Acta Sil va e et Ligni 132 (2023), 1–12 1 Izvirni znanstveni članek / Original scientific article PATOGENOST IZOLATOV IZBRANIH VRST GLIV NA Pinus sylvestris L. IN P . nigra Arnold PATHOGENICITY OF SELECTED FUNGAL SPECIES ISOLATES ON Pinus sylvestris L. AND P . nigra Arnold Ana BRGLEZ 1 , Barbara PIŠKUR 2 , Nikica OGRIS 3 (1) Gozdarski inštitut Slovenije, Oddelek za varstvo gozdov, ana.brglez@gozdis.si (2) Gozdarski inštitut Slovenije, Oddelek za varstvo gozdov, barbara.piskur@gozdis.si (2) Gozdarski inštitut Slovenije, Oddelek za varstvo gozdov, nikica.ogris@gozdis.si IZVLEČEK Na sadikah rdečega in črnega bora smo testirali patogenost osmih izbranih izolatov gliv (Corinectria fuckeliana, Diaporthe eres, Diplodia pinea, Fusarium sp. 1 in 2, Fusicolla sp., Nectria dematiosa in Tympanis sp.), ki smo jih izolirali iz obolelih borovih dreves v Sloveniji v letih 2020 in 2021. Inokulirali smo skupno 115 sadik borov (vključno s kontrolo), periodično smo preverja- li njihovo zdravstveno stanje in ob prvih znakih sušenja opravili reizolacije iz robov nastalih nekroz. Reizolacije so bile uspešne le v primeru inokulacije z vrstami gliv Diplodia pinea, Diaporthe eres in Fusarium sp. 2. Povprečna dolžina nekroz sadik rdečega bora, inokuliranih z D. pinea, Di. eres in Tympanis sp., se je statistično značilno razlikovala od kontrolnih sadik (p < 0,05). Pri sadikah črnega bora pa so se za statistično značilne izkazale povprečne dolžine nekroz pri kontroli in inokulacijah z glivama D. pinea in Tympanis sp. (p < 0,05). Ključne besede: test patogenosti, reizolacije, Pinus sylvestris, rdeči bor, Pinus nigra, črni bor ABSTRACT The pathogenicity of eight selected fungal isolates (Corinectria fuckeliana, Diaporthe eres, Diplodia pinea, Fusarium sp. 1 and 2, Fusicolla sp., Nectria dematiosa and Tympanis sp.), isolated from diseased pines in Slovenia in 2020 and 2021, was tested on seedlings of Scots and Austrian pine. We inoculated a total of 115 pine seedlings (including the control group), regularly checked their health status and performed re-isolations from necrotic margins at the first signs of desiccation. Re-isolations were successful only when inoculated with Diplodia pinea, Diaporthe eres and Fusarium sp. 2. The average length of necrosis in Scots pine seedlings inoculated with D. pinea, Di. eres and Tympanis sp. was significantly different from that of the control group (p < 0.05). In Austrian pine seedlings, the average length of necrosis differed significantly between the control group and seedlings inoculated with the fungi D. pinea and Tympanis sp. (p < 0.05). Key words: pathogenicity test, re-isolations, Pinus sylvestris, Scots pine, Pinus nigra, Austrian pine GDK 443.2:174.7Pinus(045)=163.6 Prispelo / Received: 21. 07. 2023 DOI 10.20315/ASetL.132.1 Sprejeto / Accepted: 07. 09. 2023 1 UVOD 1 INTRODUCTION Bor (Pinus spp.) je vrstno najbogatejši rod iglav- cev na svetu, skupaj je znanih okrog 100 vrst (Farjon in Styles, 1998). V Evropi avtohtono raste 10 vrst, v Sloveniji pa štiri: rdeči bor (P . sylvestris L.), črni bor (P . nigra Arnold), rušje (P . mugo Turra) in cemprin (P . cembra L.) (Brus, 2008). V Evropi je rdeči bor najbolj razširjen iglavec. Na revnih in degradiranih rastiščih opravlja pomembno melioracijsko vlogo (Brus, 2008). V letu 2021 je lesna zaloga borov znašala 5,4 % skupne lesne zaloge slovenskih gozdov (Gozdni fondi, b. l.). Najpomembnejše vrste gliv, ki povzročajo bolezni borov pri nas, so: Cenangium ferruginosum Fr. (suši- ca borovih vej), Corinectria fuckeliana (C. Booth) C.D. González & P . Chaverri (sušica vej iglavcev), Cyclaneu- sma minus (Butin) DiCosmo, Peredo & Minter (rume- ni osip borovih iglic), Diplodia pinea (Desm.) J. Kickx f. (sušica najmlajših borovih poganjkov), Dothistroma spp. Hulbary (rdeča pegavost borovih iglic), Gremme- niella abietina (Lagerb.) M. Morelet (odmiranje po- ganjkov črnega bora), Lecanosticta acicola (Thüm.) Syd. (rjavenje borovih iglic), Lophodermium seditiosum Minter, Staley & Millar (osip borovih iglic), Meloderma desmazieri (Duby) Darker (osip iglic zelenega bora) in nekatere rje (Maček, 2008). Med škodljivimi žuželkami na borih pa pri nas prevladujejo vrste iz družine pod- lubnikov (Scolytidae), navadna in rjava borova grizlica (Diprion pini Linnaeus in Neodiprion sertifer Geoffroy), vrste iz družine zapredkaric (Acantholyda hieroglyphi- 2 B r gl ez A., Pišk ur B., Ogr is N.: P a t ogenost iz ola t o v izbr anih vrst gli v na Pinus syl v estr is L. in P . nigr a Arnol d ca Christ, A. nemoralis Thomson, A. erythrocephala Lin- naeus), zavijač borovih poganjkov (Rhyacionia buolia- na Denis & Schiffermüller) ipd. (Jurc, 2011). Poleg že ustaljenih škodljivih organizmov pa se lahko k nam razširijo tudi novi, za zdaj na območju Slovenije neznani organizmi. Na karantenskih listah EU (Izvedbena uredba komisije…, 2019) se pojavlja več vrst gliv in žuželk, ki pomenijo tveganje za bore v Evropi. V Sloveniji smo do sedaj z rednimi letnimi pro- grami preiskav ugotavljali njihovo navzočnost (npr. Atropellis spp., Bursaphelenchus xylophilus / Steiner et Bührer / Nickle et al., Cronartium spp., razen Cronarti- um gentianeum, Cronartium pini / Willdenow / Jørstad in Cronartium ribicola Fischer, Dendrolimus sibiricus Chetverikov, Monochamus spp. (neevropske populaci- je), Pissodes spp. (neevropske populacije)), a iskanih organizmov v Sloveniji nismo našli. Eden takšnih je tudi gliva Fusarium circinatum Nirenberg & O'Donnell, ki povzroča borov smolasti rak (angl. pine pitch can- ker). Gre za bolezen borov z značilnimi nekrozami na deblu, vejah in koreninah ter obilnim smoljenjem (Pest survey ..., 2020; Fusarium circinatum, 2022b) (slika 1). Domneva se, da vrsta izvira iz Mehike (Wikler in Gor- (Wikler in Gor- don, 2000), od koder se je najverjetneje razširila