Boštjan Luzar1, Nina Gale2, Mario Poljak3, Andrej Cor4
Telomere in telomeraza pri človeku - zgradba, funkcija in vloga v procesu kancerogeneze
Human Telomere and Telomerase: Structure, Function and Role in Cancerogenesis
IZVLEČEK_
KLJUČNE BESEDE: telomere, telomeraza, kancerogeneza.
Z vsako celično delitvijo se telomere človeških somatskih celic skrajšajo. Kritično kratke telomere celični popravljalni mehanizmi spoznajo kot okvarjeno DNA in zaustavijo celično delitev. Celice vstopijo v obdobje staranja in odmrejo. Mutacije v genih, ki uravnavajo celično delitev, oziroma motnje v delovanju njihovih beljakovinskih pridelkov, omogočijo tako spremenjenim celicam nadaljevanje delitev. V obdobju podaljšane življenjske dobe celice lahko pridobijo dodatne genetske napake, telomere se še naprej krajšajo in genomska nestabilnost se povečuje. Zaradi izrazitega skrajšanja telomer, kopičenja genetskih napak in povečevanja genomske nestabilnosti večina celic vstopi v fazo krize in odmre. Celice, ki krajšanje telomer preprečijo, obdobje krize preživijo. Take celice so nesmrtne, saj imajo zaradi uravnavane dolžine telomer neomejeno možnost proliferacije. Encim telomeraza nadomesti izgubo telomer
z njihovo ponovno sintezo in je do sedaj edini znani mehanizem uravnavanja dolžine telo- _
mer pri človeku. Večina normalnih somatskih celic nima dokazljive telomerazne aktivnosti, 271 njena ponovna aktivacija pa je dokazljiva v več kot 85 % malignih tumorjev. Razliko v telo-merazni aktivnosti med tumorskim tkivom in normalnimi tkivi bi zato lahko uporabili v diagnostiki malignih obolenj in pri načrtovanju novih načinov zdravljenja malignih tumorjev. V prispevku so opisana najnovejša spoznanja o telomernem kompleksu, njegovi zgradbi in delovanju pri človeku. Prikazana je zgradba, vloga in mehanizem delovanja telomeraze ter njen pomen v procesu kancerogeneze pri človeku.
ABSTRACT_
KEY WORDS: telomere, telomerase, cancerogenesis.
With each somatic cell division, the chromosomal ends, or telomeres, progressively shorten. Critically shortened telomeres are recognised by DNA repair systems as DNA damage, the cells are withdrawn from the cell cycle, senesce and eventually die. Mutations in the genes responsible for cell division cycle control, or repression of their protein products, enable cells to continue their proliferation. In the period of the so-called extended life span the cells acquire
1	Asist. Boštjan Luzar, dr. med., Inštitut za patologijo, Medicinska fakulteta Univerze v Ljubljani, Koryt-kova 2, 1000 Ljubljana.
2	Prof. dr. Nina Gale, dr. med., Inštitut za patologijo, Medicinska fakulteta Univerze v Ljubljani, Koryt-kova 2, 1000 Ljubljana.
3	Doc. dr. Mario Poljak, dr. med., Inštitut za mikrobiologijo in imunologijo, Medicinska fakulteta Univerze v Ljubljani, Korytkova 2, 1000 Ljubljana.
4	Doc. dr. Andrej Cor, dr. med., Inštitut za histologijo in embriologijo, Medicinska fakulteta Univerze v Ljubljani, Korytkova 2, 1000 Ljubljana.
additional genetic mutations, telomeres progressively shorten, and genomic instability increases. Due to the extremely shortened telomeres accompanied by accumulation of genetic abnormalities and increased genomic instability, most cells enter the period of crisis and die. Those cells that can prevent telomere shortening escape crisis and continue to proliferate. Due to the stabilised telomeres they have the ability to proliferate indefinitely. The only known mechanism so far by which human cells can regulate the length of telomeres is by the action of the enzyme telomerase. Detection of telomerase activity in the overwhelming majority of advanced and metastatic human cancer but not in most somatic cells implies that telomerase dependent immortalization could contribute to the development of malignancy. Thus, repression of telomerase activity may be a novel adjuvant therapy for the treatment of human cancer and detection of telomerase activity may be important for cancer diagnostics. In the present review we have described the most recent advances in the field of telomeres and telomere related proteins, the so-called telomeric complex, its structure and function. Furthermore, we have also outlined the structure, function and mechanisms, by which telomerase regulates the length of human telomeres. Finally, the current views on the role of telomerase in human cancerogenesis are presented.
