Pregledni prispevek/Review article
DIHALNI TEST S SEČNINO -NJEGOVO MESTO V DIAGNOSTIKI
UREA BREATH TEST - ITS ROLE IN DIAGNOSTICS
Joško Osredkar
Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo, Klinični center, Njegoševa 4, 1525 Ljubljana
Prispelo 2003-07-21, sprejeto 2003-11-04; ZDRAV VESTN 2004; 73: 13-7
Ključne besede: Helicobacter pylori; invazivni in neinva-zivni diagnostični testi; dihalni test s sečnino
Izvleček - Izhodišča. Vsako leto mnogo pacientov obišče svoje osebne zdravnike in navaja prebavne motnje, najpogosteje gre za funkcionalno dispepsijo aligastroezofagealni refluks. Mnogi pacienti imajo dejansko želodčno razjedo ali razjedo v dvanajstniku, ki jo običajno povzroča bakterija Helicobacter pylori (HP) in je ozdravljiva. Ker ozdravitev okužbe običajno pozdravi razjedo in preprečuje ponovni razrast, je bistvenega pomena pravilna diagnoza. Za postavitev diagnoze imamo več možnosti: s serološkimi testi določimo protitelesa proti bakteriji, endoskopska biopsija nam daje material za izvedbo hitrega ureaznega testa, biopt lahko obarvamo s specialnimi barvili, celice lahko kultiviramo. Na žalost so te metode invazivne, drage in vedno ne tudi dovolj natančne. Za serološke teste potrebujemo kri, iz tega rezultata pa lahko izvemo samo to, ali je bil pacient pred časom izpostavljen bakteriji, ne pa, ali je bakterija tudi trenutno prisotna. Endoskopija in biopsija lahko detektirata trenutno okužbo — CLO ure-azni test nam omogoča hitro določitev bakterije HP v bioptu - sta pa to metodi, ki sta invazivni, za pacienta neprijetni. Test, kije široko dostopen in je občutljiv, specifičen in neinva-ziven, je dihalni test s sečnino za detekcijo okužbe s HP. Ko okužena oseba pogoltne odmerek sečnine, ki je označena z izotopom ogljika (13C ali 14C), HP v želodčni mukozi cepi sečnino na amoniak in ogljikov dioksid, ki ima v tem primeru tudi izotop (13C ali 14C). Ogljikov dioksid se absorbira v krvni obtok in se nato izloča z izdihanim zrakom prek pljuč. Pacient izdihne zrak v epruveto oziroma balon, v izdihanem zraku pa izmerimo delež izotopa. Dihalni test s sečnino je specifičen za HP (samo tiste bakterije, ki proizvajajo ureazo) in občutljiv (označena sečnina se porazdeli po celotni površini želodca in tako odraža celotno ureazno aktivnost) ter daje ponovljive rezultate.
Zaključki. Opisani so invazivni in neinvazivni testi za odkrivanje okužbe s Helicobacter pylori. Podrobneje je predstavljen dihalni test s sečnino, ki ima po priporočilih Evropskega združenja gastroenterologov tudi svoje mesto. Dihalni test s sečnino naj bi bil kot pripomoček pri diagnozi v ambulanti splošnega zdravnika.
Key words: Helicobacter pylori; invasive and noninvasive diagnostic tests; urea breath test
Abstract - Background. Each year many patients visit their physicians complaining of digestive symptoms, most commonly functional dyspepsia (»indigestion«) or gastroesophageal reflux (»heartburn«). However, many patients with abdominal discomfort are actually suffering from gastric or duodenal ulcers that are commonly caused by H. pylori and thus are curable. Clearing the infection usually heals the ulcer and prevents relapse, so an accurate diagnosis is important. There are several options for diagnosing H. pylori infection: serology to detect antibodies against the bacterium; endoscopic biopsy for urease testing (H. pylori produce a urease that breaks down urea to ammonia and carbon dioxide); histology with special stains; or culture. Unfortunately, these procedures are invasive, expensive and not always accurate. Serological tests require a blood sample and tell only that a patient has been exposed to H. pylori at some time in the past, but not whether the patient is currently infected. Endoscopy and biopsy can detect current infection — the CLO test urease test allows rapid detection of H. pylori in gastric biopsy specimens — but endoscopy and biopsy are unpleasant medical procedures.