po Severni Ameriki in drugih delih sveta (Japonska, Južna Koreja, Južna Afrika, Brazilija, Čile, Kolumbija, Urugvaj) (Fusarium circinatum, 2022a). Leta 2003 so jo prvič za- . Leta 2003 so jo prvič za- sledili v Španiji (Landeras in sod., 2005), kasneje tudi na Portugalskem (Bragança in sod., 2009), v Franciji (First report ..., 2006) in Italiji (Carlucci in sod., 2007). Bolezen so uspešno zatrli v Franciji in Italiji, v Španiji in na Portugalskem pa se še vedno pojavlja in širi. Bo- lezen se na kratkih razdaljah širi s pomočjo vetra in žu- želk, na daljših razdaljah pa s transportom okuženega semena, sadik, lesa, zemlje, lubja ipd. (Pest survey ..., 2020). V preglednem članku Drenkhan in sod. (2020) navajajo 106 gostiteljskih vrst, od tega 85 vrst iz rodu Pinus, 6 drugih drevesnih vrst in 15 vrst trav in zelišč. Glavna gostitelja sta bor (Pinus spp. L.) in navadna ameriška duglazija (Pseudotsuga menziesii /Mirbel/ Franco). Možnosti za vnos in širjenje glive v Evropi in pri nas so zaradi ugodnih klimatskih razmer in razšir- jenosti gostiteljskih dreves razmeroma velike (Ganley in sod., 2009; Möykkynen in sod., 2015; Ogris, 2017). Fusarium circinatum je v okviru Evropske unije uvrščen kot karantenski škodljivi organizem v Prilogo II.B Uredbe 2019/2072/EU (Izvedbena uredba komisi- je …, 2019), poleg tega pa je bil leta 2019 sprejet Izved- beni sklep komisije (EU) 2019/2032 (Izvedbeni sklep komisije ..., 2019), s katerim so države članice EU ob- , s katerim so države članice EU ob- vezane k letnim pregledom za ugotavljanje navzočno- sti omenjene glive. Programe preiskav za ugotavljanje navzočnosti škodljivih organizmov rastlin uresničuje Uprava Republike Slovenije za varno hrano, veterinar- stvo in varstvo rastlin s pomočjo pooblaščenih javnih zavodov in Inšpekcije za varno hrano, veterinarstvo in varstvo rastlin (Programi preiskav ..., 2022) in vklju- (Programi preiskav ..., 2022) in vklju- in vklju- čujejo vizualne preglede, vzorčenje simptomatskih rastlin ter ugotavljanje navzočnosti glive na potencial- nih vektorjih, ki jih lovimo s pastmi. Gozdarski inštitut Slovenije je vključen v vsakoletni program preiskav za ugotavljanje navzočnosti karantenske glive F. circi- natum, a omenjene glive do zdaj v Sloveniji še nismo zaznali (Programi preiskav ..., 2022). Iz gostiteljskih rastlin, ki kažejo podobna znamenja poškodovanosti ali okužb z glivo F. circinatum, pogosto med analizami vzorcev izoliramo številne druge glive, ki so potencial- no patogene in lahko povzročijo podobna bolezenska znamenja kot F. circinatum. Za ugotavljanje vpliva izoli- ranih vrst gliv na zdravstveno stanje borov (Pinus spp.) smo v naši raziskavi ugotavljali patogenost izbranih izolatov gliv na sadikah rdečega in črnega bora. Slika 1: Značilna bolezenska znamenja borovega smolastega raka: a) odmiranje poganjkov in vej, b) rakava rana na deblu, ki obilno smoli, in c) s smolo prepojeni les (foto: Nikica Ogris) Fig. 1: Typical symptoms of pine canker disease: a) dieback of shoots and branches, b) copious resin exudates (pitch) be- neath cankers, and c) resin-soaked wood (Photo: Nikica Ogris) Acta Sil va e et Ligni 132 (2023), 1–12 3 2 METODE 2 METHODS 2.1 Izolati gliv 2.1 Fungal isolates Za poskus smo izbrali izolate osmih vrst gliv, ki smo jih pridobili med programom preiskav za ugotavljanje navzočnosti patogene glive Fusarium circinatum v le- tih 2020 in 2021. Bori (Pinus spp.), ki so bili vključeni v vzorčenje, so izražali venenje, odmiranje poganjkov, rakaste razjede na deblu in vejah, izcejanje smole iz prizadetih delov. Izolati so bili izolirani iz rastlinskega materiala, in sicer iz roba nekroz borov (Pinus spp.). Odstranili smo zunanji del suberizirane skorje, iz roba nekroze s sterilnim skalpelom izrezali trak skorje z lesom velikosti približno 10 × 2 mm 2 in na sterilnem filter-papirju pripravljeni trak razrezali na manjše koščke velikosti približno 2 × 2 mm 2 . V sterilno plastič- no petrijevko (Ø = 70 mm) s hranilnim agarjem PDA (angl. potato dextrose agar; slo. krompirjev dekstrozni agar; Becton Dickinson, Sparks, MD, ZDA), pripravlje- nim po navodilih proizvajalca (39 g PDA raztopljenih v 1 l destilirane vode ter sterilizacija pri 121 °C in 1,2 bara) z dodatkom antibiotika streptomicin (0,5 g anti- biotika dodanega v sterilizirano gojišče, ohlajeno na 60 °C), smo vstavili štiri koščke. Med inkubacijo na 24 °C v temi smo petrijevke večkrat preverili in v mikrobio- loški komori aseptično precepili vse izraščajoče vrste gliv na sveže gojišče PDA. Izbrani izolati so bili do ni- voja vrste ali rodu določeni na podlagi primerjav več regij DNA z referenčnimi nukleotidnimi zaporedji in z javno dostopnimi bazami GenBank (b. l.), BOLD (b. l.) oziroma FUSARIOID-ID (b. l.) (preglednica 1). 2.2 Test patogenosti 2.2 Pathogenicity test V drevesnici Gozdarskega inštituta Slovenije pri Šentjakobu ob Savi (X: 467.968 m, Y: 104.607 m) smo aprila 2022 posadili skupno 126 triletnih sadik rdeče- ga in črnega bora. Sadike rdečega bora so bile vzgoje- ne iz semena, ki je bil pridobljen v semenskem sestoju z reg. št. 4.0253 (Udin Boršt) in glavnim spričevalom SI 05-006, črni bor pa v semenskem sestoju z reg. št. 7.0289 (Čebulovica) in glavnim spričevalom SI 09-023. Mesec dni kasneje smo vizualno zdrave in nepoškodo- vane sadike (119) inokulirali z izbranimi izolati gliv (preglednica 1). Debelca smo najprej površinsko raz- Vrste ZLVG 1 GenBank 2 Lokacija 3 Gostitelj Corinectria fuckeliana (C. Booth) C.D. González & P. Chaverri 911 ITS EF-1α LSU OR077711 OR105860 OR077743 X: 437383 Y: 76576 (Strmica) P. sylvestris Diaporthe eres Nitschke 987 ITS BT EF-1α OR077715 OR098303 OR122685 X: 436884 Y: 66882 (Matenja vas) P. wallichiana Diplodia pinea (Desm.) J. Kickx f. 900 ITS EF-1α OR077709 OR105859 X: 390462 Y: 80296 (Opatje selo) P. pinea Fusarium