Laški smilj Uredile Dunja Bandelj Zala Jenko Pražnikar Ana Petelin Laški smilj Helichrysum italicum (Roth) G. Don Uredile Dunja Bandelj Zala Jenko Pražnikar Ana Petelin Laški smilj Helichrysum italicum (Roth) G. Don Uredile · Dunja Bandelj, Zala Jenko Pražnikar in Ana Petelin Recenzenta · Andreja ˇ Cerenak in Lovro Žiberna Tehniˇcna ureditev · Tajda Senica Lektor · Davorin Dukiˇc Prelom · Primož Orešnik Izdala in založila · Založba Univerze na Primorskem Titov trg 4, 6000 Koper · www.hippocampus.si Glavna urednica · Simona Kustec Vodja založbe · Alen Ježovnik Koper · 2025 © 2025 Avtorji Brezplaˇcna elektronska izdaja https://www.hippocampus.si/ISBN/978-961-293-525-2.pdf https://www.hippocampus.si/ISBN/978-961-293-526-9/index.html https://doi.org/10.26493/978-961-293-525-2 Izid monografije je finanˇcno podprla Javna agencija za znanstvenoraziskovalno in inovacijsko dejavnost Republike Slovenije iz sredstev državnega proraˇcuna iz naslova razpisa za sofinanciranje znanstvenih monografij Kataložni zapis o publikaciji (CIP) pripravili v Narodni in univerzitetni knjižnici v Ljubljani COBISS.SI-ID 258839811 ISBN 978-961-293-525-2 (PDF) ISBN 978-961-293-526-9 (HTML) Vsebina Predgovor ∙ 9 Dunja Bandelj in Zala Jenko Pražnikar Sklop 1 ∙ 13 Opis rastline, genetski označevalci za identifikacijo ter agronomski vidik s tržno vrednostjo 1 Nomenklatura, zgodovinski zapisi ter opis laškega smilja ∙ 15 Alenka Baruca Arbeiter, Matjaž Hladnik, Petra Gabrovšek in Dunja Bandelj Botanična nomenklatura ∙ 15 Zgodovinski pregled zapisov o laškem smilju ∙ 16 Taksonomska klasifikacija in razširjenost laškega smilja ∙ 19 Morfološke značilnosti podvrste laškega smilja H. italicum subsp. italicum ∙ 23 Viri ∙ 27 2 Genetske in genomske raziskave laškega smilja ∙ 31 Petra Gabrovšek, Alenka Baruca Arbeiter, Matjaž Hladnik in Dunja Bandelj Uvod ∙ 31 Uporabnost mikrosatelitskih označevalcev ∙ 31 Mikrosateliti laškega smilja in njihova uporabnost v genetskih raziskavah ∙ 33 Raziskave laškega smilja z uporabo drugih označevalcev DNA ∙ 38 Zaključek ∙ 42 Viri ∙ 42 3 Pridelava laškega smilja ∙ 47 Dunja Bandelj in Matjaž Hladnik Agroekološke zahteve laškega smilja ∙ 47 Razmnoževanje in priprava sadilnega materiala ∙ 55 Načini razmnoževanja laškega smilja ∙ 58 Priprava in oskrba nasada laškega smilja ∙ 61 Varstvo laškega smilja ∙ 65 Viri ∙ 71 4 Tržni potencial laškega smilja ∙ 77 Alenka Baruca Arbeiter in Dunja Bandelj Viri ∙ 80 Bandelj, D., Z. Jenko Pražnikar in A. Petelin, ur. 2025. 5 Laški smilj. Založba Univerze na Primorskem Vsebina 5 Laški smilj v prehrani ∙ 83 Nina Mohorko Uvod ∙ 83 Dinamika spreminjanja znanja o divjih rastlinah in njihovi uporabi v kulinariki ∙ 84 Uporaba laškega smilja v kulinariki ∙ 85 Prehranska vrednost laškega smilja ∙ 86 Vpliv načina priprave hrane na prisotnost bioaktivnih snovi v njej ∙ 89 Grenka hrana kot zdravilo ∙ 89 Zaključek ∙ 91 Viri ∙ 91 Sklop 2 ∙ 97 Tehnološki postopki in bioaktivne spojine laškega smilja 6 Spravilo in predelava laškega smilja ∙ 99 Dunja Bandelj, Alenka Baruca Arbeiter, Matjaž Hladnik in Katja Kramberger Žetev laškega smilja in pridelki ∙ 99 Pridobivanje eteričnega olja in hidrolata ∙ 104 Shranjevanje eteričnega olja in hidrolata ∙ 106 Viri ∙ 107 7 Tehnološki postopki pridobivanja pripravkov iz laškega smilja ∙ 111 Katja Kramberger Uvod ∙ 111 Ekstrakcija ∙ 111 Faktorji, ki vplivajo na učinkovitost ekstrakcije ∙ 112 Ekstrakcijske metode ∙ 114 Separacijske metode ∙ 118 Identifikacija bioaktivnih spojin ∙ 122 Viri ∙ 124 8 Bioaktivne spojine vodnih in organskih izvlečkov laškega smilja ∙ 127 Katja Kramberger Uvod ∙ 127 Kemijska klasifikacija fenolnih spojin ∙ 129 Fenolne in druge spojine v izvlečkih laškega smilja ∙ 131 Viri ∙ 136 6 Vsebina 9 Bioaktivne spojine hidrolata in eteričnega olja laškega smilja ∙ 141 Dunja Bandelj, Katja Kramberger, Matjaž Hladnik Bioaktivne spojine v eteričnem olju laškega smilja ∙ 141 Dejavniki, ki vplivajo na biokemijsko sestavo in kakovost eteričnega olja ∙ 150 Bioaktivne spojine v hidrolatu laškega smilja ∙ 154 Viri ∙ 156 Sklop 3 ∙ 161 Biološki učinki laškega smilja 10 Biološka dostopnost in uporabnost zaužitih fenolnih spojin v laškem smilju ∙ 163 Zala Jenko Pražnikar in Ana Petelin Uvod ∙ 163 Interakcije med fenolnimi spojinami in molekulami v lumnu črevesnega trakta ∙ 164 Interakcije med fenolnimi spojinami, prebavnimi encimi črevesnega trakta in prenašalnimi molekulami ∙ 166 Mehanizmi transporta fenolnih spojin v ali iz enterocitov ∙ 167 Presnova fenolnih spojin ∙ 169 Porazdelitev in izločanje fenolnih spojin ∙ 170 Farmakokinetika fenolnih spojin, zaznanih v vodnih izvlečkih laškega smilja ∙ 170 Zaključek ∙ 172 Viri ∙ 173 11 Antioksidativno in protivnetno delovanje laškega smilja ∙ 181 Saša Kenig in Zala Jenko Pražnikar Uvod ∙ 181 Določanje antioksidativnega potenciala ∙ 182 Antioksidativno delovanje laškega smilja – dokazi raziskav in vitro ∙ 183 Antioksidativno delovanje laškega smilja – dokazi raziskav na celičnih in živalskih modelih ∙ 184 Antioksidativno delovanje – klinične raziskave ∙ 186 Protivnetno delovanje ∙ 186 Določanje provnetnih in protivnetnih biooznačevalcev ∙ 188 Protivnetno delovanje laškega smilja – dokazi raziskav in vitro ∙ 189 Protivnetno delovanje laškega smilja – dokazi raziskav in vivo ∙ 191 Protivnetno delovanje laškega smilja – klinične raziskave ∙ 191 Zaključek ∙ 192 Viri ∙ 193 7 Vsebina 12 Interakcije laškega smilja z mikroorganizmi ∙ 199 Katja Kranjc in Karin Šik Novak Uvod ∙ 199 Protimikrobni učinek pripravkov iz laškega smilja ∙ 200 Učinki čaja iz smilja na črevesno mikrobno združbo ∙ 202 Učinki na raznolikost črevesne mikrobne združbe ∙ 206 Učinki na črevesno mikrobno združbo na ravni debel ∙ 206 Učinki na črevesno mikrobno združbo na ravni rodov ∙ 207 Zaključek ∙ 208 Viri ∙ 209 13 Učinki laškega smilja na presnovo ∙ 215 Zala Jenko Pražnikar in Ana Petelin Uvod ∙ 215 Učinki laškega smilja na presnovo v mirovanju ∙ 216 Učinki laškega smilja na antropometrične parametre in na krvni tlak ∙ 217 Učinki laškega smilja na presnovo glukoze oz. na glukostazo ∙ 219 Učinki laškega smilja na lipidni profil ∙ 220 Hepatoprotektivni učinki laškega smilja ∙ 221 Zaključek ∙ 222 Viri ∙ 222 14 Uporaba laškega smilja v dermatologiji ∙ 227 Saša Kenig Celjenje rane ∙ 228 Raziskave in vitro ∙ 229 Raziskave in vivo ∙ 230 Drugi ugodni učinki na kožo ∙ 231 Viri ∙ 235 Recenziji ∙ 239 8 Predgovor Dunja Bandelj Zala Jenko Pražnikar Fakulteta za matematiko, naravo- Fakulteta za vede o zdravju, slovje in informacijske tehnologije, Univerza na Primorskem Univerza na Primorskem © 2025 Dunja Bandelj in Zala Jenko Pražnikar https://doi.org/10.26493/978-961-293-525-2.0 Laški smilj (Helichrysum italicum (Roth) G. Don), nativna rastlina Sredo- zemlja, je bogat vir številnih fitokemijskih spojin z različnimi biološkimi lastnostmi. Pripisujejo mu protimikrobno, protivnetno, antioksidativno, protivirusno, protitumorsko, protilarvicidno in repelentno aktivnost. Tradicionalno se je uporabljal za zdravljenje respiratornih, prebavnih in kožnih vnetnih obolenj. Druge terapevtske aplikacije vključujejo upo- rabo pri celjenju ran kot protimikrobno sredstvo, za zdravljenje motenj delovanja žolča in mehurja ter kot analgetično sredstvo. Dragocene bio- loške lastnosti rastlinskih izvlečkov in odlična adaptacija rastline na eks- tremno sušo ter ostre okoljske pogoje prispevajo k povečanemu zanima- nju za gojenje rastline v kmetijstvu, kar prispeva k varovanju naravnih populacij ter omogoča stabilno pridelavo in s tem povečuje možnosti za njeno vključitev v kozmetične ter prehranske izdelke z dodano vrednost- jo. Gojenje smilja postaja gospodarsko zelo pomembna panoga. Ideja, da na Univerzi na Primorskem (UP) začnemo z raziskovanjem laš- kega smilja, se je rodila spontano med pogovorom raziskovalk UP Dunje Bandelj in Zale Jenko Pražnikar med preživljanjem počitnic z družinama na Korziki, ki predstavlja pravo bogato zakladnico raznolikosti te drago- cene zdravilne rastline. Okrog leta 2015 smo snovali nove raziskovalne zgodbe naše skupne programske skupine Varstvena biologija od molekul do ekosistema, s katero smo želeli povezati raziskave Fakultete za ma- tematiko, naravoslovje in informacijske tehnologije in Fakultete za vede o zdravju. Entuziazem, navdušenost nad rastlino in raziskovalna rado- vednost so botrovale snovanju raziskav, za katere je bilo že na začetku jasno, da morajo biti aplikativno naravnane, da bomo na koncu znali pojasniti, kakšen učinek ima uporaba laškega smilja na zdravje človeka. Po začetnem pregledu dokumentiranih strokovnih in znanstvenih ob- jav je bilo razvidno, da o genetiki – na ravni molekule DNA – te rastline Bandelj, D., Z. Jenko Pražnikar in A. Petelin, ur. 2025. 9 Laški smilj. Založba Univerze na Primorskem Dunja Bandelj in Zala Jenko Pražnikar ni razpoložljivih informacij, da je večina raziskav osredotočena le na kemijske analize eteričnega olja in da je objavljenih le nekaj raziskav in vitro ter raziskav na živalskih modelih o učinkovanju laškega smilja na vnetne procese in/ali oksidativni stres. Po pregledu naravnih rastišč laš- kega smilja, ki so bila evidentirana sredi 20. stoletja v Sloveniji, pa smo ugotovili, da smo to vrsto v Sloveniji izgubili, najverjetneje zaradi zaraš- čanja in spremenjene rabe zemljišč. Tako je bilo že na samem začetku pomembno, da se raziskave zastavi celostno in preuči genetske, biolo- ške, biokemijske ter fiziološke lastnosti rastline, značilnosti pridelave in predelave, pridobivanje rastlinskih izvlečkov s kemijsko karakterizacijo in z uporabo rastlinskih izvlečkov za zdravstvene namene, da bi lahko znanstveno podprli tradicionalno rabo laškega smilja in raziskali more- bitne nove mehanizme delovanja. Raziskovalno delo je tako plod tesnega sodelovanja raziskovalcev različnih strokovnih profilov; agronomov, ge- netikov, kemikov, biokemikov, mikrobiologov, dietetikov in farmacevtov, zaposlenih na Fakulteti za matematiko, naravoslovje in informacijske tehnologije in Fakulteti za vede o zdravju UP. Povezali smo se tudi z lo- kalnimi pridelovalci, pri čemer je treba posebej poudariti sodelovanje z največjo pridelovalko mag. Jano Bergant, ki nam nesebično predaja dra- gocene izkušnje. Na UP se tako lahko pohvalimo, da smo kot prva raz- iskovalno-izobraževalna institucija v Sloveniji začeli s sistematičnim in celostnim raziskovanjem laškega smilja. Na začetku raziskovalne poti laškega smilja smo z inventarizacijo doma- čih vrtov na Obali pridobili rastlinski material, ki smo ga razmnožili in vzpostavili začasni kolekcijski nasad na Purissimi (Spodnje Škofije), ki je bil namenjen vzdrževanju matičnih rastlin za razmnoževanje. V letu 2020 smo v skladu s standardi in protokoli za vzdrževanje genske banke na polju vzpostavili večji nasad v Ospu, kjer hranimo prek 150 različnih genotipov, ki so v fazi preizkušanja in selekcije z namenom, da identifici- ramo najprimernejše za gojenje v slovenskih pridelovalnih okoliščinah. Kolekcija UP predstavlja največjo zbirko raznolikih genotipov smilja v se- vernem Jadranu oz. v Sloveniji. Poleg tega nam kolekcijski nasad služi kot vir rastlinskega materiala za kemijsko karakterizacijo in vrednotenje bio- loških učinkov laškega smilja in vitro ter in vivo. V programski skupini na UP smo pridobili tudi prve sekvence genoma H. italicum subsp. italicum, iz katerih smo razvili visoko informativne označevalce DNA, ki so upo- rabno orodje za genetsko profiliranje laškega smilja in njegovih sorodnih vrst. To delo je izredno pomembno in omogoča zanesljivo identifikacijo in geografsko sledljivost vrst ter podvrst rodu Helichrysum. 10 Predgovor Od leta 2017 naprej smo raziskovalci Fakultete za matematiko, naravo- slovje in informacijske tehnologije ter Fakultete za vede o zdravju izvedli številne raziskave, ki so podrobneje opisane v pričujoči znanstveni mo- nografiji. Rezultati raziskovalnega dela so nastajali v okviru dveh razisko- valnih programov, in sicer v okviru stabilno financiranega raziskovalnega programa ARIS Varstvena biologija od molekul do ekosistema (P1-0386) in internega raziskovalnega programa UP Funkcionalna hrana, dveh bilateralnih projektov, Slovenija–Francija: Genetska in kemijska razno- likost slovenskega in korziškega smilja SloCorim (BI-FR/23-24-PRO- TEUS-003) in Slovenija–Srbija: Trajnostna hrana za zdravo prihodnost (BI-RS/23-25-039), podoktorskega projekta Potencial jadranskega smilja (Helichrysum italicum (Roth) G. Don): celovito profiliranje genoma in transkriptoma za odkrivaje genov v biosintezi rastlinskih naravnih pro- duktov (Z4-1875), aplikativnega projekta Proizvodnja, izolacija in formu- lacija zdravju koristnih substanc iz Helichrysum italicum za uporabo v kozmetični industriji (L2-4430), ciljno-raziskovalnega projekta Možnosti razvoja zeliščarstva v Sloveniji (V4-2207), projekta LAS Vzpostavitev raz- vojnega in učnega centra Slovenske Istre – VRT PURISSIMA ter študent- skega projekta Karakterizacija smilja in proučevanje učinkov produktov smilja na oksidativni stres in vnetje. Izpostaviti velja tudi številne diplomske, magistrske in doktorsko nalo- go, dela, ki so nastala na podlagi naših raziskav o laškem smilju. Poleg omenjenega smo v zadnjih petih letih objavili več kot deset znanstvenih člankov na temo laškega smilja in znanstveni skupnosti prispevali šte- vilna nova spoznanja o njem. Da bi rastlino spoznala širša publika, smo se odločili za predstavitev pionirskega dela na njej z izdajo znanstvene monografije, ki vsebuje celosten pregled podatkov o rastlini in najnovej- ša znanstvena dognanja. Hkrati bo delo predstavljalo dragoceno gradi- vo za študente Fakultete za matematiko, naravoslovje in informacijske tehnologije (programov Agronomija in Varstvena biologija na 1. stopnji ter Varstvo narave na 2. stopnji), Fakultete za vede o zdravju (programa Prehransko svetovanje – dietetika na 1. stopnji ter Dietetika in klinična prehrana na 2. stopnji) ter za številne druge študente preostalih sloven- skih univerz in nasploh za vse, ki se ukvarjajo s preučevanjem ali pa z gojenjem laškega smilja. 11 Sklop 1 Opis rastline, genetski označevalci za identifikacijo ter agronomski vidik s tržno vrednostjo 1 Nomenklatura, zgodovinski zapisi ter opis laškega smilja ∙ 15 Alenka Baruca Arbeiter, Matjaž Hladnik, Petra Gabrovšek in Dunja Bandelj 2 Genetske in genomske raziskave laškega smilja ∙ 31 Petra Gabrovšek, Alenka Baruca Arbeiter, Matjaž Hladnik in Dunja Bandelj 3 Pridelava laškega smilja ∙ 47 Dunja Bandelj in Matjaž Hladnik 4 Tržni potencial laškega smilja ∙ 77 Alenka Baruca Arbeiter in Dunja Bandelj 5 Laški smilj v prehrani ∙ 83 Nina Mohorko 13 1 Nomenklatura, zgodovinski zapisi ter opis laškega smilja Alenka Baruca Arbeiter Petra Gabrovšek Fakulteta za matematiko, naravo- Fakulteta za matematiko, naravo- slovje in informacijske tehnologije, slovje in informacijske tehnologije, Univerza na Primorskem Univerza na Primorskem Matjaž Hladnik Dunja Bandelj Fakulteta za matematiko, naravo- Fakulteta za matematiko, naravo- slovje in informacijske tehnologije, slovje in informacijske tehnologije, Univerza na Primorskem Univerza na Primorskem © 2025 Alenka Baruca Arbeiter, Matjaž Hladnik, Petra Gabrovšek in Dunja Bandelj https://doi.org/10.26493/978-961-293-525-2.1 Botanična nomenklatura Slovensko ime: laški smilj (Martinčič idr. 2007) Sinonimi: suhocvetnica, nesmrtnica (angl. everlasting, it. perpetuino in semprevivo, fr. immortelle), »kari rastlina« (angl. curry plant) (Appendino idr. 2015) Slovenska ljudska poimenovanja: božja strešca, božja strešica, laška ka-milica, madronšica, molčevje, molec, molova roža, neven, smilje, zmin (Petauer 1993) Latinsko ime: Helichrysum italicum (Roth) G. Don, Hort. Brit. (Loudon) 342 (1830) Sinonimi: Gnaphalium italicum Roth, Bot. Mag. (Romer in Usteri) 4 (10): 19 (1790) H. italicum (Roth) Guss., Fl. Sicul. Syn. 2:469 (1844), comb. superfl. Heli- chrysum angustifolium subsp. italicum (Roth) Briq. in Cavill. (Burnat) Fl. Alpes Marit. 6 (2): 265 (1917) (Herrando-Moraira idr. 2016) Bandelj, D., Z. Jenko Pražnikar in A. Petelin, ur. 2025. 15 Laški smilj. Založba Univerze na Primorskem Alenka Baruca Arbeiter idr. Zgodovinski pregled zapisov o laškem smilju Laški smilj (Helichrysum italicum (Roth) G. Don) (v nadaljevanju H. itali- cum) je ena najznamenitejših in ikoničnih rastlin Sredozemlja (Appendi- no idr. 2015), ki so ji že v antičnih evropskih knjigah o zeliščih posvečeni posamezni deli. Najstarejši zapisi o uporabi rastlinskih vrst iz rodu He- lichrysum v zdravilne namene so iz obdobja med 3. in 2. stoletjem pred našim štetjem. Teofrast (okoli 371–287 pr. n. št.), starogrški filozof in ute- meljitelj botanike, je v knjigi Opisi rastlin (Historia Plantarum), ki velja za eno najpomembnejših knjig naravoslovja iz časa antike, zapisal, da se vrste »Heleiochrysos« lahko uporablja pri zdravljenju opeklin in pri pikih ali ugrizih strupenih živali. Zapisal je tudi recept za Helichrysum z medom za zdravljenje opeklin in ran (Scarborough 1978). Leta 77 je gr- ški zdravnik Dioskorid (1. stol. n. št.) objavil ilustrirano knjigo o zeliščih De Materia Medica, v kateri je zbral okoli 600 rastlin Sredozemlja, in za Helichrysum navedel, da ima poparek cvetov, maceriranih v vinu, diure- tične lastnosti in je primeren za zdravljenje motenj uriniranja. Pisal je tudi o njegovi uporabnosti pri kačjih ugrizih ter zdravljenju išiasa in her- nije (Quer 1993). Kot navajata Ana Ličina in Vesna Ročak Kralj (2016), je Campanini leta 2009 v svojem delu zapisal, da je rimski pisec in učenjak Plinij Starejši, med drugim izjemen poznavalec antične botanike in far- macije, v svojem delu Naravoslovje (Naturalis historia), ki zajema večino takratnega naravoslovnega znanja, svetoval uporabo vrst Helichrysum pri bolečinah v hrbtu in kolkih (Ličina in Ročak Kralj 2016). Zapisal je tudi, da je rastlina zaradi svojevrstnega vonja primerna za zaščito oblačil pred molji. Appendino idr. (2015) pa navajajo, da je tudi Plinij Starejši v svo- jem znamenitem delu Naravoslovje (Naturalis Historia) iz leta 21 n. št. zapisal, da se je Helichrysum uporabljalo predvsem kot lokalni antisep- tik, za preprečevanje nastanka brazgotin, zdravljenje sklepov in zaščito jeter ter zdravljenje okužb dihalnih poti. Sledijo zapisi iz obdobja renesanse, ki velja za zibelko sodobne medi- cine in znanosti (Pušnik 1991). Škotski botanik Robert Morison (1715), pionir sodobne sistematske botanike, ki je začel klasificirati rastline na podlagi morfoloških značilnosti, je v knjigi Plantarum historiae univer- salis Oxoniensis seu herbarum distributio nova, per tabulas cognationis et affinitatis ex libro Naturae observata et detecata vrsto poimenoval Helichrysum chrysocome angustifolia vulgaris. Nizozemski botanik Her- manni Boerhaave je v knjigi Historia plantarum quae in Horto Academi- co Lugduni-Batavorum crescunt: cum earum characteribus, & medicina- libus virtutibus (Boerhaave 1727) pisal o zdravilnih lastnostih vrst iz rodu 16 Nomenklatura, zgodovinski zapisi ter opis laškega smilja Helichrysum in o njihovi uporabi pri zdravljenju živčne napetosti ter his- terije (Scott in Hewett 2008). Ker se je v času renesanse za zdravljenje uporab ljalo predvsem zdravila na bazi rastlin, so bile prve medicinske tiskane knjige knjige o zeliščih (Pušnik 1991). V njih so se pogosto skli- cevali na starogrške in rimske avtorje ter uporabljali podobne recepture. Iz tega obdobja je tudi priznani italijanski zdravnik in botanik Casto- re Durante (1529–1590), ki je v svojem obsežnem delu Novo zeliščar- stvo (Herbario Nuovo) opisal več kot 900 rastlin in njihovo uporabo za zdravljenje različnih bolezni, med drugim tudi Helichrysum. Zanj je zapi- sal recepturo za pripravo zdravilnega vina s socvetji za zdravljenje jetrnih obolenj ter priporočil pripravo poparka rastline za lajšanje težav s katar- jem. Vsem zapisom je skupno, da avtorji načeloma niso navajali točnega imena vrste, ki so ji pripisovali zdravilne lastnosti, temveč le ime rodu Helichrysum sp. (Appendino idr. 2015). Helichrysum se je uporabljalo tudi pri duhovnih obredih in ritualih. Naj- verjetneje gre za dolgo tradicijo, saj ga je že Teofrast uvrstil med rastline, ki spreminjajo um, zato so ga uporabljali pri obrednem zadimljanju. Stari Rimljani so z njim krasili grobnice, ker cvetovi nikoli ne ovenijo in tako simbolizirajo večnost ter spomin (Appendino idr. 2015). Na hrvaš kih oto- kih so s posušenim laškim smiljem polnili vzglavnike, da bi imeli v mrzlih in vetrovnih zimah globlji spanec. Prav tako je bil med najpogosteje upo- rabljenimi rastlinami v venčkih, suhih šopkih ter aranžmajih pri različnih Slika 1 Aranžmaji laškega smilja v hiši umetnika Salvadorja Dalíja v Španiji (mesto Figueres v Kataloniji) (foto: D. Petrič) 17 Alenka Baruca Arbeiter idr. Preglednica 1 Pregled etnofarmakoloških študij, vključujoč laški smilj, v raz- ličnih predelih Evrope (prirejeno po Antunes Viegas idr. 2014) Območje Indikacija Del rastline in priprava Granada, Španija Zobobol Poparek cvetov (za spiranje ust) Castellón, Španija Prebavne motnje Poparek cvetov Sardinija, Italija Alergije Poparek celotne rastline Cordoba, Španija Čiščenje želodca Prevretek Toskana, Italija Prehlad, kašelj, traheitis in Poparek in hlapi listov ter laringitis cvetnih vršičkov Lucca, Italija Prehlad Poparek in hlapi nadzemnih delov Sardinija, Italija Alopecija Prevretek celotne rastline Jaén, Španija Prebavne motnje in katar - Alicante, Španija Zobobol, okužbe v ustih Poparek cvetov (za spiranje ust) Katalonija, Španija Prebavne motnje Poparek cvetov Bosna in Težave z jetri in žolčem, Poparek cvetov Hercegovina kašelj Kalabrija, Italija Bronhitis in faringitis Poparek ali uprašena cvetoča zel z medom Algarvio, Dermatološke težave Eterično olje nadzemnih delov Portugalska Kampanija, Italija Kašelj Poparek ali prevretek cvetov La Coruña, Španija Vnetje kože Poparek cvetov (za zunanjo uporabo) Valencija, Španija Okužbe črevesja s paraziti - Murcia, Španija Celjenje ran Prah cvetov, stebel in listov Ligurija, Italija Nespečnost, glavobol, Poparek cvetov kihanje in kašelj Vnetje dihal in kašelj Prevretek cvetov in listov Bolečine v želodcu Sok mladih listov in vršičkov Okužbe s helminti Prevretek cvetov Zahodna Grenada, Prebavne motnje, bolečine Poparek cvetov Španija v želodcu Kašelj, bolezni ust, jetrne Poparek cvetoče zeli bolezni, herpes Portugalska Dermatomikoza Eterično olje nadzemnih delov Kampanija, Italija Astma Prevretek cvetoče zeli verskih praznikih in še danes starejši prebivalci na hrvaških otokih z njim krasijo svetišča ter cerkve (Ličina in Ročak Kralj 2016; Łuczaj idr. 2024). Posušeno cvetje laškega smilja se uporablja tudi za okraševanje domov (slika 1). 18 Nomenklatura, zgodovinski zapisi ter opis laškega smilja Na prehodu iz 20. v 21. stoletje je bilo opravljenih precej etnofarmako- loških raziskav laškega smilja (H. italicum). Največ podatkov o njegovi tradicionalni rabi izhaja iz italijanskih pokrajin in z otoka Sardinije, ki ležijo ob Tirenskem morju, ter iz Španije pa tudi iz Portugalske ter Bosne in Hercegovine. Tradicionalno se je laški smilj uporabljalo za zdravljen- je respiratornih, prebavnih težav ter kožnih vnetnih obolenj, kot proti- mikrobno sredstvo in za celjenje ran, za zdravljenje motenj delovanja žolča in mehurja ter kot analgetično sredstvo. Za zdravilne pripravke se je uporabljalo le socvetja ali vse zelnate dele rastline (listi, steblo, socve- tje). Med načini priprave, s katerimi so iz rastline ekstrahirali zdravilne učinkovine, so prevladovali poparki in prevretki (Antunes Viegas idr. 2014; Appendino idr. 2015). Pregled etnoframakoloških zapisov o laškem smilju je zbran v preglednici 1. Za očeta sodobnih znanstvenih raziskav laškega smilj velja Leonardo Santini (1904–1983), ki je med letoma 1940 in 1950 izvedel klinične raziskave pri bolnikih z bronhitisom in astmo. Svoje ugotovitve je objavil v manj uglednih revijah, zato so bile po njegovi smrti dolgo časa prezrte. Poglobljene raziskave laškega smilja in znan- stvene objave se začno številčneje pojavljati šele po 90. letih prejšnjega stoletja (Appendino idr. 2015). Taksonomska klasifikacija in razširjenost laškega smilja Laški smilj (H. italicum (Roth) G. Don) spada v družino Asteraceae (nebi- novke), poddružino Asteroideae, pleme Gnaphalieae in rod Helichrysum Mill. (smilj) (preglednica 2). Rod vključuje približno 600 vrst, ki so raz- širjene v Afriki, na Madagaskarju, v Makroneziji, srednji Aziji, Indiji in na območju sredozemskega bazena (Anderberg 1991), kjer uspeva okoli Preglednica 2 Taksonomska klasifikacija vrste H. italicum (Roth) G. Don (laški smilj) (Martinčič idr. 2007) Vrsta H. italicum (Roth) G. Don (laški smilj) Rod Helichrysum Mill. (smilj) Pleme Gnaphalieae Poddružina Asteroideae Družina Asteraceae (nebinovke) Red Asterales (košarnice) Podrazred Asteridae Razred Magnoliopsida (dvokaličnice) Poddeblo Magnoliophytina (kritosemenke) Deblo Spermatophyta (semenke) Kraljestvo Plantae 19 Alenka Baruca Arbeiter idr. 25 avtohtonih vrst rodu Helichrysum (Morone-Fortunato idr. 2010). Ime rodu izvira iz grških besed helios (sonce) in chrysos (zlato), kar je poveza- no z značilno zlatorumeno barvo cvetov smilja (Perrini idr. 2009). V publikaciji Flora Europea (Tutin idr. 1976) so sredozemske, evropske, zahodnoazijske in srednjeazijske vrste rodu Helichrysum razvrščene v tri sekcije: (1) Helichrysum sect. Helichrysum, (2) Helichrysum sect. Virginea (DC) Fiori in (3) Helichrysum sect. Xerochlaena (DC.) Bentham. Nato so Mercè Galbany-Casals idr. (2006) predlagali dodatno delitev sekcije Heli- chrysum v sekciji Helichrysum sect. Helichrysum in Helichrysum sect. Stoe- chadina. V sekcijo Stoechadina (DC.) Gren. & Godr. sodi osem sredozem- skih vrst, med drugim tudi kompleks H. italicum, ki vključuje več podvrst. Po trenutni taksonomski klasifikaciji, ki temelji na obsežni multivariatni analizi morfoloških značilnosti, genetski strukturi ter geografski razširje- nosti, se ta kompleks deli v štiri podvrste (Herrando-Moraira idr. 2016): 1. H. italicum subsp. italicum – najbolj zastopana podvrsta v Sredozem- lju in je razširjena v Italiji in na Hrvaškem, na vzhodni sredozemski obali Francije in Korzike, v Bosni in Hercegovini ter delih Grčije (Egejski otoki in Ciper). 