ANALIZA IN NADZOR ZDRAVIL UČNO GRADIVO ZA VAJE Stane Pajk, Martina Hrast Rambaher, Damijan Knez in Janez Ilaš Ljubljana, 2023 ANALIZA IN NADZOR ZDRAVIL Učno gradivo za vaje Avtorji: Stane Pajk, Martina Hrast Rambaher, Damijan Knez, Janez Ilaš Recenzenti – študentje: Metka Kocjančič Nastja Pavlišič Zala Pestotnik Anja Tršek, Ana Rahne Recenzenti: izr. prof. dr. Janez Mravljak, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo doc. dr. Rok Frlan, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo dr. Ema Valentina Brovč, Novartis d. o. o. dr. Žiga Hodnik, Krka d. d. Lektoriranje: Helena Kavaš Grafično oblikovanje in prelom: Omisli.si, d. o. o. Založnik: Založba Univerze v Ljubljani (University of Ljubljana Press) Za založnika: prof. dr. Gregor Majdič, rektor Izdajatelj: Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo Za izdajatelja: prof. dr. Rok Dreu, dekan Ljubljana, 2023 Prva e-izdaja. Publikacija je brezplačna. Publikacija je v digitalni obliki prosto dostopna na: https://ebooks.uni-lj.si/ZalozbaUL Kataložni zapis o publikaciji (CIP) pripravili v Narodni in univerzitetni knjižnici v Ljubljani COBISS.SI-ID 178209539 ISBN 978-961-297-232-5 (PDF) Predgovor V hitro napredujočem svetu farmacevtske znanosti se izpostavlja področje, ki leži v osrčju zagotavljanja varnih, učinkovitih in kakovostnih zdravil – farmacevtska analiza in nadzor zdravil. Pri vajah iz Analize in nadzora zdravil se ne ukvarjamo le z enačbami in laboratorijskimi napravami; gre tudi za razvoj zavesti o natančnosti, odgovornosti in etičnem ravnanju. Gre za ključ k razumevanju farmacevtske analize zdravil, kjer sta skrbno opazovanje in natančno delo ključnega pomena. Kot študenti ne oblikujete le svoje nadaljnje kariere, temveč s svojim delom potencialno vplivate na zdravje in dobro počutje številnih uporabnikov farmacevtskih izdelkov, kar vam kot bodočim farmacevtom nalaga veliko odgovornost. Analiza in nadzor zdravil ni le še en predmet; gre za pomembno orodje pri zagotavljanju varnosti in kakovosti zdravil, ki spreminjajo življenja milijonov. To je znanost, ki pomaga preveriti kakovost in čistoto zdravil, razumeti, kako le-ta delujejo, in prepoznati morebitna tveganja (povezana z njihovo uporabo). Te vaje vas bodo seznanile z osnovami analitskih pristopov, ki so temelj pri razvoju, proizvodnji ter nadzoru kakovosti farmacevtskih izdelkov. Laboratorijske vaje ponujajo študentom praktične izkušnje, ki so bistvene za njihovo nadaljnjo kariero, asistenti pa postanemo most med akademsko teorijo in uporabo v resničnem svetu. S tem učbenikom želimo avtorji s študentom prijaznim, multimedijskim pristopom prispevati k zgoraj opisanim ciljem. Avtorji Osnovna pravila za delo v analiznem laboratoriju Kazalo 1. Osnovna pravila za delo v analiznem laboratoriju .............................................................. 2 1.1. Laboratorijski red in varnost pri delu ............................................................................. 2 1.2. Pravilno tehtanje in odmerjanje volumnov ter prava uporaba količin ........................... 4 1.3. Določanje vsebnosti ........................................................................................................ 7 1.4. Splošna navodila za izvedbo vaj ..................................................................................... 8 2. Prvi sklop krožnih vaj ....................................................................................................... 10 2.1. Acidoalkalimetrija: Vsebnost acetilsalicilne kisline .................................................... 10 2.2. Oksidoreduktometrija: Vsebnost askorbinske kisline v tabletah .................................. 14 2.3. Argentometrija: Določanje vsebnosti kloridnih ionov v Ringerjevi infuzijski raztopini 20 3. Drugi sklop krožnih vaj .................................................................................................... 24 3.1. UV-Vis In IR spektroskopija: Identifikacija in vsebnost paracetamola v tabletah ter kvalifikacija UV-Vis spektrofotometra ........................................................................ 24 3.2. Fluorimetrija: Preskus prisotnosti aluminija v natrijevem kloridu ............................... 30 3.3. Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti: Vsebnost amoksicilina in klavulanske kisline v tabletah ........................................................................................................... 34 4. Tretji sklop krožnih vaj ..................................................................................................... 38 4.1. UV-Vis spektroskopija: Določanje vsebnosti železa(III) v sirupu ............................... 38 4.2. Titracije v brezvodnem mediju: Vsebnost lidokainijevega klorida v raztopini za injiciranje ...................................................................................................................... 42 4.3. Plinska kromatografija: Določanje vsebnosti D-α-tokoferola v mehkih želatinastih kapsulah ........................................................................................................................ 46 4.4. Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti: Določitev vsebnosti izoniazida in nečistot v učinkovini ..................................................................................................... 50 4.5. Kompleksometrija: Priprava in standardizacija 0,05 M dinatrijevega edetata, priprava in standardizacija 0,05 M cinkovega sulfata ter vsebnost aluminijevega hidroksida in magnezijevega hidroksida v tabletah ............................................................................ 55 4.6. UV-Vis spektroskopija: Identifikacija furosemida v tabletah in določanje enakomernosti vsebnosti furosemida v tabletah ........................................................... 62 4.7. Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti: Določitev vsebnosti sulfametoksazola in nečistot v učinkovini ..................................................................................................... 68 4.8. Teoretična vaja: Določitev vsebnosti učinkovine v snovi za farmacevtsko uporabo ... 72 - 1 - Osnovna pravila za delo v analiznem laboratoriju 1. Osnovna pravila za delo v analiznem laboratoriju 1.1. Laboratorijski red in varnost pri delu Čisto in urejeno delovno okolje je v analiznem laboratoriju izjemno pomembno tako za zagotavljanje osebne varnosti in varnosti drugih kot tudi za kakovost izvedenih analiz. Osebna varovalna oprema − Delovna obleka (hlače in laboratorijska halja ali delovna obleka z dolgimi rokavi): ves čas v laboratoriju nosite zapeto laboratorijsko haljo, da zaščitite svoja oblačila in kožo pred morebitnimi razlitji kemikalij in kontaminacijo. Vstopanje v prostore laboratorija ni dovoljeno v kratkih hlačah, majicah in s spredaj odprto obutvijo. − Sredstva za zaščito oči in obraza: nosite zaščitna očala ali ščitnik za obraz, da zaščitite oči pred brizgi kemikalij ali letečimi drobci. − Rokavice: pri ravnanju z nevarnimi kemikalijami in steklovino uporabljajte ustrezne zaščitne rokavice. Prepričajte se, da so odporne proti kemikalijam, da so ustrezne velikosti in da so pravilno nameščene (segajo čez rokav halje). Osebna higiena − Umivanje rok: pred delom v laboratoriju in po njem si temeljito umijte roke, zlasti preden jeste, pijete ali se dotikate obraza. − Hrana in pijača: v laboratoriju ne uživajte hrane ali pijače. Ravnanje s kemikalijami − Kemikalij nikoli ne preizkušajte organoleptično (ugotavljanje vonja in okusa), razen če je to izrecno zahtevano v specifikaciji (npr. arome). − V digestoriju izvajajte aktivnosti s kemikalijami, kot so prelivanje, mešanje, segrevanje in podobno. − Označevanje: pred uporabo vedno preverite kemijske oznake glede vsebine, nevarnosti in datumov poteka uporabnosti. Nikoli ne uporabljajte kemikalij, ki so neustrezno označene. − Skladiščenje kemikalij: kemikalije hranite na za to določenih območjih ob upoštevanju pravil toksičnosti, vnetljivosti, jedkosti, oksidativnosti, eksplozivnosti in združljivosti. Ločeno hranite nezdružljive snovi. − Z vnetljivimi kemikalijami napolnite največ do 95 % prostornine zbirnega vsebnika. − Kislin in baz ne shranjujte skupaj na isti polici zaradi nevarnosti ekostemnega učinka. − Večjih steklenic nikoli ne prenašajte samo s prijemom za vrat, ampak jim vedno podpirajte tudi dno (možnost globokih ureznin). Razlitje kemikalij in nujni primeri − Razlitje: razlitje kemikalij takoj prijavite asistentu na vajah. Po asistentovih navodilih uporabite ustrezen postopek čiščenja. - 2 - Osnovna pravila za delo v analiznem laboratoriju − Požarna varnost: seznanite se z lokacijo in pravilno uporabo peska za gašenje ter gasilnih aparatov in zasilnih izhodov. V primeru požarnega alarma evakuirajte laboratorij. − Za nujne primere se seznanite z lokacijo tušev (pri vratih), postaj za izpiranje oči (poleg umivalnika) in kompletov prve pomoči (v označeni stenski omari). − V primeru politja kože s kemikalijo prizadeto mesto takoj izpirajte s tekočo vodo najmanj 15 minut. Po brizgu kemikalije v oči prizadeto oko takoj sperite s tekočo vodo ali fiziološko raztopino in nadaljujte z nevtralizacijskim sredstvom. Odstranjevanje odpadkov − Po končani uporabi vzorce, ostanke analiz, kemikalije in delovne pripomočke odstranite z delovne površine, jih pospravite na ustrezna mesta za shranjevanje le-teh, odpadke ustrezno ločite in jih oddajte na definirano zbirno mesto. − Ločevanje: pravilno ločujte in označite nevarne in nenevarne odpadke. Pri odstranjevanju odpadkov upoštevajte navodila. Organska topila odstranjujte v plastične 10-litrske vsebnike, trdne odpadke v plastične 1-litrske vsebnike. − Ostri predmeti: ostre predmete (igle) zavrzite v za to namenjene in označene vsebnike za igle (rumene škatle z rdečim pokrovom). Nadzor kontaminacije − Navzkrižna kontaminacija: bodite previdni, da preprečite navzkrižno kontaminacijo med vzorci, standardi in reagenti. Med uporabo očistite opremo in površine. − Umazano steklovino dobro sperite. Uporaba analiznih instrumentov − Pred uporabo opreme preberite dana navodila in se posvetujete z asistentom. − Vzdrževanje opreme: nemudoma prijavite vsako okvarjeno opremo. Ne poskušajte popravljati opreme brez ustreznega dovoljenja. Poročanje − Nesreče in incidenti: o vseh nesrečah, incidentih ali nevarnih razmerah na vajah nemudoma obvestite asistenta. − Zdravstvene težave: obvestite svojega asistenta, če imate kakršne koli zdravstvene težave, ki so povezane z izpostavljenostjo kemikalijam oz. nezdružljive z delom v laboratoriju (nosečnost). Usposabljanje in znanje − V analizni laboratorij vstopajte le ustrezno pripravljeni. Če za izvedbo vaje niste ustrezno pripravljeni, ima asistent zaradi vaše varnosti pravico, da vam prepreči opravljanje vaje. - 3 - Osnovna pravila za delo v analiznem laboratoriju 1.2. Pravilno tehtanje in odmerjanje volumnov ter prava uporaba količin Količina, navedena v predpisu (natehta ali odmerjen volumen vzorca), ustreza količini, ki je bila uporabljena med razvojem analitskega postopka. Dejansko uporabljena količina sme odstopati od navedene količine za največ 10 odstotkov. Uporabljena količina vzorca se v vseh primerih natančno izmeri, rezultat analize pa se izračuna glede na odmerjeno količino. Tudi reagente uporabljamo v predpisanih količinah in v odstopanju za največ deset odstotkov. Število signifikantnih mest v farmakopeji navedenih številčnih vrednosti količin definirajo zahteve za navedene količine (masa ali prostornina), ki jih je treba izmeriti na ustrezen način. Tehtanje Tehtanje je