Recently, noninvasive, sensitive, specific, easy to perform and patient's well accepted methods had been developed known as urea breath test (UBT). When an infected person swallows a dose of urea labeled with an isotope of carbon — carbon-13 (13C) or carbon-14 (14C) - H. pylori in the gastric mucosa break down the labeled urea to form ammonia and labeled carbon dioxide. The carbon dioxide is absorbed into the bloodstream and excreted via the lungs. The patient then exhales into a device that measures the level of carbon dioxide. The urea breath test is specific for H. pylori (it detects only urease-producing bacteria), it is sensitive (the labeled urea reaches a large area of the stomach and thus reflects total gastric urease activity) and the results can be reproduced.
Conclusions. Invasive and noninvasive diagnostic tests for H. pylori are described. In a more detailed frame UBT is presented, the test which is recomended in certain instances by European Gastroenterologic Society. The UBT should be available for use in the doctor's office to provide a rapid diagnosis.
Uvod
Bakterija Helicobacter pylori je vpletena v nastanek velikega števila bolezni želodčne sluznice. Odkritje te bakterije in njenega pomena pri želodčnih boleznih je eno najpomembnejših odkritij v gastroenterologiji v zadnjih 20 letih (1). Ker je povzročiteljica kroničnih želodčnih vnetij, razjede na dvanajst-niku in želodcu in tudi sokrivec raka na želodcu, je pomembno, da to bakterijo z zdravljenjem odstranimo. Za spremljanje uspešnosti zdravljenja imamo na voljo več različnih metod, ki so bolj ali manj prijazne do bolnika. Ena od prijaznejših metod je t. i. dihalni test s sečnino.
Mikrobiološke značilnosti bakterije Helicobacter pylori
Bakterija Helicobacter pylori (HP) je gramnegativna, 0,3 x 3 do 5 um velika spiralna bakterija, ki se lahko svedrasto giblje s pomočjo štirih do šestih bičkov (sl. 1).
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Starost / Age
Sl. 2. Odstotek prebivalcev v razvitih državah (spodnja linija) in v deželah v razvoju (zgornja linija), okuženih s H. pylori.
Figure 2. Incidence of Helicobacter pylori infection in developed countries (lower line) and in developing countries (upper line).
Sl. 1. Helicobacter pylori na celicah želodčne sluznice (elektronski mikroskop).
Figure 1. Helicobacter pylori bacteria on gastric mucosa cells (electronic microscope).
Specializirana je za življenje na želodčni sluznici. Bakterija izloča encim ureazo, ki razgrajuje sečnino (ureo) na amoniak in bikarbonat (2).
Epidemiologija okužbe z bakterijo HP
Razširjenost okužbe z bakterijo HP je glede na razvitost držav različna (sl. 2).
Prevalenca okužbe s Helicobacter pylori najbolje korelira s socialno-ekonomskim položajem. V nerazvitem svetu z nizkim standardom (ekonomskim in higienskim) se večina prebivalstva okuži že v otroštvu, medtem ko se v razvitem svetu odstotek okuženosti poviša po 50. letu starosti, prekuženost pa je večja pri revnejšem sloju. Višja prekuženost z bakterijo v razvitem svetu pri starejših prebivalcih je po vsej verjetnosti posledica slabih higienskih navad in slabših ekonomskih razmer (3).
Možne posledice okužbe s HP
Okužba s HP je najpogostejša okužba pri ljudeh, saj je z njo okužena več kot polovica človeštva. Pri približno petini okuženih se pojavijo različne težave oziroma bolezni (sl. 3).
Sl. 3. Možni izidi okužbe z bakterijo H. pylori. Figure 3. Possible outcomes of infections caused by H. pylori.
Kakšne bodo težave, je odvisno od same vrste bakterije (različni sevi), od obrambnih sposobnosti gostitelja, od dejavnikov okolja in tudi od starosti gostitelja v času okužbe.
Diagnostika okužbe s HP
Kot rečeno, se v približno 20% primerov okužbe s HP razvije klinično pomembna bolezen. Za potrjevanje prisotnosti okužbe ob različnih težavah imamo na voljo več postopkov in testov, ki jih delimo v dve skupini:
-	invazivne diagnostične metode in
-	neinvazivne diagnostične metode (razpr. 1).
HP je bakterija, ki proizvaja velike količine ureaze in ta ji omogoča, da preživi v izrazito kisli sredini želodčnega soka. Čeprav je HP bolj odporna proti želodčni kislini kot druge bakterije, pa se ob prihodu v želodec prav tako sreča z agresivnostjo želodčnega soka. Prav zaradi tega je gibljiva, kar ji omogoča, da se umesti v sloj med sluzjo in epitelijem in v tem, manj kislem milijeju tvori velike količine ureaze. Ureaza je prisotna v citoplazmi bakterijske celice z namenom, da oskrbuje celico z amoniakom in dušikom, ki sta nujna grad-
nika aminokislin. Druga naloga ureaze je nevtralizacija želodčne kisline. Ureaza katalizira hidrolizo sečnine na amo-niak in karbamat. Karbamat se naprej spontano hidrolizira z nastankom amoniaka in karbonilne kisline. V reakciji z vodo iz amoniaka nastaja amonijev hidroksid, kar vodi do hitrega porasta pH vrednosti in alkalizacije okolice bakterije. Poleg ureaze ima pomembno vlogo pri regulaciji kislosti tudi ATP-aza P-tip.