2. H. italicum subsp. microphyllum – podvrsta je endemična na Kreti. 3. H. italicum subsp. siculum – podvrsta je endemična na Siciliji. 4. H. italicum subsp. tyrrhenicum – podvrsta je razširjena na jugu Kor- zike, na Sardiniji, na obali Majorke in na otoku Dragonera. Za določanje podvrst laškega smilja so potrebni podatki o višini rastli- ne, o listih na generativnih in vegetativnih poganjkih (dolžina, valovitost listnega roba, obarvanost, prisotnost nežleznih in žleznih trihomov na zgornji ter spodnji listni povrhnjici) ter pakobulastem socvetju (širina, število koškov) (preglednica 3). Za podvrste kompleksa H. italicum je značilna izjemna raznolikost feno- tipov (fenotip = morfološke in biokemijske lastnosti), ki nastane zaradi interakcije genotipa (genotip = zapis v molekuli DNA) in okolja. Poleg tega je med vrstami in podvrstami možno spontano križanje, zato genet- ske in morfološke razlike med njimi niso vedno povsem jasne. Razlikova- nje podvrst je zato še posebej zahtevno na območjih, kjer dve podvrsti ali vrsti uspevata v neposredni bližini. Tak primer je na južnem delu Korzi- ke, kjer sobivata podvrsti italicum in tyrrhenicum, v vzhodnem delu Sre- dozemlja, kjer se podvrsta italicum po morfoloških značilnostih približu- je podvrsti microphyllum (Galbany-Casals idr. 2006; Galbany-Casals idr. 2011; Galbany-Casals idr. 2012; Baruca Arbeiter idr. 2021), ter v Toskani 20 Nomenklatura, zgodovinski zapisi ter opis laškega smilja Preglednica 3 Ključ za določanje podvrst H. italicum – laškega smilja 1. Bazalni in pravi listi so izrazito Bazalni in pravi listi so enobarvni dvobarvni, na zgornji listni povrhnjici ali skoraj enobarvni, na zgornji listni skoraj goli – redki nežlezni trihomi – povrhnjici pajčevinasto do gosto in na spodnji listni povrhnjici gosto porasli z nežleznimi trihomi, na porasli z nežleznimi trihomi. spodnji listni povrhnjici pa gosto 2 porasli z nežleznimi trihomi. 4 2. Rastlina visoka do 70 cm, z nekaj Rastlina visoka do 40 cm, s številnimi zalistnimi listnimi snopi – izjemoma zalistnimi listnimi snopi. Bazalni in brez njih. Bazalni in pravi listi na pravi listi na cvetnih in vegetativnih cvetnih in vegetativnih poganjkih poganjkih so dolgi 3–18,5 (21) mm. so dolgi (8) 12–37 mm. Pakobulasto Pakobulasto socvetje širine 6–23 (35) socvetje širine 10–35 (62) x (15) 18–55 x 8,5–27 (37) mm, s 3–36 (42) koški. (80) mm, z (8) 15–94 (120) koški. H. italicum subsp. italicum 3 3. Bazalni in pravi listi na cvetnih in Bazalni in pravi listi na cvetnih ter vegetativnih poganjkih so dolgi vegetativnih poganjkih so dolgi 3–10 (7) 10–18,5 (21) mm, z nevalovitim (14,3) mm, z običajno valovitim listnim robom. listnim robom. H. italicum subsp. siculum H. italicum subsp. microphyllum 4. Rastlina visoka do 40 cm, s številnimi Rastlina visoka do 70 cm, z nekaj zalistnimi listnimi snopi. Bazalni in zalistnimi listnimi snopi, izjemoma pravi listi na cvetnih in vegetativnih brez njih. Bazalni in pravi listi na poganjkih so dolgi 3,7–20 (29) mm. cvetnih ter vegetativnih poganjkih Pakolubasto socvetje širine (9,3) so dolgi 8 (12)–37 mm. Pakolubasto 14–37 (51,5) mm, s 5–37 (64) koški. socvetje širine (15) 18–55 (80) mm, z 8 (15)–94 (120) koški. H. italicum subsp. tyrrhenicum H. italicum subsp. italicum Opomba Določevalni ključ je povzet po Sonii Herrando-Moraira idr. (2016). (Italija), kjer so bili odkriti potencialni hibridi vrst H. italicum in H. lito- reum (Marini idr. 2023). K pretoku genov znotraj posamezne podvrste in med podvrstami pomembno prispeva tudi način opraševanja, saj je H. italicum žužkocvetna ali entomofilna in vetrocvetna ali anemofilna vrsta (Galbany-Casals idr. 2011). Z žuželkami se pelodna zrna običajno pre- našajo na krajše razdalje, medtem ko veter zlahka prenaša pelod na bi- stveno daljše razdalje. Poleg različnih načinov prenašanja peloda imajo pomembno vlogo tudi zračni tokovi, ki raznašajo lahka semena na daljše razdalje in prispevajo k razširjenosti vrste ter posledično k izjemni genet- ski in morfološki raznolikosti (Hladnik idr. 2024). V Sredozemlju je najbolj razširjena podvrsta H. italicum subsp. italicum, značilna za Francijo (še posebej Korziko), Italijo, Španijo, Hrvaško, Bos- no in Hercegovino, Srbijo, Črno goro, Grčijo, Ciper, Egejske otoke ter za 21 Alenka Baruca Arbeiter idr. posamezna območja Alžirije, Maroka in Tunizije (Pohajda idr. 2015; Her- rando-Moraira idr. 2016). Uspevanje laškega smilja na naravnih rastiščih v Sloveniji je s primerki v herbarijski zbirki Univerze v Ljubljani (Herbarij LJU, Oddelek za biologijo, Biotehniška fakulteta) dokumentirano do 60. let 20. stoletja (slika 2): • A: v kraju Harije (pri Ilirski Bistrici) (V. Plemel, 1844, LJU10028514), • B: ob vznožju Slavnika pri Podgorju (R. Justin, 1903, LJU10028516), • C: na travnikih Kojnika nad Podgorjem (R. Justin, 1904, LJU10028517), A B C D E F Slika 2 Primerki laškega smilja v herbarijski zbirki Uni- verze v Ljubljani, nabrani na sedmih naravnih rastiščih v Sloveniji: okolica Ilirske Bistrice (A, D), Slavnik (B, F), Kojnik (C), dolina reke Dra- G gonje (E), okolica Sočerge (G) (foto: M. Bačič, 2017) 22 Nomenklatura, zgodovinski zapisi ter opis laškega smilja • D: na pustih pašnikih med vasema Brce in Tominje (pri Ilirski Bistri- ci) (R. Justin, 1905, LJU10028518), • E: v dolini reke Dragonje (V. Šupin-Šiškovič, 1956, LJU10028522), • F: na Slavniku (T. Wraber, 1957, LJU10028520), • G: nad vasico Karli pri Sočergi (T. Wraber, 1959, LJU10028521). Laški smilj na naravnih rastiščih v Sloveniji trenutno ne raste. Najverjet- neje je zaradi zaraščanja izgubil življenjski prostor, saj v naravi uspeva na odprtih, suhih, kamnitih in prisojnih območjih (Galbany-Casals idr. 2011; Bandelj idr. 2020). Pravilna identifikacija in taksonomska klasifikacija nista pomembni le z botaničnega vidika, temveč tudi zaradi načrtnega gojenja laškega smilja podvrste H. italicum subsp. italicum. Podvrsta je genetsko zelo raznoli- ka, kar vpliva na kemijsko sestavo eteričnega olja in drugih rastlinskih izvlečkov. Raznolikost v kemijski sestavi pa določa terapevtske lastnosti in usmerja uporabo laškega smilja v različne namene. Morfološke značilnosti podvrste laškega smilja H. italicum subsp. italicum Podvrsta laškega smilja H. italicum subsp. italicum je zelnata, aromatična trajnica. Raste v obliki polgrma, ki lahko doseže do 70 cm višine. Grm je celi ali črtalasti listi • d: 8–37 mm • š: 0,4–1,8 mm pakobulasto socvetje • d: 10–62 mm • š: 15–80 mm • 15–94 koškov zalisti • d: 3–11 mm • š: 0,5–1,3 mm • v obliki snopov • izjemoma niso prisotni Slika 3 Zgradba laškega smilja 23 Alenka Baruca Arbeiter idr. pri dnu olesenel in razvejan. Iz olesenelega dela izraščajo pokončni vege- tativni in cvetni poganjki. Listi, ki izraščajo iz stebel, so nameščeni spira- lasto ali premenjalno in so celi ter črtalasti. Listi na cvetnih poganjkih so proti vrhu vedno krajši. Na steblih so pogosto prisotni tudi zalisti, ki iz- raščajo v obliki snopov. Izjemoma se lahko zgodi, da zalisti niso prisotni. Na vrhu cvetnega poganjka je pakobulasto socvetje, ki vsebuje številne koške (slika 3) (Galbany-Casals idr. 2006; Galbany-Casals idr. 2011; Her- rando-Moraira idr. 2016). Košek (capitulum) je glavičasto socvetje in je cilindrične do ozko zvona- ste oblike. Košek je obdan z rumenkasto-zelenkastimi ovojkovimi listi, kjer so najbolj zunanji manjši in notranji večji. Košek vsebuje rumene, predvsem cevaste cvetove, ki so hermafroditski (v cvetu so prisotni moški in ženski organi) in jih oprašujejo žuželke ter veter. Venec je zrasel v cev in je zvezdaste oblike, saj se na vrhu končuje s petimi zobci. V cvetu je pet prašnikov in prašnice so zrasle v cev, ki obdaja vrat pestiča. Izjemoma se v košku pojavljajo tudi jezičasti (funkcionalno ženski) cvetovi. Čaša je preobražena v kodeljico (papus) iz peresastih ali neperesastih laskov. Plod je orešek ali rožka, ki je cilindrične do ovoidne oblike, z enakomerno razporejenimi belimi laski (kodeljica) (slika 4) (Galbany-Casals idr. 2006; Galbany-Casals idr. 2011; Herrando-Moraira idr., 2016). dvospolni cevast cvet • zvezdast • d: 2,7–4,4 mm košek • 5 prašnikov • d: 4–6,5 mm • š: 2–4 mm kodeljica • d: 2,2–4 mm rumeni cvetovi • iz peresastih/neperesastih (14–34) laskov ovojkovi listi (22–40) zunanji notranji • š: 0,4–1,5 mm plod = orešek ali rožka • d: 1–3 mm • d: 3,2–5,5 mm • črtalasto-suličasti do • d: 0,9–1 mm • š: 0,5–1,2 mm suličasti • š: 0,4–0,5 mm • črtalasto-suličasti • rahlo do zmerno dlakavi • cilindrične do ovoidne • goli do rahlo dlakavi oblike Slika 4 Zgradba koška in cevastega cveta ter ploda laškega smilja 24 Nomenklatura, zgodovinski zapisi ter opis laškega smilja Za rob listne ploskve je značilno, da je zakrivljen navzdol proti spodnji list ni ploskvi in ni valovit. Zgornja listna povrhnjica (adaksialna stran li- sta) je zelene barve in prekriva jo zaščitna kutikula (plast kutina in voskov na zunanjih stenah celic povrhnjice). Za zgornjo povrhnjico so značil- ni redkejši nežlezni trihomi in praviloma ni žleznih trihomov ali pa so ti zelo redki. Spodnja listna povrhnjica (abaksialna stran lista) je sivo-ze- lene barve prav zaradi številnih nežleznih trihomov in zanjo so značilni tudi številni žlezni trihomi (slika 5) (Galbany-Casals idr. 2006; Galbany- -Casals idr. 2011; Herrando-Moraira idr. 2016). Izjemna morfološka raznolikost rastlin se ne kaže le med podvrstami laš- kega smilja, temveč tudi znotraj podvrste H. italicum subsp. italicum. Ra- stline se lahko razlikujejo po višini, od nižje rastočih in kompaktnejših do pokončnejših oblik, kar je pogosto odziv rastline na okoljske razmere, kot so suša, veter, slana in peščena tla na obalnih območjih ali kamnita tla. Listi se lahko razlikujejo po dolžini in širini ter barvnih odtenkih, ki so od srebrnkastosivih do zelenkastih tonov, kar je odvisno od gostote nitastih nežleznih trihomov. Zelo raznoliki so tudi koški, ki variirajo v velikosti, obliki in odtenkih zlatorumene barve (slika 6). Iz povrhnjice nadzemnih delov laškega smilja (steblo, stebelni listi, ovoj- kovi listi, cvetni listi) izraščajo nežlezni in žlezni laski ali trihomi. To so zgornja listna povrhnjica • zelena • redkejši nežlezni trihomi • žleznih trihomov ni ali pa so zelo redki zaščitna kutikula rob listne ploskve • zakrivljen navzdol proti spodnji listni ploskvi spodnja listna povrhnjica • ni valovit • sivo-zelena • številni nežlezni in žlezni trihomi Slika 5 Prečni prerez črtalastega lista laškega smilja z zakrivljenim robom listne ploskve 25 Alenka Baruca Arbeiter idr. Slika 6 Morfološka raznolikost koškov v pakobulastem socvetju in rastlin laškega smilja specializirane strukture, ki se pri laškem smilju razvijejo iz epidermal- nih celic in so različno oblikovane. Nežlezni trihomi so večcelični, ne- razvejani in gladki ter zelo dolgi in prožni. Rastlino ščitijo pred nizkimi temperaturami in škodljivim UV-B-sevanjem, zmanjšujejo izhlapevanje vode iz rastline ter prispevajo k zeleno-sivim barvnim odtenkom (Perrini idr., 2009; Rodrigues idr., 2015). Žlezni trihomi so prav tako večcelični in Preglednica 4 Celična zgradba in značilnosti dveh tipov (I in II) žleznih trihomov laškega smilja (Perrini idr., 2009; Rodrigues idr., 2015) Tip I Tip II Značilnosti Večji in kompleksnejši Manjši in enostavnejši Celična Bazalni del ali Daljši, število celic Kratek, 2 celici zgradba pecelj variira Osrednji del 4–6 parov vzporednih 2 para vzporednih celic celic Apikalni del 2 večji in daljši izločalni 2 izločalni celici, celici, ki tvorita velik ki tvorita ozek subkutikularni prostor subkutikularni prostor Lokacija Stebelni listi, steblo Ovojkovi listi koškov in cvetni listi Sinteza eteričnega olja Velike količine Manjše količine 26 Nomenklatura, zgodovinski zapisi ter opis laškega smilja A B C 10 μm 10 μm 10 μm Slika 7 Celična struktura nežleznih trihomov (A) ter žleznih trihomov tipa I (B) in tipa II (C) mikroskopske raziskave so pokazale, da sta za laški smilj značilna dva tipa žleznih trihomov (Perrini idr., 2009; Rodrigues idr., 2015). Oba tipa prispevata k izločanju eteričnega olja, a se razlikujeta v celični zgradbi, količini sintetiziranega olja ter mestu na rastlini (preglednica 4, slika 7). Viri Anderberg, A. A. 1991. Taxonomy and Phylogeny of the Tribe Gnaphalieae (Asteraceae). 104. izd. Opera Botanica. Council for Nordic Publications in Botany. Antunes Viegas, D., A. Palmeira-de-Oliveira, L. Salguiero, J. Martinez-de-O- liveira in R. Palmeira-de-Oliveira. 2014. »Helichrysum italicum: From Traditional Use to Scientific Data.« Journal of Ethnopharmacology 151 (1): 54–65. Appendino, G., O. Taglialatela-Scafati, A. Minassi, F. Pollastro, M. Ballero in A. Maxia. 2015. »Helichrysum italicum: The Sleeping Giant of Mediter-ranean Herbal Medicine.« HerbalGram 105:36–47. Baruca Arbeiter, A., M. Hladnik, J. Jakše in D. Bandelj. 2021. »First Set of Microsatellite Markers for Immortelle (Helichrysum italicum (Roth) G. Don): A Step Towards the Selection of the Most Promising Genotypes for Cultivation.« Industrial Crops and Products 162 (10): 113298. Bandelj, D., M. Hladnik, K. Kramberger in A. Baruca Arbeiter. 2020. Spoznaj- mo laški smilj. Založba Univerze na Primorskem. Boerhaave, H. 1727. Historia plantarum quae in Horto Academico Lugduni- -Batavorum crescunt: cum earum characteribus, & medicinalibus virtu-tibus. Franciscum Gonzagam. 27 Alenka Baruca Arbeiter idr. Galbany-Casals, M., L. Sáez in C. Benedi. 2006. »A Taxonomic Revision of Helichrysum Sect: Stoechadina (Asteraceae, Gnaphalieae).« Canadian Journal of Botany 84 (8): 1203–1232. Galbany-Casals, M., P. Carnicero-Campmany, J. M. Blanco-Moreno in R. D. Smissen. 2011. »Genetic Variation in Mediterranean Helichrysum itali- cum (Asteraceae; Gnaphalieae): Do Disjunct Populations of Subsp. Mi- crophyllum Have a Common Origin?« Plant Biology 13 (4): 678–687. Galbany-Casals, M., J. M. Blanco-Moreno, N. Garcia-Jacas, I. Breitwieser in R. D. Smissen. 2012. »Morphological and Genetic Evidence of Con- temporary Intersectional Hybridisation in Mediterranean Helichrysum (Asteraceae, Gnaphalieae).« Plant Biology 14 (5): 789–800. Herrando-Moraira, S., J. M. Blanco-Moreno, L. Sáez in M. Galbany-Casals. 2016. »Re-Evaluation of the Helichrysum italicum Complex (Composi- tae: Gnaphalieae): A New Species from Majorca (Balearic Islands).« Co- llectanea Botanica 35:e009. Hladnik, M., A. Baruca Arbeiter, P. Gabrovšek idr. 2024. »New Chloroplast Microsatellites in Helichrysum italicum (Roth) G. Don: Their Characteri- zation and Application for the Evaluation of Genetic Resources.« Plants 13 (19): 2740. Ličina, A., in V. Ročak Kralj. 2016. »Mediterranean Gold– Helichrysum itali- cum.« The International Journal of Professional Holistic Aromatherapy 4 (4): 5–12. Łuczaj, Ł., M. Jug-Dujaković, K. Dolina, M. Jeričević in I. Vitasović-Kosić. 2024. »Ethnobotany of the Ritual Plants of the Adriatic Islands (Croatia) Associated with the Roman-Catholic Ceremonial Year.« Acta Societatis Botanicorum Poloniae 93:180804. Marini, L., L. Bini, M. Gori idr. 2023. »Genetic and Morphological Assessment of Helichrysum Mill. from Tuscan Archipelago (Italy).« Scientia Horticul- turae 321:112360. Martinčič, A., T. Wraber, N. Jogan, A. Podobnik, B. Turk in B. Vreš. 2007. Mala flora Slovenije: ključ za določevanje praprotnic in semenk. Tehniška za- ložba Slovenije. Morison, R. 1715. Plantarum historiae universalis Oxoniensis seu herbarum distributio nova, per tabulas cognationis et affinitatis ex libro Naturae observata et detecata. Theatrum Sheldonianum. Morone-Fortunato, I., C. Montemurro, C. Ruta idr. 2010. »Essential Oils, Ge- netic Relationships and in vitro Establishment of Helichrysum italicum (Roth) G. Don ssp. Italicum from Wild Mediterranean Germplasm.« In- dustrial Crops and Products 32 (3): 639–649. Perrini, R., I. Morone-Fortunato, E. Lorusso in P. Avato. 2009. »Glands, Es- sential Oils and in vitro Establishment of Helichrysum italicum (Roth) G. 28 Nomenklatura, zgodovinski zapisi ter opis laškega smilja Don ssp. microphyllum (Willd.) Nyman.« Industrial Crops and Products 29 (2–3): 395–403. Petauer, T. 1993. Leksikon rastlinskih bogastev. Tehniška založba Slovenije. Pohajda, I., G. Dragun in L. Puharić Visković. 2015. Smilje. Savjetodavna služba. Pušnik, F. 1991. »Medicina renesanse in dunajska medicinska fakulteta v času Andreja Perlacha (1490–1551).« Časopis za zgodovino in narodo-pisje 62 (2): 237–250. Quer, P. F. 1993. Plantas medicinales: el Dioscórides renovado. Zv. 3. Labor. Rodrigues, A. M., L. Silva, P. L. V. Fale, M. L. Serralheiro in L. Ascensão. 2015. »Glandular Trichomes and Biological Activities in Helichrysum italicum and H. stoechas, Two Asteraceae Species Growing Wild in Portugal.« Mi-croscopy and Microanalysis 21 (5): 91–92. Scarborough, J. 1978. »Theophrastus on Herbals and Herbal Remedies.« Jour nal of the History of Biology 11 (2): 353–385. Scott, G., in L. M. Hewett. 2008. »Pioneers in Ethnopharmacology: The Dutch East India Company (VOC) at the Cape from 1650 to 1800.« Journal of Ethnopharmacology 115 (3): 339–360. Tutin, T. G., V. H. Heywood, N. A. Burges in D. H. Valentine. 1976. Flora Euro- paea. Zv. 4, Plantaginaceae to Compositae (and Rubiaceae). Cambridge University Press. 29 2 Genetske in genomske raziskave laškega smilja Petra Gabrovšek Matjaž Hladnik Fakulteta za matematiko, naravo- Fakulteta za matematiko, naravo- slovje in informacijske tehnologije, slovje in informacijske tehnologije, Univerza na Primorskem Univerza na Primorskem Alenka Baruca Arbeiter Dunja Bandelj Fakulteta za matematiko, naravo- Fakulteta za matematiko, naravo- slovje in informacijske tehnologije, slovje in informacijske tehnologije, Univerza na Primorskem Univerza na Primorskem © 2025 Petra Gabrovšek, Alenka Baruca Arbeiter, Matjaž Hladnik in Dunja Bandelj https://doi.org/10.26493/978-961-293-525-2.2 Uvod Preučevanje genskih virov je pomembno za ugotavljanje uporabnosti rastlin laškega smilja in omogoča izbor najprimernejših genotipov za pri- delavo v kmetijskem prostoru. Za raziskave genskih virov so, poleg preiz- kušanja ter morfološkega in biokemijskega vrednotenja genskih virov v kolekcijskih nasadih, potrebna tudi učinkovita molekularna orodja. Razli- kovanje genotipov laškega smilja na osnovi morfologije je zaradi njegove fenotipske raznolikosti in spontanega križanja med podvrstami na obmo- čjih, kjer se njihova rastišča prekrivajo, izjemno težavno (Galbany-Casals idr. 2006). Natančna karakterizacija in identifikacija laškega smilja na ravni genoma sta pomembni tudi v postopkih identifikacije za kontrolo identitete vrste, podvrste, za določanje geografskega izvora ter za zagota- vljanje sledljivosti sadilnega materiala na trgu (Baruca Arbeiter idr. 2021). Uporabnost mikrosatelitskih označevalcev Označevalci DNA predstavljajo pomembno orodje v raziskavah raznoli- kosti genskih virov. Za namene razlikovanja posameznih rastlin znotraj Bandelj, D., Z. Jenko Pražnikar in A. Petelin, ur. 2025. 31 Laški smilj. Založba Univerze na Primorskem Petra Gabrovšek idr. in med populacijami sorodnih vrst se razvija vrstno specifične, kodomi- nantne mikrosatelitske označevalce. Mikrosateteliti ali SSR (iz angl. Sim- ple Sequence Repeats; ponovitve enostavnih zaporedij) so kratka zapo- redja z osnovnim motivom dolžine od enega do šest nukleotidov (Gupta idr. 1996), ki se nahajajo v kodirajočih (angl. EST-SSR – Expressed Sequ- ence Tag derived SSR; SSR, pridobljeni iz oznak izraženih zaporedij) in nekodirajočih regijah ter v kloroplastnem (Chung idr. 2006) in mitohon- drijskem genomu (Rajendrakumar idr. 2007). Zaradi kodominantnega dedovanja omogočajo sledenje materinim in očetovim alelom na lokusu, ki jih pomnožimo v verižni reakciji s polimerazo (angl. Polymerase Cha- in Reaction – PCR). S pomočjo mikrosatelitov pridobimo profile DNA ali prstni odtis DNA (angl. DNA fingerprinting) posamezne rastline. Rastline med seboj ločimo na osnovi prisotnosti različnih, pomnoženih alelov na več lokusih. Mikrosatelite odlikuje izjemna variabilnost, zato se kot ozna- čevalski sistem uvrščajo v sam vrh glede uporabnosti v genetskih raziska- vah. Pri rastlinah so se izkazali kot zelo primerno orodje za genotipiza- cijo ali identifikacijo osebkov oz. sorodnih taksonov, za karakterizacijo rastlinskih genskih virov, za preučevanje raznolikosti ter za filogenetske, populacijske in evolucijske raziskave. Poleg tega so nepogrešljivo orodje v programih žlahtnjenja rastlin (Varshney idr. 2005; Zalapa idr. 2012; Vie- ira idr. 2016; Taheri idr. 2018). Za razvoj mikrosatelitskega označevalskega sistema je potrebno pozna- vanje zaporedja DNA tarčne vrste, in v primeru, če zaporedij ni na voljo, je potrebno predhodno sekvenciranje genoma ali transkriptoma preu- čevane vrste. Sledita identifikacija regij s prisotnimi mikrosatelitskimi motivi ter razvoj začetnih oligonukleotidov, ki se prilegajo na obrob- no regijo mikrosatelita. Novorazvite začetne oligonukleotide je treba predhodno testirati glede uspešnosti pomnoževanja v PCR. Iz nabora večjega števila uspešno pomnoženih mikrosatelitov se nato za nadalj- nje raziskave izbere le visoko informativne, polimorfne mikrosatelitske lokuse. Pridobljena nukleotidna zaporedja genoma in transkriptoma omogočajo še številne druge aplikacije. Mednje sodijo asociacijske raziskave celotnih genomov (angl. Genome-Wide Association Studies – GWAS), ki povezujejo genotip s fenotipom in vključujejo iskanje genet- skih variacij po celotnem genomu ter njihovo povezovanje z določeni- mi lastnostmi (Guo idr. 2021). Prav tako omogočajo tudi identifikacijo genov, odgovornih za določene lastnosti (npr. za odpornost rastlin ali sintezo biološko aktivnih spojin), ter ekspresijske raziskave (Lovén idr. 2012). 32 Genetske in genomske raziskave laškega smilja Sekvenciranje Helichrysum Sekvenciranje genoma italicum transkriptoma subsp. italicum 24 genomskih SSRs kloroplastni HiUP 23 genskih SSRs genom EST-HiUP H. italicum 16 kloroplastnih SSRs cpHiUP Genetska raznolikost populacij Identifikacija in selekcija H. italicum genotipov Ita Korzika lija (Francija) Istra (Hrvaška) Slika 1 Genetske raziskave laškega smilja na UP FAMNIT: razvoj genoma in transkriptoma ter treh nizov mikrosatelitskih označevalcev (HiUP, cpHiUP, EST-HiUP) Mikrosateliti laškega smilja in njihova uporabnost v genetskih raziskavah Raziskovalci Univerze na Primorskem, Fakultete za matematiko, naravo- slovje in informacijske tehnologije (UP FAMNIT) smo prvi v svetovnem merilu razvili mikrosatelitske označevalce laškega smilja. K odločitvi za ra- zvoj je prispeval pregled genetskih raziskav in podatkovnih zbirk nukleo- tidnih zaporedij za laški smilj v letu 2020, s katerim smo ugotovili, da so in- formacije zanj izjemno skromne in omejene ter da ni razpoložljivih vrstno specifičnih molekulskih označevalcev. Mikrosatelite smo razvili iz zapore- dij, ki smo jih pridobili s sekvenciranjem genoma (DNA) in transkriptoma (RNA) ter jih uspešno uporabili za identifikacijo genotipov in preučevanje genetske raznolikosti naravnih populacij laškega smilja (slika 1). Sekvenciranje genomske DNA smo opravili s tehnologijo Ion Torrent. Iz pridobljenih 17.025.076 kakovostnih zaporedij s povprečno dolžino 245 baznih parov (bp) smo pridobili 450.590 daljših zaporedij ali kontigov v skupni dolžini 258,6 Mbp, kar predstavlja 15,9 % predvidene celotne veli- kosti genoma laškega smilja (Baruca Arbeiter idr. 2021). Zložena nukleotidna zaporedja smo uporabili za razvoj mikrosatelit- skih označevalcev. Mikrosatelitske motive je vsebovalo 8,19 % kontigov (36.882), med katerimi so prevladovali dinukleotidni motivi (71,2 %; 33 Petra Gabrovšek idr. a) Dinukleotidi (71,2 %) Trinukleotidi (24,4 %) Tetranukleotidi (2,9 %) b) Pentanukleotidi (0,7 %) Heksanukl. (0,62 %) 30 75 20 50 Odstotek Odstotek 10 25 0 0 TA/TA AT/AT TG/CA AC/GT GA/TC CT/AG Ostalo Ostalo Ostalo Ostalo Ostalo ATT/AAT ATA/TAT TAA/TTA GAT/ATC CAT/ATG TCA/TGA TTC/GAA TTG/CAA TATT/AATA AAAT/ATTT CATA/TATG ATAA/TTAT GTAT/ATAC TAAA/TTTA ATTA/TAAT ACAT/ATGT TGTA/TACA GATA/TATC CTAT/ATAG TTATA/TATAA TATAT/ATATA TTTTA/TAAAA AATAT/ATATT TTTAT/ATAAA ATCTA/GAGAT TAATT/AATTA TATATG/CATATA TATACA/TGTATA ATTATA/TATAAT ACATAT/ATATGT GTATAT/ATATAC Slika 2 Pogostost dinukleotidov, trinukleotidov in tetranukleotidov (a) ter pentanukleotidov in heksanukleotidov (b) v genomu laškega smilja 30.673), sledili so trinukleotidi (24,4 %; 10.519) in tetranukleotidi (2,9 %; 1.243), penta- in heksanukelotidi pa so skupno predstavljali najmanjši delež (1,4 %) v genomu laškega smilja. Najpogostejši dinukleotidni mo- tivi so bili TA/AT (36,1 %), AT/AT (31,3 %), TG/CA (10,1 %) in AC/GT (8,8 %), medtem ko so bili najpogostejši trinukleotidni motivi ATT/AAT (17,4 %), ATA/TAT (15,7 %) in TAA/TTA (13,5 %) (slika 2). V nadaljevanju smo pregledali zložena nukleotidna zaporedja z mikrosatelitskimi motivi po izbranih kriterijih in izbrali 60 zaporedij, primernih za razvoj zače- tnih oligonukleotidov. Od 60 regij z razvitimi začetnimi oligonukleotidi sta bila dva uspešno pomnožena lokusa monomorfna (0,9 %), preostalih 24 (41,8 %) pa polimorfnih. Končni niz vključuje 24 genomskih mikrosa- telitskih označevalcev z oznako HiUP, katerih podatki so prosto dostopni v podatkovni bazi GenBank (Baruca Arbeiter idr. 2021). Mikrosatelitske označevalce smo uporabili v preliminarni raziskavi za preučevanje genetske raznolikosti 27 rastlin laškega smilja z vzhodne jadranske obale in rastlin, ki smo jih vzgojili iz kupljenega certificirane- ga semena laškega smilja na trgu. Na lokusu HiUP-21 smo odkrili le dva alela, največ alelov (15) pa smo odkrili na lokusu HiUP-23. V povprečju smo z nizom HiUP 24 označevalcev pomnožili 8,5 alela na mikrosatelit- ski lokus. Na podlagi analize nekaterih parametrov variabilnosti (število efektivnih alelov, opažena in pričakovana heterozigotnost, informacijska vrednost polimorfizma, verjetnost enakosti genotipov) smo izbrali deset 34 Genetske in genomske raziskave laškega smilja Slika 3 Kloroplastni genom laškega smilja mikrosatelitskih označevalcev (HiUP-04, HiUP-05, HiUP-07, Hi-UP-13, HiUP-14, HiUP-18, HiUP-19, HiUP-20, HiUP-22, HiUP-24), ki so se izka- zali kot zelo informativni in primerni za preučevanje genetske strukture ter raznolikosti laškega smilja. Omogočili so tudi razlikovanje med popu- lacijami laškega smilja s severnega in z južnega dela vzhodnojadranske regije. Genotipizacija z mikrosateliti je razkrila tudi napačno identifika- cijo vrste na deklaraciji certificiranega semena. Z genetskimi profili, pod- prtimi z edinstvenimi aleli, smo potrdili, da certificiran sadilni material ne pripada vrsti Helichrysum italicum, kar smo podprli še z morfološki- mi meritvami, temveč gre za vrsto Helichrysum angustifolium (Lam.) DC (Baruca Arbeiter idr. 2021) oz. po novem predlogu poimenovanja za vrsto Helichrysum litoreum Guss (Aghababyan idr. 2009; Baruca Arbeiter idr. 2021; Hladnik idr. 2023). Pomnoževanje z novimi označevalci je bilo us- pešno tudi pri vrsti peščeni smilj (Helichrysum arenarium (L.) Moench) (Kramberger idr. 2021; Van Rossum idr. 2024). Prvi niz mikrosatelitskih 35 Petra Gabrovšek idr. označevalcev laškega smilja predstavlja dragoceno orodje za nadaljnje selekcijske programe, karakterizacijo genskih virov in zaradi prenoslji- vosti omogoča tudi raziskave sorodnih vrst laškega smilja. Nukleotidno zaporedje genoma laškega smilja smo uporabili tudi za sestavo celotne kloroplastne DNA (angl. Chloroplast DNA – cpDNA) (Hladnik idr. 2019). Velikost kloroplastnega genoma laškega smilja je 152.431 bp in vsebuje 131 genov, od tega 85 protein kodirajočih genov, 36 genov za prenašalno RNA (angl. Transfer RNA – tRNA), osem genov za ribosomsko RNA (angl. Ribosomal RNA – rRNA) in dva delna gena (ycf1, rps19) (slika 3). Dolžina regije LSC (angl. Large Single Copy; večja enojna kopija) znaša 84.445 bp, regije IR (angl. Inverted Repeats; inverzni oz. na- sprotno orientirani ponovitvi) 24.773 bp in regije SSC (angl. Small Single Copy, manjša enojna kopija) 18.440 bp. V kloroplastu adenin predstavlja 31,3 %, citozin 18,3 %, gvanin 18,8 % in timin 31,5 %. Sestavljen kloroplastni genom nam je omogočil identifikacijo in razvoj kloroplastnih mikrosatelitskih označevalcev (angl. Chloroplast Simple Sequence Repeats – cpSSRs) (Hladnik idr. 2024). V cpDNA smo identifici- rali 43 regij z mikrosatelitskimi ponovitvami. Največ je bilo mononukle- otidnih mikrosatelitov (31; 72,1 %), sledili so dinukleotidni (9; 21,0 %) in trinukleotidni (3; 6,9 %) (slika 4). 