272
UVOD
Telomere so specifična ponavljajoča se zaporedja nukleotidov na koncih linearnih kromosomov. Pri človeku je zaporedje zgrajeno iz šestih nukleotidov, (TTAGGG)n, ki se ponavljajo na 3'-koncu molekule DNA v dolžini od 8-15 kilobaznih parov (1). Na dvojnovijač-na telomerna zaporedja se vežejo različne regulatorne beljakovine, ki skupaj s telomer-nimi zaporedji tvorijo telomerni kompleks. Zaradi svoje značilne zgradbe in prostorske ureditve telomerni kompleks omogoča, da celični popravljalni mehanizmi normalne konce linearnih kromosomov ločijo od naključnih prelomov DNA (2). Ti povzročijo aktivacijo celičnih popravljalnih mehanizmov, ki odstranijo nastale napake. Telomerni kompleks zagotavlja stabilnost kromosomov, preprečuje njihovo razgradnjo, medsebojno zlepljanje koncev linearnih kromosomov ter omogoči normalno ločevanje kromosomov med procesom celične delitve (3). Telomerna zaporedja tvorijo tudi čvrste povezave z jedrnim matrik-som, zato imajo verjetno pomembno vlogo v vzdrževanju ustrezne strukture jedra (4).
Telomere somatskih celic se z vsako celično delitvijo skrajšajo za 50-200 baznih parov (5). Vzrok za ta pojav je problem podvajanja koncev linearnih kromosomov, ki ga je Olovnikov opisal že leta 1973 (6) (slika 1).
Izguba telomernih zaporedij na 5'-koncu sledilne verige je večja, kot bi pričakovali, če bi prišlo do izgube TTAGGG-zaporedij le zaradi
problema podvajanja koncev linearnih kromosomov. Pri krajšanju telomer sodeluje tudi eksonukleaza 5'-3', ki deluje sama ali pa kot sestavni del DNA-polimeraze (7) in ima verjetno pomembno vlogo v razgradnji RNA-začetnikov na sledilni verigi (8). Dolžina 3'-previsa ni enaka v vseh celicah in je sorazmerna s stopnjo krajšanja telomer (9). 3'-previs je dolg približno 300 nukleotidov v celicah, ki pri celični delitvi izgubijo okrog 100 baznih parov telomer-nih zaporedij, in le 150 nukleotidov v celicah, ki izgubijo 50 baznih parov telomernih zaporedij na celično delitev. Ko se telomere skrajšajo na kritično dolžino, pride do aktivacije popravljalnih procesov na DNA, ki ustavijo celični cikel in sprožijo staranje celice (10) ali pa progami-rano celično smrt, apoptozo (11). Vse več je dokazov, da prav dolžina telomer določa proli-feracijsko aktivnost celice (12), zato telomere imenujemo tudi mitotično uro.
Dolžina telomernih zaporedij je odvisna od vrste tkiva (13). Zarodne celice (klične celice) (14), kot tudi nesmrtne celične vrste v kulturi, vzdržujejo nespremenjeno dolžino telomer. Ugotovili so, da je v njih prisoten encim telomeraza, ki nadomesti izgubo koncev kromosomov med vsako celično delitvijo z njihovo ponovno sintezo.
ENCIM TELOMERAZA -ZGRADBA IN FUNKCIJA
Telomeraza je encimski kompleks, zgrajen iz več podenot (slika 2). Njena zgradba še ni
konci kromosomov
5' ^^^m
3'
centromere
j DNA replikacija
3'
RNA začetnik
5' i::::::::::::::::::: 3'
j Ligacija Okazakijevih fragmentov
5' vrzel
3' ^m
vodilna sledilna
vodilna sledilna
G-rep
Slika 1. Problem podvajanja koncev linearnih kromosomov. DNA-polimeraza lahko tvori novo verigo le v smeri 5-3' in potrebuje začetno zaporedje (angl. primer), ki ga nato podaljšuje. Sinteza vodilne verige poteka vsmeri 5—3' neprekinjeno. Sinteza verige, ki sledi (angl. lagging strand), poteka prav tako v smeri 5—3', vendar prekinjeno, v obliki kratkih 100-200 nukleotidov dolgih odsekov - Okazakijevih fragmentov. Vsak tak odsek se začne s kratkim RNA začetnikom dolžine 8-12 baznih parov, ki ga sinteti-zira RNA-primaza in nato podaljša DNA-polimeraza. RNA-začetniki se iz sledilne verige hitro odstranijo, vrzel pa zapolni DNA-polimeraza. Odstranitev RNA-začetnika na skrajnem 5'-koncu sledilne verige ima za posledico vrzel, ki ostane nezapolnjena, ker DNA-polimeraza nima začetnika, ki bi omogočil njeno normalno delovanje. Zaradi problema podvajanja koncev linearnih kromosomov ostane na 3-koncu molekule DNA linearna enovijačna DNA, bogata z gvaninskimi nukleotidi - 3-previs oz. 3' G-rep.
