Zaključno poročilo ciljnega raziskovalnega projekta - 2021Zaključno poročilo ciljnega raziskovalnega projekta - 202118 / 20 Zaključno poročilo ciljnega raziskovalnega projekta - 2021 ELABORAT O REZULTATIH OPRAVLJENEGA RAZISKOVALNEGA DELA NA PROJEKTU V OKVIRU CILJNEGA RAZISKOVALNEGA PROGRAMA (CRP) »ZAGOTOVIMO SI HRANO ZA JUTRI« V LETU 2018 (Uradni list RS, št. 41/2018, z dne 15. 06. 2018) Težišče 1 Prehranska varnost Slovenije PROJEKT CRP V1-1808 Uporaba tehnologije DNA za ugotavljanje poneverb v ribiških proizvodih z vrednotenjem socio ekonomskih vidikov 01. 11. 2018 – 31. 10. 2020, podaljšanje brez financiranja do 31. 3. 2021 Vodja projekta: prof. dr. Lovrenc Lipej Avtorji: doc. dr. Andreja Ramšak, dr. Alenka Arbeiter Baruca, doc. dr. Matjaž Hladnik, izr. prof. dr. Dunja Bandelj, prof. dr. Štefan Bojnec Projekt CRP V1-1808 je financirala Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije in Ministrstvo za kmetijstvo, gozdarstvo in prehrano iz proračunskih sredstev. Kazalo Uvod ........................................................................................................................................................ 5 Pregled literature .................................................................................................................................... 6 Rezultati................................................................................................................................................. 13 DELOVNI SKLOP 1: Izdelava standardiziranega molekularnega testa za zanesljivo identifikacijo svežih in predelanih ribiških proizvodov........................................................................................... 13 DS1.1: Vzorčenje, obdelava vzorcev in biološkega materiala ....................................................... 13 DS1.2: Genetska identifikacija referenčnega materiala................................................................ 16 DS1.3: Razvoj in optimizacija molekularnega testa na osnovi informativnih odsekov mitohondrijske DNA ...................................................................................................................... 19 DS1.4: Testiranje in optimizacija Q-PCR testov ............................................................................. 23 DS2.2 Proučitev primernosti novo razvitih molekularnih testov za razvoj metode LAMP ............... 24 DS2.3: Optimizacija standardiziranega molekularnega testa........................................................ 26 DELOVNI SKLOP 3: vzpostavitev zbirke vzorcev DNA referenčnega materiala in elektronsko shranjevanje podatkov. ..................................................................................................................... 33 Vzpostavitev zbirke vzorcev DNA referenčnega materiala ........................................................... 33 Vzpostavitev podatkovne zbirke pridobljenih rezultatov ............................................................. 33 Predlogi za dopolnitve Pravilnika o trgovskih imenih rib (Ur.l.RS, št. 46/2005) ........................... 34 DELOVNI SKLOP 4: socio-ekonomski vidik napačnega deklariranja in označevanja ribiških proizvodov......................................................................................................................................... 40 Analiza ribiških proizvodov, ki so na trgu (s trga EU in iz uvoza) s poudarkom na količinah in vrstah............................................................................................................................................. 43 Ovrednotenje količine napačno deklariranih ribiških proizvodov in ekonomsko škodo zaradi napačnega označevanja ribiških proizvodov................................................................................. 43 DELOVNI SKLOP 5: diseminacija projekta in rezultatov projekta ...................................................... 44 Objave zavedene v sistemu COBISS .............................................................................................. 47 Literatura............................................................................................................................................... 48 Priloge................................................................................................................................................ 50 Priloga 1 Izolacija DNA................................................................................................................... 50 Priloga 2 Filogenetsko drevo lignjev narejeno na osnovi COI (vir: M. Rubinić magistrsko delo, Univerza v Reki). ............................................................................................................................ 54 Kazalo slik Slika 1 Informacije za potrošnika –pomen deklaracije (vir: EK). ............................................................. 8 Slika 2 Shema oskrbne verige v ribištvu in kompleksnost trgovanja z dobrinami, nekateri proizvodi prečkajo več državnih meja v oskrbni verigi, včasih prečkajo ozemlja brez strogih in določenih zahtev po sledljivosti (Oceana, 2016). Okusno, alergeno, ulovljeno ali gojeno? (vir: Oceana, 2016). ............... 9 Slika 3 Okusno, alergeno, ulovljeno ali gojeno? (vir: Oceana, 2016). ................................................... 10 Slika 4 Primer vzorčenega biološkega materiala v trgovskih verigah in ribarnicah (fileti (levo) in lignji (desno)................................................................................................................................................... 13 Slika 5 Slikovno dokumentiranje vzorčenih lignjev (od leve proti desni: jadranski ligenj Loligo vulgaris, L. gahi, in neidentificirana vrsta), imena so zapisana enako kot na deklaracijah, kasneje smo preverili z barkodiranjem identiteto vrst. .............................................................................................................. 16 Slika 6 Rezultati pomnoževanja regije COI pri lignjih (zgoraj: oznake vzorcev). ................................... 18 Slika 7 Prikaz prileganja začetnih oligonukleotidov in sonde s fluorescentno oznako ter utiševalcema (Vir: Integrated DNA Technologies)....................................................................................................... 20 Slika 8 Prikaz pomnožitvenih krivulj (zgoraj) in prikaz plošče s pozitivnimi rezultati (zelena barva) in negativno kontrolo (rdeča barva) za vrste sardela Sardina pilchardus, sardon Engraulis encrasicolous in inčun Sprattus sprattus. .................................................................................................................... 22 Slika 9 Primer pomnožitvenih krivulj standardnih raztopin za vrsto sardela Sardina pilchardus. ........ 22 Slika 10 Primer umeritvene krivulje, izrisane izkvantifikacijskih vrednosti (Cq vrednosti) in desetiškega logaritma količine DNA za vrsto sardela Sardina pilchardus................................................................. 23 Slika 11 Prikaz talilnih krivulj za določanje HRM (High Resolution melting) s SyberGreen; različni testi so označeni z barvami: Test 1 (rdeče Tm= 73,87)), Test 2 (modro Tm=72,86) in Test 3 (zeleno Tm=70,84) narejeni na neredčenih vzorcih. Temperatura pomnoževanja je bila 60°C........................ 28 Slika 12 Prikaz pomnoževalnih krivulj za test HMT s SyberGreen pri temperaturi 60°C....................... 28 Slika 13 Prikaz pomnoževalnih krivulj za test HMT s SyberGreen za Test 1 narejen na neredčenih vzorcih lignjev. Temperatura pomnoževanja je bila 62°C. .................................................................... 29 Slika 14 Prikaz pomnoževalnih krivulj za test 2. Temperatura pomnoževanja je bila 62°C. ................. 30 Slika 15 Prikaz pomnoževalnih krivulj za test HMT s SyberGreen za Test 3 narejen na neredčenih vzorcih lignjev. Temperatura pomnoževanja je bila 62°C. .................................................................... 32 Slika 16 Shema zbiranja podatkov z deklaracij ter preverjanje skladnosti s Pravilnikom o trgovskih imenih rib in drugih ribolovnih organizmov (Ur. L. RS, št. 46/2005)..................................................... 34 Kazalo tabel Tabela 1 Reakcijska mešanica pomnoževanja v PCR za lignje............................................................... 17 Tabela 2 Temperaturni profil pomnoževanja gena COI pri lignjih. ....................................................... 17 Tabela 3 Reakcijska mešanica pomnoževanja v PCR za vrste sardela, sardon in papalina. .................. 17 Tabela 4 Temperaturni profil pomnoževanja gena COI pri vrstah sardela, sardon in papalina............ 18 Tabela 5 Temperaturni profil sekvenčne reakcije za pomnoževanje gena COI pri vrstah sardela, sardon in papalina za sekvenciranje...................................................................................................... 19 Tabela 6 Reakcijska mešanica za Q-PCR za testiranje specifičnosti razvitih molekularnih testov na osnovi 16S rDNA za izbrane vrste rib. ................................................................................................... 21 Tabela 7 Temperaturni profil reakcije PCR v aparatu LightCycler 96.................................................... 21 Tabela 8 Seznam analiziranih vrst rib ter število analiziranih konzerv in število posameznih osebkov. ............................................................................................................................................................... 23 Tabela 9 Priporočena koncentracija začetnih oligonukleotidov za 25,0 µL LAMP reakcijo .................. 26 Tabela 10 Reakcijske mešanice za ugotavljanje Tm za različne Q-PCR teste za Loligo vulgaris............ 27 Tabela 11 Temperaturni profil pomnoževanja DNA lignjev s Q-PCR za določanje optimalne in specifične temperature pomnoževanja Tabela 12 Preverba slovenskih in latinskih imen za konzerve sardin v Pravilnik o trgovskih imenih rib in drugih ribolovnih organizmov (Ur. L. RS, št. 46/2005) in njihova veljavnost v WORMS. Imena iz pravilnika so zapisana identično kot v Pravilnik o trgovskih imenih rib in drugih ribolovnih organizmov (Ur. L. RS, št. 46/2005) 31 Tabela 13 Rezultati pomnoževanja pri 62°C za Test 2. 32 Tabela 14 Rezultati pomnoževanja pri 62°C za Test 3. 32 Tabela 15 Preverba slovenskih in latinskih imen za lignje v Pravilnik o trgovskih imenih rib in drugih ribolovnih organizmov (Ur. L. RS, št. 46/2005) in njihova veljavnost v WORMS. Imena iz pravilnika so zapisana identično kot v Pravilnik o trgovskih imenih rib in drugih ribolovnih organizmov (Ur. L. RS, št. 46/2005) ................................................................................................................................................ 34 Tabela 16 Preverba slovenskih in latinskih imen za konzerve sardin v Pravilnik o trgovskih imenih rib in drugih ribolovnih organizmov (Ur. L. RS, št. 46/2005) in njihova veljavnost v WORMS. Imena iz pravilnika so zapisana identično kot v Pravilnik o trgovskih imenih rib in drugih ribolovnih organizmov (Ur. L. RS, št. 46/2005)........................................................................................................................... 37 Uvod Ciljni raziskovalni projekt Uporaba tehnologije DNA za ugotavljanje poneverb v ribiških proizvodih z vrednotenjem socio ekonomskih vidikov (šifra projekta V1-1808), je eden prvih projektov s področja poneverb morske hrane. To področje je razmeroma slabo obdelano, četudi je hrana iz morja pomemben vir beljakovin za 20 % človeštva predvsem v nerazvitih državah. V razvitih državah predstavlja hrana iz morja pomembno dobrino, ki pogosto dosega visoko tržno vrednost. V zadnjih dveh desetletjih je poraba rib in drugih vrst iz morskega ribolova narasla zaradi oglaševanja blagodejnih učinkov na človekovo zdravje. Z razvojem ribištva in z njim povezane predelovalne dejavnosti se je celotna veriga od ulova do predelave in distribucije do potrošnika zelo podaljšala. Ribolov se je pomaknil na bolj oddaljena območja zaradi osiromašenih ribolovnih virov, povečuje se zmogljivost plovil in ribolovnih orodij, ulov predelujejo na ribiških plovilih (npr. filetiranje), iztovarjajo in predelujejo v tretjih državah, čemur lahko sledi ponovna predelava in šele nato distribucija do maloprodajnih mest. Zato je ribiška panoga zelo občutljiva na poneverbe v celotni verigi od ribolova in vzreje v akvakulturi do maloprodaje. Med njimi so najpogostejše zamenjave vrst: nenamerne, zaradi velike podobnosti vrst in zato težke taksonomske določitve ali namerne, da se prikrije ilegalni ribolov, ali da se proda manj kakovostne vrste kot bolj kakovostne. Spremenile so se tudi prehranjevalne navade potrošnikov, ki zaradi pomanjkanja časa želijo izdelke za hitro pripravo (npr. ribje palčke, očiščene ribe v obliki filetov), ki vsebujejo zelo predelane sestavine in je njihovo vrstno sestavo težko ugotavljati. Zaradi škandalov s ponarejanjem hrane in zaradi vedno večjega prelova na svetovni ravni, se je pojavila potreba po vedno večjem nadzoru ter se okrepila zavest potrošnikov, da je treba natančno preveriti ribiške proizvode. Poleg tega so zaradi zamenjav vrst možne tudi hude zdravstvene težave, kajti nekatere vrste rib in nekatere vrste mehkužcev sodijo med zelo alergena živila, ki lahko povzročijo hude alergijske reakcije. Zdravstvene težave povzročajo tudi toksini alg, s katerimi so lahko kontaminirani morski organizmi ali zaradi kemijskega onesnaženja v okolju. Nekateri potrošniki so tudi vedno bolj ozaveščeni in želijo imeti na razpolago več informacij, da se lažje odločijo za nakup rib ali drugih ribiških proizvodov. Evropska komisija je izdala uredbo, ki predpisuje, katere informacije mora vsebovati deklaracija, da se potrošnik seznani z izvorom, načinom ribolova ter ribolovnim območjem, kadar gre za prodajo celih rib ali filetov. Medtem ko se v predelanih proizvodih sledljivost izgubi, je enako vprašljiva vrstna sestava takih proizvodov. V zadnjem desetletju so se uveljavile številne laboratorijske metode za ugotavljanje istovetnosti hrane (naprimer za rdeče meso, arome), medtem ko je njihova uporaba še vedno v zaostanku kadar gre za hrano iz morja. Glede na to, da je poglavitna težava v ribištvu ugotavljanje istovetnosti ribolovne vrste so napori raziskovalcev usmerjeni v razvoj tehnik za čim bolj poenostavljeno, hitro, a izjemno zanesljivo identifikacijo vrst. Nekatere tehnologije so uradno v veljavi, kot je ugotavljanje identitete vrst z barkodiranjem primernih genetskih markerjev, ki so običajno na mitohondrijski DNA. Barkodiranje je natančna, a zamudna tehnika, ki pa kljub vsemu v nekaterih primerih ni primerna (npr. introgresija med vrstami, močno predelane surovine). Zaradi vedno večjega pritiska na ribolovne vire in številnih ugotovljenih goljufij s hrano, so bile po celem svetu opravljene študije , da bi ocenili obseg goljufij in gospodarske škode, ki je s tem povzročena. Rezultati so pokazali, da je v ribiških proizvodih (od filetov do bolj predelanih proizvodov) velik delež napačno prepoznanih vrst. Za Slovenijo so bili na voljo zelo skopi podatki. V študiji Evropske komisije (EK) je navedeno, da je bilo pri nas v letu 2015 približno 1 % napačno določenih ribjih vrst, ko so testirali filetirane ribe. V Sloveniji je za testiranje filetov v uporabi barkodiranje COI. Metoda je zanesljiva, vendar ima omejitve, ko gre za toplotno ali močno predelane proizvode ali pa nizko vsebnost sestavin. Problem je prepoznala tudi EK in Komisija za ribištvo. Prav tako se pojavljajo zahteve s strani različnih deležnikov (MKGP, predelovalna industrija, ozaveščeni potrošniki…) po znanju in metodah, s katerimi je možno zanesljivo in hitro