sp. 1 Link 982 ITS EF-1α rpb2 OR077708 OR105858 OR098304 X: 552238 Y: 78337 (Grad Mokrice) P. strobus Fusarium sp. 2 Link 985 ITS EF-1α rpb2 OR077713 OR105857 OR098305 X: 440126 Y: 86607 (Logatec) P. wallichiana Fusicolla sp. Bonord 984 ITS EF-1α rpb2 OR077712 OR105856 OR098306 X: 440126 Y: 86607 (Logatec) P. wallichiana Nectria dematiosa (Schwein.) Berk. 965 ITS EF-1α LSU OR077714 OR105861 OR077744 X: 459060 Y: 59883 (Snežnik) P. wallichiana Tympanis sp. Tode 983 ITS LSU OR077710 OR077742 X: 490100 Y: 56942 (Kočevje) P. sylvestris 1 Številka izolata v zbirki trajnih kultur Laboratorija za varstvo gozdov 2 Številke nukleotidnih zaporedij različnih regij DNA v bazi GenBank 3 Koordinate so v D48 koordinatnem sistemu Preglednica 1: Izolati gliv, uporabljeni v poskusu Table 1: Fungal isolates used in the study 4 B r gl ez A., Pišk ur B., Ogr is N.: P a t ogenost iz ola t o v izbr anih vrst gli v na Pinus syl v estr is L. in P . nigr a Arnol d kužili s 70 % etanolom. Na sredini očiščenega dela de- belca smo skorjo ranili s sterilnim luknjačem za usnje (Ø = 4 mm) in v rano vstavili košček agarja z micelijem z roba aktivno rastočih, 10 dni starih kultur izbranih gliv (na gojišču PDA pri 24 °C). Inokulacijski košček smo prekrili z vlažno sterilno vato (velikosti približno 1 × 1 cm 2 ) ter mesto inokulacije tesno ovili z alufolijo in parafilmom. Z vsako izbrano glivo smo inokulirali naj- manj šest sadik rdečega in najmanj šest sadik črnega bora. Šest sadik rdečega in sedem sadik črnega bora, ki smo jim v rano vstavili košček sterilnega agarja, je rabilo za kontrolo. Število inokuliranih sadik se je med obravnavanji razlikovalo (preglednica 2), saj se je do inokulacije nekaj sadik posušilo ali pa so bile poškodo- vane, zato smo jih izločili iz poskusa. Zdravstveno stanje inokuliranih sadik smo perio- dično (na 14 dni) preverjali in ob začetnih znamenjih sušenja smo poskus, ki je vključeval sadike, inokulira- ne z isto vrsto glive, zaključili in opravili reizolacije. Po 49 dneh od inokulacij smo zaključili poskus z glivo D. pinea, po 60 dneh z glivama Fusarium sp. 1 in Fusarium sp. 2, po 103 dneh z glivami C. fuckeliana, Tympanis sp. in kontrolo ter po 105 dneh z glivami Di. eres, Fusicolla sp. in N. dematiosa. Sadike smo izruvali s koreninskim sistemom vred in jih prepeljali v Laboratorij za varstvo gozdov na Gozdarskem inštitut Slovenije. Debelca ino- kuliranih in kontrolnih sadik smo v laboratoriju najprej površinsko razkužili. S kuhinjsko gobico smo pod teko- čo vodo odstranili zemljo in druge nečistoče. Nato smo debelca za eno minuto potopili v 70 % etanol, za 30 s v komercialno Varikino z 1 % aktivnega klora, ponovno za minuto v 70 % etanol in jih na koncu sprali v steril- ni destilirani vodi. S sterilnim skalpelom smo vzorcem najprej odstranili periderm (zunanji del skorje), da smo identificirali rob nekroze. Dolžino vidne nekroze smo merili z navadnim plastičnim ravnilom (slika 2) in iz njenega roba odvzeli po 8 (v primeru suhe sadike) oz. 16 (v primeru žive sadike) koščkov lesa približne velikosti 2 × 2 mm 2 ter jih nacepili na 3,9 % (m/V) PDA- gojišče z dodatkom 0,05 % (m/V) antibiotika strepto- micin. Petrijevke s po štirimi koščki lesa smo inkubirali v temi v inkubatorju pri temperaturi 24 °C in periodič- no (3x tedensko) preverjali rast ter precepljali kulture na sveže gojišče PDA. Dobljene čiste kulture gliv smo na podlagi vizualnih makromorfoloških značilnosti (npr. barva in oblika kulture, tip micelija, oblika roba kulture, barva na hrbtni strani petrijevke) razvrstili v morfotipe. V poskusu smo po reizolacijah pridobili Preglednica 2: Število sadik rdečega in črnega bora, ki smo jih inokulirali z izbranimi izolati gliv Table 2: Number of P . sylvestris and P . nigra seedlings inocu- lated with selected fungal isolates Pinus sylvestris Pinus nigra Corinectria fuckeliana 7 7 Diaporthe eres 7 6 Diplodia pinea 6 7 Fusarium sp. 1 6 7 Fusarium sp. 2 6 7 Fusicolla sp. 6 7 Nectria dematiosa 6 7 Tympanis sp. 7 7 Kontrola 6 7 Slika 2: Prikaz dolžine nekroze (razdalja med rdečima črtama) Fig. 2: Display of necrosis length (distance between the red lines) Acta Sil va e et Ligni 132 (2023), 1–12 5 30 morfotipov, za nadaljnjo identifikacijo smo izbrali 14 morfotipov, ki so bili najpogostejši, oziroma mor- fotipe, ki so bili podobni glivam, ki smo jih uporabili za inokulacijo. Za molekularno določanje smo izbrali eno reprezentativno kulturo posameznega morfotipa. Reprezentativne kulture so shranjene v zbirki trajnih kultur Laboratorija za varstvo gozdov na Gozdarskem inštitutu Slovenije. 2.3 DNA ekstrakcija, pomnoževanje in sekvenci- ranje 2.3 DNA extraction, amplification and sequen- cing Za namen identifikacije izolatov smo uporabili identifikacijo na podlagi molekularnih podatkov. Iz micelija, postrganega iz gojišča PDA, smo izolirali celo- kupno DNA glive s komercialnim ekstrakcijskim kitom Nucleospin Plant II (Macherey Nagel, Düren, Nemčija). Ekstrakcijo smo opravili po navodilih proizvajalca, le da smo za homogenizacijo glivnega materiala uporabi- li tubice Lysing Matrix A (MP Biomedicals, Solon, OH, ZDA) in homogenizator Precellys Evolution (Bertin Technologies, Montigny-le-Bretonneux, Francija). Za pomnoževanje izbranih regij DNA smo uporabili kom- binacije začetnih oligonukleotidov in pogojev, kot so opredeljeni v preglednici 3. Dobljene PCR-produkte smo v nadaljevanju očistili s pomočjo komercialnega kita Wizard SV Gel in PCR Clean-Up System (Prome- ga, Fitchburg, WI, ZDA) po navodilih proizvajalca ter poslali na sekvenciranje v Eurofins Genomics (Köln, Nemčija). Sekvence smo vizualizirali in obdelali v pro- gramu Geneious (Biomatters Ltd., Auckland, Nova Ze- landija). Konsenze sekvenc smo med 29. julijem in 3. novembrom 2022 preverjali z različnimi javno dosto- pnimi bazami nukleotidnih zaporedij ter primerjali s sekvencami izolatov, ki so bili uporabljeni v testu pato- genosti. Sekvence smo deponirali v podatkovno zbirko GenBank. 