Acta agriculturae Slovenica, 120/2, 1–10, Ljubljana 2024 doi:10.14720/aas.2024.120.2.17019 Review article / pregledni znanstveni članek Biotehnološki procesi kot sredstvo za povečanje dostopnosti in antioksi- dativne aktivnosti fenolnih spojin iz zrn krušne pšenice in pire Marjeta MENCIN 1, 2 Received December 11, 2023; accepted May 01, 2024. Delo je prispelo 11. decembra 2023, sprejeto 1. maja 2024. 1 Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, Ljubljana, Slovenija 2 Korespondenčni avtor, e-naslov: marjeta.mencin@ijs.si Biotechnological processes as means to increase the accessi- bility and antioxidant activity of phenolic compounds from bread wheat and spelt grains Abstract: Cereal grains, especially bran, are a rich source of phenolic compounds with antioxidant activity. The poten- tial positive effects of phenolics from whole grains of spelt and bread wheat on human health are limited by the poor bioac- cessibility and bioavailability of their bound phenolics. Stud- ies have shown that biotechnological processes (germination/ fermentation/enzymatic treatment) are an effective strategy for improving the release of bound phenolics from the cell wall matrix of cereal grains. In this review article, the effects of biotechnological processes on the composition, antioxidant activity and bioaccessibility of phenolics from spelt and bread wheat grains are discussed in detail. Existing research indicates the presence of a different phenolics in spelt and bread wheat grains, making whole grains excellent for improving nutritional value of products. It has been shown that biotechnological pro- cesses can effectively increase the content of bioaccessible and bioavailable phenolics in cereal grains, which enables improved in vitro antioxidant activity. Currently, there is a lack of in vivo studies to confirm the findings obtained in vitro, so in vivo stud- ies to determine the biological activity of phenolic compounds from pre-treated grains will be crucial in the future. Key words: phenolic compounds, antioxidant activity, accessibility, germination, fermentation, enzymatic treatment, LC-MS/MS Biotehnološki procesi kot sredstvo za povečanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti fenolnih spojin iz zrn krušne pšenice in pire Izvleček: Žitna zrna, zlasti otrobi, so bogat vir fenolnih spojin z antioksidativnim delovanjem. Potencialni pozitiv- ni učinki fenolnih spojin iz polnozrnatih zrn krušne pšenice (Triticum aestivum L.) in pire (Triticum spelta L.) na človeško zdravje so zaradi slabe biološke dostopnosti in razpoložljivosti vezanih fenolnih spojin omejeni. Študije so pokazale, da so bio- tehnološki procesi (kaljenje/fermentacija/encimsko tretiranje) učinkovita strategija za izboljšanje sproščanja vezanih fenolnih spojin iz matriksa celičnih sten žitnih zrn. V preglednem članku temeljito obravnavamo vplive biotehnoloških procesov na ses- tavo, antioksidativno aktivnost in biološko dostopnost fenolnih spojin iz zrn krušne pšenice in pire. Obstoječe raziskave kažejo na prisotnost raznovrstnih fenolnih spojin v zrnih krušne pše- nice in pire, zaradi česar so polnozrnata žitna zrna odlična za uporabo v izdelkih, z namenom izboljšanja njihove hranilne vrednosti. Dokazano je, da biotehnološki procesi učinkovito povečajo vsebnost biološko dostopnih fenolnih spojin v žitnih zrnih, kar omogoča izboljšano in vitro antioksidativno delovan- je. Trenutno primanjkuje in vivo študij za potrditev ugotovitev dobljenih in vitro, zato bodo v prihodnosti ključne in vivo štu- dije določanja biološke aktivnosti fenolnih spojin iz predhodno obdelanih zrn. Ključne besede: fenolne spojine, antioksidativna aktiv- nost, dostopnost, kaljenje, fermentacija, encimsko tretiranje, LC-MS/MS Acta agriculturae Slovenica, 120/2 – 20242 M. MENCIN 1 UVOD Krušno pšenico (Triticum aestivum L.) in piro (Tri- ticum spelta L.) taksonomsko uvrščamo v družino trav (Poaceae), rod pšenice (Triticum). Pšenica predstavlja eno najpomembnejših rastlin namenjenih prehrani. Po- znamo več vrst pšenice, vendar pa je v svetovnem merilu najbolj razširjena navadna ali krušna pšenica. To potrju- jejo podatki FAOSTAT, ki navajajo, da so leta 2021 pri- delali več kot 770 milijonov ton krušne pšenice na več kot 200 milijonih hektarjev (FAOSTAT, 2023). Krušna pšenica in izdelki iz nje predstavljajo dober vir energije, esencialnih aminokislin, mineralov, vitaminov in pre- hranskih vlaknin (Escarnot in sod., 2012). Pira predstavl- ja najstarejšo obliko heksaploidne pšenice. V začetku 20. stoletja se je pridelava pire močno zmanjšala, v zadnjih letih pa postaja pomembna alternativa navadni pšenici, zaradi večjega povpraševanja po ekološko pridelani hra- ni in pozitivnih učinkov na zdravje ljudi (Bojňanská in Frančáková, 2011). Pridelava pire ima številne prednosti, kot so majhni stroški pridelave, primerna je za gojenje brez pesticidov, saj ima dobro odpornost proti boleznim in škodljivcem, raste tudi v težkih pridelovalnih razme- rah, vendar pa je hektarski pridelek manjši kot pri pše- nici. Iz prehranskega stališča pa pira v primerjavi s kruš- no pšenico postaja bolj zaželena zaradi večje vsebnosti beljakovin (Pruska-Kedzior in sod., 2008), prostih slad- korjev (Zörb in sod., 2007), maščobnih kislin in lipidov (Ruibal-Mendieta in sod., 2005). Tako pri krušni pšenici kot piri predstavljajo ogljikovi hidrati glavne sestavine (59-71 %) zrna (Escarnot in sod., 2012), ki so bogata tudi s prehranskimi vlakninami (2 %). Poleg tega, da ima pira večjo vsebnost proteinov kot krušna pšenica, pa se razli- kuje tudi razmerje med gliadinom in gluteninom, ki se pri piri giblje med 2,8 in 4,0, pri krušni pšenici pa med 1,5 in 3,1, kar nakazuje na večjo razteznost testa in manj- ši volumen pirinega kruha (Geisslitz in sod., 2019). Pri vsebnosti bioaktivnih spojin nekateri avtor- ji navajajo, da večjih razlik med piro in krušno pšenico ni mogoče opaziti (Bonafaccia in sod., 2000), medtem ko drugi avtorji pripisujejo beli pirini moki večjo vseb- nost antioksidantov kot moki iz krušne pšenice (Wang in sod., 2020). Bioaktivne spojine se v žitnih zrnih veči- noma nahajajo v zunanjih plasteh zrna (perikarp, testa, alevronska plast), zato med bolj zdrave živilske izdelke sodijo polnozrnati izdelki. V žitnih zrnih so najpogos- tejše bioaktivne spojine: prehranske vlaknine (β-glukani, arabinoksilani, rezistentni škrob), fenolne spojine (fe- nolne kisline, flavonoidi), karotenoidi, steroli, fitati, itd. (Gani in sod., 2012). Fenolne spojine se v rastlinski celici nahajajo v topni obliki, kamor spadajo proste in konjugirane fenolne spo- jine, ter v netopni vezani obliki. Proste fenolne spojine so v nevezani obliki, konjugirane pa so vezane na topne molekule z majhno molekulsko maso (sladkorji, maščob- ne kisline), običajno pride med njimi do tvorbe kovalent- nih vezi, lahko pa tudi do nekovalentnih vezi, vodikovih vezi ali hidrofobnih interakcij med različnimi