34 mikrosatelitov (79,1 %) smo odkrili v regiji LSC, sedem (16,3 %) v regiji SSC, dva mikrosatelita pa smo iden- tificirali v regijah IRA in IRB. Za vse najdene mikrosatelite smo dizajni- rali pare začetnih oligonukleotidov in preizkusili uspešnost njihovega pomnoževanja. Izbrani niz 16 polimorfnih kloroplastnih mikrosatelit- skih označevalcev (cpHiUP) smo uporabili za genotipizacijo desetih po- pulacij laškega smilja s Korzike (Francija) in z rta Kamenjak (Hrvaška). Populacijsko analizo smo izvedli le z desetimi najboljšimi označevalci (cpHiUP-01, cpHiUP-05, cpHiUP-06, cpHiUP-7, cpHiUP-08, cpHiUP-12, cpHiUP-13, cpHiUP-14, cpHiUP-15, cpHiUP-15) in odkrili kar 38 haploti- pov (specifična kombinacija alelov na več kloroplastnih mikrosatelitskih lokusih), od tega 32 geografsko specifičnih ter deset privatnih alelov, zna- čilnih za sedem populacij. Z vsemi desetimi kloroplastnimi mikrosatelit- skimi označevalci je bilo pomnoževanje uspešno tudi na vzorcih H. lito- reum in H. arenarium, s čimer smo potrdili 100-odstotno prenosljivost na sorodne vrste. Skupno smo detektirali 56 alelov, od tega sedem unikatnih za H. litoreum, šest za H. arenarium in 26 za H. italicum, medtem ko je bil le en alel skupen vsem trem vrstam. 36 Genetske in genomske raziskave laškega smilja 10 9 8 7 6 5 4 3 Pogostost mikrosatelitskih motivov 2 1 0 10 11 10 11 12 13 10 5 6 5 6 5 5 5 Število ponovitev A T AT TA AAT AGA ATT Mikrosatelitski motiv Slika 4 Pogostost posameznih mikrosatelitskih motivov v kloroplastnem genomu laškega smilja Novorazviti genomski in kloroplastni mikrosatelitski označevalci pred- stavljajo nepogrešljivo orodje za razlikovanje vrst, ki je pomembno v ta- ksonomskih in filogenetskih raziskavah, zato so uporabni tudi na podro- čju varstvene biologije. V sodelovanju s skupino Fabienne Van Rossum idr. (2024) smo raziskovalci UP FAMNIT genomske mikrosatelitske označevalce laškega smilja uporabili za analizo genetske raznolikosti upadajočih populacij vrste peščenega smilja z namenom ohranitve edi- ne naravne populacije v Belgiji. Pristopili smo z idejo, da bi potencial- ne, genetsko raznolike in neklonsko razmnožene rastline iz populacij v Nemčiji uporabili kot vir rastlinskega materiala za izboljšanje genskega pretoka zadnje populacije na jugu Belgije. Prenosljivost 12 genomskih mikrosatelitskih označevalcev smo testirali na vzorcih peščenega smi- lja treh nemških populacij ter potrdili uspešno pomnoževanje pri os- mih lokusih (HiUP-01, HiUP-02, HiUP-05, HiUP-08, HiUP-13, HiUP-16, HiUP-18 in HiUP-19). Na podlagi parametrov variabilnosti smo za nem- ške populacije ugotovili visoko genetsko raznolikost in nizek koeficient samoopraševanja, kljub dejstvu, da je vrsta znana kot samooplodna, 37 Petra Gabrovšek idr. medtem ko smo v belgijski populaciji ugotovili nizko genetsko raznoli- kost in klonalnost. V raziskavi smo potrdili domnevo, da so nemške po- pulacije primerne za translokacijo rastlin v belgijsko populacijo, s čimer bi omogočili povečan je genetske raznolikosti in evolucijske odpornosti populacij peščenega smilja v Belgiji. Za genetske raziskave rastlin so, poleg genomskih in kloroplastnih mi- krosatelitskih označevalcev, uporabni tudi genski mikrosateliti ali EST-SSRs. Primerni so za odkrivanje raznolikosti v izraženih regijah ge- noma in so označevalci tarčnih genov (Andersen in Lübbersteedt 2003). Tako kot genomski mikrosateliti so tudi genski običajno uporabni za sorodne vrste (Wöhrmann in Weising 2011). Razvoj označevalcev EST- -SSRs je odvisen od razpoložljivosti zbirk EST, zato smo na UP FAMNIT z uporabo enake tehnologije, omenjene pri sekvenciranju genomske DNA, razvili transkriptom laškega smilja in prve genske mikrosatelitske označevalce (EST-SSRs) laškega smilja (Gabrovšek idr. 2024). Pridobi- li smo 21.568.881 kakovostnih zaporedij, združenih v 24.806 kontigov s povprečno dolžino 1.832 bp, kar po oceni, pridobljeni z analizo z orod- jem BUSCO, znaša 48,6 % popolnega transkriptoma. Nato smo izvedli funkcijsko anotacijo kontigov, s poudarkom na agronomsko zanimivih lastnostih, kot so različni presnovki in biosintezne poti za terpenoide, po- liketide, glikane ter druge sekundarne presnovke, odpornost na bolezni in škodljivce ipd. V anotiranih transkriptih smo identificirali 1.999 popol- nih mikrosatelitov. Najpogostejši so bili trinukleotidni motivi (70,03 %, 1.397), sledili so dinukleotidni (24,26 %, 484), tetranukleotidni (2,76 %, 55), heksanukleotidni (2,01 %, 40) ter pentanukleotidni (0,95 %, 19) mi- krosatelitski motivi. Iz nabora anotiranih transkriptov z mikrosatelitski- mi regijami smo, upoštevajoč domnevno funkcijo, izbrali 79 lokusov za razvoj začetnih oligonukleotidov (Gabrovšek idr. 2024). Po končani opti- mizaciji protokola pomnoževanja smo pri 31 (39,2 %) EST-SSRs pridobili kakovostne pomnožke, medtem ko pri ostalih 48 (60,8 %) označevalcih EST-SSRs pomnoževanje ni bilo uspešno ali pa so se pomnožili nespe- cifični produkti. V nizu 31 EST-SSRs je bilo osem lokusov monomorfnih, preostalih 23 pa polimorfnih, zato so potencialno uporabni za genetske raziskave. Raziskave laškega smilja z uporabo drugih označevalcev DNA Pred razvojem vrstno specifičnih mikrosatelitskih označevalcev so bili genski viri rodu Helichrysum na območju sredozemskega bazena preu- čevani z različnimi označevalskimi sistemi. Mercè Galbany-Casals idr. 38 Genetske in genomske raziskave laškega smilja (2004) so želeli ugotoviti, ali je rod Helichrysum monofiletski, kar pomeni, da vse vrste v tem rodu izvirajo iz enega skupnega prednika. Med prvi- mi so preučili vrste rodu Helichrysum z območja Sredozemlja ter nekaj predstavnikov afriškega izvora z analizo nukleotidnega zaporedja regi- je ITS (iz angl. Internal Transcribed Spacer; notranji prepisni vmesnik). Uporabili so regiji ITS1 in ITS2, ki se nahajata med geni za rRNA, ki se jih uporablja za filogenetske in taksonomske analize zaradi njihove variabil- nosti med vrstami ter znotraj vrst (Mäder idr. 2010). Kot zunanjo skupino so vključili vrste iz plemena Gnaphalieae (družina Asteraceae). Rezultati raziskave so pokazali, da naj bi bil rod Helichrysum polifiletski. Pleme Gnaphalieae najverjetneje izvira iz Afrike, od koder se je širilo v Evrazi- jo, Avstralijo in Ameriko. Za potrditev te hipoteze so potrebne dodatne raziskave. Filogenetska raziskava je vrsto H. italicum uvrstila v osrednji predel sredozemskega bazena. Rezultati so podprli domnevo, da je rod Helichrysum v Sredozemlju monofiletski. Izjemi sta vrsti H. frigidum in H. montelinasanum, ki naj bi se razvili iz afriških vrst. Razmerja podob- nosti znotraj vrst iz Sredozemlja ostajajo nerazjasnjena, kar je posledica nedavnih dogodkov speciacije znotraj rodu ter spontanega križanja in genskega pretoka. Z namenom izboljšanja razlikovanja med zelo sorodnimi vrstami so Mercè Galbany-Casals idr. (2009) raziskavo razširili in označevalce ITS nadgradili z analizo nukleotidnih zaporedij regije ETS (iz angl. External Transcribed Spacer; zunanji prepisni vmesnik). Tudi regija ETS je del gena za rRNA in se pogosto uporablja za filogenetske in evolucijske razi- skave. Analizirali so 36 vrst rodu Helichrysum iz Sredozemlja in Azije, 47 predstavnikov afriških vrst Helichrysum ter dve vrsti iz Irana in Jemna. V filogenetskem drevesu ETS so imeli vzorci podvrste H. italicum subsp. italicum skupno vozlišče s H. italicum subsp. siculum in H. italicum sub- sp. microphyllum. Podatki nakazujejo, da prednik predstavnikov rodu Helichrysum izvira iz Sredozemlja, od koder se je razširil v azijsko regijo. Tudi Nie idr. (2013) so z analizo regije ITS nakazali sorodnost med sredo- zemskimi in azijskimi predstavniki iz rodu Helichrysum. Raziskovalci UP FAMNIT (Hladnik idr. 2023) smo regije ITS uporabili za analizo genetske raznolikosti naravnih populacij laškega smilja z vzhod- ne jadranske obale (Hrvaška, Črna gora) ter okrasnih rastlin iz Slovenije z namenom ločevanja rastlin različnega geografskega porekla na podlagi unikatnih nukleotidnih zaporedij regije ITS. Z raziskavo smo pokazali, da prihaja do velikega prekrivanja v nukleotidnih zaporedjih regije ITS, 39 Petra Gabrovšek idr. kar zmanjšuje možnost uporabe označevalcev za razlikovanje med pod- vrstami in za ugotavljanje geografskega izvora rastlin. Wilma Sabetta idr. (2006) pa so za preučevanje genetske raznolikosti laš- kega smilja z območja Sredozemlja uporabili označevalce AFLP (iz angl. Amplified Fragment Length Polymorphism; polimorfizem dolžin pomno- ženih fragmentov), ki omogočajo odkrivanje polimorfizmov v naključnih regijah genoma. V raziskavo so vključili rastline laškega smilja iz Francije (Korzika) in Italije (Apulija, Sicilija, Sardinija, Bazilikata, Kalabrija, Toska- na in Ligurija). Vzorci so se glede na sorodnost razporedili v tri skupine. V prvi skupini so prevladovali vzorci s Korzike, v drugi z območij Apuli- je in Bazilikate ter nekaj klonov s Korzike, tretjo skupino pa so zastopali vzorci z otoka Elba, iz Toskane in Ligurije. Označevalce AFLP so uporabili tudi Rosaria Perrini idr. (2009) za razi- skavo vpliva tehnik rastlinskih tkivnih kultur na genetsko variabilnost ekotipa H. italicum subsp. microphyllum (po novejši klasifikaciji subsp. tyrhennicum) s Korzike. Rezultati analize so pokazali, da je rastlinski ma- terial pri gojenju in vitro genetsko stabilen, saj so rastline ohranile 99,3 % podobnosti. Variabilnost na določenih lokusih bi bila lahko tudi posledi- ca in vitro induciranih DNA-metilacijskih sprememb, na katere so lahko občutljivi restrikcijski encimi, ki so del protokola AFLP. Irene Morone-Fortunato idr. (2010) so s pomočjo označevalcev AFLP in analize eteričnega olja ugotavljali genetsko in kemijsko variabilnosti 20 genotipov H. italicum subsp. italicum z območja Italije in Francije (Kor- zika). Genotipi so se razvrstili v dve skupini, ki sta odražali tudi kemijsko raznolikost. Na območju Sardinije (Italija) so Sara Melito idr. (2013) preučevali genet- sko in kemijsko raznolikost laškega smilja. V analizo AFLP je bilo vključe- nih 50 populacij. Razvrščanje v sorodnostne skupine je pokazalo dve gru- či, ki sta se ujemali z geografsko razširjenostjo in okoljskimi razmerami Sardinije. Predpostavljajo, da je genetska struktura nastala pod vplivom prilagoditve okolju, kar se odraža v genetski in kemijski raznolikosti vrste. Na območju vzhodne jadranske obale so Tonka Ninčević idr. (2021) sis- tematično vzorčili 18 naravno rastočih populacij laškega smilja in jih analizirali z označevalci AFLP. Želeli so preučiti genetsko raznolikost in strukturo ter identificirati lokuse, ki so potencialno odgovorni za razvoj lastnosti, pomembnih za prilagajanje rastlin okolju. Vzorci so se razvrstili v dve sorodnostni skupini glede na geografsko območje (severni in juž- ni Jadran). Identificirali so štiri lokuse, ki so bili povezani z okoljskimi 40 Genetske in genomske raziskave laškega smilja lastnostmi (temperatura in padavine), kar nakazuje, da je na nastanek genetske raznolikosti vplivalo tudi lokalno podnebje. V nekatere raziskave genskih virov rodu Helichrysum je bilo vključenih več različnih označevalskih sistemov. Mercè Galbany-Casals idr. (2011) so z označevalci AFLP, s kloroplastnimi označevalci (regija psbA-trnH) ter z morfološkim vrednotenjem raziskovali podvrsti H. italicum subsp. microphyllum in H. italicum subsp. italicum v sredozemskem bazenu. Ugotovili so, da se vrsta H. italicum deli na vzhodno in zahodno sre- dozemsko skupino, delitev pa se ni ujemala glede na podvrsto (subsp. microphyllum in subsp. italicum). Genetska raznolikost je bila skladna z morfološko raznolikostjo, kar so pripisali lokalni selekciji lokusov, ki so povezani s kvantitativnimi lastnostmi. Precejšen polimorfizem v nukle- otidnih zaporedjih kloroplastne DNA so odkrili v zahodnosredozemski skupini, tako med populacijami kot tudi znotraj njih. Primerjava nukle- otidnih zaporedij cpDNA H. italicum in drugih vrst rodu Helichrysum pa je pokazala, da so nekateri haplotipi skupni vsem vrstam. Mercè Galbany-Casals idr. (2014) so za filogenetsko analizo rodu Helich- rysum uporabili kombinacijo označevalcev ITS in regije rpl32-trnL v klo- roplastu. V analizo so bile vključene številne vrste iz rodu Helichrysum, med drugim tudi H. italicum subsp. italicum in subsp. microphyllum, ter vrste iz rodov Achyrocline, Anaphalis, Pseudognaphaium in Humeocline. Filogenetsko drevo z označevalci ITS se je nekoliko razlikovalo od filoge- netskega drevesa s kloroplastnimi označevalci, kar je najverjetneje pos- ledica kompleksnih evolucijskih procesov, kot so spontano križanje, alo- poliploidija (pogost mehanizem za razvoj vrst pri rastlinah, do katerega pride, ko se križata dve različni vrsti in ima potomec garnituri kromoso- mov obeh staršev, kromosomi pa niso homologni) in hitra radiacija, kar pomeni hiter razvoj velikega števila vrst iz skupnega prednika v kratkem evolucijskem času (Galbany-Casals idr. 2014). Raziskava je potrdila, da je rod Helichrysum filogenetsko zelo kompleksen in široko razpršen znotraj plemena Gnaphalieae. Izviral naj bi iz južne Afrike, kjer je tudi središče njegove diverzifikacije. Avtorji so poudarili, da bi bilo za pravilno razu- mevanje razmerij znotraj rodu Helichrysum in sorodnih vrst ključnega pomena povezovanje molekularnih, morfoloških ter biogeografskih po- datkov. Genetsko in morfološko raznolikost 12 populacij rodu Helichrysum iz Toskane so nedavno raziskali tudi Marini idr. (2023) ter uporabili ozna- čevalski sistem medmikrosatelitne regije (angl. Inter Simple Sequence 41 Petra Gabrovšek idr. Repeats – ISSR; regije med ponovitvami enostavnih zaporedij) in 27 mor- foloških znakov. Raziskava je potrdila visoko genetsko in morfološko ra- znolikost, ki je bila izrazitejša znotraj populacij kot med populacijami. Za večino toskanskih vzorcev so potrdili, da pripadajo vrsti H. italicum, pri nekaterih pa so zaznali potencialno hibridizacijo z vrsto H. litoreum. Zaključek Raziskave laškega smilja in njegovih podvrst z različnimi molekulskimi označevalci potrjujejo, da je taksonomija zelo kompleksna in še vedno ne povsem pojasnjena, predvsem zaradi izjemne fenotipske raznoliko- sti, ki je posledica razlik v genotipih in okolju. Zaradi tega je še posebej pomemben razvoj označevalcev EST-SSRs, ki kažejo na splošno nižji po- limorfizem v primerjavi z genomskimi SSR (Gupta idr. 2003) in bi bili zato učinkovitejši pri razlikovanju podvrst laškega smilja ter geografsko loče- nih populacij. Nedvoumna identifikacija zdravilnih rastlin je ključnega pomena za zagotavljanje avtentičnosti in sledljivosti sadilnega materiala ter s tem varne uporabe rastlin. Z nizom novih označevalcev EST-SSRs nismo povečali le razpoložljivosti označevalcev laškega smilja, temveč bodo ti tudi v pomoč pri identifikaciji lokalnih genotipov (za zaščito pristnosti lokalnih proizvodov in geografskega porekla) in razvoju no- vih sort visoke kakovosti. Kljub številnim aplikacijam, ki jih omogočajo genomske in transkriptomske raziskave, je razpoložljivost kodirajočih in nekodirajočih nukleotidnih zaporedij pri laškem smilju omejena. Poleg tega prevladujejo raziskave, ki so osredotočene samo na kemijsko anali- zo eteričnega olja in drugih izvlečkov laškega smilja, medtem ko ostaja genetsko ozadje raznolikosti kemotipov nepojasnjeno. Zato je izjemno pomembno, da si nenehno prizadevamo za razvoj vi- sokokakovostnih nukleotidnih zaporedij genoma in transkriptoma ter visokoinformativnih molekulskih označevalcev, s čimer pomembno pris pevamo k boljšemu razumevanju genetskega ozadja kompleksnih presnovnih poti in raznolikih kemotipov laškega smilja. To je namreč os- nova za napredek v žlahtniteljskih programih, ki lahko hitreje privedejo do razvoja prvih dragocenih sort laškega smilja za ciljno uporabo v me- dicini in farmaciji. Viri Aghababyan, M., W. Greuter, P. Mazzola in F. M. Raimondo. 2009. »On the Taxonomy and Nomenclature of Gnaphalium angustifolium Lam. and Helichrysum litoreum Guss. (Compositae).« Bocconea 23:157–163. 42 Genetske in genomske raziskave laškega smilja Andersen, J. R., in T. Lübberstedt. 2003. »Functional Markers in Plants.« Trends in Plant Science 8 (11): 554–560. Baruca Arbeiter, A., M. Hladnik, J. Jakše in D. Bandelj. 2021. »First Set of Microsatellite Markers for Immortelle (Helichrysum italicum (Roth) G. Don): A Step Towards the Selection of the Most Promising Genotypes for Cultivation.« Industrial Crops and Products 162 (10): 113298. Chung, A. M., J. E. Staub in J. F. Chen. 2006. »Molecular Phylogeny of Cucu- mis Apecies as Revealed by Consensus Chloroplast SSR Marker Length and Sequence Variation.« Genome 49 (3): 219–229. Gabrovšek, P., A. Baruca Arbeiter, M. Hladnik in D. Bandelj. 2024. »Deve- lopment of EST-SSR from Helichrysum italicum (Roth) G. Don (Aste-raceae) de novo Assembled Transcriptome.« V Genetika 2024: Book of Abstracts: 10th Congress of the Genetic Society of Slovenia and [10th] Meeting of the Slovenian Society for Human Genetics, uredili S. Kranjc Brezar, M. Čemažar in B. Markelc. Genetic Society of Slovenia. Galbany-Casals, M., L. Saez in C. Benedi. 2006. »A Taxonomic Revision of Helichrysumsect. Stoechadina (Asteraceae, Gnaphalieae).« Canadian Journal of Botany 84 (4): 1203–1232. Galbany-Casals, M., M. Blanco-Moreno, N. Garcia-Jancas, I. Breitwieser in R. D. Smissen. 2011. »Genetic Variation in Mediterranean Helichrysum italicum (Asteraceae; Gnaphalieae): Do Disjunct Populations of subsp. microphyllum Have a Common Origin?« Plant Biology 13 (4): 678–687. Galbany-Casals, M., N. Garcia-Jacas, L. Saez, C. Benedi in A. Susanna. 2009. »Phylogeny, Biogeography, and Character Evolution in Mediterranean, Asiatic, and Macaronesian Helichrysum (Asteraceae, Gnaphalieae) In-ferred from Nuclear Phylogenetic Analyses.« International Journal of Plant Sciences 170 (3): 365–380. Galbany-Casals, M., N. Garcia-Jacas, A. Susanna, L. Saez in C. Benedi. 2004. »Phylogenetic Relationships in the Mediterranean Helichrysum (Aste-raceae, Gnaphalieae) Based on Nuclear rDNA ITS Sequence Data.« Au-stralian Systematic Botany 17 (3): 241–253. Galbany-Casals, M., M. Unwin, N. Garcia-Jacas, R. D. Smissen, A. Susanna in R. J. Bayer. 2014. »Phylogenetic Relationships in Helichrysum (Composi-tae: Gnaphalieae) and Related Genera: Incongruence Between Nuclear and Plastid Phylogenies, Biogeographic and Morphological Patterns, and Implications for Generic Delimination.« Taxon 63 (3): 608–624. Guo, X., Y. Song, S. Liu, M. Gao, Y. Qi in X. Shang. 2021. »Linking Genotype to Phenotype in Multi-Omics Data of Small Sample.« BMC Genomics 22 (1): 537. 43 Petra Gabrovšek idr. Gupta, P. K., H. S. Balyan, P. C. Sharma in B. Ramesh. 1996. »Microsatellites in Plants: A New Class of Molecular Markers.« Current Science 70 (1): 45–54. Gupta, P. K., S. Rustgi, S. Sharma, R. Singh, N. Kumar in H. S. Balyan. 2003. »Transferable EST-SSR Markers for the Study of Polymorphism and Ge- netic Diversity in Bread Wheat.« Molecular Genetics and Genomic 270 (4): 315–323. Hladnik, M., A. Baruca Arbeiter in D. Bandelj. 2023. »Sequence Characteri- zation of ITS Regions of Immortelle Helichrysum italicum (Roth) G. Don from the East Adriatic Coast.« Genes 14 (2): 480. Hladnik, M., A. Baruca Arbeiter, T. Knap, J. Jakše in D. Bandelj. 2019. »The Complete Chloroplast Genome of Helichrysum italicum (Roth) G. Don (Asteraceae).« Mitochondrial DNA Part B 4 (1): 1036–1037. Hladnik, M., A. Baruca Arbeiter, P. Gabrovšek idr. 2024. »New Chloroplast Microsatellites in Helichrysum italicum (Roth) G. Don: Their Characteri- zation and Application for the Evaluation of Genetic Resources.« Plants 13 (9): 2740. Kramberger, K., Z. Jenko Pražnikar, A. Baruca Arbeiter, A. Petelin, D. Bandelj in S. Kenig. 2021. »A Comparative Study of the Antioxidative Effects of Helichrysum italicum and Helichrysum arenarium Infusions.« Antioxi- dants 10 (3): 380. Lovén, J., D. A. Orlando, A. A. Sigova idr. 2012. »Revisiting Global Gene Expression Analysis.« Cell 151 (3): 476–482. Mäder, G., P. M. Zamberlan, N. J. R. Fagundes idr. 2010. »The Use and Li- mits of ITS Data in the Analysis of Intraspecific Variation in Passiflora L. (Passifloraceae).« Genetics and Molecular Biology 33 (1): 99–108. Marini, L., L. Bini, M. Gori idr. 2023. »Genetic and Morphological Assessment of Helichrysum Mill. from Tuscan Archipelago (Italy).« Scientia Horticul- turae 321:112360. Melito, S., A. Sias, G. L. Petretto, M. Chessa, G. Pintore in A. Porceddu. 2013. »Genetic and Metabolite Diversity of Sardinian Populations of Helich- rysum italicum.« PLOS One 8 (11): e79043. Morone-Fortunato, I., C. Montemurro, C. Ruta idr. 2010. »Essential Oils, Ge- netic Relationships and in vitro Establishment of Helichrysum italicum (Roth) G. Don spp. italicum from Wild Mediterranean Germplasm.« In- dustrial Crops and Products 32 (3): 639–649. Nie, Z., V. Funk, H. Sun, T. Deng, Y. Meng in J. Ween. 2013. »Molecular Phylo- geny of Anaphalis (Asteraceae, Gnaphalieae) with Biogeographic Impli- cations in the Northern Hemisphere.« Journal of Plant Research 126 (1): 17–32. 44 Genetske in genomske raziskave laškega smilja Ninčević, T., M. Jug-Dujaković, M. Grdiš idr. 2021. »Population Structure and Adaptive Variation of Helichrysum italicum (Roth) G. Don Along Eastern Adriatic Temperature and Precipitation Gradient.« Scientific Re-ports 11:24333. Perrini, R., V. Alba, C. Ruta, I. Morone-Fortunato, A. Blanco in C. Montemur- ro. 2009. »An Evaluation of a New Approach to the Regeneration of Heli-chrysum italicum (Roth) G. Don, and the Molecular Characterization of the Variation Among Sets of Differently Derived Regenerants.« Cellular and Molecular Biology Letters 14 (3): 377–394. Rajendrakumar, P., A. K. Biswal, S. M. Balachandran, K. Srinivasarao in R. M. Sundaram. 2007. »Simple Sequence Repeats in Organellar Genomes of Rice: Frequency and Distribution in Genic and Intergenic Regions.« Bioinformatics 23 (1). https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btl547. Sabetta, W., C. Montemurro, R. Perrini, I. Morone-Fortunato in A. Blanco. 2006. »Genetic Diversity Assessment of Helichrysum italicum (Roth) G. Don Mediterranean Germplasm by AFLP Markers.« V Proceedings of the 50th Italian Society of Agricultural Genetics Annual Congress. Società Italiana di Genetica Agraria. Taheri, S., T. L. Abdulah, M. R. Yusop idr. 2018. »Mining and Development of Novel SSR Markers Using Next Generation Sequencing (NGS) Data in Plants.« Molecules 23 (2): 399. Van Rossum, F., C. Godé, A. Baruca Arbeiter idr. 2024. »Genetic Diversity As- sessment of Helichrysum arenarium (Asteraceae) for the Genetic Resto-ration of Declining Populations.« Ecology and Evolution 14 (2): e10953. Varshney, R. K., A. Graner in M. E. Sorrells. 2005. »Genic Microsatellite Mar- kers in Plants: Features and Applications.« Trends in Biotechnology 23 (1): 48–55. Vieira, M. L. C., L. Santini, A. L. Diniz in C. F. Munhoz. 2016. »Microsatellite Markers: What They Mean and Why They Are so Useful.« Genetics and Molecular Biology 39 (3): 312–328. Wöhrmann, T., in K. Weising. 2011. »In Silico Mining for Simple Sequen- ce Repeat Loci in a Pineapple Expressed Sequence Tag Database and Cross-Species Amplification of EST-SSR Markers Across Bromeliaceae.« Theoretical and Applied Genetics 123 (4): 635-647. Zalapa, J. E., H. Cuevas, H. Zhu idr. 2012. »Using Next-Generation Sequen- cing Approaches to Isolate Simple Sequence Repeat (SSR) Loci in the Plant Sciences.« American Journal of Botany 99 (2): 193–208. 