Simpozij z mednarodno udeležbo Vodni dne Vi 2015 Podčetrtek, 15.—16. oktober 111 110 FARMAKoLoŠKo AKTiVne Sno Vi V Vodoo SKRBneM SiSTeMU URBAneGA oKoLJA VeSnA HRŽenJAK 1 , mag. VenČeSLAV LAPAJne 2 Povzetek Opredelitev problema in izhodišča: Farmakološko aktivne snovi (FAS) so kompleksne molekule z zelo različnimi funkcionalnimi, fizikalno-kemičnimi in biološkimi lastnostmi. Šte- vilne do sedaj izvedene raziskave v Evropi in ZDA so pokazale prisotnost FAS-ov oziroma njihovih ostankov v odpadnih in površinskih vodah, podtalnici in tudi v pitni vodi, zaradi česar so bili FAS-i spoznani kot pomemben dejavnik tveganja v okolju. Namen: Opredeliti pojavnost FAS-ov oziroma njihovih ostankov v vodnem ciklu vodooskrb- nega sistema Mestne občine Maribor. Metode dela: V analizo so bili vključeni vzorci vode iz vseh delov vodnega cikla vodoo- skrbnega sistema Mestne občine Maribor (površinske, podzemne, odpadne in pitne vode). Za analizo vzorcev je bila uporabljena metoda tekočinske kromatografije v kombinaciji z masnoselektivnim detektorjem (LC/MS/MS). Vnos podatkov v računalnik je potekal s pro- gramom Microsoft EXCEL, s katerim so se podatki tudi analizirali. Rezultati in zaključek: Na določenih odvzemnih mestih vodnega cikla vodooskrbnega sistema Mestne občine Maribor je bila ugotovljena prisotnost petih farmakološko aktivnih snovi: kofeina, teofilina, paracetamola, karbamazepina in sulfametoksazola, kar kaže, da so ostanki FAS-ov v vodnem ciklu prisotni in lahko predstavljajo dolgoročno potencialno nevar- nost za okolje in tudi za človeka. Ključne besede: farmakološko aktivne substance, odpadna voda, pitna voda, podtalnica, površinske vode 1 Vesna Hrženjak, dr. med., spec. javnega zdravja, Nacionalni laboratorij za zdravje, okolje in hrano 2 Mag. Venčeslav Lapajne, univ. dipl. kem., zunanji strokovni sodelavec Nacionalnega laboratorija za zdravje, okolje in hrano Že četrtletje Vaš partner za čisto okolje. Področja našega dela in strokovnosti: • pr ojektir anje in idejne r ešit v e • čišč enje komunalne in industr ijske odpadne v ode s fizik alnimi, biološk imi in kemijsk imi post opk i • pr ipr a v a pitne in industr ijske v ode z r azličnimi fizik alnimi in kemijsk imi post opk i • baz ensk a t ehnik a • namak alni sist emi • mon taža opr eme in zagon sist emo v • šolanje osebja in ser visir anje sist emo v • zast opst v o domačih in tujih podjetij s podr očja t ehnolog ije v ode Spletna str an: www.impvoda.com Elektronski naslov: tehnologijavode@siol.net Simpozij z mednarodno udeležbo Vodni dne Vi 2015 Podčetrtek, 15.—16. oktober 113 112 lastnosti FAS-ov, ki so nujno potrebne za njihov terapevtski učinek, vplivajo tudi na usodo FAS-ov po izločanju v okolje. Lipofilnost jim omogoča vstop v prehrambno verigo in povečeva- nje njihove vsebnosti vzdolž le-te, obstojnost pa pomeni tudi obstojnost v okolju [3]. 1.2. izhodišča FAS-i oziroma njihovi ostanki v okolju so skupina novih, tako imenovanih »emerging« konta- minantov okolja, ki v zadnjih letih povzročajo zaskrbljenost strokovne in laične javnosti zaradi naslednjih razlogov: • zaradi njihovega stalnega sproščanja v okolje preko iztokov iz čistilnih naprav in iz sep- tičnih sistemov, zaradi česar jih uvrščamo med pseudo-perzistentne kontaminante, kar pomeni, da se njihova morebitna transformacija in razgradnja v okolju kompenzirata s stalnim sproščanjem v okolje; • razviti so z namenom, da sprožijo neki biološki efekt, • pogosto imajo enake fizikalno-kemične značilnosti kot drugi znani škodljivi ksenobiotiki (obstojnost, lipofilnost), • uporabljajo se v velikih količinah [4]. 