ugotavljati poneverbe ribiških proizvodov. Cilji predlaganega projekta so bili pregledati ponudbo ribiških proizvodov na slovenskem tržišču in ugotoviti, kateri so najbolj rizični ribiški proizvodi in vrste, ki jih je potrebno nadzirat in preverjat identiteto deklariranih vrst, katere vrste so tržno najbolj pomembne in kolikšna je verjetnost, da so napačno identificirane. Prav tako je nujno potrebno vpeljati ustrezne napredne tehnologije DNA (metabarkodiranje na osnovi NGS, Q-PCR, LAMP) za odkrivanje poneverb v ribiških proizvodih. Pregled literature Ribištvo in akvakultura zagotavljata na svetovni ravni približno 20 % prebivalstva glavni vir živalskih beljakovinah in približno 7 % vseh beljakovin, ki jih porabi človeštvo. Od leta 1960 je narasla poraba rib v povprečju od 9,9kg naprebivalca, v 90ih je bila že 14,4 kg in v 2013 je dosegla 19,7 kg na prebivalca ter v letu 2017 je bila poraba rib 24,4 kg na prebivalcav Evropski uniji (EU). V letu 2014 je proizvodnja v ribištvu znašala 167 milijon ton, od tega je ribolov prispeval 93 milijonov ton (FAO, 2016, Campbell in Pauly, 2013, Pauly in Zeller, 2017). Ribe so bile v zadnjih desetletjih intenzivno reklamirane kot zdrava lahko prebavljiva hrana in vir koristnih maščobnih kislin za zdravje ljudi, kar predstavlja velik pritisk na ribolovne vire. Ribolov pa postaja vedno bolj nevzdržen za morske ekosisteme in ogroža prehransko varnost milijardam prebivalcev (FAO, 2018). Zaradi tega je v vzponu akvakultura rib, rakov in mehkužcev v celinskih in somorničnih vodah (predvsem na Kitajskem in v sosednjih državah), ki zagotavlja hrano in zaslužek podhranjenemu prebivalstvu in je pomembna izvozna panoga v razviti del sveta. V Sloveniji so leta 2016 gospodarski ribiči iztovorili 152 ton svežih ribiških proizvodov, kar je glede na leto 2015 za 22 % manj iztovorjene mase, povečal se je iztovor rakov, glavonožcev školjk in polžev. Povečala se je tudi vzreja morskih mehkužcev za dobrih 5 % in proizvodnja v marikulturi je znašala 664 ton. Ulov iz prostočasnega ribolova je prispeval 15 ton. V ribogojnicah v celinskih vodah je bilo v letu 2016 vzrejenih skoraj 241 ton rib, izlov športnega ribolova v celinskih vodah je znašal 142 ton (Filipi, 2016). V finančni perspektivi (2011-2027) bo EK namenila več denarja za prehransko varnost EU preko trajnostnega in konkurenčnega ribištva ter trajnostni modri rasti, večji poudarek bo na malih priobalnih ribičih. Kljub mednarodnemu in državnemu upravljanju se ribištvo spopada z dvema glavnima težavama: 1.) ilegalen, neprijavljen, nereguliran (IUU) ribolov in 2.) poneverbe ribiških proizvodov, ki v prvi vrsti prizadenejo potrošnike. Termin ribiški proizvod se nanaša na ribe in ostale ribolovne vrste, vse od ulova (vključno z akvakulturo) do prodaje in zajema vse prodajne oblike od cele ribe do predelanih proizvodov kot so fileti in paštete. Poneverbe ribiških proizvodov so možne v celotni verigi od ulova do prodaje (Fiorino in sod., 2018). Poneverbe so najpogosteje zamenjave ribolovnih vrst, ki so lahko nenamerne ali celo namerne zaradi različnih vzrokov kot so posledica slabega poznavanja taksonomije ribolovnih vrst, prikrivanje nelegalnega ulova, zamenjava zaščitene vrste z vrsto, ki ni pod regulacijo, nepravilno označevanje geografskega izvora rib, prikrivanje uporabljenih ribolovnih orodij. Poneverbe v okrbni verigi v ribištvu niso zanemarljive, lahko so vzrok resnih zdravstvenih problemov za potrošnike (zastrupitve, alergije…), zmanjšujejo njihovo zaupanje v ribiške proizvode, vplivajo na obseg davkov ter so tudi vir gospodarske škode za državo, saj vplivajo na prihodke ribičev in distributerjev. Poneverbe vplivajo na izkoriščanje ribolovnih virov in na vzdržnost ekosistemov v katerih poteka ribolov in akvakultura. Ribištvo je nadzorovana in zelo upravljana gospodarska panoga, za članice EU je pomembna Skupna ribiška politika in številne mednarodne organizacije, ki delujejo na določenem geografskem območju in se ukvarjajo z upravljanjem določenih vrst rib. Prav tako se EU trudi zagotoviti sledljivost ribiških proizvodov ter ponuditi potrošnikom zanesljive in relevantne podatke o ribiških proizvodih (primer deklaracije na Sliki 1). EU s številnimi pravnimi akti ureja področje sledljivosti ribiških proizvodov -velja izpostaviti Uredbo Evropskega parlamenta in Sveta (ES) št. 854/2004 z dne 29. aprila 2004 o določitvi posebnih predpisov za organizacijo uradnega nadzora proizvodov živalskega izvora, namenjenih za prehrano ljudi (Ur. l. EU, št.139/2004). Uredba v uvodu določa ”(točka 23) Pristojni nacionalni organi, odgovorni za spremljanje in uveljavljanje izpolnjevanja obveznosti iz te uredbe, bi zaradi varstva potrošnikov morali izkoristiti vso razpoložljivo tehnologijo, tudi preverjanje DNK, da bi gospodarske subjekte odvrnili od lažnega označevanja ulova.” ter “(točka 26) Izboljšati je treba zbiranje, obdelavo in razširjanje ekonomskih informacij o trgih z ribiškimi proizvodi in proizvodi iz ribogojstva v Uniji.” Slika 1 Informacije za potrošnika –pomen deklaracije (vir: EK). Novejše študije kažejo, da je ribolov in celotna oskrbna veriga do prodaje zelo ranljiva in se v njej dogajajo poneverbe. Razlogi za ranljivost so posledica narave sektorja (lov, pretovor, predelava tudi večkratna predelava, distribucija do potrošnika…). Poneverbe v celotni verigi so tako obsežne in pomembne za različne vidike, da je EUROPOL-ova raziskava dokazala, da so ribji proizvodi tretja najbolj potvarjana skupina hrane (EUROPOL; 2016), medtem, ko je po mnenju Evropske komisije (EK) uvrščena še višje; na drugo mesto po potvarjanju sestavin. Evropska skupnost je poleg ZDA tudi najpomembnejši trg na katerem se prodajo izjemno velike količine rib in druge morske hrane (v EU je na voljo več kot 1200 vrst uvoženih iz več kot 120 držav, FAO, 2016). Podatki temeljijo v glavnem na študijah iz razvitih držav, medtem ko obseg težave ni znan v nerazvitih državah. Kompleksnost oskrbne verige v ribolovu in akvakulturi ter točke na katerih prihaja do zlorab so preučili Fox in sod. (2018) na primeru Velike Britanije. Avtorji so v članku obdelali goljufije v oskrbni verigi v akvakulturi (školjke in raki) in v ribolovu ter tudi analizirali vzroke in posledice. V sektorju ribolova so prepoznali tri skupine izjemno kritičnih točk: i.) ponarejanje, ki zajema zamenjave in ponarejanje vrst in podaljševanje roka uporabnosti; ii.) ponarejanje porekla ribištva, ki zajema zamenjave in zlorabe oskrbne verige ter iii.) kršenje etičnih načel v ribištvu, kamor sodi nezakonit, nereguliran in neprijavljen ribolov, uporaba nedovoljenih ribolovnih orodij in nehumano ravnanje z ujetimi živalmi. Slika 2 prikazuje kompleksnost oskrbne verige v ribištvu. Slika 2 Shema oskrbne verige v ribištvu in kompleksnost trgovanja z dobrinami, nekateri proizvodi prečkajo več državnih meja v oskrbni verigi, včasih prečkajo ozemlja brez strogih in določenih zahtev po sledljivosti (Oceana, 2016). Okusno, alergeno, ulovljeno ali gojeno? (vir: Oceana, 2016). Pereč problem so poneverbe ribiških proizvodov, kajti trgovanje z njimi je zelo kompleksno (D’Amico in sod., 2014). Taka kriminalna dejanja vplivajo na varnost in avtetičnost hrane. Poznamo različne oblike goljufij, ki se dogajajo v državnih in v mednarodnih prodajnih verigah z ribami in ribiškimi proizvodi. Ocene poneverb z ribiškimi proizvodi se zelo razlikujejo med državami, tako kot so različne zmožnosti določene države izvajati nadzor nad ribiškimi proizvodi, proizvajalci in prodajalci. Nadzor se opravlja preko dokazovanja sledljivosti in istovetnosti vrst v analiziranih proizvodih za kar so potrebni poleg zakonodajne ureditve tudi usposobljeni laboratoriji, ki opravljajo testiranja. Z napredkom metod molekularne identifikacije, kot je barkodiranje DNA in naslednja generacija sekvenciranja (NGS) so na voljo možnosti za večjo preglednost v prodajni verigi z ribiškimi proizvodi (Littlefair in Claire, 2016, Giusti et al., 2017). Boj proti poneverjanju v ribištvu je zelo kompleksna naloga, ki vključuje več državnih agencij, ki imajo ustrezna pooblastila, hkrati pa področje urejajo številni zakoni, ki pokrivajo različne vidike poneverb s hrano. Odgovornost je razdeljena med državne nadzorne organe, specializirane agencije, organe pregona. Vrednost trgovanja z ribiškimi proizvodi se je v zadnjih 40 letih povečal za 0.8 milijon ton, vrednost trgovanja je leta 1974 znašala 1,3 milijarde dolarjev, v letu 2012 pa že 16.5 milijarde dolarjev (NOAA; 2013). Dosedanje študije so kot identifikacijsko orodje uporabljale barkodiranje in kot genetski marker so uporabili COI ali cyt b ter nato primerjali dobljena nukleotidna zaporedja s podatki oziroma nukleotidnimi zaporedji v javnih podatkovnih zbirkah in v referenčnih zbirkah (GenBank, BOLD, FISHBOLD, Refence Standard Sequence Library (RSSL) for Seafood Identification FDA, itd.). Težavo predstavljao referenčne zbirke nukleotidnih zaporedij, ki so redke oziroma jih dopolnjujejo le redki laboratoriji. Pomembno je tudi poudariti, da ni standardizirane zbirke sekvenc, ampak so v uporabi že prej naštete in le nekaj laboratorijev ima svoje referenčne podatkovne zbirke v ključno z vavčerskimi vzorci. To je pomembno dejstvo, ker se v mnogih javnih zbirkah sekvence ne ujemajo s pravo vrsto in je potrebna velika mera previdnosti za izločitev takšnih sekvenc. Podrobnejši pregled po nekaterih pomembnih trgih pokaže zelo skrb vzbujajoče podatke; v ZDA je najbolj pogosto zamenjana vrsta rdeči hlastač (Lutjanus sebae) in sicer v 75 % primerov (Marko in sod., 2004), nekatere vrste iz rodu Lutjanus so celo na Rdečem seznamu ogroženih vrst IUCN (http://www.iucnredlist.org/search?page=2). Nevladna organizacija OCEANA redno objavlja rezultate svojih neodvisnih študij poneverjanja ribiških proizvodov in njihovi podatki potrjujejo, da je v ZDA v maloprodaji kar 33 % hrane iz morja z napačno identificiranimi vrstami (Warner in sod., 2013), najnovejša študija je pokazala, da je 16,5 % rib v ribjih restavracijah napačno identificiranih (Ksaksar in sod., 2015), medtem ko je v sushi barih ta delež izjemno visok in znaša 47 % napačno identificiranih rib (Willette, 2017), kar je posledica uvoza rib iz azijskih trgov, predvsem iz Kitajske. Tudi v Kanadi so poneverbe ribolovnih vrst zaskrbljujoče, kajti 41 % vzorcev je bilo napačno identificiranih (Hanner et al., 2011). EK je po škandalu s konjskim mesom naredila nadzorni pregled na trgu bele ribe, ki je bil opravljen na 4000 vzorcih v 29 državah, ki je pokazal skladnost med identifikacijo na deklaraciji in testiranjem v 94 % (EK, 2015), medtem ko študije narejene po posameznih evropskih državah in po večjem številu raznovrstnih ribiških proizvodih kažejo mnogo bolj zaskrbljujočo sliko. Študija iz Italije pokaže 22,5 % napačno označenih proizvodov in med njimi so največkrat glavonožci (43,8 %), raki (17 %) in ribe (14 %) v glavnem uvoženi iz JV Azije (Guardonone in sod., 2017), medtem ko je ta odstotek na jugu Italije še višji (42,8 %) in gre predvsem za napačno identifikacijo osličev, bokoplavut (morskih listov, plošče, iverke) in lososov. Pod njihovimi imeni so prodajali sladkovodne vrste azijskih somov iz akavakulture, kajti prej omenjene vrste rib so zelo cenjene in dosegajo višje cene (Slika 3). Na Sardiniji je delež poneverb še višji (82 % v maloprodaji) (Meloni, Piras, Mazzete, 2015). Slika 3 Okusno, alergeno, ulovljeno ali gojeno? (vir: Oceana, 2016). Pomembna je tudi osveščenost potrošnikov oziroma njihova občutljivost za poneverbe ribiških proizvodov. Nedavna študija, ki so jo opravili v šestih evropskih državah (Velika Britanija, Irska, Belgija, Španija, Italija in Grčija) v kateri so preverili kako dobro potrošniki poznajo ribolovne vrste z lokalnih trgov. V anketo je bilo zajetih 720 ljudi, ki so jih naključno izbrali v velikih trgovskih centrih ter jim pokazali slike izbranih vrst rib (skuša, brancin, morski list, sardon, losos, polenovka). Anketirance so vprašali pod katerim imenom poznajo vrsto in zabeležili vse odgovore ter kolikokrat na mesec jedo ribe ali druge morske sadeže. Rezultati niso bili spodbudni, saj je le 30 odstotkov vprašanih pravilno prepoznalo vrste s fotografij, najslabše rezultate so dosegli potrošniki iz Velike Britanije, medtem ko so bili najboljši poznavalci potrošniki iz Španije. Potrošniki so najbolje prepoznavali vrste, ki izvirajo iz lokalnega okolja in so najbolj pogoste na njihovem trgu. Zavedati se je treba, da je ponudba odvisna od prehranjevalnih navad, ki se razlikujejo od države do države (VB, Irska, Francija prevladujejo vrste iz družin Gadidae in Salmonidae, v Nemčiji bokoplavute, v Španiji in Portugalskem osliči, sardele in sorodne vrste iz družine Clupeidae in tuni). Največ kupcev iz Velike Britanije je odgovorilo, da nikoli ne jedo rib ali morskih sadežev. Ugotovili so, da ozaveščeni kupci bolje prepoznajo vrste rib, na njihovo izbiro vplivajo informacije z embalaže in informacije o izvoru proizvoda. Avtorji so rezultate pospremili z mislijo, da dokler ne bodo potrošniki vzpostavili boljše povezave s hrano (odtujenost od pridelave oziroma ribolova), ki je na krožniku, bodo še naprej odprte možnosti za zlorabe v oskrbni verigi (Cusa in sod., 2021). Potrošniki imajo pomembno vlogo, a morajo biti osveščeni in se zavedati, da lahko s svojim vedenjem vplivajo na trg rib. Identifikacija marsikatere ribolovne vrste na osnovi analize DNA je znanstveno izvedljiva in že uveljavljena kot neodvisno in nepristransko orodje ter služi tudi kot dokazno gradivo v sodnih postopkih (glej tudi Martinsohn, 2011). Poznavanje molekulskih markerjev (npr. SNP, COI, rDNA) ter demografskih značilnosti nekaterih najbolj izkoriščanih populacij (npr. v Severnem morju, Baltiku, Sredozemskem morju) omogočajo zanesljivo identifikacijo vrst, kot tudi prepoznavanje njihovega geografskega izvora (Nielsen in sod., 2012). Najpogosteje uporabljene metode vključujejo izolacijo DNA, pomnoževanje genskega markerja, sekvenciranje in primerjavo pridobljenega zaporedja s podatki v javnih ali tudi internih referenčnih zbirkah. Metoda se imenuje “DNA barkodiranje” (angl. DNA barcoding). Za barkodiranje uporabljamo 655 bp dolg fragment (COI) (Hebert in sod., 2003) in jo uporablja tudi Ameriška agencija za hrano in zdravila (FDA) pooblaščena za nadzor nad ribiškimi proizvodi (Handy in sod., 2011). COI primerjamo s podatki iz zbirk: (1) FISH-BOL (http://www.fishbol.org/), nastala v sodelovanju z mednarodnim projektom Barcode of Life (iBOL, http://ibol.org/phase1/); (2) “Reference Standard Sequence Library (RSSL) for Seafood Identification” (https://www.accessdata.fda.gov/scripts/fdcc/?set=seafood_barcode_data), ki jo je vzpostavila Ameriška agencija za hrano in zdravila (FDA), in vsebuje več kot 1700 vrst; (3) GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) je pod okriljem Nacionalnega inštituta za biotehnološke informacije (NCBI) v ZDA ter (4) podatkovna zbirka »The Barcode of Life Data System (BOLD). Slabosti barkodiranja COI so razgradnja DNA med postopki predelave rib (Pardo in Perez, 2004; Chapela in sod., 2007; Wong in Hanner, 2008), prisotnost aditivov, ki preprečujejo uspešnost izolacije in pomnoževanja DNA ali pa heteroplazmija in introgresija, kot je to pri nekaterih vrstah tunov, salmonidov, rodu Mytilus (Pardo in sod., 2015), kjer je potrebno uporabiti druge markerje za “DNA barkodiranje”. V predelanih ribiških proizvodih je uspešnost boljša z metodo “mini DNA barkodiranje”, ki temelji na uporabi krajše regije gena COI (Armani in sod., 2015) oz. seta regij v dolžini od 127 do 314 bp (Shokralla in sod., 2015). Raziskovalcem je uspelo izboljšati uspešnost pomnoževanja COI v predelanih proizvodih z uporabo mini barkod (Pollack in sod., 2018). Na osnovi markerjev SNP