45 3 Pridelava laškega smilja Dunja Bandelj Matjaž Hladnik Fakulteta za matematiko, naravo- Fakulteta za matematiko, naravo- slovje in informacijske tehnologije, slovje in informacijske tehnologije, Univerza na Primorskem Univerza na Primorskem © 2025 Dunja Bandelj in Matjaž Hladnik https://doi.org/10.26493/978-961-293-525-2.3 Agroekološke zahteve laškega smilja Laški smilj je prostorastoča rastlina v naravi, ki je zaradi vsestranske upo- rabe nedavno prešla v kmetijski prostor (agroekosistem). Prenos rastline iz naravnega okolja v kmetijsko predstavlja izziv, saj se ekosistema razli- kujeta v strukturi in delovanju. Za naravni ekosistem so značilni visoka habitatna heterogenost, vrstna in genetska pestrost, zaprt krogotok hra- nil in odpornost na vplive abiotskih (neživih) ter biotskih (živih) dejav- nikov. Na populacije vplivajo razmere v okolju in tekmovanje med or- ganizmi. Agroekosistem je poenostavljen in ranljiv, vanj posega človek. Za agroekosisteme sta značilna slabše kroženje in izguba hranil, biološka raznolikost je manjša, trofične ravni so poenostavljene, mnoge niše osta- nejo nezasedene, obstaja velika nevarnost pojava patogenov in škodljiv- cev (Gliessman 2014). S pomočjo poznavanja agroekologije se poskuša v kmetijstvu čim bolj posnemati naravne ekosisteme in pridelavo izva- jati z minimalnimi vložki. Gospodarski uspeh pridelave laškega smilja bo odvisen od upoštevanja njegovih ekoloških zahtev. Lego nasada zato izberemo glede na primernost ekoloških dejavnikov za rastlino (slika 1) in ne obratno, saj dejavnike okolja težko ali jih ne moremo spreminjati. Omenjeni pristop je glavno vodilo agroekologije. Neprimerne lege višajo stroške priprave terena in pridelave, tvegamo pa tudi večji napad bolezni in škodljivcev. Običajno dejavniki okolja delujejo hkrati in v interakciji vplivajo na rast, razvoj ter pridelek rastline. Bandelj, D., Z. Jenko Pražnikar in A. Petelin, ur. 2025. 47 Laški smilj. Založba Univerze na Primorskem Dunja Bandelj in Matjaž Hladnik GENOM AGROEKOSISTEM genotip, zapis DNA AGROEKOSISTEM VETER, FENOTIP SONCE morfologija, TLA: biokemija, fiziologija HRANILA, ORGANIZMI VODA METABOLOM PADAVINE, VLAGA metabolno profiliranje– raznolikost bioloških molekul TEMPERATURA Farmacija Fitofarmacija Aromaterapija Kozmetika Živilska industrija Slika 1 Prikaz ekoloških dejavnikov v agroekosistemu, ki vplivajo na fenotip in posledično na metabolom izvlečkov laškega smilja Svetloba Sončna svetloba je primarni vir energije v ekosistemih, ki jo rastline prestrežejo s fotosintetskim aparatom in s fotosintezo pretvorijo v kemij- sko energijo, ki se vgradi v biomaso oz. organske spojine rastline. Svet- loba, ki neposredno vpliva na rastline, vključuje ultravijolično svetlobo (UV), vidni spekter (400 in 760 nm) ter nevidni infrardeči spekter (IR) (800 in 3000 nm). UV v interakciji z vidnim spektrom pospešuje tvorbo rastlinskih pigmentov iz skupine antocianov, svetlobna energija vidnega spektra pa je pomembna za fotosintezo rastlin. Infrardeča svetloba vpliva na hormone, ki so vključeni v kalitev in regulirajo odziv rastline na dolži- no dnevne svetlobe, medtem ko svetloba z valovno dolžino nad 3.000 nm segreva (Gliessman 2014). Kakovost, intenziteta in čas trajanja fotosintet- sko aktivne svetlobe so ključnega pomena za rastlino. Laški smilj je izrazito heliofilna rastlina, zato so zanj primerne le dobro osončene lege. Osvetlitev omogoča tudi primerna sadilna razdalja med vrstami in v vrsti. Nepravilna izbira lege in slaba osvetljenost nasada bosta negativno vplivali na vegetativno prirast, slabši bo razvoj cvetnih poganjkov in pričakovati je časovni zamik v fenoloških fazah. Ker sekun- darni presnovki nastajajo kot odgovor na dejavnike iz okolja, se lahko spremeni tudi sinteza nekaterih sekundarnih presnovkov. V senčnih le- gah se lahko poveča tudi tveganje za razvoj glivičnih obolenj ali razmno- ževanje škodljivcev. 48 Pridelava laškega smilja Temperatura Temperatura neposredno vpliva na rast in razvoj rastlin. Rastline imajo omejitve, zato so razvile različne tolerance na ekstremno nizke ali visoke temperature. Pri izbiri lokacije je treba preučiti povprečne dnevne tem- perature, razlike v temperaturi med dnevom in nočjo ter letnimi časi. Pomembno je pridobiti tudi podatek o pogostosti ekstremno visokih ali nizkih temperatur. Na temperaturo, vlažnost zraka in prisotnost vetrov vplivata tudi topografija ter bližina vodnih površin, gozda ali urbanega naselja. Učinki visokih temperatur na rastline so rezultat kompleksne in- terakcije procesov v rastlini. Rastline izgubljajo vodo, poveča se propust- nost membran, pojavijo se motnje v transportu, zaradi inaktivacije enci- mov in drugih pomembnih beljakovin se zmanjša presnovna aktivnost, hkrati pa se lahko tvorijo presnovki, s katerimi rastlina poskuša kljubovati stresu. Ta proces je za rastlino energetsko potraten. Če dihanje rastline preseže aktivnost fotosinteze, se rast ustavi. Vztrajanje previsokih tempe- ratur lahko vodi v celično smrt, ki jo na rastlini opazimo v obliki kloroz in ožigov (Bandelj in Baruca Arbeiter 2020). V večini primerov je funkcija listov oslabljena pri temperaturi 42 °C, letalne temperature pa so med 50 in 60 °C. Rastline so za presežek temperatur razvile številne prilagoditve, kot so manjši, svetlejši, beli do sivi listi, ki odbijejo svetlobo in absorbirajo manj toplote, dlakavost, vertikalna orientacija listov ter obsežnejši kore- ninski sistem, ki omogoča večjo absorpcijo vode. Tudi nizke temperature vplivajo na rastlino. Pri padcu temperature se presnova upočasni in rastli- na preide v mirovanje. Pri padcu temperature pod ledišče se v citoplaz- mi celic formirajo kristali, ki poškodujejo membrane in celične organele. Poškodbe celic in tkiv so odvisne od trajanja nizke temperature, hitrosti ohlajanja ozračja ter spremljajočih dogodkov (Gliessman 2014). Posebnih raziskav, ki bi poročale o idealnih temperaturah za gojenje laš- kega smilja, ni na voljo. Laški smilj zelo dobro tolerira širok razpon tem- peratur, saj uspeva na morski obali pa vse do 800 m (Ciccarelli idr. 2016) oz. 1.700 m nadmorske višine (Melito idr. 2016). Uspeva tudi na obmo- čjih s snežno odejo, kjer le-ta deluje kot toplotni izolator z vzdrževanjem kons tantne temperature. Visoke temperature mu ne povzročajo težav, ker je nanje prilagojen in uspeva v zelo vročih, suhih poletjih z močnim sončnim sevanjem. Taka rastišča so značilna za peščene sipine in obalne klife v Sredozemlju, kjer so pogoji za rast izredno ekstremni zaradi plitvih in s hranili siromašnih tal, pomanjkanja vode, intenzivne sončne svet- lobe, pršenja morske vode in povečane koncentracije soli ter močnega vetra (Ciccarelli idr. 2016). 49 Dunja Bandelj in Matjaž Hladnik Padavine in vlaga Padavine so v sredozemskem okolju najpomembnejši omejitveni dejav- nik okolja v kmetijski pridelavi. Pri načrtovanju lokacije nasada je treba preučiti povprečno letno količino padavin, razporeditev, periodičnost, intenziteto, čas trajanja ter dostopnost vode rastlinam. V Sloveniji je v zadnjih dveh desetletjih možno zaznati spremembe v padavinskem re- žimu. Razporeditev padavin skozi leto ne sledi več običajnemu vzorcu jesensko-zimskih in spomladanskih viškov, temveč so padavine časovno nepredvidljive. Pogosto jih primanjkuje izven rastne dobe. Te padavine so za kmetijsko pridelavo pomembne, saj ustvarijo vodne rezerve v tleh za poletni čas, ko padavin običajno ni. Ker pa je laški smilj prilagojen na pomanjkanje vode, poletna suša nanj ne vpliva. Na Korziki, denimo, kjer obdelujejo preko 100 ha površin laškega smilja, so rastline v rastni dobi izpostavljene dolgemu sušnemu obdobju, vendar rastlin ne namakajo. Podobno velja za slovenske razmere. S tega vidika je laški smilj rastlina, primerna za območja, ki so izpostavljena dolgotrajni suši. Obratno pa območja z veliko padavin, v kombinaciji s težkimi, slabo odcednimi tle- mi, negativno vplivajo na rast in razvoj rastlin. V težkih in mokrih tleh se ustvarijo ugodne razmere za razrast talnih gliv, ki zamašijo prevodni sistem in uničijo rastline. Prilagodljivost laškega smilja na sušni stres potrjujejo tudi raziskave. Tonka Ninčević idr. (2021) so z analizo genetske raznolikosti in pod- nebnih dejavnikov na vzhodni jadranski obali ugotovili, da je imel sušni stres najverjetneje pomembno vlogo pri prilagajanju na okolje in obliko- vanju genetske raznolikosti populacij jadranskega laškega smilja. Carla Cesaraccio idr. (2004) so pri preučevanju vpliva suše na fenološke faze H. italicum ugotovili, da v neugodnih, sušnih razmerah rastlina preki- ne vegetativno rast. Ker je laški smilj predstavnik sušnih, polzimzelenih rastlin, se okolju s pomanjkanjem vode prilagaja z odpadanjem oz. s su- šenjem listov, s čimer zmanjšuje celotno listno površino, zato uporablja strategijo izogibanja (Ciccarelli idr. 2016). Laški smilj ima tudi zelo plitke korenine, kar mu omogoča, da prestreže zračno vlago in roso, ki nasta- ne na tleh ponoči in predstavlja pomemben vir vode v okoljih, kjer le-te primanjkuje (Antunes idr. 2018). Sušni stres v sredozemskem podnebju navadno spremljajo visoke temperature in višja raven sončnega sevanja, ki skupaj povzročajo fotoinhibicijo (zmanjšanje fotosintetske aktivno- sti, pri čemer rastlina ne porablja več ogljikovega dioksida, ampak za- radi celičnega dihanja porablja le kisik in proizvaja ogljikov dioksid) in fotooksidacijo (oksidacija, ki jo povzroči svetloba in vodi do nastanka 50 Pridelava laškega smilja hidroperoksidov), ki prispevata k nastanku reaktivnih kisikovih spojin, ter fotorespiracijo (svetlobno dihanje), ki ščiti fotosintetski aparat pred fotoinhibicijo (Zhang idr. 2016). Rastline poskušajo to uravnotežiti s sin- tezo neencimatskih in encimatskih spojin, sekundarnih presnovkov/an- tioksidantov/osmoprotektorjev, s katerimi se inducira fiziološka in mo- lekularna obramba (Caser idr. 2016). Spojine ščitijo celične membrane in proteine v obdobju pomanjkanja vode ter reaktivnim kisikovim spoji- nam preprečujejo, da bi uničile fotosistem v kloroplastih, kjer na tilako- idnih membranah poteka fotosinteza (Bandelj in Baruca Arbeiter 2020). Raziskav, ki bi natančeje opisale fiziološke in biokemijske odzive laškega smilja na sušo, zaenkrat ni na voljo. So pa raziskave sorodne vrste He- lichrysum petiolare pokazale, da močan stres zaradi pomanjkanja vode drastično zniža suho maso nadzemnega in podzemnega dela, vsebnost klorofila in karotenoidov, vodni potencial listov, učinkovitost rabe vode, stopnjo transpiracije, stomatalno prevodnost, neto stopnjo fotosinteze in antioksidativno delovanje. Zmerni sušni stres pa je povzročil le majhne spremembe v fiziologiji. Vplival je na povečanje količine monoterpen- skih ogljikovodikov in oksigeniranih seskviterpenov, kar Caser idr. (2016) ocenjujejo kot pozitivno, saj te spojine bogatijo rastlinske izvlečke. Laški smilj samoniklo v naravi uspeva v zelo suhem in tudi vlažnem oko- lju ob morju. Relativna zračna vlaga zraka bo v agroekološkem sistemu imela bistveno večji vpliv. Več vlage lahko pričakujemo v nasadih v pri- obalnem pasu in v nižjih legah ter v bližini gozda. Čeprav posebnih raz- iskav za laški smilj ni na razpolago, lahko iz izkušenj v kmetijstvu pred- videvamo, da povečana vlaga povečuje možnost pojava glivičnih okužb, zato za laški smilj v vsakem primeru svetujemo izbiro prevetrene lege. Veter Veter ni vedno prisoten ekološki dejavnik. V agroekosistemu je pomem- ben, saj vpliva na razporeditev toplote in prispeva k regulaciji zračne vlage. Njegov vpliv je odvisen od jakosti in časa trajanja. Na območjih s konstantnimi vetrovi (bližina morja, gorovja) je pričakovati močnejši vpliv. Prisotnost rahlega vetra v pridelovalnih sistemih zmanjšuje vlago in tako preprečuje širjenje patogenih gliv. Prav tako veter v nasadu zni- žuje temperaturo in blaži vpliv močnega sončnega sevanja. Pri rastlinah ima vpliv na dinamiko odpiranja in zapiranja listnih rež pri transpiraciji. Posledično določa status vode v rastlini, večje izgube nastajajo pri hitro- sti vetra nad 10 km/h. Rastlina izgubo kompenzira z vlekom vode iz tal in s premeščanjem vode iz koreninskega sistema v liste. Pretirana izguba 51 Dunja Bandelj in Matjaž Hladnik Slika 2 H. italicum subsp. tyrrheni- cum na jugu Korzike vode lahko vpliva na fotosintezo in privede do počasnejše rasti (Bandelj in Baruca Arbeiter 2020; Gliessman 2014). Zaradi močnega vetra lahko rastline laškega smilja pred žetvijo poležejo, zato je lahko spravilo pridelka nekoliko težavnejše. V naravi laški smilj uspeva na obali, ki je zelo izpostavljena ostrim pogojem z močnimi vet- rovi (npr. rt Kamenjak na istrskem polotoku), zato laški smilj močan ve- ter tolerira. V nekaterih primerih pa lahko opazimo tudi rastline nižje, pritlikave rasti, kar je ena od prilagoditev ostrim pogojem. Take rastline laškega smilja uspevajo na kamnitih in peščenih sipinah obale na jugu Korzike, ki so taksonomsko uvrščene v podvrsto tyrrhenicum (slika 2). Tla Tla so kompleksna, živa, spreminjajoča se in dinamična komponenta ag- roekosistema. Z razpoložljivostjo tehnologij v današnji kmetijski praksi, ki se poslužuje mehanske in kemijske obdelave tal, se lahko hitro spre- minja razmere v tleh. Tla se običajno obravnava kot medij za rast rastlin in se kompleksnim ekološkim procesom namenja premalo pozornosti. V zadnjem obdobju se raziskave na tem področju usmerjajo v preučevanje mikrobne združbe, ki ima ključno vlogo pri regulaciji bioloških, kemijskih 52 Pridelava laškega smilja Slika 3 Rastišče laškega smilja na granitni podlagi na Korziki in fizioloških procesov vzpostavljanja ter ohranjanja rodovitnosti tal. Po- membni dejavniki so tekstura, struktura, gostota, poroznost, prisotnost zraka in vode v tleh, pH tal, vsebnost hranil in organske snovi ter biotska pestrost v tleh (Bandelj in Baruca Arbeiter 2020). Laški smilj uspeva na apnenčasti, granitni (slika 3) ali vulkanski podlagi. Bianchini idr. (2009) so preučevali vpliv parametrov tal na sestavo ete- ričnega olja laškega smilja na Korziki. Ugotovili so velik vpliv teksture in kislosti. Vsebnost anorganskih spojin (Ca, Na, Fe, Mn, Zn, Cu, N, P, Mg, K) v tleh je imela nekoliko manjši vpliv na sestavo eteričnega olja. Po- zitivno korelacijo so ugotovili za Zn in Mn z monoterpenskimi ogljiko- vodiki. Ugotovili so povezanost vsebnosti neril-aceteta z relativno nizko kislostjo, nizkim odstotkom gline, finega peska in grobega melja oz. viso- kim odstotkom grobega peska in drobnega melja. Avtorji poudarjajo, da je sestava eteričnega olja lahko odvisna tudi od sončnega sevanja, razpo- ložljivosti vode oz. drugih ekoloških dejavnikov, ki pa niso bili predmet omenjene raziskave. Laški smilj je prilagojen na siromašna tla z minimalno vsebnostjo hranil (Pohajda idr. 2015), uspeva pa tudi v pesku (slika 4). Ines Pohajda idr. (2015) menijo, da kisla tla niso primerna za sajenje laškega smilja, gojen je 53 Dunja Bandelj in Matjaž Hladnik Slika 4 Peščeno rastišče H. itali- cum subsp. tyrrhenicum na jugu Korzike pa se lahko načrtuje v karbonatnih, dobro odcednih, lahkih, peščenih, plitkih in ilovnatih tleh. Po izkušnjah UP FAMNIT so srednje težka tla lah- ko že mejna, saj se tako kot pri težkih tleh lahko pojavijo okužbe s talni- mi glivami, ki največkrat vodijo v postopno propadanje rastlin. Laškega smilja zato ne sadimo v tla, ki so slabo propustna in se v njih zadržuje voda. V slovenskih razmerah se nasadi laškega smilja nahajajo večinoma na lažjih in srednje težkih tleh v slovenski Istri ter na Krasu. Kar nekaj raziskav je bilo opravljenih na področju onesnaženosti tal in vpliva le-teh na laški smilj. V Toskani (Italija) so Bini idr. (2016) preučevali vpliv tal, onesnaženih z nekaterimi težkimi kovinami (Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb, Zn) na rastline laškega smilja. Z mikroskopsko analizo listov so ugotovili, da se pri rastlinah pojavijo spremembe v organizaciji celic. Žlezni trihomi rastlin z onesnaženega območja so deformirani, saj imajo popolnoma drugačno morfologijo. Sestavljeni so samo iz daljšega peclja, ki ga tvorijo 3–4 celice in na vrhu katerega je ena izločalna celica. Tudi palisadno tkivo je manj organizirano in zmanjšana je debelina listov. Bini idr. (2016) menijo, da rastline po strukturi celic kažejo na določeno stop- njo odpornosti, zato bi se lahko laški smilj uporabljal za projekte remedi- acije tal. Podobno je pokazala tudi raziskava na Sardiniji. Rastline laškega 54 Pridelava laškega smilja smilja, ki rastejo na onesnaženih tleh, akumulirajo bistveno več Cd, Ni, Pb in Zn kot rastline, ki rastejo na neonesnaženih tleh, pri Cu pa niso odkrili bistvenih razlik. Rastline so zaradi povišanih koncentracij težkih kovin za ekstrakcijo neprimerne, lahko pa se uporabijo za fitoremediacijo, saj so večinoma tolerantne, predvsem za Cd, Pb in Zn (Greggio idr. 2022). Razmnoževanje in priprava sadilnega materiala Za vzpostavitev nasada je treba izbrati sadilni material s preverjeno tak- sonomsko identiteto in zdravstvenim stanjem ter z ustreznimi kemijski- mi karakteristikami glede na cilj gojenja. Pri taksonomski klasifikaciji moramo biti pozorni na informacijo o vrsti in podvrsti. Od ponudnika zahtevamo informacije o izvoru in o njegovi sledljivosti, še posebej v primeru, če nismo usposobljeni za morfološko ločevanje podvrst ali vrst (Bandelj idr. 2020). Na trgu je veliko ponudnikov sadik in semen in v praksi so se že pojavi- li primeri, ko kljub deklaraciji o vrsti, potrjeni s strani certifikacijskega organa, taksonomska identiteta ni bila pravilna. Pojav smo zaznali tudi na UP FAMNIT, ko smo kupili certificirano seme vrste H. italicum, v na- sadu pa opazili odstopanja v morfologiji in vsebnosti eteričnega olja. Z genetskim profiliranjem DNA smo ugotovili, da gre za popolnoma dru- go vrsto (Helichrysum litoreum) (Baruca Arbeiter idr. 2021; Hladnik idr. 2023), ki zaradi izjemno nizke vsebnosti eteričnega olja in drugačnega vonja ni ustrezala namenu pridobivanja eteričnega olja. V fazi razvoja sa- dik iz semen in sajenja mladih rastlin ni bila možna identifikacija vrste, saj rastline še niso bile dokončno morfološko razvite. V takih primerih lahko pride do ogromne gospodarske škode s finančnimi posledicami, še posebej če z napačnim sadilnim materialom zasadimo večjo površi- no nasada. O podobnem primeru poročajo tudi na Hrvaškem (Baruca Arbeiter idr. 2021). Dobra praksa, ki bi jo veljalo vpeljati v drevesnice, je kontrola identitete vrste z označevalci DNA, ki bi jo lahko opravljale inštitucije s kompetencami in z znanjem za genetsko profiliranje rastlin. Na podlagi izkušenj in raziskovanja genskih virov laškega smilja agro- nomi svetujemo izbor podvrste, ki uspeva prosto v naravi geografskega območja, kjer je nasad načrtovan. Običajno so nativni genski viri dobro prilagojeni na ekološke razmere svojega okolja in zato se pričakuje, da bodo uspešni tudi v pridelavi. Če se nasad načrtuje v Sloveniji, je zaradi geografske bližine in podobnosti podnebnih razmer najbolje pridobiti rastline, ki izvirajo iz severovzhodne obale Jadranskega morja oz. istrske- ga polotoka ali severnega Jadrana. Na trgu so zaradi prostega trgovanja 55 Dunja Bandelj in Matjaž Hladnik s sadilnim materialom v Evropski uniji razpoložljive tudi sadike iz držav, kjer laški smilj ni nativen (npr. sadike iz Nemčije, Avstrije, Velike Brita- nije). Tudi anketiranje v okviru Ciljno raziskovalnega projekta V4-2207 Možnosti razvoja zeliščarstva v Sloveniji (2022–2024) slovenskih pridelo- valcev smilja je pokazalo raznolikost porekla sadilnega materiala. Večina (48 %) pridelovalcev je sadike laškega smilja kupila v Sloveniji, sledijo Italija in Hrvaška (vsaka z 11 %) ter Avstrija (7 %), medtem ko imajo posa- mezne kmetije sadike s Korzike in iz Nemčije. Poleg tega je večina pride- lovalcev (70 %) sadike kupila, 19 % pa jih je poročalo o lastni proizvodnji. V primeru nepoznavanja natančnega geografskega izvora sadilnega ma- teriala se svetuje predhodno testiranje v slovenskih ekoloških razmerah. Preizkušanje potenciala rastlin v introdukcijskem nasadu, kjer se ugota- vlja uspešnost rastlin v domačem okolju, je osnovna dobra praksa v kme- tijstvu. Vrednotenje tujih genskih virov običajno poteka več zaporednih let, z namenom, da se izniči vpliv variabilnosti zaradi vremenskih razmer ter da se ugotovi, kako bodo izbrane agronomske tehnologije vplivale na rast in razvoj, cvetenje, vsebnost in kemijsko sestavo eteričnega olja ter katere bolezni ali škodljivci bi lahko potencialno ogrožali pridelavo. Preizkušanje potenciala rastlin je potrebno tudi v primeru, če si sadilni Preizkušanje potenciala rastlin 4. korak 3. korak GOJENJE 2. korak Vrednotenje rastlin, selekcija in odbira 1. korak najboljših kandidatov Razmnoževanje za gojenje s semeni ali potaknjenci, sajenje Nabiranje rastlinskega v poskusni nasad materiala na naravnih rastiščih, nakup sadilnega materiala populacije/kupljen Prostorastoče Selekcija rastline in Razmnoževanje Poljski poskusi superiornih genotipov sadilni material VREDNOTENJE Morfološke, genetske, kemijske analize Agronomske lastnosti (pridelek, odpornost) Farmakološka aktivnost Slika 5 Preizkušanje potenciala in izbira najboljših rastlin laškega smilja za pridelavo potekata v več korakih 56 Pridelava laškega smilja material zagotovimo sami z nabiranjem semen ali rezanjem potaknjen- cev v naravi. Koraki preizkušanja potenciala rastlin v introdukcijskem na- sadu so prikazani na sliki 5. Razmnoževanje laškega smilja lahko poteka generativno s semeni ali ve- getativno s potaknjenci. Mnogi zeliščarji se poslužujejo nabiranja semen in poganjkov za potaknjence v naravi ter domače vzgoje sadik. V Sloveniji smo dolžni za odvzem iz narave pridobiti dovoljenje v primeru, ko gre za ogrožene prostoživeče rastlinske vrste, ki so zavarovane z Uredbo o za- varovanih prosto živečih rastlinskih vrstah (2004). Sestavni del uredbe je tudi priloga, v kateri so določene vse ogrožene in mednarodno varovane rastlinske vrste, vendar laški smilj ni uvrščen na seznam zavarovanih ra- stlinskih vrst na območju Slovenije, kar je pričakovano, saj pri nas trenut- no ni evidentiranih populacij ali naravnih rastišč laškega smilja. Slednje pomeni, da v naravi ni možno pridobiti razmnoževalnega materiala. V primeru nabiranja sadilnega materiala v naravi v drugi državi je tre- ba upoštevati nacionalno in mednarodno zakonodajo oz. uredbe, ki urejajo dostop do genskih virov. Evropska unija se je pravno zavezala k Nagojskemu protokolu h Konvenciji o biološki raznovrstnosti, ki ureja pošteno in pravično delitev uporabe genskih virov. Konvencija o biolo- ški raznovrstnosti priznava suverene pravice držav do njihovih naravnih virov. Pogodbenice protokola so pristojne za odločanje o tem, ali želijo urediti dostop do svojih genskih virov in določiti pogoje za delitev koristi, ki izhajajo iz uporabe genskih virov (»Dostop do genskih virov in delitev koristi, ki izhajajo iz njihove uporabe (Nagojski protokol)« 2020). Na Hrvaškem je laški smilj uvrščen na listo zaščitenih rastlin (Pravilnik o proglašavanju divljih svojti zaštićenim i strogo zaštićenim 2009, Priloga III), zato je za njegovo nabiranje za namene destilacije ali trženja potreb- no dovoljenje, ki ga izda Ministrstvo za varstvo okolja in narave. Dovo- ljenje lahko izdajo samo za lokacije, kjer rastline niso ogrožene (Pohajda idr. 2015), in prav tako natančno definirajo količino rastlinskega materi- ala, ki se ga lahko nabere. V primeru, če se odloči za pridobitev razmno- ževalnega materiala v drugi državi, je treba glede tam veljavne zakono- daje in regulativnih zahtev o dostopu ter delitvi koristi od rabe genskih virov kontaktirati tamkajšnjo nacionalno kontaktno točko za izvajanje Nagojskega protokola. Glede na zahtevno regulacijo prenosa sadilnega materiala med državami se svetuje, da se sadilni material zagotovi pri uradnih slovenskih dobaviteljih. Pri nenadzorovanem prenosu rastlin iz druge države se je treba zavedati tveganj vnosa rastlinskih patogenov, ki lahko ogrozijo celotno rastlinsko 57 Dunja Bandelj in Matjaž Hladnik pridelavo v Sloveniji, zato se tak način vnosa v državo odsvetuje. Nepo- znavalci fitopatologije in entomologije običajno niso pozorni na znake okužb, po drugi strani pa rastline, ki se jih prenaša, morda ne kažejo znamenj okužb in se le-te pokažejo šele kasneje v pridelavi. Zato je zelo pomembno, da rastline pregleda fitopatolog. Fitosanitarno spričevalo se dosledno zahteva za rastline, ki izhajajo iz držav izven EU (Finančna uprava Republike Slovenije 2022), pri prenosu znotraj EU pa le za tiste rastlinske vrste, kjer je visoko tveganje v zvezi z določenimi škodljivimi organizmi. Tak primer je bakterija Xylella fastidiosa, ki povzroča propad številnih rastlin, med njimi citrusov, oljk (bakterijski ožig oljk) in trte, zato so te rastline pri prenosu znotraj EU ustrezno pregledane in spremljane. Gostiteljske rastline te bakterije pa so številne aromatične rastline, med njimi tudi laški smilj, zato je vsakršno nekontrolirano vnašanje v državo zelo tvegano. Do leta 2010 se je bakterija pojavljala samo v severni in juž- ni Ameriki, v Aziji (Tajvan) so jo odkrili leta 2013, na sredozemskih vrstah in v urbanem okolju pa so jo v Evropi odkrili v Španiji, Italiji, Franciji in na Portugalskem (EPPO Global Database: https://gd.eppo.int/). S tega vidika je torej zelo pomembno, da se rastlinskega materiala ne prenaša z okuženih območij (Bandelj idr. 2024). V primeru prenosa rastlinskega materiala znotraj EU za potrebe trgovanja pa je treba upoštevati pred- pise, določene z zakonodajo EU, pri čemer mora biti rastlinski material opremljen z rastlinskim potnim listom. Načini razmnoževanja laškega smilja Generativno razmnoževanje Seme laškega smilja je zelo drobno, podolgovate oblike in črne barve. V enem gramu je običajno od 3.300 do 3.700 semen (Pohajda idr. 2015). Po izkušnjah UP FAMNIT je kaljivost kupljenega semena približno 50-odstot na, podatki o kaljivosti semena iz narave pa niso razpoložljivi. Rastline, ki so razmnožene s semenom, razvijejo generativni koreninski sistem, ki ga tvorijo glavna in stranske korenine. Običajno so rastline od- pornejše na sušo, saj koreninski sistem prodira globlje v talni profil. Pri vzgoji sadik iz semen se seme poseje v kakovosten substrat, za 1 m2 za- dostuje 0,5 g semena. Tako se pridobi od 300 do 400 sadik, ki so po treh mesecih primerne za saditev na prostem (Pohajda idr. 2015). Pri razmno- ževanju laškega smilja s semenom se pričakuje izjemno heterogenost in raznolikost rastlin. Vzrok sta navzkrižna oprašitev in oplodnja ter posle- dično edinstvena garnitura genov v vsaki posamezni rastlini (Bandelj idr. 2020). Rastline, vzgojene iz semena, bodo v nasadu neizenačene, kar ima 58 Pridelava laškega smilja lahko določene prednosti, kot npr. možnost različne odpornosti na biot- ske ali abiotske dejavnike. Po drugi strani pa se lahko neizenačenost kaže v različnih kemotipih posameznih rastlin in časovno različnem nastopu posameznih fenofaz. Vegetativno razmnoževanje Za pripravo večjih nasadov laškega smilja se svetuje izbiro vegetativno razmnoženih sadik, ki omogočajo pridelavo stabilnega pridelka z ize- načenimi kakovostnimi lastnostmi. Vegetativno razmnožene sadike se pripravi iz poganjkov matičnih (izvornih) rastlin, ki morajo biti popolno- ma zdrave. Potaknjence se pripravlja v zaščitenem prostoru. Za njihovo pripravo se vzame letošnje poganjke z grmičkov, ki imajo dobro razvit in olesenel bazalni del. Poganjke se nareže na dolžino od 4 do 6 cm. V spod- njem delu se liste odstrani, na zgornjem pa liste pustimo. Po izkušnjah UP FAMNIT tretiranje s hormoni za pospešitev razvoja korenin ni pot- rebno. Pripravljene poganjke se nato potika v kakovosten substrat. Potak- njencem je treba zagotoviti dovolj vode, visoko relativno zračno vlago in primerno osvetlitev. Ko rastline dobro razvijejo koreninski sistem in pri- merno odženejo, se jih presadi v lončke. Potaknjence se lahko pripravlja v spomladanskem in jesenskem času. Celoten proces razmnoževanja v zaščitenem prostoru poteka od štiri do pet tednov (Pohajda idr. 2015). Na UP FAMNIT smo v letu 2024 izvedli poskus razmnoževanja sedmih različnih genotipov – križancev laškega smilja. Iz matičnih rastlin smo pridobili potaknjence, ki so bili brez predhodnega tretiranja s hormoni vloženi v kakovosten substrat. Preživetje (in koreninjenje) klonov je bilo odvisno od genotipa; najnižje ugotovljeno preživetje rastlin je znašalo le 16,7 %, najvišje pa 90,5 %. Razmnoževanje s tkivnimi kulturami Laški smilj se dobro odziva tudi v tkivni kulturi. V tem primeru gre za vzgojo rastlinskega materiala in vitro, v sterilnih razmerah na definiranih trdih ali tekočih hranilnih podlagah ali gojiščih. Zaradi dela v sterilnih razmerah je možnost prenosa okužb s patogeni manjša v primerjavi z drugimi načini razmnoževanja. Z mikropropagacijo, kot imenujemo hit- ro in vitro razmnoževanje rastlin s pomočjo tehnik tkivnih kultur, lahko v laboratoriju vzgojimo veliko število rastlin. Za izvorni material za vzpo- stavitev tkivne kulture uporabimo apikalne (terminalne) in aksilarne (la- teralne ali stranske) brste. Preden se poganjke razreže na izsečke (deli poganjka z enim ali več kolenci), jih je treba najprej temeljito razkužiti. 