molekula- mi. Večina topnih fenolnih spojin se nahaja v vakuolah rastlinskih celic (Shahidi in Yeo, 2016; Xu in sod., 2020). Proste in konjugirane fenolne spojine tako uvrščamo med ekstraktibilne fenolne spojine, netopne vezane fe- nolne spojine pa med neekstraktibilne (Xu in sod., 2020). Količinsko najbolj zastopana oblika so netopne vezane fenolne spojine, kar so potrdile tudi številne raziskave (Chen in sod., 2017; Pang in sod., 2018). Vezane fenolne spojine tvorijo različne vezi z molekulami v celičnih ste- nah zrna, tako lahko karboksilna skupina fenolnih kislin (benzojske in cimetne kisline) tvori estrske vezi s hidrok- silno skupino komponent celične stene (strukturni ogl- jikovi hidrati, proteini). Med hidroksilnimi skupinami fenolnih spojin in komponentami celične stene (celulo- za, lignin) se lahko tvorijo etrske vezi (Acosta-Estrada in sod., 2014). Nadalje se lahko med ogljikovim atomom fenolnih spojin in ogljikovim atomom komponent celič- nih sten tvorijo tudi C-C vezi (C-glikozidi) ali pa fenolne spojine sodelujejo pri tvorbi vodikovih in elektrostatskih vezi (Shahidi in Yeo, 2016). Vezane fenolne spojine pred- stavljajo glede na skupno količino fenolnih spojin: 92 % v piri (Mencin in sod., 2022a), in 75 % v krušni pšenici (Adom in Liu, 2002). Nahajajo se v otrobih žitnih zrn, zato je pomembno poudariti, da uživanje žit pripomore k večjemu vnosu fenolnih spojin le pri uživanju polnozr- natih izdelkov. Fenolne spojine zaradi svoje strukture izražajo anti- oksidativno aktivnost, tako da prostim radikalom oddajo elektron ali vodikov atom in jih na ta način stabilizirajo (Terpinc in Abramovič, 2010). V raziskavah kjer so z in vitro testi določali antioksidativno aktivnost, so ugotovi- li, da vezane fenolne spojine izkazujejo znatno večjo anti- oksidativno aktivnost v primerjavi s prosto in konjugira- no obliko (Acosta-Estrada in sod., 2014; Chen in sod., 2017; Pang in sod., 2018). V in vivo raziskavi, ki je bila narejena na 32 zdravih prostovoljcih, so Costabile in sod. (2008) ugotovili, da uživanje polnozrnate krušne pšenice prispeva k povečani koncentraciji ferulne kisline v krvi, hkrati pa pozitivno vpliva na črevesno mikrobioto, saj se je povečala populacija koristnih bifidobakterij in mleč- nokislinskih bakterij. Struktura matriksa celičnih sten v otrobih in način, kako so fenolne spojine vključene v matriks, močno vpli- vata na njihovo biološko dostopnost. Zato so se razvile različne tehnologije, s katerimi olajšamo cepitev vezi, povečamo količino sproščenih vezanih fenolnih spojin in posledično izboljšamo njihovo biološko dostopnost (Wang in sod., 2014). Biotehnološki procesi, kamor spa- Acta agriculturae Slovenica, 120/2 – 2024 3 Biotehnološki procesi kot sredstvo za povečanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti fenolnih spojin ... dajo kaljenje, fermentacija in encimsko tretiranje, trenut- no predstavljajo eno izmed najbolj aktualnih tem s pod- ročja izboljšanja biološke dostopnosti in razpoložljivosti fenolnih spojin. Kaljenje predstavlja ekonomično in učinkovito na- ravno metodo, ki zmehča strukturo in izboljša hranilno vrednost zrna - poveča se vsebnost bioaktivnih spojin, hkrati pa se zmanjša vsebnost antinutritivnih kompo- nent (Singh in Sharma, 2017). Kaljenje poveča aktiv- nost hidrolitičnih encimov, spodbudi nastanek novih in aktivacijo tistih, ki so v nekaljenem zrnu v neaktivnem stanju. Med procesom kaljenja pride do razgradnje mak- rohranil (ogljikovih hidratov, proteinov, lipidov), kar po- veča količino njihovih presnovnih produktov (enostav- nih sladkorjev, prostih aminokislin, organskih kislin), istočasno pa se sproži sinteza sekundarnih metabolitov. Z razgradnjo makrohranil se posledično sproščajo tudi vezane fenolne spojine, kar v začetni fazi kaljenja pome- ni upad vezane frakcije in porast proste (Terpinc, 2019). Na omenjene spremembe lahko dodatno vpliva abiot- ski stres med kaljenjem. Rastline se na stresne razmere odzivajo tako, da inducirajo sintezo različnih zaščitnih spojin, tudi številnih fenolnih spojin, ki omogočajo pre- živetje in nadaljnjo rast v takšnih razmerah (Falcinelli in sod., 2017; Chen in sod., 2019; Ma in sod., 2019). Različ- ne raziskave so pokazale, da je količina fenolnih spojin in razmerje med ekstraktibilnimi in vezanimi fenolnimi spojinami odvisno od obdelave zrn pred kaljenjem, raz- mer namakanja (Yang, 2001; Xu in sod., 2009) in od raz- mer, v katerih zrno kali: temperature (Paucar-Menacho in sod., 2017; Chavarín-Martínez in sod., 2019; Mencin in sod., 2021a), časa kaljenja (Terpinc in sod., 2016; Pau- car-Menacho in sod., 2017; Kim in sod., 2018), načina osvetljevanja (Xiang in sod., 2017) in relativne vlage (Yang, 2001). Druge postopke, s katerim lahko povečamo biolo- ško dostopnost bioaktivnih spojin, predstavljajo različni tipi fermentacije (alkoholna, mlečnokislinska, spontana, itd.) (Angelino in sod., 2017). Prednost tega procesa je, da poleg encimov iz žitnih zrn sodelujejo tudi encimi eksternih mikroorganizmov, ki pripomorejo k razgrad- nji celične stene. Prav tako pa fermentacija spodbuja sin- tezo novih spojin kot tudi encimsko transformacijo že prisotnih bioaktivnih spojin. Dosedanje študije o vplivu fermentacije na vezane fenolne spojine v različnih žitnih zrnih so potrdile povečanje njihove biološke dostopnosti in razpoložljivosti (Wang in sod., 2014). Vpliv fermenta- cije na fenolne spojine je v glavnem odvisen od vrste zrn (Đorđević in sod., 2010), vrste mikroorganizmov (Kati- na in sod., 2007; Đorđević in sod., 2010; Mencin in sod., 2022a) in razmer fermentacije (temperatura, pH, čas) (Boskov Hansen in sod., 2002; Katina in sod., 2007). Prav tako učinkovit postopek za sproščanje vezanih fenolnih spojin iz komponent celične stene žitnih zrn je encimsko tretiranje, za katerega velja, da je okolju prijaz- no, energetsko učinkovito in sprošča le specifične spoji- ne, ne da bi pri tem poškodoval ostale spojine (Ferri in sod., 2020). Pri encimskem tretiranju zrna neposredno obdelamo s hidrolitičnimi encimi, s čimer izboljšamo biološko dostopnost in razpoložljivost fenolnih spojin. Encimi, ki hidrolizirajo celične stene (celulaze, ksilanaze, esteraze itd.), so bili že večkrat uporabljeni za razgradn- jo matriksa celičnih sten v žitnih zrnih (Moore in sod., 2006; Acosta-Estrada in sod., 2014; Bei in sod., 2018; Mencin in sod., 2022b). Feruloil esteraze spadajo v sku- pino esteraz, ki hidrolizirajo estrsko vez med hidroksici- metnimi kislinami in hemicelulozo, prisotno v celičnih stenah žitnih zrn. Prav tako je feruloil esteraza sposobna katalizirati cepitev kovalentne vezi med dvema ferulnima kislinama, ki sta pritrjeni na sosednja arabinoksilana. Fe- ruloil esteraza postane aktivna tudi med kaljenjem, našli pa so jo tudi pri laktobacilih, prisotnih v črevesju človeka (Faulds in sod., 2004; Gänzle, 2014). Številni znanstveni članki (Sancho in sod., 2001; Mathew in Abraham, 2004; Moore in sod., 2006) opisujejo