pogosta operacija v analitskih postopkih in tehtnica je bistven del laboratorijske opreme. Tehtanje je lahko vir napak, ki jih je težko zaznati v končnem analitskem rezultatu, zato je natančno tehtanje izredno pomembno. Pred izvedbo tehtanja izberemo primerno posodo glede na količino in vrsto tehtalnega materiala (tekočine, trdne snovi, praški). Zahteve glede mase pri tehtnicah za analitske namene so navedene v splošnem poglavju Evropske farmakopeje 2.1.7 Tehtnice za analitski namen in veljajo za vsa besedila. Vrednost prikaza tehtnice se mora med tehtanjem ujemati z vrednostjo ciljne mase, ki je navedena v besedilu, ko je matematično zaokrožena na enako število signifikantnih mest. Na primer, če je ciljna masna vrednost, navedena v besedilu, 50,0 mg, mora minimalna natehta tehnice (mmin) uporabljene tehtnice manjša od naše mase. Dejansko natehtana količina snovi lahko odstopa od predpisane za ± 10 %. Tehtanje izvedemo znotraj ± 5 podenot glede na zadnjo številko navedene masne vrednosti. Torej, 50,0 mg je treba razlagati kot 49,95 mg do 50,04 mg ali 49,950 mg do 50,049 mg, odvisno od občutljivosti tehtnice. Praktičen primer Glede na vse navedeno (dovoljeno odstopanje ter natančnost tehtanja), bo v primeru, ko je farmakopejski predpis za tehtanje 50,0 mg: − katerakoli natehta na tehtnici z odčitki na 0,01 mg v območju 44,95 mg do 55,04 mg ustrezna, − katerakoli natehta na tehtnici z odčitki na 0,001 mg v območju od 44,950 mg do 55,049 mg ustrezna. Za izračun rezultata analize moramo upoštevati dejansko natehto. Pri testih vsebnosti je pomembno, da za standard in vzorec uporabimo enako vrsto tehtnice. - 4 - Osnovna pravila za delo v analiznem laboratoriju Poznamo več vrst tehtnic − Precizne tehtnice: najmanjši odčitek 1 mg (uporabno za tehtanje reagentov). − Analitske tehtnice: najmanjši odčitek 0,1 mg (uporabno za tehtanje vzorcev ali standardov). − Semi-mikro analitske tehtnice: najmanjši odčitek 0,01 mg. − Mikro analitske tehtnice: najmanjši odčitek 0,001 mg (1 µg). − Ultra-mikro analitske tehtnice: najmanjši odčitek 0,0001 mg (0,1 µg). Najbolj pomemben podatek, ki v praksi določa, ali je neka tehtnica primerna za tehtanje določenih količin, je podatek o minimalni natehti. Če ste v dilemi, ali tehtnica pravilno deluje, to lahko preverite z zunanjo utežjo, ki zagotavlja, da tehtnica deluje znotraj predpisanih meja. Pogostost preverjanja tehtnic določimo glede na podlago kritičnosti procesa. Če imamo zahtevo po točnem tehtanju, moramo tehtanje izvesti na tehtnici, ki je kalibrirana v celotnem merilnem območju in mora ustrezati kriterijem za ponovljivost in točnost. Odmerjanje volumnov Če je v farmakopeji za določeno prostornino številka za decimalno vejico nič ali se konča z ničlo (na primer 10,0 mL ali 0,50 mL), navedeno prostornino izmerimo s polnilno pipeto, volumetrično bučko ali bireto, kot je primerno. V nasprotnem primeru lahko uporabimo merilni valj ali merilno pipeto (na primer za 10 mL). Prostornine, navedene v mikrolitrih, merimo z mikropipeto ali mikrobrizgo. Steklovina Volumetrična steklovina je ustrezna, če je v skladu z zahtevami razreda A ustreznega mednarodnega standarda, ki ga je izdala Mednarodna organizacija za standardizacijo (ISO). Tipična steklovina, ki jo uporabljamo na vajah, je prikazana na Sliki 1. - 5 - Osnovna pravila za delo v analiznem laboratoriju Slika 1: Steklovina, ki jo uporabljamo v analitskem laboratoriju: a) polnilna pipeta, b) bireta, c) volumetrična bučka, d) merilna pipeta, e) merilni valj, f) erlenmajerica. Prvi trije kosi steklovine (a, b, c) omogočajo točno odmerjanje volumnov, drugi trije kosi (d, e, f) ne omogočajo točnega odmerjanja volumnov. - 6 - Osnovna pravila za delo v analiznem laboratoriju 1.3. Določanje vsebnosti Pri določanju vsebnosti se »odstotek« uporablja v dveh kontekstih glede na okoliščine: − »odstotek m/m« (odstotek, masa v masi oz. masno-masni odstotek) predstavlja število gramov snovi v 100 g končnega izdelka; − »odstotek v/v« (odstotek, prostornina v prostornini oz. volumsko-volumski odstotek) predstavlja število mililitrov snovi v 100 mL končnega izdelka. Izraza »ppm« (deli v milijonu delov) in »ppb« (deli v milijardi delov) se nanašata na maso v masi, razen če je navedeno drugače. Koncentracijo volumetričnih raztopin (npr. standardne raztopine pri titrimetrični analizi) navajamo z nominalno koncentracijo (npr. 1 M) in korekcijskim faktorjem (npr. f = 0,912). Slednjega izračunamo tako, da delimo dejansko koncentracijo (cd) z nominalno (cn). 𝑐𝑑𝑒𝑗𝑎𝑛𝑠𝑘𝑎 𝑓 = 𝑐𝑛𝑜𝑚𝑖𝑛𝑎𝑙𝑛𝑎 Meje in pravila signifikantnih mest Signifikantna mesta se uporabljajo za približno oceno natančnosti ali negotovosti številčnega rezultata. Pri preverjanju skladnosti z numerično omejitvijo rezultate izračunajo na navedeno število signifikantnih mest, razen če ni predpisano drugače. Meje, ne glede na to, ali so vrednosti izražene v odstotkih ali kot absolutne vrednosti, veljajo za pomembne do zadnje prikazane števke (na primer, 0,15 označuje 2 signifikantni mesti, 140 označuje 3 signifikantna mesta). Pri zaokroževanju je treba upoštevati samo številko neposredno desno od zadnjega mesta v omejitvi. Če je ta številka manjša od 5, se izloči in predhodna številka ostane nespremenjena. Če je ta številka enaka ali večja od 5, se izloči in predhodna številka pa se poveča za 1. Če je pri izračunu vsebnosti navedena meja 98,0–102,0 %, se rezultat poda (zaokroži) na enak način (preglednica 1). Pri izračunih, kot so seštevanje, odštevanje, deljenje, množenje, vedno najprej izvedemo izračun in šele nato zaokrožimo rezultat (rezultat zaokrožimo le enkrat, pri končnem podajanju rezultata). Rezultat naj nikoli ne vsebuje več signifikantnih mest, kot jih vsebuje najmanj natančen podatek, ki je bil uporabljen v izračunu. Preglednica 1: Primeri za zaokroževanje in ugotavljanje ustreznosti izračunan rezultat zaokrožen rezultat ustreznost 97,96 % 98,0 % DA 97,94 % 97,9 % NE 97,95 % 98,0 % DA 102,05 % 102,1 % NE 101,96 % 102,0 % DA 101,95 % 102,0 % DA - 7 - Osnovna pravila za delo v analiznem laboratoriju Preglednica 2: Pravila za določitev števila signifikantnih mest pravilo primer št. signifikantnih mest Signifikantna mesta so vse 0 in 10,10 4 števke za in pred decimalno 110 3 vejico. 110,0 4 Neničelne števke: vsa neničelna 1,2345 5 števila v številu so signifikantna. Ujete ničle: Ujete ničle med števkami se štejejo za 100,01 5 signifikantna mesta. Vodilne ničle: Vodilne ničle, ki se pojavljajo pred prvo neničelno 0,011 2 števko, niso signifikantne. Enak pristop uporabljamo tudi pri drugih numeričnih mejah, rezultat se poda (zaokroži) na enak način (Preglednica 3). Preglednica 3: Primeri zaokroževanja in ugotavljanja ustreznosti za preskus z mejo 5 ppm izračunan rezultat zaokrožen rezultat ustreznost 5,5 ppm 6 ppm NE 5,4 ppm 5 ppm DA 4,5 ppm 5 ppm DA Če uporaba referenčnega standarda za določeno nečistoto ni predpisana, se lahko vsebnost nečistote izrazi kot delež nazivne koncentracije snovi, ki se uporablja za pripravo referenčne (standardne) raztopine, razen če je navedeno drugače. 1.4. Splošna navodila za izvedbo vaj Vsa steklovina, ki jo potrebujemo za izvedbo vaje, je pripravljena na pladnjih oziroma ob analiznih instrumentih, kjer izvajamo analizo. Vse pripravljene raztopine in reagente moramo ustrezno označiti. Po končanih vajah naj bo steklovina čista (brez ostankov reagentov in oznak) in pospravljena nazaj na pladnje. Med pranjem steklovine obvezno uporabljamo rokavice. Vse birete po končani analizi speremo z vodo in 96 % etanolom. Če pri analizi uporabimo organska topila oziroma druge nevarne kemikalije, jih po izvedeni analizi prenesemo v označene vsebnike za odpadna organska topila oz. vsebnike za odpadne reagente. Vaje vedno izvajamo v treh ponovitvah (triplikatih), razen če so navodila za posamezno vajo drugačna. Pri ponovitvah analize uporabljamo bodisi alikvote ali paralelke vzorca. Alikvot predstavlja reprezentativni del laboratorijskega vzorca, ki ga potrebujemo za izvedbo ene analize, pri čemer je v vsakem alikvotu količina analita identična. Navadno uporabimo alikvote pri raztopinah vzorcev ali standardov, ker lahko z ustreznimi pipetami večkrat odmerimo enak volumen, ki vsebuje enako količino analita (primer: od osnovne raztopine vzamemo del, ki ga uporabimo za eno analizo). V primeru trdnih vzorcev ali standardov, ki jih tehtamo, uporabimo paralelke. Pri slednjih vzorec ali standard natehtamo večkrat, pri čemer se mase posameznih nateht (paralelk) med seboj razlikujejo. V primeru paralelk tako vzamemo določeno količino vzorca (točno natehto) in jo uporabimo za izvedbo ene analize. Ker so točne natehte vzorca pri - 8 - Osnovna pravila za delo v analiznem laboratoriju paralelkah različne, je posledično različna tudi količina analita, zato moramo pri izračunu uporabiti posamezne točne natehte. V teoriji bi lahko tudi pri trdnih vzorcih vsakič natehtali enako maso, vendar je to zelo zamudno in nepraktično. Slepa raztopina je vedno pripravljena po enakem postopku kot vzorec, le da v njej analit ni prisoten. Razredčene raztopine kislin vedno pripravljamo tako, da v volumetrično bučko ustrezne velikosti najprej nalijemo vodo R do polovice volumna bučke in nato dodamo ustrezen volumen koncentrirane kisline ter dopolnimo z vodo R do oznake in premešamo. Če se raztopina močno segreva, jo hladimo na ledeni kopeli. Pri vajah kot osnovno literaturo uporabljamo Evropsko, Ameriško in Britansko farmakopejo. Vse farmakopeje so dostopne v fizični obliki v laboratoriju za Analizo in nadzor zdravil. Reagenti, ki jih uporabljamo pod oznako: − Alkohol R: 96 % etanol. − Voda R: prečiščena voda. − Voda brez ogljikovega dioksida R: pri določenih analizah moramo uporabiti vodo brez CO2, v tem primeru uporabimo prečiščeno vodo. - 9 - Prvi sklop krožnih vaj 2. Prvi sklop krožnih vaj 2.1. ACIDOALKALIMETRIJA: Vsebnost acetilsalicilne kisline a) Opis vaje Pripravimo raztopino 0,5 M klorovodikove kisline (HCl) in jo standardiziramo s primarnim standardom tris(hidroksimetil)aminometanom (trometamolom). Za določanje vsebnosti acetilsalicilne kisline pripravimo tudi raztopino 0,5 M natrijevega hidroksida (NaOH), ki pa je ne standardiziramo. Vsebnost acetilsalicilne kisline določimo tako, da znani masi acetilsalicilne kisline dodamo presežno količino raztopine 0,5 M natrijevega hidroksida. Nasvet: Najprej pripravimo raztopino 0,5 M natrijevega hidroksida in jo dodamo k acetilsalicilni kislini. Reakcija poteka eno uro. Nato pripravimo in standardiziramo raztopino 0,5 M klorovodikove kisline, s katero nato titriramo presežni 0,5 M natrijev hidroksid, ki smo ga dodali acetilsalicilni kislini. Struktura tris(hidroksimetil)aminometana (trometamol): Hidroliza acetilsalicilne kisline poteka po dodatku 0,5 M natrijevega hidroksida. V tej reakciji se ester acetilsalicilne kisline hidrolizira, pri čemer se za vsak ekvivalent acetilsalicilne kisline porabita dva ekvivalenta natrijevega hidroksida. b) Priprava 0,5 M natrijevega hidroksida Pripravimo 250 mL 0,5 M natrijevega hidroksida po prilagojenem predpisu iz Ph. Eur. 11.2 (v okvirčku). Upoštevajte, da je navedeni predpis za 1 L 1 M raztopine NaOH. 1 M natrijev hidroksid ( 1 M Sodium hydroxide) Priprava: 42 g natrijevega hidroksida R raztopimo v vodi R in z istim topilom razredčimo na 1000,0 mL ter premešamo. c) Priprava in standardizacija 0,5 M klorovodikove kisline Pripravimo 250 mL 0,5 M klorovodikove kisline in jo standardiziramo po prilagojenem predpisu iz Ph. Eur. 11.2 (naveden v okvirčku). Predpis opisuje pripravo 1 M raztopine, zato je treba preračunati ustrezne količine za pripravo 0,5 M raztopine. Titriramo 1 × slepo raztopino in 3 × raztopine trometamola (3 paralelke). - 10 - Prvi sklop krožnih vaj 1 M klorovodikova kislina ( 1 M Hydrochloric acid) Priprava: 103,0 g klorovodikove kisline R razredčimo z vodo R na 1000,0 mL. Standardizacija. 