59 Dunja Bandelj in Matjaž Hladnik Izsečke se pripravi v sterilnih pogojih, v brezprašni komori, ter se jih na- mesti v pripravljeno sterilno gojišče. Gojišče poleg drugih komponent vsebuje makro- in mikrohranila, vitamine in hormone oz. rastne regu- latorje, ki v fazi vzpostavitve tkivne kulture in razmnoževanja uravnava- jo rast poganjkov, v kasnejši fazi (faza koreninjenja) pa razvoj korenin. Pos kusi mikropropagacije so pokazali, da sta za laški smilj primerna oba medija, MS (Murashige in Skoog) in DKW (Driver in Kuniyuki), ki so jima dodali različne citokinine v koncentraciji 5 μM (benzilaminopurin (BAP), kinetin ali zeatin), 0,005 μM avksina indol-3-maslene kisline (IBA), 30 g/L saharoze in 6,5 g/L agarja. Najvišji delež rastlin sta Nataliya Dimitrova in Lilyana Nacheva (2018) dobili z medijem DKW ob dodatku 5 μM kineti- na. Koreninjenje je potekalo v gojišču MS s polovično količino makroele- mentov in z dodanim avksinom, ki je bil tokrat v višji koncentraciji v pri- merjavi s predhodnim gojiščem (0,1 mg/L ali 0,2 mg/L), in sicer IBA ali naftalenocetno kislino (angl. Naphthaleneacetic acid – NAA). Visok delež koreninjenja so dosegli na vseh testiranih medijih. Skoraj 100-odstotno koreninjenje so zabeležili pri kontrolnem gojišču brez dodanega rastne- ga regulatorja, vendar pa je dodatek IBA ali NAA pripomogel k večjemu številu korenin pri posamezni rastlini (razen v primeru gojišča z 0,2 mg/L NAA, pri katerem je bilo število korenin manjše v primerjavi s kontrolo) ter k višjim rastlinam (Dimitrova in Nacheva 2018). Rastlinski material, poganjke in ukoreninjene rastline se goji v rastni komori, kjer je možna regulacija dolžine osvetlitve (fotoperioda), temperature, valovne dolžine in intenzitete svetlobe. Po štirih tednih poganjki običajno dosežejo dolži- no 3–4 cm in razvijejo pet do šest kolenc. Ko rastline razvijejo koreninski sistem, se jih posadi v lončke s substratom in sledi faza aklimatizacije v rastlinjaku (Perrini idr. 2009). Različne načine razmnoževanja laškega smilja so preučevali tudi Asya Kozhuharova idr. (2019), ki so za gojenje in vitro kot začetni material upo- rabili semena in vršičke poganjkov ter potaknjence za hidroponsko raz- množevanje. V začetni fazi, po nanosu semen in izsečkov na gojišče, so ugotovili visoko stopnjo kontaminacije z mikroorganizmi, saj je preživelo le 55,8 % semen in večina izsečkov je propadla zaradi nekroz ali priso- tnosti gliv. Kaljivost semen so spodbudili z dodatkom giberelinske kisline (GA3) (0,1 %) in tako dosegli 24,4-odstotno kaljivost, medtem ko so kul- turo vršičkov poganjkov brez okužb z glivami pridobili na gojišču z do- danim antibiotikom. Na sistemu hidroponike pa se je ukoreninilo 77,8 % potaknjencev. Oba postopka, in vitro in hidroponski, sta se pokazala kot učinkovita ter omogočila razmnožitev rastlinic v obdobju šestih mesecev. 60 Pridelava laškega smilja Slika 6 Tkivna kultura laškega smilja in oprema za delo s tkivnimi kulturami Od začetka razmnoževanja laškega smilja z vršički poganjkov v tkivni kul- turi z metodami in vitro pa do razvoja cvetočih rastlin v kolekcijskem na- sadu je bilo potrebnih 18 mesecev (Kozhuharova idr. 2023). Na UP FAMNIT smo rastline laškega smilja v tkivni kulturi vzgojili iz se- mena. Za delo s tkivnimi kulturami je potrebna posebna laboratorijska oprema kot, denimo, brezprašna komora za delo v sterilnih pogojih (slika 6) ter rastna komora, kjer v reguliranih pogojih vzdržujemo tkivne kulture. Priprava in oskrba nasada laškega smilja Laški smilj se goji kot trajnico od pet do osem let (Pohajda idr. 2015), zato se je treba načrtovanja in vzpostavitve nasada lotiti skrbno. Ključna je izbira ustrezne lokacije, ki mora temeljiti na osnovi analiz okoljskih razmer in tal. Nato je treba ustrezno pripraviti tla, izdelati sadilni načrt, priskrbeti ustrezen sadilni material in sajenje izvesti z ustreznimi sadil- nimi razdal jami. Z drevesnicami ali vrtnarijami se je treba pravočasno dogovoriti za dobavo in nakup sadilnega materiala. Izbira lege z ustreznimi ekološkimi razmerami je ključen dejavnik us- pešnosti pridelave. Kot je opisano v poglavju »Pridelava laškega smilja« (razdelek Agroekološke zahteve laškega smilja), so tla ključen dejavnik, zato se izbere le takšna, kjer ne prihaja do zastajanja vode. Priprava tal mora biti osredotočena na aktivnosti, ki bodo zagotovile optimalne raz- mere za rast in razvoj rastlin že od samega začetka. Priporoča se globlje 61 Dunja Bandelj in Matjaž Hladnik oranje in rahljanje talne grude spomladi ali jeseni pred sajenjem. Nujno je opraviti tudi analize tal, da se pridobi podatke o vsebnosti makro- in mikrohranil. Na osnovi kemijske analize kmetijski svetovalci pripravijo gnojilni načrt, po katerem se tla založno gnoji pred globokim oranjem. Zelišča se gojijo po ekološki shemi, zato je treba upoštevati smernice za ekološko gnojenje. Priporočljivo je tudi, da so tla predhodno obogatena z organsko snovjo, kar se lahko doseže s predhodnim gojenjem predpo- sevka ali podorin. Laški smilj se običajno sadi spomladi (marec, april) ali jeseni (septem- ber, oktober). Na manjših površinah, kjer se bo laški smilj gojil za hobi in lastne potrebe, lahko sajenje poteka ročno. Na večjih površinah pa bo sajenje lažje s pomočjo strojev. Pri določanju razdalje med vrstami se upošteva tudi delovno širino strojev za obdelavo tal, ki so na razpolago. Na manjših površinah, kjer bo prevladovala ročna obdelava, se lahko sadi gosteje. Kljub temu da so priporočene razdalje med vrstami in v vrsti 0,7 m x 0,4 m (35.000 sadik/ha) ali 0,6 m x 0,3 m (55.000 sadik/ha) (Pohajda idr. 2015), pa so izkušnje UP FAMNIT pokazale, da se v treh letih rastline tako razrastejo, da je prehod med njimi med žetvijo otežen. Zato se tudi na manjših površinah priporoča razdaljo vsaj 0,7 m x 0,5 m (pribl. 28.000 rastlin/ha, 0,35 m2/rastlino, pribl. 3 rastline/1 m2). V večjih, plantažnih nasadih priporočajo razdalji 0,9 m x 0,4 m in 0,8 m x 0,4 m (Čagalj idr. 2019). Za večje nasade nad 1 ha na UP FAMNIT priporočamo razdaljo vsaj 1,0 m x 0,5 (pribl. 20.000 rastlin/ha, 0,5 m2/rastlino, 2 rastlini/1 m2). Glede na izkušnje večjega pridelovalca laškega smilja v dolini reke Dra- gonje se je za primerno gostoto sajenja izkazala razdalja 1,6 m x 0,8 m (1,28 m2/rastlino, 7.800 rastlin/ha). Sajenje spomladi bo pri mladih rastlinah zahtevalo nekoliko več pozor- nosti glede razpoložljivosti vode, saj so padavine v rastni dobi oz. poleti nepredvidljive in jih običajno primanjkuje, zato je suša zelo pogost pojav. V tem primeru se v prvem letu po sajenju priporoča občasno zalivanje. V jesenskem obdobju so padavine pogostejše, čeprav je lahko tudi jeseni prisotna suša, kar je posledica globalnih podnebnih sprememb in spre- menjenega padavinskega režima. V vsakem primeru je treba biti pozo- ren, da imajo mlade rastline na začetku dovolj vode za nemoten razvoj in dobro ukoreninjenje na polju. Ker je laški smilj dobro prilagojen na arid- na območja, kasnejše dodajanje vode ni potrebno, s čimer prispevamo tudi k ohranjanju dragocenega naravnega vira – vode. 62 Pridelava laškega smilja Redna obdelava tal v nasadu je pomembna in upravljanje s pleveli pred- stavlja največji izziv. Pridelki zelišč in aromatičnih rastlin se lahko zaradi plevelov drastično zmanjšajo. Pleveli z gojenimi rastlinami tekmujejo, jim odvzemajo vodo, hranila, svetlobo in življenjski prostor. Ob neopti- malnem upravljanju plevelov lahko pride do manjših pridelkov in več- jega pojava bolezni ter škodljivcev, saj so pleveli gostiteljske rastline za številne rastlinske patogene. Pleveli zmanjšujejo zeleno maso, vplivajo pa tudi na vsebnost eteričnega olja (Pala in Mennan 2022). Njihova pri- sotnost v požetem materialu lahko pridelek zelišč kontaminira. Primesi niso zaželene, ker lahko prisotnost posebnih presnovkov vpliva na kemij- sko sestavo ali kakovost pridelka. Čeprav je bilo opravljenih nekaj pos- kusov zatiranja plevelov s kemični sredstvi pri zeliščih, pa je zanimanje za ta pristop majhno, saj se spodbuja ekološko pridelavo in metode, kjer je uporaba kemičnih snovi prepovedana (Council Regulation (EEC) No 2092/91 1991 in Council Regulation (EEC) No 2078/92 1992). Ker običaj- ne prakse za zmanjševanje populacije plevelov ne zadostujejo, je velik interes za razvoj učinkovitih agronomskih, bioloških ali fizikalnih metod kot alternativo kemijskim metodam (Carrubba in Militello 2013). Pri zatiranju plevela se najpogosteje poslužuje mehanskega pristopa, kot so puljenje, okopavanje, košnja, mulčenje, osipavanje, rahljanje s pre- kopalniki. Nekateri pridelovalci na manjših površinah uporabljajo tudi prekrivne materiale, kot so zastirke, mulči, razne tkanine (juta), rastlin- ski materiali (pokošena trava, slama, žagovina ...). Zastirke iz umetnih mas – PVC-folije se zaradi ekoloških tveganj počasi umikajo iz pridelave, nadomeščajo pa jih biorazgradljive folije, ki pa so povezane z večjimi fi- nančnimi vložki. Pri tem je treba upoštevati, da s pokrivanjem površin vplivamo na mikroklimo v nasadu, saj spremenimo vlažnost in tempera- turo. Če se uporablja zastirke iz rastlinskih materialov, se lahko spreme- ni tudi dostopnost hranil, razgradnja rastlinskih zastirk pa lahko zaradi sproščanja spojin v okolje na zelišča deluje alelopatsko (Dias 1991). V prihodnosti bo morda zaživela uporaba bioherbicidov iz rastlin, ki lahko zaradi alelopatskih lastnosti zavirajo rast plevelov (Kostina-Bednarz idr. 2023), vendar je na tem področju potrebnih še veliko raziskav. Names- to čiste obdelave se lahko nasad zatravi in se izvaja košnjo med vrstami, kar bo v primeru obilnejših padavin preprečilo erozijo in zbitost tal ter prispevalo k večji biotski raznovrstnosti rastlin in organizmov v medvrst- nem prostoru. Kateri način zatiranja plevelov se izbere, je odvisno tudi od površine nasada, izbranih sadilnih razdalj in razpoložljive mehaniza- cije. Pomembno je, da se plevele kontinuirano odstranjuje. 63 Dunja Bandelj in Matjaž Hladnik Načeloma je laški smilj nezahtevna rastlina za gojenje. V primeru čiste obdelave v nasadu (slika 7) je treba večjo pozornost nameniti oskrbi tal s hranili in z organsko snovjo. Dodajanje hranil in organske snovi se vedno načrtuje na osnovi analize tal ter izdelanega gnojilnega načrta. V ekološki pridelavi gnojenje z lahkotopnimi mineralnimi gnojili ni dovoljeno, lah- ko pa se uporablja gnojila, ki so v ekološki pridelavi dovoljena (organska: kompost, uležan gnoj domačih živali, kupljena organska gnojila, organ- ski ostanki iz rastlinske predelave, gnojenje z mletimi zrni stročnic itd. ter naravna, težko topna mineralna gnojila kot npr. hypercorn (26 % P O ) 2 5 ter kalijev fosfat (50 % K O). Alternativi čisti obdelavi sta sejanje podorin, 2 metuljnic in uporaba naravnih zastirk, ovčje volne (Kmetijsko gozdarska zbornica 2017). V prvih dveh letih po sajenju je pomembno, da se rastline okrepijo, kar se lahko doseže z ustrezno rezjo. Priporočljivo je, da se rastline po cvetenju poreže na višino 10 cm in s tem spodbudi razrast stranskih poganjkov ter krepitev bazalnega dela rastline. V tretjem letu se lahko pričakuje že pol- no razvitost rastlin. V četrtem letu je običajno čas za pomladitev rastlin. Ko spodnji deli grmov začenjajo leseneti, se prirast enoletnih poganjkov Slika 7 Nasad laškega smilja s čisto obdelavo tal 64 Pridelava laškega smilja zmanjša in potrebna je nizka rez, ki bo spodbudila odganjanje iz brstov, ki se nahajajo na olesenelih delih. Pomembno je, da se rez ne opravi prenizko proti koreninskemu vratu, temveč nad delom, kjer se nahajajo brsti. Svetuje se, da se pomladitveno rez opravi v zgodnjem spomladan- skem času. Po izkušnjah UP FAMNIT ima laški smilj odlično regenera- tivno sposobnost ter pomladitvena, močna rez zelo dobro spodbudi rast novih poganjkov. Varstvo laškega smilja Podatkov s področja varstva laškega smilja je v primerjavi z drugimi kme- tijskimi rastlinami manj. Po poročanju slovenskih pridelovalcev in iz pre- gleda literature so bile na laškem smilju v manjšem ali večjem obsegu opažene različne bolezni (preglednica 1) in škodljivci (preglednica 2). Iz Bosne in Hercegovine, območja Hercegovine, kjer laški smilj uspeva na 1.500 hektarjih (Ostojić idr. 2018), poročajo, da so se škodljivci pričeli pojavljati sočasno s širjenjem površin (Ostojić idr. 2019). V nasadih so opazili predvsem gosenice osatnika (Vanessa cardui (Linnaeus, 1758)), kjer so na posamezni rastlini zabeležili tudi po več kot trideset gosenic. Ostojić idr. (2018) navajajo, da so pomembni tudi naslednji škodljivci: gosenice talnih ali zemeljskih sovk (Agrotis spp.), srebrnosivi rilčkar (Phyllobius argentatus (Linnaeus, 1758)) in hrušev rjavček (Phyllobius oblongus (Linnaeus, 1758)). Potrdili so tudi prisotnost listnih uši vrste Macrosiphoniella helihrysi (Remaudière, 1952) (Ostojić idr. 2019). Pre- gledne raziskave Ostojića idr. (2018) ter Pohajde idr. (2015) omenjajo še nekatere molje, kot npr. Bucculatrix gnaphaliella (Treitschke, 1833), Eublemma minutata (Fabricius, 1794), Pyrausta aerealis (Hübner, 1793), Coleophora gnaphalii (Zeller, 1839), Coleophora helichrysiella (Krone, 1909) in Bucculatrix helichrysella (Constant, 1889), vendar v Bosni in Hercegovini ter na Hrvaškem njihova prisotnost oz. škodljivost še ni bila potrjena. V tehnološkem listu za gojenje laškega smilja, ki so ga pripravili v Fran- ciji na Kmetijski zbornici Okcitanija (Occitanie) in v okviru medregijske skupine PPAM BIO1 (Plantes à parfum, aromatiques et médicinales bio- logiques) navajajo, da laški smilj nima ekonomsko pomembnejših ško- dljivcev (Riquet in Sauvaire 2020). 1 PPAM BIO je skupina pridelovalcev za pridelavo eteričnih, aromatičnih in zdravilnih rastlin, pridelanih ekološko. Ustanovila jo je Nacionalna zveza za ekološko kmetij- stvo (Féderation Nationale d‘Agriculture Biologique – FNAB), ki deluje pod okriljem organizacije FranceAgriMer, le-ta pa pod Ministrstvom za kmetijstvo. 65 Dunja Bandelj in Matjaž Hladnik Preglednica 1 Pregled škodljivcev laškega smilja. Red Vrsta Slovensko ime*** Vir (znanstveno ime) Coleoptera Phyllobius argentatus srebrnosivi rilčkar Ostojić idr. (2018) (hrošči) (Linnaeus, 1758)* Phyllobius oblongus rjavček Ostojić idr. (2018) (Linnaeus, 1758)* Diptera Liriomyza spp. listne zavrtalke Ostojić idr. (2018) (dvokrilci) Hemiptera Macrosiphoniella vrsta uši Ostojić idr. (2018) (polkrilci) janckei (Börner, 1939) Macrosiphoniella vrsta uši Ostojić idr. (2019) helichrysi (Remaudière, 1952) Coccidae kaparji iz družine Ostojić idr. (2018) (Stephens, 1829) Coccidae Lygus spp. ščitaste stenice Bandelj idr. (2020) Lepidoptera Agrotis spp. sovke iz rodu Ostojić idr. (2018) (metulji) Agrotis Vanessa cardui osatnik Ostojić idr. (2018) (Linnaeus, 1758)* Tebenna micalis kovinski molj UP FAMNIT (Mann, 1857) Acronicta rumicis kislična sovka Ostojić idr. (2018) (Linnaeus, 1758)* Thysanoptera Frankliniella cvetlični resar Ostojić idr. (2018); (resokrilci) occidentalis Pohajda idr. (2015) (Pergande, 1895)** Opombe * Prepoznani kot pomembnejši škodljivci. ** Predvsem škodljivci v zaprtih prostorih. *** Obstoj slovenskih imen je bil najprej preverjen v Šifrantu imen CIRSIUM (http://www.fito-info.si/APL/Sist/SifrantOrg.htm) ter na portalu IVR (https://www.ivr.si/skodljivi-organizmi/). Od leta 2020, ko je bil vzpostavljen kolekcijski nasad na UP FAMNIT, spremljamo tudi zdravstveno stanje rastlin laškega smilja. Poleg uši in se- dempikčastih polonic (Coccinella septempunctata (Linnaeus, 1758)) ter njihovih ličink (slika 8), ki se z ušmi prehranjujejo, smo v prvih letih opa- zili še ščitaste stenice iz rodu Lygus sp., ki škodo povzročajo s sesanjem rastlinskih sokov (Bandelj idr. 2020). V letu 2024 je v kolekcijskem nasadu v Ospu prvič prišlo do številčnega pojava molja Tebenna micalis (Mann, 1857), katerega gosenice so povzročile veliko škodo z ustvarjanjem rovov v poganjkih in posledično je prišlo do sušenja rastlin (sliki 9 in 10). T. micalis je oligofag, običajno gostuje na rastlinah družine Asteraceae (El- lis 2023), pojavlja pa se od junija do avgusta (UKMoths, b. l.). V primeru 66 Pridelava laškega smilja A B Slika 8 Listne uši (Aphididae) (A) in ličinka sedempikčaste polonice (C. septempunctata) (B) na laškem smilju A B Slika 9 Zapredki gosenic T. micalis (A) in poškodovan osrednji del rastline (B) A B Slika 10 Gosenica (A) in odrasel osebek T. micalis (B) 67 Dunja Bandelj in Matjaž Hladnik številčnega napada na UP FAMNIT svetujemo predčasno žetev laškega smilja, saj so gosenice po rezi bolj izpostavljene zunanjim dejavnikom (npr. visoki temperaturi poleti), kar lahko pripomore k zmanjšanemu preživetju. O škodljivcu poročajo tudi v Franciji (Allegret b. l.). V primeru daljšega obdobja z visoko relativno zračno vlago lahko pride do pojava plesni (Botrytis sp.) na nadzemnih delih rastline ali gliv iz ro- dov Pythium in Rhizoctonia, ki povzročajo gnitje koreninskega sistema in drugih delov rastline (preglednica 2) (Pohajda idr. 2015). V Srbiji na laškem smilju poročajo o pojavu glive ogljene trohnobe soje (Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid) (Pavlović idr. 2015). Glivo so odkrili na rastlinah s hitro sušečimi se listi in temno rjavimi pegami v spodnjem delu rastlin. Za omenjeno bolezen je značilno, da se bole- zenska znamenja pokažejo v vročih in suhih obdobjih, ko so rastline iz- postavljene stresu (Žerjav 2017). Propadnje posameznih rastlin smo opazili tudi v kolekcijskem nasadu UP FAMNIT v Ospu. Glede na vidna znamenja bolezni (slika 11) in genet- ska testiranja je propadanje najverjetneje povezano s patogenimi gliva- mi. V sodelovanju s Kmetijsko gozdarskim zavodom Nova Gorica (KGZS- -Zavod GO) smo odvzeli vzorce propadajočih rastlin in rezultati analize, ki jo je opravil Kmetijski inštitut Slovenije (KIS), so pokazali prisotnost gliv Diaporthe spp. (nespolni stadiji Phomopsis) in Phoma spp. (Marko Devetak, osebna informacija). Glive iz rodu Phomopsis so večinoma he- mibiotrofne, kar pomeni, da imajo lastnosti biotrofnih in nekrotrofnih gliv (Udayanga idr. 2011). Biotrofne glive za razvoj potrebujejo živega go- stitelja, medtem ko gostitelj po okužbi z nekrotrofno glivo propade, gliva pa za rast izkorišča hranila iz odmrlih delov organizma. Med glivami iz rodu Phomopsis so poznane tudi endofitne vrste, ki so pogosto prisotne v prevodnih sistemih rastlin, kjer lahko delujejo tudi kot koristni orga- nizmi (Udayanga idr. 2011). V izogib okužbam s kompleksom gliv Dia- porthe/Phomopsis je treba izbirati lege z manj vlage. Izgube pridelkov lahko močno narastejo v primeru deževnega in toplega vremena (Žerjav in Zajc 2022). Tudi za glive iz rodu Phoma velja, da se okužbe pojavljajo v slabo odcednih tleh (Deb idr. 2020). Analiza prisotnosti gliv na rastlinah z znamenji glivičnih okužb (prisotnost micelija, plodišč, sušenje rastlin) je bila izvedena tudi na UP FAMNIT. Glive smo izolirali iz stebla, listov in korenin rastlin. Pred identifikaci- jo z analizo DNA smo izolirane glive gojili na gojišču v petrijevkah, ki je bilo pripravljeno s krompirjevim dekstroznim agarjem. Pred nanosom 68 Pridelava laškega smilja Preglednica 2 Pregled gliv, ki lahko povzročijo propadanje rastlin laškega smilja Deblo/red Vrsta Bolezen1 Vir v povezavi z (znanstveno ime) laškim smiljem Ascomycota/ Macrophomina Ogljena trohnoba soje Pavlović idr. Botryosphaeriales phaseolina (2015) (Tassi) Goid Ascomycota/ Diaporthe spp./ Kompleks gliv, ki UP FAMNIT, Diaporthales Phomopsis povzroča bolezni kot KGZS-Zavod npr. črna pegavost GO (Marko stebel soje, ožig stebel, Devetak, pegavost in ožig strokov, osebna plesnivost semen informacija) (Žerjav in Zajc 2022) Ascomycota/ Botrytis spp. Vrste, ki povzročajo Pohajda idr. Helotiales sivo plesen na različnih (2015) kulturah Ascomycota/ Fusarium spp. Z glivami iz rodu Beljo idr. (2016) Hypocreales Fusarium so povezane bolezni kot npr. bolezni korenin, trohnoba in različne uvelosti Ascomycota/ Alternaria spp. Z glivami iz rodu Beljo idr. Pleosporales Alternaria so povezane (2016), Pohajda različne pegavosti listov idr. (2015) Ascomycota/ Phoma spp. Npr. fižolova rjava UP FAMNIT, Pleosporales pegavost KGZS-Zavod GO (Marko Devetak, osebna informacija) Basidiomycota/ Rhizoctonia spp. Z glivami iz rodu Pohajda idr. Ceratobasidiales Rhizoctonia so (2015) povezane bolezni kot npr. padavica sadik, gnitje korenin, gnitje plodov in stebla Oomycota/ Pythium spp. Padavica sadik Pohajda idr. Peronosporales (2015) Oomycota/ Phytophthora spp. Z glivami iz rodu Beljo idr. (2016) Peronosporales Phytophthora so povezane bolezni korenin in plesni ter gniloba plodov Opomba V kolikor ni navedenega vira, je bil seznam bolezni pridobljen na portalu Inte- grirano varstvo rastlin (https://www.ivr.si/skodljivi-organizmi/). 69 Dunja Bandelj in Matjaž Hladnik A B Slika 11 Sušenje posameznih rastlin v nasadu (A) in prečni prerez olesene- lega stebla propadajoče rastline (B) rastlinskega materiala (izsečkov) na gojišče smo korenine in stebla preč- no prerezali, liste pa narezali na rezine. Del rastlinskega materiala smo pred pripravo izsečkov sterilizirali z 10-odstotnim natrijevim hipoklori- tom, preostali rastlinski material pa je bil na gojišče položen brez pred- hodne sterilizacije. Namen površinske sterilizacije je preučevanje en- dofitov, tj. gliv, ki naseljujejo notranje dele rastlin. Glive, ki so izraščale A B Slika 12 Kultura glive, izolirana iz površinsko sterilizirane korenine in z DNA-analizo, identificirana kot Fusarium oxysporum Schltdl (slovenska imena bolezni: fuzarijska uvelost graha, krompirjeva uvelost, nožna bolezen beluša) (A), in kultura, izolirana iz površin-sko steriliziranega stebla in identificirana kot Alternaria alternata (Fr.) Keissl (slovenska imena bolezni: alternarijska pegavost plodov paradižnika, padavica sadik) (B) (vir: CIRSIUM (http://www .fito-info.si/APL/Sist/SifrantOrg.htm)) 70 Pridelava laškega smilja iz izsečka rastline, smo prenesli na nova gojišča in tako pridobili čisto kulturo glive (slika 12). Poleg gliv F. oxysporum in A. alternata (slika 12), so bile identificirane tudi druge glive, kot so Curvularia spicifera ((Bainier) Boedijn), Rhizocto- nia solani (J. G. Kühn) in Rhizopus oryzae (Went & Prins. Geerl). Rodo- vi Fusarium, Alternaria in Rhizoctonia, iz katerih izhajajo povzročitelji bolezni laškega smilja, so že bili omenjeni (preglednica 2). Kompleks F. oxysporum vsebuje številne seve, ki povzročajo vaskularno uvelost pri različnih kmetijskih rastlinah v različnih tleh in po vsem svetu (Gordon 2017). Znani so tudi sevi, ki niso patogeni in so bili testirani za možnost uporabe v biotičnem varstvu (Edel-Hermann idr. 2009). A. alternata je gliva, ki je pogosto omenjena kot patogena, vendar lahko živi tudi v asimptomatski simbiozi kot endofit (DeMers 2022). V znanstveni literaturi ni zaslediti omembe vrst C. spicifera in R. oryzae kot patogenov laškega smilja. Po navedbah v podatkovni zbirki Evropske in sredozemske organizacije za zaščito rastlin (EPPO Global Database) ter Safe Qostal idr. (2019) gliva C. spicifera povzroča predvsem bolezni trav in žit (gniloba, ožigi). Nedavno je bila potrjena tudi kot povzročite- ljica ožigov listov navadnega komarčka v Turčiji (Eken idr. 2024). Glive iz rodu Rhizopus običajno živijo na odmrlem in propadajočem rastlin- skem materialu (Lennartsson idr. 2014). Omenjajo jih kot povzročiteljice sadne gnilobe med skladiščenjem (Khokhar idr. 2019), vendar je bila R. oryzae prepoznana tudi kot povzročiteljica koreninske gnilobe arašidov (Xu idr. 2015). Omenjene glive bi bile lahko vir okužb in propadanja rastlin, vendar pa je glede na različne lastnosti sevov posameznih vrst mogoče, da iden- tificirane glive rastline kolonizirajo brez škodljivega učinka ali pa so se na rastline naselile šele po okužbi, na propadajoč rastlinski material kot saprofiti. Analize mikrobnih združb kažejo, da rastline sobivajo s številni- mi mikroorganizmi, ki jih bo treba v prihodnje bolje preučiti. Viri Allegret, S. B. l. »Fiche technique Hélichryse italienne Biotop.