je možno identificirati geografsko poreklo vzorcev znotraj vrst (Gadus morhua, Clupea harengus, Solea solea in Merluccius merluccius) zaradi genske adaptacije na okoljske razmere (Nielsen in sod., 2012). Za namen identifikacije rib je možno uporabiti metode Q-PCR, ki so hitrejše in cenovno ugodnejše. Potreben je razvoj in optimizacija za posamezno vrsto, vendar so ravno zaradi tega tudi veliko bolj specifične in omogočajo detekcijo že zelo majhnih količin DNA in so uporabljene za potvorbe trske (Gadus morhua) spacifiško trsko (Gadus macrocephalus) in aljaškim polakom (Gadus chalcogrammus) (Taboada in sod., 2017, Tomás in sod., 2017). Glede na veliko število vrst, ki so lahko prisotne v hrani ter glede na precejšnje število metod, ki so laboratorijem na voljo, je potrebna harmonizacija metod za testiranje ribiških proizvodov na nivoju EU (Griffiths in sod., 2014). Trenutno v EU še ni dorečeno katere so uradno potrjene metode za preverjanje identitete vrst (glej tudi predpise s področja označevanja in sledljivosti 104/2000, 2065/2001, 01224/2009 in 404/2001). Kot je prikazano je problematika zaskrbljujoča, medtem ko napredek pri uvajanju tehnik na osnovi DNA tehnologije ni zadosten navkljub znanstvenemu in tehnološkemu razvoju na področju analiz DNA, kar je poudarjeno tudi v poročilu JRC (Martinson, 2011). V Sloveniji nimamo podrobnih rezultatov o tem kaj se dogaja v maloprodaji, medtem ko se barkodiranje opravlja na zahtevo Urada za varno hrano (MKGP) v pooblaščenem laboratoriju ali na zahteve prodajalca. Obseg težave v Sloveniji ni bil raziskan, še posebej ne za predelane ribiške proizvode in na voljo ni študije, ki bi opisala obseg poneverb v ribiških proizvodih v Sloveniji. Leta 2015 je Evropska komisija opravila študijo, v kateri so testirali skoraj 4000 vzorcev morske hrane, v kateri so bile deklarirane pridnene bele ribe, rezultati so pokazali da je bilo samo 6 % vzorcev napačno označenih. Vendar je slika drugačna, ko podatke razčlenimo po državah in glede na vrste rib, ki so napačno označene. Uradni podatki te študije so pokazali, da je v Sloveniji bilo napačno označenih 1 % pregledanih proizvodov (European Commission, 2015). Med najbolj poneverjanimi so vrste iz družine Serranidae (zobčasti ostriži), med katerimi je delež napačno označenih proizvodov znašal 31 %. V ZDA so vrste zobčastih ostrižev (ang. grouper) zelo cenjene v ribjih hamburgerjih in podobno ter so najbolj poneverjene (Ulrich in sod., 2015). Do sedaj financirani CRP projekti namenjeni ribištvu so maloštevilni ter so obravnavali i.) onesnažila v ribah na slovenskem tržišču (težke kovine, PCBje) ter ugotavljali senzorične lastnosti izbranih vrst rib (CRP V4-1120, 2011 -2014), ii.) sinergijske učinke ribištva in turizma na slovenski obali (V5-1013, 2010-2012, iii.) ukrepe za ohranjanje ogroženih sladkovodnih vrst, medtem ko problematika poneverjanja ribiških proizvodov na slovenskem tržišču še ni bila obravnavana. Problematika poneverb v ribiški industriji je bila obravnavana v preteklih EU projektih, ki so bili zelo odmevni ter prinesli nova spoznanja o metodah za študij populacijske genetike izkoriščanih populacij ter genskih markerjih, ki so uporabni za ugotavljanje geografskega izvora ulovljenih rib (npr. LABELFISH (INTERREG IVB), FishPopTrace, SEAFOOD, FishTrace idr.), medtem ko se v zadnjih treh letih pojavljajo projekti, ki se posvečajo zamenjavam vrst in drugim odklonom ter kršitvam v oskrbni verigi v ribištvu ter razvoju metod za identifikacijo vrst (npr. SEATRACES, SeaFoodTomorrow). Rezultati DELOVNI SKLOP 1: Izdelava standardiziranega molekularnega testa za zanesljivo identifikacijo svežih in predelanih ribiških proizvodov. DS1.1: Vzorčenje, obdelava vzorcev in biološkega materiala Z vzorčenjem biološkega materiala po ribarnicah in trgovskih verigah smo začeli v januarju 2019 in smo ga končali v marcu 2019. V prvih vzorčenjih smo preizkusili načrt vzorčenja, ki je obsegal izbor ribiških proizvodov, zbiranje podatkov z deklaracije in njihovo shranjevanje ter arhiviranje, fotografiranje in odvzem biološkega vzorca za analize DNA v laboratoriju, shranjevanje tkiv in njihovo označevanje ter anonimizacija vzorcev ter zagotovitev sledljivosti vzorcev. V trgovskih verigah in ribarnicah smo vzorčili zamrznjene ali sveže filetirane proizvode, ribje konzerve in lignje (Slika 4), kar je bilo v trenutku vzorčenja na voljo. Zbrani biološki material smo v laboratoriju najprej fotografirali in dokumentirali (Slika 4, 5 in 6). Za vsak tip vzorčenega biološkega materiala smo pripravili tabele za zbiranje podatkov glede na vrsto ribiškega proizvoda in z njim povezanih podatkov (datum, lokacija, ime proizvoda, trgovsko ime vrste, zapisano znanstveno ime, oblika ponudbe, način shranjevanja, ribolovno območje, država porekla, ribolovno orodje, način proizvodnje, cena, oznaka veterinarskega žiga, proizvajalec, blagovna znamka). Vse naštete podatke, ki so bili navedeni na deklaraciji smo zbrali v tabelah. Zbrani podatki služijo za pripravo podatkovnega modela in za pripravo šifrantov (sodelovanje z Zavodom za ribištvo Slovenije-ZZRS). Slika 4 Primer vzorčenega biološkega materiala v trgovskih verigah in ribarnicah (fileti (levo) in lignji (desno). Konzerve. V trgovskih verigah smo vzorčili konzerve, ki vsebujejo vrste iz družine Clupeidae, zbrani material je deklariran kot vrste Sardina pilchardus, Sprattus sprattus, Engraulis encrasicolus, E. ringens po podatkih na deklaraciji. Ugotovili smo, da je ponudba konzerv zelo raznolika in se razlikuje po trgovskih verigah. Najbolj raznoliko ponudbo omenjenih konzerv ima E. Leclerc in Spar, medtem ko je najbolj skromna ponudba v Tušu. Vzorčenih je bilo 36 konzerv različnih blagovnih znamk. Fotografirali smo embalažo, ribice v konzervi ter prepisali vse informacije z deklaracije za nadaljno analizo (Slika 5). V vsaki konzervi smo najprej pregledali vse ribe v konzervi in preverili ali so med deklarirano vrsto še druge vrste, ki jih je možno razločiti že po videzu. Za DNA testiranje smo izbrali osebke, ki po izgledu niso sodili v deklarirano vrsto, označeno na deklaraciji ter tri naključno izbrane osebke (Slika 5). Od vsakega izbranega osebka smo shranili tri koščke tkiva v tri 2 mL mikrocentrifugirke in jih prelili z 96 % etanolom ter shranili na -20 °C za zbirko tkivnih vzorcev in nadaljne analize. Odvzeta tkiva za testiranje s Q-PCR testom, ki smo ga razvili v tem projektu (glej poglavje DS1.3 za opis testa), tkiva smo pred analizo obdelali po posebnem postopku. Vzorce tkiv smo najprej razmastili z mešanico kloroforma, metanola in destilirane vode v razmerju 1:2:0,8. Tkivo smo dali v 2 mL mikrocentrifugirko skupaj s pufrom za razmastitev in jih pustili na sobni temperaturi in v temnem prostoru do naslednjega dne in šele nato izolirali celokupno DNA. Slika 5 Fotodokumentirana embalaža, vsebina konzerve in posamezni osebki pred nadaljnjo obdelavo. Referenčni material za testiranje v konzervah. Za razvoj in optimizacijo molekularnega testa za pomnoževanje 16S rDNA s Q-PCR smo zbrali sveže ribe iz družine Clupeidae, ki predstavljajo referenčni material za testiranje rib v konzervah in so vključene v referenčno zbirko tkiv in DNA, ki je na Morski biološki postaji, Nacionalni inštitut za biologijo. Zbrali smo naslednje vrste iz družine Clupeaidae: navadna sardela (Sardina pilchardus), sardon (Engraulis encrasicolus) in papalina (Sprattus sprattus). Nekaj osebkov referenčnih vrst je na Sliki 6, od vsake vrste smo shranili vsaj 10 osebkov zaradi variabilnosti v nukleotidnih zaporedjih 16S rDNA. Zbirko bomo povečevali s priložnostnimi vzorci tudi v prihodnje. Slika 6 Foto dokumentirani posamezni osebki referenčnega materiala pred nadaljnjim shranjevanjem in izolacijo DNA. V trgovskih verigah smo vzorčili tudi predelane ribje proizvode (ribje palčke, surimi ipd.) in do sedaj povzorčili 11 vrst različnih proizvodov. Vzorčili smo tudi filete in glede na deklaracije smo do sedaj na tržišču našli filete treh vrst tunov in ene vrste lososa. Od vsakega fileta lososa ali tune smo odvzeli tri koščke tkiva, jih prav tako prenesli v 2 mL mikrocentrifugirke in jih shranili v 96 % etanolu ter shranili na -20 °C. Dva koščka tkiva smo uporabili za izolacijo DNA (torej dve ponovitvi za posamezen filet), tretji košček tkiva pa shranili v skrinjo na -20 °C za morebitne dodatne analize in so del zbirke tkiv in DNA. Lignje smo vzorčili v 7 slovenskih mestih (Izola, Koper, Solkan, Nova Gorica, Celje, Maribor in Murska Sobota), med vzorčnimi mesti so bile tri majhne ribarnice (v Izoli, Solkanu, Mariboru), trgovske verige (Spar v Izoli in Murski Soboti, Lidl v Kopru, Hofer v Kopru, Merkator v Kopru in Nova Gorica, Tuš v Celju, E. Leclerc v Mariboru). V večini mest ni več manjših ribarnic (v Novem mestu, Murska Sobota), ampak so ribarnice v sklopu trgovskih verig kot so Spar in E.Leclerc. Na tržišču smo našli 7 vrst lignjev glede na podatke na deklaracijah (od tega je ena vrsta neidentificirana, Loligo vulgaris, L. gahi. L. duvaceli, L. chinensis, Loligo patagonica, Dasidicus gigas, Todarodes sagittatus) ter zelo neopredeljeno trgovsko ime z navedbo Loligo spp., ki so bili ulovljeni na različnih geografskih območjih (Slika 7). Skupaj smo nabrali 17 vzorcev lignjev v 11 prodajalnah (3 ribarnice in 6 velikih trgovskih verig). Za vsako deklarirano vrsto lignja smo vzorčili 10 osebkov. Od vsakega smo shranili tkivo v treh podvzorcih (3 mikrocentrifugirke) in še dodatno en košček tkiva na -20 °C za morebitne dodatne analize. V vsako 2 mL mikrocentrifugirko smo shranili tri koščke tkiva in jih shranili v 96 % etanolu ter shranili na ­20°C. Dva koščka tkiva od vsakega osebka smo uporabili za izolacijo DNA (torej dve tehnični ponovitvi za vsak osebek). Slika 5 Slikovno dokumentiranje vzorčenih lignjev (od leve proti desni: jadranski ligenj Loligo vulgaris, L. gahi, in neidentificirana vrsta), imena so zapisana enako kot na deklaracijah, kasneje smo preverili z barkodiranjem identiteto vrst. DS1.2: Genetska identifikacija referenčnega materiala Izolacija DNA. Za izolacijo DNA iz svežih celih rib, konzerviranih rib, filetov in lignjev smo optimizirali dva protokola, in sicer protocol CTAB-PVP, prirejen po Japelaghi in sod. (2011) in komercialni kit za izolacijo DNA E.Z.N.A Mollusc DNA Kit (OMEGA bio-tek). Izolacija DNA s kitom proizvajalca E.Z.N.A Mollusc DNA Kit (OMEGA bio-tek) je bila enostavnejša, izolirana DNA višje čistosti zaradi adhezije DNA na silikatnih kolonah. S protokolom CTAB-PVP smo pridobili večjo količino DNA, zato smo za vse nadaljnje vzorce uporabili to metodo. Poleg tega je metoda tudi cenovno ugodnejša. Protokol za izolacijo DNA je v Prilogi 1. Koncentracijo izolirane DNA smo izmerili s fluorimetrično metodo na fluorimetru Qubit™ v 3.0 (Invitrogen, ZDA) in s kompletom reagentov Quant® dsDNA BR Assay Kit (Invitrogen, ZDA). Za izolacijo DNA iz različnih vzorcev (sveži vzorci, zamrznjeni vzorci tkiv, prekuhani in naoljeni vzorci kot so ribje konzerve, ribje palčke) smo uporabili različne metode izolacije DNA od komercialnih kitov do klasičnih metod izolacije. Vzorce konzerv in ribjih palčk smo najprej v različnih raztopinah razmastili (heksan, mešanica kloroforma in izoamil alkohola), da bi pridobili čimbolj čisto DNA, za različne tehnike pomnoževanja, ki sse med sabo ločijo po občutljivosti (LAMP, Q-PCR testi, klasičen PCR). Rezultate je potrebno sistematično opisati in objaviti v strokovni literaturi. Genetska karakterizacija referenčnega materiala z markerjem COI. Za genetsko karakterizacijo lignjev smo uporabili univerzalne začetne oligonukleotide (Folmer in sod., 1994) in pomnoževanje s klasičnim PCR in testirali različne pogoje pomnoževanja (Tabela 2) ter preverili vpliv posameznih reagentov v PCR na učinkovitost pomnoževanja. Za osnovni PCR protokol smo uporabili protokol avtorjev Knebelsberger in sod. (2016), ter ga modificirali (glej Tabela 2), ena od bistvenih komponent je izbira primerne Taq DNA polimeraze (Thermo Fisher), ki omogoči optimalno pomnoževanje. Tabela 2 Reakcijska mešanica pomnoževanja v PCR za lignje. Reagenti Volumen [µL] Delovna koncentracija 10× PCR pufer 2,5 1× PCR pufer MgCl2 (25 mM) 2,0 2 mM dNTP (2 mM vsak) 2,5 0,2 mM vsak LCO1490 (10 pmol/µl) 0,5 0,2 pmol/µl HCO2198 (10 pmol/µl) 0,5 0,2 pmol/µl DNA-polimeraza (5 U/µl) 0,125 0,025 U/µl H2O 15,875 DNA 1 Skupni volumen reakcije 25 Tabela 3 Temperaturni profil pomnoževanja gena COI pri lignjih. Temperatura Čas 94 °C 2 min 94 °C 30 s ×35 55 °C 30 s 72 °C 60 s 72 °C 10 min 4 °C . Za ribje vrste sardela, sardon in papalina smo uporabili začetne oligonukleotide z oznako Fish (Ward in sod., 2005) in polimerazo GoTaq® DNA (Promega). Reakcija PCR je potekala v skupnem volumnu 15 µl (Tabela 4), po naslednjem temperaturnem profilu (Tabela 5): Tabela 4 Reakcijska mešanica pomnoževanja v PCR za vrste sardela, sardon in papalina. Reagenti Volumen [µL] Delovna koncentracija 5× PCR pufer 3 1× PCR pufer MgCl2 (25 mM) 1,2 2 mM dNTP (2 mM vsak) 1,2 0,2 mM vsak FishF1_2 (10 pmol/µl) 0,3 0,2 pmol/µl FishR1_2 (10 pmol/µl) 0,3 0,2 pmol/µl DNA-polimeraza (5 U/µl) 0,075 0,025 U/µl H2O 3,9 DNA 5 Skupni volumen reakcije 15 Tabela 5 Temperaturni profil pomnoževanja gena COI pri vrstah sardela, sardon in papalina. Temperatura Čas 94 °C 5 min 94 °C 30 s ×30 52 °C 30 s 72 °C 1 min 30 s 72 °C 10 min 4 °C . Uspešnost pomnoževanja DNA rib in lignjev v reakciji PCR smo pred nadaljnjimi analizami preverili na 1,8 % agaroznem gelu (Slika 6). Pričakovana velikost fragmenta COI je 600bp, kar je videti na Slika 6, kjer so naloženi na agarozni gel namnoženi fragmenti COI iz različni vrst lignjev. 1 kb 7/5 7/6 8/1 8/3 8/4 8/5 8/6 11/1 11/2 11/3 11/4 11/5 14/1 14/2 14/3 14/4 14/5 14/6 GeneRuler Slika 6 Rezultati pomnoževanja regije COI pri lignjih (zgoraj: oznake vzorcev). Po uspešnem pomnoževanju vzorcev rib in lignjev je sledilo čiščenje PCR produktov z reagentom Exonuclease I (ExoI, Thermo Scientific), ki razgradi začetne oligonukleotide, in z reagentom Thermo Sensitive Alkaline Phosphatase (FastAP, Thermo Scientific), ki razgradi nukleotide (A, C, G, T), ki se niso porabili v reakciji PCR. Sledila je priprava sekvenčne reakcije za pomnoževanje produktov za sekvenciranje v skupnem volumnu 10 µl. V tem PCR smo poprej očiščenemu produktu PCR (3,5 µl) dodali začetni oligonukleotid (začetni ali povratni oligonukleotid) v založni koncentraciji 10 µM (0,2 µl na vzorec), BigDye 3.1 terminator (0,5 µl na vzorec), 5x sekvenčni pufer (2 µl na vzorec) in vodo (3,8 µl na vzorec). Temperaturni profil sekvenčne reakcije je prikazan v Tabela 6. Tabela 6 Temperaturni profil sekvenčne reakcije za pomnoževanje gena COI pri vrstah sardela, sardon in papalina za sekvenciranje. Temperatura Čas 96 °C 3 min 96 °C 10 s ×50 50 °C 10 s 60 °C 4 min 72 °C 7 min 4 °C . Po končani sekvenčni reakciji smo produkte očistili in jih nato sekvencirali na genetskem analizatorju SeqStudio (Applied Biosystems). Za sekvenciranje vzorcev v postopku barkodiranja smo uporabili še komercialni servis Macrogen, kamor smo poslali prečiščene produkte PCR na sekvenciranje (76 vzorcev) obeh verig DNA. Nato smo v programu Chromas naredili konsenzusna zaporedja in ročno preverila vsako nukleotidno zaporedje in preverili bralni okvir z orodjem Expasy Tool (Swiss Bioinformatics Institute). Dobljena nukleotidna zaporedja rib in lignjev smo primerjali z obstoječimi podatki v javno dostopnih mednarodnih podatkovnih bazah (GenBank NCBI in BOLD) in tako potrdili, kateri vrsti pripadajo analizirani vzorci. Vse vzorce lignjev, ki smo jih povzorčili smo barkodirali in naredili filogenetsko drevo, da smo preverili ali so vrste, ki smo jih obravnavali filogenetsko ločene, ker iz literature teh podatkov nismo mogli pridobiti. V Prilogi 2 je prikazano filogeentsko drevo na osnovi COI markerja za vzorčene in referenčne vrste lignjev. Obširno je postopek in rezultati opisano v magistrski nalogi RUBINIĆ, Marko. Visokoosjetljivi DNA testovi za određivanje zamjena vrsta u plodovima mora : diplomski rad. Rijeka: [M. Rubinić], 2020. 