Razpr. 1. Diagnostične metode za ugotavljanje okužbe z bakterijo H. pylori.
Table 1. Diagnostic methods for Helicobacter pylori infection.
Invazivne - Hitri bioptični ureazni test (HUT) Invasive	Rapid urease test
-	Faznokontrastni mikroskopski pregled svežega biopta Phase contrast microscopy test
-	Histološka preiskava biopta Histology of gastric biopsy
-	Kultura Culture
-	Reakcija verižne polimeraze (PCR) Gastric biopsy PCR
Neinvazivne - Serološke preiskave (določanje protiteles IgG in IgA) Noninvasive Serology (IgG and IgA antibodies detection)
-	Dihalni test s sečnino (13C ali 14C) Urea breath test (13C or 14C)
-	Dokazovanje HP v blatu Stool culture
Hitri bioptični ureazni test (HUT)
Temelji na sposobnosti razgradnje sečnine (uree) s pomočjo bakterijskega encima ureaze v amonijev ion in bikarbonat:
NH,
NH,
13C = O ^ ► 13C02 + 2 NHa
Med reakcijo pride do spremembe pH, kar zaznamo s pH indikatorjem. Hitrost reakcije je premosorazmerna koncentraciji HP v vzorcu in je lahko v nekaterih primerih zaradi majhnega števila bakterij rezultat tudi lažno negativen. Lažno pozitivne rezultate dobimo zelo redko, ker je HP edina bakterija, ki v tako veliki koncentraciji tvori ureazo. Segrevanje medija z vzorcem lahko pospeši reakcijo, ne vpliva pa na občutljivost in specifičnost. Skoraj vsi »CLO-testi« imajo občutljivost in specifičnost med 90 in 95%.
Zdravnik test opravi takoj ob gastroskopiji na odvzetem koščku želodčne sluznice (biopt). Pozitivni rezultat je potrditev okužbe.
Fazno kontrastni mikroskopski pregled svežega biopta
Bioptični vzorec brez barvanja lahko pregledamo s fazno kontrastnim mikroskopom.
Histološka preiskava biopta
To je metoda z visoko občutljivostjo. Zdravnik pri gastrosko-piji odvzame vzorec na dveh različnih mestih. Te vzorce obarvamo s posebnimi barvili in jih pregledamo pod mikroskopom. Ta preiskava nam da še veliko drugih odgovorov, ne samo to, ali je prisotna okužba s HP.
Kultura
Ob histološki preiskavi in dihalnem testu je kultura ena od treh metod, ki jih imenujemo »zlati standard«. Odvzeti košček sluznice nanesemo na gojišče in v 3-14 dneh dobimo rezultat. Ta test je uporaben za ugotavljanje rezistence (zmanjšanja občutljivosti) bakterije na HP.
Reakcije verižne polimerizacije (PCR)
PCR je zelo občutljiva genetska metoda, ki jo lahko uporabimo tako za določanje bakterijske DNK kot tudi za ugotavljanje rezistence na antibiotike.
Serološke preiskave
Serološke preiskave so za bolnika nekoliko bolj prijazne, saj so prve v skupini neinvazivnih preiskav. Ker okužba s HP povzroči tvorbo protiteles, lahko po določenem času določimo koncentracijo teh protiteles v krvi, želodčnem soku, slini ali blatu. Določitev teh protiteles ni uporabna pri ugotavljanju uspešnosti terapije z antibiotiki.