« Pépinières Bi- otop. https://www.biotop-aromatiques.com/pages/fiche.php?ref=17. Antunes, C., A. J. Pereira, P. Fernandes idr. 2018. »Understanding Plant Dro- ught Resistance in a Mediterranean Coastal Sand Dune Ecosystem: Di-fferences between Native and Exotic Invasive Species.« Journal of Plant Ecology 11 (1): 26–38. 71 Dunja Bandelj in Matjaž Hladnik Bandelj, D., in A. Baruca Arbeiter. 2020. »Ekološke zahteve.« V Oljka, uredila S. Dreu. Kmečki glas. Bandelj, D., M. Hladnik in A. Baruca Arbeiter. 2020. Tehnološke smernice za gojenje laškega smilja. Založba Univerze na Primorskem. Bandelj, D., M. Hladnik in A. Baruca Arbeiter. 2024. »Izzivi pri prenosu prostorastočih zdravilnih in aromatičnih rastlin v pridelavo.« Hmeljar- ski bilten 31:130–149. Baruca Arbeiter, A., M. Hladnik, J. Jakše in D. Bandelj. 2021. »First Set of Microsatellite Markers for Immortelle (Helichrysum italicum (Roth) G. Don): A Step Towards the Selection of the Most Promising Genotypes for Cultivation.« Industrial Crops and Products 162 (10): 113298. Beljo, J., M. Barbarić, M. Čagalj idr. 2016. »Ekološka proizvodnja smilja i ete- ričnog ulja: dosadašnje spoznaje.« V Ekološka proizvodnja smilja i ete- ričnog ulja: dosadašnje spoznaje, uredila M. Ivanković in J. Duranović. Algoritam in. Bianchini, A., F. Santoni, J. Paolini, A.-F. Bernardini, D. Mouillot in J. Costa. 2009. »Partitioning the Relative Contributions of Inorganic Plant Com- position and Soil Characteristics to the Quality of H. italicum subsp. ita- licum (Roth) G. Don fil. Essential Oil.« Chemistry and Biodiversity 6 (7): 1014–1033. Bini, C., L. Maleci, C. Tani in M. Wahsha. 2016. »Preliminary Observations on the Metal Tolerance and Resilience Capacity of Helichrysum italicum (Roth) G. Don Growing Oo Mine Soils.« EQA – International Journal of Environmental Quality 21 (1): 41–50. Carrubba, A., in M. Militello. 2013. »Nonchemical Weeding of Medicinal and Aromatic Plants.« Agronomy for Sustainable Development 33 (3): 551–561. Caser, M., F. D‘Angiolillo, W. Chitarra idr. 2016. »Water Deficit Regimes Trig- ger Changes in Valuable Physiological and Phytochemical Parameters in Helichrysum petiolare Hilliard & B.L. Burtt.« Industrial Crops and Products 83:680–692. Cesaraccio, C., G. Pellizzaro, P. Duce in D. Spano. 2004. »Analysis of Phenolo- gical Behaviour of some Mediterranean Shrub Species in Responses to Warming and Drought Conditions.« V 16th Biometeorology and Aerobi- ology Conference. American Meteorological Society. Ciccarelli, D., P. Picciarelli, G. Bedini in C. Sorce. 2016. »Mediterranean Sea Cliff Plants: Morphological and Physiological Responses to Envi- ronmental Conditions.« Journal of Plant Ecology 9 (2): 153–164. Council Regulation (EEC) No 2092/91 of 24 June 1991 on Organic Producti- on of Agricultural Products and Indications Referring Thereto on Agri- 72 Pridelava laškega smilja cultural Products and Foodstuffs. 1991. Qfficial Journal of the European Communities, št. L 198: 1–15. Council Regulation (EEC) No 2078/92 of 30 June 1992 on Agricultural Produ- ction Methods Compatible with the Requirements of the Protection of the Environment and the Maintenance of the Countryside. 1992. Qfficial Journal of the European Communities, L 215: 85–90. Čagalj, M., I. Grgić in M. Zrakić Sušac. 2019. »Economic Evaluation (Effi- ciency) of Investment in Organically Grown Immortelle [Helichrysum italicum ssp. italicum] in Bosnia and Herzegovina: The First Report from Mediterranean.« Journal of Central European Agriculture 20 (1): 524–551. Deb, D., A. Khan in N. Dey. 2020. »Phoma Diseases: Epidemiology and Con- trol.« Plant Pathology 69 (7): 1203–1217. DeMers, M. 2022. »Alternaria alternata as Endophyte and Šathogen.« Micro- biology 168 (3): 001153. Dias, L. S. 1991. »Allelopathic Activity of Decomposing Straw of Wheat and Oat and Associated Soil on Some Crop Species.« Soil and Tillage Resear-ch 21 (1–2): 113–120. Dimitrova, N., in L. Nacheva. 2018. »Micropropagation of Helichrysum itali- cum (ROTH) G. Don: A Medicinal Plant with Ornamental Value.« Jour-nal of BioScience and Biotechnology 7 (2): 97–101. »Dostop do genskih virov in delitev koristi, ki izhajajo iz njihove uporabe (Nagojski protokol).« 2020. European Union: EUR-Lex, 20. november, https://eur-lex.europa.eu/SL/legal-content/summary/access -to -genetic-resources-and-sharing-of-benefits-arising-from-their -utilisation-nagoya-protocol.html. Edel-Hermann, V., S. Brenot, N. Gautheron, S. Aimé, C. Alabouvette in C. Steinberg. 2009. »Ecological Fitness of the Biocontrol Agent Fusarium Oxysporum Fo47 in Soil and Its Impact on the Soil Microbial Communi-ties.« FEMS Microbiology Ecology 68 (1): 37–45. Eken, C., M. Mutlucan, S. Önder, M. Tonguç in S. Erba ş. 2024. »Identification of Curvularia Spicifera Causing Foliage Blight on Foeniculum Vulgare.« Notulae Scientia Biologicae 16 (2): 11966. Ellis, W. N. 2023. »Tebenna Micalis (Mann, 1857).« Plant Parasites of Euro- pe: Leafminers, Galls and Fungi, 10. marec https://bladmineerders .nl/parasites/animalia/arthropoda/insecta/lepidoptera/ditrysia /apoditrysia/choreutoidea/choreutidae/tebenna/tebenna-micalis/. Finančna uprava Republike Slovenije. 2022. »Vnos rastlin in rastlinskih proi- zvodov.« Portal Finančne uprave Republike Slovenije, 28. oktober. https:// www.fu.gov.si/zivljenjski_dogodki_prebivalci/vnos_rastlin_in _rastlinskih_proizvodov. 73 Dunja Bandelj in Matjaž Hladnik Gliessman, S. R. 2014. Agroecology: The Ecology of Sustainable Food Systems. 3. izd. CRC. Gordon, T. R. 2017. »Fusarium oxysporum and the Fusarium Wilt Syndro- me.« Annual Review of Phytopathology 55 (1): 23–39. Greggio, N., A. Buscaroli, D. Zannoni, S. Sighinolfi in E. Dinelli. 2022. »Heli- crysum italicum (roth) G. Don, a Promising Species for the Phytostabi- lization of Polluted Mine Sites: A Case Study in the Montevecchio Mine (Sardinia, Italy).« Journal of Geochemical Exploration 242 (1-3): 107088. Hladnik, M., A. Baruca Arbeiter in D. Bandelj. 2023. »Sequence Characteri- zation of ITS Regions of Immortelle H. italicum (Roth) G. Don from the East Adriatic Coast.« Genes 14 (2): 480. Khokhar, I., Y. Jia, I. Mukhtar idr. 2019. »First Report of Rhizopus Oryzae Causing Postharvest Fruit Rot on Pear in China.« Plant Disease 103 (6): 1423–1423. Kmetijsko gozdarska zbornica. 2017. »Tehnološka navodila za ekološko pri- delavo zelenjadnic.« Kostina-Bednarz, M., J. Płonka in H. Barchanska. 2023. »Allelopathy as a Source of Bioherbicides: Challenges and Prospects for Sustainable Agri- culture.« Reviews in Environmental Science and Bio/Technology 22:471– 504. Kozhuharova, A., B. Traykova, Y. Shopova in M. Stanilova. 2019. »Alternative Biotechnological Approaches for Propagation of Helichrysum italicum (Roth) G. Don (Asteraceae).« ARPHA Conference Abstracts 2:e46447. Kozhuharova, A., M. Stanilova, V. Vladimirov, M. Nikolova, B. Traykova in S. Berkov. 2023. »Clonal In Vitro Propagation as a Tool for Production of High Quality Planting Material of Helichrysum italicum (Asterace- ae).« Proceedings of the Bulgarian Academy of Sciences 76 (8): 1206–1213. Lennartsson, P. R., M. J. Taherzadeh in L. Edebo. 2014. »Rhizopus.« V En- cyclopedia of Food Microbiology, uredila C. A. Batt in M. L. Tortorello, 2. izd. Academic Press. Melito, S., G. L. Petretto, J. Podani idr. 2016. »Altitude and Climate Influence Helichrysum italicum subsp. Microphyllum Essential Oils Compositi- on.« Industrial Crops and Products 80:242–250. Ninčević, T., M. Jug-Dujaković, M. Grdiša idr. 2021. »Population Structure and Adaptive Variation of Helichrysum italicum (Roth) G. Don Along Eastern Adriatic Temperature and Precipitation Gradient.« Scientific Re- ports 11 (1): 24333. Ostojić, I., M. Zovko, D. Petrović in L. Bošnjak. 2018. »Štetnici smilja [He- lichrysum italicum (Roth) G. Don.] u plantažnom uzgoju na području Hercegovine.« Fragmenta phytomedica 32 (1): 21–30. 74 Pridelava laškega smilja Ostojić, I., M. Zovko, D. Petrović, D. Jurković in L. Bošnjak. 2019. »Lisna uš smilja Macrosiphoniella helichrysi (Hemiptera: Aphididae), nova vrsta u fauni lisnih uši u Bosni in Hercegovini.« Radovi Poljoprivredno-pre-hrambenog fakulteta Univerziteta u Sarajevu 69 (1): 59–67. Pala, F., in H. Mennan. 2022. »Weed Management in Medicinal and Aromatic Plants.« V New Development on Medicinal and Aromatic Plants-II, ure-dil G. Özyazici. Iksad. Pavlović, S., D. Ristić, G. Aleksić, D. Milosević, T. Stević in M. Starović. 2015. »The First Report of Macrophomina Phaseolina of Immortelle (Helich-rysum italicum) in Serbia.« Plant Disease 99 (9): 1279–1279. Perrini, R., I. Morone-Fortunato, E. Lorusso in P. Avato. 2009. »Glands, Es- sential Oils and in vitro Establishment of Helichrysum italicum (Roth) G. Don ssp. microphyllum (Willd.) Nyman.« Industrial Crops and Products 29 (2–3): 395–403. Pohajda, I., G. Dragun in L. Puharić Visković. 2015. Smilje. Savjetodavna služba. Pravilnik o proglašavanju divljih svojti zaštićenim i strogo zaštićenim. 2009. Narodne novine, št. 99. https://narodne-novine.nn.hr/clanci/sluzbeni /2009_08_99_2569.html. Qostal, S., S. Kribel, M. Chliyeh idr. 2019. »Curvularia Spicifera, a Parasite of the Fungal Complex of Root Rot of Wheat and Barley in Morocco.« Plant Cell Biotechnology and Molecular Biology 20 (9–10): 354–365. Riquet, J., in Y. Sauvaire. 2020. »Éléments technico-économiques pour l’Occitanie – juin 2020.« Chambre régionale d’agriculture d’Occitanie in PPAM BIO Conseil. Udayanga, D., X. Liu, E. H. C. McKenzie idr. 2011. »The Genus Phomopsis: Biology, Applications, Species Concepts and Names of Common Phyto-pathogens.« Fungal Diversity 50 (1): 189–225. UKMoths. B. l. »Tebenna micalis (Mann, 1857).« UKMoths. https://ukmoths .org.uk/species/tebenna-micalis/. Uredba o zavarovanih prosto živečih rastlinskih vrstah. 2004. Uradni list Re- publike Slovenije, št 46. https://www.uradni-list.si/1/objava.jsp?sop = 2004-01-2215. Xu, M. L., J. G. Yang, F. L. Wang, J. X. Wu in Y. C. Chi. 2015. »First Report of Rhizopus Arrhizus (Syn. R. Oryzae) Causing Root Rot of Peanut in Chi-na.« Plant Disease 99 (10): 1448. Zhang, C., D.-X. Zhan, H.-H. Luo, Y.-L. Zhang in W.-F. Zhang. 2016. »Pho- torespiration and Photoinhibition in the Bracts of Cotton Under Water Stress.« Photosynthetica 54 (1): 12–18. 75 Dunja Bandelj in Matjaž Hladnik Žerjav, M. 2017. »Ogljena trohnoba soje.« Integrirano varstvo rastlin, okto- ber. https://www.ivr.si/skodljivec/ogljena-trohnoba-soje/. Žerjav, M., in J. Zajc. 2022. »Ožig stebel in strokov soje, črna pegavost stebla in plesnivost semen.« Integrirano varstvo rastlin, julij. https:// www .ivr .si /skodljivec /ozig -stebel -in -strokov -soje -crna -pegavost -stebla -in -plesnivost -semen/. 76 4 Tržni potencial laškega smilja Alenka Baruca Arbeiter Dunja Bandelj Fakulteta za matematiko, naravo- Fakulteta za matematiko, naravo- slovje in informacijske tehnologije, slovje in informacijske tehnologije, Univerza na Primorskem Univerza na Primorskem © 2025 Alenka Baruca Arbeiter in Dunja Bandelj https://doi.org/10.26493/978-961-293-525-2.4 Zanimanje za laški smilj je zaradi njegovih številnih biološko aktivnih spojin, odlične prilagoditve rastline na sušo in zahtevne okoljske raz- mere ter vsestranske uporabnosti čedalje večje, zato je nedavno prešel v kmetijsko pridelavo. Gojenje laškega smilja postaja gospodarsko zani- miva panoga in danes ga v večjem obsegu gojijo na Korziki (Francija) in na Hrvaškem ter v Italiji, Bolgariji in Srbiji (Ninčević idr. 2019; Aćimović idr. 2021). V Sloveniji je več pridelovalnih površin prisotnih predvsem v slovenski Istri in na Krasu, kjer so ekološki pogoji zanj ustrezni. Na sple- tu številni slovenski ponudniki promovirajo izdelke iz laškega smilja, iz česar je moč sklepati, da je interes zanje med potrošniki velik. Slednje predstavlja priložnost za gojenje rastline z namenom pridobivanja proi- zvodov in izdelkov slovenskega izvora. Z anketo smo v okviru Ciljno raz- iskovalnega projekta V4-2207 Možnosti razvoja zeliščarstva v Sloveniji (2022–2024) v Sloveniji evidentirali le 2,54 ha površin, posajenih z laškim smiljem, zato je ocena pridelka eteričnega olja med 27,7 (7.800 rastlin/ ha) do 68,1 kg (20.000 rastlin/ha). Podatki najverjetneje ne odražajo real- nega stanja, saj v raziskavi niso bili evidentirani vsi nasadi laškega smilja v Sloveniji. Mnogi laški smilj pridelujejo na manjših površinah, zato niso vpisani v Register kmetijskih gospodarstev in tudi nimajo registrirane dopolnilne dejavnosti. Po podatkih Javne agencije Republike Slovenije za zdravila in medi- cinske pripomočke (JAZMP) je trenutno v register uvoznikov učinko- vin vpisanih 18 podjetij (Javna agencija Republike Slovenije za zdravila Bandelj, D., Z. Jenko Pražnikar in A. Petelin, ur. 2025. 77 Laški smilj. Založba Univerze na Primorskem Alenka Baruca Arbeiter in Dunja Bandelj in medicinske pripomočke, b. l.a) in v register veletrgovcev z učinkovi- nami kar 33 podjetij (Javna agencija Republike Slovenije za zdravila in medicinske pripomočke, b. l.b); uvoz surovine močno presega trenutno ponudbo doma pridelanega laškega smilja. Vsa registrirana podjetja lah- ko predstavljajo potencialne partnerje v naročeni pridelavi zelišč, s čimer bi lahko vzpostavili dolgoročne pogodbe za odkup laškega smilja in nje- govih polizdelkov ter omogočili vključitev slovenskega laškega smilja v farmacevtske in kozmetične izdelke. Eterično olje laškega smilja velja za eno najdražjih, zato je na mednarod- nem trgu velika konkurenca, predvsem iz držav, kot so Francija (Korzika), Italija, Hrvaška, Bosna in Hercegovina, Srbija ter Bolgarija, kjer so pride- lovalci bolje organizirani in imajo dogovorjen odkup pridelka. V Slove- niji bi težko konkurirali velikim pridelovalcem iz tujine, vendar pa je to tudi priložnost, da se slovenski pridelovalci povežejo in osredotočijo na višjo kakovost, butičnost ter ekološko pridelavo. Laški smilj zaradi tera- pevtskih lastnosti predstavlja izjemen potencial uporabe v kozmetičnih in farmacevtskih izdelkih ter v aromaterapiji in prehrani. Zaradi tega bi se morali slovenski pridelovalci povezovati z domačo kozmetično, far- macevtsko in živilsko industrijo, galenskimi laboratoriji ter veletrgovci, da bi ti prepoznali vrednost slovenske, doma pridelane surovine, saj so trenutno usmerjeni v uvoz zelišč in standardiziranih polizdelkov (eterič- na olja in drugi rastlinski izvlečki) (Javna agencija Republike Slovenije za zdravila in medicinske pripomočke b. l.a.). Laški smilj predstavlja tudi velik potencial za razvoj butičnih produktov in blagovnih znamk. Iz pregleda spletnih strani je razvidno, da številni slovenski ponudniki rastlino pridelajo sami in jo vključujejo v lastne pro- izvode. Med slovenskimi ponudniki pa so tudi taki, ki eterično olje ali hidrolat laškega smilja kupijo in sami izdelujejo najrazličnejše produkte (kreme, čistilne gele, micelarno vodo, pilinge, macerate, šampone, mila, čaje). Mnogi te produkte promovirajo kot slovenske, čeprav pri specifi- kaciji njihovih sestavin ni razvidno poreklo eteričnega olja ali hidrolata. Pri zeliščih je sledljivost izjemnega pomena predvsem z vidika namen- skih ali nenamenskih poneverb. Tveganje zanje se običajno poveča z naraščanjem povpraševanja in cen ter v primeru daljših dobavnih ve- rig (Black idr. 2016). Med poneverbe sodi zamenjava rastlinskih vrst ali podvrst, ki je mogoča tudi pri laškem smilju, saj je zanj značilna izjemna genetska, morfološka in biokemijska raznolikost (Herrando-Moraira idr. 2016; Hladnik idr. 2024). Vse bolj pereča tema je ponarejanje eteričnega 78 Tržni potencial laškega smilja olja. Naravni rastlinski izvlečki imajo pomembno tržno prednost pri proizvod nji številnih izdelkov, vendar je njihova cena pogosto veliko višja od cen sintetičnih spojin (Do idr. 2015). Eteričnim oljem, ki dosegajo vi- soko ceno, kamor sodi tudi laški smilj, se pogosto dodaja cenejša eterična olja in umetne dišave ali sintetične biološko aktivne spojine, z namenom poustvarjanja značilnega vonja in terapevtskih učinkov. Druga vrsta po- narejanja eteričnega olja je celo redčenje z rastlinskimi olji (Capetti idr. 2021). V Sloveniji zakonodaja in standardi kakovosti za eterična olja temelji- jo na evropski zakonodaji in mednarodnih standardih: Uredba (ES) št. 178/2002 Evropskega parlamenta in Sveta (2002) vzpostavlja splošne zahteve za varnost hrane in sledljivost, kar vključuje tudi eterična olja, če so namenjena prehrani ali uporabi v prehranskih dopolnilih; Uredba (ES) št. 1223/2009 Evropskega parlamenta in Sveta (2009) o kozmetič- nih izdelkih ureja enotna pravila za vse kozmetične izdelke z namenom zagotavljanja usklajenega trga ter varovanja zdravja potrošnikov; Ured- ba (ES) št. 1907/2006 Evropskega Parlamenta in Sveta (2006) upravlja registracijo, evalvacijo, avtorizacijo in omejevanje kemikalij, kar velja tudi za eterična olja; Uredba (ES) št. 1272/2008 Evropskega parlamenta in Sveta (2008) določa klasifikacijo, označevanje in pakiranje nevarnih snovi, vključno z eteričnimi olji. Poleg tega morajo slovenski proizvajalci upoštevati nacionalno zakonodajo s področij varnosti hrane, kozmetike in kemikalij, ki vključuje določila, ki urejajo eterična olja oz. registraci- jo, uporabo in obravnavo kemikalij, vključno z eteričnimi olji (Zakon o zdravstveni ustreznosti živil in izdelkov ter snovi, ki prihajajo v stik z ži- vili (ZZUZIS) 2000; Zakon o kemikalijah (Zkem-UPB1) (2003); Zakon o kozmetičnih proizvodih (ZkozP-UPB) 2003), ki so usklajeni z evropskimi predpisi. Čeprav posebni slovenski standardi za kakovost eteričnih olj ne obstajajo, se slednja pogosto preverja glede na ISO-standarde (ISO 9235 opredeljuje naravna aromatična sredstva, vključno z eteričnimi olji) ali zahtevane specifikacije posameznih industrijskih sektorjev (prehra- na, kozmetika, farmacija). Gre za zakonodajno zahtevno področje, ki bi zahtevalo več strokovne podpore. Tak pristop bi omogočil proizvodnjo kakovostnih in preverjenih izdelkov ter zagotovil zaščito potrošnikov, da prejmejo točno tisto, kar plačajo. Dragocene terapevtske lastnosti, raznolika uporabnost in možnosti pri- delave laškega smilja v različnih slovenskih regijah predstavljajo izjemno priložnost, da slovenski laški smilj postane ključna surovina za razvoj 79 Alenka Baruca Arbeiter in Dunja Bandelj naravnih izdelkov z visoko dodano vrednostjo. Slovenija se ponaša z dol- go tradicijo farmacevtske in kozmetične industrije, kar odpira številne možnosti za vključitev smilja v razvoj naravnih zdravilnih in kozmetičnih izdelkov, ki bodo prepoznavni in konkurenčni na domačem ter medna- rodnem trgu. Viri Aćimović, M., J. Ljujić, J. Vulić idr. 2021. »Helichrysum italicum (Roth) G. Don Essential Oil from Serbia: Chemical Composition, Classification and Bi- ological Activity – May It Be a Suitable New Crop for Serbia?« Agronomy 11 (7): 1282. Black, C., S. A. Haughey, O. P. Chevallier, P. Galvin-King in C. T. Elliott. 2016. »A Comprehensive Strategy to Detect the Fraudulent Adulteration of Herbs: The Oregano Approach.« Food Chemistry 210:551–557. Do, T. K. T., F. Hadji-Minaglou, S. Antoniotti in X. Fernandez. 2015. »Authen- ticity of Essential Oils.« TrAC Trends in Analytical Chemistry 66:146–157. Capetti, F., A. Marengo, C. Cagliero idr. 2021. »Adulteration of Essential Oils: A Multitask Issue for Quality Control. Three Case Studies: Lavandula angustifolia Mill., Citrus limon (L.) Osbeck and Melaleuca alternifolia (Maiden & Betche) Cheel.« Molecules 26 (18): 5610. Herrando-Moraira, S., J. M. Blanco-Moreno, L. Sáez in M. Galbany-Casals. 2016. »Re-Evaluation of the Helichrysum italicum Complex (Composi- tae: Gnaphalieae): A New Species from Majorca (Balearic Islands).« Co- llectanea Botanica 35: e009. Hladnik, M., A. Baruca Arbeiter, P. Gabrovšek idr. 2024. »New Chloroplast Microsatellites in Helichrysum italicum (Roth) G. Don: Their Characteri- zation and Application for the Evaluation of Genetic Resources.« Plants 13 (19): 2740. Javna agencija Republike Slovenije za zdravila in medicinske pripomočke. B. l.a. »Seznam uvoznikov učinkovin vpisanih v register uvoznikov učinko- vin na dan 30. 6. 2025.« Javna agencija Republike Slovenije za zdravila in medicinske pripomočke. B. l.b. »Seznam veletrgovcev z učinkovinami vpisanih v register veletrgov- cev z učinkovinami na dan 30. 6. 2025.« Ninčević, T., M. Grdiša, Z. Šatović in M. Jug-Dujaković. 2019. »H. italicum (Roth.) G. Don: Taxonomy, Biological Activity, Biochemical and Genetic Diversity.« Industrial Crops and Products 138:111487. Uredba (ES) št. 178/2002 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 28. januarja 2002 o določitvi splošnih načel in zahtevah živilske zakonodaje, ustano- 80 Tržni potencial laškega smilja vitvi Evropske agencije za varnost hrane in postopkih, ki zadevajo var-nost hrane. 2002. Uradni list Evropskih skupnosti, št. L 21: 1–24. Uredba (ES) št. 1907/2006 Evropskega Parlamenta in Sveta z dne 18. decem- bra 2006 o registraciji, evalvaciji, avtorizaciji in omejevanju kemikalij (REACH), o ustanovitvi Evropske agencije za kemikalije ter spremem-bi Direktive 1999/45/ES ter razveljavitvi Uredbe Sveta (EGS) št. 793/93 in Uredbe Komisije (ES) št. 1488/94 ter Direktive Sveta 76/769/EGS in direktiv Komisije 91/155/EGS, 93/67/EGS, 93/105/ES in 2000/21/ES. 2006. Uradni list Evropske unije, št. L 396: 1–849. Uredba (ES) št. 1272/2008 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 16. de- cembra 2008 o razvrščanju, označevanju in pakiranju snovi ter zmesi, o spremembi in razveljavitvi direktiv 67/548/EGS in 1999/45/ES ter spre-membi Uredbe (ES) št. 1907/2006. 2008. Uradni list Evropske unije, št. L 353: 1–1355. Uredba (ES) št. 1223/2009 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 30. novem- bra 2009 o kozmetičnih izdelkih (prenovitev). 2009. Uradni list Evropske unije, št. L 341: 59–209. Zakon o zdravstveni ustreznosti živil in izdelkov ter snovi, ki prihajajo v stik z živili (ZZUZIS). 2000. Uradni list Republike Slovenije, št. 52. https:// www.uradni-list.si/1/objava.jsp?sop=2000-01-2452. Zakon o kemikalijah (ZKem-UPB1). 2003. Uradni list Republike Slovenije, št. 110. https://www.uradni-list.si/1/objava.jsp?sop=2003-01-4831. Zakon o kozmetičnih proizvodih (ZkozP-UPB). 2003. Uradni list Republike Slovenije, št. 110. https://www.uradni-list.si/1/objava.jsp?sop=2003-01 -4832. 81 5 Laški smilj v prehrani Nina Mohorko Fakulteta za vede o zdravju, Univerza na Primorskem © 2025 Nina Mohorko https://doi.org/10.26493/978-961-293-525-2.5 Uvod Hrana in jedi so od nekdaj odsevale identiteto ljudi. Nanje pa močno vpli- va tudi lokalno okolje, katerega del so divje rastline. Literatura poroča o povezavah med prehransko tradicijo prebivalcev Sredozemlja in njihovo dolgoživostjo, zato so mnoge raziskave usmerjene v povezavo med sre- dozemsko prehrano in zdravstvenim stanjem lokalnih skupnosti (Pieroni idr. 2005). V preteklosti se uživanja rastlin v prehranske namene ni raz- likovalo od njihovega uživanja v medicinske namene (Guarrera in Savo 2016). Čeprav večina znanstvene literature k rastlinskim virom živil v sre- dozemski prehrani prišteva zgolj gojene rastline, je uporaba divjih rastlin kot del prehrane pomemben, a zapostavljen sestavni del sredozemske prehrane in odseva tradicionalno lokalno ekološko znanje (Hadjicham- bis idr. 2008; Biscotti in Pieroni 2015). Sredozemska prehrana namreč ni enoten sistem prehranjevanja v sredozemskem bazenu, temveč jo sesta- vlja množica lokalnih jedi in običajev in je kot taka deležna Unescove zaščite (Guarrera in Savo 2016). Kulinarična uporaba divjih rastlin je zelo lokalna, tudi etnobotanične raziskave poročajo o zelo nizkih indeksih podobnosti med različnimi kraji (Hadjichambis idr. 2008). Termin divje rastline označuje rastline, ki rastejo v svojem naravnem okolju, ne da bi bile gojene, včasih take, ki so bile v neko okolje prinesene in so bile na- turalizirane, včasih, predvsem ko gre za zelišča, ki se uporabljajo za čaje, pa tudi rastline, ki so gojene, vendar ljudje o njih govorijo kot o divjih rastlinah (Łuczaj idr. 2012). Tradicionalno se za pripravo živil zmeša več divjih rastlin in se jih pripravi na različne načine: pogosto se divje rastline prevre (na ta način se uniči toksične sestavine nekaterih od njih), včasih Bandelj, D., Z. Jenko Pražnikar in A. Petelin, ur. 2025. 