0,950 g trometamola RV raztopimo v 50 mL vode R. Titriramo z raztopino klorovodikove kisline, končno točko določimo potenciometrično ali z uporabo 0,1 mL raztopine metilno oranžnega R kot indikatorja, dokler ne dobimo rumenkasto rdeče barve. 1 mL 1 M klorovodikove kisline ustreza 121,1 mg C4H11NO3. d) Določanje vsebnosti acetilsalicilne kisline v učinkovini Vsebnost acetilsalicilne kisline v učinkovini določamo po prilagojenem predpisu iz Ph. Eur. 11.2 (v okvirčku). Titriramo 1 × slepo raztopino in 3 × raztopine vzorcev (3 paralelke). Acetilsalicilna kislina (Acetylsalicylic acid) Zahtevana vsebnost: 99,5–101,0 % (računano na suho snov) V erlenmajerici z obrusom raztopimo 1,000 g acetilsalicilne kisline v 10 mL etanola R (96 % v/v). Dodamo 50,0 mL 0,5 M natrijevega hidroksida, erlenmajerico zapremo in pustimo stati 1 uro. Dodamo 0,2 mL raztopine indikatorja fenolftaleina R, premešamo in titriramo z 0,5 M klorovodikovo kislino. Izvedemo slepo titracijo. 1 mL 0,5 M natrijevega hidroksida ustreza 45,04 mg C9H8O4. Vprašanje Zakaj ni treba standardizirati 0,5 M natrijevega hidroksida? Literatura − Evropska farmakopeja 11.2, poglavje 4.2.2. volumetrične raztopine. − Evropska farmakopeja 11.2, poglavje 14, monografija acetilsalicilna kislina. - 11 - Prvi sklop krožnih vaj POROČILO 1. vaja: Vsebnost acetilsalicilne kisline Priprava in standardizacija 0,5 M klorovodikove kisline Standard: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Serija: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Datum proizvodnje: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Proizvajalec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Rezultati analize: natehta poraba raztopine koncentracija faktor (f) trometamola [mg] HCl [mL]: raztopine HCl [M] 0,5 M HCl 1 2 3 Slepa [mL]: 𝑓 ̅ = Izračun: RSD [%] = Komentar: - 12 - Prvi sklop krožnih vaj Vsebnost acetilsalicilne kisline Vzorec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Serija: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Datum proizvodnje: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Proizvajalec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Rezultati analize: natehta vzorca poraba vsebnost [mg] vsebnost glede na navedeno [mg] 0,5 M HCl [mL] vsebnost v učinkovini [%] 1 2 3 Slepa (mL): 𝑣 ̅ 𝑠𝑒𝑏 ̅̅̅̅ 𝑛 ̅̅ 𝑜 ̅̅ 𝑠𝑡 ̅̅̅ = Izračun: RSD [%] = Zahteva: Vzorec: ustreza ne ustreza Komentar: Analizo opravil: Pregledal: Datum: - 13 - Prvi sklop krožnih vaj 2.2. OKSIDOREDUKTOMETRIJA: Vsebnost askorbinske kisline v tabletah a) Opis vaje Pripravimo 0,033 M kalijev bromat ( KBrO3, primarni standard,), 0,05 M jod in 0,1 M natrijev tiosulfat ( Na2S2O3). 0,1 M natrijev tiosulfat standardiziramo tako, da 0,033 M kalijevemu bromatu (koncentracijo slednjega poznamo) dodamo presežno količino kalijevega jodida, pri čemer nastane jod, ki ga titriramo z 0,1 M natrijevim tiosulfatom. S standardizirano raztopino Na2S2O3 nato standardiziramo 0,05 M jod. Za določitev vsebnosti askorbinske kisline v tabletah najprej stehtamo in zdrobimo 3 tablete, nato preračunamo, koliko tabletnega prahu potrebujemo za analizo in preračunano količino natehtamo. Vsebnost askorbinske kisline v tabletnem prahu določimo s titracijo z raztopino 0,05 M joda. Princip standardizacije 0,1 M natrijevega tiosulfata: BrO – 3 + 6 I– + 6 H+ → Br– + 3 I2 + 3 H2O 2 S 2– 2– 2O3 + I2 → S4O6 + 2 I– Princip standardizacije 0,05 M joda: 2 S 2– 2– 2O3 + I2 → S4O6 + 2 I– Princip določanja vsebnosti askorbinske kisline: Reakcija: b) Priprava 0,033 M kalijevega bromata Pripravimo 50,0 mL 0,033 M kalijevega bromata (primarni standard) po prilagojenem predpisu iz Ph. Eur. 11.2. Predpis je za 1 L raztopine, zato je treba preračunati ustrezne količine za pripravo 50 mL raztopine. 0,033 M kalijev bromat ( 0.033 M Potassium bromate) Priprava: 5,5670 g kalijevega bromata RV raztopimo v vodi R in z istim topilom razredčimo na 1000,0 mL ter premešamo. c) Priprava in standardizacija 0,1 M natrijevega tiosulfata Pripravimo 500 mL 0,1 M natrijevega tiosulfata in ga standardiziramo po prilagojenem predpisu iz Ph. Eur. 11.2. Predpis (spodaj v okvirčku) je za 1 L raztopine, zato preračunamo - 14 - Prvi sklop krožnih vaj ustrezne količine za pripravo 500 mL raztopine. 0,1 M natrijev tiosulfat standardiziramo s tremi alikvoti 0,033 M kalijevega bromata. 0,1 M natrijev tiosulfat ( 0.1 M Sodium thiosulfate) Priprava: 25 g natrijevega tiosulfata R in 0,2 g natrijevega karbonata R raztopimo v vodi R in z istim topilom razredčimo na 1000,0 mL. Standardizacija: 10,0 mL 0,033 M kalijevega bromata dodamo 40 mL vode R, 10 mL raztopine kalijevega jodida R in 5 mL klorovodikove kisline R1. Titriramo z raztopino natrijevega tiosulfata, pri čemer kot indikator uporabimo 1 mL raztopine škroba R, dodane proti koncu titracije. 1 mL 0,1 M natrijevega tiosulfata ustreza 2,783 mg KBrO3 ali 0,5 mL 0,033 M kalijevega bromata. d) Standardizacija 0,05 M joda Pripravimo 250 mL 0,05 M joda po prilagojenem predpisu iz Ph. Eur. 11.2. Standardizacijo izvedemo s tremi alikvoti 0,05 M joda. Predpis (v okvirčku) je za 1 L raztopine, zato preračunamo ustrezne količine za pripravo 250 mL raztopine. 0,05 M jod ( 0.05 M Iodine) Priprava: 12,7 g joda R in 20 g kalijevega jodida R raztopimo v vodi R in z istim topilom razredčimo na 1000,0 mL in premešamo. Standardizacija: K 20,0 mL raztopine joda dodamo 1 mL razredčene ocetne kisline R in 30 mL vode R. Titriramo z 0,1 M natrijevim tiosulfatom, za indikator uporabimo raztopino škroba R. Vsebnik z jodovico mora biti zaščiten pred svetlobo. e) Določanje vsebnosti askorbinske kisline v tabletah oziroma kapsulah Vsebnost askorbinske kisline v tabletah ali kapsulah določamo po prilagojenem predpisu iz Ph. Eur. 11.2. Titracijo izvedemo v 3 paralelkah, slepe titracije ne izvajamo. Postopek: Stehtamo in zdrobimo 3 tablete. V primeru kapsul najprej stehtamo 3 polne kapsule, nato odstranimo vsebino in stehtamo prazne kapsule. Natehtamo količino prahu, ki ustreza približno 150 mg askorbinske kisline, in jo raztopimo v razredčeni žveplovi kislini R ter 80 mL vode R. Dodamo 1 mL raztopine škroba R in titriramo z 0,05 M jodom, dokler ne dobimo obstojne vijolično modre barve. 1 mL 0,05 M joda ustreza 8,81 mg C6H8O6. Zahtevana vsebnost: 95,0–105,0 % navedene vsebnosti. - 15 - Prvi sklop krožnih vaj Za izvedbo vaje potrebujemo še spodnje raztopine: Raztopina kalijevega jodida (Potassium iodide solution) – za standardizacijo tiosulfata. Vsebuje 166 g/L kalijevega jodida. Ocetna kislina, razredčena (Acetic acid, dilute) – za standardizacijo joda. Vsebuje med 115 g/L in 125 g/L ocetne kisline. 12 g ledoceta R razredčimo z vodo R na 100 mL. Klorovodikova kislina R1 (Hydrochloric acid R1) – za standardizacijo tiosulfata. Vsebuje 250 g/L klorovodikove kisline. 70 g klorovodikove kisline R razredčimo z vodo R na 100 mL. Žveplova(VI) kislina, razredčena (Sulfuric acid, dilute R) – za določanje askorbinske kisline. Vsebuje 98 g/L žveplove(VI) kisline. V 60 mL vode R dodamo 5,5 mL žveplove(VI) kisline R, pustimo, da se ohladi in z istim topilom razredčimo na 100 mL. Vprašanji Zakaj pri pripravi raztopine joda dodamo k raztopini kalijev jodid? Kaj je lahko vzrok za večjo vsebnost askorbinske kisline, kot je navedeno, v tabletah ali v kapsulah? Literatura − Evropska farmakopeja 11.2, poglavje 4.2.2. volumetrične raztopine. − Evropska farmakopeja 11.2, poglavje 4.1.1. reagenti. − Evropska farmakopeja 11.2, poglavje 14, monografija askorbinska kislina. - 16 - Prvi sklop krožnih vaj POROČILO 2. vaja: Vsebnost askorbinske kisline Priprava in standardizacija 0,1 M natrijevega tiosulfata Standard: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ m (KBrO3) = _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ f (0,033 M KBrO3) = _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Rezultati analize: V 0,033 M poraba 0,1 M koncentracija faktor ( f) KBrO3 [mL] Na2S2O3 [mL] Na2S2O3 [M] 0,1 M Na2S2O3 1 2 3 Izračun: 𝑓 ̅ = RSD [%] = Komentar: - 17 - Prvi sklop krožnih vaj Priprava in standardizacija 0,05 M joda Standard: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ c (Na2S2O3) = _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ f (0,1 M Na2S2O3) = _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Rezultati analize: V 0,05 M I2 poraba koncentracija faktor ( f) [mL] 0,1 M Na2S2O3 [mL] I2 [M] 0,05 M I2 1 2 3 Izračun: 𝑓̅ = RSD [%] = Komentar: - 18 - Prvi sklop krožnih vaj Vsebnost askorbinske kisline Vzorec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Serija: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Datum proizvodnje: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Proizvajalec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Rezultati analize: natehta vzorca poraba vsebnost na vsebnost glede na [mg] 0,05 M I2 [mL] tableto [mg] navedeno vsebnost [%] 1 2 3 Izračun: 𝑣 ̅ 𝑠𝑒𝑏 ̅̅̅̅ 𝑛 ̅̅ 𝑜 ̅̅ 𝑠𝑡 ̅̅̅ = RSD [%] = Zahteva: Vzorec: ustreza ne ustreza Komentar: Analizo opravil: Pregledal: Datum: - 19 - Prvi sklop krožnih vaj 2.3. ARGENTOMETRIJA: Določanje vsebnosti kloridnih ionov v Ringerjevi infuzijski raztopini a) Opis vaje Pripravimo raztopino 0,1 M srebrovega nitrata ( AgNO3), ki jo nato standardiziramo z natrijevim kloridom ( NaCl, primarni standard). S standardiziranim 0,1 M srebrovim nitratom nato določimo vsebnost kloridnih ionov v Ringerjevi raztopini. Opozorila: Ob stiku s kožo srebrov nitrat pusti siv ali črn madež, zato med vajo vseskozi nosite rokavice. Količina pripravljenega 0,1 M srebrovega nitrata zadošča za izvedbo vseh titracij, če ni nepotrebnih izgub (npr. pri prelivanju raztopin, pretitraciji itd). Po končanem delu oborine, ki vsebujejo Ag+ ione, odfiltriramo in shranimo v temu namenjene vsebnike. Matičnice (vodne raztopine) lahko zlijemo v odtok. b) Priprava in standardizacija 0,1 M srebrovega nitrata Pripravimo 100,0 mL 0,1 M srebrovega nitrata in standardiziramo po prilagojenem predpisu iz Ph. Eur. 11.2 (predpis v okvirčku). Analizo izvedemo v treh paralelkah, slepe titracije ne izvajamo. 0,1 M srebrov nitrat (0.1 M Silver nitrate) Priprava: 17,0 g srebrovega nitrata R raztopimo v vodi R in z istim topilom razredčimo na 1000,0 mL in premešamo. Standardizacija: 0,100 g natrijevega klorida RV raztopimo v 30 mL vode R. Titriramo z raztopino srebrovega nitrata. Kot indikator uporabimo 0,25 mL raztopine kalijevega kromata, ki v končni točki titracije tvori rjavo oborino. 1 mL 0,1 M srebrovega nitrata ustreza 5,844 mg NaCl. Shranjevanje: zaščititi pred svetlobo. Kalijev kromat(VI), raztopina (Potassium chromate solution) Raztopina 50 g/L kalijevega(VI) kromata. c) Določanje vsebnosti kloridnih ionov v Ringerjevi infuzijski raztopini S pomočjo brizge in injekcijske igle v suho erlenmajerico prenesemo približno 40 mL infuzijske raztopine. Nato vsebnost kloridnih ionov v Ringerjevi infuzijski raztopini določamo po prilagojenem predpisu iz USP 43. Titracijo izvedemo v treh alikvotih, slepe titracije ne izvajamo. Rezultat podamo kot vsebnost kloridnih ionov (mmol/L). - 20 - Prvi sklop krožnih vaj 10,0 mL Ringerjeve infuzijske raztopine prenesemo v erlenmajerico in dodamo 10 mL ledoceta R in 25 mL metanola R. Titriramo z 0,1 M srebrovim nitratom do končne točke, kot indikator uporabimo 0,25 mL raztopine eozina Y, ki v končni točki titracije tvori roza obarvano oborino. 