2.4 Analiza podatkov 2.4 Data analysis Podatke o dolžinah nekroz sadik borov smo anali- zirali s pomočjo programskega paketa Microsoft Excel verzija 2210 in programske opreme za statistične ana- lize R (R Core Team, 2019). Za testiranje homogeno- (R Core Team, 2019). Za testiranje homogeno- . Za testiranje homogeno- sti varianc smo uporabili Levenov test. V nadaljevanju smo v primeru podatkov za rdeči bor s pomočjo Kru- skal-Wallisovega testa primerjali povprečne dolžine nekroz pri sadikah, inokuliranih z različnimi izolati iz- branih gliv. Nato smo uporabili post-hoc Dunnov test multiplih parnih primerjav. V primeru podatkov za črni bor je bila v skupini sadik, okuženih z D. pinea, le ena vrednost, zato smo uporabili parametrični test ANOVA in post-hoc Tukey HSD test. Iz obdelave smo namreč v obeh primerih izločili suhe sadike, kjer nismo imeli podatkov o dolžinah nekroz. Iz podatkov o reizoliranih vrstah smo s pomočjo Microsoft Excel verzije 2210 izračunali stopnjo koloni- zacije in relativne frekvence. Stopnjo kolonizacije smo izračunali kot količnik med številom okuženih koščkov (izraščajoč micelij) in skupnim številom nacepljenih koščkov. Relativna frekvenca (F) posameznega taksona je bila izračunana kot količnik med številom kultur do- ločenega taksona in skupnim številom kultur. Določili smo tudi stopnjo propadlih sadik. 3 REZUL T ATI 3 RESUL TS 3.1 Test patogenosti 3.1 Pathogenicity test Inokulacijska mesta so se v večini primerov po koncu poskusa že zaraščala, dobro opazna je bila tudi tvorba kalusa. Kljub temu smo z robov nekroze oz. robov mest inokulacije opravili reizolacije v čiste kul- ture. Očitne nekroze so bile opazne samo pri sadikah, inokuliranih z D. pinea (slika 3c in slika 4c). Kontrolne sadike so se večinoma zaraščale, zato v teh primerih na mestih inokulacij ni bilo nekroz. Pri nekaj inokuliranih Regija Začetni oligonukleotidi T naleganja (˚C) Reference ITS rDNA ITS1 / ITS4 55 (White in sod., 1990) EF-1α EF1-728f / EF1-1567 66 (9x) in 56 (35x) (Hirooka in sod., 2012) EF-1α EF1f / EF1r 55 (PM 7/91 ..., 2019) LSU LR0R / LR5 53 (Vilgalys in Hester, 1990) β-tubulin BT2a / BT2b 60 (Gomes in sod., 2013) rpb2 RPB2-5f2 / RPB2-7cr in RPB2-7cf / RPB2-11ar 55 (Crous in sod., 2021) Preglednica 3: Uporabljene kombinacije začetnih oligonuk- leotidov in pogoji reakcij PCR Table 3: Primer oligonucleotide combinations used and PCR reaction conditions 6 B r gl ez A., Pišk ur B., Ogr is N.: P a t ogenost iz ola t o v izbr anih vrst gli v na Pinus syl v estr is L. in P . nigr a Arnol d sadikah je bila opazna zadebelitev na mestu inokulaci- je (slika 3b). Povprečna dolžina nekroz kontrolnih sadik rdečega bora se je statistično značilno razlikovala od dolžin ne- kroz sadik, inokuliranih z D. pinea, Di. eres in Tympanis sp. (p < 0,05). V primeru sadik črnega bora pa so bile statistično značilne razlike v povprečni dolžini nekroz med kontrolo in sadikami, inokuliranimi z D. pinea in Tympanis sp. (p < 0,05) (sliki 5 in 6). Najdaljšo nekrozo (63 mm) je povzročila inokulacija z glivo D. pinea na rdečem boru. Suhim sadikam ob koncu poskusa nismo izmerili dolžine nekroz in jih nismo vključili v nadaljnje analize (preglednica 4). Ponovna reizolacija gliv, s katerimi smo okužili sa- dike rdečega in črnega bora, je bila uspešna le v treh primerih, in sicer pri inokulaciji z D. pinea, Di. eres in Fusarium sp. 2. Identiteta sekvenc reizoliranih izolatov se je popolnoma (100 %) ujemala z osnovnimi sekven- cami izolatov, s katerimi smo opravljali inokulacije sadik (dostopne sekvence ITS regije v bazi GenBank: OR077709 (D. pinea), OR077715 (Di. eres), OR077713 (Fusarium sp. 2)). Z roba nekroz smo sicer določili tudi številne druge vrste (slika 7). Iz 1784 nacepljenih koščkov lesa smo pridobili 1478 kultur, ki so predstavljale 30 morfoti- pov. Stopnja kolonizacije pri sadikah rdečega bora je znašala 88,2 %, pri sadikah črnega bora pa 77,8 %. Na sadikah rdečega bora smo identificirali 13 različ- nih taksonov, na sadikah črnega bora pa 16 taksonov gliv. Sekvence identificiranih taksonov so dostopne v podatkovni zbirki GenBank pod kodami: OR091293– OR091327. Reprezentativne kulture pa so shranjene v zbirki trajnih kultur Laboratorija za varstvo gozdov (ZLVG 1026–ZLVG 1038). 4 RAZPRAVA IN ZAKLJUČKI 4 DISCUSSION AND CONCLUSIONS Test patogenosti smo opravili na sadikah, posajenih v gredi v drevesnici Gozdarskega inštituta Slovenije. Sadike so bile izpostavljene vplivu stresnih dejavnikov – suša, obilne padavine, žuželke, drugi patogeni orga- Slika 3: Nekroze na sadikah rdečega bora, ki so jih povzročile glive: a) C. fuckeliana, b) Di. eres, c) D. pinea, d) Fusarium sp. 1, e) Fusarium sp. 2, f) Fusicolla sp., g) N. dematiosa, h) Tym- panis sp. in i) kontrola Fig. 3: Necroses on P . sylvestris saplings inoculated with a) C. fuckeliana, b) Di. eres, c) D. pinea, d) Fusarium sp. 1, e) Fusar- ium sp. 2, f) Fusicolla sp., g) N. dematiosa, h) Tympanis sp. and control Slika 4: Nekroze na sadikah črnega bora, ki so jih povzročile glive: a) C. fuckeliana, b) Di. eres, c) D. pinea, d) Fusarium sp. 1, e) Fusarium sp. 2, f) Fusicolla sp., g) N. dematiosa, h) Tym- panis sp. in i) kontrola Fig. 4: Necroses on P . nigra saplings inoculated with a) C. fuckeliana, b) Di. eres, c) D. pinea, d) Fusarium sp. 1, e) Fusari- um sp. 2, f) Fusicolla sp., g) N. dematiosa, h) Tympanis sp. and i) control Acta Sil va e et Ligni 132 (2023), 1–12 7 Slika 5: Dolžine nekroz sadik rdečega bora, inokuliranih z izbranimi izolati gliv ob koncu testa patogenosti. Grafikon prikazuje minimum, prvi kvartil, mediano, tretji kvartil in maksimum. Črke ponazarjajo različne statistične skupine (glede na post-hoc Dunnov test). Fig. 5: Necrosis lengths of P . sylvestris inoculated with se- lected fungi at the end of the pathogenicity test. The boxplot shows the minimum, first quartile, median, third quartile and maximum values. The letters represent different statisti- cal groups (based on post-hoc Dunn test). Slika 6: Dolžine nekroz sadik črnega bora, inokuliranih z iz- branimi izolati gliv ob koncu testa patogenosti. Grafikon pri- kazuje minimum, prvi kvartil, mediano, tretji kvartil in mak- simum. Črke ponazarjajo različne statistične skupine (glede na post-hoc Tukey HSD test). Fig. 6: Necrosis lengths of P . nigra inoculated with selected fungi at the end of the pathogenicity test. The boxplot shows the minimum, first quartile, median, third quartile and maxi- mum values. The letters represent different statistical groups (based on post-hoc Tukey HSD test). 