103 f., ilustr. [COBISS.SI-ID 34083331]. DS1.3: Razvoj in optimizacija molekularnega testa na osnovi informativnih odsekov mitohondrijske DNA DNA predelanih rib, kot so konzerve, je zaradi toplotne obdelave razgrajena na krajše fragmente, ki so lahko krajši od 500bp. V takih primerih je težko pomnoževanje daljših markerjev kot je barkodiranje s COI. Identifikacija predelanih rib je zato uspešnejša s pomnoževanjem s Q-PCR, ki omogoča specifično detekcijo in kvantifikacijo DNA v zahtevnih vzorcih kot so vzorci z razgrajeno DNA, majhna količina matrične DNA, itd. Pregled literature in primerjava nukleotidnih zaporedij tarčnih vrst velika sardela Sardinella aurita, sardela Sardina pilchardus, papalina Sprattus sprattus, sardon Engraulis encrasicolous ter sorodnih vrst je pokazala, da je primeren marker 16S rDNA iz mitohondrijev. Primerjava nukleotidnih zaporedij je pokazala, da so določene regije 16S rDNA dovolj specifične za razlikovanje rodov znotraj družine Clupeidae in da je možno narediti identifikacijske teste, ki so specifični za vrsto. Razvili smo specifične molekularne sonde za odkrivanje vrst velika sardela Sardinella aurita, sardela Sardina pilchardus, papalina Sprattus sprattus, sardon Engraulis encrasicolous na osnovi 16S rDNA. Molekularni test za posamezno vrsto vključuje vodilni (F) in povratni (R) začetni oligonukleotid ter sondo, ki je označena z barvilom FAM in z dvojnima utiševalcema (ZEN in 3IABkFQ) (Integrated DNA Technologies) kot prikazuje Slika 7. Slika 7 Prikaz prileganja začetnih oligonukleotidov in sonde s fluorescentno oznako ter utiševalcema (Vir: Integrated DNA Technologies). Na osnovi obsežne primerjave nukleotidnih zaporedij iz omenjenih vrst, smo razvili naslednja zaporedja začetnih oligonukleotidov in sond na podlagi bioinformatske analize nukleotidnih zaporedij 16S rDNA: Test za Engraulis encrasicolous F: AGACGAGAAGACCCTATGGAGCT R:TGGTCGCCCCAACCTAAGA sonda: 5'-/56-FAM/AAC TCA ACA /ZEN/ AGT CCT AAA TAC CCG CAG CCT T/3IABkFQ/-3' Test za Sardina pilchardus F: AGACGAGAAGACCCTATGGAGCT R:TCGCCCCAACCGAAGA sonda: 5'-/56-FAM/AGC ACC CTA /ZEN/ CAC CAG GGC CCA AAC/3IABkFQ/-3' Test za Sardinella aurita F: AGACGAGAAGACCCTATGGAGCT R:TCGCCCCAACCGAAGA sonda: 5'-/56-FAM/AGA TGC TCT /ZEN/ AAA CAA CGC GGT CCT GGT A /3IABkFQ /-3' Test za Sprattus sprattus F: AGACGAGAAGACCCTATGGAGCT R:TCGCCCCAACCGAAGA sonda: 5'-/56-FAM/CCC ACC AAT /ZEN/ CAT GAA AAG CAA GTC TCA GTT /3IABkFQ /-3' Specifičnost 16S rDNA molekularnih testov za identifikacijo posamezne vrste smo najprej testirali na svežem referenčnem tkivu navedenih vrst. Za testiranje smo uporabili reagente PerfeCTa qPCR ToughMix (Quanta bio) in reakcijsko mešanico pripravili po navodilih proizvajalca (Tabela 7). Tabela 7 Reakcijska mešanica za Q-PCR za testiranje specifičnosti razvitih molekularnih testov na osnovi 16S rDNA za izbrane vrste rib. Reagent Volumen [µL] Delovne koncentracije Ultra čista voda 3 Vodilni začetni oligonukleotid (10 µM) 0,8 0,4 µM Povratni začetni oligonukleotid (10 µM) 0,8 0,4 µM Sonda 0,4 0,2 µM Master Mix 10 DNA 5 Skupni volumen reakcije 20 Pomnoževanje vzorcev DNA je potekalo v aparatu LightCycler 96 (Life Science, Roche) po temperaturnem profilu predstavljenem v Tabela 8. Tabela 8 Temperaturni profil reakcije PCR v aparatu LightCycler 96. Korak PCR reakcije Temperatura Čas pomnoževanja Denaturacija DNA 95 °C 600 s 2-stopenjsko pomnoževanje 95 °C 10 s (hitrost segrevanja 4,4 °C) × 45 ciklov 60 °C 30 s (hitrost ohlajanja 2,2 °C) Ohlajanje 37 °C 30 s S testiranjem molekularnih testov na referenčnem materialu smo potrdili specifičnost molekularnih testov za vrste sardela Sardina pilchardus, inčun Sprattus sprattus in sardon Engraulis encrasicolous (Slika 8). Specifičnosti molekularnega testa za vrsto Sardinella aurita nismo testirali, ker nismo imeli na voljo refrenčnega materiala. Omenjen molekularni test smo preizkusili na vrsti Sardina pilchardus, kjer nismo ugotovili navzkrižnega pomnoževanja.Z navzkrižnim testiranjem smo preverili tudi specifičnost drugih molekularnih testov. Pri nobeni kombinaciji nismo zaznali nespecifičnega pomnoževanja in zato sklepamo, da so razviti molekularni testi vrstno specifični, kot prikazuje Slika 8. Slika 8 Prikaz pomnožitvenih krivulj (zgoraj) in prikaz plošče s pozitivnimi rezultati (zelena barva) in negativno kontrolo (rdeča barva) za vrste sardela Sardina pilchardus, sardon Engraulis encrasicolous in inčun Sprattus sprattus. Q-PCR omogoča kvantifikacijo specifičnih molekul DNA v vzorcu, zato smo testirali občutljivost razvitih molekularnih testov za kvantifikacijo DNA specifične vrste. Pripravili smo standardne raztopine DNA različnih redčitev in pripravili umeritveno krivuljo iz naslednjih količin DNA: 10 ng, 5 ng, 1 ng in 0,5 ng. Umeritvena krivulja prikazuje odvisnost med kvantifikacijskimi cikli (cikel, pri katerem fluorescenca vzorca preseže fluorescenco ozadja, ang. quantification cycle, Cq) in desetiškim logaritmom začetne količine tarčne DNA. Slika 9 prikazuje primer pomnožitvene krivulje in Slika 10 umeritveno krivuljo za kvantifikacijo DNA v referenčnem vzorcu sardele Sardina pilchardus. Slika 9 Primer pomnožitvenih krivulj standardnih raztopin za vrsto sardela Sardina pilchardus. Novo razvite molekularne teste smo nato testirali na ribjih konzervah. Vzorce sardele smo testirali z molekularnima testoma za Sardina pilchardus in Sardinella aurita, vzorce sardona s testom za Engraulis encrasicolous in vzorce papaline s testom za Sprattus sprattus. DS1.4: Testiranje in optimizacija Q-PCR testov Preverba specifičnosti razvitih molekularnih testov je bila predpogoj, da smo lahko začeli s testiranjem vseh vzorcev iz ribjih konzerv s Q-PCR za vrste sardela Sardina pilchardus, velika sardela Sardinella aurita, papalina Sprattus sprattus in sardon Engraulis encrasicolous. Za testiranje identitete navedene vrste na embalaži smo uporabili DNA, ki smo jo izolirali po postoku navedenem v poglavju DS1.2. Preverjali smo identiteto vrste, ki je navedena na deklaraciji na embalaži, v nekaterih primerih vrsta ni bila navedena (7 konzerv brez navedbe vrste). Analizirali smo 34 različnih konzerv, ki so pripadale 29 blagovnim znamkam, ki so glede na informacije na deklaraciji vsebovale vrste iz družine Clupeidae. Po podatkih na deklaracijah smo zbrali naslednje vrste: Engraulis encrasicolus, E. ringens, Sardina pilchardus in Sprattus sprattus. Med vsemi zbranimi konzervami so bile najbolj zastopane konzerve s sardelami (21 konzerv), sledile so konzerve s sardoni (10 konzerv), 2 konzervi s perujskimi sardoni in 1 konzerva s papalinami. Iz vsake konzerve smo v analizo vključili vsaj tri osebke: osebke, ki po videzu niso sodili v deklarirano vrsto, označeno na deklaraciji, oziroma tri naključno izbrane osebke. Skupno smo torej analizirali 34 konzerv in 102 vzorca DNA (Tabela 9). Vsi vzorci DNA so bili analizirani v dveh tehničnih ponovitvah. Tabela 9 Seznam analiziranih vrst rib ter število analiziranih konzerv in število posameznih osebkov. Vrsta ribe Število analiziranih konzerv Število analiziranih osebkov sardela (Sardina pilchardus) 21 62 sardon (Engraulis encrasicolus) 10 30 Perujski sardon (Engraulis ringens) 2 7 Papalina (Sprattus sprattus) 1 3 SKUPAJ 34 102 Vzorce sardel smo testirali s Q-PCR testom za vrsto Sardinella pilchardus in Sardinella aurita, da bi zagotovili nedvoumno identifikacijo vrste. Znano je namreč, da se vrsto sardela (Sardinella pilchardus) potvarja z vrsto velika sardela (Saridna aurita). Vzorce sardonov smo analizirali samo z molekularnim testom za Engraulis encrasicolus in vzorce papalin z molekularnim testom Sprattus sprattus. Konzerve s sardelami: v primeru ene konzerve (4 testirani osebki) z oznako, da vsebuje sardele, so bili rezultati analize negativni, kar pomeni, da ni bilo mogoče potrditi skladnost s poimenovanjem vrste na deklaraciji. Pri vseh ostalih 20 konzervah sardel je bilo pomnoževanje DNA uspešno z molekularnim testom za vrsto Sardina pilchardus. Vse te osebke smo testirali še z molekularnim testom za vrsto Sardinella aurita in v nobenem primeru ni prišlo do pomnoževanja. V vseh 20 konzervah smo potrdili pravilnost navedbe na deklaraciji in potrdili uporabnost testa za potrjevanje vrste Sardina pilchardus. Konzerve s sardoni: analizirali smo 10 konzerv s sardoni in dve konzervi s perujskimi sardoni. Pomnoževanje DNA je bilo uspešno v 10 konzervah, na katerih je bilo na deklaracijah navedeno, da gre za vrsto Engraulis encrasicolous. S tem smo potrdili pravilno označbo vrste na deklaracijah desetih konzerv. DNA iz vzorcev perujskih sardonov se s testom za vrsto Engraulis encrasicolous ni pomnožila, s čimer smo potrdili specifičnost testa za vrsto Engraulis encrasicolus. Testa za Engraulis ringens ni na voljo in zato tudi ni bilo moč potrditi pravilnosti navedbe na deklaraciji. Konzerva s papalinami: analizirali smo eno konzervo oziroma tri osebke in potrdili istovetnost z označeno vrsto na deklaraciji konzerve. DS2.2 Proučitev primernosti novo razvitih molekularnih testov za razvoj metode LAMP Za razvoj LAMP testa (angl. loop-mediated isothermal amplification oz. izotermalno pomnoževanje posredovano z zanko) za potrjevanje pristnosti živilskih proizvodov iz lignjev smo določili 4 kandidatne genske regije (16S rRNA, 18S rRNA, citokrom c oksidaza (COI) in citokrom b oksidaza (cytb)), ki so v uporabi tudi pri identifikaciji drugih živalskih vrst. Po javno dostopnih zbirkah sekvenc (GenBank, BOLD http://boldsystems.org/ ) smo poiskali vse razpoložljive sekvence od vsake genske regije po vrstah lignjev, ki smo jih s popisom ugotovili na slovenskem tržišču glede na deklaracije: Doryteuthis gahi, Dosidicus gigas, Illex coindetii, Loligo forbesi, Loligo reynaudii, Loligo vulgaris, Urotheuthis chinensis. Regija na mitohondrijski DNA, oz. del zaporedja encima citokrom oksidaze podenota I (COI, Folmerjeva regija v dolžini 650 bp) je bila v podatkovnih zbirkah najbolj zastopana za proučevane vrste in je zato služila kot osnova za razvoj metode LAMP. Za vzpostavitev lastne zbirke nukleotidnih zaporedij tržno dostopnih vrst lignjev v Sloveniji (vzorčenje opravljeno v 16 trgovinah po Sloveniji, 1 trgovina predstavlja 1 vzorec z 10 osebki) smo v pridobljenih vzorcih pomnožili regijo COI in določili nukleotidno zaporedje. Nekateri vzorci so zahtevali še dodatno optimizacijo pomnoževanja s PCR (sprememba temperaturnega profila, zamenjava Taq polimeraze), da je bilo njihovo pomnoževanje uspešno (Tabela 2). Vsa zbrana nukleotidna zaporedja regije COI za omenjene vrste lignjev smo poravnali ter odbrali tiste, ki so se z referenčnimi sekvencami (iz podatkovne zbirke BOLD ter zaporedja, ki smo jih pridobili s sekvenciranjem regije COI lastnih vzorcev) najbolj ujemale in jih ocenili kot verodostojne za nadaljne analize in kot uporabne za izdelavo metode LAMP. Poudariti je potrebno, da je pri odbiranju nukleotidnih zaporedij za razvoj metod potrebna velika previdnost, saj je objavljenih veliko nezanesljivih zaporedij, ki niso povezana s taksonomsko določitvijo analiziranega osebka, kar povzroča velik šum pri analizi ali celo napake. Še posebej smo bili pozorni ali zaporedje izvira iz znanstvene objave in na spremljajoče podatke o analiziranem osebku: dokumentirana taksonomska določitev in vključitev v zbirko BOLD, geografski izvor, vrsta vzorca ali je bilo to sveže tkivo, predelano živilo ter tudi kakovost znanstvene objave. Vsako zaporedje je bilo ročno pregledano v programu ChromasPro 2.1.8 (Technelysium, 2018), preverjeno ali kodira pravi protein z orodjem ExPASy Translate Tool (Swiss Institute of Bioinformatics) z mitohondrijskim genskim kodom. Končni set podatkov po vrstah smo poravnali z uporabo programa MAFFT (Kazutaka Katoh, 2006) in dokončno obdelali s programsko opremo MEGA 10. 0.5 (2020). Na tako poravnanih sekvencah smo začeli z izdelavo začetnih oligonukleotidov za LAMP. Izmed vseh izbranih nukleotidnih zaporedij navadnega lignja smo identificirali 21 haplotipov (zaporedij, ki so se med seboj razlikovala vsaj na enem nukleotidnem mestu). Najbolj zastopano zaporedje vrste Loligo vulgaris smo določili za referenčno zaporedje. Zaradi ugotovljene znotrajvrstne variabilnosti na regiji COI smo k razvoju metode LAMP pristopili na način, da bi z enim setom začetnih oligonukleotidov lahko pomnožili nukleotidna zaporedja vseh haplotipov. Za razvoj začetnih oligonukleotidov za metodo LAMP smo uporabili prosto dostopno orodje PrimerExplorer v5, ki ima implementiran algoritem za načrtovanje specifičnih začetnih oligonukleotidov, t.j. da začetni oligonukleotidi pomnožijo le haplotipe izbrane vrste, tako da upošteva podatek, na katerih mestih v nukleotidnem zaporedju se druge vrste ločijo od referenčnega zaporedja navadnega lignja. Za identifikacijo variabilnih mest smo haplotipe ostalih vrst poravnali z referenčnim zaporedjem navadnega lignja z orodjem Clustal Omega in rezultat uporabili za pripravo vhodne datoteke za PrimerExplorer v5 s spletnim orodjem MorphoCatcher. Z orodjem PrimerExplorer v5 smo pridobili več setov začetnih oligonukleotidov za vsako vrsto posebej, med katerimi je bilo sedem takih, ki so bili določeni kot specifični za pomnoževanje le DNA navadnega lignja. Začetne oligonukleotide izbranih setov smo modificirali tako, da smo nukleotidna mesta, ki prilegajo na znotrajvrstna variabilna mesta, nadomestili z IUPAC oznako (s tem smo zagotovili, da začetni oligonukleotidi priležejo na zaporedja vseh haplotipov). Specifičnost setov začetnih oligonukleotidov smo preverili še z orodjem Primer-BLAST oziroma z R paketom primerTree, ki omogoča dostop do Primer-BLAST z uporabo programa R. Z IUPAC oznakami smo modificirali vseh 7 izbranih setov začetnih oligonukleotidov za metodo LAMP. Natančen opis bioinformacijskega dela razvoja metode LAMP je podrobno opisan v zaključni nalogi študenta Gregorja Grbca, s katero je uspešno zaključil študij Bioinformatike na Univerzi na Primorskem, FAMNIT (povezava do zaključne naloge https://www.famnit.upr.si/sl/studij/zakljucna_dela/view/934) DS2.3: Optimizacija standardiziranega molekularnega testa Testiranje testa LAMP v laboratoriju (NIB), kjer smo izdelali smo laboratorijski protokol za testiranje LAMP. Upoštevali smo priporočene standardne pogoje za reakcijo LAMP po navodilih Optigene Ltd., Horsham, UK (glej Tabela 10). Tabela 10 Priporočena koncentracija začetnih oligonukleotidov za 25,0 µL LAMP reakcijo Začetni oligonukleotid koncentracija F3 0,2µM B3 0,2µM FIP 0,2µM BIP 0,2µM LoopF 0,2µM LoopB 0,2µM Uporabili smo set reagentov proizvajalca GspSSD Master Mix (Kat. Št. ISO-001), ki ima primerne lastnosti: temperaturni optimum delovanja polimeraze je 65°C in zadovoljivo območje delovanja je od 60°C do 65°C. Preizkus reakcije je potekal 60 minut na 63°C in na 65°C, koncentracijski razpon DNA od 2 ng/µL do 15ng/µL in volumen reakcije 25,0 µL. Testiranje smo izvedli na referenčnih vzorcih lignjev Loligo vulgaris. Na osnovi znane velikosti mitohondrijskega genoma lignjev (Idiosepius sp. velikost mitohondrijske DNA je 16.183 bp) in koncentracije izolirane DNA smo ugotovili da imamo v vzorcih od 1.4x1010 do 2.86x1010 mitohondrijskih genomov, kar smo potrebovali za izračun redčenja DNA. Rezultat amplifikacije testa LAMP je bil pri obeh temperaturah negativen, kar pomeni da nismo mogli izdelati testa pod temi pogoji. Izdelava Q-PCR testa za identifikacijo lignjev s Q-PCR na osnovi Tm za različne matrične DNA. Izvedba poskusnega testiranja za ugotavljanje Tm -High Resolution Melting (HRM) na podlagi katere lahko ločimo molekule DNA (zaradi različne sestave baz se nekoliko loči tudi Tm) s sondo, ki je označena s fluorokromom SyberGreen. Za vsak test smo pripravili reakcijsko mešanico kot je navedeno v Tabela 11. V reakcijo smo dodali še 3 µL vzorca (neredčena izolirana DNA iz lignja). Analizirali smo vse referenčne vzorce lignja Loligo vulgaris ter po 3 vzorce iz vsake skupine (12 skupin), za vsak vzorec smo naredili 2 redčini (10x in 100x redčenje), skupaj smo analizirali 60 vzorcev. Za negativno kontrolo smo uporabili PCR vodo, za pozitivno kontrolo pa sintetizirano konsenzusno zaporedje COI narejeno na osnovi analiziranih COI nukleotidnih zaporedij iz lignja Loligo vulgaris, ki so ga sintetizirali po naročilu v podjetju Eurofins. Liofilizirano DNA smo raztopili v pufru TE na koncentracijo 10ng/µL in jo nato redčili še 100x, 1000x in 1.000 000x ter jih uporabili kot pozitivne kontrole v Q-PCR. Tabela 11 Reakcijske mešanice za ugotavljanje Tm za različne Q-PCR teste za Loligo vulgaris Test 1 Loligo vulgaris Reagent Končna koncentracija .l za 1 reakcijo (20.l) L.vulgaris_1FP (10 uM) 900 nM 1.8 L.vulgaris_1RP (10uM) 900 nM 1.8 2x Power SYBRGreen Mastermix 1x 10 PCR voda / 3.4 Test 2 Loligo vulgaris L.vulgaris_2FP (10 uM) 900 nM 1.8 L.vulgaris_2RP (10uM) 900 nM 1.8 2x Power SYBRGreen Mastermix 1x 10 PCR voda / 3.4 Test 3 Loligo vulgaris L.vulgaris_3FP (10 uM) 900 nM 1.8 L.vulgaris_3RP (10uM) 900 nM 1.8 2x Power SYBRGreen Mastermix 1x 10 PCR voda / 3.4 Rezultati: Testiranje vzorcev lignjev s testom SyberGreen za razločevanje vrst. Na sliki so profili Tm krivulj. Test smo ponovili še z vzorci, ki smo jih redčili še 10x (3µL DNA in 27 µL PCR vode) in 100x (3µL 10x redčine, 27µL vode). Za pozitivno kotrolo smo uporabili sintetizirano DNA lignja Loligo vulgaris, ki je bila redčena 1. 