1 mL 0,1 M srebrovega nitrata ustreza 3,545 mg Cl. Eozin Y (Eosin Y TS) Raztopina 1 g eozina Y R v 2 mL vode R in 50 mL alkohola R. Vprašanje Razložite princip delovanja indikatorja eozina Y. Literatura − Evropska farmakopeja 11.2, poglavje 4.2.2. volumetrične raztopine. − Evropska farmakopeja 11.2, poglavje 4.1.1. reagenti. − Ameriška farmakopeja (USP 43), monografija Ringerjeva injekcijska raztopina. - 21 - Prvi sklop krožnih vaj POROČILO 3. vaja: Določanje vsebnosti kloridnih ionov v Ringerjevi infuzijski raztopini po USP 43 Priprava in standardizacija 0,1 M srebrovega nitrata Standard: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Rezultati analize: poraba 0,1 M koncentracija faktor ( f) m NaCl [mg] AgNO3 [mL] AgNO3 [M] 0,1 M AgNO3 1 2 3 𝑓̅ = RSD [%] = Izračun: Komentar: - 22 - Prvi sklop krožnih vaj Vsebnost kloridnih ionov v Ringerjevi infuzijski raztopini Vzorec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Serija: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Datum proizvodnje: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Proizvajalec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Rezultati analize: V vzorca poraba 0,1 M vsebnost Cl– vsebnost Cl– [mL] AgNO3 [mL] [mg/100 mL] [mmol/L] 1 2 3 𝑣𝑠 ̅̅ 𝑒 ̅̅ 𝑏 ̅ 𝑛𝑜𝑠 ̅̅̅̅̅ 𝑡 ̅̅ = RSD [%] = Zahteva: Vzorec: ustreza ne ustreza Izračun: Komentar: Analizo opravil: Pregledal: Datum: - 23 - Drugi sklop krožnih vaj 3. Drugi sklop krožnih vaj 3.1. UV-VIS IN IR SPEKTROSKOPIJA: Identifikacija in vsebnost paracetamola v tabletah ter kvalifikacija UV-Vis spektrofotometra a) Opis vaje Najprej izvedemo izbrane preskuse kvalifikacije UV-Vis spektrofotometra (prilagojene po navodilih iz Ph. Eur. 11.2): preverjanje točnosti absorbance, preverjanje točnosti valovnih dolžin in meja razpršene svetlobe. Nato določimo vsebnost paracetamola v tabletah z UV-Vis spektrofotometrom in potrdimo istovetnost z IR spektrofotometrom. Postopek za določitev vsebnosti je prilagojen po monografiji iz Britanske farmakopeje. b) Kvalifikacija UV-Vis spektrofotometra Za snemanje absorpcijskih spektrov in merjenje absorbance si oglejte posnetek na povezavi ali uporabite QR kodo. − https://video.arnes.si/watch/2jjr2473jkld − Preverjanje točnosti absorbance ( Control of absorbance accuracy) Priprava raztopine nikotinske kisline: 57,0–63,0 mg nikotinske kisline za kvalifikacijo opreme CRS prenesemo v 200,0 mL bučko, raztopimo v 0,1 M klorovodikovi kislini R, dopolnimo do oznake in premešamo. 2,0 mL pripravljene raztopine prenesemo v 50,0 mL bučko in dopolnimo do oznake (končna koncentracija nikotinske kisline je približno 12 mg/L). Raztopini pomerimo absorbanci pri 213 nm in 261 nm. Merila sprejemljivosti: Razlika med izmerjeno in izračunano absorbanco certificiranega materiala za vsako kombinacijo valovnih dolžin ne sme presegati ± 0,010 ali ± 1 odstotka, pri čemer se upošteva večjo od obeh vrednosti. Podatki specifične absorbance za nikotinsko kislino CRS: 𝐴1 % 1 𝑐𝑚 = 430,7 (pri 213 nm) 𝐴1 % 1 𝑐𝑚 = 422,5 (pri 261 nm) - 24 - Drugi sklop krožnih vaj − Preverjanje točnosti valovnih dolžin ( Control of wavelength accuracy) Posnamemo spekter raztopine holmijevega(III) perklorata med 200 nm in 700 nm in preverimo ustreznost valovnih dolžin spektrofotometra. Raztopine holmijevega(III) perklorata ne zavržemo. Pričakovani absorpcijski vrhovi za raztopino holmijevega(III) perklorata R so naslednji: 241,1; 287,2; 361,3; 451,4; 485,2; 536,6; 640,5 (Slika 2) Slika 2: Primer absorpcijskega spektra raztopine holmijevega(III) perklorata R Merila sprejemljivosti: Za namizne instrumente je dovoljeno odstopanje valovne dolžine posameznega absorpcijskega vrha ± 1 nm pri valovnih dolžinah pod 400 nm in ± 3 nm pri valovnih dolžinah 400 nm in več. − Meja razpršene svetlobe ( Limit of stray light) Pripravimo 25 mL ustrezne raztopine kalijevega klorida s koncentracijo 12 g/L, posnamemo spekter med 190 nm in 260 nm ter odčitamo absorbanco pri 198 nm. Merila sprejemljivosti: Absorbanca pri 198 nm ne sme biti manjša kot 2 (Slika 3). - 25 - Drugi sklop krožnih vaj Slika 3: Primer absorpcijskega spektra raztopine kalijevega klorida (12 g/L) c) Vsebnost paracetamola Pred pripravo vzorcev pripravimo 1 L 0,1 M natrijevega hidroksida. Iz povprečne mase tablet preračunamo količino prahu, ki vsebuje ustrezno količino paracetamola za izvedbo analize. Vsebnost določamo v 2 paralelkah (+ slepi vzorec). Po koncu vaje preostanek tabletne mase prenesemo v vsebnik za trdne odpadke. Tablete s paracetamolom Zahtevana vsebnost: 95,0–105,0 % navedene vsebnosti Stehtamo in zdrobimo 5 tablet. V 200,0 mL bučko natehtamo količino praška, ki vsebuje 0,15 g paracetamola in dodamo 50 mL 0,1 M natrijevega hidroksida ter 100 mL vode R. Suspenzijo stresamo 15 minut in z vodo dopolnimo do oznake. Nastalo suspenzijo premešamo in filtriramo, pri čemer prvih 10 mL filtrata zavržemo. 10,0 mL filtrata prenesemo v 100,0 mL bučko in dopolnimo do oznake z vodo. 10,0 mL dobljene raztopine prenesemo v 100,0 mL bučko, dodamo 10 mL 0,1 M natrijevega hidroksida in dopolnimo z vodo do oznake. Tako pripravljeni raztopini pomerimo absorbanco pri 257 nm. Za izračun vsebnosti paracetamola (C8H9NO2) vzamemo A(1 %, 1 cm), ki pri 257 nm znaša 715. d) Identifikacija paracetamola K masi tabletnega prahu, ki vsebuje približno 250 mg paracetamola, dodamo 10 mL acetona. Steklovina mora biti suha! Pokrijemo s folijo in mešamo 10 minut. Nato prefiltriramo v suho čašo in pustimo, da aceton izpari. To izvajamo v digestoriju, vmes lahko previdno segrejemo. Suh zaostanek dodatno posušimo v sušilniku, približno 10 minut pri 105 °C. Ustrezno - 26 - Drugi sklop krožnih vaj pripravimo vzorec (tableta s KBr), posnamemo spekter med 2000 cm–1 in 400 cm–1 ter primerjamo z referenčnim spektrom paracetamola (Slika 4). Za pripravo vzorca za IR in snemanje IR spektra si oglejte posnetka na spodnjih povezavah ali uporabite QR kodo za dostop. − https://video.arnes.si/watch/zdvt9dqr5frt − https://video.arnes.si/watch/v2z9mrr8kt0c Slika 4: Referenčni IR spekter paracetamola Vprašanji Zakaj pri določanju vsebnosti paracetamola kot topilo uporabljamo 0,1 M natrijev hidroksid in ne vode? Ali bi lahko za identifikacijo paracetamola z IR spektroskopijo uporabili kar tabletni prah? Literatura − Britanska farmakopeja 2009, monografija za tablete s paracetamolom. − Evropska farmakopeja 11.2, poglavje 2.2.25 – absorpcijska spektrometrija, UV in Vis. - 27 - Drugi sklop krožnih vaj POROČILO UV-Vis in IR spektroskopija Vsebnost paracetamola v tabletah Vzorec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Serija: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Datum proizvodnje: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Proizvajalec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Rezultati analize: natehta vzorca absorbanca vsebnost vsebnost glede na [mg] [mg/tableto] navedeno vsebnost [%] 1 2 𝑣 ̅ 𝑠𝑒𝑏 ̅̅̅̅ 𝑛 ̅̅ 𝑜 ̅̅ 𝑠𝑡 ̅̅̅ = Izračun: RSD [%] = Zahteva: Vzorec: ustreza ne ustreza Komentar: Analizo opravil: Pregledal: Datum: - 28 - Drugi sklop krožnih vaj Kvalifikacija UV-Vis spektrofotometra po Ph. Eur. 11.2 (2.2.25) Preverjanje točnosti absorbance UV-Vis spektrofotometra Rezultati in komentar: val. dolžina [nm] Aizmerjena Areferenčna zahteve ustreznost Preverjanje točnosti valovnih dolžin UV-Vis spektrofotometra Rezultati in komentar: λizmerjena λreferenčna zahteve ustreznost Meja razpršene svetlobe Rezultati in komentar: Analizo opravil: Pregledal: Datum: - 29 - Drugi sklop krožnih vaj 3.2. FLUORIMETRIJA: Preskus prisotnosti aluminija v natrijevem kloridu a) Opis vaje Navodila za preskus prisotnosti aluminija so prilagojena po monografijah iz Ph. Eur. 11.2. Po navodilih najprej pripravimo ustrezne količine acetatne pufrske raztopine pH 6,0, razredčeno žveplovo(VI) kislino, raztopino 8-hidroksikinolina v diklorometanu in standardno raztopino aluminija (2 ppm Al). Nato pripravimo raztopine vzorca, slepe in referenčno raztopino. Posamezno raztopino nato ekstrahiramo z raztopino 8-hidroksikinolina v diklorometanu (diklorometan ima večjo gostoto kot voda). Pri tem se tvori kompleks med 8-hidroksikinolinom in aluminijem, ki fluorescira, in je dobro topen v diklorometanu. Po ekstrakciji združimo posamezne organske faze in pomerimo emisijski spekter. Tvorba kompleksa med aluminijem in 8-hidroksikinolinom: b) Priprava raztopin, ki jih potrebujemo za izvedbo preskusa Pripravimo 50 mL acetatne pufrske raztopine pH 6,0 po spodnjem predpisu. pH vrednosti ne preverjamo. Acetatna pufrska raztopina pH 6,0 (Acetate buffer solution pH 6.0) 100 g amonijevega acetata R raztopimo v 300 mL vode R, dodamo 4,1 mL koncentrirane ocetne kisline R, z vodo R dopolnimo do 500,0 mL in premešamo. Pripr avimo 100 mL razredčene žveplove(VI) kisline po spodnjem predpisu. Razredčena žveplova(VI) kislina (Sulfuric acid, dilute) 5,5 mL žveplove(VI) kisline R dodamo k 60 mL vode R, pustimo, da se ohladi in z vodo R razredčimo na 100 mL ter premešamo. Pripr avimo 150 mL raztopine 8-hidroksikinolina v diklorometanu s koncentracijo 5 g/L. Raztopina 8-hidroksikinolina v diklorometanu V 250 mL erlenmajerico z obrusom natehtamo preračunano količino 8-hidroksikinolina R in ga raztopimo v 150 mL diklorometana R, ki ga odmerimo z merilnim valjem. - 30 - Drugi sklop krožnih vaj Pripravimo 100,0 mL standardne raztopine aluminija (2,0 ppm) Standardna raztopina aluminija (2 ppm Al) ( Aluminium standard solution (2 ppm Al)) Raztopino pripravimo tik pred uporabo. Točno in natančno natehtamo 352 mg AlK(SO4)2 × 12H2O v 100,0 mL bučko, dodamo 10 mL razredčene žveplove(VI) kisline, pomešamo, da se sol raztopi, in dopolnimo do oznake z vodo R. 1,0 mL tako pripravljene raztopine nato prenesemo v 100,0 mL bučko in dopolnimo do oznake z vodo R ter premešamo. c) Priprava raztopin vzorca, slepe in referenčne raztopine aluminija Referenčna raztopina ( Reference solution) 2 mL standardne raztopine aluminija (2 ppm Al) R prenesemo v erlenmajerico, dodamo 10 mL acetatne pufrske raztopine pH 6,0 R in 100 mL vode R ter premešamo. Raztopina vzorca ( Prescribed solution) 20 g natrijevega klorida prenesemo v erlenmajerico, dodamo 100 mL vode R in 10 mL raztopine acetatne pufrske raztopine pH 6,0 R ter dobro premešamo. Slepa raztopina ( Blank solution) 10 mL acetatne pufrske raztopine pH 6,0 R prenesemo v erlenmajerico in dodamo in 100 mL vode R ter premešamo. d) Ekstrakcija vodnih raztopin in meritve fluorescence Vsako raztopino posebej prenesemo v lij ločnik in ekstrahiramo z 2 × 20 mL in 1 × 10 mL raztopine 8-hidroksikinolina v diklorometanu. Diklorometan je težji od vode! Organsko fazo združujemo v 50,0 mL bučko, ki jo po ekstrakciji dopolnimo do oznake z diklorometanom. Pri tem za vsako raztopino uporabite ločen lij ločnik, da zmanjšamo možnost kontaminacije. Tako dobimo tri ekstrakte: testno raztopino ( Test solution) – ekstrakt raztopine vzorca, standard ( Standard) – ekstrakt referenčne raztopine in slepo ( Blank) – ekstrakt slepe raztopine. Tem raztopinam nato na spektrofluorometru izmerimo emisijski spekter (Slika 5) in odčitamo intenziteto fluorescence pri 520 nm za vsako raztopino: I1 (intenziteta za testno raztopino), I2 (intenziteta za standard) in I3 (intenziteta za slepo). Natrijev klorid prestane preskus prisotnosti aluminija, če vrednost emisije fluorescence za testno raztopino ( I 1 − I 3) ni večja od intenzitete emisije fluorescence za standard ( I 2 − I 3). - 31 - Drugi sklop krožnih vaj Slika 5: Primeri spektrov, ki so bili izmerjeni pri preskusu za aluminij. Za pripravo vzorca za fluorimetrijo, snemanje spektra in interpretacijo spektra si oglejte posnetke na spodnjih