001- 14 x(i) Slika 2.6: ISIH za različne vrste procesov, pri katerih se aktivnost s časom ne spreminja ( a ), se začasno poveča (b) in začasno zmanjša (c). V primeru (c) je eden od intervalov bistveno daljši od drugih, v primeru (b) pa je razred z majhnimi intervali številnejši. x(i) ~ čas do naslednjega dogodka; f - število dogodkov. x i = U — ti-i (Slika 2.7, str. 15). V takem grafu ne vidimo posameznih dogodkov na časovni osi. V primeru velike koreliranosti se točke zgostijo na glavni diagonali, sicer Pa so raztresene po prvem kvadrantu z robnima porazdelitvama, ki sta enakovredni ISI histogramu. V primeru povečane aktivnosti se točke gostijo ob koordinatnem izhodišču (primerjaj primera a in b v Sliki 2.7). V primeru zmanjšane hitrosti proženja dogodkov °Pazimo oddaljene točke (Slika 2.7c), ki ustrezajo dogodkom z dolgim časom do nasle¬ dnjega dogodka. Časa takih dogodkov ne moremo neposredno odčitati iz grafa. V analizi odzivov živčnih celic je na tej osnovi zgrajen grafični prikaz znan kot JISI (joint, interspike interval). Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. — Dokt. disertacija, Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 15 3 1 3 1 + V + 77 V • /V * « * b 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 x(i) x(i) 3 n .+ V 0 J V + o 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 x(i) x(i) Slika 2.7: Razsevni graf časa do prejšnjega dogodka - x(i) in časa do naslednjega dogodka - x (i+l). Procesi s časovno nespremenjeno (a), začasno povečano (b) in začasno zmanjšano aktivnostjo (c) - s puščicama sta označeni točki, ki ustrezata dolgemu intervalu v času zmanjšanja aktivnosti, d) proces s skupki dogodkov. Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubliani, Biotehniška fa kulteta, 2001 - 16 Slika 2.8: Logaritem krivulje preživetja. Procesi s časovno nespremenjeno (a), začasno Povečano (b) in začasno zmanjšano aktivnostjo (c). 2.1.1.7 Krivulja preživetja Krivulja preživetja je preoblikovana porazdelitvena funkcija porazdelitve časov med do¬ godki (ISI) in prikazuje delež intervalov med dogodki, ki so daljši od izbrane dolžine x l : R = 1 — i/N . Če so izpolnjeni pogoji Poissonovega procesa, je empirična porazdelitev pri¬ bližno eksponentna, zato navadno narišemo logaritem empirične preživetvene krivulje, ki J e linearen (Slika 2.8). Opaženi odkloni od linearnosti nakazujejo odklone od pričakovane e ksponentne porazdelitve in opozarjajo na neizpolnjevanje privzetkov. Krivulj preživetja v analizi odzivov živčnih celic navadno ne uporabljajo. 2 -2 SPONTANA AKTIVNOST VOHALNE CELICE KOT SLUČAJNOSTNI PROCES V stalnem zunanjem okolju bi bili intervali med akcijskimi potenciali spontano aktivne v °halne celice enaki; lahko govorimo o "spontani frekvenci stalnega okolja”. Ker se tudi brez draženja zunanje okolje vohalne celice neprestano in slučajno spreminja, so akcijski Potenciali razporejeni statistično okoli "spontane frekvence stalnega okolja”. Smatramo ^hko, da so časi med akcijskimi potenciali spontano aktivne vohalne celice slučajni (glej Tuckwell, 1988, str. 112). Aktivnost vohalne celice, ki je zaporedje akcijskih potencialov, J e v splošnem kompleksna. Zaradi refraktarne periode živčne celice ne morejo sprožiti hveh akcijskih potencialov hkrati. Z nekaterimi privzetimi poenostavitvami pa jo lahko °bravnavamo z uveljavljenimi modeli za obravnavo slučajnostnih procesov. Blejec, A, Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vokalnih celic. - Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani^otehm ska fakulteta, 2001 - 17 2 . 2.1 Obnovitven proces Ce med spontano aktivnostjo stanje vohalne čutilne celice po predhodnem akcijskem po¬ tencialu ne vpliva na čas nastanka naslednjega akcijskega potenciala, lahko vzamemo, da je verjetnost pojavljanja posameznega dogodka neodvisna od časov pojavljanja prejšnjih do¬ godkov. Zaporedni dogodki na vohalni celici se pojavljajo v slučajnih časih Ti, T 2 , T 3 ,_ Naj bodo slučajne spremenljivke X{ — T i+ \ — T, i = 1,2,... , časi med zaporednimi dogodki ( čakalni ali obnovitveni čas). Preštejmo dogodke, ki so se zgodili do vključno Poljubnega časa t > 0 in njihovo število označimo z N(t). Točkovni proces {N(t),t > 0}, pri katerem so časi med zaporednimi dogodki AT, neodvi¬ sni in enako porazdeljeni (iid), imenujemo obnovitven proces. Dogodkom obnovitvenega Procesa rečemo tudi obnovitve, čakalnim časom pa obnovitveni časi. Če se značilnosti slučajnostnega procesa ohranjajo v enako dolgih časovnih intervalih, ne glede na njihovo lego, je proces stacionaren. Pri stacionarnih procesih lahko poljubno izberemo časovno izhodišče. Zaradi enostavnosti postavimo časovno izhodišče v čas prvega dogodka, tako daje =0. V omenjenih slučajnih spremenljivkah lahko prepoznamo X, kot čase med akcijskimi po¬ tenciali ali ISI (interspike intervale). Čase pojavljanja akcijskih potencialov prepoznamo k°t N(t) pa je kumulativno število akcijskih potencialov do časa t in ga imenujemo kumulativna porazdelitev. Zaradi privzete neodvisnosti in enake porazdeljenosti časov teed zaporednimi dogodki Xi so verjetnostne lastnosti z obnovitvenim procesom opisa- ne ga zaporedja akcijskih potencialov povsem določene s porazdelitveno funkcijo časov med zaporednimi dogodki (ISI) F(t) = F x (t) = P{X i < t} za t > 0 ali z gostoto porazdelitve f{t) — f x (t), ki jo ocenimo z ISIH. Porazdelitev intervalov X je lahko poljubna. Zaradi e Uostavnosti imajo posebno mesto gama porazdelitve f(t) = A(Af) r-1 exp(— \t)/Y{r) s Povprečno hitrostjo proženja dogodkov A in obliko r. Pri r = 1 je f(t) — Aexp(—At), t.j. ®ksponentna porazdelitev. Če je r > 1 ima porazdelitev gama ničlo pri t = 0, kar pomeni, da čakalni čas med dogodkoma ne more biti enak 0. Ker je med dvema akcijskima po¬ tencialoma vedno minimalen čas, najmanj refraktarna perioda, se zdi gama porazdelitev zelo primerna za opis časov med akcijskimi potenciali (Glaser in Ruchkin, 1976). Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. -Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 18 2-2.1.1 Lastnosti obnovitvenih procesov 1. Kot vse točkovne procese, lahko tudi obnovitven proces opišemo z enim od zaporedij spremenljivk {T,} in {X,} ali pa s funkcijo N(t). Med opisi obstajajo preproste zveze N(t) Tk>t , k = 1,2,... (2.1) in Tk — X\ + X2 + • • • + Xk t k = 1,2,... . 2. Zaradi (2.1) lahko izrazimo P{N(t) t} = 1 - F k (t). Ker po (2.1) velja N(t) = k <=> T k 0 P{N(t,t + At) = 1} = XAt + o{At), (2.11) P{N(t, t + At) = 0} = 1 - XAt + o(At), (2.12) tako da je P{N(t,t + At)> l} = o(At), (2.13) Pri čemer je število dogodkov N(t,t + At) povsem neodvisno od pojavljanja dogodkov v (0, tj, o(At) pa gre proti 0 hitreje kot At t.j. limAt_>o o(Ač)/At = 0. Tako slučajnostno zaporedje dogodkov je Poissonov proces s hitrostjo proženja dogodkov A. V pogojih zapi- s ana neodvisnost določa posebno vrsto slučajnosti procesa. Enačbi (2.11)—(2.12) opisujeta sorazmernost verjetnosti pojavljanja dogodka od dolžine intervala, enačba (2.13) pa pred¬ videva, da se dogodki ne pojavljajo hkrati. Hitrost proženja dogodkov A ustreza "spontani frekvenci stalnega okolja” vohalne celice. 2-2.2.1 Lastnosti Poissonovih procesov Naštejmo nekaj osnovnih lastnosti Poissonovega procesa (Cox in Lewis, 1968; Cox in Miller, 1972): 1. Porazdelitev časov med zaporednimi dogodki je eksponentna s parametrom A. Vzemimo, da se je dogodek zgodil v nekem času t 0 , naslednji dogodek pa naj se pojavi v času t 0 + X. Slučajna spremenljivka X, ki določa čas do prvega naslednjega dogodka (čakalni ali obnovitveni čas ), je po predpostavi neodvisna od pojavljanja dogodkov pred in v časn to. Naj bo P(x) = P{X > x}. Ker se po (2.13) dva dogodka ne zgodita hkrati, je P(0) = P{X > 0} = 1. Zaradi (2.11)—(2.13) je P(x) = exp(—Ax). Porazdelitvena funkcija slučajne spremenljivke X je Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. — Dokt., disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 21 gostota verjetnosti pa f(x) = f x (x) = Xe- Xx (x > 0). (2.15) 2. Razdalja X med zaporednimi dogodki ima pričakovano vrednost 1/A in varianco 1/A 2 E[X) = 1/A, Var[X} = 1/A 2 , zato je koeficient variacije KV(X) = 1. 3. Slučajna spremenljivka X ^ = Ti +n — Ti = Y^j=\Xi+j, ki določa čas med nekim dogodkom in n-tim naslednjim dogodkom (n-ti čakalni čas), je gama porazdeljena z gostoto verjetnosti = (*>0), (2.16) ki se za n = 1 poenostavi v (2.15). Na sliki 2.9 so narisane gostote verjetnosti gama porazdelitve za različne vrednosti n. n= 1 n=3 Slika 2.9: Porazdelitve n-tih čakalnih (obnovitvenih) časov Poissonovega procesa. Gostote Porazdelitve f { ~ n \x) za A = 1 in različne vrednosti n = 1,3,5 in 10. BI leJ n C ), A ' : Alterna -ti™a statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Jjgjd- disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 22 4. Ker so zaporedni intervali med dogodki neodvisni ima X' rL ' > povprečje n /A in vari¬ anco n j A 2 E[XW] = n/ A, Var[XW] = n /A 2 . (2.17) Zaradi (2.16) je 2AX (n) porazdeljen po % 2 porazdelitvi z 2 n stopinjami prostosti 2AX (n) ~ xln (2.18) Za velike vrednosti n, je X^ n) asimptotično normalno porazdeljen, tako da je {XX {n) - n)/y/n porazdeljen standardizirano normalno (Cox in Lewis, 1968). 5. Število dogodkov v opazovanih intervalih je porazdeljeno po Poissonovi porazdelitvi: naj bo N(t) število dogodkov v intervalu z dolžino t npr. (0,£]. Število dogodkov v neprekritih intervalih je zaradi definicijskih lastnosti Poissonovega procesa neod¬ visno. Naj bo pk(t) = P{N(t) = k}, to je verjetnost, da je v intervalu z dolžino t natanko k dogodkov. Potem je p k (t) = e~ Xt ^- (/c = 0,1,2,...). (2.19) Pri Poissonovi porazdelitvi (2.19) sta povprečje in varianca enaka A t, koeficient variacije jel/ y/kt, E[N(t)] = A t, Var[N(t)] = A t Porazdelitev gre z rastočim At —> oo proti normalni porazdelitvi. 6. Obnovitvena funkcija je linearna ( 2 . 20 ) M(t) = A t. <• Gostota dogodkov je konstantna m(t) = A. ( 2 . 21 ) ( 2 . 22 ) 8- Časi pojavljanja dogodkov Poissonovega procesa so neodvisno in enakomerno poraz¬ deljeni v opazovanem intervalu (0,čj (Cox in Lewis, 1968, str. 28). ®' e jec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. <^q -D okt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 __ 9. Poissonov proces je stacionaren , saj je število dogodkov med časoma ti in t 2 (0 < či < č 2 ) odvisno le od širine intervala t 2 — ti ne pa od časa začetka opazovanja (Tuckwell, 1988, str. 124) P{N(t 2 ) - N(t i) = k} = . /C! 10. Poissonov proces s konstantno hitrostjo proženja dogodkov A lahko posplošimo v časovno odvisen (nehomogen) Poissonov proces tako, daje hitrost proženja dogod¬ kov funkcija časa A (t). Število dogodkov v intervalu (f, t -f At] je povsem neodvisno od pojavljanja dogodkov v (0, t]. Enačbe (2.11) - (2.13) ostanejo nespremenjene, le A(t) zamenja A. Število dogodkov N(t) ima Poissonovo porazdelitev s povprečjem / 0 £ A (u)du. V primeru odziva živčne celice na draženje opazimo spremembo hitrosti proženja akcijskih potencialov, zato lahko odziv obravnavamo kot časovno odvisen slučajnostmi proces, ki je, razen v času draženja, stacionaren. 2 . 2 . 2.2 Ocenjevanje hitrosti proženja dogodkov Za ocenjevanje hitrosti proženja dogodkov lahko uporabimo navedene lastnosti Poissono- Ve ga procesa. Ker je zaradi (2.20) E[iV(t)] = At, lahko ocenimo hitrost proženja dogodkov k°t razmerje števila opaženih dogodkov N in časa opazovanja T A = N/T, (2.23) je zadostna in nepristranska cenilka hitrosti proženja dogodkov A (Cox in Lewis, 1968). Taka ocena je uporabna za homogene Poissonove procese. Pri časovno odvisnih ali ne¬ homogenih Poissonovih procesih opišemo časovno spremenljivost hitrosti proženja A(f) tako, da razdelimo celoten čas opazovanja na manjše neprekrite časovne intervale s širino 2h = At. Predpostavimo, da je hitrost proženja v posameznem intervalu konstantna. delimo število dogodkov (n t ) v intervalu (t — h, t + h] z njegovo širino, dobimo oceno hitrosti proženja v sredini izbranega intervala: A (t) = n t /At. (2.24) kh' r izraža razmerje n t /At gostoto dogodkov v časovnem intervalu smo s tem dobili oceno Za gostoto dogodkov rri(t). Ta način ocenjevanja hitrosti proženja dogodkov uporabljamo Za Prikaze slučajnostnega procesa s histogrami. Gladko krivuljo gostote dogodkov dobimo, Ce število dogodkov v razredih zgladimo z uporabo jeder (Sziics, 1998; Nawrot s sod., 1999). Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 24 Pri ocenjevanju hitrosti proženja dogodkov lahko uporabimo pričakovano dolžino n-tega čakalnega časa, ki je zaradi (2.17) E[X^] = n/ A. Izberimo n zaporednih dogodkov z opaženimi časi pojavljanja t i+i ,... ,t i+n , ki neposredno sledijo dogodku v času t t \ Hitrost proženja X(t) ali gostoto dogodkov rn(t) lahko ocenimo kot \(t) =n/(t i+n -ti). (2.25) Ocenjeno vrednost navadno pripišemo sredini intervala (U,ti +n ]. Tako ocenjeno hitrost proženja uporabljajo pri oceni RIPP (rate of inhomogenous point process) (Parzen, 1962; Awiszus, 1992). Ker je po (2.18) 2AX (n ) porazdeljen kot xin> lahko to lastnost uporabimo za določanje intervalne ocene hitrosti proženja dogodkov Poissonovega procesa procesa. Meji zaupanja (s stopnjo zaupanja 1 — a) za parameter A sta 2^2n,l-a/2 /(U+n ~ U) < A < kjer je xl, a o-kvantilna vrednost \ 2 z v stopinjami prostosti. 9X2«,<1/2/ (ti+n ti) 7 Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. — Dokt, disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001__ 25 Ali models are wrong but some are useful G. E. P. Box, 1979 3 METODA ZA ZASLEDOVANJE SPREMEMB AKTIVNOSTI Prvi sloj vohalne živčne mreže rib sestavljajo vohalne celice (pri različnih vrstah rib °d nekaj sto tisoč do nekaj milijonov), ki so spontano aktivne in se odzivajo na vohalne dražljaje s supresijo (začasnim zmanjšanjem frekvence, slika 3.1) ah z ekscitacijo (začasnim Povečanjem frekvence akcijskih potencialov, slika 3.2) spontane aktivnosti. Predposta¬ vljamo, da je vzorec aktivnosti vseh celic v tem sloju (Aleksander in Morton, 1993) vo- halna koda za posamezne snovi, ki ga celice prevajajo v vohalne glomerule v vohalnem bulbusu. Čeprav je stopnja konvergence med vohalnimi čutilnimi celicami in mitralnimi celicami v vohalnem bulbusu zelo velika (več kot 100 : 1, Duchamp-Viret s sod. (1989)), je vzorec aktivnosti, ki se med draženjem spreminja, odvisen od aktivnosti posameznih vohalnih celic. Kakšen je vhod vohalne informacije v vohalni bulbus lahko predvidimo le, ce analiziramo spremebe aktivnosti na dovolj velikem vzorcu posameznih vohalnih celic. Z optičnimi metodami je možno zasledovati aktivnost glomerulov in s tem dobiti predstavo 0 vohalni kodi v drugem sloju vohalne mreže, v vohalnem bulbusu. Vendar s tem ni poja¬ snjeno, kako ta koda nastane, poznati moramo tudi vhod vzburjenja v drugi sloj vohalne nireže. To lahko ugotovimo le, če med kemijskim draženjem zasledujemo spremembe aktivnosti zadostnega števila posameznih vohalnih celic. S tem lahko dobimo kvantitati¬ ven vpogled v senzorično informacijo, vohalno kodo v prvem sloju vohalne mreže. Zato nioramo razpolagati z elektrohziološkimi metodami, ki omogočajo hitro vzorčenje aktiv¬ nosti posameznih vohalnih celic in s statističnimi metodami, ki omogočajo zasledovanje značilnih sprememb aktivnosti teh celic. Za kvantitativno predstavitev vohalne kode moramo vzorčiti aktivnost nekaj tisoč celic. Ker iz ponovitev poskusa na eni celici spoznamo samo odzivnost te celice na eno snov, ni snaiselno ponavljati poskusa na posamezni celici. Za analizo aktivnosti vohalnih celic je Potrebna metoda, ki lahko iz"posnetka posameznega poskusa določi odziv vohalne celice. Razvili bomo metodo, ki iz posameznega posnetka aktivnosti vohalne celice s primerjavo spontane aktivnosti pred draženjem in aktivnosti po začetku draženja omogoča določiti v rsto, začetek in trajanje ter jakost odziva posamezne vohalne celice. Pri tem ohranimo v pogled v časovni potek aktivnosti, s tem pa omogočimo primerjavo rezultatov analize in Ble jec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. — Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubliani, Biotehniška fakulteta, 2001___ 26 A B C Voda L-Cys 10‘ 4 M L-Cys 1(T M L-Cys 10 2 M 5 s Slika 3.1: Supresija. Posnetki odziva celice na dražljaj z različno koncentracijo. Celica Se v primerih B - D na dražljaj (navpična črtkana črta) odzove z zmanjšanjem frekvence akcijskih potencialov v primerjavi s frekvenco pri spontani aktivnosti pred draženjem. A ' spontana aktivnost se nadaljuje tudi med "draženjem” z vodo (iz Koce, 1999). dejanske aktivnosti vohalne celice. Ker je za razumevanje vzorca aktivnosti potrebno pre¬ gledati odzive velikega števila celic, predlagamo nekaj grafičnih načinov prikaza sprememb aktivnosti večjega števila celic. Ble jec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. — Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001___ 27 Voda L-nVal 10- 7 M L-nVal 10‘ 4 M Slika 3.2: Ekscitacija. Posnetki odziva celice na dražljaj z različno koncentracijo. Celica se n a dražljaj (navpična črtkana črta) odzove s povečanjem frekvence akcijskih potencialov v primerjavi s frekvenco pri spontani aktivnosti pred draženjem (iz Koce, 1999). Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 28 3.1 IZBIRA OSNOVNIH LASTNOSTI METODE Metoda za analizo posameznega posnetka aktivnosti vohalne celice (Sliki 3.2 in 3.1) iz¬ vira iz nekaterih lastnosti obnovitvenih procesov. Z nekaj poenostavitvami lahko pri¬ vzamemo, da spontana aktivnost zadošča pogojem Poissonovega procesa. Celoten poskus lahko obravnavamo kot nehomogen (časovno spremenljiv) Poissonov process, saj se zaradi draženja lahko spremeni hitrost proženja akcijskih potencialov. Ker so privzetki Poissono¬ vega procesa o spontani aktivnosti pogosto preveč omejujoči, opišemo aktivnost vohalne celice kot obnovitven proces s časovno spremenljivo obnovitveno gostoto dogodkov. 3.1.1 Časovna opredelitev poskusa V tipičnem poskusu spontano aktivni celici nekaj časa dovajamo dražečo snov, s katero želimo vzbuditi odziv. Osnovno razdelitev časovnega poteka poskusa opremo na začetek in konec dovajanja dražilne raztopine in dobimo (1) obdobje pred začetkom dovajanja raztopine (Predi), (2) obdobje med dovajanjem raztopine (Medi) in (3) obdobje po koncu dovajanja raztopine (Pol) (Slika 3.3). Postopek se na nivoju vohalne celice časovno razdeli Predi ■ Medi j_Pol 0 10 20 30 40 čas Slika 3.3: Različna časovna obdobja poskusa, sestavljenega iz dovajanja dražilne snovi (I), draženja (D) in odziva (O). MO - obdobje pričakovanega odziva. Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 29 v delno zamaknjena obdobja glede na prisotnost dražljaja v okolici celice. Snov zaradi postavitve poskusa in nedoločljivih pogojev v preparatu prispe do vohalne celice šele nekaj časa po začetku dovajanja dražljaja. Tako dobimo obdobje pred draženjem (PredD), med draženjem (MedD) in obdobje po draženju (PoD), ki se zaradi počasnega izpiranja preparata lahko konča po koncu dovajanja dražljaja. Celica se ne more odzvati na dražljaj pred začetkom draženja, lahko pa se odzove z zamudo. Odziv se lahko nadaljuje tudi po koncu draženja, tako da je območje, v katerem je možen odziv (MO) širše od območja draženja, ki se lahko začne šele ob začetku draženja. Spontana aktivnost vohalne celice pred odzivom (PredO) preide v spremenjeno aktivnost v območju odziva (MedO) in se zaključi s spontano aktivnostjo v obdobju po odzivu (PoO). Ker časov začetka in konca dejanskega draženja ne poznamo, se izraz ”med draženjem” navadno nanaša na časovno obdobje dovajanja dražilne raztopine (Medi). Če dejanskega začetka draženja ne poznamo, vzamemo kot začetek območja možnega odziva začetek dovajanja dražilne raztopine. 3.1.2 Opis poskusnih podatkov Posnetek sestavljajo časi pojavljanja akcijskih potencialov {ti} oziroma časi med zapo¬ rednimi dogodki {x t }. Obe vrsti podatkov sta za opis časovnega dogajanja enakovre¬ dni. Razen tega imamo podatka o času začetka in trajanju draženja. Ta dva podatka zadoščata za časovno opredelitev poskusnih obdobij. Pogosto imamo na razpolago tudi EOG (electro-olfactogram), ki je zapis sumarične aktivnosti vohalnih celic. Signal EOG se v primeru splošnega odziva vohalnih celic na dražljaj spremeni glede na mirovno vre¬ dnost in omogoča izbiro boljše ocene začetka dejanskega draženja. V takem primeru lahko zanesljiveje določimo čas možnega začetka odziva. 3.1.3 Izbira načina opisa aktivnosti vohalne celice Točkovne slučajnostne procese lahko opišemo na tri različne načine (podpoglavje 2.2.1.1, str. 18), ti pa pogojujejo možnosti za analizo podatkov: 1. Čase pojavljanja akcijskih potencialov {t,} grafično prikažemo z rasterskim grafom (poglavje 2.1.1.1). Tako prikazane podatke navadno analiziramo s histogramom PSTH (post stimulus time histogram, str. 12), za katerega subjektivno izberemo širino razreda. Odločitev o širini razredov predefinira časovno ločljivost metode. Pri preširokih razredih izgubimo možnost zaznave kratkotrajnih sprememb, zgrešimo pa tudi začetek teh sprememb. Pri ozkih razredih je uporabnost PSTH za ana¬ lizo posameznega odziva celice vprašljiva, ker je frekvenca akcijskih potencialov v Ble jec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. — Dokt, disertacija. Ljubljana. Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001__ 30 posameznem razredu zelo majhna. Pri nehomogenih procesih se srečamo tudi s pro¬ blemom določitve mej razredov. Če začetka odziva ne poznamo, se lahko zgodi, da začetek odziva ne leži na meji razreda. Tako so v razredu, ki vsebuje začetek odziva, združeni akcijski potenciali spontane aktivnosti in odziva na kemijsko draženje, kar onemogoča razlikovanje ene aktivnosti od druge. Z našo metodo se želimo izogniti problemom, ki so povezani z uporabo PSTH. 2. Analiza porazdelitve čakalnih časov {xi} je metoda, ki jo pogosto uporabljajo pri analizi slučajnostnih procesov, v nevrofiziologiji je to metoda ISIH (interspike inter¬ val histogram, str. 13). Čakalne čase razdelimo v primerno široke časovne razrede in jih prikažemo z ISI histogramom. Tudi v tem primeru se srečamo s problemom subjektivne izbire širine razredov. Iz eksponentne oblike ISI histograma lahko za Poissonov proces iz (2.15) določimo hitrost proženja dogodkov. Vohalna celica ima v različnih obdobjih različno hitrost proženja dogodkov, zato bi morali obravna¬ vati posebej vsak del poskusa, in sicer spontano aktivnost, draženje in aktivnost po koncu draženja. To zaradi majhnega števila akcijskih potencialov v enem po¬ snetku ni izvedljivo. Ko obravnavamo celoten posnetek kot nehomogen Poissonov ali splošen obnovitven proces, ne poznamo pričakovanih lastnosti porazdelitve čakalnih časov. Zato ne moremo razlikovati ekscitacije in supresije od spontane aktivnosti živčnih celic. Čakalnih časov v ISIH ne prikažemo na dejanski časovni osi, zato v rezultatu analize potek poskusa ni viden. 3. Točkovni proces lahko opišemo s kumulativnim številom dogodkov N(t), ki so se zgodili pred časom t (razdelek 2.1.1.2, str. 11). Ta prikaz omogoča enotno obrav¬ navo vseh treh poskusnih obdobij. N(t) je stopničasta funkcija, ki se vije okrog obnovitvene funkcije, ki je po (2.4), M(t) = 15[iV(t)]. Kadar so izpolnjeni pogoji Poissonovega procesa o porazdelitvi čakalnih časov, zaradi (2.21) opazimo na grafih N(t) linearne odseke (glej Sliko 2.3, str. 11). Ker je po (2.5) gostota dogodkov m(t) = dM(t)/dt (hitrost proženja dogodkov) enaka odvodu obnovitvene funkcije, se hitrost proženja dogodkov odraža na naklonu krivulje N(t). Pri večji hitrosti proženja dogodkov (ekscitacija) je krivulja bolj strma (Slika ??), pri manjši (supre- sija) pa bolj položna (Slika ??). Za našo metodo zasledovanja sprememb aktivno¬ sti spontano aktivnih vohalnih celic smo uporabili analizo naklonov kumulativnega števila dogodkov, ki omogoča enotno obravnavanje vseh treh obdobij. Graf kumu¬ lativne funkcije N(t) lahko podpremo z rastrskim grafom, zato je možna neposre¬ dna primerjava rezultatov analize s časovnim zapisom dogajanja. Aktivnosti med draženjem in po njem lahko primerjamo s spontano aktivnostjo. Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001__ 31 Slika 3.4: Kumulativna porazdelitev akcijskih potencialov, ko se celica odzove z ekscita- cijo. Premici nakazujeta različna naklona krivulje pred draženjem in ob začetku odziva. Navpična črta: začetek dovajanja dražilne snovi. Slika 3.5: Kumulativna porazdelitev akcijskih potencialov, ko se celica odzove s supre- sijo. Premici nakazujeta različna naklona krivulje pred draženjem in na začetku odziva. Navpična črta: začetek dovajanja dražilne snovi. Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. __ Dokt, disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001____ 32 3.1.4 Aproksimacija obnovitvene funkcije in gostote dogodkov V daljših časovnih obdobjih nehomogenega obnovitvenega procesa je oblika obnovitvene funkcije M(t) neznana. V primeru konstantne hitrosti proženja dogodkov je obnovitvena funkcija linearna (Slika 3.6). Če privzamemo, da se v krajših časovnih intervalih hitrost Slika 3.6: Obnovitvena funkcija spontano aktivne celice s konstantno hitrostjo proženja do¬ godkov (o). Premici nakazujeta podobnost naklonov krivulje v različnih časih. Navpična črta: začetek dovajanja dražilne snovi. Proženja ne spreminja, lahko obnovitveno funkcijo nadomestimo z odsekoma linearno funkcijo nad primerno majhnimi časovnimi intervali (Slika 3.7). Odsekoma linearno funk¬ cijo lahko določimo s pomočjo lokalne linearne regresije. Naklon premice M(t) = a + bt, ki lokalno aproksimira obnovitveno funkcijo M(t), vzamemo za lokalno oceno hitrosti Proženja dogodkov ali trenutno hitrost proženja dogodkov m(t) = dM(t)/dt = b. Ker časi v katerih poznamo kumulativno funkcijo N(t) niso ekvidistantni, ne moremo oce¬ niti odvoda obnovitvene funkcije z običajnimi metodami za numerično odvajanje (Abra- ttLowitz in Stegun, 1974, str. 883). Za približek odvoda obnovitvene funkcije uporabimo naklon regresijske premice, ki je v primeru ekvidistantnih podatkov identičen ocenam numeričnega odvajanja. Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001__ 33 Čas Slika 3.7: Odsekoma linearna aproksimacija obnovitvene funkcije M(t). Odseki regresij- skih premic so zaradi poudarka aproksimacije narisani povdarjeno predolgi. 3.1.5 Časovne in dogodkovne okolice Časovne intervale za določanje odsekoma linearne regresijske aproksimacije lahko izbe¬ remo na različne načine. Razdelitev celotnega časa opazovanja na primerno majhne časovne intervale (razrede) je neprimerna za določanje lokalne regresijske aproksimacije, ker je lahko število dogodkov v intervalih zelo različno, pri majhni aktivnosti pa so ne¬ kateri razredi celo prazni (Slika 3.8). Z naklonom regresijske premice ocenimo lokalno gostoto dogodkov v sredini razreda, ki v večini primerov ne ustreza času kakega dogodka ~ akcijskega potenciala. Ker izhajamo iz empirične porazdelitvene funkcije N(t), ki se spreminja v trenutkih pojavljanja akcijskih potencialov ti,t 2 ,... , je smiselno ocenjevati obnovitveno gostoto m(t) kot. naklon lokalne regresijske premice v časih dogodkov tako, da določimo regresijsko premico v okolicah ti,t 2 ,... . Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. - Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 __ 34 4 —©- 4 ^ 1 d 1 4 ' O 1 1 1 5 —Lig- 5 ' 4 ) ' - ' d 11 o 1 ' d 1 ,.1,1 liliI, I.IJU—LL,_ Milili I 0 5 10 15 20 25 čas Slika 3.8: Razdelitev opazovalnega obdobja na neprekrite časovne razrede z enako širino. Nad rasterskim prikazom dogodkov so narisani časovni intervali (vodoravne črte) z do¬ godki, ki sodijo vanje (navpične črtice). Pred intervalom je izpisano število dogodkov v intervalu, o - sredine razredov. 3-1.5.1 Časovna okolica Za okolico dogodka v času tj (i = 1,2,...) vzamemo interval s širino At = 2 h in sredino ti 1-j. (ti~h,ti + h] (Slika 3.9). Tako okolico bomo imenovali časovna okolica. Dobimo vrsto e nako širokih in delno prekritih časovnih okolic, v katerih je različno število dogodkov. V teh okolicah lahko ocenimo gostoto dogodkov s pomočjo (2.24). Uporabili bi lahko tudi ocenjevanje gostote s pomočjo jeder (kernel estimation, Sziics, 1998; Nawrot s sod., 1999). Tako izbrane okolice so ugodne, ker se sredine intervalov ujemajo s časi dogodkov. Pri tnajhnih okolicah in majhni gostoti dogodkov vsebujejo nekatere okolice, razen srednjega dogodka, majhno število drugih dogodkov, to pa onemogoča uporabo linearne regresije za določevanje naklona obnovitvene funkcije. 3 ■ 1.5.2 Dogodkovna okolica dogodkovno okolico nekega časa U izberemo tako, da vsebuje določeno število dogodkov (Slika 3.10).Izberemo lahko simetrično okolico , v kateri je razen izbranega dogodka v času h še j dogodkov pred in j dogodkov za izbranim dogodkom. V taki okolici je vnaprej Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001_ 35 12 121 12j_ 12 j- 1 0-L_ -©- 0- -e-* -©- fi i o 7r_x_u_ " 0 - -©• 0- 9 -ji.j -©- -0.LC -©- 0 5 10 15 20 25 čas Slika 3.9: Simetrične časovne okolice s stalno širino 2h = 3 oklepajo dogodke (o). Ob mtervaln z označenimi dogodki (navpične črtice) je zapisano število dogodkov. določeno število zaporednih dogodkov v časih ti—ji ti—j+1) ■ ■ ■ j ^t) • ■ ■ > ^i+j— 1) ti+j' Te okolice pokrivajo različno široke intervale t i+ j] in vsebujejo enako število 2 j + 1 dogodkov. Pri določanju povečane aktivnosti smo uporabili tudi v desno asimetrične dogodkovne okolice (ali desne okolice) v katerih je razen izbranega dogodka v času t z še 2 j naslednjih zaporednih dogodkov v časih ti j ti +11 • ■ ■ i t'i+2j ■ B^jec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokl, disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001___ 36 7 -LL-I- —j 7 - IZ* 7j_ 7 . u. 0 ... l —■ 0 ... ( -J-1— e- 7rx 7-u- 0 .11 e- - j e- _©LL X0_ -©"• 0 5 10 15 20 25 čas Slika 3.10: Simetrične dogodkovne okolice s stalnim številom dogodkov. Navpične črtice nad intervali označujejo dogodke, število dogodkov (7 = 2j + 1) je napisano pred interva¬ lom, o označuje referenčni dogodek. Tudi take okolice pokrivajo različno široke intervale (čj_i,£ i+2 j] in vsebujejo enako število 2j+l dogodkov. Na podoben način lahko določimo tudi levo okolico U\, ki vsebuje 2 j zaporednih dogodkov tik pred dogodkom t % . Času ti rečemo referenčni čas , dogodku v času ti pa referenčni dogodek . Okolice lahko na kratko označimo s parom vrednosti (č A:), kjer je l število vključenih dogodkov pred, k pa število vključenih dogodkov za referenčnim dogodkom. Simetrične okolice so tako označene kot (j, j), ustrezne desne pa k°t(0,2j). V dogodkovni okolici časa ti v katerem določamo naklon obnovitvene krivulje M(U) je enako število dogodkov. To omogoča uporabo naklona regresijske premice M(t) = ai + bit 2 a določanje gostote dogodkov m{tj). Naklon regresijske premice b L predstavlja oceno Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. _Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001__ 37 gostote dogodkov v izbranem času tj, ki je v primeru simetrične okolice nekje v intervalu v primeru desne okolice pa prvi dogodek v intervalu (tj_i, t i+2j ]. Simetričnih okolic ne moremo določiti za prvih in zadnjih j dogodkov. Tem lahko določimo desne (0,2j) oziroma leve okolice (2j,0). Simetrične dogodkovne okolice uporabljajo pri določanju RIPP (Parzen, 1962; Awiszus, 1992). Oceno, ki upošteva širino in število dogodkov okolice pripišejo sredini časovnega intervala h=£^i+i _ Ta se ne ujema mijno s časom referenčnega dogodka tj. Zaradi stalnega števila opazovanih dogodkov smo za ocenjevanje gostote akcijskih poten¬ cialov v časih pojavljanja dogodkov tj uporabili dogodkovne okolice teh časov. 3.1.6 Porazdelitev ocen gostote akcijskih potencialov spontano aktivne vo- halne celice Večina vohalnih celic je pred draženjem spontano aktivnih in ima zaradi (2.22) konstantno obnovitveno gostoto A. Gostoto akcijskih potencialov ocenimo z naklonom regresijske Premice aj + 6jt = M (t) = £7[iV(t)] nad dogodkovno okolico (z 2 j + 1 dogodki) vsakega časa tj : Aj = m{ti) = bi. (3.1) Časovni potek lokalne gostote dogodkov lahko prikažemo s krivuljo ocen gostote rh(tj). Iz °cen gostote (3.1) dobimo, za vse razpoložljive okolice akcijskih potencialov, množico ocen A* = bi, iz katerih sestavimo vzorčno porazdelitev obnovitvene gostote A. Ker empirična kumulativna porazdelitev N(t) narašča v časih tj, so vse ocene pozitivne Aj > 0. Razdalja cued zaporednimi akcijskimi potenciali je lahko zelo majhna (omejena je z refraktarno Periodo), zato je N(t) lahko odsekoma zelo strma - ima velik naklon 6j. Ker je porazdelitev °cen A j navzdol omejena, pričakujemo da je pozitivno asimetrična. Porazdelitev ocen Aj za simuliran Poissonov proces z gostoto dogodkov A = 4.6 je prikazana na sliki 3.11. Oblika porazdelitve je odvisna od širine dogodkovnih okolic, saj širša dogodkovna okolica 2 ajame večje število dogodkov (Slika 3.12). Ocene so pri širših okolicah manj variabilne, zaradi (2.21) in stacionarnosti pa je cenilka A nepristranska £[A] = A. Spontana aktivnost nekaterih vohalnih celic je lahko zelo posebna. Pri teh celicah opa¬ zimo skupke - vlake akcijskih potencialov. V splošnem ne vemo, ali spontana aktivnost Posamezne celice zadošča pogojem Poissonovega procesa. Za opis lastnosti ocen gostote dogodkov spontane aktivnosti smo uporabili kvantilne lastnosti empirične vzorčne poraz- Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 38 Čas Porazdelitev naklonov in centilni meji o J Supresija 0 10 20 30 40 50 Število naklonov Slika 3.11: Ocene lokalne gostote (krivulja v zgornjem delu na levi) dogodkov, ki so Prikazani z rasterskim grafom levo spodaj. Desno: porazdelitev ocen gostote dogodkov. Vodoravni črti (5%) in (95%) predstavljata 5 in 95 centil. delitve. Za pričakovano vrednost ocen gostote uporabimo mediano E[ A;1 = Me x . (3.2) Območje pričakovanih vrednosti ocen A z zaupanjem (1 — 2 a) smo določili kot Qa < A < Qx- a (3.3) kjer sta kritični meji Q v kvantila s kvantilnim rangom p = a oziroma p = 1 — a : P (A < Q P ) = P- Območje pričakovanih vrednosti (3.3) določimo na osnovi ocen A v času pred draženjem (PredD). Če bi se spontana aktivnost (s posebnostmi kot so npr. skupki) nadaljevala tudi po začetku draženja pričakujemo, z zaupanjem (1 — 2 a), da bi ležale ocene gostote Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001____ 39 ( 1 . 1 ) ( 2 , 2 ) m(t) (4,4) m(t) ( 10 , 10 ) m(t) (5,5; m(t) ( 15 , 15 ) m(t) m(t) ( 3 , 3 ) ( 6 , 6 ) ( 20,20 ) Slika 3.12: Porazdelitve ocen gostote dogodkov m(t) za različno široke simetrične do¬ godkovne okolice. V oklepajih nad sliko je navedeno število dogodkov pred oziroma za referenčnim dogodkom uporabljene okolice. Navpična črta nakazuje lego mediane ocen, ^ - prava vrednost gostote dogodkov A. dogodkov v območju pričakovanih vrednosti. Kritične meje območja pričakovanih vredno¬ sti omogočajo neparametrično testiranje hipotez o spremembi hitrosti proženja akcijskih Potencialov: Ho : Xpo = A pred =>• ni odziva H ! : A po > A pred => ekscitacija Hi : A po < A pred => supresija, Pri čemer sta A po in A pred hitrosti proženja akcijskih potencialov po in pred draženjem. Območje pričakovanih vrednosti določimo iz vzorčne porazdelitve ocen. Ocene gostot, ki so zunaj območja pričakovanih vrednosti, pomenijo značilno spremenjeno hitrost proženja a kcijskih potencialov (z enostransko stopnjo tveganja a). Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. — Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001___ 40 3.1.7 Kontrolni pas gostote dogodkov Interval pričakovanih vrednosti (3.3), ki smo ga določili iz porazdelitve ocen gostote do¬ godkov spontane aktivnosti pred draženjem, smo uporabili kot kontrolni pas, v katerem ležijo ocene gostote dogodkov (Slika 3.13). Uporaba empiričnih kvantilnih mej na osnovi Simulated: n 0 5 10 15 20 25 Čas [s] Določanje: supresije (5,5) E: 494.5 S: 494.5 0 5 10 15 20 25 Določanje: ekscitacije (0,10) E: 494.5 S: 494.5 0 5 10 15 20 25 Slika 3.13: Kontrolno območje pričakovanih ocen. Na srednji in spodnji sliki je kontrolno območje predstavljeno z vodoravnima črtama - spodnjo in zgornjo mejo. Zgornja slika: kumulativna porazdelitev. Srednja slika: ocene gostot dogodkov (nakloni regresijskih Premic) iz simetričnih okolic; vodoravni črti: kritični meji. Spodnja slika: ocene iz desnih okolic; vodoravni črti: kritični meji. Navpična črta: začetek draženja; krivulja s točkami: ocene gostote dogodkov; črta nad časovno osjo: območje pričakovanega odziva. opažene spontane aktivnosti prilagodi kriterij ocenjevanja posebnostim proučevane celice. Za celice, ki lokalno zelo spreminjajo hitrost proženja akcijskih potencialov (npr. proženje skupkov akcijskih potencialov) , je kontrolni pas širši, za celice z zelo pravilno aktivnostjo Pa ožji. Ce se celica na dražljaj odzove z ekscitacijo , se hitrost proženja akcijskih potencialov Poveča. Zaradi večje gostote akcijskih potencialov se v okolicah akcijskih potencialov Poveča naklon kumulativne porazdelitve. Naklon lokalne regresijske premice, ki je v nekaj Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. _ Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 41 zaporednih okolicah večji od zgornje kritične meje Qi- a , omogoča prepoznavo ekscitacije. Med ekscit.acijo krivulja ocen gostote dogodkov za nekaj časa močno preseže zgornjo kritično mejo kontrolnega pasu (Slika 3.14). Čez nekaj časa se krivulja ocen gostote vrne v kontrolni pas, kar pomeni, da je celica spet spontano aktivna. Simulated: e Čas [s] Določanje: supresije (5,5) E: 1.083 S: 495 0 5 10 15 20 25 Določanje: ekscitacije (0,10) E: 1 S: 495 o 10 15 20 25 Slika 3.14: Ocenjevanje ekscitacije. Ce se celica odzove z začasnim zmanjšanjem hitrosti proženja akcijskih potencialov - supresijo - se po začetku odziva gostota dogodkov zmanjša. Opazimo enega ali več ne¬ navadno dolgih intervalov med zaporednimi akcijskimi potenciali. Na takem mestu je krivulja kumulativne porazdelitve dogodkov zelo položna. Naklon lokalne regresijske pre¬ mice, ki je v nekaj zaporednih okolicah manjši od spodnje kritične meje Q a omogoča Prepoznavo supresije celice. Po začetku draženja je krivulja ocen gostote dogodkov za nekaj časa manjša od spodnje kritične meje kontrolnega pasu (Slika 3.15), kar kaže na zmanjšano aktivnost celice - supresijo. Ko se celica vrne v spontano aktivnost, je krivulja °cen gostote dogodkov spet v kontrolnem pasu. Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 42 Simulated: s Slika 3.15: Ocenjevanje supresije. 3.1.8 Določitev vrste odziva Zaradi lastnosti krivulje ocen gostote dogodkov lahko, v območju možnega odziva (MO), zaznamo povečanja (E - ekscitacija) in zmanjšanja (S - supresija) gostote dogodkov. Če značilnih sprememb aktivnosti ne zasledimo, se celica ni odzvala (N). Celice se lahko odzovejo tudi na sestavljen način: ekscitaciji lahko sledi supresija (ES), supresiji lahko sledi ekscitacija (SE). Vrste odzivov, ki jih določamo z opisano metodo se ujemajo z Ustaljenimi opisi vrst odzivov (Slika 3.16, iz Kauer, 1974).Vsak od delnih odzivov E ali S ima dodatne lastnosti (čas začetka odziva, trajanje odziva, jakost odziva) (Sliki 3.14 in 3.15). 3-1.9 Določitev začetka odziva Razen vrste odziva (ekscitacija/supresija) je pomembno ugotoviti, kdaj se odziv začne. Cas začetka odziva izrazimo glede na čas enega od pomembnih trenutkov v poskusu: Začetek draženja ali začetek sprememb EOG. Tak trenutek lahko uporabimo za izhodišče Uierjenja časov. Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 43 I N S, Sj Ei E, Slika 3.16: Vrste odzivov. Klasifikacija vrst odziva iz literature in CSA se ujemata: N=N, Si=S, S 2 =SE, E x =E, E 2 =ES; I-IV: faze EOG (slika povzeta iz Kauer, 1974). Na začetku odziva se naklon kumulativne porazdelitve zelo spremeni. V primeru eksci¬ tacije (gostote so nad pričakovanimi) je naklon regresijske premice v desni okolici časa začetka ekscitacije t E veliko večji od naklonov pred odzivom. Krivulja ocen gostote do¬ godkov je ocenjena iz delno prekritih okolic, zato je nekoliko zglajena. Ker je povečano število akcijskih potencialov vključenih tudi v okolice pred okolico t E , je v teh okolicah go¬ stota dogodkov nekoliko precenjena. Opisane lastnosti ne vplivajo na lego vrha ocenjene gostote dogodkov. V primeru ekscitacije vzamemo za začetek odziva čas t E , v katerem °cenimo največjo gostoto dogodkov. Za določanje začetka supresije (gostote dogodkov so pod pričakovanimi), pri kateri je r ned dogodki nekaj velikih intervalov, uporabljamo simetrične dogodkovne okolice. Na ta ftačin dobimo ocene, ki dobro pokažejo zmanjšanje naklona obnovitvene krivulje v okolici razredčine dogodkov. V primeru supresije vzamemo za začetek odziva čas t$, ki ustreza akcijskemu potencialu tik pred časom, v katerem krivulja ocen prvič doseže najmanjšo v rednost. Strogo vzeto je tg lahko premajhen (za pričakovano vrednost čakalnega časa), Sa j pričakujemo naslednji akcijski potencial v času ts + E{X). Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 44 3.1.10 Trajanje in jakost odziva Pri nekaterih vohalnih celicah sta trajanje in jakost odziva povezana z intenziteto kemičnega dražljaja, zato želimo opisati tudi trajanje in jakost odziva. Načinov opisa trajanja in ja¬ kosti odziva je v literaturi malo (Falzett s sod., 1985). Za grobo oceno trajanja odziva predlagamo čas od začetka odziva do trenutka, ko se krivulja vrne v kritični pas spontane aktivnosti. Kot relativno oceno jakosti dražljaja predlagamo razmerje med ekstremno gostoto dogodkov v času trajanja odziva in pričakovano gostoto spontane aktivnosti, ki je po (3.2) enaka mediani Me x : max bi ekscitacija Je — —7— > 1, Me x min bi supresija 0 < J s = -7-7— < 1. Me x Ekstrema max 6, in min iščemo v času trajanja odziva. Razmerje Je pove, kolikokrat večja je hitrost proženja akcijskih potencialov od pričakovane hitrosti. Razmerje Js izraža hitrost proženja v času supresije kot delež pričakovane hitrosti proženja. Jakost odziva lahko predstavimo z obratnim razmerjem J' s = I/J5 — Me x / min 6,, ki pove kolikokrat manjša od hitrosti spontane aktivnosti je hitrost proženja akcijskih potencialov med su- presijo. Razpon ocen hitrosti proženja dogodkov je odvisen od števila dogodkov v okolicah (Slika 3.12), zato sta razmerji Je in Js odvisni od širine uporabljenih okolic. Vpliv velikosti oko¬ lic na oceno relativne jakosti odziva zmanjšamo, če primerjamo ekstremno hitrost proženja dogodkov med odzivom z največjo oziroma najmanjšo pričakovano hitrostjo proženja do¬ godkov spontane aktivnosti: Pri tem sta Q\- a in Q a po (3.3) zgornja oziroma spodnja meja kontrolnega pasu t.j. kvantila s kvantilnim rangom 1 - a oziroma a za porazdelitev ocen hitrosti proženja do¬ godkov med spontano aktivnostjo. Razmerje Ie pove, kolikokrat večja je hitrost proženja akcijskih potencialov med odzivom glede na največjo opaženo hitrost proženja akcijskih potencialov med spontano aktivnostjo. Razmerje /5 pa pove, kolikokrat manjša je hitrost proženja akcijskih potencialov med odzivom glede na najmanjšo opaženo hitrost proženja akcijskih potencialov med spontano aktivnostjo. Zaradi majhne občutljivosti na širino uporabljenih okolic smo za oceni jakosti odziva izbrali Ie in Is (3.4 in 3.5). Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 45 3.1.11 Približna ocena odziva vohalne celice Poteki kumulativne funkcije N(t) imajo tipične lastnosti, ki so odvisne od vrste od¬ ziva. Spontano aktivnost pred draženjem opišemo z naklonom začetne regresijske pre¬ mice dpred + bpredt v celotnem času pred draženjem (PredD). Če predvidevamo, da je po končanem odzivu celica spontano aktivna, lahko to aktivnost lahko opišemo z regresijsko premico a po -(- b po t (končna premica ). Ce po draženju celica preide v spontano aktivnost z enako hitrostjo proženja akcijskih potencialov kot pred draženjem, sta naklona pre¬ mic b pred in b po enaka. Večji naklon končne regresijske premice pomeni večjo, manjši pa manjšo hitrost proženja v primerjavi s spontano aktivnostjo pred draženjem. V primeru ekscitacije (Slika 3.17), je končna regresijska premica v primerjavi z začetno regresijsko premico premaknjena navzgor ( a po > a Trred ). če se celica odzove s supresijo (Slika 3.18), je končna regresijska premica premaknjena navzdol ( a po < a Tfred ). Odmik in s tem razlika začetnih vrednosti je odvisna od trajanja in intenzitete odziva (Sliki 3.17 in 3.18). S primerno spremembo koordinatnega sistema lahko normiramo začetno premico tako, da je a pred = 0 in bpr ed = 1. To omogoča primerjavo parametrov končne premice in klasifi¬ kacijo odziva več celic ne glede na hitrost proženja akcijskih potencialov med spontano aktivnostjo posamezne celice (glej razdelek 3.2.2 na str. 48). Slika 3.17: Ekscitacija: končna premica leži nad začetno premico. Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 46 Slika 3.18: Supresija: končna premica leži pod začetno premico. Na podoben način lahko primerjamo regresijsko premico v času možnega odziva (vmesna premica ) z regresijsko premico pred draženjem. Velik naklon b me d > 1 in negativen odrezek na ordinatni osi a me( i < 0 sta povezana z ekscitacijo, majhen naklon b med < 1 in pozitiven odrezek na ordinatni osi a med > 0 pa s supresijo (Slika 3.19). Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 47 Slika 3.19: Začetna (b), končna (a) in vmesna premica (c) v primem snpresije, ki ji sledi ekscitacija. Končna hitrost proženja akcijskih potencialov je podobna začetni. Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt.. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 48 3.2 PREGLEDNI GRAFIČNI PRIKAZI Kot smo omenili v uvodu tega poglavja, je potrebno za razumevanje vohalne kode analizi¬ rati odzivnost velikega števila celic. Odzivnost velikega števila celic, ki se izraža s podatki o vrsti, času pojavljanja, jakosti, in trajanju odziva celice, bi radi grafično prikazali v enotnem grafu. 3.2.1 Časovni potek odzivov - ES graf Za prikaz časovnega poteka odzivov večjega števila celic lahko sestavimo ES graf, v kate¬ rem na absciso, ki predstavlja časovno os z izhodiščem v času začetka draženja, nanašamo začetke in trajanje odzivov (Slika 3.20). Na ordinatno os nanašamo jakosti odzivov glede na referenčno jakost spontane aktivnosti 1. Jakosti odzivov I E in /^nanašamo tako, da so za ekscitacije narisane nad l,za supresije pa pod 1. V primeru sestavljenega odziva (npr. ES, glej razdelek 3.1.8, str. 42) povežemo konec prvega dela odziva (E) z začetkom drugega dela odziva (S). Odziv celice dobi glede na vrsto, čas začetka, trajanje in jakost lasten profil, ki ga lahko primerjamo s profili celic s sorodnimi lastnostmi. 3.2.2 Prostor parametrov končnih premic— ab graf Na osnovi v razdelku 3.1.11 opisanih lastnosti končne premice lahko odziv vsake celice predstavimo kot točko v prostoru parametrov (6, a)(Slika 3.21).Za vsako celico določimo naklon Mn začetno vrednost na ordinatni osi avmesne ali končne premice. V graf z absciso Mn ordinato avnesemo odziv kot točko s kordinatama (6, a ).Točke blizu navpičnice b = lpripadajo celicam, ki po draženju nimajo spremenjene aktivnosti. Točke v prostoru desno od b = limajo povečano, točke levo od b = lpa zmanjšano aktivnost. Celice, ki so pod vodoravno črto a = Oso se na draženje odzvale s supresijo, tiste, ki imajo točke nad premico n = 0, pa z ekscitacijo. Točke, ki ležijo blizu premice a = Ose niso odzvale na dražljaj. Celice, ki niso spremenile svoje aktivnosti imajo točke blizu presečišča referenčnih premic (1,0).Prostor parametrov razpade na območja, v katerih lahko klasificiramo celice glede na njihov odziv. Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 49 Slika 3.20: ES graf za časovne poteke skupine celic: supresiji sledi ekscitacija. ro 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 b Slika 3.21: Prostor parametrov končnih premic: b in a sta naklon in odrezek regresijske premice bx + a. Vsaka točka predstavlja odraz odziva celice na končni premici. Ob točkah so na levi oznake vrste odziva (E: ekscitacija, S: supresija, N: ni odziva; ES, SE. kombiniran odziv) in identifikacijske oznake celic. Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001_____ 50 ... to suppress the pictures is to suppress a powerful source of suggestion. Pictorial representation is essential for discoverg and rapid understanding... J.L. Sgnge, 1957 4 RAČUNALNIŠKI PROGRAM ZA ANALIZO AKTIVNOSTI VOHALNIH CELIC Obstoječi računalniški programi za analizo nevrofizioloških podatkov vsebujejo možnosti analize nevrofizioloških podatkov s PSTH, JPSTH, JISI, avto- in križno- korelacijo. Ti programi so manj primerni za analizo sprememb aktivnosti spontano aktivnih živčnih celic. Zato smo na osnovi v podpoglavju 3.1 opisanih lastnosti razvili metodo in njej pri- lagojen računalniški program za analizo sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Ta program uporablja lastnosti naklonov kumulativne porazdelitve pojavljanja do¬ godkov. Metodo in program smo poimenovali CSA (Cumulative Slope Analysis). Program CSA je razvit v statističnem programskem okolju S-PLUS , ki omogoča učinkovit razvoj novih statističnih metod. Glavne lastnosti S-PL US so širok izbor osnovnih stati¬ stičnih funkcij, prilagodljivost podatkovnih struktur za posebne namene, vektorsko računanje Po komponentah in programabilna grahka (MathSoft, 1999). Prepis podatkov, ki so zbrani z napravami za digitalizacijo električnih signalov, v ustrezno obliko poteka v posebnem Programu v osnovnem okolju DOS. 4.1 OPIS LASTNOSTI IN UPORABE PROGRAMA Analizo posnetkov aktivnosti opravimo v dveh korakih: 1. predpriprava podatkov 2. analiza podatkov (a) ogled posnetka aktivnosti in naklonov začetne in končne premice • pregledni prikaz odzivov celic (ab graf) Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 51 (b) določitev vrste, začetka, trajanja in jakosti odziva • pregledni prikaz potekov odzivov (ES graf) V posamezni analizi izberemo enega ali več postopkov iz točke 2. Glavni del analize aktivnosti vohalnih celic je točka 2.b. 4.1.1 Predpriprava podatkov Posnetki poskusov različnih laboratorijev so v osnovi enaki, ločijo pa se v podrobnostih, ki so odvisne od različne merilne opreme. Posnetke poskusov je bilo pred uporabo potrebno poenotiti. Program omogoča tudi analizo obstoječih laboratorijskih posnetkov. Za prepis izvirnih podatkov v obliko, ki je primerna za uporabo CSA, smo pripravili predprogram PreCSA. Ta vključuje posebnosti podatkov iz različnih laboratorijev 1 v katerih smo razvi¬ jali in preskušali novo metodo. S predprogramom PreCSA uredimo podatke o aktivnosti in začetku dovajanja dražilne snovi ter postavimo nekaj laboratorijsko specifičnih para¬ metrov poskusa: trajanje draženja in čase pročakovanega odziva. Če je posnet EOG, iz njega določimo čas začetka spremembe električne aktivnosti vohalnega organa. Potek EOG potrebujemo le še na grafičnih prikazih, zato lahko zmanjšamo natančnost posnetka. Iz praktičnih razlogov so datoteke vsakega laboratorija prepoznavne po podaljšku imena datotek. Samo ime datoteke določa identifikacijo vohalne celice in poskusnih pogojev. Na ta način ohranimo ustaljen način dela v laboratoriju, datoteke za CSA so le dopol¬ nilo obstoječim datotekam. Datoteke smiselno uredimo v poddirektorije za skupine celic in/ah skupine poskusnih pogojev. To omogoča paketno predpripravo podatkov (program PreCSA preuredi datoteke posameznega posnetka ali pa skupine posnetkov) in kasnejšo analizo skupin posnetkov s CSA. Program PreCSA je sprogramiran v programskem jeziku Pascal in deluje v okolju DOS. 4.1.2 Ogled posnetka aktivnosti Ogled posnetka aktivnosti omogoča funkcija pike. Funkcija pripravi sliko, v kateri so združeni rasterski prikaz dogodkov, kumulativna porazdelitev in začetna, vmesna in končna premica (glej podpoglavje 3.1.11). V sliki je nakazan začetek dovajanja dražilne snovi in gostota dogodkov pred začetkom draženja (Slika 3.19). Posnetek EOG je prikazan le, če Metodo smo razvijali v laboratorijih na Univerzi v Ljubljani, Universitaet Goettingen, University of Minnesota (St. Paul) in Tufts University (Boston). Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 52 je dodan posnetku aktivnosti celice. Na taki sliki lahko opazimo osnovne značilnosti in spremembe aktivnosti opazovane celice. S funkcija show.x pripravimo pregledne slike za skupino posnetkov. Taka slika omogoča pregled rezultatov podrobnejših analiz. Funkcijo show.x pripravi tabelo (objekt ab) s podatki o premicah, ki opisujejo aktivnost pred, med in po odzivu celice na dražljaj. 4.1.2.1 Pregledna slika aktivnosti celic Tabelo aktivnosti pripravimo s funkcijo show.x, iz nje pa, s funkcijo show.ab, pregledno sliko aktivnosti skupine celic. Spremembo aktivnosti vsake celice predstavimo s točko (b, a), kjer je b naklon, a pa odrezek končne in/ali vmesne premice. Točka (1,0) predsta¬ vlja normirano spontano aktivnost celic (glej podpoglavje 3.2.2 in sliko 3.21). Točke, ki predstavljajo celice s spremenjeno aktivnostjo, so glede na spremembo aktivnosti bolj ali manj oddaljene od točke spontane aktivnosti. 4.1.3 Določitev vrste, začetka, trajanja in jakosti odziva Glavni del programske izvedbe metode CSA je funkcija špike. S to funkcijo določimo vrsto, začetek, trajanje in jakost odziva na način, ki je opisan v podpoglavjih 3.1.8 - 3.1.10. Funkcijo špike lahko uporabimo za analizo aktivnosti posamezne celic, s funkcijo show. bs pa za poljubno veliko skupino posnetkov aktivnosti celic. Če analiziramo skupino posnetkov, pripravi funkcija shou. bs tabelo z rezultati analize: vrsto, začetek, trajanje in jakost odziva (objekt ES). Tabela z rezultati analiz omogoča pregled aktivnosti večjega števila celic, na primer porazdelitev vrste odzivov (E/S). 4.1.3.1 Pregledna slika poteka odziva Iz tabele odzivov (ES) pripravimo s funkcijo show.es pregledno sliko poteka odzivov (podpoglavje 3.2.1, Slika 3.20). Vsako celico opisuje profil, ki ga določa kombinacija in zaporedje odzivov: N=ni odziva, S=supresija, E=ekscitacija, ES=ekscitacija in supresija, SE =supresija in ekscitacrja (glej podpoglavje 3.1.8). Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 53 Exploratory data nothing else can serve analgsis can never be the whole story, but as the foundation stone - as the first step J. W. Tukey, 1977 5 PRIMERI UPORABE Metoda CSA je uporabna za analizo aktivnosti procesov, ki so nenehno aktivni. Upo¬ rabimo jo lahko za analizo vohalnih čutilnih celic, ki so v odsotnosti dražljaja spontano aktivne. CSA je uporabna tudi za analizo aktivnosti mitralnih celic v vohalnem bulbusu, ki so nenehno aktivne tudi zaradi spontane aktivnosti vohalnih čutilnih celic s katerimi so povezane v mrežo. S CSA smo analizirali posnetke aktivnosti vohalnih čutilnih ce¬ lic ameriškega somiča ( Ameiurus nebulosus ) ter mitralnih celic zlate ribice ( Carassius auratus ) in aksolotla ( Ambystoma tigrinum). Podatki so bili zbrani in analizirani v štirih laboratorijih na Univerzi v Ljubljani, Univer- sity of Minnesota, Universitat Gottingen in Tufts University. 5.1 VOHALNE ČUTILNE CELICE AMERIŠKEGA SOMIČA 5.1.1 Opis poskusnih pogojev in podatkov Prof. dr. Tine Valentinčič, Laboratorij za nevroetologijo, Univerza v Ljubljani (Valentin¬ čič s sod., 1996; Koce, 1999) Vrsta živali: ameriški somič ( Ameiurus nebulosus ) Elektrofiziološka metoda: platinum black Frekvenca digitalizacije analognega zapisa: 44,1 kHz Vohalne čutilne celice (prvi sloj vohalne živčne mreže) Draženje z L-amino kislinami Posnetek spontane akti vbosti: 10 s, trajanje draženja: 30 s Posnetki: - EOG za časovni okvir odziva posameznih celic - Aktivnost živčne celice, čas med akcijskimi potenciali - Časovne oznake: začetek poskusa, začetek dovajanja dražljaja (odpiranje ventila) Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001____ 54 C99218a3.nem Določanje: ekscitacije (0,10) E: 488.422 S: 0.145 0 5 10 15 20 25 30 Slika 5.1: S - supresija. Oznaka dražilne snovi in poskusa: c99218a3. Krivulja ocenjene hitrosti proženja akcijskih potencialov je pod spodnjo kritično mejo (srednja slika). Opis slik tega poglavja: Zgornja slika: kumulativna porazdelitev. Srednja slika: ocene gostot dogodkov (nakloni regresijskih premic) iz simetričnih okolic; vodoravni črti: kritični meji. Spodnja slika: ocene iz desnih okolic; vodoravni črti: kritični meji. Črta nad časovno osjo - območje pričakovanega odziva; navpična črta - začetek draženja, krivulja s točkami - ocene gostote dogodkov. .. Naklon Naklon Kumulativna frekvenca Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001_____ 55 c99210fn.nem o 5 10 15 20 25 Določanje: supresije (5,5) E: 490 S: 490 30 Čas [s] Slika 5.2: N - ni odziva. Oznaka dražilne snovi in poskusa: c99210fn. Celica se v ob¬ dobju možnega odziva (5s) ni odzvala na dražljaj. Ocenjena hitrost proženja akcijskih potencialov je v območju pričakovanih vrednosti tudi med draženjem. Naklon Kumulativna frekvenca 56 Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 __ C99223a2.nem S 0.459/1.1 Določanje: supresije (5,5) E: 488.54 S: 0.459 10 15 20 Določanje: ekscitacije (0,10) E: 488.54 S: 0.459 o 5 10 15 20 25 30 Slika 5.3: S - supresija. Oznaka dražilne snovi in poskusa: c99223a2. Območje možnega odgovora se začne ob spremembi EOG (debela črta nad časovno osjo). Nak,on Naklon Kumulativna frekvenca Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001__ 57 C99223gn.ems 0 5 10 15 20 25 Določanje: ekscitacije (0,10) E: 0.717 S: 488.971 Slika 5.4: E - ekscitacija. Oznaka dražilne snovi in poskusa: c.99223gn. Celica z majhno spontano aktivnostjo se je odzvala z močno ekscitacijo in se vrnila v prvotno spontano aktivnost. Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 58 5.2 MITRALNE CELICE ZLATE RIBICE 5.2.1 Opis poskusnih pogojev in podatkov Prof. dr. Peter W. Sorensen, Department of Fisheries and Wildlife, Universit,y of Minnesota, St. Paul (Hanson s sod., 1998; Hanson, 2001) Vrsta živali: zlata ribica (Carassius auratus ) Elektrofiziološka metoda: steklena elektroda (upornost 2-8 MO) Digitalizacija analognega zapisa: LabView, DataWave Mitralne celice (drugi sloj vohalne živčne mreže, vohalni bulbus) Dražilne snovi: feromonske mešanice iz prostaglandina 15K-PGF 2a , CypSul, 1720bP-S, L-Serin Posnetek spontane akticnosti: 15-20 s Trajanje draženja 3 s, med ponovitvami poskusov 150 s Posnetki: - EOG za časovni okvir odziva posameznih celic - Aktivnost živčne celice, čas med akcijskimi potenciali - Časovne ooznake: začetek poskusa, začetek dovajanja dražljaja: 2 s pred spremembo EOG 0101ax82.tmn E 2.586/2.19/0.338. f=3 3/S O.«""”' » « ttrti im m milili m m I «s» > ** EOG ima Ni lil' I II milil »I III l« milil lili M lili. Določanje: supresije (5,5) E : 2.924 S: 480,895 Čas [s] Slika 5.5: E - ekscitacija. Oznaka dražilne snovi in poskusa: 0101ax82. Navidezna su- presija se začne pred spremembo EOG, zato je ne štejemo. Podobne zakasnitve akcijskih potencialov opazimo tudi med spontano aktivnostjo. Blejec, A,: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 ____ 59 1231aw52.tmn 0 10 20 30 40 o 10 20 30 40 Slika 5.6: E - ekscitacija. Oznaka dražilne snovi in poskusa: 1231aw52. Celica se odzove z ekscitacijo, po odzivu pa je aktivnost večja od aktivnosti pred draženjem. Naklon Kumulativna frekvenca 60 Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 1231aya1.tmn 0 10 20 30 Določanje: ekscitacije (0,10) E: 1.861 S: 482.685 o 10 20 30 Slika 5.7: E - ekscitacija. Oznaka dražilne snovi in poskusa: 1231ayal. Naklon Kumulativna frekvenca 61 Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 1223aya3.tmn o 10 S 20 E 30 40 Čas [s] Določanje: supresije (5,5) E: 6.991 S: 0.135 0 10 20 30 40 Določanje: ekscitacije (0,10) E: 5.545 S: 483.635 o 10 20 30 40 Slika 5.8: SE - supresija in ekscitacija. Oznaka dražilne snovi in poskusa: 1223aya3. Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001__ 62 5.3 MITRALNE CELICE ZLATE RIBICE 5.3.1 Opis poskusnih pogojev in podatkov Prof. dr. Peter Zippel, Physiologishes Institut, Universitat Gottingen (Zippel s sod., 1994, 1999) Vrsta živali: zlata ribica (Carassius auratus ) Elektrofiziološka metoda: steklena elektroda (A-M systems, 10-12 MG) Digitalizacija analognega zapisa: Discovery, Brainwave, 30KHz Mitralne celice (drugi sloj vohalne živčne mreže, vohalni bulbus) Dražilne snovi: aminokisline (L-Ala, L-Glu, L-Arg, L-Lys) Trajanje: zaporedno 15 sekundno draženje med ponovitvami poskusa 180 s posnete vodne prekinitve Posnetki: - EOG za časovni okvir odziva posameznih celic - Aktivnost živčne celice, čas med akcijskimi potenciali - Časovne ooznake: začetek poskusa, začetek dovajanja dražljaja (odpiranje ventila) Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001_ vohalnih celic. 63 1311cv02.gef run 2 celi 1 TO O 3 O E - E 1.601 /2.05/0.942 S 6.461 /1.54 / 5.079.--"" f= 8.6 /s o ** **** ** .< ># mr Tff n t i m. m m m m m in m m 11 111 i m um ■ i it juiiuii! ,(© o o ao o ) 0 !! ! I II • !! 