000 000x gBLOCK in ponovili vse tri teste (Test 1, Test 2 in Test 3) z različnimi referenčnimi vzorci lignjev Loligo vulgaris (glej Slika 11). Slika 12 prikazuje pomnoževanje COI v jadranskih lignjih Loligo vulgaris in drugih vrstah (Todarodes sagittatus, Illex coindetti ter v skupinah nabranih vzorcev); ugotovili smo da prihaja do navzkrižne reaktivnosti z ostalimi vrstami. Pri nekaterih vrstah kaže, kot da prihaja do inhibicije pomnoževanja, saj je rezultat 10x redčine slabši kot pri 100x redčenju vzorcev. Zaradi navzkrižne reaktivnosti z drugimi vrstami smo se odločili preizkusiti višjo temperaturo naleganja začetnih oligonukleotidov in sond pri 62°C (glej Tabela ). Tabela 12 Temperaturni profil pomnoževanja DNA lignjev s Q-PCR za določanje optimalne in specifične temperature pomnoževanja Postopek (Procedure): 02GPos32 Dejavnost Temperatura Čas Število ciklov (instrument) Hitrost segrevanja / ohlajanja UNG. aktivnost 50.C 2 min 1 1,6°C/s Aktivacija polimeraze 95.C 10 min 1 1,6°C/s Amplifikacija 95.C 62.C 15 s 60 s 45 ciklov 1,6°C/s HRM 95.C 60.C 95.C 15 s 15 s 15 s 1 1,8°C/min; 1,6°C/min; 0,03°C /s Rezultati pomnoževanja pri višji temperaturi so prikazani na spodnji sliki in tabeli. Test 1 Loligo vulgaris FP ATGAACAGTGTACCCCCCATTATC RP GACGGTCCTGCGTGAGAAAG SEQ-Loligo vulgaris ATGAACAGTGTACCCCCCATTATCTAGAAATCTTTCTCACGCAGGACCGTC Rezultati pomnoževanja s testom 1 so prikazani na Slika 13 in v Tabela 2, razvidna je navzkrižna reaktivnost Uroteuthis chinensis (100x redčena DNA), ki pa se kasneje pri višji redčitvi (1000x) ne pojavi več. Rezultat je potrebno še enkrat ovrednotiti. Tabela 13 Rezultati pomnoževanja pri 62°C za Test 1. Test 2 Loligo vulgaris FP GCTTCCCCCTTCACTGACACT RP CCTCTTTCTACAGCAGATGAAGCTAAT SEQ-Loligo vulgaris GCTTCCCCCTTCACTGACACTTTTATTAGCTTCATCTGCTGTAGAAAGAGG Pomnoževanje DNA izolirane iz Loligo vulgaris je potekalo uspešno in je v ciklu 16 že nastalo zadosti produkta, ki je povzročil povečanje intenzivnosti fluorescence in s tem zadostno količino produkta za detekcijo (Slika 14). Rezultat testa je pokazal, da bi lahko prišlo na navzkrižne reaktivnosti pri pomnoževanju DNA od Loligo vulgaris z vrsto Alloteuthis media (Tabela 1) pri pogojih kot so opredeljeni v Tabeli 11 in s setom začetnih olinukleotidov kot so navedeni za Test 2. Tabela 14 Rezultati pomnoževanja pri 62°C za Test 2. Test 3 Loligo vulgaris FP TAATAATTCGAACAGAACTAGGTAAACCC RP GATCATCATTTAACAGTGAACCGG SEQ-Loligo vulgaris TAATAATTCGAACAGAACTAGGTAAACCCGGTTCACTGTTAAATGATGATC Najbolj specifičen rezultat pomnoževanja DNA iz Loligo vulgaris smo dobili s Testom 3 in s temperaturo pomnoževanja pri 62°C (Tabela 4). V ciklu 16 je nastalo dovolj produkta za povečanje intenzitete fluorescence in za zanesljivo detekcijo signala (Slika 15), prav tako ni bilo opaziti navzkrižne reaktivnosti z drugimi testiranimi vrstami lignjev. Tabela 15 Rezultati pomnoževanja pri 62°C za Test 3. DELOVNI SKLOP 3: vzpostavitev zbirke vzorcev DNA referenčnega materiala in elektronsko shranjevanje podatkov. Vzpostavitev zbirke vzorcev DNA referenčnega materiala Referenčni material za vrsto ligenj Loligo vulgaris in pritlikavi ligenj Alloteuthis media je bil nabran v sodelovanju z Zavodom za ribištvo Slovenije. Osebke smo evidentirali in tkiva shranili na -20°C za arhiv in ponovna preverjanja. Takoj po arhiviranju smo vse osebke barkodirali kar pomeni, da smo iz vsakega posebej izolirali DNA ter pomnožili genetske markerje, prvenstveno COI iz mitohondrijske DNA ter še 18S in 28S rDNA z jedrne DNA. Uporabili smo univerzalne začetne oligonukleotide za nevretenčarje in sicer za COI: LCO1490 in HCO2198 ter za 28S rDNA: 28SLev2 in 28SDes2. Vzpostavili smo mednarodno sodelavo z vrhunsko strokovnjakinjo za glavonožce dr. Luise Allcock z National University of Ireland, Galway, ki je odstopila referenčni material za naslednje vrste puščičasti ligenj Todarodes sagittatus, Loligo forbesi in Illex coindetti. Pridobili smo 85 osebkov omenjenih vrst z različnih geografskih območij, vzorce je določila vrhunska strokovnjakinja za glavonožce dr. Luise Allcock. Iz poslanih tkiv smo izolirali DNA, pomnožili COI, in jih nato sekvencirali po Sangerju ter bioinformatsko obdelali in uporabili za referenčni material za primerjavo v barkodiranju. Iz zbirke BOLD http://boldsystems.org/ smo odbrali še sekvence za COI, ki imajo v tej zbirki deponirano fotografijo in sekvenco po vseh zahtevanih kriterijih za vrste Loligo vulgaris, Alloteuthis media, Uroteuthis chinensis, Uroteuthis duvaucelii, Doryteuthis gahi. Te sekvence služijo za preverjanje sekvenc iz naših vzorcev: za primerjavo istovetnosti v barkodiranju in za izdelavo sond za LAMP. Vzpostavitev zbirke referenčnega materiala.Pripravili smo zanesljivo referenčno zbirko sekvenc za primerjavo za barkodiranje in druge bioinformatske analize ter za kontrolne vzorce DNA v molekularnih testih. Na osnovi obdelanih sekvenc smo tudi pripravili konsenzusna zaporedja, prav tako lahko originalne sekvence uporabimo za naročilo sintetične DNA, ki služi kot pozitivna kontrola v testih in lahko nadomesti naravno DNA, ki je v omejenih koncentracijah. Zbirka tkivnih vzorcev in izolirane DNA je shranjena na Morski biološki postaji v Piranu, sekvence se nahajajo trenutno v zbirki na Morski biološki postaji, javnosti bodo na voljo po objavi v znanstvenih publikacij (v 2 letih po zaključku projekta), ko bodo javno dostopne v GenBank. Vzpostavitev podatkovne zbirke pridobljenih rezultatov Pripravili smo podatkovni model, ki zajema podatke o vzorcih, ki so bili vzorčeni v prodajalnah (podatki z deklaracij), podatke o referenčnih vzorcih (vrsta, lokacija, datum vzorčenja, določevalec), ter podatke o sekvencah genskih markerjev COI, 28S DNA in 18S DNA vzorcev ter referenčnega materiala. Tkivna banka obsega zamrznjena tkiva vzorcev iz prodajaln in tkiva referenčnih vrst, ki so shranjena na -20°C. Vzorce (tkiv in izolirana DNA) in embalažo (fotografije embalaže) smo arhivirali z vsemi metapodatki (datum vzorčenja, lokacija, ime prodajalne, ime proizvoda (kot je bilo zapisano na deklaraciji), trgovsko ime na deklaraciji, znanstveno ime vrste, oblika ponudbe, veterinarski žig, ribolovno območje, država porekla, ribolovno orodje, način proizvodnje, cena, shranjevanje). Predlogi za dopolnitve Pravilnika o trgovskih imenih rib (Ur.l.RS, št. 46/2005) Pregledali smo obstoječi Pravilnik o trgovskih imenih rib in drugih ribolovnih organizmov (Ur. L. RS, št. 46/2005), in se posebej posvetili dvema skupinama za kateri smo tudi pridobili rezultate o istovetnosti vrst na podlagi barkodiranja (lignji) in za konzerve sardin (Q-PCR test na podlagi 16SrDNA iz mitohondrijske DNA). Postopek preverjanja je prikazan na Slika 16. Pomemben dokument v oskrbni verigi je Pravilnik o trgovskih imenih rib in drugih ribolovnih organizmov (Ur. L. RS, št. 46/2005), ki določa trgovska imena proizvodov (celi osebki ali fileti), ki izvirajo iz ribolovnih vrst (rib in drugih nevretenčarjev). Pravilnik o trgovskih imenih predstavlja podlago na kateri se določi ime ribiškega proizvoda pred prodajo in se na trgovsko ime navezuje tudi znanstveno ime vrste, v nekaterih primerih se uporablja tudi določitev na nivoju rodu. imenih rib in drugih ribolovnih organizmov (Ur. L. RS, št. 46/2005). V obstoječem pravilniku Pravilnik o trgovskih imenih rib in drugih ribolovnih organizmov (Ur. L. RS, št. 46/2005) smo pregledali vse zapise, ki se nanašajo na lignje; najprej smo preverili skladnost imen v Pravilniku z veljavnimi imeni v WORMS (World Register of Marine Species). Ugotovili smo, da Pravilnik vsebuje 15 zapisov o lignjih, od tega so 3 zapisi na nivoju rodu in vsi trije rodovi so veljavni, 10 zapisov je na nivoju vrste in od teh je 8 vrst veljavnih, medtem ko sta 2 vrsti preimenovani v drug rod (glej Tabela 15). Tabela 15 Preverba slovenskih in latinskih imen za lignje v Pravilnik o trgovskih imenih rib in drugih ribolovnih organizmov (Ur. L. RS, št. 46/2005) in njihova veljavnost v WORMS. Imena iz pravilnika so zapisana identično kot v Pravilnik o trgovskih imenih rib in drugih ribolovnih organizmov (Ur. L. RS, št. 46/2005) Slovensko trgovsko ime Znanstveno ime v pravilniku Veljavno ime v WORMS Skladnost z WORMS DA/NE Argentinski kratkoplavuti ligenj Illex argentinus Illex argentinus DA Dolgoplavuti ligenj Loligo pealei*# Doryteuthis pealeii NE Južnoafriški ligenj Loligo reynaudii Loligo reynaudii DA Kratkoplavuti ligenj Illex spp Veljaven rod Ligenj vrste Martalia hyadesi Martialia hyadesi Martialia hyadesi DA Lignji Loligo spp Veljaven rod Pacifiški puščičasti ligenj Todarodes pacificus Todarodes pacificus DA Patagonski ligenj Loligo gahi Doryteuthis gahi NE Puščičasti ligenj Nototodarius sloanii* Nototodarus sloanii DA Puščičasti ligenj Nototodarus gouldi Nototodarus gouldi DA Puščičasti ligenj Ommastrephes spp Veljaven rod Severni kratkoplavuti ligenj Illex illecebrosus Illex illecebrosus DA Navadni ligenj Loligo vulgaris Loligo vulgaris DA Norveški puščičasti ligenj Todarodes sagittatus Todarodes sagittatus DA Orjaški ligenj Dosidicus gigas Dosidicus gigas DA . Napačno črkovano ime , pravilno Loligo pealeii . # zastarela, neveljavna imena Da bi ugotovili v kolikšni meri veljavni Pravilnik o trgovskih imenih rib (Ur. L. RS, št. 46/2005) ustreza sedanjim razmeram in v kolikšnem obsegu deklaracije vsebujejo veljavna trgovska imena smo naredili podrobno analizo deklaracij, ki opisujejo vzorce lignjev. Preverjali smo skladnost deklaracije, ki spremlja prodajane lignje s Pravilnikom o trgovskih imenih rib (Ur. L. RS, št. 46/2005), ki so bili naprodaj v februarju in marcu leta 2019 po različnih prodajalnah v 10 slovenskih mestih. Najprej smo preverili skladnost zapisanih trgovskih imen in znanstvenih imen med deklaracijo proizvoda in veljavnim Pravilnikom o trgovskih imenih rib (Ur. L. RS, št. 46/2005). Slovensko trgovsko ime je bilo navedeno v 94 % (16/17) vzorcev, enako velja za znanstveno ime (94 %, 16/17), v enem primeru ni bilo navedeno slovensko trgovsko ime in v drugem primeru ni bilo navedeno znanstveno ime. V 12 (70 %) primerih je bila navedena šifra FAO za ribolovno območje, ter v 11 (65 %) primerih je bilo napisano z besedo območje ribolova, država porekla je bila navedena v 10 (59 %) primerih. Ribolovno orodje je bilo navedeno v 14 (82 %) primerih (v 2 primerih trnki in vrvice ter v 12 primerih vlečne mreže). Veterinarski žig je bil na 2 proizvodih, v 3 primerih so jih prodajali kot sveže ulovljene (kot jadranske lignje (Loligo vulgaris), kot Loligo spp., in kot lignji totan (Todarodes sagitatus)), 7 vzorcev je bilo zamrznjenih, 6 vzorcev je bilo ponovno odmrznjenih, 1 vzorec so bili lignji konzervirani v olju. Preverjanje skladnosti med zapisi na deklaracijah za vzorce lignjev in med Pravilnikom o trgovskih imenih rib (Ur. L. RS, št. 46/2005) pokaže, da ima 65 % (11/17) vzorcev navedene podatke na deklaraciji neskladne s Pravilnikom o trgovskih imenih rib (Ur. L. RS, št. 46/2005), bodisi da se ne ujema navedba slovenskega trgovskega imena ali znanstvenega imena z imeni v pravilniku. Nato smo preverili skladnost znanstvenih imen v Pravilniku o trgovskih imenih rib (Ur. L. RS, št. 46/2005) z veljavnimi znanstvenimi imeni v WORMS. Pravilnik o trgovskih imenih rib (Ur. L. RS, št. 46/2005) vsebuje 13 zapisov o lignjih, od tega so 3 zapisi na ravni rodu in vsi trije rodovi so veljavni, 10 zapisov je na ravni vrste in od teh je 8 vrst veljavnih, medtem ko sta 2 vrsti premeščeni v drug rod. Barkodiranje smo opravili pri vseh vzorcih (potrditev identitete vrste s sekvenciranjem COI) smo ugotovili, da je 41 % (7/17) vzorcev navedena vrsta ista kot potrjena z barkodiranjem (primerjali smo znanstveno ime na deklaraciji in barkodo). Glavnina (7 vzorcev) je pripadalo vrsti D. gahi (patagonski lignji), 2 vrst L. vulgaris, 2 Uroteuthis duvaucelii, 2 Uroteuthis chinensis, 2 Illex coindetii in 1 Dosiducus gigas, 4 vzorci so bili označeni samo kot Loligo spp. in po barkodiranju smo identificirali naslednje vrste: L. vulgaris, D. gahi, U. chinensis in I. coindetii. Preverili smo tudi ujemanje med navedenim FAO ribolovnim območjem na deklaraciji in ribolovnim območjem vrste kot je bila identificirana z barkodiranjem: v 53 % se je navedeno FAO območje ujemalo z arealom vrste, in v 47 % je bilo navedeno napačno ribolovno območje. V Pravilniku o trgovskih imenih rib in drugih ribolovnih organizmov (Ur. L. RS, št. 46/2005) smo preverili vse zapise, ki so povezani z najdenimi zapisi trgovskih imen na konzervah v katerih smo preverjali identiteto vrst s testom Q-PCR narejenim na osnovi 16S rDNA specifične za Clupeidae. Ponovno smo najprej preverili vse zapise za vrste Sardinella aurita, Sardina pilchardus, Engraulis encrasicolous, Sprattus sprattus in njim sorodne vrste. Našli smo 20 zapisov, ki so ustrezali tem kriterijem in preverili ali znanstvena imena še veljajo. Ugotovili smo, da v 3 primerih znanstvena imena ne ustrezajo (glej Tabela 6). Tabela 16 Preverba slovenskih in latinskih imen za konzerve sardin v Pravilnik o trgovskih imenih rib in drugih ribolovnih organizmov (Ur. L. RS, št. 46/2005) in njihova veljavnost v WORMS. Imena iz pravilnika so zapisana identično kot v Pravilnik o trgovskih imenih rib in drugih ribolovnih organizmov (Ur. L. RS, št. 46/2005) Slovensko trgovsko ime Znanstveno ime v pravilniku Veljavno ime v WORMS Skladnost z WORMS DA/NE Argentinski sardon Engraulis anchoita Engraulis anchoita DA Japonski sardon Engraulis japonicus, E. japonica Engraulis japonicus DA Perujski sardon Engraulis ringens Engraulis ringens DA Papalina Sprattus sprattus Sprattus sprattus DA Sardon Engraulis capensis Engraulis capensis DA Sardon Engraulis encrasicolus Engraulis encrasicolus DA Sardoni Engraulis spp. Kalifornijski sardon Engraulis mordax Engraulis mordax DA Brazilska velika sardela Sardinella brasiliensis Sardinella brasiliensis DA Dolgoglava velika