povezavah oziroma uporabite QR kode. − https://video.arnes.si/watch/4nkhdg357qkx − https://video.arnes.si/watch/sqtlfwvyb3yd − https://video.arnes.si/watch/rxf8xbb4rqv5 Vprašanji Kakšna je prednost fluorimetrije v primerjavi z UV-Vis spektroskopijo v primeru limitnih preskusov? Katero enoto pri intenziteti fluorescence predstavlja oznaka “au”? Literatura − Evropska farmakopeja 11.2, poglavje 4.1.1. reagenti. − Evropska farmakopeja 11.2, poglavje 2.4.17. limitni testi. − Evropska farmakopeja 11.2, poglavje 17, monografija za natrijev klorid. - 32 - Drugi sklop krožnih vaj FLUORIMETRIJA: Preskus na prisotnost aluminija v natrijevem kloridu Vzorec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Serija: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Datum proizvodnje: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Proizvajalec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Rezultati analize: raztopina izmerjena fluorescenca 1 2 3 Zahteva: Vzorec: ustreza ne ustreza Komentar: Analizo opravil: Pregledal: Datum: - 33 - Drugi sklop krožnih vaj 3.3. TEKOČINSKA KROMATOGRAFIJA VISOKE LOČLJIVOSTI: Vsebnost amoksicilina in klavulanske kisline v tabletah a) Opis vaje S tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC) analiziramo vsebnost amoksicilina in klavulanske kisline v različnih farmacevtskih oblikah (tablete, peroralna suspenzija). Najprej pripravimo primerno mobilno fazo, nato standarde in vzorce ter izvedemo analizo po prilagojenem postopku iz USP 43. b) Priprava mobilne faze, standardov in vzorca − Mobilna faza: metanol in pufer v razmerju 1:19 (v/v). Pufer: 7,8 g natrijev dihidrogenfosfat v 1000 mL vode, pH 4,4 ± 0,1. Za umerjanje elektrode pH metra in postopek priprave pufra si oglejte posnetka na spodnjih povezavah ali uporabite QR kodi. − https://video.arnes.si/en/watch/vpkyyyc7f75y − https://video.arnes.si/en/watch/zdvt9dqr5frt − Priprava standarda: Natehtamo 20,0 mg standarda kalijevega klavulanata RS in 50,0 mg standarda amoksicilina trihidrata RS, ju kvantitativno prenesemo v isto 100,0 mL bučko, raztopimo v vodi R ter dopolnimo z vodo R do oznake ter premešamo (označimo kot ST). − Priprava vzorca: 2 tableti (oziroma ustrezno količino suspenzije, ki ustreza 1000 mg amoksicilina) prenesemo v 500,0 mL bučko, dopolnimo z vodo R do oznake in šele nato dodamo magnet. Mešamo vsaj 60 minut z magnetnim mešalom, da tablete popolnoma razpadejo in da se učinkovina raztopi. Del raztopine filtriramo skozi filter papir, prvih nekaj mL filtrata zavržemo, nato razredčimo z vodo R, da dobimo končno koncentracijo amoksicilina 0,5 mg/mL (označimo kot VZ). - 34 - Drugi sklop krožnih vaj − Priprava slepe raztopine: Mobilno fazo filtriramo skozi filter z velikostjo por 0,45 μm v HPLC vialo (označimo kot SL). c) Analiza vzorca Pred injiciranjem standard in vzorec filtriramo skozi 0,45 μm filter direktno v HPLC vialo. Relativni retencijski faktor za klavulansko kislino znaša 0,5 in za amoksicilin 1,0 (Slika 5). − Ločevanje: v uravnotežen kromatografski sistem injiciramo 1 × SL, 3 × ST (iz iste viale), 1 × VZ in 1 × SL. − Zahteve za vsebnost: Vsebnost amoksicilina: 90,0–120,0 %, vsebnost klavulanske kisline: 90,0–120,0 %. Pri izračunu upoštevamo jakost oziroma čistot standardov. Slika 6: Kromatogram amoksicilina in klavulanske kisline Kromatografski pogoji Mobilna faza 50 mM NaH2PO4, MeOH (95:5 v/v) (uporabimo enokanalen način) Pretok 1,5 mL/min Kolona dimenzije: 4,6 × 250 mm, stacionarna faza: oktadecilsilil silika gel (C18) za kromatografijo 3,5 μm, temperatura kolone: 20–30 °C Detekcija spektrofotometerična pri 220 nm. Volumen injiciranja 20 μL Čas analize 8 min − Ustreznost kromatografskega sistema: o Relativna standardna deviacija (RSD) površine kromatografskegih vrhov treh zaporednih injiciranj raztopine standarda je manjši od 2,0 %. o Resolucija (R) med amoksicilinom in klavulansko kislino v raztopini standarda je vsaj 3,5. o Faktor simetrije (T) vsakega signala ni večji od 1,5. - 35 - Drugi sklop krožnih vaj Literatura − Evropska farmakopeja 11.2, poglavje 2.2.26 tekočinska kromatografija. − Evropska farmakopeja 11.2, poglavje 2.2.46 kromatografske separacijske tehnike. − Ameriška farmakopeja (USP 43), monografija za tablete z amoksicilinom in kalijevim klavulanatom. - 36 - Drugi sklop krožnih vaj POROČILO HPLC: Vsebnost amoksicilina in klavulanske kisline po USP 43 Vzorec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Serija: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Datum proizvodnje: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Proizvajalec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Ustreznost kromatografskega sistema: parameter zahteva rezultat R T RSD Rezultati analize vsebnosti: Izračun: Zahteva: Vzorec: ustreza ne ustreza Komentar: Analizo opravil: Pregledal: Datum: - 37 - Tretji sklop krožnih vaj 4. Tretji sklop krožnih vaj 4.1. UV-VIS SPEKTROSKOPIJA: Določanje vsebnosti železa(III) v sirupu a) Opis vaje Najprej pripravimo 0,1 % raztopino fenantrolina, 10 % raztopino hidroksilamonijevega klorida in pufrsko raztopino natrijevega acetata pH 4,8, nato pripravimo standardne raztopine železovega(III) klorida heksahidrata (FeCl3 × 6H2O) in raztopine vzorcev. Vsebnost železa v vzorcu določimo tako, da vzorcu dodamo raztopino fenantrolina in izmerimo absorbanco nastalega kompleksa pri absorpcijskem maksimumu. Nasvet: Pred vajo si oglejte posnetek o pravilnem pipetiranju s polavtomatsko pipeto. − https://www.youtube.com/watch?v=QGX490kuKjg Princip določanja vsebnosti železa: Železo(III) v prisotnosti hidroksilamonijevega klorida reduciramo v železo(II), ki s fenantrolinom tvori stabilen obarvan kompleks z absorpcijskim maksimumom pri λ = 510 nm. b) Priprava osnovnih raztopin 0,1 % Raztopina fenantrolina: Natehtamo 250,0 mg fenantrolinijevega monohidrata, ga prenesemo v 250,0 mL bučko, dodamo 200 mL vode R in soniciramo v ultrazvočni kadički, dokler se ves fenantrolin ne raztopi (približno 10 minut). Nato dodamo vodo R do oznake ter dobro premešamo. - 38 - Tretji sklop krožnih vaj 10 % raztopina hidroksilamonjievega klorida: V 50,0 mL bučko natehtamo 5,0 g hidroksilamonijevega klorida (NH2OH × HCl), dopolnimo z vodo R do oznake in dobro premešamo, da dobimo bistro raztopino. Pufrska raztopina natrijevega acetata pH 4,8: V 250,0 mL bučko natehtamo 25,0 g natrijevega acetata, bučko dopolnimo z vodo R do oznake in dobro premešamo, da dobimo bistro raztopino. c) Priprava standardnih raztopin železovega(III) klorida heksahidrata (FeCl3 × 6H2O) Standard: železov(III) klorid heksahidrat (FeCl3 × 6H2O). 1. V 100,0 mL bučko natehtamo količino standarda, ki ustreza 100 mg železa, nato dodamo 10 mL vode R in 10 mL konc. HCl (37 %). Premešamo in soniciramo 10 minut v ultrazvočni kadički, ohladimo, dopolnimo z vodo R do oznake in dobro premešamo (raztopina standarda 1, c = 1 mg/mL). 2. 5,0 mL pripravljene raztopine standarda 1 odpipetiramo v 50,0 mL bučko, dopolnimo z vodo R do oznake in dobro premešamo (raztopina standarda 2, c = 0,1 mg/mL). 3. V 20,0 mL bučko natočimo približno 10 mL vode R ter pripravljene raztopine v naslednjem zaporedju: X µL raztopine standarda 2; 200,0 µL 10 % raztopine hidroksilamonijevega klorida; 2,0 mL 0,1 % raztopine fenantrolina in 1,6 mL pufrske raztopine natrijevega acetata ter dopolnimo z vodo R do oznake in dobro premešamo. X = 0,0 µL (slepa); 200,0 µL; 400,0 µL; 600,0 µL; 800,0 µL; 1000,0 µL 4. Počakamo 10 minut, nato pripravljenim raztopinam izmerimo absorbanco pri absorpcijskem maksimumu kompleksa (λ = 510 nm). d) Priprava raztopin vzorcev 1. V 100,0 mL bučko odmerimo volumen vzorca (sirupa), ki ustreza 100 mg železa(III), dodamo 10 mL vode R in 10 mL koncentrirane klorovodikove kisline (37 %), premešamo ter soniciramo 10 minut v ultrazvočni kadički z vodo, segreto na 90 °C. Raztopino nato ohladimo na sobno temperaturo, dopolnimo z vodo R do oznake in dobro premešamo (raztopina vzorca 1). Vsebnost izvajamo v treh paralelkah (pripravimo tri raztopine vzorca 1) ter ustrezen vzorec brez sirupa (slepi vzorec). 2. Pripravljeno raztopino vzorca 1 po potrebi filtriramo (če je v raztopini prisotna oborina, prvih nekaj mL filtrata zavržemo), nato v 50,0 mL bučko odpipetiramo 5,0 mL filtrata, dopolnimo z vodo R do oznake in dobro premešamo (raztopina vzorca 2). 3. V 20,0 mL bučko nalijemo 10 mL vode R ter dodamo pripravljene raztopine v naslednjem zaporedju: 800,0 µL raztopine vzorca 2; 200,0 µL 10 % raztopine hidroksilamonijevega klorida; 2,0 mL 0,1 % raztopine fenantrolina in 1,6 mL pufrske raztopine natrijevega acetata ter dopolnimo z vodo R do oznake in dobro premešamo. 4. Počakamo 10 minut, nato pripravljeni raztopini izmerimo absorbanco pri absorpcijskem maksimumu kompleksa (λ = 510 nm). - 39 - Tretji sklop krožnih vaj e) Izračun Iz izračunanih koncentracij in izmerjenih absorbanc standardnih raztopin narišemo umeritveno krivuljo ter določimo enačbo umeritvene premice. Enačbo umeritvene premice nato uporabimo za izračun vsebnosti železa(III) v sirupu. Vsebnost železa(III) v sirupu izračunamo še s pomočjo molarnega absorpcijskega koeficienta za kompleks železa(II) s fenantrolinom (ε = 11000 L mol–1 cm–1) in primerjamo oba rezultata. Zahteva za vsebnost železa(III) v sirupu: 95–105 % navedene vsebnosti. Literatura − D. A. Skoog, D. M. West, F. J. Holler, and S. R. Crouch, Analytical Chemistry: An Introduction, 7th ed., Chapters 21 and 22, pp. 547‒592. - 40 - Tretji sklop krožnih vaj POROČILO Določanje vsebnosti železa(III) v sirupu Vzorec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Serija: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Datum proizvodnje: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Proizvajalec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Rezultati analize in izračun: Natehta FeCl3 × 6H2O [mg]: Meritve: koncentracija Fe(III) Enačba umeritvene premice: Aizmerjena [mg/mL] 𝑣 ̅ 𝑠𝑒𝑏 ̅̅̅̅ 𝑛 ̅̅ 𝑜 ̅̅ 𝑠𝑡 ̅̅̅ = Izračun: RSD [%] = Zahteva: Vzorec: ustreza ne ustreza Komentar: Analizo opravil: Datum: Pregledal: - 41 - Tretji sklop krožnih vaj 4.2. TITRACIJE V BREZVODNEM MEDIJU: Vsebnost lidokainijevega klorida v raztopini za injiciranje a) Opis vaje Pripravimo 0,02 M perklorovo kislino in jo standardiziramo s primarnim standardom kalijevim hidrogen ftalatom RV po predpisu iz Ph. Eur. 11.2, nato pa določimo vsebnost lidokainijevega klorida v raztopini za injiciranje po prilagojenem postopku iz BP 2011. Princip standardizacije perklorove kisline : Nasvet: Uporabljamo zgolj suho steklovino. Z diklorometanom delamo v digestoriju, steklovina naj bo pokrita s folijo. Odpadne raztopine, ki vsebujejo diklorometan oziroma ocetno kislino, zbiramo v ločeni posodi za odpadna topila. b) Priprava in standardizacija 0,02 M perklorove kisline 0,1 M perklorova kislina (0.1 M Perchloric acid) V merilno bučko, ki vsebuje približno 900 mL ledoceta R, damo 8,5 mL perklorove kisline R in premešamo. Dodamo 30 mL acetanhidrida R, razredčimo do 1000,0 mL ledocetom R, premešamo in pustimo stati 24 h. Standardizacija: 0,350 g kalijevega hidrogenftalata RV raztopimo v 50 mL brezvodne ocetne kisline R in po potrebi rahlo segrejemo. Zaščiteno pred zrakom pustimo, da se ohladi in titriramo z 0,1 M perklorovo kislino, pri čemer kot indikator uporabimo 0,05 mL raztopine kristalno vijoličnega R. Upoštevamo temperaturo 0,1 M perklorove kisline v času titracije. Če se temperatura med analizo razlikuje od tiste, pri kateri je bila standardizirana 0,1 M perklorova kislina, upoštevamo naslednji korekcijski faktor za volumen, uporabljen v analizi: Vc = V [1 + ( T1 – T2) 0,0011] T 1 = temperatura med standardizacijo T 2 = temperatura med preskusom Vc = popravljen volumen V = določen volumen 1 mL 0,1 M perklorove kisline ustreza 20,42 mg C8H5KO4. Opomba: 0,02 M perklorova kislina je že pripravljena. - 42 - Tretji sklop krožnih vaj Standardizacijo 0,02 M perklorove kisline izvedemo v 3 paralelkah, izvedemo tudi slepo titracijo. Natehtamo 100,0 mg kalijevega hidrogenftalata (predhodno sušen pri 120 °C), ga raztopimo v 20 mL ledoceta (po potrebi rahlo segrejemo, da se kristali kalijevega hidrogenftalata RV raztopijo) in titriramo ob prisotnosti 0,05 mL (1 kapljica) raztopine indikatorja kristalno vijoličnega do modrozelene barve. c) Določanje vsebnosti lidokainijevega klorida v raztopini za injiciranje po prilagojenem postopku iz BP 2011 Injekcije z lidokainom Zahtevana vsebnost: 95,0–105,0 % (računano na C14H22N2O × HCl × H2O) Odpipetiramo 5,0 mL raztopine za injiciranje, dodamo 1 mL 2 M natrijevega hidroksida (pH preverimo s pH lističi) in ekstrahiramo s 3 × 20 mL diklorometana R (manj toksičen od kloroforma). Združene organske faze prenesemo v lij ločnik in ekstrahiramo z 10 mL vode R. Organsko fazo nato filtriramo skozi Whatman PS1 filter (teflonski filter za fazno separacijo, ki ni prepusten za vodo), filter na koncu speremo z 10 mL diklorometana R. Slepi vzorec: 60 mL diklorometana R ekstrahiramo z 10 mL vode R, filtriramo skozi Whatman PS1 filter in speremo z 10 mL diklorometana R. Organsko fazo titriramo z 0,02 M perklorovo kislino ob prisotnosti indikatorja raztopine kristalno vijoličnega R (1 kapljica). 