150 160 170 180 E S Določanje: supresije (5,5) E: 1.83 S: 6.461 Čas [s] 150 190 Določanje: ekscitacije (0,10) E: 1.601 S: 5.624 Slika 5.9: ES odziv in skupki akcijskih potencialov. Oznaka dražilne snovi in poskusa: 1311cv02/2/1. Ekscitaciji sledi supresija. Med spontano aktivnostjo se pojavljajo skupki akcijskih potencialov (burst), ki jih opazimo kot periodične vrhove v krivulji ocen hitrosti proženja akcijskih potencialov. Porazdelitev ocen je zelo asimetrična, zato dobimo veliko zgornjo mejo pričakovanih hitrosti proženja. Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 __ 64 E n * 1311cv02.gef run 2 celi 2 E 2.197/2.51 /0.638 > C0S& c (ODO OOtOODO j 0®&° 0< CD 0®£*0 00 * 3 » O ®® 0 f= 1.5/s, ffffiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii»iii[iii Milin milini i milil n 1 50 100 150 200 Slika 5.10: E - ekscitacija. Oznaka dražilne snovi in poskusa: 1311cv02/2/2. Hitrost proženja v prvih 50s spontane aktivnosti je večja od kasnejše in primerljiva s hitrostjo proženja med odzivom. Začetek posnetka je najbrž del odziva prejšnjega poskusa. 180s dolga prekinitev med poskusi zagotavlja, da se celica vrne v prvotno stanje spontane aktivnosti. Naklon Kumulativna frekvenca Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 65 1311cv02.gef run 2 celi 3 60 80 100 120 140 160 180 200 Določanje: ekscitacije (0,10) E: 1.802 S: 319.92 Slika 5.11: E - ekscitacija. Oznaka dražilne snovi in poskusa: 131cv02/2/3. Celica z nizko spontano aktivnostjo se je na dražljaj odzvala z močno ekscitacijo. Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001_ 66 5.4 MITRALNE CELICE TIGRASTEGA AKSOLOTLA 5.4.1 Opis poskusnih pogojev in podatkov Prof. dr. John S. Kauer, Department of Neuroscience, Tufts University, Boston (Kauer, 1974; Kauer in Shepherd, 1977; Dorries s sod., 1997) Vrsta živali: tigrasti aksolotl (Ambystoma tigrinum ) Elektrofiziološka metoda: steklena mikroelektroda (upornost 50-200 MO) Digitalizacija analognega zapisa: DataWave Mitralne celice (drugi sloj vohalne živčne mreže, vohalni bulbus) Dražilne snovi: 4 koncentracije isoamyl acetat, cineol, kafra Trajanje draženja: 1 s, med ponovitvami najmanj 60 s Posnetki: - EOG za časovni okvir odziva posameznih celic - Aktivnost živčne celice, čas med akcijskimi potenciali - Časovne ooznake: začetek poskusa, začetek dovajanja dražljaja (odpiranje ventila) Naklon Naklon Kumulativna frekvenca Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001__ 67 Določanje: ekscitacije (0,10) E: 3.894 S: 480.3 Slika 5.12: SE - supresija in ekscitacija. Oznaka dražilne snovi in poskusa: 514a3/2. Celica se je na draženje odzvala s takojšnjo supresijo, nato pa z ekscitacijo. Po draženju se je aktivnost celice vrnila v stanje pred draženjem. Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 68 4174p5.tim/2 Določanje: supresije (5,5) E: 6.968 S: 480 0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60 Slika 5.13: E - ekscitacija. Oznaka dražilne snovi in poskusa: 4174p5/2. Celica, ki je imela med spontano aktivnostjo majhno hitrost proženja akcijskih potencialov se je na dražljaj odzvala z ekscitacijo. Po draženju se je aktivnost vrnila v stanje pred draženjem. ”Supresija” pred ekscitacijo se je začela že pred draženjem, zato je ne upoštevamo. Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001_ 69 4173a5.tim/3 trials Določanje: ekscitacije (0,10) E: 1.026 S: 480 Slika 5.14: Velika koncentracija akcijskih potencialov takoj po začetku draženja. Oznaka dražilne snovi in poskusa: 4173a5/0/3. V združenem posnetku treh ponovitev poskusa na isti celici opazimo sinhronost pojavljanja majhnega števila akcijskih potencialov, ki mu sledi kratka prekinitev. S CSA lahko zaznamo tudi tako kratkotrajne zgoščine akcijskih potencialov. Združevanje posnetkov je smiselno, ker dražljaj po zraku hitro in v enakem času doseže vohalno celico. Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 ____ 70 The individual špike, so often averaged in with its neighbors, deserves more respect F. Rieke, 1999 6 RAZPRAVA IN SKLEPI Analiza aktivnosti živčnih celic je pomemben način spoznavanja njihovega delovanja pa tudi vloge v živčnih mrežah. Vohalne čutilne celice so poseben primer živčnih celic, saj skoznje vstopa informacija iz okolja v živčevje živali. Večina vohalnih celic je spontano aktivna, kar je s stališča električnega vrednotenja signalov stalen šum (Tuckwell, 1988). S pomočjo uporabe enostavnih statističnih lastnosti šuma smo razvili metodo, ki jo ime¬ nujemo Analiza kumulative dogodkov (Cumulative Slope Analysis ali CSA). CSA zazna značilne signale - spremembe aktivnosti celice, ki se pojavljajo v šumu. Pri tem smo si prizadevali ohraniti nazorno povezavo osnovnega zapisa pojava in rezultatov analize. Statistične lastnosti pojavljanja akcijskih potencialov živčnih celic so teoretično dobro opisane (Cox in Lewis, 1968; Cox in Miller, 1972) in prilagojene za uporabo v nevrofi- ziologiji (Gerstein in Kiang, 1960; Moore s sod., 1966; Perkel s sod., 1967a,b; Glaser in Ruchkin, 1976; ?; Yang in Chen, 1978; Tuc.kwell, 1988; Brillinger, 1992; Theunissen in Miller, 1995; Johnson, 1996; Awiszus, 1997). Analize čakalnih časov in avtokorelacijska funkcija obravnavajo razdalje med zaporednimi dogodki (x) ne glede na čas pojavljanja dogodkov, zato z njimi ne moremo zasledovati sprememb v času. Opišemo lahko le splošne spremembe aktivnosti v daljšem času npr. spremembo aktivnosti med ah po draženju glede na spontano aktivnost. V porazdelitvah lahko opazimo, daje v procesu nenavadno dolg ali nenavadno kratek interval med dogodki, ne vemo pa, kdaj se je tak interval pojavil. Dejanski procesi, pri katerih iščemo spremembo aktivnosti, se ne ujemajo z zamišljenimi modeli procesov. Z neujemanjem opaženih in teoretično predvidenih porazdelitev lahko zaznamo pojavljanje skupkov (vlakov) akcijskih potencialov, nestacionarnost procesa in podobno. Postopki, ki temeljijo na IS1 ( ISIH , JISI (Rodieck s sod., 1962) in korekcijske metode) so namenjeni za analizo, prikazovanje in primerjavo lastnosti živčnih celic v različnih pogojih (Perkel s sod., 1967a; Glaser in Ruchkin, 1976). Ker rezultati teh postopkov (interspike-histogram, avtokorelacijska funkcija, sklopljena porazdelitev intervalov med dogodki) niso prikazani na isti časovni Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 71 osi kot časi pojavljanja dogodkov, uporablja večina raziskovalcev post stirnulus histograme {PST H). P ST H prikazuje časovni potek hitrosti proženja akcijskih potencialov in daje v okviru subjektivno izbranega razreda povprečno mero aktivnosti celice (Gerstein in Kiang, 1960; Moore s sod., 1966; ?). PSTH zabriše lego dogodkov v okviru razreda , zato lahko v preširokih razredih spregledamo kratkotrajne spremembe aktivnosti (Tuckwell, 1988). Da bi ohranili časovni razpored dogodkov, opišemo aktivnost vohalne celice s kumula¬ tivno porazdelitvijo dogodkov ( CSA ). Kumulativna porazdelitev dogodkov (obnovitveno funkcijo) ohranja lego posameznih dogodkov in s strmino krivulje ponazori razdaljo med dogodki ( ISI ). Kumulativna porazdelitev ima dve preprosti lastnosti: 1) v primeru kon¬ stantne hitrosti proženja dogodkov je krivulja linearna in 2) naklon krivulje je neposredno enak gostoti dogodkov t.j. hitrosti proženja dogodkov. Nekateri uporabljajo PSTH in iz PSTH izpeljano kumulativno porazdelitev ( CUSJJM ) (Ellaway, 1978; Awiszus, 1997). Medtem ko je CUSUM odvisna od širine razredov PSTH, prikazuje kumulativna poraz¬ delitev dogodkov opažene dogodke neposredno. Večina spontano aktivnih vohalnih celic rib se odziva na enega ali več različnih dražljajev, odzivi pa so ekscitacije in supresije. Zaradi zajemanja dogodkov v časovne intervale je učinkovitost PSTH metode odvisna od ponavljaj poskusa, ki zagotovijo, da je število opazovanih dogodkov med spontano aktivnostjo veliko. Na eni vohalni celici lahko v raz¬ položljivem času opravimo največ deset meritev, zato iz praktičnih razlogov ponovimo isti poskus največ dvakrat. Zato uporaba PSTH metod pri analizi odzivnosti spontano aktivnih vohalnih celic ni mogoča. Pri združevanju posnetkov se ojačijo tiste lastnosti, ki se glede na začetek draženja pojavljajo v istem času. Zaradi težko določljivega začetka in konca draženja (Slika 3.3) je združevanje ponovitev za uporabo v PSTH in drugih metodah vprašljivo. Ustrezneje je, če poravnamo posnetke glede na začetek odziva. Me¬ toda CSA omogoča določitev začetka odziva in s tem pravilnejšo poravnavo posnetkov ter pravilnejšo uporabo metod PSTH. Problem neznanih časov začetkov draženja in odziva celice pomembno vpliva na uporabo PSTH. Pri majhnem številu dogodkov je oblika histograma odvisna od izbire mej in širin razredov. PSTH je primernejši za analizo odzivov živčnih celic, ki niso spontano aktivne (Tuckwell, 1988). Uporaba PSTH za analizo posameznih posnetkov aktivnosti vohalnih celic je omejena na primere, pri katerih je število dogodkov v razredih zelo veliko. Število dogodkov v razredih lahko povečamo s širino razredov, s tem pa izgubimo možnost zazna¬ vanja kratkotrajnih sprememb. Za analizo aktivnosti celic z majhno frekvenco proženja akcijskih potencialov pogosto uporabljajo razrede, ki so celo širši od trajanja odziva. Kot spodnjo mejo za začetni razred uporabijo začetek dovajanja dražilne snovi. Širina razre¬ dov je določena subjektivno. Odziv je spremenjeno število dogodkov v razredih. Če se začetni trenutek štetja odzivov v razredu ne ujema z začetkom odziva celice je, v pii- Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 72 meru ekscitacije, je tako dobljena frekvenca premajhna, v primeru supresije pa prevelika. Uporabo PSTH lahko izboljšamo, če postavimo mejo začetnega razreda v začetek od¬ ziva. Z metodo CSA določimo začetek odziva za vsak poskns oposebej, kar prispeva k učinkovitejši uporabi PSTH in sorodnih metod. Metoda CSA ocenjuje aktivnost celice z naklonom kumulativne porazdelitve dogodkov. Za določitev naklona kumulativne porazdelitve uporabljamo dogodkovne okolice z izbra¬ nim številom dogodkov. V CSA je širina okolice prilagojena gostoti dogodkov v bližini referenčnega dogodka, v PSTH pa širina razreda določa na kakšne kose bomo razrezali poskusni posnetek. Točne lege dogodkov so v CSA ohranjene, v PSTH pa leg dogodkov ne poznamo. Ko okolice drsijo od dogodka do dogodka, pregledamo vse skupine sosednjih dogodkov v posnetku. Ne glede na izbrano število dogodkov v okolicah je čas začetka odziva ohranjen. Z naklonom linearne regresije ocenimo gostoto dogodkov v okolici vsa¬ kega dogodka. Porazdelitev ocenjenih lokalnih gostot in oblika krivulje gostote dogodkov sta delno odvisni od števila dogodkov v okolici, od stacionarnosti in frekvence spontane aktivnosti pred draženjem (Slika 3.11). Točna oblika krivulje gostot, ki jo uporabimo le za določitev trenutkov odzivov in ne za predstavitev dogajanja kot pri PSTH, za analizo ni bistvena. Zanimajo nas značilne spremembe, vrhovi in doline, s katerimi določimo tip in začetek odziva. Značilne spremembe določamo s pomočjo kvantilnih vrednosti em¬ pirične porazdelitve ocen dogodkov, ki opisuje spontano aktivnost celice. Ne glede na ujemanje s Poissonovim procesom vsebuje empirična porazdelitev vse posebnosti aktiv¬ nosti te celice. Zato uporabljamo metodo CSA brez predpostavk o neodvisnosti in enaki porazdeljenosti časov med dogodki. Pri analizi CUSUM skušajo določiti značilna odsto¬ panja števila dogodkov v razredih PSTH tako, da izračunajo odklone števila dogodkov od pričakovane povprečne aktivnosti pred draženjem. Pri tem računajo na normalno poraz¬ deljenost števila dogodkov v razredih pred draženjam in primerjajo odklone s standardno deviacijo števila dogodkov v razredih (Davey s sod., 1986; Awiszus, 1997). Drseče dogodkovne okolice s stalnim številom dogodkov so osnova za ocenjevanje hitro¬ sti proženja dogodkov nehomogenega Poissonovega procesa ( RIPP , Awiszus (1992)). V tej metodi ocenjujejo gostoto z razmerjem števila dogodkov v okolici in časovne širine okolice. Z metodo RIPP ne upoštevamo lege posameznih dogodkov v okolici, zato ne za¬ znamo kratkotrajnih sprememb gostote dogodkov. Regresijski način ocenjevanja gostote dogodkov v CSA upošteva lego vseh dogodkov v okolici in zato zazna posebnosti živčne aktivnosti, kot so vlaki akcijskih potencialov. Gostoto dogodkov, ki jo ocenimo z me¬ todo RIPP, pripišemo srednji točki dogodkovne okolice. Sredina dogodkovnega intervala se zgolj slučajno ujema z dejanskim