8 B r gl ez A., Pišk ur B., Ogr is N.: P a t ogenost iz ola t o v izbr anih vrst gli v na Pinus syl v estr is L. in P . nigr a Arnol d nizmi, ki so poleg inokuliranih gliv tudi vplivali na re- zultate testa patogenosti. Na 4,8 % inokuliranih sadik ob koncu poskusa ni bilo vidnih nekroz, mesta inokulacije pa so bila v teh primerih skoraj v celoti zaraščena. Isti izolat je na ne- katerih sadikah povzročil nekroze, na drugih pa so se rane popolnoma zaraščale. To lahko kaže, da so dolo- čeni izbrani izolati manj virulentni in na končni rezul- tat odločilno vplivajo drugi dejavniki, npr. predhodno zdravstveno stanje sadik, odpornost rastline, globina inokulacije, prisotnost endofitov, interakcije z drugimi vrstami in mikrolokacija. Dolžine nekroz so lahko po- vezane tudi z različno hitrostjo rasti posameznih gliv. Micelij določenih vrst lahko namreč raste mnogo hitre- je od drugih in zato tudi prej povzroči tvorbo nekroz. Takšne glive imajo kasneje tudi večjo možnost za pozi- tivno reizolacijo (Kowalski in sod., 2017). Inokulirane glive so, razen v primeru D. pinea, pov- zročile malo variabilne dolžine nekroz na sadikah rde- čega in črnega bora. Največjo variabilnost smo opazili pri sadikah rdečega bora, okuženih z D. pinea, kjer je razpon dolžine nekroz znašal 41 mm. Testirane glive imajo različne vloge v ekosistemu in so tako glede naših opažanj in literaturnih podatkov znane kot bolj ali manj patogene za bore (Pinus spp.). Gliva Corinectria fuckeliana spada v družino Nectriace- ae in povzroča rake številnih iglastih in listnatih dreves (Salgado-Salazar in Crouch, 2019). Diplodia pinea je Pinus sylvestris Pinus nigra n a % n a % Corinectria fuckeliana 1 14,3 Diplodia pinea 6 85,7 Fusarium sp. 1 2 33,3 Fusarium sp. 2 1 16,7 1 14,3 Nectria dematiosa 1 14,3 Tympanis sp. 1 14,3 Kontrola 2 33,3 a – število suhih sadik ob koncu poskusa Preglednica 4: Delež propadlih sadik rdečega in črnega bora ob koncu testa patogenosti Table 4: Mortality rates of P . sylvestris and P . nigra at the end of the pathogenicity test Slika 7: Relativne frekvence izoliranih vrst gliv z roba nekroz na sadikah rdečega in črnega bora Fig. 7: Relative frequencies of isolated fungi from the mar- gins of necroses on P . sylvestris and P . nigra saplings Aequabiliella sp. Coniochaeta sp Fusarium sp. 2 Phaemoniella sp. Paraphoma sp. Aspergillus sp Capronia sp. Paraphoma radicina Paraconiothyrium sp. Alternaria sp. Talaromyces sp. Coniochaeta sp. Diaporthe eres Alternaria/Diplodia Diplodia pinea Fusarium sp. Diaporthe sp. 0 5 10 15 20 25 30 Pinus nigra Pinus sylvestris Relativne frekvence (%) Acta Sil va e et Ligni 132 (2023), 1–12 9 močno razširjena gliva v srednji Evropi in povzroča od- miranje enoletnih poganjkov črnega in rdečega bora. Ob odmiranju se poganjki tudi izrazito smolijo (Maček, 2008). Trenutno je zelo aktualna v severni Evropi, kjer predvsem v stresnih razmerah gostiteljskih dre- ves povzroča velike škode (Brodde in sod., 2019). Di- aporthe eres je prav tako ena izmed znanih patogenih gliv, ki z raki in nekrozami debel, odmrtjem korenični- ka, odmiranjem vej, nekrozami listov in poganjkov ipd. negativno vpliva na številne gospodarsko pomembne rastline (Chaisiri in sod., 2021). Glive iz rodu Fusari- um so ena izmed najpomembnejših skupin rastlinskih patogenov in so zato tudi predmet številnih raziskav. Trenutno je znanih več kot 300 vrst, ki jih delimo v 23 vrstnih kompleksov (Jacobs-Venter in sod., 2018). Šele Gräfenhan in sod. (2011) so nekaj predstavnikov vrstnega kompleksa F. aquaeducuum in F. merismoides uvrstili v samostojen rod Fusicolla. Rod Nectria je rod gliv, ki jih pogosto najdemo v zmernem podnebju se- verne poloble. Povezujejo jih z odmiranjem in raki šte- vilnih lesnatih rastlin. Vrsto Nectria dematiosa, ki smo jo uporabili v našem poskusu, so v preteklosti razume- li kot sinonim za N. cinnabarina, povzročiteljico rdeče sušice listavcev (Hirooka in sod., 2011). Vrste iz rodu Tympanis sp. pa med drugim povezujejo z raki na de- blih različnih vrst borov (Groves in Leach, 1949). Vendar pa razlike v patogenosti testiranih gliv na borovih sadikah v našem poskusu niso bile najbolj oči- tne. Največjo patogenost je v primeru rdečega in črne- ga bora izražal izolat glive D. pinea. V primeru rdečega bora sta se za značilno virulentnejši od kontrole izka- zali še Di. eres in Tympanis sp., v primeru črnega bora pa le Tympanis sp. Patogenost drugih izbranih vrst gliv se ni statistično značilno razlikovala od kontrole. Re- izolacije gliv smo opravili ob prvih znamenjih sušenja sadik. Sklepamo, da smo poskus prehitro zaključili, saj smo domnevali, da se sadike sušijo zaradi delovanja inokuliranih gliv. Ker je bilo število inokuliranih sadik na izolat glive relativno majhno (6–7), nismo mogli poskusno preveriti pri eni ali dveh sadikah, kakšno je dejansko stanje, saj bi s tem izgubili prevelik delež sa- dik. Kasneje se je izkazalo, da so se zaradi delovanja inokuliranih