2. nAMen Opredeliti pojavnost FAS-ov oziroma njihovih ostankov v vodnem ciklu vodooskrbnega siste- ma Mestne občine Maribor. 3. MeTode de LA 3.1. opis vzorca V analizo vsebnosti FAS-ov oziroma njihovih ostankov smo vključili vzorce vode iz vseh delov vodnega cikla vodooskrbnega sistema Mestne občine Maribor, kar pomeni analizo vzorcev površinske, podzemne, odpadne in pitne vode. Vzorci za analizo so bili odvzeti na izbranih lokacijah Mestne občine Maribor, na katerih smo pričakovali največji vpliv na vsebnost FAS-ov oziroma njihovih ostankov v pitni vodi, namenjeni končnemu uporabniku. Predvidena mesta vzorčenja so prikazana v tabeli 1. 1. UVod 1.1. opredelitev problema Farmakološko aktivne snovi so heterogena skupina substanc, sestavljena predvsem iz zdravil, ki se uporabljajo v humani medicini, kot so zdravila za izključno bolnišnično uporabo, zdravila za domačo uporabo, ki se predpisujejo na recept, in zdravila v prosti prodaji ter v veterinarski medicini [2]. Delimo jih lahko glede na njihov terapevtski učinek (npr.: antibiotiki, analgetiki, citostatiki …) ali glede na kemično strukturo (npr. antibiotike delimo glede na kemično struk- turo v cefalosporine, peniciline, kinolone …) [1]. FAS-i se v humani ali veterinarski medicini lahko uporabljajo na različne načine: oralno, dermalno ali parenteralno, odvisno od same substance in medicinske indikacije [1]. Določeni FAS-i se uporabljajo tudi v pridelavi živil (npr. streptomicin v sadjarstvu, dezinficiensi v predelavi živil) in v kozmetični negi [1]. Posledica uporabe FAS-ov v različne namene je njihovo izločanje v okolje. Zaradi pravil dobre proizvodne prakse in praviloma visoke cene aktivnih substanc so emisije med proizvodnjo, transportom in skladiščenjem FAS-ov minimalne. Večje lokalne emisije običajno nastanejo le pri nesrečah [1]. Točkasti viri onesnaženja so zato v primeru FAS-ov manj pomembni, priso- tnost v okolju je predvsem posledica razpršenih virov, pri čemer so najpogostejši viri FAS-ov v okolju uporaba FAS-ov v zdravstvenih ustanovah in domačem okolju. Večina FAS-ov in njiho- vih metabolitov se po uporabi skupaj z izločki (blato, urin) izloča z odpadnimi vodami v sistem kanalizacije in preko njega v čistilne naprave. Če FAS-i ali njihovi metaboliti v čistilni napravi niso odstranjeni, lahko vstopijo v vodno okolje in jih posledično najdemo tudi v pitni vodi. Manj pomemben, vendar ne nepomemben, vir FAS-ov v okolju je nepravilno odstranjevanje neporabljenih zdravil ali zdravil s preteklim rokom uporabe. Čeprav Evropska zakonodaja že od leta 1994 prepoveduje tovrstno odstranjevanje zdravil, se še vedno veliko zdravil odloži med komunalne odpadke ali se splakne v sistem kanalizacije. Raziskave, opravljene v posa- meznih državah Evropske unije, so pokazale, da je bila kar ena tretjina celotnega volumna FAS-ov prodana v Nemčiji (2003) in okoli 25 % prodanih v Avstriji (1999) odstranjena na ta način [1]. Celotna