sardela Sardinella longiceps Sardinella longiceps DA Kalifornijska sardela Sardinops caeruleus Sardinops sagax NE Kalifornijska sardela Sardinops melanostictus Sardinops sagax NE Kalifornijska sardela Sardinops ocellatus Sardinops sagax NE Kalifornijska sardela Sardinops sagax Sardinops sagax DA Kalifornijske sardele Sardinops spp. Madeirska velika sardela Sardinella maderensis Sardinella maderensis DA Sardela Sardina pilchardus Sardina pilchardus DA Velike sardele Sardinella spp. Zlatoproga velika sardela Sardinella gibbosa Sardinella gibbosa DA . Napačno črkovano ime . # zastarela, neveljavna imena, N.B. Sardinella aurita ni v Pravilniku Nato smo preverili zapise na deklaracijah (trgovsko ime in znanstveno ime) z trgovskim imenom in znanstvenim imenov kot to predpisuje Pravilnik o trgovskih imenih rib in drugih ribolovnih organizmov (Ur. L. RS, št. 46/2005) in ugotovili, da je od 37 vzorcev skladnih 15 (40%) vzorcev, medem ko je 13 (35%) vzorcev neskladnih. Preostalih 9 (25%) vzorcev imelo na deklaraciji samo slovensko ime proizvoda, ki ni ustrezalo predpisanemu trgovskemu imenu in v teh vzorcih samo po informacijah na deklaraciji ni bilo možno določiti vrste. V takšnih primerih je edina zanesljiva možna identifikacija samo na osnovi DNA, taksonomska določitev pogosto ni možna, ker so ribe brez glave in pogosto delno očiščene, s čimer se odstranijo zunanji taksonomski znaki. Rezultati so izpostavili zastarelost znanstvenih imen (uporaba starih sinonimov) v Pravilniku o trgovskih imenih rib in drugih ribolovnih organizmov (Ur. L. RS, št. 46/2005), kar otežuje sledenje po podatkih, ki so navedeni na deklaraciji. V projektu smo se osredotočili samo na dve taksonomski skupini in to so lignji in vrste iz družine Clupeidae in Engraulidae. Problematična je uporaba zgolj rodovnega imena (v pravilniku so: Loligo spp., Illex spp., Ommastrephes spp., Engraulis spp., Sardinella spp., Sardinops spp.), ki zajema vse vrste v rodu, kar je izjemno nenatančno. Nenatančno navajanje podatkov na dokumentih skozi oskrbno verigo ima daljnosežne posledice ne samo za potrošnike, ampak tudi na upravljanje ribištva in vpliva na zanesljivost zbranih podatkov in uradne statistike. Nezanesljivi podatki povečujejo negotovost v statističnih izračunih ter vplivajo na upravljanje ribištva, slabo upravljanje ribištva lahko vodi v prelov ribolovnih virov. Kot primer slabe prakse uporabe všečnega trgovskega imena je primer patagonske zobate ribe (Dissostichus eleginoides, ang. Patagonian toothfish), ki so jo prodajali pod angleškim trgovskim imenom “Chilean sea bass”. Trgovsko ime si je leta 1977 izmislil trgovec, da bi ogroženo in redko vrsto ribe iz južnih arktičnih morij uspešno prodajal v ZDA. Prelov te vrste je preprečila pridobitev certifikata Marine Stewardship Council (MSC), ki je kot pogoj postavil trajnostno izkoriščanje in preprečil nadaljnjo prodaja te vrste pod drugimi trgovskimi imeni (Marko, Nance, Guynn, 2011). Pripravili smo priporočila za izboljšave Pravilnika o trgovskih imenih rib (Ur. L. RS, št. 46/2005): 1.) priporočamo, da je Pravilnik o trgovskih imenih rib v elektronski obliki, da ga je možno dopolnjevati. Primeri takšnih seznamov so Seafood List v ZDA, ki ga vzdržuje Agencija za zdravila in hrano, ki je dostopen na spletu­https://www.cfsanappsexternal.fda.gov/scripts/fdcc/?set=SeafoodList (dostop do posodobitev https://www.fda.gov/food/seafood-guidance-documents-regulatory­ information/fda-seafood-list-updates-2020), FishList, ki ga vzdržuje Agencija za nadzor nad hrano v Kanadi https://inspection.canada.ca/food-label­ requirements/labelling/industry/fish-and-fish-products/fish­ list/eng/1352923480852/1352923563904 prav tako dostopen na spletni strani. Zakonodaja EU nalaga svojim članicam, da vzpostavijo in objavijo seznam komercialnih proizvodov iz ribolova in akvakulture ter znanstvena imena gojenih organizmov. 2.) dosledna uporaba slovenskih imen vrst za trgovska imena. Natančno in enoznačno poimenovanje omogoča, da potrošniki lažje prepoznajo vrsto in najdejo nadaljnje informacije kadar to želijo. Pri izdelavi seznama trgovskih imen ribiških proizvodov je potrebno upoštevati govorna območja, ker se pod istim imenom lahko poimenujejo različne vrste in so tudi priporočilo FAO (Martinez, James and Loreal, 2005). Priporočilo je pomembno tudi za Slovenijo, ker je v veljavi veliko domačih imen, ki izvirajo iz hrvaškega in italijanskega jezika še posebej na področju morskega ribištva, prav tako je potrebno neprestano spremljanje ribolovnih vrst, ker so med njimi nove vrste za katere še nimamo slovenskih imen, enako velja za uvožene ribiške proizvode. Ena od osnovnih in pomembnih izzivov pri ugotavljanju poneverb z ribiškimi proizvodi je vzpostavitev uradnega seznama slovenskih imen vrst, ki je enoznačno povezan z veljavnim seznamom znanstvenih imen. Uveljavitev takšnega seznama zahteva natančno preverjanje domačih imen z znanstvenimi imeni ob pomoči strokovnjaka taksonoma s področja ribištva. 3.) dosledno uporabljati veljavna znanstvena imena in jih redno posodabljati. Sodobna ribiška znanost je dinamična veda, ki neprestano vključuje tudi spoznanja drugih disciplin kot so integrativna taksonomija, zato so pogosta tudi preimenovanja in prerazvrstitve ribolovnih vrst. Slovenska trgovska imena je potrebno neprestano usklajevati z znanstvenimi imeni, ki skladna z najnovejšimi taksonomskimi spoznanji kot orodje se lahko uporabi portal WORMS https://www.marinespecies.org/ ter vir na spletni strani EK List of commercial and scientific name of species https://fish-commercial-names.ec.europa.eu/fish­ names/species_en?sn=14802. 4.) uskladitev poimenovanj v Pravilniku o trgovskih imenih rib s slovarjem IATE (Interactive Terminology of Europe (https://iate.europa.eu/home), ki je uradni terminološki dokument in vsebuje tudi izrazoslovje s področja ribištva in ga uporabljajo za uradne prevode. Uskladitev med obema pomeni, da so vedno na voljo najnovejše posodobitve poimenovanj in ne prihaja do različnih poimenovanj. DELOVNI SKLOP 4: socio-ekonomski vidik napačnega deklariranja in označevanja ribiških proizvodov. V tem sklopu smo opravili mapiranje deležnikov, ki so relevantni za trg rib in v izbranih organizacijah in institucijah povprašali za odgovorno osebo ali strokovnjaka s katerim bi izvedli intervju o tematiki trga rib in ribolova v Sloveniji. Mapiranje je potekalo v obdobju od julija 2019 do januarja 2020 preko elektronske pošte in s telefonskimi pogovori. Pri načrtovanju dela smo se oprli tudi na zaključke in priporočila strokovnjakov, ki smo jih obiskali na oddelku za morsko ribištvo na Zavodu za ribištvo Republike Slovenije (ZZRS) takoj ob začetku projekta in strokovnjakov iz inšpekcijskih služb, zadolženih za področje ribolova. Najprej smo jim predstavili projektno nalogo in cilje in se nato v pogovoru osredotočili na pregled ponudbe ribiških proizvodov na slovenskem tržišču, na identifikacijo najbolj rizičnih vrst rib in proizvodov, predstavitev metod na osnovi DNA tehnologije, ki so primerne za identifikacijo rib in proizvodov na tržišču, vzpostavitev zbirke referenčnega materiala ter pridobitev referenčnega materiala iz biološkega vzorčenja, ki ga v okviru morskega ribištva opravlja ZZRS, pridobitev podatkov za oceno socioekonomskih vidikov zaradi napačnega deklariranja in označevanja ribiških proizvodov, izobraževanje deležnikov (izbira ključnih deležnikov s področja morskega ribištva) ter primerne vsebine. Medtem ko so nam predstavniki inšpekcijskih služb predstavili svoje videnje problematike v inšpekcijskem nadzoru kot so težave pri preverjanju deklaracij na predpakiranih živilih, razločevanje med vrstami tunov in geografskim izvorom (ribolovnimi območji), težavna identifikacija glavonožcev v izdelkih kot so morske solate in v drugih podobnih proizvodih, težave pri identifikaciji surovine v morski hrani pri različnih ponudnikih, težave pri izvajanju nadzora v ribarnicah ter gostinskih obratih ter potrebe po analitskih metodah za identifikacijo ribiških proizvodov v inšpekcijskem postopku. Raziskovalna vprašanja so oblikovana na osnovi zbrane literature, glede na odprta socio-ekonomska vprašanja in težave v oskrbni verigi v ribištvu. Z intervjuji smo želeli dobiti odgovore na naslednja vprašanja: - Kakšne so specifike trga rib in ribištva v Sloveniji ter v kakšni smeri se razvijata? - Kakšne so morebitne kršitve standardov in predpisov ter kakšne težave in poneverbe se pojavljajo na trgu rib ter v ribištvu? - Kakšno je povpraševanje potrošnikov in njihova ozaveščenost o ribah v Sloveniji? - Kakšne so razlike med ribolovom in ribogojstvom ter zakaj so pomembne za ribiško vrednostno verigo? - Kakšne so razlike med gospodarskim in negospodarskim ribištvom? - Kako sta ekološki vidik in trajnostni razvoj vključena v ribištvo in trg rib v Sloveniji? - Katere organizacije v Sloveniji preučujejo ribištvo in trg rib ter skrbijo zanj in za ugotavljanje poneverb v ribiških proizvodih? - Kako se bosta v prihodnje razvijala trg rib in ribištvo, s poudarkom na socio-ekonomskih vidikih? Izvedenih je bilo petnajst polstrukturiranih intervjujev, ki so trajali od 45 do 60 minut. Intervjuje smo izvedli s strokovnjaki z Ministrstva za kmetijstvo, gozdarstvo in prehrano (MKGP); Morske biološke postaje Piran, Nacionalni inštitut za biologijo; Zavoda za ribištvo Slovenije (dva intervjuja); Inšpektorata za kmetijstvo, gozdarstvo, lovstvo in ribištvo (Ribiške inšpekcije); Ribiške zveze Slovenije; Kmetijsko gozdarske zbornice Slovenije (dva intervjuja); Gospodarske zbornice Slovenije; Zveze potrošnikov Slovenije, WWF Adria, Racoon d. o. o., s predstavnikom Varuha odnosov v verigi preskrbe s hrano in z ribiči ter s predstavniki ribičev. Izbrani intervjuvanci so bili predhodno obveščeni o intervjuju in smo jim posredovali vprašalnik pred izvedbo intervjuja, da so se lahko ustrezno pripravili na izvedbo intervjuja. Glede na izvedene osebne intervjuje iz oči v oči so bila mogoča podvprašanja in usmerjena razprava glede na poslana vprašanja. Z raziskavo smo zbrali podatke in informacije, ki so kvalitativne narave in so namenjeni za predstavitev implikacij in možnosti, kako bi lahko izboljšali stanje v ribištvu in na trgu rib v Sloveniji. Cilji raziskave so bili: -preučiti domačo in tujo literaturo ter relevantne dokumente s področja ribištva in preučevanja kršitev na trgu rib v Sloveniji; -na osnovi rezultatov raziskave ugotoviti in analizirati lastnosti in kršitve na trgu in v ribištvu v Sloveniji, s poudarkom na socio-ekonomskih dejavnikih; -pregledati in analizirati težave, povezane s povpraševanjem, ponudbo, trajnostnim razvojem, kršitvami standardov in predpisov, z izvozom in uvozom rib in ribiških izdelkov ter druge pomembne specifike in lastnosti trga rib v Sloveniji; -pregledati, kako je trajnostni razvoj in ekološki vidik uveljavljen v ribištvu in na trgu rib v praksah in aktivnostih, ki jih udeleženci izvajajo, pregled uveljavitve trajnostnih in ekoloških norm ter morebitnih slabih in spornih praks; -pregledati in analizirati načine lovljenja in vzreje rib ter vrednostno verigo trga rib, skrbi za okolje in odprta socio-ekonomska vprašanja udeležencev; in podati predloge, kako bi prakse na trgu rib in v ribištvu v Sloveniji lahko izboljšali Z intervjuji smo pridobili primarne podatke za raziskovanje, ki so vključevali različne vidike in segmente ribiškega trga v Sloveniji, s poudarkom na socio-ekonomskih dejavnikih. Preučevali smo ribolov in vzrejo školjk ter rib v morju in v celinskih vodah, povezovanje ribištva s turizmom, predelavo ribiških izdelkov, zlorabe na ribiškem trgu in sorodne teme kakor tudi možnosti za trajnostni razvoj ribištva v slovenskem morju in v celinskih vodah. Rezultati intervjujev so nam dali vpogled v različne težave, ki so prisotne in možne rešitve kot so jih predvideli različni deležniki povezani s trgom rib. Analiza odgovorov je pokazala, da ima največ možnosti za razvoj akvakultura, pri čemer je treba upoštevati podnebne spremembe in razpoložljivi prostor; možen je razvoj novih prehranskih proizvodov ter razširiti ponudbo rib; če se poveča povpraševanje po ribah se bo povečal uvoz ribiških proizvodov; mnogi intervjuvanci slabo poznajo principe sledljivosti v ribištvu in še manj razpoložljive metodologije; poudarili so pomen dostopa do zanesljivih informacij. Rezultati so bili zbrani v okviru magisterske naloge MAVRIČ, Alex. Trg rib in ribištvo v Sloveniji, 2020, Fakulteta za Management, Univerza na Primorskem (mentor prof. dr. Štefan Bojnec) in nato še predstavljeni v prispevku MAVRIČ, Alex, RAMŠAK, Andreja, BOJNEC, Štefan. Trg rib in ribištvo v Sloveniji. V: PRIŠENK, Jernej (ur.). Razvojni vidiki prenosa znanja v skupni kmetijski politiki po letu 2020. 8. konferenca DAES, Maribor, 20.-21. februar 2020. 1. izd. Maribor: Društvo agrarnih ekonomistov Slovenije -DAES, 2020. Str. 137-148, ilustr. ISBN 978-961­91094-9-6. [COBISS.SI-ID 1541983172]. Problematika je izčrpno obdelana v monografiji katere avtorji so A. Mavrič, Š. Bojnec; A. Ramšak z naslovom Izzivi razvoja ribištva v Sloveniji, Koper 2021, ki je bila poslana na razpis ARRS v letu 2021 za sofinanciranje znanstvenih monografij, založnik Univerza na Primorskem in v članku z naslovom Socioeconomic and environmental importance of the fish market and fisheries in Slovenia avtorjev A. Mavrič, Š. Bojnec; A. Ramšak (članek je v pripravi). Tukaj povzemamo glavne ugotovitve, ki se nanašajo na: -specifike trga rib in ribištva v Sloveniji ter smer razvoja (v predelavi in trženju je še prostor za razvoj manjših podjetij, možnosti za izdelavo inovativnih izdelkov in v ponudbi novih zanimivih vrst ribolovnih organizmov, pri povečani potrošnji se bo ribiški trg preusmeril v uvoz izdelkov, le ozaveščeni potrošniki bodo ribe in izdelke iskali pri lokalnih proizvajalcih). -Kršitve standardov in predpisov ter problemi in poneverbe, ki se dogajajo na trgu rib in pri ribištvu(zamenjave vrst, zamenjave gojenih in divjih vrst, ponujene ribe niso sveže, v nekaterih primerih je težko ugotoviti poreklo -geografski izvor rib, rekreativni ribolov in prodaja ulova ni urejena, na splošno kršitev ni veliko) -Povpraševanje in ozaveščenost potrošnikov o ribah in ribiških izdelkih v Sloveniji (nizko povpraševanje, večje je le v obalnih mestih in Ljubljani, v splošnem je ozaveščenost potrošnikov slaba, ne prepoznajo kršitev, ne prepoznavajo ponudbe in kakovosti) -Razlike med ribolovom in ribogojstvom in pomembnost za ribiško vrednostno verigo (večji potencial razvoja je prepoznan v celinskem ribogojstvu kakor v morskem ribogojstvu) -Vključitev ekološkega in trajnostnega razvoja v ribištvo in ribiški trg v Sloveniji (omejene možnosti za izboljšanje stanja, premalo investicij v trajnosti razvoj, akvakultura potrebuje izvajanje dobrih proizvodnih praks, da se ohrani kakovost vode, pomanjkanje strokovnih znanj, ki bi pospešila razvoj akvakulture v Sloveniji) -prihodnji razvoj trga rib in ribištva s poudarkom na socio-ekonomskih vidikih (povezovanje ribištva z drugimi gospodarskimi panogami, razvoj zaprtih sistemov za akvakulturo -predvsem na kopnem, dolgoročno usmerjeno oglaševanje potrošnikov in njihovo motiviranje, razvoj lokalnih in butičnih izdelkov, razvoj inovativnih izdelkov in blagovne znamke, ki lahko pripomorejo k razvoju specialnih tržnih niš). Analiza ribiških proizvodov, ki so na trgu (s trga EU in iz uvoza) s poudarkom na količinah in vrstah Slovenija je neto uvoznica rib in ribiških izdelkov, kar pomeni, da več uvaža kot izvaža. V Sloveniji je večji del predelanih surovin uvoženih iz različnih delov sveta, ker pri nas ni zadostnih količin surovin iz ribolova, na drugi strani pa ribiči lahko prodajo slovenski ulov po višjih cenah v restavracije in v ribarnicah kot