dogodkom v opazovani okolici. Ker se ocenjene go¬ stote časovno ne ujemajo s časi dogodkov, zaznava začetka odziva ni mogoča, če rečemo, da se odziv začne v času največje ocenjene gostote dogodkov, je to običajno čas med dvema opaženima akcijskima potencialoma. V CSA pripišemo gostoti dogodkov času re- Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 73 ferenčnega dogodka okolice. Čas začetka odziva je zato povezan z časom enega od opaženih akcijskih potencialov. Bistven podatek za razumevanje vohalne kode je vrsta odziva vohalne celice. V PSTH subjektivno ocenjujemo vrsto odziva. Zaradi praznih razredov je statistična analiza od¬ stopanj v primeru supresije neizvedljiva. Za analizo posameznih posnetkov celic je zaradi majhnega števila dogodk vprašljiva tudi uporaba ISIH. Zgoščine in razredčine v posnetkih so v ISI histogramih slabo vidne (Slika 2.6). Podobni problemi se pojavijo pri uporabi avtokorelacijske funkcije. Ker ne poznamo pričakovane porazdelitve je v posameznem primeru težko primerjati ISI porazdelitve. Zaradi majhnega števila akcijskih potencialov je v primeru supresije primerjava porazdelitve ISI pred in med draženjem nemogoča. Za vrednotenje odzivnosti sloja čutilnih celic na posamezne in sestavljene vrste dražljajev je potrebno poznati vrsto odziva nekaj tisočev vohalnih celic. Za analizo takega števila poskusnih posnetkov potrebujemo metodo, ki na avtomatičen način analizira veliko število posnetkov. Računalniška izvedba CSA omogoča, da hitro pregledamo veliko število posku¬ snih posnetkov. Rezultate analiz prikažemo v grafični in tabelarični obliki. V grafičnem prikazi so tudi podrobnosti, kot je krivulja ocen naklonov, kar omogoči, da preverimo ustreznost rezultatov analize. S tabelo rezultatov analize lahko ugotavljamo porazdelitev vrste odzivov. Metoda CSA analizira potek procesov v časih pojavljanja dogodkov. Z njo opredelimo vrsto odziva, ki je zelo pomembna za bodoče razumevanje vohalne kode. Z drugimi metodami je določitev vrste odziva problematična. Drug pomemben podatek, ki ga določi CSA, je čas začetka odziva. S poznavanjem tega časa lahko izboljšamo uporabo tistih metod, ki so odvisne od zanesljive določitve časa začetka odziva. Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001__ 74 7 POVZETEK Vnos informacij v vohalni sistem poteka skozi slojevite strukture. Prvi sloj vohalne živčne mreže sestavljajo vohalne čutilne celice v vohalnem epitelu. V drugem sloju vohalne živčne mreže so mitralne celice vohalnega bulbusa. Pri ribah je začetna vohalna informa¬ cija kodirana na milijonih spontano aktivnih vohalnih čutilnih celic, ki v času stimulacije spremenijo aktivnost. Spontana aktivnost vohalnih celic predvidoma vzpodbuja nenehno aktivnost mitralnih celic v vohalnem bulbusu, tako, da se sprememba aktivnosti vohalnih čutilnih celic odraža v spremenjeni aktivnosti mitralnih celic vohalnega bulbusa. Vohalna čutilna celica se odzove na kemično draženje z zmanjšano (supresija) ali zvečano (ekscita- cija) hitrostjo proženja akcijakih potencialov. Večina vohalnih čutilnih celic se odziva na več različnih kemičnih dražljajev. Za razumevanje kvantitativnih lastnosti vohalne kode moramo poznati aktivnost velikega števila čutilnih celic. Zaznavanje odziva mitralnih celic pa je zelo pomembno za razumevanje vohalne kode v drugem sloju vohalne živčne mreže. Aktivnost živčnih celic navadno opišemo z obnovitvenim in Poissonovim točkovnim slu¬ čaj nostnimprocesom. Metode, ki temeljijo na analizi čakalnih časov med akcijskimi po¬ tenciali (ISI, int.er-spike interval) oziroma histogramu aktivnosti (PSTH - Post Stimulus Histogram) niso primerne za zaznavanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih živčnih celic. Razvili smo metodo in računalniški program za analizo naklonov kumulativne porazde¬ litve (CSA), ki omogoča hitro zaznavanje sprememb aktivnosti vohalnih čutilnih celic. Metoda uporablja lastnosti obnovitvenih in Poissonovih procesov. Predpostavljamo, da so časi pojavljanja akcijskih potencialov med spontano ali stalno vzpodbujano aktivno¬ stjo neodvisni in enakomerno porazdeljeni, zato imajo linearno kumulativno porazdelitev. Spremembo aktivnosti take živčne celice opazimo kot spremembo naklona porazdelitvene funkcije (kumulativne porazdelitve) akcijskih potencialov. Med ekscitacijo se naklon po¬ razdelitvene funkcije poveča, med supresijo pa zmanjša. Empirično porazdelitveno funk¬ cijo aktivnosti živčne celice v okolicah z izbranim število akcijskih potencialov lokalno aproksimiramo z linearno regresijo. Kot oceno trenutne hitrosti proženja akcijskih po- Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001_ 75 tencialov pripišemo vsakemu akcijskemu potencialu naklon lokalne regresijske premice v ustrezni okolici . Tako dobimo vzorčno porazdelitev ocen hitrosti proženja akcijskih po¬ tencialov med spontano aktivnostjo. Z uporabo centilnih vrednosti vzorčne porazdelitve določimo spodnjo in zgornjo kritično mejo intervala pričakovanih vrednosti. Ta interval omogoča neparametrično določitev značilih povečanj oziroma zmanjšanj hitrosti proženja akcijskih potencialov. Določimo tudi začetek, trajanje in jakost odziva. Za določevanje značilnih sprememb aktivnosti uporabljamo lastnosti empirične vzorčne porazdelitve na¬ klonov porazdelitvene funkcije. Za vsak opazovan primer se empirična vzorčna poraz¬ delitev prilagodi posebnostim spontane aktivnosti, zato lahko metodo uporabljamo brez predpostav o slučajnostnih lastnostih spontane aktivnosti. Program za analizo aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic CSA uporablja statistično programsko okolje S-PLUS. Opisu odziva je dodan grafični prikaz osnovnih podatkov. Program je prirejen za paketno analizo velikega števila poskusov. Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 _ 76 8 SUMMARY 01factory information in fish and other vertebrates is received and processed by a series of complex and poorly understood neural networks, the first of which is the olfactory epithelium and is comprised of many millions of olfactory receptor neurons. These neu- rons project to, and converge onto, a second set of neurons known as mitral celiš, which project to the brain and are key elements of the glomeruli of the olfactory bulb. Local interneurons known as granule celiš run between glomeruli and modulate mitral celi ac- tivity. Although the specificity of this coding system originates in the olfactory receptor neurons, which express one-few olfactory receptors, it is presently thought likely the inte- ractions between glomeruli define finer molecular attributes of individual odors. Together, this system is notable because ali of its principal neural elements have highly variable, spontaneous act,ivity; thus, olfactory information is encoded by a complex scheme that involves both inhibition and excitation of specific elements of a complex neural network residing wit,hin the olfactory bulb. In fishes it is now well established that spontaneously active olfactory receptor neurons can either respond to odorous stimuli with enhanced or reduced firing rates. Further, these changes may have short duration, and some neural elements can be influenced by more than one single odorant. How this systcm encodes olfactory information is presently poorly understood but is presently of great, interest to olfactory biologists who have been attempting to decipher the patterning of neural fire rates of both neural elements while animals are exposed to various odorants. To date, progress has been hampered by a lack of statistical tools with which to evaluate these complex activity patterns. Indeed, most attempts to analyze these patterns have either examined time between action potentials (ISI, inter-spike interval) or spikes per unit time then compared values collected before and after stimulus application by t-test; an appro- ach which both lacks power and violates several statistical principals. For my dissertation I have developed a new, statistic,ally rigorous, yet easily applied approach to eircumvent these difhculties. I have created an algorithm that models the activity of neurons based on stochastic renewal and Poisson point process. I term this technique Cumulative Slope Analysis (CSA) and have developed and implemented a Computer program which allows it to Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001_ 77 be readily used by electrophysiologists attempting to understand olfactory neuron firing patterns. The CSA method assumes that when spontaneously active (e.g. not stimulated by an odor), the action potentials of individual olfactory neurons are independent and uniformly distributed with time, and when plotted their cumulative distribution is thus linear. However, when influenced by an odor, this firing rate will change in some manner and hence result in at least a momentary change in the slope of the action potential distribution function (cumulative distribution). Accordingly, during excitation the slope of the distribution function of the firing rate of a nerve increases, while it decreases during suppression. I have devised a means whereby empirical distribution function of nerve celi activity can be approximated by examining multiple local linear regressions associated with selected numbers of action potentials found at different time intervals in each recording the electrophysiologist makes. A sampling distribution of the spontaneous activity action potential firing rate prior to the stimulation is thus determined. Using the percentile values of the sampling distribution, my program next determines the critical limits of each distribution of slopes. Slopes are then calculated for time intervals after odor stimulation, and compared using non-parametric means with the pre-stimnlns distribution to determine if a change has occurred. No assumptions of inherent, firing rates or patterns, dependence between data points, or even the precise timing of the response need be made yet my procedure can appropriately and accurately identify changes in firing rate that represent either significant suppression or excitation. The onset, duration, and amplitude of the response can also ali be easily determined. Also, a graphic representation of the data is produced. My CSA program for analysis of spontaneously active neuron activity uses a S-PLUS programming environment and has now been made available and tested by several rese- archers on salamander, goldfish, and catfish in both Europe and North America. In ali instances it has proven to be an extremely useful tool. Several modifications have been made and it is the basis of at least one other significant study. The program is suitable for batch analyses of large samples. It represents a new tool for studies of vertebrate olfactory function. Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 aktivnih vohalnih celic. 