Dihalni test z uporabo s 13C označene sečnine (uree) (Dihalni test s sečnino - SDT)
Tako kot hitri ureazni test, ki ga zdravnik naredi ob gastroskopiji, tudi dihalni test temelji na isti reakciji. Uporabo principa dihalnega testa sta istočasno predlagala dva avtorja: Graham (4) in Marshall (5). Zelo hitro po prvih objavah je test zaradi enostavnosti, visoke občutljivosti in specifičnosti ter zanesljivosti v diagnostiki primarne okužbe prešel v široko uporabo. Danes, petnajst let po uvedbi v diagnostiko, še vedno ostaja nekaj nejasnosti v zvezi s ponovljivostjo, razvija pa se tehnologija in širijo se indikacije. Princip testa temelji na že predstavljeni reakciji sečnine in ureaze. S testom določamo celokupno encimsko aktivnost. Pri testu damo pacientu določeno količino sečnine, ki ima namesto 12C v molekuli 13C. Ko v želodcu ureaza, ki jo izloča HP, razgradi testno sečnino, se 13C pojavi v bikarbonatnem anionu. Bikarbonatni anion se absorbira v kri in se kot CO2 oziroma 13CO2 izloči v izdihanem zraku. Če izmerimo razmerje 12C/13C pred tem, ko bolniku damo označeno sečnino, in po tem, ko je bolnik popil označeno sečnino, bo to razmerje ob prisotnosti bakterije spremenjeno. Če je povečanje razmerja za več kot 4 %o, je rezultat pozitiven. V zadnjem času se pojavljajo objave, kjer mejno vrednost postavljajo celo na 3 %o oziroma 2,5 %o (6). Izotop 13C je povsem neškodljiv in je primeren tudi za uporabo pri otrocih, nosečnicah in doječih materah. Princip dihalnega testa s sečnino je prikazan na sliki 4.
Sl. 4. Princip dihalnega testa s sečnino. Figure 4. Urea breath testprinciple.
Dokazovanje HP v blatu
V zadnjem času se je pojavil tudi test, pri katerem dokazujemo HP v blatu. Princip določanja je dokazovanje specifičnega antigena, ki se pojavi v blatu po okužbi organizma s HP. S peroksidazo konjugirana poliklonalna anti HP protitelesa so nanesena na mikrotitersko ploščo in reagirajo s HP antigenom v razredčenem vzorcu blata. Pozitivni rezultat je definiran kot tisti, kjer je absorbanca večja ali enaka 0,160.
Občutljivost in specifičnost posameznih testov
Občutljivost in specifičnost testov, ki jih uporabljamo v diagnostiki okužbe s HP, lahko podajamo na dva načina. Prvi je t. i. »zlati standard« - oblikovan glede na rezultate testiranja z invazivnimi metodami (kultivacija, histološki pregled in ure-azni CLO test), drugi način pa je t. i. »empirični pristop«, ki je oblikovan glede na rezultate testiranja z vsemi metodami. Najpopolnejše podatke o uporabljenih testih lahko povzamemo po študiji, ki je bila objavljena leta 2001 v reviji The American Journal of Gastroenterology (7), in so prikazani v razpredelnici 2.
Razpr. 2. Občutljivost, specifičnost in napovedne vrednosti različnih testov za diagnostiko okužbe s H. pylori.
Table 2. Sensivity, specificity and positive predicting values (PPVs) of different tests for diagnosing H. pylori infection.
Metoda Method	Obč./Spec.* Sens./Spec.*	Obč./Spec.** Sens./Spec.**	PPV*/PPV**%	NPV*/NPV**% PPV*/PPV**%
Invazivne metode Invasive methods				
Kultivacija Culture	100/100	93,8/100	100/100	100/94,9
Histološki pregled Histology	95,6/100	93,8/98,2	100/97,8	96,4/94,8
CLO test CLO test	88,6/100	83,0/96,4	100/95,1	91,5/87,1
PCR PCR	93,2/96,2	91,5/96,4	95,3/95,6	94,3/92,9
Neinvazivne metode Noninvasive methods				
Dihalni test s sečnino Urea breath test Serološki test Serology	93,3/98,1 95,6/92,6	93,8/100 95,8/94,6	97,7/100 91,5/93,9	94,6/94,9 96,2/96,4
Helicoblot Helicoblot Test v blatu Stool test	95,6/92,6 88,9/94,4	95,8/94,6 89,6/92,9	91,5/93,9 90,9/93,5	96,2/96,4 90,7/91,2
* - zlati standard / gold standard ** - empirični pristop / empirical approach
Postopek izvedbe dihalnega testa
a)	Odvzem vzorcev za 0. (bazalno) meritev. Pacient 2-krat pihne skozi slamico v zeleni epruveti (bazalno) toliko zraka, da se epruveta orosi. Epruveto takoj zamašimo.
b)	V tem času izpolnimo formular s pacientovimi podatki (oziroma dopolnimo).
c)	Bolnik nato popije testni obrok, ki je sestavljen na bazi citronske kisline. Ker je v testnem kompletu že prisoten testni napitek, nam tega obroka ni treba posebej pripravljati.
d)	Zaužitje 13C sečnine (pet minut po 0. - bazalnem - pihanju). Pacientu damo popiti raztopino sečnine (75 mg sečnine). Ob prvem požirku sprožimo štoparico.
d)	Odvzem naslednjih vzorcev: Naslednji vzorec vzamemo po 30 minutah (v določenih primerih lahko vzamemo tudi več vzorcev, vsakič izvedemo enak postopek).
e)	Epruvete pripravimo za merjenje na aparatu.