sinergistične interakcije med ksilanazami, ki naključno cepijo β-1,4 ksilansko strukturo, in med feruloil esterazami, ki olajšajo ksilana- zam dostopnost do komponent celičnih sten. V povezavi z razgradnjo celičnh sten se omenjajo tudi α-amilaze in proteaze (Singh in sod., 2016). Nekaj študij (Katina in sod., 2007; Anson in sod., 2009) je bilo narejenih tudi na področju uporabe raz- ličnih kombinacij biotehnoloških procesov (kaljenja/ fermentacije/encimskega tretiranja) na različnih žitnih zrnih. Raziskave kažejo na sinergističen učinek pri sočas- ni uporabi različnih biotehnoloških procesov, saj pripo- morejo k večji koncentraciji in aktivnosti hidrolitičnih encimov. Uživanje bioaktivnih spojin je ključno predvsem za- radi njihovih ugodnih učinkov na naše zdravje. Preden lahko posamezni spojini pripišemo pozitivno delovanje, je potrebno poznati njeno biološko dostopnost in razpoložljivost v človeškem organizmu. Biološka dostopnost (ang. bioaccessibility) je definirana kot količina snovi, ki se lahko sprosti iz matriksa hrane v pre- bavni trakt in je na voljo za absorpcijo v tankem črevesu. Razgradnja hrane, ki je ključna za biološko dostopnost in razpoložljivost, se prične v ustih, nadaljuje se v želodcu in v črevesu. Vezane fenolne spojine niso dostopne enci- mom gastrointestinalnega (GI) trakta, tako ima več kot 90 % fenolnih spojin v žitnih zrnih majhno biološko dos- topnost. Neabsorbirane fenolne spojine potujejo v debelo črevo, kjer njihovo razgradnjo deloma katalizirajo enci- mi črevesne mikrobiote (Vitaglione in sod., 2008). Prispevek povzema rezultate raziskav, ki so bile opravljene na zrnih krušne pšenice in pire z namenom Acta agriculturae Slovenica, 120/2 – 20244 M. MENCIN izboljšanja dostopnosti in antioksidativne aktivnosti fe- nolnih spojin z različnimi biotehnološkimi procesi. 2 BIOTEHNOLOŠKI PROCESI IN NJIHOVA APLIKACIJA NA PODLAGI DOSEDANJIH RAZISKAV V okviru svoje študije so Mencin in sod. (2021) ra- ziskovali vpliv kaljenja pirinih zrn v različnih stresnih razmerah na antioksidativne lastnosti fenolnih spojin. Zanimala jih je vsebnost ekstraktibilnih in vezanih skup- nih fenolnih spojin, določena s Folin-Ciocalteu metodo, hkrati pa tudi identifikacija in kvantifikacija posameznih fenolnih spojin, določena s HPLC-MS/MS metodo. Ek- straktibilne fenolne spojine so ekstrahirali z absolutnim metanolom, iz trdnega preostanka po metanolni ekstrak- ciji pa so netopne vezane fenolne spojine sprostili iz ve- zane oblike s pomočjo alkalne hidrolize. V raziskavi so zrna pire kalili 144 h v temi, stresne razmere so zagotovili z manj ugodno temperaturo kaljenja, manjšim dodatkom vode, povečano slanostjo in osmolarnostjo, z mehansko poškodbo kalčkov ter z različnimi kombinacijami na- štetega. Prav kombiniranje različnih stresnih razmer je rezultiralo v večjih vsebnostih ekstraktibilnih in vezanih fenolnih spojin, hkrati pa se je povečala tudi sposobnost lovljenja DPPH• radikalov v primerjavi s kontrolo, tj. zrna kaljena 144 h pri 20 °C. Ne glede na vrsto abiotskega stresa, so opazili znatne razlike v vsebnosti ekstraktibilnih in vezanih fenolnih spojin pri kaljenih zrnih, slednje so predstavljale kar dve tretjini vseh fenolnih spojin. Kal- jenje pirinih zrn ob dodatku 25  mM NaCl in 50  mM sorbitola brez aplicirane mehanske poškodbe je med vsemi preizkušenimi kombinacijami najbolj prispevala k povečanju vsebnosti fenolnih spojin in njihove antiok- sidativne aktivnosti. Na podlagi preliminarnih poskusov so avtorji ugotovili, da sta ustrezna temperatura kaljenja in dodatek vode predpogoj za povečano tvorbo fenol- nih spojin med kaljenjem, saj so optimalno kombinacijo stresa aplicirali pri 25 °C in razmerju med maso zrn in dodatkom vode: 1:2 (15 g:30 ml). Prav tako so opazili, da so ekstraktibilne frakcije fenolnih spojin izkazovale rela- tivno veliko antioksidativno aktivnost, glede na znatno večjo vsebnost fenolnih spojin v vezanih frakcijah. Av- torji so predvidevali, da večja heterogenost ekstraktibilne frakcije prispeva k antioksidativni aktivnosti. Hübner in Arendt (2013) sta poročala, da je vseb- nost fenolnih spojin, ki jih rastlina sintetizira in kopiči med kaljenjem, odvisna predvsem od odziva rastline na stresne dejavnike. Nadalje so različne raziskave pokazale, da kaljenje zrn poveča vsebnost topnih fenolnih spojin, kar pripisujejo sintezi de novo in različnim biološkim transformacijam (Gan in sod., 2017; Kim in sod., 2018). Transformacije, ki se dogajajo med kaljenjem, so odvis- ne tudi od dolžine kaljenja, saj se v zgodnji fazi kaljenja zaradi razgradnje gradnikov celičih sten poveča vsebnost enostavnih sladkorjev in aminokislin, hkrati pa se za- čnejo sproščati tudi fenolne spojine vezane na kompo- nente celičnh sten. Z daljšim časom kaljenja se začnejo sintetizirati rastlinske celice z novimi celičnimi stenami in nekatere de novo sintetizirane topne fenolne spojine se vežejo z novo nastalimi komponentami celičnih sten. Tako se pri daljšem času kaljenja začne povečevati vseb- nost vezanih fenolnih spojin (Wang in sod., 2014). Večina raziskav poroča, da kaljenje znatno izboljša tudi antioksidativno aktivnost ekstraktibilnih fenolnih spojin v primerjavi z nekaljenimi žitnimi zrni (krušna pšenica, riž, koruza, ječmen), kar pripisujejo povečani vsebnosti antioksidativnih spojin v kaljenih zrnih (Don- kor in sod., 2012; Ti in sod., 2014; Žilić in sod., 2015). Živković in sod. (2023) so poročali, da je kaljenje (96  h) pirinih zrn znatno povečalo vsebnost prostih in vezanih metabolitov. Večina fenolnih spojin pa je bila prisotna v vezani frakciji, kjer je prevladovala trans-fe- rulna kislina. V prosti frakciji so našli veliko vsebnost apigenin di-C-glikozidov, kaljenje pa je najbolj vplivalo na vsebnost šaftozida, saj se je vsebnost le-tega povečala za trikrat. Opazili so tudi povečanje antioksidativne ak- tivnosti kaljenih zrn pire, predvsem na račun kopičenja sekundarnih metabolitov. Prav tako so Mencin in sod. (2021) poročali, da sta trans-ferulna in p-kumarna kislina glavni predstavnici identificiranih vezanih fenolnih spojin v 144 h kaljenih zrnih pire, njuna vezana oblika pa predstavlja kar 99 % od skupne vsebnosti (ekstraktibilne + vezane) posa- mezne kisline. Zanimivo je, da so stresne razmere vpli- vale na zmanjšanje vsebnost posameznih ekstraktibilnih fenolnih kislin, po drugi strani pa se je vsebnost vezanih povečala v vzorcih, ki so bili izpostavljeni povečani sla- nosti in osmolarnosti. Fermentacija je še ena koristna tehnika predhod- ne obdelave zrn, ki učinkovito sprošča fenolne spojine iz žitnih otrobov (Angelino in sod., 2017). Mencin in sod. (2022a) so pirina zrna izpostavili različnim tipom fermentacije (mlečnokislinska, alkoholna, kombinira- na (mlečnokislinska + alkoholna), spontana), ki so jih kombinirali s kaljenjem in z encimskim tretiranjem. Ugotovili so, da se je ne glede na prisotno mikrofloro, po fermentaciji neobdelanih, kaljenih in encimsko tre- tiranih