količina FAS-ov se na ta način izloči v okolje nespremenjena, to je kot aktiv- na substanca. Pri odlaganju med komunalne odpadke FAS-i pristanejo na deponiji komunalnih odpadkov in preko izcednih vod tudi v podtalnici ter posledično v pitni vodi, pri splaknjenju v sistem kanalizacije pa preko čistilne naprave v površinskih vodah. Pomemben vir FAS-ov v okolju je tudi kmetijstvo, zlasti živinoreja. V živinoreji se med FAS-i največ uporabljajo protimikrobni FAS-i [1]. Zdravila, ki se uporabljajo v živinoreji za zdravlje- nje ali za pospeševanje rasti, in njihovi metaboliti se po uporabi skupaj z izločki (blato, urin) izločijo v gnojevki, ki jo kmetje uporabljajo za gnojenje njiv, in s tem pridejo v tla. S spira- njem pri močnejšem deževju lahko dosežejo površinske vode, s filtracijo v tleh pa podtalnico in pitno vodo. Za FAS-e je značilno, da imajo specifične lastnosti, pomembne za njihovo delovanje, kot so lipofilnost, ki jim omogoča prehod preko celične membrane, in obstojnost kemijske strukture, ki jim omogoči delovanje [3]. Večina FAS-ov je polarnih in visoko bioaktivnih [4]. Specifične Simpozij z mednarodno udeležbo Vodni dne Vi 2015 Podčetrtek, 15.—16. oktober 115 114 Izbor FAS-ov oziroma njihovih ostankov, ki so se analizirali, je potekal na podlagi naslednjih kriterijev: • pregled strokovne literature in podobnih tujih raziskav o pojavnosti in obnašanju FAS-ov oziroma njihovih ostankov v vodnem okolju (primer: Nemčija, Italija) [5, 6]; • določitev najpogosteje predpisovanih zdravilnih učinkovin v Republiki Sloveniji glede na število izdanih receptov [7]; • pregled toksikoloških in drugih pomembnih lastnosti najpogosteje predpisovanih zdravil- nih učinkovin v Republiki Sloveniji glede na število izdanih receptov; • analitske zmožnosti laboratorijev (obstoječi »paketi« preiskav, multirezidualne metode ipd.). Za analizo vzorcev glede vsebnosti FAS-ov oziroma njihovih ostankov na podlagi zgoraj nave- denih kriterijev je bil določen naslednji izbor FAS-ov oziroma njihovih ostankov (glej tabelo 2). Tabela 2: Izbor FAS-ov oziroma njihovih ostankov za analizo odvzetih vzorcev Spojina CAS 17 beta estradiol 50-28-2, 57-91-0 (±) Acetilsalicilna kislina 50-78-2 Betaksolol 63659-18-7 Bezafibrat 41859-67-0 Dietilstilbestrol 56-53-1 Diklofenak Estriol 50-27-1 Estron 53-16-7 Etnilestradiol 77538-56-8 Fenofibrat 49562-28-9 Fenoterol 3.12.1944 Gemfibrozil 25812-30-0 Indometacin 53-86-1 Karbamazepin 298-46-4 Ketoprofen 56105-81-8 Kodein 41444-62-6 Kofein 95789-13-2 Mestranol 72-33-3 Metoprolol 83-43-2 Penicilin 1538-09-8 Propanolol 318-98-9 Sulfametoksazol 723-46-6 Sulfomerazin 127-79-7 Tamoksifen 10540-29-1 Teofilin 75448-53-2 Testosteron 58-22-0 Triklosan 3380-34-5 Tabela 1: Mesta vzorčenja Tip vode Mesto vzorčenja Območje Število vzorcev Podzemna voda Vrbanska VM 1 Maribor 1 Betnava 2 Maribor 1 Bohova 2 Bohova, Hoče - Slivnica 1 KP 2 Maribor 1 LD IEI 2 Limbuška Dobrava, Maribor 1 VMB 1 (preskusna vrtina) Drava 1 Površinska voda Reka Drava pred HE Mariborski otok Maribor, Mariborski otok 1 Reka Drava dolvodno od iztoka CČN Maribor Maribor, Duplek 1 Odpadna voda Vtok v CČN Maribor 1 Iztok iz CČN Maribor 1 Pitna voda Oskrba z območja vodnega zajetja Vrbanski plato – 3 lokacije uporabe pitne vode Maribor 3 Oskrba z območja vodnega zajetja Bohova – 3 lokacije uporabe pitne vode Maribor, Hoče - Slivnica 3 Oskrba z območja vodnega zajetja Betnava – 3 lokacije uporabe pitne vode Maribor 3 Skupaj 19 Iz tabele 1 je razvidno, da je bilo analiziranih 6 vzorcev podzemne vode, 2 vzorca površinske vode, 2 vzorca odpadne vode in 9 vzorcev pitne vode. Vzorci so bili odvzeti v obdobju nizkega vodostaja (oktobra). 