273
Telomerna DNA
-	TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAG
-	AATCCCAAT
Legenda:
hTR RNA-podenota
katalitična podenota beljakovina TEP1 (angl. telo-merase associated protein 1), povezuje med seboj katalitično podenoto in RNA-podenoto beljakovini p23 in Hsp 90 Hsp 90 z vezavo na hTERT vplivata na aktivnost telome-raznega kompleksa
hTERT TEP 1
p23
+
+
Slika 2. Hipotetični prikaz zgradbe aktivnega telomeraznega kompleksa.
v celoti poznana. Glavni podenoti telomera-ze sta RNA in katalitična podenota (15, 16), ki sta med seboj povezani z beljakovino TEP1 (angl. telomerase associated protein 1) (17, 18). Za normalno delovanje telomeraze sta ključni obe podenoti. Od stopnje aktivnosti telomeraze je odvisno, ali bodo telomere po delitvi celic krajše, enako dolge ali daljše.
RNA-podenota (hTR). Imenujemo jo tudi funkcionalna oz. matrična (angl. template) RNA (Shay JW, osebna komunikacija) in je posebna oblika mRNA (informacijska RNA, angl. messenger RNA), saj jo najverjetneje sintetizira RNA-polimeraza II (19). RNA-po-limeraza II prepisuje gene, katerih mRNA je namenjena sintezi beljakovin v cito-plazmi (20). Preden iz primarnega prepisa RNA-polimeraze II nastane mRNA, pride do kovalentne modifikacije na koncu 5' in 3' primarnega prepisa. Poliadenilacija 3'-konca ima ključno vlogo pri prenosu mRNA v citoplaz-mo, metilacija G-nukleotida na 5'-koncu pa je pomembna za začetek sinteze beljakovin v citoplazmi (20). hTR nima 3'-poliadenilira-
nega konca, zato nikoli ne zapusti jedra (19) (Shay JW, osebna komunikacija).
Aktivno mesto v hTR je funkcijsko razdeljeno na dva dela. Zaporedje, ki je bližje 3'-koncu hTR, prepoznava komplementarna telomerna zaporedja na 3'-previsu, z njimi tvori bazne pare ter tako omogoči prileganje telomeraznega kompleksa. Zaporedje, ki je bližje 5'-koncu hTR je matrica katalitični podenoti pri sintezi komplementarnega zaporedja na 3'-previsu. (15) (slika 3). Celoten encimski kompleks se nato premakne v 3'-smeri previsa in postopek se ponovi. Sinteza komplementarne verige na 5'-koncu DNA pa poteka po klasični poti z DNA poli-merazo.
Kataliti~na podenota (beljakovina h-TERT). Deluje kot reverzna transkriptaza (21). Gen hTERT, ki vsebuje zapis za katalitično podenoto, je v genomu le v eni kopiji (22). Prisotni pa so številni različni mRNA-prepisi tega gena, ki verjetno nastanejo z mehanizmom alternativnega izrezovanja intronov v primarnem DNA-prepisu (angl. alternative
274
1. PRILEGANJE	^3'	5'\
C )hTR
3'-AATCCCAATCCCAATCCC	VCC AAUCCCAAUCy
5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAG
2. PODALJŠANJE	^3'	5'
3
'	x hTR
)
3'-AATCCCAATCCCAATCCC	v CC CAAUCCCAAUC
5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAG-3'
3. PREMIK in PONOVNO PRILEGANJE	/3'	5'-v
C )hTR
3'-AATCCCAATCCCAATCCC	VCC \AUCCCAAUCy
5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAG-3'
4. PODALJŠANJE	/3'	5'^
C yhTR
3'-AATCCCAATCCCAATCCC	VCC \AUCCCAAUCy
5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAG-3'
Slika 3. Model delovanja RNA-podenote telomeraznega kompleksa. Aktivno mesto vhTR (tj. RNA-podenota telomeraznega kompleksa) je funkcijsko razdeljeno na dva dela: zaporedje bližje 3' hTR (označeno ), omogoča prileganje hTR na enovijačni 3' DNA-previs (prileganje). Zaporedje bližje 5' hTR (označeno ■), deluje kot matrica katalitični podenoti za sintezo komplementarnega zaporedja na koncu 3'previsa (podaljšanje). hTR se nato premakne v 3'-smeri G-repa (premik). Celoten postopek se nato ponovi.