1 mL 0,02 M perklorove kisline ustreza 5,776 mg C14H22N2O × HCl × H2O. Določitev vsebnosti lidokainijevega klorida izvedemo v 3 paralelkah, izvedemo tudi slepo titracijo (1 ×). Opomba: Pri izračunu vsebnosti lidokainijevega klorida bodite pozorni, saj je izračun vsebnosti po farmakopeji podan za lidokainijev klorid monohidrat. Vprašanje Zakaj raztopino za injiciranje z lidokainijevim kloridom najprej naalkalimo z 2 M natrijevim hidroksidom? Literatura − Evropska farmakopeja 11.2, poglavje 4.2.2. volumetrične raztopine − Britanska farmakopeja 2009, monografija za injekcije z lidokainom - 43 - Tretji sklop krožnih vaj POROČILO Titracije v brezvodnem mediju Priprava in standardizacija 0,02 M perklorove kisline Standard: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Serija: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Datum proizvodnje: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Proizvajalec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Rezultati analize: natehta C8H5KO4 poraba raztopine faktor ( f) [mg] HClO4 [mL]: 0,02 M HClO4 1 2 3 Slepa (mL): 𝑓 ̅ = Izračun: RSD [%] = Komentar: - 44 - Tretji sklop krožnih vaj Vsebnost lidokainijevega klorida Vzorec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Serija: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Datum proizvodnje: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Proizvajalec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Rezultati analize: volumen poraba vsebnost vsebnost glede na vzorca [mL] 0,02 M HClO4 [mL] [mg/mL] navedeno vsebnost [%] 1 2 3 Slepa (mL): 𝑣 ̅ 𝑠𝑒𝑏 ̅̅̅̅ 𝑛 ̅̅ 𝑜 ̅̅ 𝑠𝑡 ̅̅̅ = Izračun: RSD [%] = Zahteva: Vzorec: ustreza ne ustreza Komentar: Analizo opravil: Pregledal: Datum: - 45 - Tretji sklop krožnih vaj 4.3. PLINSKA KROMATOGRAFIJA: Določanje vsebnosti D-α-tokoferola v mehkih želatinastih kapsulah a) Opis vaje S plinsko kromatografijo (GC) analiziramo vsebnost D-α-tokoferola v mehkih želatinastih kapsulah. Najprej natehtamo standarde in pripravimo ustrezne raztopine. Nato pripravimo vzorec in mu dodamo interni standard ter izvedemo analizo vsebnosti po prilagojenem postopku iz Ph. Eur. 11.2. Opomba: Pri vaji mora biti vsa steklovina suha, po koncu vaje pa steklovine ne spiramo z vodo, ampak z acetonom. b) Priprava raztopin standardov − Raztopina internega standarda (IS) V 50,0 mL bučko natehtamo 250 mg skvalena R, ga raztopimo v približno 35 mL cikloheksana R, dopolnimo s topilom do oznake in dobro premešamo. (cskv ~ 5 mg/mL) − Raztopina D-α-tokoferola (α-Toc-OH) V 20,0 mL bučko približno natančno natehtamo 100,0 mg standarda D-α-tokoferola R, ga raztopimo v približno 15 mL cikloheksana R, dopolnimo s topilom do oznake in dobro premešamo. Standard D-α-tokoferola tehtamo tako, da najprej stariramo 20,0 mL bučko in nato čisto stekleno palčko ali spatulo pomočimo v standard. Viskozno tekočino, ki se oprime palčke ali spatule, prenesemo direktno v bučko in zapišemo maso. Natehtan standard nato s stene bučke speremo s cikloheksanom R iz puhalke in z istim topilom dopolnimo do oznake. (cα-Toc-OH ~ 5 mg/mL) − Raztopina α-tokoferilacetata (α-Toc-Ac) V 20,0 mL bučko natehtamo približno 100 mg standarda α-tokoferilacetata R, ga raztopimo v približno 15 mL cikloheksana R, dopolnimo do oznake s cikloheksanom R in dobro premešamo. (cα-Toc-Ac ~ 5 mg/mL) − Raztopina standarda a (RSa) V 25,0 mL bučko odmerimo 5,0 mL raztopine D- α-tokoferola R (α-Toc-OH) in 5,0 mL raztopine internega standarda (IS), dopolnimo do oznake s cikloheksanom R in dobro premešamo. (cα-Toc-OH ~ 1 mg/mL, cskv ~ 1 mg/mL) - 46 - Tretji sklop krožnih vaj − Raztopina standarda b (RSb) V 25,0 mL bučko odmerimo 5,0 mL raztopine D-α-tokoferola R (α-Toc-OH) in 5,0 mL raztopine α-tokoferilacetata R (α-Toc-Ac), dopolnimo do oznake s cikloheksanom R in dobro premešamo. (cα-Toc-OH ~ 1 mg/mL, cα-Toc-Ac ~ 1 mg/mL) c) Priprava raztopine vzorca (RV) Stehtamo 5 mehkih želatinskih kapsul. Kapsule nato previdno prebodemo z injekcijsko iglo. Iglo izvlečemo ter jih ponovno previdno prebodemo na drugi strani ter vsebino vseh petih kapsul s pomočjo injekcijske igle in brizge prenesemo v suho vialo. Prazne kapsule damo v manjšo (50 ali 100 mL) čašo in vse skupaj postavimo v sušilnik pri 65 °C za 5 minut, da se kapsule nekoliko zmehčajo. Kapsule nato previdno (držimo jih s pinceto!) prerežemo na dva dela, ki ju nad večjo čašo speremo s heksanom (vsebino čaše po spiranju zavržemo v odpadna topila). Čiste kapsule damo v manjšo suho čašo in jih ponovno postavimo za 5 minut v sušilnik (65 °C), da se posušijo. Nato jih ohladimo na sobno temperaturo ter stehtamo. Maso suhih kapsul odštejemo od začetne mase kapsul ter tako določimo maso vsebine kapsul. V 25,0 mL bučko točno natehtamo vsebino kapsul, ki vsebuje približno 28,0 mg D-α- tokoferola, dodamo 10 mL cikloheksana R in 5,0 mL raztopine internega standarda (IS), premešamo, dopolnimo do oznake s cikloheksanom R in dobro premešamo. Tako pripravljeno raztopino filtriramo skozi 0,45 μm filter v 1,5 mL vialo za injiciranje. (c α-Toc-OH ~ 1,1 mg/mL, cskv ~ 1 mg/mL) Za pripravo vzorca za GC si oglejte posnetek na spodnji povezavi ali uporabite QR kodo za dostop. − https://video.arnes.si/watch/mjrzj30nf9n5 d) Analiza vzorca V kromatografski sistem zaporedoma injiciramo raztopino standarda a (RSa), raztopino standarda b (RSb) in raztopino vzorca (RV). - 47 - Tretji sklop krožnih vaj − Ustreznost kromatografskega sistema: Ločljivost med vrhovoma D-α-tokoferola in α-tokoferilacetata v raztopini standarda b ne sme biti manjša od 3,5. Kromatografski pogoji Nosilni plin helij, 3 mL/min Kolona dimenzije: 0, 25 mm × 30 m, stacionarna faza: silika gel 5 % fenil Zebron ZB-5MSi 95 % metil; 0,25 µ temperatura kolone: 290 °C Detekcija detektor s plamensko ionizacijo ( flame ionisation detector, FID) Volumen injiciranja 1 μL Način injiciranja »split« (1:100) Temperatura injekotrja 320 °C Čas analize 10 min − Zahteva: vsebnost D-α-tokoferola 95,0–105,0 %. Literatura − Evropska farmakopeja 11.2, poglavje 2.2.28 plinska kromatografija. − Evropska farmakopeja 11.2, poglavje 2.2.46 kromatografske separacijske tehnike. − Evropska farmakopeja 11.2, poglavje 17, monografija za RRR-α-tokoferol. - 48 - Tretji sklop krožnih vaj POROČILO Plinska kromatografija Določanje vsebnosti D-α-tokoferola v mehkih želatinastih kapsulah Vzorec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Serija: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Datum proizvodnje: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Proizvajalec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Ustreznost kromatografskega sistema: parameter zahteva rezultat R Rezultati analize vsebnosti: Izračun: Zahteva: Vzorec: ustreza ne ustreza Komentar: Analizo opravil: Pregledal: Datum: - 49 - Tretji sklop krožnih vaj 4.4. TEKOČINSKA KROMATOGRAFIJA VISOKE LOČLJIVOSTI: Določitev vsebnosti izoniazida in nečistot v učinkovini a) Opis vaje S tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC) določamo vsebnost izoniazida v učinkovini, ki so jo pripravili študentje na vajah iz Farmacevtske kemije 3 v prejšnjih študijskih letih. Pufer pripravimo po spodaj opisanem postopku, pripravimo tudi raztopino standarda, raztopino za preverjaje ustreznosti kromatografskega sistema in raztopino vzorca ter jih injiciramo v uravnotežen kromatografski sistem. Sledi analiza rezultatov in izračun vsebnosti. Struktura izoniazida (Mr = 137,14): b) Priprava pufrske raztopine in mobilne faze: 50 mM fosfatna pufrska raztopina pH 6,9 Za pripravo 500 mL pufra natehtamo 2,16 g dikalijevega hidrogenfosfata (K2HPO4) in 1,71 g kalijevega dihidrogenfosfata (KH2PO4), ju prenesemo v 500 mL erlenmajerico in raztopimo v približno 450 mL bidestilirane (MilliQ) vode. pH preverimo s predhodno umerjenim pH metrom in po potrebi uravnamo pH pufra z dodatkom 5 % raztopine kalijevega hidroksida (KOH) oziroma 10 % raztopine fosforjeve(V) kisline (H3PO4). Po uravnavi pH (pH = 6,85–6,94) prenesemo pufer v 500 mL bučko in dopolnimo z bidestilirano (MilliQ) vodo do oznake. Za pripravo mobilne faze (50 mM fosfatna puferska raztopina pH 6,9, metanol [95:5 V/V]) z merilnim valjem odmerimo ustrezno količino pufra in metanola (HPLC čistost) ter ju prenesemo v čisto 500 mL erlenmajerico, premešamo ter filtriramo skozi 0,45 μm filter v steklenico za HPLC topila. Približno 250 mL mobilne faze odlijemo v čisto erlenmajerico (potrebujemo za pripravo vzorcev in standardov), preostanek pa uporabimo kot mobilno fazo. Za umerjanje elektrode pH metra in postopek priprave pufra si oglejte posnetka na spodnjih povezavah ali uporabite QR kodi. − https://video.arnes.si/en/watch/vpkyyyc7f75y − https://video.arnes.si/en/watch/zdvt9dqr5frt - 50 - Tretji sklop krožnih vaj c) Priprava raztopin z izoniazidom in nečistot − Raztopina standarda: V 25,0 mL bučko približno natančno natehtamo 25,0 mg standarda izoniazida in dopolnimo do oznake z mobilno fazo (standard stock – ST-stock, cST-stock ~ 1 mg/mL). 