bi jim bila ponujena za predelavo. Glavni proizvodi predelave v Sloveniji so različne vrste ribjih konzerv, tunine paštete, bakala namazi, izdelki iz lososa (namazi, prigrizki), izdelki iz glavonožcev in morski sadeži (Bolje idr. 2019, 139–141). V letu 2015 je bilo v Sloveniji 12 podjetij, ki so se ukvarjala s predelavo ribolovnih organizmov, ki so ustvarila 25,7 milijona evrov prihodka iz prodaje ter so zaposlovala 209 ljudi. Največji slovenski partnerji za dobavo surovin iz morskega ribolova so Italija, Španija in Hrvaška, največ so podjetja izvozila v Avstrijo, Hrvaško in Bosno in Hercegovino (141; Publications Office of the EU 2019, 26). Največ se uvaža iz držav članic EU, in sicer iz Hrvaške, Italije, Španije, Grčije in iz severnih morij. Od svežih rib se največ uvaža gojene orade in brancine, filete svežih lososov ter dimljene losose. Sveži in delno zmrznjeni izdelki so največkrat uvoženi iz sredozemskih držav. Iz Hrvaške se največ uvaža gojene orade in brancine. Uvaža se gojene vrste: orade, brancine, losose in šarenke ter postrvi iz Italije. Od zmrznjenih izdelkov se največ uvaža patagonske lignje preko Španije, nato osliče, fileje vitkega soma, fileje pange in morske sadeže. Podjetja, ki izvajajo predelavo rib, uvažajo vrste kot so lososi, tune, sardele, skuše in polenovke za predelavo v konzerve ali ribje namaze. Iz tretjih ne EU držav se večinoma uvažajo le zmrznjene ribiške proizvode (osliče in lignje). Za zamrznjene izdelke velja, da ti lahko prihajajo iz različnih geografskih delov sveta (Argentina in Azija). Veliko uvoženih zamrznjenih izdelkov izvira iz jugovzhodne Azije (Vietnam in okolica). Sladkovodnih rib se uvaža manj kot morskih, uvoz sladkovodnih rib prihaja večinoma iz sosednjih držav in iz Bosne in Hercegovine. Izvoz ribiških izdelkov iz Slovenije v druge države je v majhnih količinah. Ne gre za klasičen izvoz, temveč za manjšo prodajo kot prodajo školjk na Hrvaško in v trgovski verigi Hofer ter Lidl. Največ se prodaja v sosednjo Hrvaško, v Avstrijo in srednjeevropske države. Morski ribiči ulov izvažajo na ribjo borzo v Trst, školjke izvažajo v sosednje države in majhne količine gojenih sladkovodnih rib. Delamaris izvaža določene manjše količine v balkanske države, vendar so naši ribiški izdelki predragi za izvoz na balkansko tržišče. Klapavice izvažamo v Romunijo, Italijo in Hrvaško. Ovrednotenje količine napačno deklariranih ribiških proizvodov in ekonomsko škodo zaradi napačnega označevanja ribiških proizvodov Ribištvo v Sloveniji je eden najmanjših sektorjev, vendar še vedno pomemben, predvsem zaradi kulturne dediščine in tržnih niš. Ribištvo v Sloveniji se prepleta z nekaterimi drugimi panogami, kot sta turizem in šport. Morsko ribištvo prevladuje v obalni regiji, celinsko ribištvo je porazdeljeno po različnih regijah glede na prevladujoči tip celinskih voda. Skupna evropska ribiška politika (SRP), ki jo po pravilih EU izvaja Slovenija, predstavlja skupek pravil, ki zagotavljajo, da se ribištvo izvaja v trajnostni smeri, s pošteno konkurenco in usmerjenim razvojem. Med cilji so ohranjanje ribolovnih virov, izvajanje trajnostnih praks in podpiranje razvoja v akvakulturi (MKGP 2019b). Ribištvo v Sloveniji obsega gospodarski in negospodarski ribolov na morju in na celinskih vodah, akvakulturo (morsko in sladkovodno), predelavo in trženje ribiških proizvodov ter upravljanje z ribolovnimi viri, ki je v pristojnosti MKGP. Pristojno ministrstvo skrbi tudi za razvoj trajnostne akvakulture. Na področju celinskega ribištva je pomembno ohranjanje in varovanje domorodnih vrst rib ter skrb za razvoj rekreacijskega ribolova, ki je pomembna panoga kot je muharjenje. Za segment predelave in trženja rib ter ribiških proizvodov se želijo zagotoviti večje proizvodne zmogljivosti in večjo dodano vrednost izdelkov (MKGP 2019b). Kršitve, ki se pojavljajo na ribiškem trgu, so zamenjave ribolovnih vrst, pogosto manj cenjene z bolj cenjenimi, zamenjave ulovljenih rib z gojenimi, neustrezno označevanje, sveže ribe pogosto niso resnično sveže, pojavljajo se lahko sporne prakse pri predelavi in prodaji, v določenih primerih je težko ugotoviti poreklo rib (lokacija vzreje ali ribolova). V akvakulturi se pojavljajo težave dodajanja aditivov in antibiotikov, kar ni v prodaji to nikjer označeno. Vzreja tujerodnih vrst v akvakulturi ni zaželena, ker lahko pride do pobega organizmov v naravo kar ima lahko zelo škodljive posledice. Ulov iz rekreativnega ribolova prodajajo različnim restavracijam, ustvari se črni trg, zaradi česar se znižajo cene ulova, ki ga ponujajo gospodarski ribiči. Intervjuvanci so omenili, da kršitev ni veliko, so pa prisotne. Kakršne koli afere v zvezi s kršitvami v ribištvu negativno vplivajo na trg, ampak običajno izzvenijo v letu ali dveh. Ovrednotene količine napačno deklariranih ribiških proizvodov in ekonomske škode zaradi napačnega označevanja ribiških proizvodov se porazdelijo na slovensko ribištvo preko nelojalne konkurence in na ekonomske škode, ki jih nosijo porabniki, saj zaradi zavajanja preplačajo kupljene ribe in ribiške proizvode. Ponudba ribiških izdelkov izven večjih centrov je zelo slaba, slabša je tudi kupna moč kupcev. Zaradi relativne majhnosti trga so tudi ekonomske škode relativno majhne. Z rastjo dohodkov porabnikov in povečano porabo rib pa bi se ekonomske škode zaradi napačnega označevanja ribiških proizvodov lahko povečale. Kakovost ribiških proizvodov večinoma ustreza standardom in predpisom, nižje kakovosti so lahko različni predelani izdelki in ribe, ki niso prodane dovolj sveže. Kršitve in nedoslednosti v sledljivosti ribiških proizvodov in v navedbah informacij na deklaracijah bi lahko zmanjšali s povečanjem nadzora in s sodelovanjem med državami, ki so udeležene v trgovanju. Pomemben dejavnik v ribištvu je zagotavljanje sledljivosti ribiških proizvodov od ribiča do potrošnika, ki je izjemno težko zaradi dolge in zapletene oskrbne verige ter dragih in zapletenih metod. Strokovnjaki si prizadevajo razviti nove metode testiranja, ki so stroškovno ugodnejše in bodo dostopne za uporabo vsem zainteresiranim na trgu rib v Sloveniji. Primanjkuje primernih in strokovnih člankov o ribištvu, ki bi lahko pripomogli pri oglaševanju in ozaveščanju porabnikov. DELOVNI SKLOP 5: diseminacija projekta in rezultatov projekta Projekt je predstavljen na spletnih straneh izvajalcev. Tematika projekta je bila predstavljena v okviru vabljenega seminarja “82415 -HOT TOPICS IN MARINE SCIENCES” na Univerzi v Bologni za študente magistrskega študija Morske biologije. Seminar je bil izveden od 21. do 25. januarja 2019 na Oddelku za biologijo, geologijo in okoljske znanosti, v Ravenni, Univerza v Bologni in ga je v celoti izvedla dr. Andreja Ramšak (8ur). Predavanje študentom v okviru poletne šole »Summer school on blue growth in the Euro-Mediterranean region”, ki sta jo organizirala Evro-sredozemska univerza (Slovenija) in Istituto Nazionale di Oceanografia e di Geofisica Sperimentale (Italija), dne 19. 6. 2019 na Evro­sredozemski univerzi , Kidričevo nabrežje 2, Piran. Predavanje z naslovom “Traceability methods as tools to combat illegal fishing« je izvedla doc. dr. Andreja Ramšak, predavanje je bilo v angleškem jeziku. Znanja iz projekta CRP V1-1808 bodo vključena tudi v magistrski študij Akvakulture in ribištva (Genetics in Aquaculture and Fishery), Univerza v Asuanu, Egipt, doc. dr. Andreja Ramšak je vključena kot zunanji ekspert Evro-sredozemske universe (EMUNI) v pripravo študijskega programa Sustainable Management of Fisheries and Aquaculture (SMFA) (projekt FishAqu, Erazmus+ H2020). Širši javnosti smo problematiko projekta in rezultate predstavili tudi s sodelovanjem v radijskem programu in kot predavanje na prireditvi Noč raziskovalcev: Radijska predstavitev: VAL 2020: 16. 11. 2019 intervju z doc. dr. Andreja Ramšak https://val202.rtvslo.si/2019/11/morska-bioloska-postaja-piran/, predstavitev projekta CRP V1-1808, tematike in rezultatov Radio Študent: Utrinki z Noči raziskovalcev na Radiu Študent v oddaji Frequenza della Scienza, prispevek https://radiostudent.si/znanost/frequenza-della-scienza/utrinki-z-no%C4%8Di­ raziskovalcev , komentar o predavanju (od 11. minute naprej) je pripravila novinarka, ki se je udeležila predavanja doc. dr. Andreja Ramšak RAMŠAK, Andreja. Iz morja do vilic -ali vemo kaj dobimo na krožnik? : predavanje na prireditvi Noč ima svojo moč, Morska biološka postaja, Piran, 27. 9. 2019. Predavanje na prireditvi Noč raziskovalcevPosredovanje pridobljenih znanj in problematike v poljudni obliki širši javnosti v okviru prireditev Evropska noč raziskovalcev: RAMŠAK, Andreja. Iz morja do vilic -ali vemo kaj dobimo na krožnik? : predavanje na prireditvi Noč ima svojo moč, Morska biološka postaja, Piran, 27. 9. 2019. [COBISS.SI-ID 5205071] Predstavitev deležnikom: predstavitev projekta delegaciji predstavnikov z Direktorata za hrano in ribištvo, Uprava RS za varno hrano, veterinarstvo in varstvo rastlin, ki je potekala na NIB, dne 17. 10. 2019. Predstavitev projektnega dela in rezultatov je opravila dr. Andreja Ramšak. RAMŠAK, Andreja. Sledi ribi -ali kako zagotoviti sledljivost ribiških proizvodov : predavanje na delavnici Povezovanje raziskav morja z ribištvom in akvakulturo, NIB -Morska biološka postaja Piran, Piran, 14. september 2018. Predstavljeni so bili principi sledljivosti v ribištvu za ključne deležnike ribiči, akvakultura in nadzorni organ ( COBISS 4817743) Sodelovanje na problemski konferenci Morje kdo bo tebe ljubil, ki je potekala 27.5. 2019 v panelu Ribištvo (Koper), kjer je bila predstavljena problematika sledljivosti in poneverb, sodelovala je dr. Alenka Baruca Arbeiter, ki je bila tudi diskutant. Predavanje na simpoziju The future of small-scale fishery markets in the Mediterranean: social, environmental, economic and governance aspects, 6. 10. 2020, Izola, online dogodek, predavanje je izvedla dr. Andreja Ramšak. RAMŠAK, Andreja. Zamenjave vrst med lignji na slovenskem tržišču : predavanje na spletnem seminarju Analize na potvorbe živil, 14. maj 2021. [COBISS.SI-ID 64001027]. Predavanje je bilo izvedeno na povabilo GZS-Zbornica kmetijskih in živilskih podjetij V okviru projekta CRP V1-1808 je bila opravljena: Diplomska naloga na Fakulteti za matematiko, naravoslovje in informacijske tehnologije, Univerza na Primorskem GRBEC, Gregor. Razvoj metode LAMP za potrjevanje pristnosti živil iz lignjev vrste Loligo vulgaris (Lamarck, 1798) = Development of a LAMP method for authenticating foodstuff consisting of species Loligo vulgaris (Lamarck, 1798) : zaključna naloga. Koper: [G. Grbec], 2020. IX, 29 f. [3] f. pril., ilustr. https://www.famnit.upr.si/sl/studij/zakljucna_dela/view/934. [COBISS.SI-ID 30627843]Mentor: doc. dr. Matjaž Hladnik in somentor: doc.dr. Andreja Ramšak Magistrska naloga na Univerza v Reki RUBINIĆ, Marko. Visokoosjetljivi DNA testovi za određivanje zamjena vrsta u plodovima mora : diplomski rad. Rijeka: [M. Rubinić], 2020. 103 f., ilustr. [COBISS.SI-ID 34083331] mentorica doc. dr. Andreja Ramšak Magistrska naloga na Fakulteti za management, Univerza na Primorskem MAVRIČ, Alex. Trg rib in ribištvo v Sloveniji: magistrska naloga. Koper: [A. Mavrič], 2020. X, 113 str., [80] str. pril., ilustr. http://www.ediplome.fm-kp.si/Mavric_Alex_20200623.pdf. [COBISS.SI-ID 20491523], mentor: prof. dr. Štefan Bojnec V delu Ramšak Andreja, Species substitution among squids on the Slovenian market, dogovorjeno za 30. 06. 2021, Piran NIB-MBP, obisk projektnih partnerjev projekt Qualify na povabilo GZS- Zbornica kmetijskih in živilskih podjetij Alex Mavrič, Štefan Bojnec, Andreja Ramšak, Socioeconomic and environmental importance of the fish market and fisheries in Slovenia, priprava članka za Annales Oddano v tisk Alex Mavrič, Štefan Bojnec, Andreja Ramšak, Izzivi razvoja ribištva v Sloveniji, izdajatelj Založba Univerze na Primorskem. Monografija je bila oddana na razpis ARRS Javni razpis za sofinanciranje izdajanja znanstvenih monografij v letu 2021. Objave zavedene v sistemu COBISS Prispevek na konferenci brez natisa Predavanje na simpoziju The future of small-scale fishery markets in the Mediterranean: social, environmental, economic and governance aspects, 6. 10. 2020, Izola, online dogodek, predavanje je izvedla dr. Andreja Ramšak. Zapis v COBISS: RAMŠAK, Andreja, BREZNIK, Bety. How can small scale fishery benefit from DNA technology applications? : lecture at the symposium The future of small-scale fishery markets in the Mediterranean: social, environmental, economic and governance aspects, Izola, 6 October 2020. [COBISS.SI-ID 31725315] MAVRIČ, Alex, RAMŠAK, Andreja, BOJNEC, Štefan. Trg rib in ribištvo v Sloveniji. V: PRIŠENK, Jernej (ur.). Razvojni vidiki prenosa znanja v skupni kmetijski politiki po letu 2020 : 8. konferenca DAES : Maribor, 20.-21. februar 2020. 8. konferenca DAES, Maribor, 20.-21. februar 2020. 1. izd. Maribor: Društvo agrarnih ekonomistov Slovenije -DAES, 2020. Str. 137­148, ilustr. ISBN 978-961-91094-9-6. http://www.daes.si/Splet/8.%20konferenca%20DAES%20-%20Zbornik.pdf. [COBISS.SI-ID 1541983172] RAMŠAK, Andreja, BREZNIK, Bety. How can small scale fishery benefit from DNA technology applications? : lecture at the symposium The future of small-scale fishery markets in the Mediterranean: social, environmental, economic and governance aspects, Izola, 6 October 2020. [COBISS.SI-ID 31725315] Radijska ali televizijska oddaja SMREKAR, Aleš (oseba, ki intervjuva), ŠVALJ, Miha (oseba, ki intervjuva), ŠOLN, Tina (oseba, ki intervjuva), MOZETIČ, Patricija (intervjuvanec), LIPEJ, Lovrenc (intervjuvanec), LIČER, Matjaž (intervjuvanec), RAMŠAK, Andreja (intervjuvanec), SIMIČ, Slobodan (intervjuvanec). O morju vemo manj kot o Marsu. Ljubljana: Radiotelevizija Slovenija javni zavod, 2019. 1 spletni vir (5 zvočih datotek). Terenski Val. https://val202.rtvslo.si/2019/11/morska-bioloska-postaja­ piran/. [COBISS.SI-ID 5334351] . Dne 16.11.2019 e VAL 2020 gostoval na MBP in je bio opravljen intervju z dr. Andreja Ramšak, ki je predstavila CRP V1-1808, teatiko in rezultate projekta. RAMŠAK, Andreja. Iz morja do vilic -ali vemo kaj dobimo na krožnik? : predavanje na prireditvi Noč ima svojo moč, Morska biološka postaja, Piran, 27. 9. 2019. [COBISS.SI-ID 5205071] RAMŠAK, Andreja. Sledi ribi -ali kako zagotoviti sledljivost ribiških proizvodov : predavanje na delavnici Povezovanje raziskav morja z ribištvom in akvakulturo, NIB -Morska biološka postaja Piran, Piran, 14. september 2018. [COBISS.SI-ID 4817743] Literatura Armani, A., Guardone, L., Castigliego, L., D'Amico, P., Messina, A., Malandra, R., Gianfaldoni, D., Guidi, A. 2015. DNA and Mini-DNA barcoding for the identification of Porgies species (family Sparidae) of commercial interest on the international market. Food Control, 50: 589-596. Biswas, G., Sakai, M. 2014. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for detection and identification of aquaculture pathogens: current state and perspectives. Appl Microbiol Biotechnol, 98(7): 2881-2895. Campbell, B., Pauly, D. 2013. Mariculture: A global analysis of production trends since 1950. Marine Policy 39, 94–100 http://dx.doi.org/10.1016/j.marpol.2012.10.009. Chapela, M. J., Sotelo, C. G., Pérez-Martín, R. I., Pardo, M. Á., Pérez-Villareal, B., Gilardi, P., Riese, J. 2007. Comparison of DNA extraction methods from muscle of canned tuna for species identification. Food Control, 18(10): 1211-1215. Codex Alimentarius Commission. 2017. Discussion paper on food integrity and food authenticity) European Commission. 2015. Fish substitution (2015). In: Food Safety [online]. /food/safety/official_controls/food_fraud/fish_substitution_en EK, https://ec.europa.eu/commission/publications/natural-resources-and-environment_sl). Cusa, M., L. Falcao, J. De Jesus, C. Biolatti, L. Blondeel, F. S. A. Bracken, L. Devriese, S. Garcés-Pastor, S. Minoudi, C. Gubili, P. L. Acutis in S. Mariani. 