geni
proteinski pridelki
medsebojni odnosi
Legenda +: spodbujevalni učinek -: zaviralni učinek
TERF 1	gen TERF1
TNKS	gen TNKS
TINF2	gen TINF2
TERF2	gen TERF2
TERF1
PIN 2 TRF 1
^ J
TNKS
t
Tankiraza
TINF2
TIN 2
TERF 2
t
TRF 2
TRF 1	beljakovina TRF 1 (angl. TTAGGG repeat-binding factor 1)
TRF 2	beljakovina TRF 2 (angl. TTAGGG repeat-binding factor 2)
PIN 2	beljakovina PIN 2 (angl. protein interacting with never-in-mitosis Aprotein kinase)
TIN 2	beljakovina TIN 2 (angl. TRFl-interacting nuclear protein 2)
Slika 4. Geni, ki so udeleženi pri uravnavanju dolžine telomer, njihovi beljakovinski pridelki in do sedaj poznani medsebojni odnosi.
mRNA splicing) (23). To je pogost način uravnavanja izraženosti genov pri višjih evkariotih (24). Biološki pomen različic hTERT-beljakovin, ki jih lahko dokažemo med embriogenezo v celicah različnih tkiv in imajo najverjetneje tudi drugačne biokemične lastnosti, do sedaj ni poznan (25).
V celicah, ki nimajo dokazljive telomeraz-ne aktivnosti, se lahko z aktivacijo hTERT-gena njena aktivnost ponovno vzpostavi. Zato sklepamo, da je hTERT-beljakovina ključni regulator telomerazne encimske aktivnosti.
Poznamo dve beljakovini, ki se vežeta na katalitično podenoto in vplivata na telome-razno aktivnost: p23 in Hsp90 (26). Ce preprečimo vezavo p23 ali pa Hsp90 na h-TERT, onemogočimo nastanek aktivnega telomeraznega kompleksa.
Beljakovina TEP 1 (TP1). Ima vezavna mesta za hTERT in hTR. Domnevajo, da je pomembna za vzdrževanje ustrezne strukture oz. za združevanje posameznih enot telome-raznega ribonukleobeljakovinskega kompleksa in s tem posredno vpliva na funkcijo telome-raze (17).
Uravnavanje dolžine telomer. Na dvoj-novijačna telomerna zaporedja se vežejo različne regulatorne beljakovine, ki uravnavajo dolžino telomer. Do sedaj so odkrili štiri
gene, ki vsebujejo zapise za telomerne regu-latorne beljakovine (slika 4). TERF1 določa beljakovini TRF 1 (TTAGGG Repeat-binding Factor) in PIN 2 (27, 28). Različna pridelka istega gena nastaneta zaradi mehanizma alternativnega izrezovanja intronov v primarnem DNA-prepisu (27). TRF 1 in PIN 2 nadzorujeta dolžino telomer (27, 28). Gen TERF2 določa beljakovino TRF 2, ki vzdržuje stabilnost kromosomov z zagotavljanjem ustrezne strukture na koncih telomer (28-30). Gen TNKS določa beljakovino tankirazo, ki je negativni regulator TRF 1 (31). Gen TINF2 (TIN2) kodira beljakovino TIN 2, ki je nujno potrebna za normalno delovanje TRF 1 (32).
Beljakovini TRF 1 in TRF 2 se kot homo-dimera specifično vežeta na dvojnovijačna telomerna DNA-zaporedja, tankiraza, TIN 2 in PIN 2 pa z vezavo na TRF 1 vplivajo na njegovo funkcijo.
Beljakovina TRF 1 je negativni regulator dolžine telomer. Vezava zadostne količine beljakovine TRF 1 vzdolž dvojnovijačnih telo-mernih zaporedij zavre telomerazo. Daljše telomere vežejo več telomeraznega zaviralca TRF 1 kot krajše, zato je tudi skupni zaviralni učinek večji (28, 33). Beljakovina TRF 1 lahko učinkovito vpliva na dolžino telomere
275
+
+
276
le, če je nanj vezana beljakovina TIN 2. TRF1 in TIN 2 s tvorbo različnih intratelomernih povezav omogočita ustrezno konformacijo telomer (2), ki telomerazi prepreči dostop na 3'-previs (32). Na TRF 1 se lahko veže tudi tan-kiraza, ki je strukturno podobna ankirinom in katalitični podenoti poli (adenozin-difos-fat-riboza) polimeraze (PARP). Ankirini so udeleženi v medsebojnih interakcijah med različnimi beljakovinami, PARP pa je sestavni del popravljalnih mehanizmov okvarjene DNA. PARP katalizira ADP-ribozilacijo beljakovin in uporablja kot substrat nikotin-amid-dinu-kleotid (NAD+). ADP-ribozilacija večinoma inaktivira beljakovine (31). Med podvajanjem DNA oziroma po njem tankiraza, ki ima lastno PARP-aktivnost, inaktivira tako TRF 1 kot tudi sebe. Neaktivna beljakovina TRF 1 se odcepi iz molekule DNA in omogoči dostop telomeraze na konce kromosomov (31, 33) in s tem njeno delovanje.