gliv sušile le sadike inokulirane z glivo D. pinea. Druge pa so se najverjetneje sušile zaradi sušne- ga stresa in že prisotnih endofitov, kot na primer Diplo- dia sp., Diaporthe sp., Fusarium sp. idr. Predvidevamo, da bi ob podaljšanju poskusa dobili drugačne rezultate in bi bile tudi reizolacije inokuliranih gliv bolj uspešne. V naravi so okužbe z izbranimi glivami precej kom- pleksne. Najpomembnejše so interakcije med patoge- nom in endofiti, ki vplivajo na okužbo in odziv nanjo (Kowalski in sod., 2017). Tudi uspeh relativno močno patogenih gliv je odvisen od oslabelosti gostitelja. V današnjih razmerah, ob upoštevanju globalnega segre- vanja in spreminjajočih se padavinskih režimov, lahko pričakujemo tudi spremembe v habitatih, življenjskih ciklih in rasti gliv, kar lahko v določenih primerih po- veča ali zmanjša njihovo patogenost (Gross in sod., 2014). V poskusu smo poskušali čim bolj posnemati procese v naravi in s tem pridobiti čim bolj realen vpo- gled v delovanje izbranih gliv. Zanimivo bi bilo preve- riti tudi različne kombinacije gliv, ker morda delujejo v sinergiji in šele v primeru skupne okužbe povzročijo večje poškodbe oz. nekroze. 5 POVZETEK 5 SUMMARY The genus Pinus (Pinaceae) is the largest conifer ge- nus on earth, encompassing more than 100 described species. In Europe, ten native species exist, with Slo- venia being home to four: Scots pine (P . sylvestris L.), Austrian pine (P . nigra Arnold), bog pine (P . mugo Tur- ra) and Swiss stone pine (P . cembra L.). Pines are par- ticularly valuable on poor and degraded sites, where they play an important role in improving habitat con- ditions. In Slovenia, the most typical pests of pine trees are the fungi Acantholyda sp.; Cenangium ferruginosum Fr.; Corinectria fuckeliana (C. Booth) C.D. González & P . Chaverri; Cyclaneusma minus (Butin) DiCosmo, Peredo & Minter; Diprion pini Linnaeus; Dothistroma spp. Hul- bary; Lecanosticta acicola (Thüm.) Syd.; Neodiprion sertifer Geoffroy; and Diplodia pinea (Desm.) J. Kickx f. In addition, non-native pests and diseases such as Fu- sarium circinatum Nirenberg & O’Donnell, the causal agent of pine pitch canker, also pose a threat. The pine pitch canker disease is believed to have originated in Mexico and has already been reported in Spain, Portu- gal, France and Italy (though it has been eradicated in France and Italy). Given the favourable climatic condi- tions and available hosts, the fungus has a high like- lihood of establishing and spreading across Europe (Möykkynen et al., 2015; Ogris, 2017; Drenkhan et al., 2020). Since 2010, the Slovenian Forestry Institute has coordinated a national survey programme to monitor F. circinatum. We have a collection of a wide range of fungal species isolated from symptomatic pine tissue. The aim of this study was to test the pathogenicity of selected fungal isolates, isolated mainly from symp- tomatic pine trees during national surveys on P . sylves- tris and P . nigra seedlings. In May 2022, 57 P . sylvestris and 62 P . nigra seed- lings were inoculated with eight fungal isolates (six or seven per fungus). The isolates were inoculated in the lower part of the stem. The inoculation point was ini- 10 B r gl ez A., Pišk ur B., Ogr is N.: P a t ogenost iz ola t o v izbr anih vrst gli v na Pinus syl v estr is L. in P . nigr a Arnol d tially surface sterilised with 70% ethanol, and then a 4 mm diameter wound was made with a sterilised leath- er punch and inoculated with an agar mycelial plug from the edge of the actively growing cultures. The in- oculation points were covered with cotton soaked in sterile water and wrapped in a piece of aluminium foil and parafilm. Control seedlings were inoculated with sterile agar plugs using the same procedure. Re-isola- tions were performed after 49–105 days by transfer- ring eight (dead seedlings) to 16 (live seedlings) pieces of wood tissue from the margin of each lesion to 3.9% PDA containing streptomycin. The stems were rinsed and scrubbed under running tap water and then sur- face sterilised. They were soaked in 70% ethanol for 60 seconds, 1% NaOCl for 30 seconds and again in 70% ethanol for 60 seconds. Finally, the samples were rinsed under distilled water. The cultures were grown at 24 °C in the dark. The obtained fungal cultures were grouped into morphotypes, and the representative cultures were selected for further molecular identifica- tion. Genomic DNA was extracted from the mycelium, and the ITS rDNA region was amplified using primer pairs ITS1 and ITS4. The obtained PCR products were purified and sequenced in both directions. The se- quences were visualised, manually edited and used to perform individual searches using the BLASTn and BOLD systems. The obtained data on wood staining length, re-isolation success, abundance and mortality rate were analysed using appropriate software. The inoculation points were mostly completely closed by the end of the pathogenicity test. Obvious necrosis was noted only in seedlings inoculated with D. pinea, where the longest necrosis (63 mm) was also recorded. Re-isolations were successful only when in- oculated with D. pinea, Di. eres and Fusarium sp. 2. The average necrosis length of P . sylvestris seedlings inocu- lated with D. pinea, Di. eres and Tympanis sp. was sig- nificantly higher than that of the control seedlings (p < 0.05). In P . nigra seedlings, the difference between the average necrosis length in the control was significantly lower than that length in the seedlings inoculated with D. pinea and Tympanis sp. (p < 0.05). In addition, isola- tions from necrosis margins revealed a wide range of fungal species, with the most common being Diaporthe sp. and Fusarium sp. The colonization rate was 88.2% for P . nigra and 77.8% for P . sylvestris. Re-isolations from