3.2. orodja in metode zbiranja podatkov Vzorčenje podzemne, površinske in pitne vode se je izvajalo v okviru projekta oziroma v pove- zavi s projektom Prehodni vir – Reorganizacija zavodov za zdravstveno varstvo in laboratorijev na področju kemijske varnosti, CRIS 2006/018-158.05.01.01. Vzorčenje so opravili vzorčeval- ci Zavoda za zdravstveno varstvo Maribor. Za analizo vzorcev glede vsebnosti FAS-ov oziroma njihovih ostankov je bila uporabljena me- toda tekočinske kromatografije v kombinaciji z masnoselektivnim detektorjem (LC/MS/MS). Simpozij z mednarodno udeležbo Vodni dne Vi 2015 Podčetrtek, 15.—16. oktober 117 116 5. ZAKLJUČeK Na določenih odvzemnih mestih vodnega cikla vodooskrbnega sistema Mestne občine Maribor so bile izmerjene povišane koncentracije za pet farmakološko aktivnih snovi. Za vse ostale FAS-e in v vseh ostalih vzorcih je bil rezultat pod mejo kvantifikacije (LOQ) za izbrano analit- sko metodo. Dve substanci, kofein (0,06 µg/l in 0,07 µg/l) in karbamazepin (0,08 µg/l), sta bili prisotni v podzemni vodi, povišano vsebnost paracetamola (0,16 µg/l, 0,22 µg/l in 0,06 µg/l) in sulfametoksazola (0,06 µg/l, 0,09 µg/l) smo izmerili v površinski vodi, teofilin (0,07 µg/l) pa je bil prisoten na pipi uporabnika, vendar le na eni lokaciji. Na vtoku v čistilno napravo Maribor smo izmerili prisotnost paracetamola (0,22 µg/l) in sulfametoksazola (0,09 µg/l), na iztoku iz čistilne naprave pa je bil med meritvami prisoten le paracetamol (0,06 µg/l). Ugotovimo lahko, da je izmerjena koncentracija teofilina in kofeina zanemarljiva v primerjavi s koncentracijami, ki jih vnašamo v telo z običajno prehrano, saj gre za substanci, ki sta na- ravno prisotni v živilih, ki predstavljajo del človekove vsakdanje prehrane. Izmerjene koncen- tracije so zelo nizke, tik nad mejo kvantifikacije. Teofilin smo v koncentraciji 0,07 µg/l sicer izmerili na eni lokaciji v pitni vodi na pipi uporabnika, vendar v ostalih vzorcih pitne vode na lokacijah, ki se napajajo iz istega vira, teofilin na pipi uporabnika ni bil prisoten. Prav tako nismo v nobenem drugem vzorcu zasledili prisotnosti teofilina. Prisotnost paracetamola, karbamazepina in sulfametoksazola v površinskih in podzemnih vo- dah pa kaže, da so ostanki farmakološko aktivnih substanc v vodnem ciklu prisotni in lahko predstavljajo dolgoročno potencialno nevarnost za okolje in tudi za človeka. Posebej zaskr- bljujoča sta zlasti dva vidika. Prvi je dolgoročna izpostavljenost človeka ter njen vpliv na zdravje, predvsem otrok in občutljivejšega dela populacije, če bi se pojavljali v pitni vodi na pipi uporabnika. Drugi je potencialna možnost povečanja rezistence bakterij v vodnem okolju, kar bi povzročilo vrsto škodljivih učinkov za okolje. Poudariti je treba, da so pridobljeni podatki rezultat enkratnega vzorčenja na izbranih loka- cijah, in še to le v vodi (ni vključen