Beljakovina TRF 2 je strukturno podobna TRF 1 in ima ključno vlogo pri vzdrževanju enovijačnega z gvaninom bogatega 3'-DNA previsa. Zavrtju beljakovine TRF 2 sledi izguba 3'-previsa, dvojnovijačni konci linearnih kromosomov se zaradi nemotenega delovanje ligaz oz. drugih popravljalnih mehanizmov na DNA kovalentno povežejo med seboj (28). Na mestu združitve koncev najdemo dvojnovijač-na telomerna zaporedja. Očitno je, da je 3'-previs pomemben za zaščito dvojnovijačnih telomernih zaporedij. Mehanizem, s katerim 3'-previs zagotavlja stabilnost telomer in preprečuje njihovo medsebojno spajanje, še ni v celoti poznan. Griffith in sodelavci menijo, da sta TRF 1 in TRF 2 odgovorna za nastanek ključnih konformacijskih sprememb telomer-ne DNA, ki omogočijo tvorbo tako imenovanih zank T in D (2) .
O«
TRF 1 dimer Q
t
:v
m tf3*
.T. .T.,
SE)
TRF 2 dimer (Q
=3»

-G*


'¡L
>
T zanka
Slika 5. Telomerni kompleks s svojo značilno zgradbo in prostorsko ureditvijo omogoča ločevanje med normalimi konci linearnih kromosomov in naključnimi prelomi DDNA molekule. Za podrobnosti glej besedilo v članku. (Modificirana slika iz članka Griffith J,et al. Mammalian telomeres end in a large duplex loop. Cell 1999; 97:503-14, zdovoljenjem avtorja in založnika).
jetneje vezan na dvojnovijačno telomerno DNA na mestu stika med nastalo T-zanko in enovijačnim 3'-previsom, povzroči delno odvitje dvojnovijačne telomerne DNA in omogoči bazno parjenje med 3'-previsom in telomerno DNA. Nastane D-zanka (angl. displacement loop) (2, 34). TRF 2 verjetno zagotovi tudi stabilnost novonastale povezave. Natančno mesto, na katerem se 3'-previs pogrezne v dvojnovijacno telomerno DNA, ni poznano. Daljše telomere tvorijo daljše T-zanke, ne morejo pa jih tvoriti kritično kratke telomere (34). Te ne zaščitijo več učinkovito kromosomskih koncev in zveču-jejo genomsko nestabilnost (2, 34).
TELOMERE TVORIJO ZANKE T IN D
T-zanka je nazaj zavihana dvojnovijačna telomerna DNA (2). TRF 1 in nanj vezan TIN 2 povzročita zavihanje dvojnovijačne telomerne DNA okoli TRF 1 - TIN 2 beljakovinskega kompleksa, ki tako enovijačni 3'-previs približa dvojnovijačni telomerni DNA (slika 5) (2, 28, 33). TRF 2, ki je najver-
NADZOR PROLIFERACIJSKE AKTIVNOSTI - TELOMERE SO CELIČNA MITOTIČNA URA
Normalne človeške diploidne celice v kulturi imajo brez telomerazne aktivnosti omejeno proliferacijsko zmogljivost. Po določenem končnem številu delitev preidejo v obdobje staranja (ang. senescence), ki ga označuje pre-
nehanje celičnih delitev. To stopnjo celičnega ciklusa imenujemo tudi Hayflickova meja oz. mortalitetni stadij 1 (M1) (35). Vzrok za aktivacijo antiproliferacijskega kontrolnega mortalitetnega stadija M1 je kritično skrajšanje telomer, ki spremeni tudi izraženost sicer normalno neaktivnih subtelomernih regula-tornih genov. Celični DNA popravljalni mehanizmi prepoznajo kritično skrajšanje telomer kot okvaro DNA in zato zaustavijo celično delitev (35). Za zaustavitev v stadiju M1 je torej ključna normalna funkcija p53 in Rb tumorje zavirajočih genov oz. njunih beljakovinskih pridelkov; p53 in pRb (36, 37). Dodatne mutacije v genih za nadzor celičnega ciklusa oz. zavrtje delovanja njihovih produktov z virusnimi onkoproteini omogočijo nadaljevanje celičnega ciklusa oz. delitev celice in s tem klonalno razširitev tako okvarjenih celic (38). Celice vstopijo v fazo podaljšane življenjske dobe (angl. extended lifespan) in nadaljujejo s celičnimi delitvami (35). Vtem obdobju pridobijo še dodatne genetske napake, telomere se še naprej krajšajo in genomska nestabilnost se povečuje. Celice se lahko delijo toliko časa, dokler ne nastopi drugi antiproliferacijski kontrolni stadij, to je faza krize oz. mortalitetni stadij 2 (M2) (3). Vstop vM2 je posledica ekstremne-ga skrajšanja telomernih zaporedij. Nezaščiteni konci linearnih kromosomov se zlepljajo med seboj, kar skupaj z nakopičenimi dodatnimi genetskimi napakami povzroči, da večina celic v fazi krize odmre. S stabilizacijo dolžine telomer lahko celica kljub prekomernim mutacijam prepreči zastoj celičnega ciklusa vM2 (39). Celice, ki preživijo M2, so nesmrtne, saj imajo neomejeno proliferacijsko sposobnost, ki omogoči njihovo klonalno razširitev (39). V večini primerov postane celica nesmrtna z reaktivacijo telomeraze (40). Reaktivacija telomeraze je posledica izgube specifičnega(-ih) represivnega(-ih) gena(-ov), ki običajno zavira(jo) ekspresijo telomera-ze (38). Osnovni pomen telomeraze v procesu kancerogeneze je stabilizacija telomer in s tem preprečevane izgube kromosomskih koncev, kar celicam omogoči neomejeno delitev - celično nesmrtnost, njihovo klonalno razširitev in kopičenje dodatnih mutacij.