P . sylvestris seedlings yielded the identification of 13 taxa, while 16 taxa were identified from P . nigra. Re-isolations were initiated at the first signs of seedling dieback, but this decision later proved to be incorrect, as dieback was most likely not primarily caused by the inoculated fungi. We hypothesized that extending the experiment would have increased the likelihood of successful re-isolation of the inoculated fungi. The differences in pathogenicity among the tested fungal isolates were not obvious. However, D. pinea showed the highest pathogenicity in our experi- ment. We suspect that we terminated the experiment prematurely under the assumption that the seedlings died from the inoculated fungi. However, they most likely died due to drought stress and pre-existing en- dophytes, such as Diplodia sp., Diaporthe sp. and Fusar- ium sp. Perhaps an extension of the experiment would have yielded different results, and re-isolation of the inoculated fungi would also have been more success- ful. ZAHVALA ACKNOWLEDGEMENTS Prispevek je nastal v okviru strokovne naloge s po- dročja zdravstvenega varstva rastlin (UVHVVR, MKGP , št. C2337-22-000020) ter raziskovalnega programa P4-0107 (ARIS). Za izdatno tehnično pomoč pri ino- kulacijah in reizolacijah se zahvaljujemo Maši Zagorac, Špeli Jagodic in Nuši Avguštinčič, za pomoč pri sadnji pa celotni ekipi Oddelka za varstvo gozdov na GIS. VIRI REFERENCES BOLD. https://www.boldsystems.org/index.php (5. 8. 2022). Bragança H., Diogo E., Moniz F., Amaro P . 2009. First report of pit- ch canker on pines caused by Fusarium circinatum in Portugal. Plant Disease, 93, 10: 1079. https://doi.org/10.1094/PDIS-93- 10-1079A Brodde L., Adamson K., Camarero J.J., Castaño C., Drenkhan R., Leh- tijärvi A., Luchi N., Migliorini D., Sánchez-Miranda A., Stenlid J., Özdag S., Oliva J. 2019. Diplodia tip blight on its way to the North: Drivers of disease emergence in Northern Europe. Frontiers in Plant Science, 9: 1–12. https://doi.org/10.3389/ fpls.2018.01818 Brus R. 2008. Dendrologija za gozdarje. Ljubljana, Univerza v Lju- bljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za gozdarstvo in obnovlji- ve gozdne vire Carlucci A., Colatruglio L., Frisullo S. 2007. First report of pitch can- ker caused by Fusarium circinatum on Pinus halepensis and P . pinea in Apulia (Southern Italy). Plant Disease, 91, 12, 1683. https://doi.org/10.1094/PDIS-91-12-1683C Chaisiri C., Liu X., Lin Y., Fu Y., Zhu F., Luo C. 2021. Phylogenetic and haplotype network analyses of Diaporthe eres species in China based on sequences of multiple loci. Biology, 10, 3, 179: 1-21. https://doi.org/10.3390/biology10030179 Acta Sil va e et Ligni 132 (2023), 1–12 11 Crous P .W., Lombard L., Sandoval-Denis M., Seifert K.A., Schroers H.J., Chaverri P ., Gene J., Guarro J., Hirooka Y., Bensch K., Kema G.H.J., Lamprecht S.C., Cai L., Rossman A.Y., Stadler M., Summerbell R.C., Taylor J.W., Ploch S., Visagie C.M., Yilmaz N., Frisvad J.C., Abdel- Azeem A.M., Abdollahzadeh J., Abdolrasouli A., Akulov A., Alberts J.F., Araújo J.P .M., Ariyawansa H.A., Bakhshi M., Bendiksby M., Ben Hadj Amor A., Bezerra J.D.P ., Boekhout T ., Camara M.P .S., Carbia M., Cardinali G., Castaneda-Ruiz R.F., Celis A., Chaturvedi V., Colle- mare J., Croll D., Damm U., Decock C.A., de Vries E.P ., Ezekiel C.N., Fan X.L., Fernández N.B., Gaya E., Gonzales C.D., Gramaje D., Groe- newald J.Z., Grube M., Guevara-Suarez M., Gupta V.K., Guarnaccia V., Haddaji A., Hagen F., Haelewaters D., Hansen K., Hashimoto A., Hernandez-Restrepo M., Houbraken J., Hubka V., Hyde K.D., Itur- riaga T ., Jeewon R., Johnston P .R., Jurjević Ž., Karalti I., Korsten L., Kuramae E.E., Kušan I., Labuda R., Lawrence D.P ., Lee H.B., Lechat C., Li H.Y., Litovka Y.A., Maharachchikumbura S.S.N., Marin-Felix Y., Matio Kemkuignou B., Matočec N., McTaggart A.R., Mlčoch P ., Mugnai L., Nakashima C., Nilsson R.H., Noumeur S.R., Pavlov I.N., Peralta M.P ., Phillips A.J.L., Pitt J.I., Polizzi G., Quaedvlieg W., Ra- jeshkumar K.C., Restrepo S., Rhaiem A., Robert J., Robert V., Ro- drigues A.M., Salgado-Salazar C., Samson R.A., Santos A.C.S., Shi- vas R.G., Souza-Motta C.M., Sun G.Y., Swart W.J., Szoke S., Tan Y.P ., Taylor J.E., Taylor P .W.J., Tiago P .V., Vaczy K.Z., van der Wiele N., van der Merwe N.A., Verkley G.J.M., Vieira W.A.S., Vizzini A., Weir B.S., Wijayawardene N.N., Xia J.W., Yanez-Morales M.J., Yurkov A., Zamora J.C., Zare R., Zhang C.L., Thines M. 2021. Fusarium: more than a node or a foot-shaped basal cell. Studies in Mycology, 98: 1–184. https://doi.org/10.1016/j.simyco.2021.100116 Drenkhan R., Ganley B., Martín-García J., Vahalík P ., Adamson K., Adamčíková K., Ahumada R., Blank L., Bragança H., Capretti P ., Cleary M., Cornejo C., Davydenko K., Diez J.J., Lehtijärvi H.T .D., Dvorák M., Enderle R., Fourie G., Georgieva M., Ghelardini L., Hantula J., Ioos R., Iturritxa E., Kanetis L., Karpun N.N., Koltay A., Landeras E., Markovskaja S., Mesanza N., Milenković I., Musolin D.L., Nikolaou K., Nowakowska J.A., Ogris N., Oskay F., Oszako T ., Papazova-Anakieva I., Paraschiv M., Pasquali M., Pecori F., Ra- foss T ., Raitelaityte K., Raposo R., Robin C., Rodas C.A., Santini A., Sanz-Ros A.V., Selikhovkin A.V., Solla A., Soukainen M., Soulioti N., Steenkamp E.T ., Tsopelas P ., Vemić A., Vettraino A.M., Wingfi- eld M.J., Woodward S., Zamora-Ballesteros C., Mullett M.S. 2020. Global geographic distribution and host range of Fusarium cir- cinatum, the causal agent of pine pitch canker. Forests, 11, 724: 1–40. https://doi.org/10.3390/f11070724 Farjon A., Styles B.T . 1998. Pinus (Pinaceae). V: Flora Neotropica Mo- nograph 75. New York, New York Botanical Garden: 68. First report of Gibberella circinata in France. 