sediment), zato so lahko le okvirni pokazatelj stanja v nekem trenutku, nikakor pa ni mogoče na njihovi podlagi oceniti realne izpostavljenosti za človeka in okolje, ki bi bila temelj za izdelavo relevantne ocene tveganja. Da bi lahko ocenili dejansko stanje, bi bilo treba opraviti več meritev ob različnih okoljskih pogojih (različni vodostaji), vključiti pa bi bilo treba tudi meritve v sedimentu, saj fizikalno-ke- mijske lastnosti mnogih farmakoloških snovi kažejo tendenco kopičenja le-teh v sedimentu. Prav tako bi bilo smiselno izvajati kontinuirane meritve na vtoku in iztoku iz čistilne naprave. Te bi dale vpogled v obremenjenost čistilne naprave s farmakološko aktivnimi snovmi preko človeških izločkov ter v njeno učinkovitost. Problem mnogih farmakoloških snovi je namreč, da so slabo ali pa sploh niso biorazgradljive, zato je učinkovitost njihovega odstranjevanja v biološki čistilni napravi nizka. Spojina CAS Trimetoprim Paracetamol 103-90-2 Enalapril (enalaprilat) 75847-73-3 Klofibrinska ksl (klofibrin) 82115-62-6 Omeprazol 82115-62-6 Amoksicilin trihidrat 26787-78-0 Naproxen 22204-53-1 3.3. orodja in metode urejanja podatkov in statistične analize Vnos podatkov v računalnik je potekal s programom Microsoft EXCEL, s katerim so se podatki tudi analizirali. 4. ReZULTATi Na določenih odvzemnih mestih vodnega cikla vodooskrbnega sistema Mestne občine Mari- bor je bila ugotovljena prisotnost petih farmakološko aktivnih snovi nad mejo kvantifikacije (LOQ): kofeina, teofilina, paracetamola, karbamazepina in sulfametoksazola. Vsebnost FAS- -ov v teh vzorcih je bila nizka (od 0,06 µg/l do največ 0,22 µg/l). V vseh preostalih vzorcih je bila vsebnost analiziranih FAS-ov nižja od izbrane analitske metode LOQ. Tabela 3: Vsebnost FAS-ov v analiziranih vzorcih Območje Mesto odvzema Karbamazepin Kofein Paracetamol Sulfametoksazol Teofilin µg/l µg/l µg/l µg/l µg/l Limbuška dobrava IEI-LD2 0,08 0,06 <0,05 <0,05 <0,05 Piezometri Maribor KP-2 <0,05 0,07 <0,05 <0,05 <0,05 Drava Drava - Mariborski otok <0,05 <0,05 0,16 <0,05 <0,05 Betnava - vodovodni sistemi <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 0,07 Čistilna naprava Maribor - Dogoše Dotok OV na ČN <0,05 <0,05 0,22 0,09 <0,05 Čistilna naprava Maribor - Dogoše Iztok OV iz ČN <0,05 <0,05 0,06 <0,05 <0,05 MV Maribor Drava - Duplek <0,05 <0,05 <0,05 0,06 <0,05 Simpozij z mednarodno udeležbo Vodni dne Vi 2015 Podčetrtek, 15.—16. oktober 119 118 LiTeRATURA in ViRi 1. Kümmerer, K.: Pharmaceuticals in the Environment: Sources, Fate, Effects and Risks, Spriger – Verlag, 2004. 2. AWWA Research Foundation, Occurrence survey of Pharmaceutically Active Coumpounds, 2005. 3. Montague, P.: Drugs in Water. That glass of tap water may contain a dosen different drugs. San diego Earth Times, 1998, pridobljeno s spletne strani http://www.sdearthtimes.com/et1098/et1098s5.html. 4. Barcelo, D., Petrovic, M.: Pharmaceuticals and personal care products (PPCPs) in the environment. In: Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2007, Vol. 387. No. 4. February. Str. 1141–1142. 5. Zuccato, E., Castiglioni, S., Fanelli, R., Baquati, R., Colamari, D.: Changes in te Presence and concentra- tions of Pharmaceuticals for Human Use in Italy. In: K. Kümmerer. Pharmaceuticals in the Environment: Sources, Fate, Effects and Risks, Spriger – Verlag, 2004. 