TELOMERAZNA AKTIVNOST
V	RAZLIČNIH VRSTAH CELIC
Telomerazne aktivnosti v normalnih somatskih celicah večinoma ni, saj se med embriogene-zo zavre njena aktivnost v večini celic. Zavrtje je lahko posledica popolne oz. delne zavore prepisovanja genov, odgovornih za nastanek telomeraznega kompleksa in njegovo delovanje. Nizka telomerazna aktivnost pa ostaja v proliferacijskih celicah regeneratornih tkiv, npr. aktiviranih limfocitih B in T, nezrelih predstopnjah hematopoetskih celic, bazalnih celicah kože, premenopavzalnem proliferacij-skem endometriju, kriptnem epitelu črevesa in matičnih celicah (angl. stem cells) različnih tkiv (41). Nizka telomerazna aktivnost v teh celicah sicer upočasni izgubo telomernih zaporedij, je pa ne more v celoti preprečiti (35). Stopnja telomerazne aktivnosti je odvisna tudi od starosti človeka in se z leti zmanjšuje.
VLOGA TELOMERAZE
V	KANCEROGENEZI PRI ČLOVEKU
V	zadnjem času pripisujejo encimu telo-merazi in njeni reaktivaciji ključno vlogo v procesu kancerogeneze. Ponovna aktivaci-ja encima telomeraze je prisotna v 85-95 % primarnih malignih tumorjev pri človeku, kot npr. v tumorjih glave in vratu, spolovil, želodca, debelega črevesa, jeter, pljuč, centralnega živčnega sistema in drugih (37). Z določanjem telomerazne aktivnosti v 895 vzorcih malignih tumorjev in 646 vzorcih nemalignih tkiv (70 vzorcih normalnih somatskih tkiv, 310 vzorcih tkiva ob tumorju ter 266 vzorcih benignih in premalignih tkiv) so ugotovili, da je njena specifičnost 91 %, občutljivost 85 %, pozitivna napovedna vrednost 93 % in negativna napovedna vrednost 81% (42). Telomerazne aktivnosti v večini normalnih somatskih celic ni, zato bi lahko bilo določanje njene aktivnosti ključni molekularno-biološ-ki označevalec neoplastičnega procesa. Reaktivacija telomerazne aktivnosti nastopi že zgodaj v procesu kancerogeneze tumorjev dojke, glave in vratu, soncu izpostavljene kože ter jetrnega karcinoma in pozno v kan-
277
278
cerogenezi tumorjev trebušne slinavke, debelega črevesa in ščitnice (43).
Določanje stopnje telomerazne aktivnosti ima tudi napovedni pomen. Visoka telomerazna aktivnost v nevroblastomih, pri akutni mieloični levkemiji, karcinomih prebavnega trakta in dojke je povezana s slabo napovedjo (43). Z določanjem telomerazne aktivnosti pri bolnikih z nevroblastomom so ugotovili, da pri podtipu tega tumorja z napredovalo boleznijo in oddaljenimi zasevki (stadij IV-S) po operaciji primarnega tumorja lahko pride do spontane regresije preostalega tumorskega tkiva (44). V veliki večini teh primerov v nevroblastomu niso mogli dokazati telomerazne aktivnosti.
Zaviranje telomeraze je obetajoča metoda zdravljenja malignih tumorjev. Metoda temelji na predpostavki, da je encim reaktiviran pri večini malignih tumorjev. Z zavrtjem delovanja telomeraze v tumorskih celicah bi povzročili kritično skrajšanje telomer, kromosomsko nestabilnost in celično smrt (42). V poskusih na nesmrtnih celičnih kulturah so namreč ugotovili, da lahko z uporabo prepisov (angl. transcripts), ki so bili komplementarni hTR, povzročimo krajšanje telomer, vstop celic v faze krize in njihovo odmiranje (19, 45). Ker telomerazne aktivnosti v večini normalnih somatskih
celic ni, predvidevamo, da bi bili stranski učinki zdravljenja z zaviralci telomeraze manjši kot pri klasičnem citostatskem zdravljenju.