83 Laški smilj. Založba Univerze na Primorskem Nina Mohorko se prevrete uporabi v omletah, lahko se jih uporabi za kuhanje juh, v so- latah, iz njih se dela rižote, pite, lahko se jih uporabi za začinjanje stroč- nic, testenin, pic in kruha, sirov, rib ter mesa in mesnih izdelkov (Gu- arrera in Savo 2016). Uporaba divjih rastlin je v tradicionalnih kuhinjah popestrila sicer monotono hrano – z dodajanjem različnih aromatičnih divjih rastlin so hrano diverzificirali (Łuczaj idr. 2012). Najpogosteje se v prehrani uporabljajo divje rastline iz družin Asteraceae in Brassicaceae, za katere je značilen grenek in oster okus, ki ga starejši domačini pove- zujejo z zdravo prehrano in mu včasih pripisujejo tudi zdravilne lastnosti (Biscotti in Pieroni 2015). Dinamika spreminjanja znanja o divjih rastlinah in njihovi uporabi v kulinariki Tradicionalno znanje o uporabi divjih rastlin v prehrani hitro izginja, tudi v najbolj izoliranih podeželskih okoljih, kjer te rastline poznajo samo še starejši prebivalci, jih nabirajo in uporabljajo (Ghirardini idr. 2007). In- formanti srednjih let uživanje divjih rastlin, ki so del lokalne tradicije, razumejo v negativnem smislu, pogosto kot simbol revščine v preteklosti, mlada generacija pa je popolnoma izgubila tradicionalno znanje, pot- rebno za njihovo identifikacijo, nabiranje in pripravo (Pieroni idr. 2005). Zaradi omenjenega hitrega izginjanja biokulturne biodiverzitete etnobo- tanične raziskave zbirajo podatke o tradicionalni rabi divjih rastlin, da bi zaščitile kulturno dediščino in biodiverziteto; po drugi strani pa lah- ko vplivajo tudi na lokalno gospodarstvo s spodbujanjem uporabe div- jih rastlin, na katere se pozablja (Łuczaj 2023). Obuditev tradicionalne- ga znanja o kulinaričnih divjih rastlinah spodbuja tudi Evropska unija v okviru svojih projektov, saj lahko v tradicionalno uporabljenih rastlinah prepoznamo nove nutracevtike, potencialno uporabne pri preprečevan- ju s starostjo povezanih bolezni (Pieroni idr. 2005). Uporaba divjih rastlin v prehrani ni statičen proces, vzporedno s poza- bljanjem tradicionalnega znanja na podeželju zaradi socioekonomskih in ekoloških sprememb se v urbanem okolju med izobraženimi mladimi ter ljudmi srednjih let povečuje zanimanje za lokalne vire hrane in za pozabljene divje rastline, ki postajajo del novega načina razmišljanja o hrani, ki se bliskovito širi po svetovnem spletu (Ghirardini idr. 2007; Łuc- zaj idr. 2012). Kot protiutež slabšanju kvalitete hrane v supermarketih se povečuje zanimanje za nabiranje divjih rastlin tudi v medijih, organizi- rajo se delavnice nabiranja rastlin, kmečki turizmi in lokalne turistične organizacije jih ponujajo kot lokalne atrakcije, prodrle pa so tudi v visoko 84 Laški smilj v prehrani kuhinjo (Łuczaj idr. 2012). Zaradi potrjenih pozitivnih učinkov nekaterih od njih na zdravje potrošniki vedno več pozornosti (ponovno) posvečajo samozdravljenju s hrano (Petropoulos idr. 2018). Divje rastline v prehra- ni tako postajajo pomembne kot t. i. superživila, kot vir novih kulinarič- nih doživetij ter v gibanjih, ki želijo zagotoviti dobro, čisto in pravično hrano za vse, kot je gibanje Slow Food – na ta način se uporaba divjih rastlin seli v okolja, ki zanje niso lokalna niti ne tradicionalna (Łuczaj idr. 2012). Uporaba laškega smilja v kulinariki Laški smilj se na območjih, kjer raste, tradicionalno uporablja tudi v ku- linariki. Njegovi listi imajo okus po kariju in sladkem korenu, zato se v angleščini imenuje tudi rastlina kari (angl. Curry plant) in ga uporabljajo za začinjanje različnih jedi in zelenjavnih juh (Cannarella idr. 2022). O tovrstni uporabi zapisi prihajajo predvsem iz Italije, kjer ga v Bazilikati uporabljajo za začinjanje omak (Guarrera idr. 2006), v Liguriji pa tradi- cionalne uporabnike spominja na rožmarin, zato ga lokalno imenujejo Rusmarin sarvego, cenijo pa ga zaradi okusa, ki je nežnejši od rožmari- novega, in uporabljajo liste za začinjanje različnih jedi (Ghirardini idr. 2007). Redna uporaba zelišč in začimb v prehrani izboljša zdravje ter zmanjša tveganje za razvoj bolezni, poleg tega pa imajo uporabniki zelišč in začimb tudi nižje vnose soli, kar dodatno ugodno vpliva na krvni pri- tisk (Jiang 2019). S Hrvaškega poročajo o uporabi celotnega nadzemne- ga dela rastline pri pripravi žgane pijače travarice v Dalmatinski zagori Slika 1 Laški smilj se pogosto uporablja kot začimba 85 Nina Mohorko (Ninčević Runjić idr. 2024). V primerjavi z drugimi divjimi rastlinami iz družine Asteraceae je etnobotaničnih zapisov o uporabi laškega smilja v kulinariki v znanstveni literaturi malo, več je etnofarmakoloških opisov, v katerih navajajo interno uporabo poparkov cvetov, cvetoče rastline, listov ali nadzemnih delov laškega smilja za prebavne težave, težave z jetri in žolčem, kašelj, prehlad in druga vnetja dihalnih poti, uporabo prevret- ka cvetov in listov za vnetje ter kašelj in za čiščenje želodca ter upora- bo soka mladih listov in vršičkov za bolečine v želodcu (Antunes Viegas idr. 2014). Literatura pa poroča tudi o protidiabetičnem delovanju čaja iz smilja (Pereira idr. 2017). Skladno s poročanjem literature o renesansi zanimanja za uporabo divjih rastlin v prehrani v urbanem okolju, kjer se jih prej ni uporabljalo, pa se več zapisov o uporabi laškega smilja v kulinariki najde v sodobni poljudni literaturi na spletu, kjer so opisani različni načini in možni vzroki upora- be (Behrič b. l.) ter različni recepti. Tako priporočajo njegovo uporabo za pripravo zeliščnega čaja in likerja (Mascotto in Tassoni 2023), kot zelišča za začinjanje mesa (Colombo 2024b), stročnic (Colombo 2024a; Bartolo- mei 2023), jajc, jogurta, sirov in rib (Lautanen-Raleigh 2018). Ekstrava- gantnejši recepti smilj priporočajo za začinjanje sadnih solat ter sladole- da (Mascotto in Tassoni 2023), naveden pa je tudi recept za pesto, kjer je količina uporabljenega smilja večja od prej navedenih (»Pesto Mandorle & Elicriso« 2022; »Spaghetti al pesto di elicriso« b. l.). Omenjeni recepti priporočajo uporabo listov, cvetov ali kombinacije obojega. Vzporedno s povečevanjem znanja o prehranski vrednosti laškega smilja in z znan- stvenim potrjevanjem njegovih učinkov na zdravje gre pričakovati nove recepte in njegovo uporabo v funkcionalnih živilih, pijačah, prehranskih dopolnilih, kot prehranski aditiv ali protimikrobno sredstvo, kot predla- gajo za druge užitne halofite iz sredozemskega bazena (Petropoulos idr. 2018; Pereira idr. 2017). Prehranska vrednost laškega smilja Zaradi povečanega zanimanja potrošnikov in prehranske industrije za zdravo ter funkcionalno hrano se je začelo raziskovati kemično sestavo divjih rastlin (Petropoulos idr. 2019). Cvetovi laškega smilja imajo relativ- no visok delež vode, približno 40 % (Primitivo idr. 2022). 85 % suhe mase predstavljajo ogljikovi hidrati, 5,5 % beljakovine in 3,6 % lipidi, kar je pri- merljivo z drugimi užitnimi cvetovi, kot so cvetovi Helichrysum petiolare, vrste smilja iz Južne Afrike, cvetovi šipka in vrtnega ognjiča (Primitivo idr. 2022). Cvetovi laškega smilja imajo ugodno maščobno sestavo: približno 86 Laški smilj v prehrani 54 % maščob je iz nasičenih maščobnih kislin, sledijo večkrat nenasičene (približno 38 % maščob) in enkrat nenasičene maščobne kisline (prib- ližno 8 % maščob) (Primitivo idr. 2022). Najbolj zastopana maščobna kislina v cvetovih laškega smilja je linolna kislina (večkrat nenasičena maščobna kislina omega-6), ki predstavlja približno 23 % vseh maščob- nih kislin; sledita palmitinska (nasičena maščobna kislina; 16,5 % ma- ščobnih kislin) in alfa-linolenska kislina (večkrat nenasičena maščobna kislina omega-3; 12,4 % maščobnih kislin), od nasičenih pa je v večji meri prisotna še miristinska (10,5 % maščobnih kislin). Od enkrat nenasičenih maščobnih kislin je najbolj prisotna oleinska kislina, ki predstavlja 4,5 % maščobnih kislin v cvetovih smilja (Primitivo idr. 2022). Tako natančna hranilna sestava cvetov laškega smilja je bila določena zgolj za podvr- sto H. italicum Picardii Franco, ki raste na zahodu Iberskega polotoka (cvetovi so bili nabrani v Leirii na Portugalskem) (Primitivo idr. 2022). V količinah, v katerih se uporaba smilja navaja v etnobotaničnih zapisih in v sodobnih priporočilih na spletu, postanejo morebitne razlike med podvrstami zanemarljive, saj se smilj večinoma uporablja kot začimba ali zelišče za čaj. V luči dinamičnega spreminjanja uporabe divjih rastlin v kulinariki, kjer v sodobnih receptih dobivajo nove vloge, pa bi bilo treba natančno določiti hranilno sestavo tudi v drugih podvrstah ter v celotni nadzemni rastlini. Mineralna sestava laškega smilja je bila določena v dveh raziskavah in je odvisna od podvrste ter sestave tal na lokaciji rastišča (Bianchini idr. 2009; Primitivo idr. 2022). Laški smilj vsebuje kalcij (4,5–20 mg/g sve- že mase), kalij (5,2– 28,3 mg/g sveže mase), fosfor (130–4100 μg/g sve- že mase), žveplo (okrog 240 μg/g sveže mase), baker (3,8–56 μg/g sveže mase), železo (88,5–950 μg/g sveže mase), mangan (74–750 μg/g sveže mase), cink (28–240 μg/g sveže mase) ter nikelj (okrog 15 μg/g sveže mase), rubidij (okrog 10,5 μg/g sveže mase) in stroncij (okrog 66 μg/g sveže mase) (Bianchini idr. 2009; Primitivo idr. 2022). Bolj od makro- in mikrohranil pa je v laškem smilju raziskana vsebnost fitokemikalij. Od barvil so v cvetovih laškega smilja, ki jih odlikuje živo- rumena barva, prisotni predvsem karotenoidi (68 ± 5 μg/g suhe mase), klorofil a (31 ± 7 μg/g suhe mase) in klorofil b (26 ± 10 μg/g suhe mase) (Primitivo idr. 2022). Karotenoidi, ki jih ljudje nismo sposobni sinteti- zirati sami in jih moramo zato v telo vnesti s hrano, imajo pri zdravju številne vloge: pomembni so za zdravje oči in vid, vplivajo na kognitiv- ne funkcije, na zdravje srca, v koži delujejo fotoprotektivno (tako funk- cijo imajo tudi v rastlinah, ki jih sintetizirajo), vplivajo na plodnost, 87 Nina Mohorko imunomodulacijo, učinkujejo na izražanje genov in delujejo preventiv- no v zvezi z rakom (Eggersdorfer in Wyss 2018). Klorofili se absorbirajo v zelo majhni meri, večina se jih med prebavo kemično spremeni in nji- hovi presnovni produkti vežejo ksenobiotike, kot so dioksini in aflato- ksin, ter povečajo njihovo izločanje (Zhong idr. 2021). Pomemben vpliv klorofilov iz laškega smilja na zdravje pa lahko pričakujemo zgolj, ko bi smilj zaužili v večjih količinah, kot npr. v obliki pesta, kar je predlaga- no v enem od netradicionalnih receptov s spleta. Vendar uporaba divje rastline v dozah, značilnih za začinjanje, ni premajhna za ugodne učin- ke na zdravje: klinične raziskave zelišč in začimb ter njihovih mešanic ugotavljajo, da ima lahko njihovo vključevanje v prehrano preventivne in terapevtske učinke ter da lahko vplivajo na ravni glukoze, inzulina in lipidov v krvi po obrokih, predvsem zaradi prisotnih bioaktivnih spojin (Mackonochie idr. 2023). Laški smilj je najbolj cenjen prav zaradi svojih bioaktivnih spojin, ki so tudi najbolj raziskane. Celokupna vsebnost fenolnih spojih v cvetovih laškega smilja podvrste picardii je bila okrog 40 mg ekvivalentov galne kisline (GAE)/g (41,8 ± 2,9 mg GAE/g v 70 % (v/v) acetonskih izvlečkov in 39,5 ± 1,1 mg GAE/g v vodnih poparkih), glavne skupine fenolnih spojih, ki so jih identificirali, pa so bile fenolne kisline, kurkuminoidi in karo- tenoidi (Primitivo idr. 2022). Celokupna vsebnost fenolnih spojin v sko- delici čaja laškega smilja podvrste picardii (1 g rastline/200 mL vode) je bila odvisna od načina priprave (v prevretku je bila višja kot v poparku) in uporabljenih delov rastline: najnižja je bila pri uporabi korenin (poparek 13,9 ± 0,5 mg GAE/200 mL; prevretek 20,5 ± 1,5 mg GAE/200 mL), sledila je nadzemna rastlina (poparek 62,0 ± 1,0 mg GAE/200 mL; prevretek 70,2 ± 4,3 mg GAE/200 mL), najvišja pa je bila pri uporabi cvetov (poparek 69,9 ± 3,9 mg GAE/200 mL; prevretek 76,5 mg ± 2,6 mg GAE/200 mL), enako stopnjevanje pa velja tudi za celokupno vsebnost flavonoidov, derivatov hidroksicimetne kisline in flavanolov (Pereira idr. 2017). Ce- lokupna vsebnost fenolnih spojih v izvlečkih celotne nadzemne rastline laškega smilja podvrste italicum je bila nižja v vročem vodnem izvlečku (19 ± 5 mg ekvivalentov klorogenske kisline (CAE)/g suhe rastline) kot v hladnem in v etanolno-vodnem izvlečku (v obeh 40 ± 1 mg CAE/g suhe rastline), v navedenih izvlečkih pa smo identificirali sto različnih fenol- nih spojih, ki so spadale k hidroksicimetnim in hidroksibenzojskim kisli- nam, flavonoidom, kumarinom, pironom pa tudi k izobenzofuranonom, neolignanom, acetofenonom in tremetonom (Kramberger idr. 2020). 88 Laški smilj v prehrani Vpliv načina priprave hrane na prisotnost bioaktivnih snovi v njej Pri oceni prehranskih vrednosti divjih rastlin je treba upoštevati način priprave, kot so termična obdelava in njena vrsta ter/ali prisotnost ma- ščobe, saj vplivajo na biorazpoložljivost specifičnih razredov naravnih sestavin in posledično na dobrodejne učinke hrane, kot sta njen antioksi- dativni potencial ali preprečevanje s starostjo povezanih bolezni (Pieroni idr. 2005). Pri pripravi čaja iz laškega smilja gre tako za vroči vodni izvle- ček, žgana pijača je primer alkoholnega macerata, medtem ko je priprava smilja v obliki pesta primer macerata v olju. Bioaktivne spojine iz laškega smilja v različnih izvlečkih in v eteričnem olju so natančneje opisane v kasnejših poglavjih, prav tako vplivi na biorazpoložljivost. Pri uporabi laškega smilja kot začimbe za termično obdelane jedi lah- ko različni načini kuhanja učinkujejo različno. Podatkov za laški smilj s področja vpliva načina kuhanja na prisotnost bioaktivnih snovi nimamo. Poročila o drugih rastlinah, npr. ingverju, pa za različne načine kuha- nja opisujejo spremembe v količini bioaktivnih snovi in njihovi sestavi (Zagórska idr. 2022). Odvisno od načina kuhanja imamo lahko kot topili prisotno vodo in/ali olje v različnih razmerjih. Pri kuhanju v vodi bioak- tivne snovi prehajajo v vodo, kar lahko vodi v izgube, posebej če se vodo zavrže (Zagórska idr. 2022). V primeru juh in omak, kjer se vodo od ku- hanja zaužije, pa morda lahko pričakujemo višjo vsebnost fenolov, saj so v prevretku laškega smilja opazili višjo celokupno vsebnost fenolov kot v poparku (Pereira idr. 2017). Kratka toplotna obdelava v vodi ali pari, kot sta blanširanje in kuhanje na pari, lahko poveča celokupno vsebnost fenolov; pri praženju vroč suh zrak interagira z živilom, pri tem pride do nastajanja novih spojih in uničenja drugih zaradi termolabilnosti, kar se odraža v spremembah sestave olja (Zagórska idr. 2022). Grenka hrana kot zdravilo V tradicionalnih družbah je znano prekrivanje med prehrano in medi- cino (Pieroni idr. 2005). Ljudje so divje rastline grenkega okusa tradicio- nalno prepoznali kot take s pozitivnim učinkom na zdravje, pri čemer je korist za zdravje prevladala nad začetno neprijetnostjo grenkega okusa (Pieroni idr. 2023). Že v antiki so stari Rimljani uporabljali grenke aperiti- ve, da bi pripravili črevesni sistem na prebavo hrane in absorpcijo hranil (Trius-Soler in Moreno 2024), in digestive po obroku za izboljšanje pre- bave ter da bi preprečili letargijo (Harmon idr. 2021), uporaba grenkih alkoholnih pijač iz zelišč kot aperitiv ali digestiv pa se je ohranila v se- danjost (Egea idr. 2015), primer take je tudi travarica iz smilja. Mnoge 89 Nina Mohorko aromatične divje rastline olajšajo prebavo in se jih zaradi tega kot začim- be dodaja hrani (Guarrera in Savo 2016). Čeprav etnobotanični zapisi o uporabi smilja kot začimbe ne navajajo njegovih učinkov na prebavo, pa o slednjih pričajo etnofarmakološki zapisi o njem (Antunes Viegas idr. 2014). Čaj iz laškega smilja, za katerega literatura poroča o ugodnih učin- kih na prebavila in dihala (Antunes Viegas idr. 2014), ima grenek okus, ki so ga preiskovanci v klinični raziskavi ocenili kot sprejemljivega (Kenig idr. 2021; Kenig idr. 2022). Grenek okus se zazna s pomočjo z G-proteinom povezanih receptorjev iz družine za okus 2, T2R (iz. angl. Taste Family 2 Receptors), ki se izra- žajo v okušalnih celicah tipa II v okušalnih mešičkih na jeziku in v oro- farinksu ter obstajajo v obliki več različnih analogov, v populaciji pa je bilo odkritih več kot 150 eno-nukleotidnih polimorfizmov, ki vplivajo na veliko variabilnost v sposobnosti zaznavanja grenkega okusa v populaci- ji (Trius-Soler in Moreno 2024). T2R pa niso zgolj gustatorni receptorji, delujejo kot kemosenzorji, ki nadzorujejo okolje v telesu in sprožijo od- zive na različne grožnje, kot so deregulacija presnove, toksini in infek- cije (Harmon idr. 2021). Tako v ustih sodelujejo pri aktivaciji prirojene imunosti, v rakavih celicah glave in vratu pa njihova signalizacija sproži znižano raven presnove, znižano proliferacijo in apoptozo (Harris idr. 2024). Receptorje za grenko T2R najdemo tudi po celotnih prebavilih, kjer vplivajo na njihovo funkcionalnost, znižajo pridobivanje telesne mase in vplivajo na homeostazo glukoze; T2R so prisotni tudi v pljučih, možganih in srcu (Trius-Soler in Moreno 2024). Dajanje grenkega popar- ka v želodec je povzročilo akutno znižanje apetita in ravni acil-grelina ter motilina v plazmi (Verbeure idr. 2021), kar potrjuje smiselnost uporabe grenkih aperitivov. Kot aperitiv bi se lahko uporabljalo tudi čaj iz laškega smilja, ki akutno po zaužitju tudi zviša presnovo v mirovanju (Kenig idr. 2021). Kronična (štiritedenska) uporaba čaja iz laškega smilja dve uri po večerji je znižala hrepenenje po sladki hrani in prigrizkih, prav tako pa je ugodno vplivala na telesno maso preiskovancev in njihov lipidni profil (Kenig idr. 2022). Morda polifenoli in druge fitokemikalije grenkega okusa, za katere so značilne nizka biorazpoložljivost in posledično nizke ravni v tkivu, svo- je fiziološke učinke dosegajo tudi preko receptorjev T2R (Trius-Soler in Moreno 2024). Grenek okus lahko nekatere ljudi odvrne od uživanja zelenjave in divjih rastlin. Vendar lahko na njegovo percepcijo vplivamo s spreminjanjem 90 Laški smilj v prehrani pH: kisel pH zniža percepcijo grenkega, tako postanejo z limono zabel- jene divje rastline (kot se jih uživa npr. v solatah) manj grenke in zato sprejemljivejše, v prebavilih, kjer je pH drugačen, pa se grenke spojine lahko vežejo na receptorje T2R in preko njih delujejo pozitivno na zdrav- je (Pieroni idr. 2023). Prav tako lahko kisel pH pomembno vpliva na bio- razpoložljivost fenolnih spojin iz rastlin (Hithamani in Srinivasan 2017). Uporabo laškega smilja z limeto priporočajo tudi nekateri recepti na spletu (Colombo 2024b). Podobno bi se dalo z dodatkom limone ali lime- te izboljšati okus čaja iz smilja, katerega ocena je bila sprejemljiva, ven- dar je dopuščala prostor za izboljšave (Kenig idr. 2021; Kenig idr. 2022). Navedena kombinacija laškega smilja in limone ali limete pa je primerna tudi za funkcionalne pijače ter funkcionalna živila, katerih raz voj je pri- čakovati glede na ugotovljene ugodne učinke laškega smilja na zdravje. Zaključek Laški smilj se v prehrani uporablja kot začimba in kot zel za pripravo čaja ter travarice. Znanje o njegovi uporabi se seli iz lokalnih tradicionalnih okolij v širšo javnost in se odmika od lokalnega okolja s pomočjo naglega širjenja informacij po spletu. To je lahko priložnost za promocijo njegove širše uporabe, saj uporaba divjih rastlin v prehrani slednjo diverzificira, hkrati pa dolgoročno ugodno deluje na zdravje. Veliko prostora je tudi za izdelavo novih, inovativnih funkcionalnih živil. Laški smilj je namreč cenjen zaradi bogate prisotnosti biološko aktivnih snovi, zaradi katerih ima ugodne učinke na prebavni trakt, dihala, uravnavanje telesne mase in presnovni sindrom. Na nekatere učinke lahko vpliva tudi njegov gre- nek okus, saj so receptorji za grenko razporejeni po celotnih prebavilih in tudi v drugih tkivih ter vpleteni v za zdravje ugodno signalizacijo. Za nekatere manj spremenljiv grenek okus se da zamaskirati s kombinacijo s kislim sokom limone ali limete, kar je pogosta strategija uživanja divjih rastlin v Sredozemlju in se najde tudi v sodobnih receptih, ki vključujejo laški smilj. Viri Antunes Viegas, D., A. Palmeira-de-Oliveira, L. Salgueiro, J. Martinez-de-O- liveira in R. Palmeira-de-Oliveira. 2014. »Helichrysum italicum: From Traditional Use to Scientific Data.« Journal of Ethnopharmacology 151 (1): 54–65. Bartolomei, D. 2023. »Zuppa ceci all’elicriso per abc un mondo di ingredienti lettera E.« L’ingrediente perduto, 26. april. https://ingredienteperduto 91 Nina Mohorko .blogspot.com/2023/04/zuppa-ceci-allelicriso-per-abc-un-mondo .html. Behrič, Bene. B. l. »Smilj – balzam za občutljivo kožo in začimba.« Bodi eko. https://www.bodieko.si/smilj. Bianchini, A., F. Santoni, J. Paolini, A.-F. Bernardini, D. Mouillot in J. Costa. 2009. »Partitioning the Relative Contributions of Inorganic Plant Com- position and Soil Characteristics to the Quality of Helichrysum italicum subsp. italicum (Roth) G. Don Fil. Essential Oil.« Chemistry and Biodi- versity 6 (7): 1014–1033. Biscotti, N., in A. Pieroni. 2015. »The Hidden Mediterranean Diet: Wild Ve- getables Traditionally Gathered and Consumed in the Gargano Area, Apulia, SE Italy.« Acta Societatis Botanicorum Poloniae 84 (3): 327–338. Cannarella, C., F. Mariani in V. Piccioni. 2022. »A spasso fra i “Semplici” e le Erbe della Tuscia.« Etrurianatura 15:126–138. Colombo, T. 2024a. »Insalata di ceci ed elicriso, un piatto raffinato e rusti- co.« Nonnapaperina, 15. junij https://www.nonnapaperina.it/2024/06 /insalata-di-ceci-ed-elicriso-un-piatto-raffinato-e-rustico/. Colombo, T. 2024b. »Pollo al lime e elicriso, un secondo raffinato e leggero.« Nonnapaperina, 3. julij https://www.nonnapaperina.it/2024/07/pollo -al-lime-e-elicriso-un-secondo-raffinato-e-leggero/. Egea, T., M. A. Signorini, P. Bruschi idr. 2015. »Spirits and Liqueurs in Euro- pean Traditional Medicine: Their History and Ethnobotany in Tuscany and Bologna (Italy).« Journal of Ethnopharmacology 175:241–255. Eggersdorfer, M., in A. Wyss. 2018. »Carotenoids in Human Nutrition and Health.« Archives of Biochemistry and Biophysics 652:18–26. Ghirardini, M. P., M. Carli, N. Del Vecchio idr. 2007. »The Importance of a Taste: A Comparative Study on Wild Food Plant Consumption in Twen- ty-One Local Communities in Italy.« Journal of Ethnobiology and Ethno- medicine 3 (1): 22. Guarrera, P. M., in V. Savo. 2016. »Wild Food Plants Used in Traditional Vege- table Mixtures in Italy.« Journal of Ethnopharmacology 185 (5): 202–234. Guarrera, P. M., G. Salerno in G. Caneva. 2006. »Food, Flavouring and Feed Plant Traditions in the Tyrrhenian Sector of Basilicata, Italy.« Journal of Ethnobiology and Ethnomedicine 2 (1): 37. Hadjichambis, A. Ch., D. Paraskeva-Hadjichambi, A. Della idr. 2008. »Wild and Semi-Domesticated Food Plant Consumption in Seven Circum- -Mediterranean Areas.« International Journal of Food Sciences and Nutrition 59 (5): 383–414. Harmon, C. P., D. Deng in P. A. S. Breslin. 2021. »Bitter Taste Receptors (T2Rs) are Sentinels that Coordinate Metabolic and Immunological Defense Responses.« Current Opinion in Physiology 20:70–76. 92 Laški smilj v prehrani Harris, J. C., R. J. Lee in R. M. Carey. 2024. »Extragustatory Bitter Taste Re- ceptors in Head and Neck Health and Disease.« Journal of Molecular Medicine 102 (12): 1413–1424. Hithamani, G., in K. Srinivasan. 2017. »Bioaccessibility of Polyphenols from Selected Cereal Grains and Legumes as Influenced by Food Acidulants.« Journal of the Science of Food and Agriculture 97 (2): 621–628. Jiang, T. A. 2019. »Health Benefits of Culinary Herbs and Spices.« Journal of AOAC International 102 (2): 395–411. Kenig, S., K. Kramberger, A. Petelin itd. 2021. »Helichrysum italicum ssp. ita- licum Infusion Promotes Fat Oxidation in Hepatocytes and Stimulates Energy Expenditure and Fat Oxidation after Acute Ingestion in Humans: A Pilot Study.« Plants 10 (8): 1516. Kenig, S., K. Kramberger, K. Šik Novak idr. 2022. »Helichrysum italicum (Roth) G. Don and Helichrysum arenarium (L.) Moench Infusions in Re-versing the Traits of Metabolic Syndrome: A Double-Blind Randomized Comparative Trial.« Food and Function 13 (14): 7697–7706. Kramberger, K., D. Barlič-Maganja, D. Bandelj idr. 2020. »HPLC-DAD-ESI- -QTOF-MS Determination of Bioactive Compounds and Antioxidant Activity Comparison of the Hydroalcoholic and Water Extracts from Two Helichrysum Italicum Species.« Metabolites 10 (10): 403. Lautanen-Raleigh, M. 2018. »Curry Plant - Herb of the Week.« Backyard Pa- tch Herbal Blog, 18. julij. https://backyardpatch.blogspot.com/2018/07 /curry-plant-herb-of-week.html. Łuczaj, Ł. 2023. »Descriptive Ethnobotanical Studies Are Needed for the Res- cue Operation of Documenting Traditional Knowledge.« Journal of Eth-nobiology and Ethnomedicine 19 (1): 37. Łuczaj, Ł., A. Pieroni, J. Tardío idr. 2012. »Wild Food Plant Use in 21st Century Europe: The Disappearance of Old Traditions and the Search for New Cuisines Involving Wild Edibles.« Acta Societatis Botanicorum Poloniae 81 (4): 359–370. Mackonochie, M., A. Rodriguez-Mateos, S. Mills in V. Rolfe. 2023. »A Scoping Review of the Clinical Evidence for the Health Benefits of Culinary Do-ses of Herbs and Spices for the Prevention and Treatment of Metabolic Syndrome.« Nutrients 15 (23): 4867. Mascotto, N., in V. Tassoni. 2023. »Elicriso in cucina: liquore di elicriso.« Vi- ttoria in cucina, 1. avgust. https://www.vittoriaincucina.it/elicriso-in -cucina-liquore-di-elicriso/. Ninčević Runjić, T., M. Jug-Dujaković, M. Runjić in Ł. Łuczaj. 2024. »Wild Edible Plants Used in Dalmatian Zagora (Croatia).« Plants 13 (8): 1079. Pereira, C. G., L. Barreira, S. Bijttebier idr. 2017. »Chemical Profiling of Infu- sions and Decoctions of H. italicum subsp. picardii by UHPLC-PDA-MS 93 Nina Mohorko and in vitro Biological Activities Comparatively with Green Tea (Camel- lia sinensis) and Rooibos Tisane (Aspalathus linearis).« Journal of Phar- maceutical and Biomedical Analysis 145:593–603. »Pesto Mandorle & Elicriso.« 2022. Fun&Food: Blog di cucina & tempo li- bero, 3. maj. https://www.funandfood.it/2022/05/03/pesto-mandorle -elicriso/. Petropoulos, S. A., A. Karkanis, N. Martins in I. C. F. R. Ferreira. 2018. »Edible Halophytes of the Mediterranean Basin: Potential Candidates for Novel Food Products.« Trends in Food Science and Technology 74:69–84. Petropoulos, S. A., Â. Fernandes, N. Tzortzakis idr. 2019. »Bioactive Com- pounds Content and Antimicrobial Activities of Wild Edible Asterace- ae Species of the Mediterranean Flora Under Commercial Cultivation Conditions.« Food Research International 119:859–868. Pieroni, A., G. Morini, M. Piochi idr. 2023. »Bitter Is Better: Wild Greens Used in the Blue Zone of Ikaria, Greece.« Nutrients 15 (14): 3242. Pieroni, A., S. Nebel, R. F. Santoro in M. Heinrich. 2005. »Food for Two Se- asons: Culinary Uses of Non-Cultivated Local Vegetables and Mushro- oms in a South Italian Village.« International Journal of Food Sciences and Nutrition 56 (4): 245–272. Primitivo, M. J., M. Neves, C. L. Pires idr. 2022. »Edible Flowers of Helich- rysum Italicum: Composition, Nutritive Value, and Bioactivities.« Food Research International 157 (2): 111399. »Spaghetti al pesto di elicriso.« B. l. Fresco Aroma. https://www.frescoaroma .it/spaghetti-al-pesto-di-elicriso/. Trius-Soler, M., in J. J. Moreno. 