zrn povečala vsebnost ekstraktibilnih in vezanih fenolnih spojin. Hkrati se je znatno zmanjšalo razmerje med vezanimi in ekstraktibilnimi fenolnimi spojinami, kar je posledično pozitivno vplivalo na dostopnost pi- rinih antioksidantov. Rezultati so pokazali, da tako ob- delava pirinih zrn s kaljenjem in encimskim tretiranjem Acta agriculturae Slovenica, 120/2 – 2024 5 Biotehnološki procesi kot sredstvo za povečanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti fenolnih spojin ... pred fermentacijo, kot tudi vrsta fermentacije vplivata na spremembe vsebnosti skupnih fenolnih spojin. Wang in sod. (2014) so poročali, da kombinacija kaljenja in fermentacije vodi do sinergističnih učinkov, saj kaljena zrna predstavljajo bogat vir fermentabilnih virov (sladkor, dušikove spojine), hkrati pa tako kaljen- je kot tudi fermentacija prispevata k večji koncentraci- ji in aktivnosti hidrolitičnih encimov, kar vodi k boljši biološki dostopnosti fenolnih spojin. Med fermentacijo zrn se vsebnost bioaktivnih komponent spreminja zaradi metabolne aktivnosti prisotnih mikroorganizmov, ki raz- grajujejo estrske vezi in hidrolizirajo β-glukozidne vezi, pri čemer se sproščajo vezane fenolne spojine (Adebo in Medina-Meza, 2020). Po drugi strani pa na vsebnost fenolnih spojin med fermentacijo lahko vpliva tudi en- dogena sinteza fenolnih spojin v mikroorganizmih (Chr- zanowski, 2020). Mencin in sod. (2022a) so poročali, da so največjo vsebnost ekstraktibilnih in vezanih fenolnih spojin ter njihovo antioksidativno aktivnost določili pri kaljenih zrnih fermentiranih s kvasovko Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hansen. Zanimivo, pri encimsko tretira- nih pirinih zrnih je najučinkoviteje povečala vsebnost ekstraktibilnih fenolnih spojin fermentacija z bakterijo Lactobacillus plantarum (Orla-Jensen 1919) Bergey  et al. 1923 (Approved Lists 1980) . medtem ko je imela ista fermentacija z L. plantarum negativen vpliv na vsebnost vezanih fenolnih spojin. O zmanjšanju vsebnosti fenol- nih spojin so poročali tudi Spaggiari in sod. (2020), ki so predvidevali, da je razlog v metabolnih lastnostih mik- roorganizmov, ki lahko transformirajo fenolne spojine v različne metabolite. Vsebnost ekstraktibilne trans-ferul- ne kisline se je najbolj povečala pri kaljeni piri fermenti- rani s kvasovko S. cerevisiae in to za kar 2922 %. Podobno so poročali tudi Anson in sod. (2009), fermentacija kruš- ne pšenice s kvasovko S. cerevisiae je povečala biološko dostopnost ferulne kisline. Prav tako so Konopka in sod. (2014) poročali, da alkoholna fermentacija poveča vseb- nost ekstraktibilne ferulne kisline v pšenici za kar 10-krat v primerjavi z neobdelanimi zrni. Mencin in sod. (2022a) so ugotovili tudi, da so fer- mentirana neobdelana, kaljena in encimsko tretirana pi- rina zrna, ki so imela večjo vsebnost skupnih fenolnih spojin, izkazovala tudi boljšo antioksidativno aktivnost, določeno z DPPH in ABTS testom. Avtorji so poudarili, da je kombiniranje biotehnoloških procesov najučinko- vitejši način za znatno povečanje vsebnosti fenolnih spo- jin in njihove antioksidativne aktivnosti. Moore in sod. (2006) so potrdili, da obdelava s kvasovkami (S. cerevisiae) znatno poveča skupno vseb- nost prostih fenolnih spojin in antioksidativno aktivnost pšeničnih otrobov. Avtorji študije so izpostavili različno zmožnost kvasovk za presnavljanje posameznih fenolnih spojin. Spaggiari in sod. (2020) so v fermentiranih pše- ničnih otrobih ugotovili relativno veliko vsebnost kavne kisline, kar nakazuje na metabolno aktivnost mikroorga- nizmov. Tudi Žilić in sod. (2015) so v svoji raziskavi na krušni pšenici izpostavili, da lahko bakterije Lactobacil- lus spp. proizvajajo kavno kislino iz klorogenske kisline. Raziskava, ki so jo naredili Montemurro in sod. (2019), je pokazala, da fermentacija kaljenih zrn krušne pšeni- ce s kislim testom ne vpliva zgolj na povečanje fenolnih spojin, ampak tudi na povečanje vsebnosti peptidov, pro- stih aminokislin, γ-aminomaslene kisline ter zmanjša koncentracijo fitinske kisline, kondenziranih taninov in inhibitorjev tripsina. Tretji biotehnološki proces, s katerim lahko izbol- jšamo biološko dostopnost fenolnih spojin v zrnih, je encimsko tretiranje. Mencin in sod. (2022b) so pirina zrna tretirali s celulazami, ksilanazami, feruloil esteraza- mi, α-amilazami in proteazami, posamezno in v različ- nih kombinacijah. Ugotovili so, da je encimsko tretiranje zrn, ne glede na vrsto uporabljenih encimov, izboljšalo vsebnost ekstraktibilnih skupnih fenolnih spojin do 5-krat v primerjavi z netretiranimi zrni. Po drugi stra- ni se je vsebnost vezanih fenolnih spojin zmanjšala po encimskem tretiranju. Tretiranje pirinih zrn z vsemi pe- timi encimi hkrati je vplivalo na največje povečanje vseb- nosti ekstraktibilnih fenolnih spojin. Nadalje so avtorji poročali, da tretiranje zrn samo s feruloil esterazami ni bistveno povečalo vsebnost ekstraktibilnih skupnih fe- nolnih spojin. Kot razlog so navedli, da feruloil esteraze niso sposobne samostojno hidrolizirati estrskih vezi med hidroksicimetnimi kislinami in hemicelulozo v zrnih pšenice in pire zaradi morebitnih steričnih ovir, ki jih po- vzroča struktura polisaharidov, s čimer je okrnjena tudi migracija encimov. Po drugi strani pa so feruloil esteraze v kombinaciji s proteazami pokazale veliko sposobnost sproščanja vezanih fenolnih spojin, kar nakazuje na to, da lahko feruloil esteraze hidrolizirajo estrsko in etrsko vez med fenolnimi spojinami in komponentami celičnih sten zrn, po tem, ko proteaze hidrolizirajo strukturne protei- ne (Mencin in sod. 2022b). Čeprav so avtorji uporabili kar pet različnih hidrolitičnih encimov, pa encimsko tre- tiranje vseeno ni v celoti sprostilo vezanih fenolnih spo- jin. Slednje je v skladu z navedbo Moore in sod. (2006), da matriks celičnih sten zrn vsebuje tudi strukturne ele- mente, ki jih encimi ne morejo hidrolizirati. Kombiniranje encimskega tretiranja z ostalima dvema biotehnološkima procesoma (kaljenjem in fer- mentacijo) je dodatno povečala vsebnost ekstraktibilnih skupnih fenolnih spojin v primerjavi s samo kaljenimi oz. fermentiranimi zrni. Poleg tega je encimsko tretiran- je kaljenih oz. fermentiranih zrn rezultiralo v povečanju deleža ekstraktibilnih fenolnih spojin glede na skupne (ekstraktibilne + vezane) in to za 10 % oz. 38 % (Mencin Acta agriculturae Slovenica, 120/2 – 20246 M. MENCIN in sod., 2022b). Bei in sod. (2018) so na podlagi zapo- redne uporabe encimskega tretiranja in fermentacije na zrnih ovsa ugotovili, da poleg transformacije netopnih fenolnih spojin v topne, omogoča oslabitev kovalentnih vezi med netopnimi fenolnimi spojinami in komponen- tami celičnih sten, zato netopne fenolne spojine lažje ek- strahiramo in tako določimo njihovo večjo vsebnost. Mencin in sod. (2022b) so poročali, da se je vsebnost prevladujočih fenolnih kislin (p-kumarne, trans-ferulne, kavne, p-hidroksibenzojske kisline) v ekstraktibilni