ZAKLJUČEK
Vznik raka pri človeku je povezan s kopičenjem številnih genetskih sprememb v celici. Te vodijo v spremenjeno izraženost protoonkogenov, tumorje zavirajočih genov in genov, ki sodelujejo pri popravljanju napak v molekuli DNA (angl. DNA mismatch repair genes). Spremembe v njihovem delovanju povečujejo genomsko nestabilnost. Reaktivacijo encima telomeraze najdemo v večini malignih tumorjev pri človeku. Omogoči stabilizacijo koncev kromosomov, genomsko stabilnost in razvoj celične nesmrtnosti. Neomejena sposobnost proliferacije omogoči klonalno razširitev celic ter dodatno kopičenje genetskih napak. Telomerazne aktivnosti v večini normalnih somatskih celic ne zasledimo, zato bi telomerazno aktivnost lahko uporabili kot ključni molekularno-biološki označevalec neoplastičnega procesa. Nenazadnje, zdravljenje malignih tumorjev z zaviralci telomerazne aktivnosti je obetajoča metoda zdravljenja malignih tumorjev tudi zaradi pričakovanih manjših stranskih učinkov kakor pri sedanjem klasičnem citostatskem zdravljenju.
LITERATURA
1.	Blackburn EH. Structure and function of telomeres. Nature 1991; 350: 569-73.
2.	Griffith JD, Comeau L, Rosenfield S, Stansel RM, Bianchi A, Moss H, et al. Mammalian telomeres end in a large duplex loop. Cell 1999; 97: 503-14.
3.	Dahse R, Fiedler W, Ernst G. Telomeres and telomerase: biological and clinical importance. Clin Chem 1997; 43:708-14.
4.	Luderus ME, van Steensel B, Chong L, Sibon OC, Cremers FF, de Lange T. Structure, subnuclear distribution, and nuclear matrix association of the mammalian telomeric complex. J Cell Biol 1996; 135: 867-81.
5.	Harley CB, Futcher AB, Greider CW. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature 1990; 345: 458-60.
6.	Olovnikov AM. A theory of marginotomy. The incomplete copying of template margin in enzymatic synthesis of polynucleotides and biological significance of the phenomenon. J Theor Biol 1973; 41: 181-90.
7.	Siegal G, Turchi JJ, Myers TW, Bambara RA. A 5' to 3' exonuclease funtionally interacts with calf DNA polymerase epsilon. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89: 9377-81.
8.	Makarov VL, Hirose Y, Langmore JP. Long G tails at both ends of human chromosomes suggest a C strand degradation mechanism for telomere shortening. Cell 1997; 88: 657-66.
9.	Huffman KE, Levene SD, Tesmer VM, Shay JW, Wright WE. Telomere shortening is proportional to the size of the 3'G-rich telomeric overhang. J Biol Chem 2000; 275: 19719-22.
10.	Preston JR. Telomeres, telomerase and chromosome stability. Radiation Res 1997; 147: 529-34.
11.	Karlseder J, Broccoli D, Dai Y, Hardy S, de Lange T. p53- and ATM-dependent apoptosis induced by telomeres lacking TRF2. Science 1999; 283: 1321-5.
12.	Bodnar AG, Quellette M, Frolkis M, Holt SE, Chiu CP, Morin GB, et al. Extension of life-span by introduction of telomerase into norman human cells. Science 1998; 279; 349-52.
13.	Autexier C, Greider CW. Telomerase and cancer: revisiting the telomere hypothesis. Trends Biochem Sci 1996; 21: 387-91.
14.	Cooke HJ, Smith BA. Variability at the telomeres of the human X/Y pseudoautosomal region. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1986; 51: 213-9.
15.	Shippen-Lentz D, Blackburn EH. Functional evidence for an RNA template in telomerase. Science 1990; 247: 546-52.
16.	Nakamura TM, Morin GB, Chapman KB, Weinrich SL, Andrews WH, Linger J, et al. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. Science 1997; 277: 955-9.
17.	Kickhoefer VA, Stephen AG, Harrington L, Robinson MO, Rome LH. Vaults and telomerase share a common subunit, TEP1. J Biol Chem 1999; 274: 32712-7.
18.	Harrington L, McPhail T, Mar V, Zhou W, Oulton R, Bass MB, et al. A mammalian telomerase-associated protein. Science 1997; 275: 973-7.