78 Zahvaljujem se ... Mentorju, prof. dr. Tinetu Valentinčiču za čas in voljo, ki jo je posvetil nastanku tega dela Prof. dr. J. Kauer-ju, Tufts University, Boston Prof. dr. P. W. Sorensen-u, University of Minnesota, St. Paul Prof. dr. P Zippel-u, Universitat Gottingen, Gottingen, da so me sprejeli v svoje laboratorije in mi omogočili analizo svojih podatkov Nacionalnemu inštitutu za biologijo in Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete, da sta časovno in finančno podprla študij in obisk tujih laboratorijev, Članom komisije za skrbno branje dela in tehtne pripombe Bližnjim sodelavcem Svojcem Andrej Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 79 Literatura Abramowitz M., Stegun I. (ur.) 1974. Handbook of mathemtical functions with formulas, graphs and mathematical tables, 7. izd., Dover Publications, New York Adrian E., 1926. The impulses produced by sensory nerve endings: Part I. J Physiol(Lond), 61: 49-72 Aleksander I., Morton H., 1993. Neurons and symbols. The stuff that mind is made of, Chapman & Hall Neural Computing Series 3, 1. izd., Chapman & Hall, London Amjad A.M., Breeze P., Conway B.A., Halliday D.M., Rosenberg J.R., 1989. Framework for the analysis of neuronal networks. Prog Brain Res, 80: 243-255 Awiszus F., 1988. Contimious functions determined by špike trains of a neuron subject to stimulation. Biol Cybem, 58: 321-327 Awiszus F., 1989. On the description of neuronal output properties using špike train data. Biol Cgbern, 60: 323-333 Awiszus F., 1992. The RIPP density estimate: an alternative method for the estimation of peri-stimulus špike density. Journal of NeuroScience, 45: 55-62 Awiszus F., 1993a. Quant,ification and statistical verification of neuronal stimulus respon- ses from noisy špike train data. Biol Cybern, 68: 267-274 Awiszus F., 1993b. Sensitivity of different stimulus-timing strategies for the detection of small excitations in noisy špike train data. Biol Cybern , 68: 553-558 Awiszus F., 1997. Špike train analysis. J Neuro s ci Methods , 74: 155-166 Balis U.J., Morris K.F., Koleski J., Lindsey B.G., 1994. Simulations of a ventrolateral medullary neural network for respiratory rhythmogenesis inferred from špike train cross- correlation. Biol Cybem , 70: 311-327 Brillinger D.R., 1992. Nerve celi špike train data analysis: a progression of technique. JASA, 87(418): 260-271 Brody C.D., 1999a. Correlations without synchrony. Neural Computation, 11: 1537-1551 Brody C.D., 1999b. On artefactual špike train cross-correlations. Neurocomputing, 26-27: 957-962 Cox D.R., Lewis P.A.W., 1968. The Statistical Analysis of Series of Events, 2. izd., Met- huen & Co, London: Cox D.R., Miller H.D., 1972. The Theory of Stochastic Processes, 4. izd., Chapman and Hall, London Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 80 Davey N.J., Ellaway P.H., Stein R.B., 1986. Statistical limits for detecting change in the cumulative sum derivative of the peristimulus time histogram. J Neurosci Metliods, 17: 153-166 Dayhoff J.E., Gerstein G.L., 1983. Favored patterns in špike trains. Detection. J Neuro- physiol, 49: 1334-1348 Dorries K., White J., Kauer J., 1997. Rapid classical conditioning of odor response in a physiological model for olfactory research, the tiger salamander. Chemical Senses, 22: 277-286 Duchamp-Viret P., Duchamp A., Vigouroux M., 1989. Amplifying role of convergence in olfactory system. a comparative study of receptor celi and second-order neuron sensiti- vities. JNeurophysiol, 61: 1085-1094 Ellaway P.H., 1978. Cumulative sum technique and its application to the analyses of peristimulus time histograms. Electromyogr Ciin Neurophgsiol, 45: 302-304 Falzett, M., Moore R.K., Petry H.M., Powers M.K., 1985. Method for determining thre- shold from single-unit neural activity. Brain Res, 347: 127-131 Feng J., Brown D., 1999. Coeffcient of variation of interspike intervals greater than 0.5. How and when? Biol Cybern , 80: 291-297 Feng J., Brown D., 2000. Impact of correlated inputs on the output of the integrate-and- fire model. Neural Computation, 12: 671-692 Fienberg S.E., 1974. Stochastic models for single neuron firing rates. Survey. Biometrics, 30: 399-427 Fitzurka M.A., Tam D.C., 1999. Joint, interspike interval difference stochastic špike train analysis: detecting local trends in the temporal firing patterns of single neurons. Biol Cybern, 80: 309-326 Gerstein G.L., Kiang N.Y.S., 1960. An approach to the quantitative analysis of electro- physiologic,al data from single neurons. Biophgs J, 1: 15—28 Glaser E.M., Ruchkin D.S., 1976. Principles of neurobiological signal analgsis, 1. izd., Academic Press, New York: Hanson L., 2001. Doktorsko delo, University of Minnesota Hanson L., Sorensen P., Cohen Y., 1998. Sex pheromones and amino acids evoke distinctily different spatial patterns of electrical activity in the goldfish olfactory bulb. Annals of the New York Academg of Sciences, 855: 521-524 Holden A. V., 1976. Models of the Stochastic Activitg of Neurones, Springer-Verlag, Berlin: Ito H., Tsuji S., 1997. Statistical st,udy of joint-PSTH for analysis of dynamical neuronal code. Neuroscience Research, 27-29: 297 Iyengar S., Liao Q., 1997. Modeling neural activity using the generalized inverse Gaussian distribution. Biol Cybern, 77: 289-295 Johnson D.H., 1996. Point process models of single-neuron discharges. J Comp Neurosci, 3: 275-299 Kaluzny P., Tarnecki R., 1993. Recurrence plots of neuronal špike trains. Biol Cybem, 58: 527-534 Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 81 Kandel E., Schwartz J., Jessell T. (ur.) 1991. Principles of Neural Science , 3. izd., Prentice Hall International Inc., London Kaneoke Y., Vitek J.L., 1996. Burst and oscillation as disparate neuroonal properties. J Neurosci Methods , 68: 211-223 Kauer J., 1974. Response patterns of amphibian olfactory bulb neurones to odour stimu- lation. J Physiol , 243: 695-715 Kauer J., Shepherd G., 1977. Analysis of the onset, phase of olfactory bulb unit, response to odour pulses in the salamander. J Physiol, 272: 495-516 Koce A., 1999. Elektrofiziološki odzivi vohalnih čutilnih celic in vokalnega epitela ameriškega somiča (Ameiurus nebulosus) na draženje z amino kislinami in njihovimi zmesmi , Doktorsko delo, Univerza v Ljubljani, Ljubljana Lange G.D., Hartline P.H., 1979. Fourier analysis of špike train data. Biol Cybern , 34: Lindsey B.G., Segers L.S., Morris K.F., Hernandez Y.M., Saporta S., Shannon R., 1994. Distributed actions and dynamic associations in respiratory- related neuronal assemblies of the ventrolateral medulla and brain stem midline: evidence from špike train analysis. J Neurophgsiol, 72: 1830-1851 Longtin A., Racicot D.M., 1997. Špike train patterning and forecastability. BioSystems, 40: 111-118 MathSoft, 1999. S-PLUS 2000: Programmer’s manual , Data Analysis Products Division, MathSoft, Seattle, WA Moore G.P., Perkel D.H., Segundo J.P., 1966. Statistical analysis and functional interpre- tation of neuronal špike data. Ann Rev Phgsiol , 28: 43-522 Nawrot M., Aertsen A., Rotter S., 1999. Single-trial estimation of neuronal firing rates: From single-neuron špike trains to population activity. J Neurosci Methods , 94: 81-92 Osborn C.E., Poppele R.E., 1988. method for determining the primary effect of a stimulus in tonically firing neurons using špike train analysis. J Neurosci Methods , 24: 125-130 Osborn C.E., Poppele R.E., 1989. Components of the responses of a population of neurons determined from single-unit recordings. J Neurophysiol, 61: 447-455 Palm G., Aertsen A., Gerstein G.L., 1988. On the significance of correlations among neuronal špike trains. Biol Cybem, 59: 1-11 Parzen E., 1962. Stochastic processes, Holden Day, San Francisco Perkel D.H., Gerstein G.L., Moore G.P., 1967a. Neuronal špike trains and stochastic point, processes. The single špike train. Biophgs J , 7: 391-418 Perkel D.H., Gerstein G.L., Moore G.P., 1967b. Neuronal špike trains and stochastic point processes. Simultaneous špike trains. Biophys J, 7: 419-440 Reike F., Warland D., de Ruyter van Stevenick R., Bialek W., 1999. Spikes: erplomng the neural code , 1. izd., The MIT Press, Cambridge: Rhoades B.K., Weil J.C., Kowalski J.M., Gross G.W., 1996. Distribution-free graphi- cal and statistical analysis of serial dependence in neuronal špike trains. J Neurosci Methods , 64: 25-37 Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 82 Rodieck R.W., Kiang N.Y.S., Gerstein G.L., 1962. Some quantitative methods for the study of spontaneous activity of single neurons. Biophys J, 2: 351-368 Sampath G., Srinivasan S.K., 1977. Stochastic Models for Špike Trains of Single Neurons, Springer, Heidelberg: Sc.hild D., 1987. Response p at ter n features of mitral celiš in the goldfish olfact,ory bulb. Bram Res, 405: 364-370 Shao X.S., Chen P.X., 1987. Normalized auto- and cross-covariance functions for neuronal špike train analysis. Int J Neurosci, 34: 85-95 Siebler M., Koller H., Rose G., Miiller H.W., 1992. An improved graphical method for pattern recognition from špike trains of spontaneously active neurons. Exp Brain Res, 90: 141-146 Suzuki H., Kazuyuki A., Murakami J., Shimozava T., 2000. Analysis of neural špike trains with interspike interval reconstruction. Biol Cybem, 82: 305-311 Sziics A., 1998. Applications of the špike density function in analysis of neural firing patterns. J Neurosci Methods, 81: 159-167 Tam D.C., 1998. Cross-interval špike train analysis: the correlation between špike gene- ration and temporal integration of doublets. Biol Cybern , 78: 95-106 Tam D.C., 1999. Špike train analysis for detecting temporal integration in neurons. Neu- rocomputing, 26-7: 1055-1060 Theunissen F., Miller J.P., 1995. Temporal encoding in nervous systems: rigorous defini- tion. J Comp Neurosci, 2: 149-162 Trivedi K.S., 1982. Probability and Statistics with Reliabilitg, Queuing, and Computer Science Applications, 1. izd., Prentice-Hall, Englewood Cliffs: Tsau Y., Chen P.X., 1989. Normalized power spectrum density function analysis on špike trains. Mathematical method and its evaluation. Int J Neurosci, 49: 115-121 Tuckwell H.C., 1988. Introduction to Theorethical Neurobiologg: volume 2, Nonlinear and Stochastic Theories, 1. izd., Cambridge Universit,y Press, Cambridge: Valentinčič T., Kralj J., Stenovec M., Koce A., 1996. Learned olfactory discrimination of amino acids and their binary mbctures in bullhead catfish (ameiurus nebulosus). Pflugers Arch , 431: R313-R314 Xu Z.M., Ivanušič J. J., Bourke D.W., Butler E.G., Horne M.K., 1999. Automatic detection of bursts in špike trains recorded from the thalamus of a monkey performing wrist movements. J Neurosci Methods, 91: 123-133 Yang G.L., Chen T.C., 1978. On statistical methods in neuronal spike-train analysis. Math Biosci, 38: 1-34 Zippel H., Rabba J., Askari P., Paschke U., 1994. Amino acid information processing of olfactory bulb neurons in goldfish. Advances in the Biosciences , 93: 141-152 Zippel H., Reschke C., Korf V., 1999. Simultaneous recordings from two physiologivally different, types of relay neurons, mitral celiš and ruffed celiš, in the olfactory bulb of goldfish. Cellular and molecular biologg, 45(3): 327-337 Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 83 Stvarno kazalo ab graf, 48 akcijski potencial, 1 skupki (burst), 37 aproksimacija odsekoma linearna, 32 avtokorelacijska funkcija, 6, 19 bulbus vohalni, 25 CSA, glej Cumulative Slope Analysis, 70, 71, 73 Cumulative Slope Analysis, CSA, 50, 53 CUSUM, 6, 71, 72 čakalni čas, glej čas čas čakalni, 17, 20 obnovitveni, 20 referenčni, 36 časovna okolica, 34 čutilne celice, 25 dogodek referenčni, 36 dogodkovna okolica, 34 draženje, 29 dražljaj, 29 ekscitacija, 25, 40 empirična porazdelitvena funkcija , 11 EOG, 29, 42 EOG, elektro olfaktogram, 51 ES graf, 48 gostota dogodkov kontrolni pas, 40 hitrost proženja dogodkov Poissonov proces, 20 hitrost proženja dogodkov, 10, 11 konstantna, 23 ocenjevanje, 23 povprečna, 17 Ie , glej jakost odziva, 48 IIF, 6 Is, glej jakost odziva, 48 ISI, 4, 70 ISIH, 5, 13, 30, 73 jakost, odziva, 44 Ie, 44 Is, 44 JID, 6 JIH, 6 JIS, 6 JISI, 14 JPSTH, 6 končna premica, 45 kontrolni pas gostote dogodkov, 40 krivulja preživetja, 16 kumulativno število dogodkov, 30 mitralne celice, 25 obnovitev, 17 obnovitven proces, 17 obnovitvena funkcija, 18 aproksimacija, 32 obnovitvena gostota, 18, 30 obnovitveni čas, 17, glej čas odziv jakost, 44 trajanje, 44 vrsta, 42 približna ocena, 45 začetek, 43 okolica časovna, 34 dogodkovna, 34 desna, 35 leva, 36 simetrična, 34 pike, glej program Poissonov proces, 1 , 8, 20 , 28, 30 gostota dogodkov, 22 nehomogen, 23 obnovitvena funkcija, 22 obnovitvena gostota, 22 PreCSA, glej program preživetje krivulja, 16 program pike, 51 PreCSA, 51 show.ab, 52 show.bs, 52 Blejec, A.: Alternativna statistična metoda za zasledovanje sprememb aktivnosti spontano aktivnih vohalnih celic. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ, v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001 84 show.es, 52 show.x, 52 špike, 52 PSTH, 3, 12, 29, 71 rasterski graf, 10 razdalja k -tega reda, 4 referenčni čas, 36 dogodek, 36 RIPP, 7, 72 S-PLUS, 50 show.ab, glej program show.bs, glej program show.es, glej program show.x, glej program špike, glej program spontana aktivnost, 16 stacionarnost, 17 supresija, 25, 41 trajanje odziva, 44 vmesna premica, 46 vohalna informacija, 25 vohalna koda, 25 vrsta odziva, 42 začetek odziva, 43 začetna premica, 45 narodna in uniuerzitetna KNJI2NICA 00000240564