frak- ciji pirinih zrn po encimskem tretiranju znatno povečala v primerjavi z netretiranimi zrni. Največje povečanje ek- straktibilne trans-ferulne kisline so zasledili pri zrnih tre- tiranih hkrati s ksilanazami in feruloil esterazami. Svoje rezultate so potrdili s teorijo, da ksilanaze naključno cepi- jo β-1,4 ksilansko strukturo, medtem ko so feruloil este- raze sposobne sproščati ferulno kislino (Sancho in sod., 2001). Podobne raziskave so delali tudi Rakariyatham in sod. (2020), ki so ugotovili, da tretiranje zrn s celulazami poveča sproščanje o-kumarne kisline, nadalje so Peixoto Araujo in sod. (2019) ugotovili, da tretiranje s proteaza- mi in celulazami poveča vsebnost ekstraktibilne ferulne in p-hidroksibenzojske kisline. Mencin in sod. (2022b) so poročali tudi o znatnem povečanju vsebnosti ekstrak- tibilne trans-ferulne kisline za kar 5899  % oz. 8263  % pri kombiniranju encimskega tretiranja s kaljenjem in fermentacijo pirinih zrn. Rezultati nakazujejo na to, da kaljena in fermentirana zrna, v primerjavi z neobdelani- mi zrni, predstavljajo znatno boljši substrat za tretiranje z eksternimi encimi. Avtorji so zaključili, da predhodna obdelava zrn omogoča eksternim encimom lažji dostop do njihovih substratov, v primerjavi z neobdelanimi zrni. Prav tako so Mencin in sod. (2022b) potrdili, da je kombinacija kaljenja oz. fermentacije z encimskim tre- tiranjem dobra strategija za izboljšanje antioksidativne aktivnosti ekstraktibilnih fenolnih spojin. Tudi Azmir in sod. (2013) so v preglednem članku poročali, da en- cimsko tretiranje poveča antioksidativno aktivnost žitnih zrn, razlog pa vidijo v sproščanju polarnih antioksidan- tov, vezanih na komponente celičnih sten, in/ali s hidroli- zo biopolimerov, kot so polipeptidi in polisaharidi. Wang in sod. (2018) pa navajajo še dve možni razlagi za pove- čanje antioksidativne aktivnosti encimsko tretiranih zrn: prva je, da z encimskim tretiranjem povečamo topnost fenolnih spojin iz zrn, druga pa je, da po encimskem tre- tiranju pridobimo fenolne spojine z večjo antioksidativ- no aktivnostjo. Zanimive so tudi ugotovitve Mencin in sod. (2021, 2022a, 2022b), kjer so poleg in vitro antioksidativne ak- tivnosti pirinih zrn obdelanih z biotehnološkimi procesi, določali tudi antioksidativno aktivnost v živi celici – kva- sovki S. cerevisiae, ki omogoča vpogled v živo okolje. Fe- nolne spojine kaljenih zrn niso pokazale antioksidativne aktivnosti v celici, ker identificirane spojine niso uspele vstopiti v celico in jo zaščititi pred oksidacijo. Po drugi strani pa so ekstraktibilne frakcije fermentiranih in en- cimsko tretiranih pirinih zrn izkazale antioksidativno aktivnost v celici, medtem, ko vezane frakcije po večini niso izkazovale antioksidativne aktivnosti v celici. Avtorji so poudarili, da je za antioksidativno delovanje fenolnega ekstrakta v živi celici, ključno tudi razmerje med različni- mi fenolnimi spojinami, ki vstopajo v celico. V njihovem primeru so določili manjšo znotrajcelično oksidacijo pri prehajanju večje količine flavonoidov in manjše količine hidroksicimetnih kislin v celico. Biotehnološke procese raziskovalci pogosto upo- rabljajo z namenom izboljšanja biološke dostopnosti različnih bioaktivnih komponent v matriksu celičnih sten rastlin. Tako so Mencin in sod. (2022c) po obdelavi pirinih zrn z različnimi biotehnološkimi procesi dolo- čali tudi biološko dostopnost prisotnih fenolnih spojin. Uporabili so in vitro statični prebavni model INFOGEST (Brodkorb in sod., 2019), s katerim so posnemali prebavo v ustih, želodcu in tankem črevesu. Avtorji so poročali, da so biotehnološki procesi statistično značilno povečali vsebnost biološko dostopnih skupnih in posameznih fe- nolnih spojin iz pirinih zrn v primerjavi z neobdelanimi zrni. Nadalje so poudarili, da kombiniranje biotehnolo- ških procesov, še posebej kaljenja in alkoholne fermenta- cije, najučinkoviteje izboljša biološko dostopnost fenol- nih spojin. Biotehnološko obdelana zrna imajo znatno večjo začetno vsebnost fenolnih spojin kot neobdelana, posledično jih lahko več vstopa v debelo črevo. Po preba- vi je bila vsebnost biološko dostopnih skupnih fenolnih spojin v kaljenih pirinih zrnih fermentiranih s kvasovko S. cerevisiae kar 7-krat večja kot pri neobdelanih zrnih. Podobno so opazili tudi Anson in sod. (2009), ki so po- ročali, da je kombinacija uporabe eksternih encimov in fermentacije pri otrobih krušne pšenice učinkovito po- večala biološko dostopnost ferulne kisline za kar 5-krat v primerjavi z neobdelanimi otrobi. Večina raziskav omen- ja velike izgube fenolnih spojin med procesom prebave (Ortega in sod., 2011; Ydjedd in sod., 2017; Chait in sod., 2020). Drastične izgube fenolnih spojin po GI prebavi so lahko posledica spremembe v molekulski strukturi fenol- nih spojin zaradi različnih kemijskih reakcij, predvsem oksidacije in polimerizacije, in zaradi encimskega delo- vanja, ki lahko povzroči spremembe v njihovi topnosti (Ortega in sod., 2011). Mencin in sod. (2022c) so poro- čali, da so se v primeru trans-ferulne kisline, ki prevladu- je v pirinih zrnih, še posebej izkazale kombinacije dveh biotehnoloških procesov, ki so njeno biološko dostop- nost povečale za od 24-krat (kaljena + encimsko tretira- na zrna) do 63-krat (encimsko tretirana + fermentirana zrna) v primerjavi z neobdelanimi zrni. Zanimive so tudi ugotovitve Zeng in sod. (2016), ki so poročali, da je bila Acta agriculturae Slovenica, 120/2 – 2024 7 Biotehnološki procesi kot sredstvo za povečanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti fenolnih spojin ... vsebnost biološko dostopnih fenolnih spojin v krušni pšenici manjša kot pri ovsu kljub večji vsebnosti skup- nih fenolnih spojin in močneje izraženi antioksidativni aktivnosti. To nakazuje, da žitna zrna z večjo vsebnostjo fenolnih spojin niso nujno tista z večjo biološko dostop- nostjo. Očitno igra matriks celičnih sten žitnih zrn ključ- no vlogo pri prebavljivosti fenolnih spojin. Lima in sod. (2019) so izpostavili, da na stabilnost fenolnih spojin med postopkom GI prebave znatno vpliva njihova kemij- ska struktura, saj imajo fenolne spojine različno občutlji- vost na spremembo vrednosti pH in aktivnost prebavnih encimov. Mencin in sod. (2022c) so ugotovili, da je kljub uporabi različnih biotehnoloških postopkov, ki so znatno povečali biološko dostopnost fenolnih spojin, večji del fenolnih spojin ostal v biološko nedostopni obliki, ki na- dalje vstopa v debelo črevo. V debelem črevesu pa poteka fermentacija, kjer bakterijski encimi olajšajo sproščanje fenolnih spojin, ki v tankem črevesu niso bile dostopne (Li in sod., 2022). 