5,0 mL tako pripravljene raztopine prenesemo v 50,0 mL bučko in dopolnimo do oznake z mobilno fazo. Raztopino filtriramo skozi 0,45 μm filter v HPLC vialo – ST. (cST ~ 0,1 mg/mL) − Raztopina vzorca: V 25,0 mL bučko približno natančno natehtamo 25,0 mg vzorca izoniazida in dopolnimo do oznake z mobilno fazo. 5,0 mL tako pripravljene raztopine prenesemo v 50,0 mL bučko in dopolnimo do oznake z mobilno fazo. Raztopino filtriramo skozi 0,45 μm filter v vialo – VZ. (cVZ ~ 0,1 mg/mL). − Raztopina za preverjanje kromatografskega sistema (SST): Natehtamo 5 mg izonikotinske kisline in 5 mg izonikotinamida, prenesemo v 50,0 mL bučko, dodamo 5,0 mL raztopine ST-stock (prva alineja) in dopolnimo do oznake z mobilno fazo – SST. (cSST ~ 0,1 mg/mL). − Slepa: mobilna faza – SL. d) Analiza vzorca − Ločevanje: v uravnotežen kromatografski sistem injiciramo 1 × SL, 3 × ST (iz iste viale), 1 × SST in 1 × VZ. − Zahteva za vsebnost iznoniazida: 95,0–105,0 %. − Relativna retencija za izonikotinsko kislino znaša 0,61, za izoniazid 1,0 in za izonikotinamid 1,15 (Slika 7). Kromatografski pogoji Mobilna faza 50 mM KH2PO4, MeOH (95:5 v/v) (uporabimo enokanalen način) Pretok 1 mL/min Kolona dimenzije: 4,6 × 150 mm, stacionarna faza: silika gel z vezanimi fenilnimi skupinami (Phenyl) za kromatografijo 3,5 μm, temperatura kolone: 20–30 °C Detekcija spektrofotometrično pri 254 nm. Volumen injiciranja 10 μL Čas analize 6 min - 51 - Tretji sklop krožnih vaj Slika 7: Kromatogram izoniazida in sorodnih substanc − Ustreznost kromatografskega sistema: o RSD površine kromatografskega vrha za izoniazid treh zaporednih injiciranj raztopine ST je manjši od 2,0 %. o Resolucija med izoniazidom in izonikotinsko kislino je vsaj 3,0 in resolucija med izoniazidom in izonikotinamidom je vsaj 2,0 na kromatogramu, posnetem s SST. − Sorodne substance: Izračun vsebnosti nečistot: o korekcijski faktorji: pomnožite površine vrhov naslednjih nečistot z ustreznim korekcijskim faktorjem: nečistota A = 1,4; nečistoča B = 1,5; o za vsako nečistoto uporabite koncentracijo izoniazida v raztopini vzorca (VZ): Nečistoti A in B v vzorcu (VZ) sta največ 0,15 %. Vsaka druga nečistota v vzorcu (VZ) je največ 0,10 %. Seštevek vseh nečistot v vzorcu (VZ) ni več kot 0,5 %. Nečistote: Izonikotinska kislina: Izonikotinamid: (nečistota A) (nečistota B) - 52 - Tretji sklop krožnih vaj Vprašanja Kaj je izvor izonikotinske kisline in izonikotinamida? Za kakšne spojine je primerna stacionarna faza s fenilnimi skupinami? Na podlagi katerih interakcij poteka separacija? Literatura − Evropska farmakopeja 11.2, poglavje 4.1.3 pufrske raztopine. − Evropska farmakopeja 11.2, poglavje 15, monografija za izoniazid. − Evropska farmakopeja 11.2, poglavje 2.2.26 tekočinska kromatografija. − Evropska farmakopeja 11.2, poglavje 2.2.46 kromatografske separacijske tehnike. - 53 - Tretji sklop krožnih vaj POROČILO Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti: Vsebnost izoniazida in nečistot v učinkovini Vzorec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Serija: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Datum proizvodnje: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Proizvajalec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Ustreznost kromatografskega sistema: parameter zahteva rezultat R T RSD Rezultati analize vsebnosti: Izračun: Zahteva: Vzorec: ustreza ne ustreza Komentar: Analizo opravil: Pregledal: Datum: - 54 - Tretji sklop krožnih vaj 4.5. KOMPLEKSOMETRIJA: Priprava in standardizacija 0,05 M dinatrijevega edetata, priprava in standardizacija 0,05 M cinkovega sulfata ter vsebnost aluminijevega hidroksida in magnezijevega hidroksida v tabletah a) Opis vaje Pripravimo 0,05 M dinatrijev edetat (Na2EDTA) in ga standardiziramo s primarnim standardom kalcijevim karbonatom RV. Pripravimo tudi 0,05 M cinkov sulfat, ki ga standardiziramo z 0,05 M raztopino Na2EDTA. Vsebnost magnezijevega hidroksida in aluminijevega hidroksida v tabletah določimo po prilagojenem predpisu iz USP 43. Princip kompleksometrije: Pri kompleksometriji uporabljamo etilendiamintetraocetno kislino (EDTA), ki z dvo- ali trovalentnimi kationi tvori stabilne komplekse v stehiometričnem razmerju 1 : 1. b) Priprava 0,05 M dinatrijevega edetata in 0,05 M cinkovega sulfata 500,0 mL 0,05 M dinatrijevega edetata in 250,0 mL 0,05 M cinkovega sulfata pripravimo po prilagojenem predpisu (spodaj) iz USP 43. Raztopini etilendiamintetraocetne kisline in cinkovega sulfata standardiziramo v 3 paralelkah, slepe titracije ne izvajamo. 0,05 M dinatrijev edetat (Edetate disodium, Twentieth-Molar (0.05 M)) C10H14N2Na2O8 × 2H2O, 372,24 Za izve 18,6 d gb o vaj Na2 e p EDT ot A re R b ru a je z te še topi sp mo od v n v je r odi a R z , topi da ne in dob r im e o agente 1000 : mL, in standardiziramo po sledečem postopku. Približno natančno natehtamo 200 mg kelometričnega standarda – kalcijev karbonat, ki smo ga predhodno sušili pri 110 °C 2 uri in ohladili v eksikatorju, prenesemo ga v 400 mL čašo, dodamo 10 mL vode in zavrtimo, da nastane gosta suspenzija. S pipeto dodamo 2 mL razredčene klorovodikove kisline. Vsebino čaše zavrtimo, da se kalcijev karbonat raztopi. Z vodo speremo stene čaše ter zunanjo površino pipete in razredčimo z vodo na približno 100 mL. Med mešanjem raztopine, po možnosti z magnetnim mešalom, dodamo približno 30 mL 0,05 M dinatrijevega edetata iz 50 mL birete, nato dodamo 15 mL natrijevega hidroksida TS in 300 mg hidroksinaftolno modrega ter nadaljujmo s titracijo z 0,05 M dinatrijevim edetatom do modre končne točke. (𝑔 𝐶𝑎𝐶𝑂 𝑀 = 3) × (1000) 100,09 × 𝑚𝐿 𝐸𝐷𝑇𝐴 - 55 - Tretji sklop krožnih vaj 0,05 M cinkov sulfat (Zinc Sulfate, Twentieth-Molar (0.05 M)) ZnSO4 × 7H2O, 287,56 14,4 g cinkovega sulfata R raztopimo v vodi R in premešamo, da dobimo 1 L. Raztopino standardiziramo po sledečem postopku. Natančno odmerimo 10 mL 0,05 M dinatrijev edetat VS v 250 mL erlenmajerico in dodamo v navedenem vrstnem redu 10 mL pufrske raztopine ocetna kislina-amonijev acetat TS, 50 mL alkohola in 2 mL ditizona TS. Titriramo z raztopino cinkovega sulfata do bistre rožnate barve. mL dinatrijev edetat × M dinatrijev edetat 𝑀 = mL ZnSO4 Za izvedbo vaje potrebujete še spodnje raztopine oziroma reagente: Razredčena klorovodikova kislina (10 %) – Pripravimo jo z mešanjem 226 mL 37 % klorovodikove kisline z vodo do volumna 1000 mL. Hidroksinaftolno modro – 100 mg hidroksinaftolno modrega R zmešamo z 10 g natrijevega klorida R in v terilnici homogeniziramo, da dobimo približno 1 % (m/m) zmes. Natrijev hidroksid TS – 4,0 g natrijevega hidroksida raztopimo v vodi, da dobimo 100 mL in premešamo. Pufrska raztopina ocetna kislina-amonijev acetat TS – 77,1 g amonijevega acetata raztopimo v 500 mL vode R, dodamo 57 mL koncentrirane ocetne kisline in razredčimo z vodo R do 1000 mL in premešamo. Ditizon TS – 25,6 mg ditizona R raztopimo v 100 mL etanola R (96 % v/v) in premešamo. Hranimo na hladnem in porabimo v 2 mesecih. Pufrska raztopina amonijak-amonijev klorid TS – 67,5 g amonijevega klorida raztopimo v vodi, dodamo 570 mL amonijevega hidroksida in dopolnimo do 1000 mL z vodo ter premešamo. Eriokrom črno T – 200 mg eriokrom črno T raztopimo v mešanici 15 mL trietanolamina in 5 mL dehidriranega alkohola in premešamo. c) Priprava vzorca Vzorec: Gastal® 450 mg/300 mg tablete: 1 tableta vsebuje 95,26 mg Al3+ in 141,11 mg Mg2+, kar ustreza 275 mg suhega Al(OH)3 in 340 mg Mg(OH)2 Zahtevana vsebnost: 90,0–110,0 % aluminijevega hidroksida in magnezijevega hidroksida Na začetku stehtamo in zdrobimo 5 tablet. Za pripravo osnovne raztopine natehtamo v 250 mL bučko za reakcije maso tabletnega prahu, ki vsebuje približno 1200 mg aluminijevega hidroksida, dodamo 30 mL vode R in 30 mL koncentrirane klorovodikove kisline ter vrelne kamenčke in segrevamo pri pogojih refluksa na grelni kaloti okoli 10 minut (v digestoriju). - 56 - Tretji sklop krožnih vaj Raztopino ohladimo in kvantitativno prenesemo v 200,0 mL bučko in dopolnimo z vodo do oznake (raztopina vzorca). d) Določanje vsebnosti aluminijeva hidroksida Vsebnost aluminijevega hidroksida izvajamo v 2 paralelkah (odpipetiramo 2 alikvota) in izvedemo slepo meritev. V 250 mL čašo odpipetiramo 10,0 mL raztopine vzorca, dodamo 20 mL vode R in med mešanjem dodamo 25,0 mL 0,05 M dinatrijevega edetata, 20 mL pufrske raztopine ocetna kislina-amonijev acetat TS in segrevamo malo pod temperaturo vrenja 5 min. Ohladimo, dodamo 50 mL etanola (96 %) in 20 mL ditizona TS ter premešamo. Titriramo z 0,05 M cinkovim sulfatom, dokler se barva ne spremeni iz zeleno vijolične v rožnato. Slepo meritev izvedemo tako, da 10,0 mL raztopine vzorca zamenjamo za vodo R. 1 mL 0,05 M dinatrijevega edetata ustreza 3,900 mg Al(OH)3. e) Določanje vsebnosti magnezijevega hidroksida Vsebnost magnezijevega hidroksida izvajamo v 2 paralelkah (odpipetiramo 2 alikvota) in izvedemo slepo meritev. Odpipetiramo 5,0 mL raztopine vzorca v 400 mL čašo, dodamo 200 mL vode R in 20 mL trietanolamina in premešamo. Dodamo 10 mL pufrske raztopine amonijak-amonijev klorid TS in 3 kapljice raztopine indikatorja eriokrom črno T. Raztopino ohladimo na 3–4 °C tako, da čašo potopimo v ledeno kopel, odstranimo z ledu ter titriramo z 0,05 M dinatrijevim edetatom do modre končne točke. Slepo meritev izvedemo tako, da 10,0 mL vzorca zamenjamo za vodo R. 1 mL 0,05 M dinatrijevega edetata ustreza 2,916 mg Mg(OH)2. Literatura − Ameriška farmakopeja USP 43, monografija za tablete z aluminijem in magnezijem. − Ameriška farmakopeja USP 43, Volume 4, poglavje volumetrične raztopine. - 57 - Tretji sklop krožnih vaj POROČILO Kompleksometrija Priprava in standardizacija 0,05 M dinatrijevega edetata Standard: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Serija: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Datum proizvodnje: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Proizvajalec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Rezultati analize: natehta CaCO3 poraba Na2EDTA koncentracija faktor ( f) [mg] raztopine [mL] Na2EDTA [M] 0,05 M Na2EDTA 1 2 3 𝑓̅ = Izračun: RSD [%] = Komentar: - 58 - Tretji sklop krožnih vaj Priprava in standardizacija 0,05 M cinkovega sulfata Standard: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Serija: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Datum proizvodnje: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Proizvajalec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Rezultati analize: volumen 0,05 M poraba ZnSO4 koncentracija faktor ( f) Na2EDTA [mL] raztopine [mL] ZnSO4 [M] 0,05 M ZnSO4 1 2 3 𝑓 ̅ = Izračun: RSD [%] = Komentar: - 59 - Tretji sklop krožnih vaj Vsebnost aluminijevega hidroksida Vzorec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Serija: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Datum proizvodnje: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Proizvajalec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Rezultati analize: natehta vzorca poraba vsebnost vsebnost glede na navedeno [mg] 0,05 M ZnSO4 [mL] [mg] vsebnost [%] 1 2 Slepa [mL]: 𝑣 ̅ 𝑠𝑒𝑏 ̅̅̅̅ 𝑛 ̅̅ 𝑜 ̅̅ 𝑠𝑡 ̅̅̅ = Izračun: RSD [%] = Zahteva: Vzorec: ustreza ne ustreza Komentar: Analizo opravil: Pregledal: Datum: - 60 - Tretji sklop krožnih vaj Vsebnost magnezijevega hidroksida Vzorec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Serija: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Datum proizvodnje: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Proizvajalec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Rezultati analize: natehta vzorca poraba vsebnost vsebnost glede na [mg] 0,05 M Na2EDTA [mL] [mg] navedeno vsebnost [%] 1 2 Slepa [mL]: 𝑣 ̅ 𝑠𝑒𝑏 ̅̅̅̅ 𝑛 ̅̅ 𝑜 ̅̅ 𝑠𝑡 ̅̅̅ = Izračun: RSD [%] = Zahteva: Vzorec: ustreza ne ustreza Komentar: Analizo opravil: Pregledal: Datum: - 61 - Tretji sklop krožnih vaj 4.6. UV-VIS SPEKTROSKOPIJA: Identifikacija furosemida v tabletah in določanje enakomernosti vsebnosti furosemida v tabletah a) Opis vaje Enakomernost vsebnosti furosemida v odmernih enotah – tabletah določamo po prilagojenem postopku iz Eur. Ph. 11.2. Pripravimo raztopine desetih tablet, ki jim določimo vsebnost s pomočjo UV-Vis spektroskopije. Nato posnamemo UV spekter enega vzorca in izvedemo identifikacijo furosemida v tabletah po Britanski farmakopeji. Preskus enakomernosti vsebnosti: Preskus enakomernosti odmernih enot temelji na določanju vsebnosti učinkovine v posamezni odmerni enoti na vnaprej predpisanem številu odmernih enot. Z njim ugotovimo, če je vsebnost zdravilne učinkovine v posamezni odmerni enoti (tableti, kapsuli itd.) znotraj postavljenih meja. Nasvet: Za pravilno uporabo UV-Vis spektrometra si oglejte posnetek z navodili o uporabi