Postopek izvedbe dihalnega testa s sečnino je prikazan na sliki 5.
M
im i Aimr-:-+ ■
0 #4 m 0
Sl. 5. Postopek izvedbe dihalnega testa s sečnino. Figure 5. Urea breath test procedure.
Zaključki
Dokazovanje prisotnosti okužbe s Helicobacter pylori je pomembna sestavina pri obravnavi pacientov s peptično razjedo. Prav tako je priporočljivo, da se ugotovi prisotnost bakterije pri pacientih z dispepsijo. Če endoskopija ni indicirana iz ostalih razlogov, so za ugotavljanje prisotnosti okužbe s HP primerni neinvazivni diagnostični postopki. Do nedavnega so bili najbolj uporabljeni testi določanja protiteles v krvi. Zaradi določenih pomanjkljivosti teh testov se danes v večji meri priporočata dva testa, in sicer dihalni test s sečnino in določanje protiteles v blatu. Oba testa sta pokazala dovolj visoko občutljivost in specifičnost, da sta primerna za ugotavljanje prisotnosti okužbe. V državah Evropske unije se po priporočilih »Maastrichta 2« uporabljata oba testa, tako dihalni test s sečnino kot test antigena v blatu.
Kako pristopiti k zdravljenju okužbe s HP, je predmet že dalj časa trajajočih razprav. V zadnjih letih imamo na tem področju dve evropski priporočili, po katerih je treba diagnostiko okužbe s HP pričeti v ambulanti primarne ravni. Izbor diagnostičnih postopkov za odkrivanje okužbe s HP je odvisen od intenzitete simptomov in starosti bolnika. Evropska skupina predlaga različen protokol pri pacientih, starejših od 45 let, kot tudi pri tistih, ki imajo dominantno prisotne simptome gastroezofagealnega refluksa. V skupini pacientov pod 45 let, brez alarmantnih simptomov, lahko diagnostični postopek začne zdravnik na primarni ravni z enim od neinva-zivnih diagnostičnih postopkov (v prvi vrsti je to dihalni test s sečnino ali pa dokazovanje protiteles v blatu). V primeru pozitivnega rezultata se priporoča eradikacijska terapija. To je t. i. pristop »test and treat«. Uspeh terapije prav tako kontroliramo z neinvazivnim testom. V primeru pacientov nad 45 let oziroma ob prisotnosti alarmantnih simptomov se pacient napoti k gastroenterologu. To je t. i. pristop »search and treat« (8).
Literatura
1.	Marshall BJ. History of discovery of C. pylori. In: Blaser MJ ed. Campylobacter pylori in gastritis and peptic ulcer disease. New York: Igaku-Shoin, 1989: 7-24.
2.	Riegg SJ, Dunn BE, Blaser MJ. Microbiology and pathogenesis of Helicobacter pylori. In: Blaser MJ, Smith PD, Ravdin J, Greenber HB, Guerront RL eds. Infection in gastrointestinal tract. New York: Raven Press, 1995; 535-50.
3.	Graham DY, Malaty H, Evans DG, Evans DJ, Klein PD, Adam E. Epidemiology of Helicobacter pylori in an asymptomatic population in the US. Effect of age, race, and socioeconomic status. Gastroenterol 1991; 100: 1495-501.
4.	Graham DY, Klein PD, Evans DJ. Campylobacter pylori detected noninvasi-vely by the 13C-urea breath test. Lancet 1987; 1: 1174-7.
5.	Marshall BJ, Surveyor I. Carbon-14 urea breath test for the diagnosis of Campylobacter pylori associated gastritis. J Nucl Med 1988; 29: 11-6.
6.	Sheu BS, Lee SC, Yang HB. Lower-dose 13C-urea breath test to detect Helicobacter pylori infection - comparison between infrared spectrometer and mass spectrometry analysis. Aliment Pharmacol Ther 2000; 14: 1359-63.
7.	Monteiro L, Mascarel A, Sarrasqueta AM et al. Diagnosis of Helicobacter pylori infection: Noninvasive methods compared to invasive methods and evaluation of two new tests. Am J Gastroenterol 2001; 96: 353-8.
8.	Malfertheiner P, Megraud F, O'Morian C et al. Current concepts in the management of Helicobacter pylori infection - The Maastricht 2-2000 Consensus Report. Aliment Pharmacol Ther 2002; 16: 167-80.