6. Heberer, T., Reddersen, K.: Occurence and Fate of Pharmaceutical Residues in the Aqutic System of Berlin as an Example for Urban Ecosystems, 2nd International Conference on Pharmaceuticals and Endocrine Disrupting Chemicals in Water, Minnesota, Oktober, 2001. 7. Ambulantno predpisovanje zdravil v Sloveniji po ATC klasifikaciji v letu 2006, Inštitut za varovanje zdravja Republike Slovenije, Ljubljana, december 2007. ViRUSi, SPReGLed Ani one SnAŽeVALCi Vod A dr. neJC RAČKi 1 , dr. ion GUTieRReZ-AGUiRRe 2 , prof. dr. MAJA RAVniKAR 3 Povzetek Med patogene mikrobe, ki povzročajo biološko onesnaženje voda, štejemo patogene praži- vali, bakterije, glive in viruse. Kljub temu da so pri ljudeh virusi odgovorni za skoraj polovico vseh okužb, ki se širijo z vodo, so pogosto spregledani. V okoljskih vodah se patogeni virusi pojavljajo v nizkih koncentracijah, ki pa zaradi izjemne infektivnosti še vedno lahko povzro- čijo okužbo, še posebej, če zaidejo v pitno vodo. Njihova prisotnost v okoljskih in pitnih vo- dah je med drugim tudi posledica neučinkovitosti tradicionalnih metod čiščenja voda, ki so bile razvite za odstranjevanje patogenih praživali in bakterij, ter so zato pri odstranjevanju ali inaktivaciji mnogo manjših in robustnejših virusov pogosto manj učinkovite. Do nedav- nega je problem predstavljala tudi detekcija virusov. Skupaj z razvojem novih molekularnih metod, ki omogočajo učinkovit in zanesljiv način določanja virusov v vodah, se spreminjajo tudi trendi pri regulatornih telesih, ki so odgovorna za nadzor kakovosti vode. V nekaterih državah so virusi v pitnih vodah delno že regulirani. V prispevku bomo predstavili rezultate večletnih raziskav, v katerih smo se skupaj s partnerskimi institucijami posvetili izboljšavi in razvoju metod za koncentriranje, določanje in kvantifikacijo tako humanih kot tudi rastlin- skih virusov v vodah ter razvili novo metodo odstranjevanja virusov iz odpadnih vod. Ključne besede: detekcija, koncentriranje, kvantifikacija, odstranjevanje, virusi v vodah, zakonodaja Abstract Biological contamination of water is caused by pathogenic microbes such as protozoa, bac- teria, fungi and viruses. Despite viruses are responsible for approximately half of the wa- terborne infections, they remain overlooked by majority of water regulatory bodies. In the environment waterborne viruses are usually found in low concentrations that due to their extremely low infectivity dose still pose a threat to human health, especially if they find their way into drinking waters. Traditional water treatment was designed for removal of pathogenic protozoa and bacteria, thus being much less effective for removal of the much smaller and robust waterborne viruses. Until just recently, the detection of viruses was long, inefficient and laborious. The development of molecular methods that enable efficient and 1 Dr. Nejc Rački, Nacionalni inštitut za biologijo, Oddelek za biotehnologijo in sistemsko biologijo 2 Dr. Ion Gutierrez-Aguirre, Nacionalni inštitut za biologijo, Oddelek za biotehnologijo in sistemsko biologijo 3 Prof. dr. Maja Ravnikar, Nacionalni inštitut za biologijo, Oddelek za biotehnologijo in sistemsko biologijo