ali uporabite QR kodo. − https://video.arnes.si/watch/2jjr2473jkld b) Identifikacija furosemida v tabletah Furosemid tablete IDENTIFIKACIJA A. Absorpcija svetlobe, Dodatek II B, v območju med 220 in 320 nm ima končna raztopina, pripravljena pri preskusu vsebnosti, dva maksimuma pri 228 nm in 271 nm (Slika 8). - 62 - Tretji sklop krožnih vaj Slika 8: Spekter furosemida b) Določanje enakomernosti vsebnosti furosemida Najprej pripravimo 2 L 0,1 M natrijevega hidroksida. Iz pretisnega omota vzamemo 10 tablet, jih vse skupaj stehtamo in izračunamo povprečno maso tablete. Nato vsako posamezno tableto prenesemo v svojo 100,0 mL bučko, dodamo približno 40 mL 0,1 M natrijevega hidroksida, stresamo, da tableta razpade, dopolnimo do oznake z 0,1 M natrijevim hidroksidom in dobro premešamo. Počakamo 10 min, da se delci suspenzije posedejo, nato iz zgornjega bistrega dela raztopine s pipeto prenesemo 1,0 mL raztopine v 50,0 mL bučko in dopolnimo do oznake z 0,1 M natrijevim hidroksidom. Tako pripravljeni raztopini pomerimo absorbanco pri 271 nm. Vsebnost za vsako izmed desetih tablet izračunamo s pomočjo specifične absorbance, ki pri 271 nm znaša 580. Iz rezultatov posameznih vsebnosti izračunamo povprečno vsebnost (v odstotkih glede na navedeno vsebnost) ter ustreznost tablet glede na preskus enakomernosti vsebnosti. Izračunamo sprejemljivo vrednost (» Acceptance Value« [ AV]) z uporabo spodnje enačbe in preglednice 4: AV = | M − 𝑿 ̅| + 𝒌𝒔. Zahteve za enakomernost vsebnosti so izpolnjene, če je sprejemljiva vrednost ( AV) za prvih 10 odmernih enot (tablet) manjša ali enaka L1. Če je sprejemljiva vrednost večja od L1, moramo preskus enakomernosti vsebnosti ponoviti še z 20 odmernimi enotami in ponovno izračunati sprejemljivo vrednost. Zahteve so izpolnjene, če je končna sprejemljiva vrednost vseh 30 odmernih enot manjša ali enaka L1 in nobena posamezna vsebnost učinkovine ni manjša kot (1 − L2 × 0,01) M ali večja kot (1 + L2 × 0,01) M. Če ni drugače določeno, je L1 = 15 in L2 = 25. - 63 - Tretji sklop krožnih vaj Preglednica 4: Izračun sprejemljive vrednosti ( AV), povzeto po Eur. Ph. 11.2, poglavje 2.9.40. Enakomernost odmernih enot. Spremenljivka Definicija Pogoj Vrednost Povprečje posameznih vsebnosti ( x 𝑋̅ 1, x2, …, xn), izraženo kot % glede na navedeno vrednost. Posamezne vsebnosti testiranih odmernih enot, x1, x2, …, xn izražene kot % glede na navedeno vsebnost. Velikost vzorca (število n odmernih enot v vzorcu). Konstanta Če je število vzorcev 10. 2,4 k sprejemljivosti. Če je število vzorcev 30. 2,0 Standardna deviacija ∑𝑛 ( 𝑥 s 𝑖=1 𝑖 − 𝑋 ̅)2 vzorca. 𝜎 = √ 𝑛 − 1 M = 𝑋̅ 98,5 % ≤ 𝑋̅ ≤ 101,5 % ( AV = ks) M (primer 1) M = 98,5 % Referenčna vrednost. 𝑋̅ < 98,5 % Ko je T ≤ 101,5 ( AV = 98,5 − 𝑋̅ + ks) M = 101,5 % 𝑋̅ > 101,5 % (AV = 𝑋̅ – 101,5 + ks) M = X 98,5 % ≤ 𝑋̅ ≤ T ( AV = ks) M (primer 2) M = 98,5 % Referenčna vrednost. 𝑋̅ < 98,5 % Ko je T > 101,5 (AV = 98,5 − 𝑋̅ + ks) M = T % 𝑋̅ > T (AV = 𝑋̅ – T + ks) Ciljna vsebnost na odmerno enoto v času izdelave, izražena kot odstotek navedene vsebnosti. T Če ni navedeno drugače, je T enak 100 % oziroma T definira proizvajalec kot ciljno vsebnost na odmerno enoto. Maksimalna dovoljena L1 = 15,0 L1 AV. (če ni definirano drugače). Na spodnji strani vsebnosti Maksimalno dovoljeno ne sme biti nobena izmed območje raztrosa odmernih enot manjša od L2 = 25,0 L2 posamezne odmerne 0,75 M, na zgornji strani (če ni definirano drugače). enote na osnovi pa ne sme biti nobena izračunane vrednosti M. izmed odmernih enot večja od 1,25 M. - 64 - Tretji sklop krožnih vaj Vprašanja Zakaj smemo tehtati tablete na precizni tehtnici, glede na to, da gre za vzorec? Ali je potrebno glede na zahteve Evropske farmakopeje opraviti preskus na enakomernost vsebnosti ( Content uniformity) za tablete s furosemidom, ki ste jih analizirali pri vajah? Ali je glede na monografijo Enakomernost odmernih enot » 2.9.40 Uniformity of dosage forms« možen oziroma dovoljen kakšen drug preskus? Literatura − Evropska farmakopeja 11.2, poglavje 2.9.40. enakomernost odmernih enot. − Britanska farmakopeja 2009, volumen 3, monografija za tablete s furosemidom. - 65 - Tretji sklop krožnih vaj POROČILO UV-Vis spektroskopija Preskus enakomernosti vsebnosti furosemida v tabletah Standard: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Serija: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Datum proizvodnje: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Proizvajalec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Rezultati preskusa enakomernosti odmernih enot: Tableta: x1 x2 x3 x4 x5 x6 x7 x8 x9 x10 Vsebnost (%) X (%) s M (T = 100) AV L1 Izračun za 1 vzorec: Zahteva: Vzorec: ustreza ne ustreza Komentar: - 66 - Tretji sklop krožnih vaj Identifikacija furosemida v tabletah Standard: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Serija: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Datum proizvodnje: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Proizvajalec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Rezultat analize: Zahteva: Vzorec: ustreza ne ustreza Komentar: Analizo opravil: Pregledal: Datum: - 67 - Tretji sklop krožnih vaj 4.7. TEKOČINSKA KROMATOGRAFIJA VISOKE LOČLJIVOSTI: Določitev vsebnosti sulfametoksazola in nečistot v učinkovini a) Opis vaje Vsebnost sulfametoksazola v učinkovini, ki so jo sintetizirali študentje na vajah iz Farmacevtske kemije 3, določamo s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC). Najprej pripravimo pufer in mobilno fazo ter začnemo uravnoteževati HPLC sistem, nato po opisanem postopku pripravimo raztopine standarda in vzorca ter jih injiciramo v uravnotežen sistem. Sledi analiza rezultatov in izračun vsebnosti. Struktura sulfametoksazola (Mr = 253,28): Nečistota A: Za umerjanje elektrode pH metra in pripravo pufra za mobilno fazo si oglejte videa s praktičnim prikazom na spodnjih povezavah ali uporabite QR kodi. − https://video.arnes.si/watch/vpkyyyc7f75y − https://video.arnes.si/watch/zdvt9dqr5frt b) Priprava pufrske raztopine amonijevega acetata pH 6,9 za mobilno fazo (20 mM NH4AcO, pH 6,9, 500 mL) Za pripravo pufra najprej izračunamo zahtevano maso amonijevega acetata (NH4AcO), asistent preveri pravilnost izračuna, nato NH4AcO prenesemo v 500 mL erlenmajerico in raztopimo v približno 450 mL bidestilirane (MilliQ) vode. pH preverimo z umerjenim pH metrom in po potrebi uravnamo pH pufra z dodatkom 5 % raztopine amonijaka oz. 5 % raztopine ocetne kisline (pH 6,85–6,94). Pufer prenesemo v 500 mL bučko, dopolnimo do oznake z bidestilirano (MilliQ) vodo, dobro premešamo, filtriramo skozi 0,45 μm filter. Približno 150 mL pufra odlijemo v čisto 250 mL erlenmajerico, ker ga potrebujemo za pripravo vzorcev, preostanek prelijemo v steklenico za HPLC in nastavimo ustrezen kanal. - 68 - Tretji sklop krožnih vaj c) Priprava raztopin s sulfametoksazolom in nečistotami − Raztopina standarda: V 25,0 mL bučko natehtamo 25,0 mg standarda sulfametoksazola in dopolnimo do oznake z metanolom R. 5,0 mL tako pripravljene raztopine prenesemo v 50,0 mL merilno bučko in dopolnimo do oznake s pufrsko raztopino amonijevega acetata pH 6,9. Raztopino filtriramo skozi 0,45 μm filter v HPLC vialo. Raztopino označimo z oznako ST. − Raztopina vzorca: V 25,0 mL merilno bučko natehtamo 25,0 mg vzorca sulfametoksazola in dopolnimo do oznake z metanolom R. 5,0 mL tako pripravljene raztopine prenesemo v 50,0 mL merilno bučko in dopolnimo do oznake s pufrsko raztopino amonijevega acetata pH 6,9. Raztopino filtriramo skozi 0,45 μm filter v HPLC vialo in jo označimo z oznako VZ. − Raztopina za preskus ustreznosti kromatografskega sistema: raztopina nečistote A in sulfametoksazola s koncentracijo 0,1 mg/mL je že pripravljena. Označimo jo z oznako SST. − Slepa: v 10,0 mL bučko odmerimo 1,0 mL metanola in dopolnimo do oznake s pufrsko raztopino amonijevega acetata pH 6,9. Raztopino filtriramo skozi 0,45 μm filter v HPLC vialo in jo označimo z oznako SL. d) Izvedba analize − Ločevanje: V uravnotežen kromatografski sistem injiciramo 3 × ST (iz iste viale), 1 × SST, 1 × SL in 1 × VZ. − Zahteva: vsebnost sulfametoksazola: 95,0–105,0 % − Zahteve za vsebnost nečistot: o Nečistota A v vzorcu (VZ) največ 0,1 % površine kromatografskega vrha ( area under curve) signala za sulfametoksazol v vzorcu (VZ). o Vsaka druga nečistota v vzorcu (VZ) največ 0,1 % površine kromatografskega vrha signala za sulfametoksazol v vzorcu (VZ). o Seštevek vseh nečistot v vzorcu (VZ) ne več kot 0,3 % površine kromatografskega vrha signala za sulfametoksazol v vzorcu (VZ). Kromatografski pogoji Mobilna faza 20 mM NH4AcO, MeOH (90:10 V/V) (uporabimo dvokanalen način) Pretok 1 mL/min Kolona dimenzije: 4.6 × 150 mm, stacionarna faza: oktadecilsilil silika gel (C18) za kromatografijo 3,5 μm, temperatura kolone: 40 °C Detekcija spektrofotomettično pri 254 nm za vsebnost in ustreznost kromatografskega sistema ter 210 nm za vsebnost nečistot. Volumen injiciranja 10 μL Čas analize 9 min - 69 - Tretji sklop krožnih vaj − Zahteve za ustreznost kromatografskega sistema: o RSD površine kromatografskega vrha za sulfametoksazol treh zaporednih injiciranj raztopine ST je največ 2 %. o Resolucija med nečistoto A in sulfametoksazolom na kromatogramu posnetem s SST je več kot 3,5. Vprašanji Kaj je izvor nečistote A? Zakaj imamo različni valovni dolžini za določanje vsebnosti in nečistot? Literatura − Evropska farmakopeja 11.2, poglavje 2.2.26 tekočinska kromatografija. − Evropska farmakopeja 11.2, poglavje 2.2.46 kromatografske separacijske tehnike. - 70 - Tretji sklop krožnih vaj Vsebnost sulfametoksazola in nečistot v učinkovini Vzorec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Serija: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Datum proizvodnje: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Proizvajalec: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Ustreznost kromatografskega sistema: parameter zahteva rezultat R T RSD Rezultati analize vsebnosti: Izračun: Zahteva: Vzorec: ustreza ne ustreza Komentar: Analizo opravil: Pregledal: Datum: - 71 - Teoretična vaja 4.8. TEORETIČNA VAJA: Določitev vsebnosti učinkovine v snovi za farmacevtsko uporabo a) Opis vaje Ta vaja je namenjena preverjanju razumevanja postopkov, opisanih v Evropski, Ameriški oziroma Britanski farmakopeji za analizo vsebnosti učinkovine v različnih snoveh za farmacevtsko uporabo. Tako kot v industriji bomo pripravili standardni postopek analize (SOP), ki mora biti razumljiv in natančen, da ga lahko v laboratoriju izvede tudi manj izkušen tehnik. Nasvet: Postopek lahko napišete na podoben način, kot so podana navodila za posamezno vajo. b) Navodila za izdelavo teoretične vaje Vsaki skupini na vajah bo asistent dodelil posamezno učinkovino, ki jo bo treba analizirati po postopku, opisanem v izbrani farmakopeji. Najprej dobro preberite navodila za analizo učinkovine v farmakopeji. Navodila prevedite v jasno slovenščino in po korakih opišite postopek analize vsebnosti vzorca. Če je treba za analizo učinkovine pripraviti volumetrične raztopine, opišite postopek priprave teh raztopin in postopek standardizacije, prav tako poiščite in opišite postopek priprave različnih reagentov, ki jih potrebujete za analizo učinkovine. V postopku jasno definirajte, katero laboratorijsko opremo boste potrebovali. Natančno opišite, na kateri tehtnici boste tehtali vzorce (analitska ali precizna ter zakaj), standarde oziroma reagente in katero steklovino boste potrebovali za pripravo posameznih raztopin (erlenmajerica, merilna bučka, merilni valj, pipeta – merilna ali polnilna). - 72 -