19.	Feng J, Funk WD, Wang SS, Weinrich SL, Avilion AA, Chiu CP, et al. The RNA component of human telomerase. Science 1995:269:1236-41.
20.	Young RA. RNA polymerase II. Annu Rev Biochem 1991; 60: 689-715.
21.	Linger J, Hughes TR, Shevchenko A, Mann M, Lundblad V, Cech TR. Reverse transcriptase motifs in the catalytic subunit of telomerase. Science 1997; 276: 561-7.
22.	Kilian A, Bowtell DD, Abud HE, Hime GR, Venter DJ, Keese PK, et al. Isolation of a candidate human telomerase catalytic subunit gene, which reveals complex splicing patterns in different cell types. Hum Mol Genet 1997; 6: 2011-9.
23.	Ulaner GA, Hu JF, Vu TH, Giudice LC, Hoffman AR. Telomerase activity in human development is regulated by human telomerase reverse transcriptase (hTERT) transcription and by alternative splicing of hTERT transcript. Cancer Res 1998; 58: 4168-72.
24.	Adams MD, Rudner DZ, Rio DC. Biochemistry and regulation of pre-mRNA splicing. Curr Opin Cell Biol 1996; 8: 331-9.
25.	Cong YS, Wen J, Baccetti S. The human telomerase catalytic subunit hTERT: organization of the gene and characterization of the promoter. Hum Mol Gen 1999; 8: 137-42.
26.	Holt SE, Aisner DL, Baur J, Tesmer VM, Dy M, Ouellette M, et al. Functional requitement of p23 and Hsp90 in telomerase complexes. Genes Dev 1999; 13: 817-26.
27.	Shen M, Haggblom C, Vogt M, Hunter T, Lu KP. Characterization and cell cycle regulation of the related human telomeric proteins Pin2 and TRF 1 suggest arole in mitosis. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 13618-23.
28.	van Steensel B, de Lange T. Control of telomere length by human telomeric protein TRF1. Nature 1997; 385; 740-3. _
29.	Bilaud T, Brun C, Ancelin K, Koering CE, Laroche T, Glison E. Telomeric localization of TRF2, a novel human 279 telobox protein. Nat Genet 1997; 17: 236-9
30.	van Steensel B, Smogorzewska A, de Lange T. TRF2 protects human telomeres from end-to-end fusions. Cell 1998; 92: 401-13.
31.	Smith S, Giriat I, Schmitt A, de Lange T. Tankyrase, a poly (ADP-ribose) polymerase at human telomeres. Science 1998; 282; 1484-7.
32.	Kim SH, Kaminker P, Campisi J. TIN2, a new regulator of telomere length in human cells. Nat Genet 1999; 23: 405-12
33.	Pennisi E. A possible new partner for telomerase. Science 1998; 282: 1395-7.
34.	Shore D. Different means to common ends. Nature 1997; 385: 676-7.
35.	Holt SE, Shay JW. Role of telomerase in cellular proliferation and cancer. J Cell Physiol 1999; 180: 10-8.
36.	Shay JW, Wright WE, Brasiskyte D, van der Haegen BA. E6 of human papillomavirus type 16 can overcome the M1 stage of immortalization in human mammary epithelial cells but not in human fibroblasts. Oncogene 1993; 8:1407-13.
37.	Shay JW, Wright WE. Telomerase activity in human cancer. Curr Opin Oncol 1996; 8: 66-71.
38.	Shay JW, Wright WE, Werbin H. Loss of telomeric DNA during aging may predispose cells to cancer. Int J Oncol 1993; 3: 559-63.
39.	Wright WE, Shay JW. The two-stage mechanism controlling cellular senescence and immortalization. Exp Gerontol 1992; 27: 383-9.
40.	Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, Harley CB, West MD, Ho PL, et al. Specific association of human telomerase activity with immoral cells and cancer. Science 1994; 266: 2011-5.
41.	Dhaene K, Van Marck E, Parwaresch R. Telomeres, telomerase and cancer: an update. Virchows Arch 2000; 437: 1-16.
42.	Kim NW. Clinical implications of telomerase in cancer. Eur J Cancer 1997; 33; 781-6.
43.	Shay JW, Gazdar AF. Telomerase in early detection of cancer. J Clin Pathol 1997; 50: 106-9.
44.	Hiyama E, Hiyama K, Yokoyama T, Matsuura Y, Piatyszek MA, Shay JW. Correlating telomerase activity levels with human neuroblastoma outcomes. Nat Med 1995; 1: 249-55.
45.	Herbert B, Pitts AE, Baker SI, Hamilton SE, Wright WE, Shay JW, et al. Inhibition of human telomerase in immortal human cells leads to progressive telomere shortening and cell death. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 14276-81.
Prispelo 20. 7. 2000