3 ZAKLJUČKI Žitna zrna predstavljajo pomemben vir vlaknin in nanje vezanih bioaktivnih spojin, ki imajo majhno biolo- ško dostopnost. Da bi izkazale svoje pozitivne učinke na zdravje, se morajo fenolne spojine sprostiti iz matriksa celičnih sten v hrani in biti dostopne v prebavnem trak- tu. Znatno večja izhodiščna vsebnost fenolnih spojin v biotehnološko obdelanih zrnih sovpada z večjo količino fenolnih spojin, ki bo uspešno prešla proces prebave. Dosedanji izsledki raziskav kažejo, da imajo biotehno- loški procesi pozitiven učinek na povečanje vsebnosti biološko dostopnih fenolih spojin in njihove antioksida- tivne aktivnosti v žitnih zrnih. Rezultati predstavljenih raziskav odpirajo možnosti za razvoj različnih funkcio- nalnih živil, saj prav s hranili osiromašena živila znatno pripomorejo k večji pojavnosti kroničnih bolezni. Zaradi številnih pozitivnih lastnosti biotehnoloških procesov, pa bi bili potencialni živilski izdelki z izboljšano hranil- no vrednostjo dobro sprejeti med potrošniki. V prihod- nje bi bilo potrebno dati poudarek na raziskavah, ki se bodo dotikale kombinacij biotehnoloških procesov, zlasti kaljenja in fermentacije, saj se je prav ta kombinacija iz- kazala za najučinkovitejšo metodo povečanja vsebnosti biološko dostopnih fenolnih spojin. Nadaljnje študije so potrebne tudi na področju biološke transformacije fenol- nih spojin v njihove metabolite, saj lahko ti lažje vstopajo v živo celico, hkrati pa bi bilo potrebno prenesti in vitro študije določanja biološke dostopnosti in razpoložljivosti fenolnih spojin na in vivo nivo. 4 VIRI Acosta-Estrada B. A., Gutiérrez-Uribe J. A., Serna-Saldívar S. O. (2014). Bound phenolics in foods, a review. Food Chemistry, 152, 46–55. https://doi.org/10.1016/j.food- chem.2013.11.093 Adebo O. A., Gabriela Medina-Meza I. (2020). Impact of fer- mentation on the phenolic compounds and antioxidant ac- tivity of whole cereal grains: a mini review. Molecules, 25(4), 927, 9 str. https://doi.org/10.3390/molecules25040927 Adom K. K., Liu R. H. (2002). Antioxidant activity of grains. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50(21), 6182– 6187. https://doi.org/10.1021/jf0205099 Angelino D., Cossu M., Marti A., Zanoletti M., Chiavaroli L., Brighenti F., Rio D. D., Martini D. (2017). Bioaccessibil- ity and bioavailability of phenolic compounds in bread: a review. Food & Function, 8(7), 2368–2393. https://doi. org/10.1039/C7FO00574A Anson N. M., Selinheimo E., Havenaar R., Aura A.-M., Mat- tila I., Lehtinen P., Bast A., Poutanen K., Haenen G. R. M. M. (2009). Bioprocessing of wheat bran improves in vitro bioaccessibility and colonic metabolism of phenolic com- pounds. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57(14), 6148–6155. https://doi.org/10.1021/jf900492h Azmir J., Zaidul I. S. M., Rahman M. M., Sharif K. M., Moham- ed A., Sahena F., Jahurul M. H. A., Ghafoor K., Norulaini N. A. N., Omar A. K. M. (2013). Techniques for extraction of bioactive compounds from plant materials: a review. Journal of Food Engineering, 117(4), 426–436. https://doi. org/10.1016/j.jfoodeng.2013.01.014 Bei Q., Chen G., Lu F., Wu S., Wu Z. (2018). Enzymatic action mechanism of phenolic mobilization in oats (Avena sativa L.) during solid-state fermentation with Monascus anka. Food Chemistry, 245, 297–304. https://doi.org/10.1016/j. foodchem.2017.10.086 Bojňanská T., Frančáková H. (2011). The use of spelt wheat (Trit- icum spelta L.) for baking applications. Plant, Soil and En- vironment, 48(4), 141–147. https://doi.org/10.17221/4212- PSE Bonafaccia G., Galli V., Francisci R., Mair V., Skrabanja V., Kreft I. (2000). Characteristics of spelt wheat products and nutritional value of spelt wheat-based bread. Food Chemistry, 68(4), 437–441. https://doi.org/10.1016/S0308- 8146(99)00215-0 Boskov Hansen H., Andreasen M., Nielsen M., Larsen L., Knudsen B. K., Meyer A., Christensen L., Hansen Å. (2002). Changes in dietary fibre, phenolic acids and activity of en- dogenous enzymes during rye bread-making. European Food Research and Technology, 214(1), 33–42. https://doi. org/10.1007/s00217-001-0417-6 Brodkorb A., Egger L., Alminger M., Alvito P., Assunção R., Ballance S., Bohn T., Bourlieu-Lacanal C., Boutrou R., Car- rière F., Clemente A., Corredig M., Dupont D., Dufour C., Edwards C., Golding M., Karakaya S., Kirkhus B., Le Feun- teun S., Lesmes U., Macierzanka A., Mackie R. A., Martins C., Marze S., McClements J. D., Ménard O., Minekus M., Acta agriculturae Slovenica, 120/2 – 20248 M. MENCIN Portmann R., Santos C. N., Souchon I., Singh R. P., Vegarud G. E., Wickham M. S. J., Weitschies W., Recio I. (2019). IN- FOGEST static in vitro simulation of gastrointestinal food digestion. Nature Protocols, 14(4), 991–1014. https://doi. org/10.1038/s41596-018-0119-1 Chait Y. A., Gunenc A., Bendali F., Hosseinian F. (2020). Simu- lated gastrointestinal digestion and in vitro colonic fermen- tation of carob polyphenols: bioaccessibility and bioactiv- ity. LWT, 117, 108623, 10 str. https://doi.org/10.1016/j. lwt.2019.108623 Chavarín-Martínez C. D., Gutiérrez-Dorado R., Perales- Sánchez J. X. K., Cuevas-Rodríguez E. O., Milán-Carrillo J., Reyes-Moreno C. (2019). Germination in optimal condi- tions as effective strategy to improve nutritional and nutra- ceutical value of underutilized Mexican blue maize seeds. Plant Foods for Human Nutrition, 74(2), 192–199. https:// doi.org/10.1007/s11130-019-00717-x Chen Z. Ma Y., Yang R., Gu Z., Wang P. (2019). Effects of exo- genous Ca2+ on phenolic accumulation and physiological changes in germinated wheat (Triticum aestivum L.) under UV-B radiation. Food Chemistry, 288, 368–376. https://doi. org/10.1016/j.foodchem.2019.02.131 Chen Z., Wang P., Weng Y., Ma Y., Gu Z., Yang R. (2017). Com- parison of phenolic profiles, antioxidant capacity and rele- vant enzyme activity of different Chinese wheat varieties during germination. Food Bioscience, 20, 159–167. https:// doi.org/10.1016/j.fbio.2017.10.004 Chrzanowski G. (2020). Saccharomyces cerevisiae—an interes- ting producer of bioactive plant polyphenolic metabolites. International Journal of Molecular Sciences, 21(19), 7343. https://doi.org/10.3390/ijms21197343 Costabile A., Klinder A., Fava F., Napolitano A., Fogliano V., Le- onard C., Gibson G. R., Tuohy K. M. (2008). Whole-grain wheat breakfast cereal has a prebiotic effect on the human gut microbiota: a double-blind, placebo-controlled, crosso- ver study. British Journal of Nutrition, 99(1), 110–120. htt- ps://doi.org/10.1017/S0007114507793923 Donkor O. N., Stojanovska L., Ginn P., Ashton J., Vasiljevic T. (2012). Germinated grains – Sources of bioactive com- pounds. Food Chemistry, 135(3), 950–959. https://doi.or- g/10.1016/j.foodchem.2012.05.058 Đorđević T. M., Šiler-Marinković S. S., Dimitrijević-Branković S. I. (2010). Effect of fermentation on antioxidant properties of some cereals and pseudo cereals. Food Chemistry, 119(3), 957–963. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2009.07.049 Escarnot E., Aguedo M., Paquot M. (2012). Enzymatic hydro- lysis of arabinoxylans from spelt bran and hull. Journal of Cereal Science, 55(2), 243–253. https://doi.org/10.1016/j. jcs.2011.12.009 Falcinelli B., Sileoni V., Marconi O., Perretti G., Quinet M., Lu- tts S., Benincasa P. (2017). Germination under moderate salinity increases phenolic content and antioxidant activity in rapeseed (Brassica napus var. oleifera Del.) sprouts. Mo- lecules, 22(8), 1377, 13 str. https://doi.org/10.3390/molecu- les22081377 FAOSTAT. (2023). Crop statistics. https://www.fao.org/faostat/ en/#data/QCL (accessible 8.12.2023) Faulds C. B., Mandalari G., LoCurto R., Bisignano G., Waldron K. W. (2004). Arabinoxylan and mono- and dimeric ferulic acid release from brewers grain and wheat bran by feruloyl esterases and glycosyl hydrolases from Humicola insolens. Applied Microbiology and Biotechnology, 64(5), 644–650. https://doi.org/10.1007/s00253-003-1520-3 Ferri M., Happel A., Zanaroli G., Bertolini M., Chiesa S., Com- misso M., Guzzo F., Tassoni A. (2020). Advances in combi- ned enzymatic extraction of ferulic acid from wheat bran. New Biotechnology, 56, 38–45. https://doi.org/10.1016/j. nbt.2019.10.010 Gan R.-Y., Lui W.-Y., Wu K., Chan C.-L., Dai S.-H., Sui Z.-Q., Corke H. (2017). Bioactive compounds and bioactivities of germinated edible seeds and sprouts: an updated review. Trends in Food Science & Technology, 59, 1–14. https://doi. org/10.1016/j.tifs.2016.11.010 Gani A., Sm W., Fa M. (2012). Whole-grain cereal bioactive compounds and their health benefits: a review. Journal of Food Processing & Technology, 3(3), 146, 10 str. https://doi. org/10.4172/2157-7110.1000146 Gänzle M. G. (2014). Enzymatic and bacterial conversions du- ring sourdough fermentation. Food Microbiology, 37, 2–10. https://doi.org/10.1016/j.fm.2013.04.007 Geisslitz S., Longin C. F. H., Scherf K. A., Koehler P. (2019). Comparative study on gluten protein composition of an- cient (einkorn, emmer and spelt) and modern wheat spe- cies (durum and common wheat). Foods, 8(9), 409. https:// doi.org/10.3390/foods8090409 Hübner F., Arendt E. K. (2013). Germination of cereal grains as a way to improve the nutritional value: a review. Critical Re- views in Food Science and Nutrition, 53(8), 853–861. https:// doi.org/10.1080/10408398.2011.562060 Katina K., Liukkonen K.-H., Kaukovirta-Norja A., Adlercreutz H., Heinonen S.-M., Lampi A.-M., Pihlava J.-M., Poutanen K. (2007). Fermentation-induced changes in the nutritional value of native or germinated rye. Journal of Cereal Science, 46(3), 348–355. https://doi.org/10.1016/j.jcs.2007.07.006 Kim M. J., Kwak H. S., Kim S. S. (2018). Effects of germina- tion on protein, γ-aminobutyric acid, phenolic acids, and antioxidant capacity in wheat. Molecules, 23(9), 2244, 13 str. https://doi.org/10.3390/molecules23092244 Konopka I., Tańska M., Faron A., Czaplicki S. (2014). Release of free ferulic acid and changes in antioxidant properties du- ring the wheat and rye bread making process. Food Science and Biotechnology, 23(3), 831–840. https://doi.org/10.1007/ s10068-014-0112-6 Li M., Bai Q., Zhou J., de Souza T. S. P., Suleria H. A. R. (2022). In vitro gastrointestinal bioaccessibility, bioactivities and colonic fermentation of phenolic compounds in different vigna beans. Foods, 11(23), 3884. https://doi.org/10.3390/ foods11233884 Lima K., Silva O., Figueira M. E., Pires C., Cruz D., Gomes S., Maurício E. M., Duarte M. P. (2019). Influence of the in vitro gastrointestinal digestion on the antioxidant activity of Ar- temisia gorgonum Webb and Hyptis pectinata (L.) Poit. in- fusions from Cape Verde. Food Research International, 115, 150–159. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2018.08.029 Ma Y., Wang P., Wang M., Sun M., Gu Z., Yang R. (2019). GABA mediates phenolic compounds accumulation and the anti- oxidant system enhancement in germinated hulless barley Acta agriculturae Slovenica, 120/2 – 2024 9 Biotehnološki procesi kot sredstvo za povečanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti fenolnih spojin ... under NaCl stress. Food Chemistry, 270, 593–601. https:// doi.org/10.1016/j.foodchem.2018.07.092 Mathew S., Abraham T. E. (2004). Ferulic acid: an antioxi- dant found naturally in plant cell walls and feruloyl ester- ases involved in its release and their applications. Criti- cal Reviews in Biotechnology, 24(2–3), 59–83. https://doi. org/10.1080/07388550490491467 Mencin M., Abramovič H., Jamnik P., Mikulič Petkovšek M., Veberič R., Terpinc P. (2021). Abiotic stress combinations improve the phenolics profiles and activities of extractable and bound antioxidants from germinated spelt (Triticum spelta L.) seeds. Food Chemistry, 344, 128704, 12 str. https:// doi.org/10.1016/j.foodchem.2020.128704 Mencin M., Jamnik P., Mikulič Petkovšek M., Veberič R., Ter- pinc P. (2022a). Improving accessibility and bioactivity of raw, germinated and enzymatic-treated spelt (Triticum spelta L.) seed antioxidants by fermentation. Food Chem- istry, 394, 133483, 12 str. https://doi.org/10.1016/j.food- chem.2022.133483 Mencin M., Jamnik P., Mikulič Petkovšek M., Veberič R., Ter- pinc P. (2022b). Enzymatic treatments of raw, germinated and fermented spelt (Triticum spelta L.) seeds improve accessibility and antioxidant activity of their pheno- lics. LWT, 169, 114046, 13 str. https://doi.org/10.1016/j. lwt.2022.114046 Mencin M., Mikulič Petkovšek M., Veberič R., Terpinc P. (2022c). Simulated gastrointestinal digestion of bio- processed spelt seeds: bioaccessibility and bioactivity of phenolics. Antioxidants, 11(9), 1703, 20 str. https://doi. org/10.3390/antiox11091703 Montemurro M., Pontonio E., Gobbetti M., Rizzello C. G. (2019). Investigation of the nutritional, functional and tech- nological effects of the sourdough fermentation of sprouted flours. International Journal of Food Microbiology, 302, 47– 58. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2018.08.005 Moore J., Cheng Z., Su L., Yu L. (2006). Effects of solid-state en- zymatic treatments on the antioxidant properties of wheat bran. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54(24), 9032–9045. https://doi.org/10.1021/jf0616715 Ortega N., Macià A., Romero M.-P., Reguant J., Motilva M.-J. (2011). Matrix composition effect on the digestibility of carob flour phenols by an in-vitro digestion model. Food Chemistry, 124(1), 65–71. https://doi.org/10.1016/j.food- chem.2010.05.105 Pang Y., Ahmed S., Xu Y., Beta T., Zhu Z., Shao Y., Bao J. (2018). Bound phenolic compounds and antioxidant properties of whole grain and bran of white, red and black rice. Food Chemistry, 240, 212–221. https://doi.org/10.1016/j.food- chem.2017.07.095 Paucar-Menacho L. M., Martínez-Villaluenga C., Dueñas M., Frias J., Peñas E. (2017). Optimization of germination time and temperature to maximize the content of bioactive com- pounds and the antioxidant activity of purple corn (Zea mays L.) by response surface methodology. LWT - Food Sci- ence and Technology, 76, 236–244. https://doi.org/10.1016/j. lwt.2016.07.064 Peixoto Araujo N. M., Pereira G. A., Arruda H. S., Prado L. G., Ruiz A. L. T. G., Eberlin M. N., Castro R. J. S., Pastore G. M. (2019). Enzymatic treatment improves the antioxidant and antiproliferative activities of Adenanthera pavonina L. seeds. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 18, 101002, 7 str. https://doi.org/10.1016/j.bcab.2019.01.040 Pruska-Kedzior A., Kedzior Z., Klockiewicz-Kaminska E. (2008). Comparison of viscoelastic properties of gluten from spelt and common wheat. European Food Research and Technology, 227(1), 199–207. https://doi.org/10.1007/ s00217-007-0710-0 Rakariyatham K., Liu X., Liu Z., Wu S., Shahidi F., Zhou D., Zhu B. (2020). Improvement of phenolic contents and antioxi- dant activities of longan (Dimocarpus longan) peel extracts by enzymatic treatment. Waste and Biomass Valorization, 11(8), 3987–4002. https://doi.org/10.1007/s12649-019- 00723-9 Ruibal-Mendieta N. L., Delacroix D. L., Mignolet E., Pycke J.- M., Marques C., Rozenberg R., Petitjean G., Habib-Jiwan J.-L., Meurens M., Quetin-Leclercq J., Delzenne N. M., Larondelle Y. (2005). Spelt (Triticum aestivum ssp. spelta) as a source of breadmaking flours and bran naturally enriched in oleic acid and minerals but not phytic acid. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53(7), 2751–2759. https:// doi.org/10.1021/jf048506e Sancho A. I., Bartolomé B., Gómez-Cordovés C., William- son G., Faulds C. B. (2001). Release of ferulic acid from cereal residues by barley enzymatic extracts. Journal of Cereal Science, 34(2), 173–179. https://doi.org/10.1006/ jcrs.2001.0386 Shahidi F., Yeo J. (2016). Insoluble-bound phenolics in food. Molecules, 21(9), 1216, 22 str. https://doi.org/10.3390/mol- ecules21091216 Singh A., Sharma S. (2017). Bioactive components and func- tional properties of biologically activated cereal grains: a bibliographic review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 57(14), 3051–3071. https://doi.org/10.1080/1040 8398.2015.1085828 Singh A., Sharma V., Banerjee R., Sharma S., Kuila A. (2016). Perspectives of cell-wall degrading enzymes in cereal pol- ishing. Food Bioscience, 15, 81–86. https://doi.org/10.1016/j. fbio.2016.05.003 Spaggiari M., Ricci A., Calani L., Bresciani L., Neviani E., Dall’Asta C., Lazzi C., Galaverna G. (2020). Solid state lactic acid fermentation: a strategy to improve wheat bran func- tionality. LWT, 118, 108668, 9 str. https://doi.org/10.1016/j. lwt.2019.108668 Terpinc P. (2019). Vezane fenolne spojine polnozrnatih žitnih pripravkov kot sestavina funkcionalnih živil: drugi del. Acta agriculturae Slovenica, 114(2), 279–291. https://doi. org/10.14720/aas.2019.114.2.12 Terpinc P., Abramovič H. (2010). A kinetic approach for evalu- ation of the antioxidant activity of selected phenolic acids. Food Chemistry, 121(2), 366–371. https://doi.org/10.1016/j. foodchem.2009.12.037 Terpinc P., Cigić B., Polak T., Hribar J., Požrl T. (2016). LC–MS analysis of phenolic compounds and antioxidant activity of buckwheat at different stages of malting. Food Chemistry, 210, 9–17. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2016.04.030 Ti H., Zhang R., Zhang M., Li Q., Wei Z., Zhang Y., Tang X., Deng Y., Liu L., Ma Y. (2014). Dynamic changes in the free and bound phenolic compounds and antioxidant ac- Acta agriculturae Slovenica, 120/2 – 202410 M. MENCIN tivity of brown rice at different germination stages. Food Chemistry, 161, 337–344. https://doi.org/10.1016/j.food- chem.2014.04.024 Vitaglione P., Napolitano A., Fogliano V. (2008). Cereal di- etary fibre: a natural functional ingredient to deliver phe- nolic compounds into the gut. Trends in Food Science & Technology, 19(9), 451–463. https://doi.org/10.1016/j. tifs.2008.02.005 Wang J., Chatzidimitriou E., Wood L., Hasanalieva G., Markel- lou E., Iversen P. O., Seal C., Baranski M., Vigar V., Ernst L., Willson A., Thapa M., Barkla B. J., Leifert C., Rempelos L. (2020). Effect of wheat species (Triticum aestivum vs T. spelta), farming system (organic vs conventional) and flour type (wholegrain vs white) on composition of wheat flour – Results of a retail survey in the UK and Germany – 2. An- tioxidant activity, and phenolic and mineral content. Food Chemistry: X, 6, 100091, 10 str. https://doi.org/10.1016/j. fochx.2020.100091 Wang T., He F., Chen G. (2014). Improving bioaccessibility and bioavailability of phenolic compounds in cereal grains through processing technologies: a concise review. Journal of Functional Foods, 7, 101–111. https://doi.org/10.1016/j. jff.2014.01.033 Xiang N., Guo X., Liu F., Li Q., Hu J., Brennan C. S. (2017). Effect of light- and dark-germination on the phenolic bio- synthesis, phytochemical profiles, and antioxidant activi- ties in sweet corn (Zea mays L.) sprouts. International Jour- nal of Molecular Sciences, 18(6), 1246, 13 str. https://doi. org/10.3390/ijms18061246 Xu J. G., Tian C. R., Hu Q. P., Luo J. Y., Wang X. D., Tian X. D. (2009). Dynamic changes in phenolic compounds and anti- oxidant activity in oats (Avena nuda L.) during steeping and germination. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57(21), 10392–10398. https://doi.org/10.1021/jf902778j Xu M., Rao J., Chen B. (2020). Phenolic compounds in germi- nated cereal and pulse seeds: classification, transformation, and metabolic process. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 60(5), 740–759. https://doi.org/10.1080/1040839 8.2018.1550051 Yang T. K. B., Ooraikul F. (2001). Studies on germination condi- tions and antioxidant contents of wheat grain. International Journal of Food Sciences and Nutrition, 52(4), 319–330. htt- ps://doi.org/10.1080/09637480120057567 Ydjedd S., Bouriche S., López-Nicolás R., Sánchez-Moya T., Frontela-Saseta C., Ros-Berruezo G., Rezgui F., Louaile- che H., Kati, D.-E. (2017). Effect of in vitro gastrointestinal digestion on encapsulated and nonencapsulated phenolic compounds of carob (Ceratonia siliqua L.) pulp extracts and their antioxidant capacity. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 65(4), 827–835. https://doi.org/10.1021/ acs.jafc.6b05103 Zeng Z., Liu C., Luo S., Chen J., Gong E. (2016). The profile and bioaccessibility of phenolic compounds in cereals influen- ced by improved extrusion cooking treatment. PLOS ONE, 11(8), e0161086, 11 str. https://doi.org/10.1371/journal. pone.0161086 Zörb C., Betsche T., Langenkämper G., Zapp J., Seifert M. (2007). Free sugars in spelt wholemeal and flour. Journal of Applied Botany and Food Quality, 81(2), 172–174. Žilić S., Delić N., Basić Z., Ignjatović-Micić D., Janković M., Vančetović J. (2015). Effects of alkaline cooking and sprouting on bioactive compounds, their bioavailability and relation to antioxidant capacity of maize flour. Journal of Food & Nutrition Research, 54(2), 155–164. Živković, A., Gođevac, D., Cigić, B., Polak, T., & Požrl, T. (2023). Identification and quantification of selected benzoxazino- ids and phenolics in germinated spelt (Triticum spelta). Fo- ods, 12(9), 9. https://doi.org/10.3390/foods12091769