2021. Fish out of water: consumers’ unfamiliarity with the appearance of commercial fish species. Sustainability Science: https://doi.org/10.1007/s11625-021-00932-z. Europol. 2016. Operation OPSON V -Report. In: Europol https://www.europol.europa.eu/publications­ documents/operation-opson-v-report FAO, 2016. The State of World Fisheries and Aquaculture. (http://www.fao.org/3/ai5555e. pdf). Fields, A.T., Abercrombie, D.L., Eng, R., Feldheim, K. & Chapman, D.D. 2015. A novel mini-DNA barcoding assay to identify processed fins from internationally protected shark species. PLOS ONE, 10(2): e0114844. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0114844 Filipi, P. 2016. Ribištvo. V: Poročilo o stanju… v letu 2016. Ur. Marjeta Pintar, KIS, 159 strani Fiorino, G.M., Garino,C., Arlorio, M., Logrieco, A.F., Losito, I., Monaci, L.. 2018. Overview on Untargeted Methods to Combat Food Frauds:A Focus on Fishery Products. Journal of Food Quality, 2018:1­13, https://doi.org/10.1155/2018/1581746 Giusti, A., Armani, A., Sotelo, C.G. 2017. Advances in the analysis of complex food matrices: Species identification in surimi-based products using Next Generation Sequencing technologies. PLoS ONE 12(10): e0185586. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0185586 Griffiths, A.M., Sotelo, C.G., Mendes, R., Pérez-Martín, R.I., Schröder, U., Shorten, M., Silva, H.A., Verrez-Bagnis, V., Mariani, S. 2014. Current methods for seafood authenticity testing in Europe: Is there a need for harmonisation?. Food Control, 45: 95-100, http://dx.doi.org/10.1016/j.foodcont.2014.04.020 Guardone, L., Tinacci, L., Costanzo, F., Azzarelli, D., D’Amico, P., Tasselli, G., Magni, A., Guidi, A., Nucera, D. & Armani, A. 2017. DNA barcoding as a tool for detecting mislabeling of fishery products imported from third countries: An official survey conducted at the border inspection post of Livorno -Pisa (Italy). Food Control, 80:204– 216.https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2017.03.056 Handy, S. M., Deeds, J. R., Ivanova, N. V., Hebert, P. D., Hanner, R. H., Ormos, A., Weigt, L. A., Moore, M. M., Yancy, H. F. 2011. A single-laboratory validated method for the generation of DNA barcodes for the identification of fish for regulatory compliance. Journal of AOAC International, 94(1): 201-210. Hanner, R., Becker, S., Ivanova, N.V. & Steinke, D. 2011. FISH-BOL and seafood identification: geographically dispersed case studies reveal systemic market substitution across Canada. Mitochondrial DNA, 22 Suppl 1: 106–122. https://doi.org/10.3109/19401736.2011.588217 Hebert, P. D. N., Ratnasingham, S., de Waard, J. R. 2003. Barcoding animal life: cytochrome oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences, 270(Suppl 1): S96. Khaksar, R., Carlson, T., Schaffner, D.W., Ghorashi, M., Best, D., Jandhyala, S., Traverso, J. &Amini, S. 2015. Unmasking seafood mislabeling in U.S. markets: DNA barcoding as a unique technology for food authentication and quality control. Food Control, 56:71– 76.https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2015.03.007. Kuščer in Gregorinčič, 2013. Prava ureditev morskega ribištva. V: POTENCIALI povezovanja ribištva in turizma / uredila Tanja Mihalič, Gorazd Sedmak. -1. natis. -Ljubljana : Ekonomska fakulteta, 2013. -(Znanstvene monografije Ekonomske fakultete). Littlefair, J.E., Clare, E.L. 2016. Barcoding the food chain: from Sanger to high-throughput sequencing1. Genome 59: 946–958, dx.doi.org/10.1139/gen-2016-0028. Marko, P.B., Lee, S.C., Rice, A.M., Gramling, J.M., Fitzhenry, T.M., McAlister, J.S., Harper, G.R. & Moran, A.L. 2004. Fisheries: mislabelling of a depleted reef fish. Nature, 430(6997): 309– 310. https://doi.org/10.1038/430309b. Marko, P. B., Nance, H. A., & Guynn, K. D. (2011). Genetic detection of mislabeled fish from a certified sustainable fishery. Letter Curr Biol, 21 (16), R621eR622.http://dx.doi.org/10.1016/j.cub.2011.07.006. Martinsohn, J. 2011. Deterring illegal activities in the fisheries sector -genetics, genomics, chemistry and forensics to fight IUU fishing and in support of fish product traceability. Publications Office of the European Union. (also available at http://publications.jrc.ec.europa.eu/repository/handle/111111111/16295). Martinez, I., James, D. & Loréal, H. 2005. Application of modern analytical techniques to ensure seafood safety and authenticity. FAO Fisheries Technical Paper No. 455. Rome, FAO. 73 pp. Meloni, D., Piras, P. & Mazzette, R. 2015. Mislabelling and species substitution in fishery products retailed in Sardinia (Italy), 2009-2014. Italian Journal of Food Safety, 4(4). https://doi.org/10.4081/ijfs.2015.5363 Nielsen, E. E., Cariani, A., Aoidh, E. M., Maes, G. E., Milano, I., Ogden, R., Taylor, M., Hemmer-Hansen, J., Babbucci, M., Bargelloni, L., Bekkevold, D., Diopere, E., Grenfell, L., Helyar, S., Limborg, M. T., Martinsohn, J. T., McEwing, R., Panitz, F., Patarnello, T., Tinti, F., Van Houdt, J. K. J., Volckaert, F. A. M., Waples, R. S., FishPopTrace, c., Carvalho, G. R. 2012. Gene-associated markers provide tools for tackling illegal fishing and false eco-certification. Nature Communications, 3: 851. NOAA (National Oceanic and Atmospheric Administration). (2013). Imports and exports of fishery products annual summary. http://www.st.nmfs.noaa.gov/st1/publications.html Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K., Amino, N., Hase, T. 2000. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research, 28: E63 Saull, J., Duggan, C., Hobbs, G., Edwards, T. 2016. The detection of Atlantic cod (Gadus morhua) using loop mediated isothermal amplification in conjunction with a simplified DNA extraction process. Food Control, 59: 306-313. Pardo, M.A., Pérez-Villareal, B. 2004. Identification of commercial canned tuna species by restriction site analysis of mitochondrial DNA products obtained by nested primer PCR. Food Chemistry, 86: 143-150. Pauly, D., Zeller, D. 2017. Comments on FAOs State of World Fisheries and Aquaculture (SOFIA 2016), Marine Policy 77 (2017) 176–181 http://dx.doi.org/10.1016/j.marpol.2017.01.006. Pardo, M.A., Jiménez, E., Pérez-Villareal, B.2016. Misdescription incidents in seafood sector, Food Control 62 (2016) 277e283 http://dx.doi.org/10.1016/j.foodcont.2015.10.048 Pollack, S. J., Kawalek, M. D., Williams-Hill, D. M., Hellberg, R. S. 2018. Evaluation of DNA barcoding methodologies for the identification of fish species in cooked products. Food Control, 84: 297­304. Shokralla, S., Hellberg, R. S., Handy, S. M., King, I., Hajibabaei, M. 2015. A DNA Mini-Barcoding System for Authentication of Processed Fish Products. Scientific Reports, 5: 15894. Taboada, L., Sánchez, A., Sotelo, C. G. 2017. A new real-time PCR method for rapid and specific detection of ling (Molva molva). Food chemistry, 228: 469-475. Tomás, C., Ferreira, I. M. P. L. V. O., Faria, M. A. 2017. Codfish authentication by a fast Short Amplicon High Resolution Melting Analysis (SA-HRMA) method. Food Control, 71: 255-263. Ulrich, R.M., John, D.E., Barton, G.W., Hendrick, G.S., Fries, D.P., Paul. J.H.2015. A handheld sensor assay for the identification of grouper as a safeguard against seafood mislabelling fraud Food Control 53 (2015) 81e90 http://dx.doi.org/10.1016/j.foodcont.2015.01.022 Warner, K., Timme, W., Lowell, B. & Hirshfield, M. 2013. Oceana study reveals seafood fraud nationwide http://oceana.org/sites/default/files/reports/National_Seafood_Fraud_Testing_Results_FINAL.pdf Willette, D.A., Simmonds, S.E., Cheng, S.H., Esteves, S., Kane, T.L., Nuetzel, H., Pilaud, N.,Rachmawati, R. & Barber, P.H. 2017. Using DNA barcoding to track seafood mislabeling in Los Angeles restaurants. Conservation Biology: The Journal of the Society for Conservation Biology, 31(5): 1076–1085. https://doi.org/10.1111/cobi.12888. Wong, E. H. K., Hanner, R. H. 2008. DNA barcoding detects market substitution in North American seafood. Food Research International, 41(8): 828-837. Priloge Priloga 1 Izolacija DNA Za izolacijo DNA smo optimizirali dva protokola in sicer protokol prirejen po Japelaghi in sod. (2011) in komercialni kit za izolacijo DNA E.Z.N.A Mollusc DNA Kit (OMEGA bio-tek) za izolacijo DNA iz konzerviranih rib, filetov in lignjev. Izolacija DNA z omenjenim kitom je enostavnejša in izolirana DNA je čistejša zaradi silikatnih kolon. PROTOKOL ZA IZOLACIJO CELOKUPNE DNA S CTAB Protokol smo optimizirali, da je primeren za izolacijo celokupne DNA iz svežih rib, filetov, ribjih konzerv in iz lignjev. Protokol je prirejen po tehniki izolacije DNA, ki so jo objavili Japelaghi in sod. (2011). Za izolacijo DNA izkonzerviranih rib je potrebno predhodno razmaščevanje zaradi jedilnih olj, ki so dodana konzerviranim izdelkom. Postopek razmaščevanja poteka preko noči v mešanici kloroforma, metanola in destilirane vode v razmerju 1:2:0.8, v temnem prostoru na sobni temperaturi. Priprava ekstrakcijskega pufra (za pripravo 200 mL): › 60 mL 1M Tris-HCl (pH 8) › 10 mL 0,5M EDTA (pH 8) › 23,36 g NaCl › 4 g PVP › 4 g CTAB › 4 mL ß-merkaptoetanola (dodamo tik pred uporabo) Za pripravo ekstrakcijskega pufra smo v merilni čaši zmešali vse naštete kemikalije, razen ß-merkaptoetanola, in dopolnili z destilirano vodo do oznake 200 mL. ß-merkaptoetanol smo dodali tik pred postopkom izolacije DNA. Postopek izolacije DNA: 1. Košček živalskega tkiva oz. predhodno razmaščen košček ribjega mesa iz konzerve smo popivnali na papirnati brisači. 2. Košček tkiva (približno 0,03g) smo dali v terilnico, ga dobro strli (Slika 1) in mu dodali 1,2 ml ekstrakcijskega pufra CTAB-PVP, ki smo ga predhodno segreli na 65 °C ter homogenizirali vzorec. Slika 1 Priprava ribjega mesa in homogenizacija v terilnici. 3. Homogenizirane vzorce smo prenesli v 2 ml mikrocentrtifugirke in jih 30 min inkubirali v vodni kopeli pri 65 °C. Med inkubacijo smo vzorce vsakih 5 minut dobro premešali. 4. Po inkubaciji smo vzorcem dodali 500 µl mešanice fenol-kloroform-izoamil alkohola, pripravljene v razmerju 25:24:1. Vzorce smo dobro premešali (vorteksirali) in jih 15 min centrifugirali pri hitrosti 14.000 rpm (centrifuga Eppendorf 5430R, Nemčija) in temperaturi 4 °C. 5. Supernatant (Slika 2) smo odpipetirali v novo 1,5 ml mikrocentrifugirko in vzorcem ponovno dodali 500 µl mešanice fenol-kloroform-izoamil alkohola. Vzorce smo dobro premešali (vorteksirali) in jih 15 min centrifugirali pri hitrosti 14.000 rpm (centrifuga Eppendorf 5430R, Nemčija) in temperaturi 4 °C. Slika 2 Ločitev DNA v vodni fazi od preostalih celičnih komponent. 6. Supernatant smo odpipetirali v novo 1,5 ml mikrocentrifugirko in DNA oborili z dodatkom 70 µl 3 M Na-acetata (pH 5,2) in 700 µl ledeno hladnega izopropanola. Vzorce smo premešali (vorteksirali) in inkubirali 30 min pri -80 °C. 7. Po končani inkubaciji smo vzorce ponovno dobro premešali in jih 30 min centrifugirali pri hitrosti 14.000 rpm in temperaturi 4 °C. 8. Supernatant smo odpipetirali, usedlino DNA sprali s 700 µL 70 % etanola ter vzorce posušili na sobni temperaturi. 9. DNA smo raztopili v 30-50 µl pufra TE [10mM Tris-HCl (pH 8,0), 1mM EDTA (pH 8,0)] in jo do nadaljnjih analiz shranili na -20 °C. Reference: Japelaghi R., Haddad R., Garoosi G. A. 2011. Rapid and Efficient Isolation of High Quality Nucleic Acids from Plant Tissues Rich in Polyphenols and Polysaccharides. Molecular Biotechnology, 49(2), 129­137. Reference: Chapela M. J., Sotelo C. G., Pérez-Martín R. I., Pardo M. Á., Pérez-Villareal B., Gilardi P., Riese, J. 2007. Comparison of DNA extraction methods from muscle of canned tuna for species identification. Food Control, 18(10): 1211-1215. Merjenje koncentracije DNA: Koncentracijo DNA vseh vzorcev smo izmerili s fluorimetrično metodo na fluorimetru QubitTM v 3.0 (Invitrogen, ZDA) in s kompletom reagentov Quant® dsDNA BR Assay Kit (Invitrogen, ZDA). Postopek merjenja koncentracije je bil sledeč: 1. Najprej smo pripravili delovno raztopino tako, da smo reagent (Quant® dsDNA BR Reagent) redčili s pufrom (Quant® dsDNA BR Buffer) v razmerju 1:200. 2. Po 190 µl delovne raztopine smo odpipetirali v merilni centrifugirki (Quant® assay tubes) za standarda. V eno centrifugirko smo dodali 10 µl standarda 1 (Quant® dsDNA BR Standard #1), ki ne vsebuje DNA, v drugo centrifugirko pa 10 µl standarda 2 (Quant® dsDNA BR #2), ki vsebuje 100 ng/µl DNA. 3. Nato smo pripravili še vzorce DNA, tako, da smo v Qubit merilno centrifugirko odpipetirali 199 µl delovne raztopine in dodali po 1 µl izolirane DNA. Vzorčke smo rahlo premešali, počakali približno 3 min in nato pričeli z merjenjem koncentracije. 4. Na fluorimetru smo v osnovnem meniju najprej izbrali »dsDNA« in nato program Quant-iT dsDNA Broad Range. Fluorimeter smo najprej umerili s standardoma 1 in 2, nato pa izmerili koncentracijo DNA vseh vzorcev v µg/ml. Priloga 2 Filogenetsko drevo lignjev narejeno na osnovi COI (vir: M. Rubinić magistrsko delo, Univerza v Reki). Priloga 3 Zbirna tabela za lignje z opisom ponudbe, skladnost z Pravilnikom o trgovskih imenih rib in drugih ribolovnih organizmov ter rezultati barkodiranja s COI. Koda Opis Trgovsko ime Znanstveno Pravilnik o trgovskih imenih rib in drugih Veljavnost Rezultati FAO območja trgovine proizvoda/oblika na proizvodu ime na ribolovnih organizmov (Ur. L. RS, št. 46/2005) imena v barkodiranja ponudbe (natančen proizvodu WORMS prepisano z prepis z (natančen Deklaracija/FAO deklaracije deklaracije) prepis z Trgovsko ime Znanstveno Skladnost deklaracije) ime 01 Lignji Jadranski lignji Loligo vulgaris Navadni ligenj Loligo vulgaris NE Loligo vulgaris Loligo vulgaris 37/27,34,37,47 01 Lignji očiščeni Atlantski lignji Loligo gahi Patagonski ligenj Loligo gahi NE Doryteuthis gahi Doryteuthis gahi 47/41,87 02 Lignji očiščeni lignji Loligo spp. lignji Loligo spp. DA Not relevant Loligo vulgaris* 51/27,34,37,47 03 Lignji, celi, očiščeni, z lignji Loligo duvaceli lignji Loligo spp- NE Uroteuthis duvaucelli Doryteuthis gahi 51/41,87 zaščitno vodno glazuro 03 N.P. N.P. Loligo Ne obstaja v Ne obstaja v NE Uroteuthis Uroteuthis 61/51,57,61,71 chinensis pravilniku pravilniku chinensis duvaucelii 03 Patagonski lignji, očiščeni, trupi in lovke patagonjsko lignji Loligo chinesis Patagonski ligenj Loligo gahi NE Doryteuthis gahi Doryteuthis gahi 41/41,87 04 Patagonski lignji, hitro zmrznjeni patagonski lignji Loligo gahi Patagonski ligenj Loligo gahi DA Doryteuthis gahi Doryteuthis gahi 41/41,87 05 Lignji orjaški lovke kuh. rez. orjaški ligenj Dosidicus gigas Orjaški ligenj Dosidicus gigas DA Dosidicus gigas Dosidicus gigas 87/57,67,77,87 06 Lignji (patagonski) lignji Loligo gahi lignji Loligo spp. NE Doryteuthis gahi 41/41,87 07 Lignji patagonika Patagonski lignji Loligo patagonica Patagonski ligenj Loligo gahi NE Doryteuthis gahi Doryteuthis gahi 42/41,87 08 Lignji, neočiščeni lignji Loligo spp. lignji Loligo spp. DA Doryteuthis gahi 0/41,87 08 Očiščeni lignji Indijski lignji Loligo duvaceli Ne obstaja v pravilniku Ne obstaja v pravilniku NE Uroteuthis duvaucellii Uroteuthis duvaucelii 51/51,57,61,71 09 Lignji neočiščeni lignji Loligo spp. lignji Loligo spp. DA Uroteuthis chinensis 0/61, 71, 81 010 Lignji patagonski Patagonski Loligo Patagonski Loligo gahi NE Doryteuthis Kontaminirani JZ-ATL/41,87 odtaljeni lignji patagonica ligenj gahi vzorci morda D. gahi 010 Lignji totan Lignji totan Todarodes sagitatus Norveški puščičasti ligenj Todarodes sagittatus NE Todarodes sagittatus Illex coindetii 0/41,87 011 Lignji patagonika očiščeni Patagonski lignji Loligo spp. Patagonski ligenj Loligo gahi NE Doryteuthis gahi Illex coindetii JZ-ATL/41,87