2006. V: EPPO Repor- ting Service no. 5. Paris, France, EPPO Reporting Service. FUSARIOID-ID. https://www.fusarium.org/page/Poly%20ID%20 Fusarium (5. 8. 2022). Fusarium circinatum. 2022a. https://gd.eppo.int/taxon/GIBBCI/dis- tribution (24. 11. 2022). Fusarium circinatum. 2022b. EPPO datasheets on pests recommen- ded for regulation. https://gd.eppo.int/taxon/GIBBCI/downlo- ad/datasheet_pdf (24. 11. 2022). Ganley R.H., Watt M.S., Manning L., Iturritxa E. 2009. A global clima- tic risk assessment of pitch canker disease. Canadian Journal of Forest Research, 39: 2246–2256. https://doi.org/10.1139/X09- 131 GenBank. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ (5. 8. 2022). Gomes R.R., Glienke C., Videira S.I.R., Lombard L., Groenewald J.Z., Crous P .W. 2013. Diaporthe: a genus of endophytic, saprobic and plant pathogenic fungi. Persoonia, 31: 1–41. https://doi. org/10.3767/003158513X666844 Gozdni fondi (stanje 2021). Ljubljana, Zavod za gozdove Slovenije. (Neobjavljeno). Gräfenhan T ., Schroers H.J., Nirenberg H.I., Seifert K.A. 2011. An overview of the taxonomy, phylogeny, and typification of nec- triaceous fungi in Cosmospora, Acremonium, Fusarium, Stilbel- la, and Volutella. Studies in Mycology, 68: 79–113. https://doi. org/10.3114/sim.2011.68.04 Gross A., Holdenrieder O., Pautasso M., Queloz V., Sieber T .N. 2014. Hymenoscyphus pseudoalbidus, the causal agent of European ash dieback. Molecular Plant Pathology, 15, 1: 5–21. https://doi. org/10.1111/mpp.12073 Groves J.W., Leach A.M. 1949. The species of Tympanis occurring on Pinus. Mycologia, 41, 1: 59–76. https://www.jstor.org/sta- ble/3755272 (23. 2. 2023). Hirooka Y., Rossman A.Y., Chaverri P . 2011. A morphological and phylogenetic revision of the Nectria cinnabarina species com- ple. Studies in Mycology, 68: 35–56. https://doi.org/10.3114/ sim.2011.68.02 Hirooka Y., Rossman A.Y., Samuels G.J., Lechat C., Chaverri P . 2012. A monograph of Allantonectria, Nectria, and Pleonectria (Nec- triaceae, Hypocreales, Ascomycota) and their pycnidial, sporo- dochial, and synnematous anamorphs. Studies in Mycology, 71: 1–210. https://doi.org/10.3114/sim0001 Izvedbena uredba komisije (EU) 2019/2072. 2019. Uradni list EU, 319/1. https://eur-lex.europa.eu/legal-content/SL/TXT/PDF/? uri=CELEX:32019R2072&from=EN (4. 9. 2023). Izvedbeni sklep komisije (EU) 2019/2032. 2019. Uradni list EU, 313/94. https://eur-lex.europa.eu/legal-content/SL/TXT/ PDF/?uri=CELEX:32019D2032 (4. 9. 2023). Jacobs-Venter A., Laraba I., Geiser D.M., Busman M., Vaughan M.M., Proctor R.H., McCormick S.P ., O’Donnell K. 2018. Molecular sys- tematics of two sister clades, the Fusarium concolor and F. babin- da species complexes, and the discovery of a novel microcycle macroconidium–producing species from South Africa. Mycolo- gia, 110, 6: 1189–1204. https://doi.org/10.1080/00275514.20 18.1526619 Jurc M. 2011. Gozdna zoologija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Bio- tehniška fakulteta, Oddelek za gozdarstvo in obnovljive gozdne vire Kowalski T ., Bilański P ., Kraj W. 2017. Pathogenicity of fungi associa- ted with ash dieback towards Fraxinus excelsior. Plant Pathology, 66: 1228–1238. https://doi.org/10.1111/ppa.12667 Landeras E., García P ., Fernández Y., Braña M., Fernández-Alonso O., Méndez-Lodos S., Pérez-Sierra A., León M., Abad-Campos P ., Berbegal M., Beltrán R., García-Jiménez J., Armengol J. 2005. Out- break of pitch canker caused by Fusarium circinatum on Pinus spp. in northern Spain. Plant Disease, 89, 9, 1015. https://doi. org/10.1094/PD-89-1015A Maček J. 2008. Gozdna fitopatologija. Ljubljana, Zavod za gozdove Slovenije: Zveza gozdarskih društev, Gozdarska založba Möykkynen T ., Capretti P ., Pukkala T . 2015. Modelling the potential spread of Fusarium circinatum, the causal agent of pitch canker in Europe. Annals of Forest Science, 72, 2: 169–181. https://doi. org/10.1007/s13595-014-0412-2 Ogris N. 2017. Simulacija potencialnega širjenja borovega smolaste- ga raka (Fusarium circinatum) v Sloveniji. V: Zbornik predavanj in referatov 13. Slovenskega posvetovanja o varstvu rastlin z mednarodno udeležbo: Rimske toplice, 7.-8. marec 2017. Dru- štvo za varstvo rastlin Slovenije: 212–221. Pest survey card on Fusarium circinatum. 2020. https://doi. org/10.2903/sp.efsa.2020.EN-1842 PM 7/91 (2) Fusarium circinatum (formerly Gibberella circinata). 2019. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin, 49, 2: 228–247. https://doi. org/10.1111/epp.12587 Programi preiskav za ugotavljanje navzočnosti škodljivih organiz- mov rastlin. 2022. Ljubljana, Uprava RS za varno hrano, veteri- narstvo in varstvo rastlin. https://www.zdravgozd.si/dat/po- sebni_nadzori/kompilacija/2022.pdf (23. 2. 2023). 12 B r gl ez A., Pišk ur B., Ogr is N.: P a t ogenost iz ola t o v izbr anih vrst gli v na Pinus syl v estr is L. in P . nigr a Arnol d R Core Team. 2019. R: a language and environment for statistical computing. http://www.R-project.org (27. 10. 2023). Salgado-Salazar C., Crouch J.A. 2019. Genome resources for the stem and bark canker pathogens Corinectria fuckeliana, Neonectria hederae and N. punicea. Plant Disease, 103: 389–391. https:// doi.org/10.1094/PDIS-05-18-0904-A Vilgalys R., Hester M. 1990. Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryp- tococcus species. Journal of Bacteriology, 172, 8: 4238–4246. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC213247/pdf/ jbacter00122-0118.pdf (23. 2. 2023). White T .J., Bruns T .D., Lee S., Taylor J. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. V: PCR protocols: A guide to methods and applications. New York, Academic Press: 315–322. Wikler K., Gordon T .R. 2000. An initial assessment of genetic relati- onships among populations of Fusarium circinatum in different parts of the world. Canadian Journal of Botany, 78: 709–717. https://doi.org/10.1139/b00-044