2024. »Bitter Taste Receptors: Key Target to Understand the Effects of Polyphenols on Glucose and Body Weight Homeostasis; Pathophysiological and Pharmacological Implications.« Biochemical Pharmacology 228:116192. Verbeure, W., E. Deloose, J. Tóth idr. 2021. »The Endocrine Effects of Bitter Tastant Administration in the Gastrointestinal System: Intragastric Versus Intraduodenal Administration.« American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism 321 (1): E1–E10. Zagórska, J., L. Czernicka-Boś, W. Kukula-Koch, R. Szalak in W. Koch. 2022. »Impact of Thermal Processing on the Composition of Secondary Meta- bolites of Ginger Rhizome: A Review.« Foods 11 (21): 3484. Zhong, S., A. Bird in R. E. Kopec. 2021. »The Metabolism and Potential Bi- oactivity of Chlorophyll and Metallo-Chlorophyll Derivatives in the Gastrointestinal Tract.«Molecular Nutrition and Food Research 65 (7): e2000761. 94 Sklop 2 Tehnološki postopki in bioaktivne spojine laškega smilja 6 Spravilo in predelava laškega smilja ∙ 99 Dunja Bandelj, Alenka Baruca Arbeiter, Matjaž Hladnik in Katja Kramberger 7 Tehnološki postopki pridobivanja pripravkov iz laškega smilja ∙ 111 Katja Kramberger 8 Bioaktivne spojine vodnih in organskih izvlečkov laškega smilja ∙ 127 Katja Kramberger 9 Bioaktivne spojine hidrolata in eteričnega olja laškega smilja ∙ 141 Dunja Bandelj, Katja Kramberger, Matjaž Hladnik 97 6 Spravilo in predelava laškega smilja Dunja Bandelj Matjaž Hladnik Fakulteta za matematiko, naravo- Fakulteta za matematiko, naravo- slovje in informacijske tehnologije, slovje in informacijske tehnologije, Univerza na Primorskem Univerza na Primorskem Alenka Baruca Arbeiter Katja Kramberger Fakulteta za matematiko, naravo- Fakulteta za vede o zdravju, slovje in informacijske tehnologije, Univerza na Primorskem Univerza na Primorskem © 2025 Dunja Bandelj, Alenka Baruca Arbeiter, Matjaž Hladnik in Katja Kramberger https://doi.org/10.26493/978-961-293-525-2.6 Žetev laškega smilja in pridelki Za načrtovanje žetve laškega smilja je pomembno spremljanje fenofaze cvetenja, saj se na osnovi razvoja pakobulastih socvetij in koškov odločamo zgornja listna povrhnjica spodnja listna povrhnjica socvetje Slika 1 Kapljice eteričnega olja na apikalnem delu žleznih trihomov na generativnih in vegetativnih poganjkih laškega smilja Bandelj, D., Z. Jenko Pražnikar in A. Petelin, ur. 2025. 99 Laški smilj. Založba Univerze na Primorskem Dunja Bandelj idr. Slika 2 Žetvena naprava za zelišča (Foto: J. Bergant) o času žetve. Po izkušnjah optimalen čas žetve med leti variira in je od- visen od vremenskih pogojev v rastni dobi ter intenzitete pomladne rezi. Močna rez lahko nekoliko zamakne nastop fenofaze cvetenja. Za prido- bitev kakovostnega eteričnega olja laški smilj žanjemo, ko je v nasadu odprta tretjina do polovica koškov v pakobulastih socvetjih (Pohajda idr. 2015; Rajić idr. 2015). Žanjemo vegetativne poganjke in generativne po- ganjke s socvetji, saj oboji vsebujejo žlezne trihome, na vrhu katerih se kopiči eterično olje (slika 1). V manjših nasadih žetev običajno poteka ročno, v večjih pa je strojna. Na manjših površinah si lahko pomagamo tudi s posebnimi žetveniki za zelišča (slika 2). Čas žetve v Sloveniji je običajno v drugi polovici junija, ponekod pa laški smilj žanjejo kasneje, v mesecu juliju. Po žetvi je treba destilacijo izvesti takoj oz. najkasneje v 24 urah, saj v požetih poganjkih intenzivno potekajo biokemijski procesi (npr. oksida- cija), ki povzročajo kemijske spremembe bioloških spojin v eteričnem olju (Matin idr. 2021). Na Hrvaškem poročajo o pomanjkanju kapacitet za destilacijo, zato ponekod požet laški smilj predhodno sušijo v sušil- nicah ali naravno, saj sušenje zmanjša encimsko in mikrobno aktivnost 100 Spravilo in predelava laškega smilja (Matin idr. 2021). Uporaba sušilnic omogoča kontrolirane pogoje sušenja (temperatura 35–40 °C), vendar pa je ta način energetsko potraten. Veči- na se poslužuje naravnega sušenja v senci, pri čemer je treba paziti, da rastlinski material ni izpostavljen živalim in pticam (Pohajda idr. 2015). S sušenjem se masa svežega materiala zmanjša za približno 65 % (Matin idr. 2021), kar smo potrdili s poskusi sušenja tudi na UP FAMNIT, kjer se je začetna masa svežega rastlinskega materiala v letih 2023 in 2024 zmanjšala za 64,3 % oz. za 63,3 %. Ponekod se odločajo tudi za drugo žetev jeseni, v mesecu oktobru. V ugod nih poletnih vremenskih razmerah laški smilj ponovno odžene in oblikuje pakobulasta socvetja, v primeru vročega poletja in suše pa je pri- rast slabša, zato v takih razmerah agronomi ne svetujejo jesenske žetve, saj bi rastline izpostavili dodatnemu stresu. Zelo pomemben podatek je pridelek sveže mase na enoto površine, ker lahko služi za oceno pridelka eteričnega olja. V kolekcijskem nasadu UP FAMNIT že več let redno spremljamo pridelke laškega smilja s tehtanjem požetih rastlin. Sveža masa požetega materiala je v letih 2023 in 2024 v povprečju znašala 342 g na rastlino, pridelek na enoto površine pa je od- visen od gostote sajenja. Pri sadilni razdalji 0,7 m x 0,5 m (28.000 rastlin/ ha) se pričakuje pridelek zelene mase 9,58 t/ha, pri 1,0 m x 0,5 m (20.000 rastlin/ha) 6,84 t/ha in pri 1,6 m x 0,80 m (7.800 rastlin/ha) 2,67 t/ha. Ines Pohajda idr. (2015) ter Aleksandra Gavarić idr. (2017) poročajo, da se lahko iz enega hektara pridobi od sedem do osem ton svežega mate- riala, medtem ko Tonka Ninčević (2020) poroča o pridelkih od 7 do 12 t/ ha sveže rastlinske mase. Dobljeni podatki na UP FAMNIT so primerljivi s podatki v omenjenih raziskvah. Večletno spremljanje in izkušnje na UP FAMNIT kažejo, da so pridelki zelene mase ter izpleni eteričnega olja zelo odvisni od genotipa rastli- ne. V nadaljevanju so predstavljeni podatki, pridobljeni z laboratorijsko parno destilacijo (slika 3) sveže mase posameznih rastlin v letu 2023, ter deleži eteričnega olja 16 genetsko različnih rastlin, ki uspevajo v ko- lekcijskem nasadu UP FAMNIT v Ospu v izenačenih okoljskih pogojih. Deleže vsebnosti eteričnega olja smo pridobili iz podatkov o sveži masi rastline in masi eteričnega olja. Najnižje dobljene vrednosti so bile od 0,07 do 0,09 %, najvišji delež eteričnega olja pa je znašal 0,35 % (slika 4). Oljevitost je med leti dokaj stabilna, zato lahko raznolikost v vsebnosti eteričnega olja pri posamezni rastlini pripišemo vplivu genotipa. Iz teh podatkov je razvidno, da izbira genotipa pomembno vpliva na količino 101 Dunja Bandelj idr. Slika 3 Laboratorijska parna destilacija iz ene rast line laškega smilja 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 Delež eteričnega olja (%) 0.10 0.05 0.00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Rastlina Slika 4 Delež eteričnega olja (masa eteričnega olja/sveža masa rastline, izra- žena v %) v posameznih genetsko različnih rastlinah (genotipih), pri-dobljen s parno, laboratorijsko destilacijo na UP FAMNIT v letu 2023 102 Spravilo in predelava laškega smilja 5.00 4.50 4.00 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 Pridelek eteričnega olja (ml eteričenga olja / kg sveže mase) 0.00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Kotel Slika 5 Prikaz volumnov eteričnega olja na kilogram sveže mase laškega smilja, dobljenih pri terenski, parni destilaciji rastlin iz kolekcijske-ga nasada v Ospu med letoma 2020 in 2024 pridelka na enoto površine, saj obstajajo genotipi laškega smilja, ki imajo v povprečju tri- do štirikrat večjo sposobnost sinteze eteričnega olja. Po- dobno ugotavljajo tudi drugi avtorji; Milena Tzanova idr. (2018) poročajo o izplenih od 0,19 do 0,26 %, Maksimović idr. (2017) o izplenih od 0,02 do 0,78 %, Silviya Mollova idr. (2020) pa o izplenih od 0,10 do 0,14 %. Na vsebnost eteričnega olja lahko vpliva tudi razvojna faza rastline. Bianchi- ni idr. (2001) so poročali, da se pridelki eteričnega olja glede na razvojno fazo gibljejo od 0,11 do 0,42 % glede na svežo maso. Realne podatke pridelka eteričnega olja s terena smo pridobili še z de- stilacijo v inoks kotlu s kapaciteto do 13 kg sveže mase. Med letoma 2020 in 2024 smo na UP FAMNIT opravili 29 destilacij svežega rastlinskega materiala iz kolekcijskega nasada v Ospu. V povprečju smo iz 1 kg sveže mase pridobili 2,9 ml eteričnega olja (oz. 2,9 l eteričnega olja, preračuna- no na tono sveže mase): najmanjši volumen je znašal 1,85 ml/kg sveže mase, največji pa 4,75 ml/kg sveže mase (slika 5). Razlike v pridobljenih volumnih med kotli so posledica odbire rastlin po izenačenosti genet- skega materiala za posamezen kotel. Vse rastline pa so bile požete v opti- malnem času, ko je bila odprta tretjina koškov v pakobulastih socvetjih. Ob upoštevanju relativne gostote eteričnega olja laškega smilja, ki znaša 103 Dunja Bandelj idr. 0,902 (Ratajc 2016), bi bili pridelki eteričnega olja v povprečju 2,6 g/kg sveže mase oz. 2,6 kg/t. V odvisnosti od oljevitosti genotipa pa bi lahko pričakovali od najmanj 1,7 do največ 4,28 kg/t. Ines Pohajda idr. (2015) poročajo, da se lahko iz 750 kg sveže mase laškega smilja pridobi 1 kg ete- ričnega olja. Vsebnost eteričnega olja v genotipih UP FAMNIT je skoraj dvakrat večja, saj bi iz 750 kg sveže mase lahko pridobili 1,95 kg eterične- ga olja, kar ponovno potrjuje pomen izbire genotipa. Če podatke terenske destilacije primerjamo s podatki laboratorijske de- stilacije, pri kateri smo glede na izračun v povprečju pridobilli 1,85 kg eteričnega olja/t svežega materiala oz. glede na oljevitost genotipa od najmanj 0,5 do največ 4,3 kg eteričnega olja/t svežega materiala, lahko zaključimo, da so podatki laboratorijske in terenske destilacije primer- ljivi. Ines Pohajda idr. (2015) poročajo, da se iz 1 ha lahko pridobi od 8 do 12 kg eteričnega olja. Iz podatkov UP FAMNIT pa je razvidno, da se lahko, v odvisnosti od gostote sajenja, z različno oljevitimi genotipi na 1 ha pridobi od 4,9 (7.800 rastlin/ha) do 17,7 kg eteričnega olja (28.000 sadik/ha). Pridobivanje eteričnega olja in hidrolata Za pridobivanje eteričnega olja in hidrolata iz večjih količin rastlinskega materiala za potrebe farmacevtske ter kozmetične industrije se najpo- gosteje uporablja parno destilacijo ali kombinirano destilacijo z vodo in vodno paro. Pri kombinirani destilaciji z vodo in vodno paro se uporablja sistem enega kotla (slika 6), ki vsebuje prostor za vodo, nad njim pa je perforirana plošča, na katero se nalaga rastlinski material. Perforirana plošča preprečuje neposreden stik vode z rastlinskim materialom. Rast- linski material se na ploščo polaga in tlači tako, da bo para čim težje in počasi prehajala čezenj ter na svoji poti ponesla s sabo čim več hlapnih spojin. Para, obogatena s spojinami, nato potuje preko cevi v kondenza- tor, kjer se ohladi in utekočini. Mešanica eteričnega olja in vode se nato v florentinski posodi, zaradi razlike v gostoti in topnosti, loči na oljno in vodno fazo. Pri destilaciji s paro se uporablja sistem dveh kotlov (slika 7); prvi je namenjen ustvarjanju vodne pare, ki se nato po ceveh dovaja v drugi kotel z rastlinskim materialom. Toplota vodne pare poruši celične strukture rastline, zato se esencialne spojine sproščajo (Tongnuanchan in Benjakul 2014). Produkta obeh načinov destilacije sta hidrolat, ki predstavlja vodno fazo in vsebuje v vodi topne spojine, ter eterično olje – oljna faza, ki vsebuje hlapne snovi, ki niso topne v vodi (Kočevar Glavač 104 Spravilo in predelava laškega smilja kondenzator odvod tople dovod vode hladne vode para, obogatena z eteričnim oljem eterično olje mešanica rastlinski eteričnega material olja in perforirana hidrolata para plošča voda hidrolat toplota separator Slika 6 Kombinirana destilacija z vodo in vodno paro kondenzator para, obogatena z eteričnim oljem dovod vode odvod tople hladne vode para l eterično ki olje ia mešanica er voda tlins eterič- ras nega mat olja toplota perforirana in hidrolata plošča hidrolat dovod vodne pare generator separator pare Slika 7 Sistem dveh kotlov za destilacijo z vodno paro 2018). Parno destilacijo se regulira s količino pare in z dolžino destilacije, kar vpliva na sestavo eteričnega olja (El Asbahani idr. 2015). 105 Dunja Bandelj idr. Shranjevanje eteričnega olja in hidrolata Pravilno shranjevanje eteričnega olja je pomembno za ohranjanje stabil- nosti in farmakoloških lastnosti, saj so hlapne spojine nestabilne, občut- ljive in podvržene reakcijam razgradnje ter drugim kemijskim spremem- bam. Najpogostejše reakcije v eteričnem olju so izomerizacija, oksidacija, dehidrogenacija, polimerizacija in toplotna preureditev. Lipofilni terpe- noidi oz. terpeni, ki predstavljajo največji delež v eteričnem olju, so ter- molabilni, tj. občutljivi na toploto. Spojine običajno tudi hitro oksidirajo ali hidrolizirajo. Dejavniki, ki vplivajo na obstojnost bioloških učinkovin, so temperatura, prisotnost kisika, svetlobe in vode. Vidna in ultravijolič- na svetloba pospešujeta avtooksidacijske procese, pri čemer nastajajo alkilni radikali. Še posebej so na svetlobo občutljivi monoterpeni. Tudi visoka temperatura pospešuje nastanek številnih prostih radikalov za- radi avtooksidacije in razgradnje vodikovih peroksidov. Podobno vlogo ima tudi prisotnost kisika, ki se pri nižjih temperaturah topi v tekočinah. Oksidacija eteričnega olja se pospeši pri povečani koncentraciji kisika. Pri eteričnem olju rožmarina in bora so ugotovili, da sobna temperatura pospešuje nastanek peroksidov, medtem ko so pri eteričnem olju sivke in timijana ugotovili povišano koncentracijo že pri 5 °C, kar nakazuje po- membnost prisotnosti topnega kisika in raznoliko kemijsko modifikaci- jo eteričnega olja različnih rastlinskih vrst. Za ohranjanje kakovosti se je treba izogibati posodam, ki vsebujejo težke kovine, npr. bakru in železu, ki spodbujata avtooksidacijo, še posebej če so v eteričnem olju prisotni vodikovi peroksidi. Tudi prisotnost vode deluje kvarljivo na eterično olje (Vaishnavi idr. 2021). Raziskav na področju sprememb kemijske sestave, obstojnosti in vpliva pogojev shranjevanja na kakovost eteričnega olja ni veliko oz. raziskovalci menijo, da je treba eterično olje vsake rastlinske vrste preučiti posebej (Turek in Stintzing 2013; Odak idr. 2018; Vaishna- vi idr. 2021). Ilijana Odak idr. (2018) so preučevali obstojnost eteričnega olja laškega smilja in navadnega brina v odvisnosti od svetlobe, tempera- ture in prisotnosti kisika. Ugotovili so, da je eterično olje laškega smilja v primerjavi z eteričnim oljem navadnega brina občutljivejše na staranje. Spremembe so bile manj izrazite, če so ga hranili v temi in dušikovi at- mosferi. Svetloba je spodbudila številne kemijske spremembe, ki so se pokazale s povečano vsebnostjo cikličnih seskviterpenov italicena in izo- italicena kot tudi povečano količino aromatičnega seskviterpena α-kur- kumena. Kisik je spodbujal povečanje α-kurkumena. Te spremembe so pripisali kemičnim transformacijam γ-kurkumena, ki je pomembna in dragocena spojina v eteričnem olju laškega smilja. Avtorji svetujejo, 106 Spravilo in predelava laškega smilja da se z namenom ohranitve začetnih koncentracij bioloških spojin ete- rično olje hrani v temi in na sobni temperaturi oz. v čisti dušikovi atmos- feri. Življenjska doba eteričnega olja je torej odvisna od številnih dejav- nikov shranjevanja, za razjasnitev kemijskih sprememb pa so potrebne dodat ne raziskave. Hidrolati so običajno stranski produkti destilacije, čeprav so aromatera- pevti mnenja, da bi jih zaradi bioloških učinkov in njihove uporabnosti morali obravnavati kot pomemben produkt destilacije. Običajno so komp leksna mešanica vodne faze s spojinami, topnimi v vodi, v sledeh pa vsebujejo tudi eterično olje (D’Amato idr. 2018; Shafie idr. 2022). Prav zaradi vodne faze pa so, v primerjavi z eteričnem oljem, manj obstojni in bolj podvrženi kemijskim spremembam. Hidrolate je priporočljivo hraniti v mrzlem prostoru, v do vrha napolnjenih aseptičnih vsebnikih, s čim manjšo prisotnostjo zraka, ki bi lahko deloval kvarljivo. Ob pravil- nem shranjevanju je lahko njihova življenjska doba do enega leta ali več. Pozornost je treba nameniti tudi mikrobni združbi (bakterije in glive), ki bi bila lahko prisotna ob shranjevanju hidrolata. Labadie idr. (2015) so, denimo, v hidrolatih cvetov pomarančevcev in cvetov vrtnic opazili heterogeno združbo Pseudomonas spp., kompleks Burkholderia cepacia, Acetobacteriaceae in Rhodospirillaceae, ki lahko proliferirajo do rela- tivno velikega števila (do 106–107 CFU/mL), kljub prisotnosti eteričnega olja v sledovih (D’Amato idr. 2018). Poleg tega lahko nekateri sevi, ki kon- taminirajo hidrolat, vplivajo na njegov profil hlapnih spojin. Baydar idr. (2013) so predlagali odstranitev kontaminantov s fizikalnimi metodami, kot sta pasterizacija ali tretiranje z žarki UV, vendar lahko uporaba to- vrstnih metod prav tako spremeni aromatični profil hidrolata. Kemijske spremembe, ki so jim hidrolati podvrženi med obdobjem shranjevanja, so v veliki meri odvisne od časa in temperature shranjevanja (Garneau idr. 2014). Rok uporabnosti hidrolata bo odvisen tudi od njegove kemij- ske sestave in intrinzične protimikrobne aktivnosti vsebovanih spojin ter morebitne kontaminacije med pakiranjem. Viri Baydar, H., H. Kulea şan, N. Kara, H. Seçilmiş-Canbay in S. Kineci. 2013. »The Effects of Pasteurization, Ultraviolet Radiation and Chemiclal Preserva-tives on Microbial Spoilage and Scent Composition of Rose Water.« Jour-nal of Essential Oil Bearing Plants 16 (2): 151–160. 107 Dunja Bandelj idr. Bianchini, A., P. Tomi, J. Costa in A. F. Bernardini. 2001. »Composition of He- lichrysum italicum (Roth) G. Don fil. subsp. italicum Essential Oils from Corsica (France).« Flavour and Fragrance Journal 16 (1): 30–34. D’Amato, S., Serio, A., Chaves López, C. in Paparella, A. 2018. »Hydrosols: Bi- ological Activity and Potential as Antimicrobials for Food Applications.« Food Control 86:126–137. El Asbahani, A., K. Miladi, W. Badri idr. 2015. »Essential Oils: From Extrac- tion to Encapsulation.« International Journal of Pharmaceutics 483 (1– 2): 220–243. Garneau, F.-X., G. Collin in H. Gagnon. 2014. »Chemical Composition and Stability of the Hydrosols Obtained During Essential Oil Production. I. The case of Melissa officinalis L. and Asarum canadense L.« American Journal of Essential Oils and Natural Products 2 (1): 54–62. Gavarić, A., S. Jokić, M. Molnar, S. Vidović, J. Vladić in M. Aćimović. 2017. »Helichrysum: The Current State of Cultivation, Production and Uses.« V Medicinal Plants: Production, Cultivation and Uses, uredila M. Aubert in L. Nicolas. Nova Science. Kočevar Glavač, N. 2018. »Pridobivanje in vrednotenje rastlinskih izvleč- kov.« Farmacevtski vestnik 69 (4): 259–264. Labadie, C., C. Ginies, M.-H. Guinebretiere, C. M. G. C. Renard, C. Cerutti in F. Carlin F. 2015. »Hydrosols of Orange Blossom (Citrus aurantium), and Rose Flower (Rosa damascena and Rosa centifolia): Support the Growth of a Heterogeneous Spoilage Microbiota.« Food Research International 76 (Del 3): 576–586. Maksimovic, S., V. Tadic, D. Skala in I. Zizovic. 2017. »Separation of Phyto- chemicals from Helichrysum italicum: An Analysis of Different Isolati- on Techniques and Biological Activity of prepared Extracts.« Phytoche- mistry 138 (22): 9-28. Matin, A., I. Pavkov, M. Grubor, V. Jurišić, M. Kontek, F. Jukić in T. Krička. 2021. »Influence of Harvest Time, Method of Preparation and Method of Distillation on the Qualitative Properties of Organically Grown and Wild H. italicum Immortelle Essential Oil.« Separations 8 (10): 167. Mollova, S., H. Fidan, D. Antonova idr. 2020. »Chemical Composition and Antimicrobial and Antioxidant Activity of Helichrysum italicum (Roth) G. Don Subspecies Essential Oils.« Turkish Journal of Agriculture and Forestry 44 (4): 371–378. Ninčević, T. 2020. »Genetska i biokemijska raznolikost sredozemnog smilja (Helichrysum italicum /Roth/ G. Don).« Doktorska disertacija, Sveuči- lište u Zagrebu. 108 Spravilo in predelava laškega smilja Odak, I., T. Lukic in S. Talic. 2018. »Impact of Storage Conditions on Altera- tion of Juniper and Immortelle Essential Oils.« Journal of Essential Oil Bearing Plants 21 (3): 614–622. Pohajda, I., G. Dragun, G in L. Puharić Visković. 2015. Smilje. Savjetodavna služba. Rajić, M., M. Bilić, K. Aladić, D. Šimunović in T. Pavković. 2015. »Od tradici- onalne uporabe do znanstvenog značaja: cvijet smilja.« Glasnik Zaštite Bilja 38 (6): 16–26. Ratajc, P. 2016. »Kaj je več: 5 gramov ali 5 mililitrov eteričnega olja?« https:// petraratajc.com/2016/05/11/kaj-je-vec-5g-ali-5ml/. Shafie, M. H., M. L. Kamal, N. A. A. Razak idr. 2022. »Antioxidant and Anti- microbial Activity of Plant Hydrosol and Its Potential Application in Co-smeceutical Products.« Jundishapur Journal of Natural Pharmaceutical Products 17 (4): e124018. Tongnuanchan, P., in S. Benjakul. 2014. »Essential Oils: Extraction, Bioacti- vities, and Their Uses for Food Preservation.« Journal of Food Science 79 (7): 1231–1249. Turek, C., in F. C. Stintzing. 2013. »Stability of Essential Oils: A Review.« Com- prehensive Reviews in Food Science and Food Safety 12 (1): 40–53. Tzanova, M., N. Grozeva, M. Gerdzhikova, V. Atanasov, S. Terzieva in R. Pro- danova. 2018. »Biochemical Composition of Essential Oil of Corsican Helichrysum italicum (Roth) G. Don, Introduced and Cultivated in South Bulgaria.« Bulgarian Journal of Agricultural Science 24 (6): 1071–1077. Vaishnavi, B. C., S. J. Ananya, N. Y. Jitendra in B. S. Rajendra. 2021. »Strategies to Improve Stability of Essential Oils.« Journal of Pharmaceutical and Science Research 13 (7): 416–425. 109 7 Tehnološki postopki pridobivanja pripravkov iz laškega smilja Katja Kramberger Fakulteta za vede o zdravju, Univerza na Primorskem © 2025 Katja Kramberger https://doi.org/10.26493/978-961-293-525-2.7 Uvod Ekstrakcija in predelava zdravilnih rastlin se izvajata z namenom nepo- srednega uživanja le-teh kot tradicionalnih zdravil rastlinskega izvora ali priprave za raziskovalne namene. Ustrezna priprava zdravilnih rastlin za raziskovalne namene je ključna za doseganje kakovostnih rezultatov raz- iskav. Vključuje pravilno in časovno ustrezno nabiranje rastline, morfo- loško določanje in avtentikacijo rastline s strani ustreznega strokovnjaka, ustrezno sušenje ter mletje suhega materiala. Predpripravi rastlinskega materiala sledi postopek ekstrakcije, pridobljeni izvleček pa lahko na- dalje frakcioniramo in iz njega izoliramo posamezne bioaktivne spojine. Pred nadaljnjimi biološkimi testiranji je treba določiti tudi kakovost in količino izvlečka oz. bioaktivnih spojin. Za pridobivanje kakovostnega pripravka je ključna izbira ustrezne ekstrakcijske metode, primernega topila, metode frakcioniranja izvlečka in načina identifikacije bioaktiv- nih spojin. Izbor ustreznih metod pa je odvisen tudi od želene aplikacije izvlečka (Abubakar in Haque 2020). Ekstrakcija Ekstrakcija zdravilnih rastlin je postopek ločevanja želenih bioaktivnih spojin ali sekundarnih presnovkov rastlin, kot so flavonoidi, terpeni in glikozidi od surovega neaktivnega materiala. Poznamo več različnih Bandelj, D., Z. Jenko Pražnikar in A. Petelin, ur. 2025. 111 Laški smilj. Založba Univerze na Primorskem Katja Kramberger načinov ekstrakcije; od destilacije, ekstrakcije s topili, ki jo lahko pospe- šimo s pomočjo ultrazvoka, mikrovalov, pulzirajočega električnega polja, povišanega tlaka ali uporabe encimov, do uporabe metod zelene tehnolo- gije, kot je ekstrakcija s superkritičnimi tekočinami. Pri konvencionalnih postopkih ekstrakcije, kot so maceracija, perkolacija in ekstrakcija pod refluksom, se večinoma uporabljajo organska topila v velikih količinah, postopek ekstrakcije pa je dolgotrajen. Novejši oz. bolj zeleni postopki, kot so ekstrakcija s superkritičnimi tekočinami, tekočinska ekstrakcija pod pritiskom in ekstrakcija z mikrovalovi, nudijo določene prednosti, kot so manjše porabe organskih topil, krajši čas ekstrakcije in večja selek- tivnost (Zhang idr. 2018). V nadaljevanju bomo opisali le tiste postopke, ki so bili, glede na objavljene vire, uporabljeni za pripravo izvlečkov oz. izolacijo spojin iz laškega smilja. Ekstrakcija bioaktivnih spojin s topili je najpogostejši način ekstrakcije in poteka po sledečih stopnjah: (1) topilo prodira v trdni rastlinski material; (2) topljenec se raztopi v topilu ali mešanici topil; (3) topljenec difundira iz rastlinskega materiala; (4) topilo z ekstrahiranimi bioaktivnimi spoji- nami (topljenci) se odstrani od rastlinskega materiala (Zhang idr. 2018). Faktorji, ki vplivajo na učinkovitost ekstrakcije Faktorji, ki lahko povečajo difuzivnost in topnost, v posameznih korakih ekstrakcije olajšajo sam proces in povečajo izkoristke ekstrakcije. To so fizikalno-kemijske lastnosti ekstrakcijskega topila, velikost trdnih delcev rastlinskega materiala, razmerje med topilom in rastlinskim materialom, temperatura ekstrakcije in čas trajanja ekstrakcije (Zhang idr. 2018). Izbira topila Izbira topila je najpomembnejši parameter učinkovitosti ekstrakcije. Glede na zakon o podobnosti in mešanju snovi oz. po načelu »podob- no se topi v podobnem« bodo topila s podobno polarnostjo, kot jo imajo topljenci oz. bioaktivne spojine, ki jih želimo izolirati, učinkovitejša pri ekstrakciji teh spojin (Zhang idr. 2018). Topila, ki se običajno uporablja- jo pri ekstrakciji zdravilnih rastlin, so bodisi polarna topila (npr. voda, etanol), srednje polarna topila (npr. aceton, diklorometan) ali nepolarna topila (npr. heksan, eter, kloroform). Alkohola, kot sta etanol in metanol, veljata za najuniverzalnejši topili in se ju posledično tudi najpogosteje uporablja. Pri izbiri topila pa imata poleg topnosti in selektivnosti vlogo tudi cena in toksičnost uporabljenega topila (Zhang idr. 2018; Abubakar 112 Tehnološki postopki pridobivanja pripravkov iz laškega smilja Preglednica 1 Lastnosti nekaterih pogosto uporabljenih topil (prirejeno po Abubakar in Haque 2020) Topilo Lastnosti Prednosti Slabosti Voda Najpolarnejše • Raztaplja širok nabor • Spodbuja rast bakterij in topilo. (polarnih) spojin. plesni. • Poceni, netoksično, • Lahko povzroči hidrolizo. nevnetljivo topilo. • Za koncentriranje izvlečka potrebno veliko energije. Alkohol Polarno topilo, • Deluje kot konzervans • Ne raztaplja maščob in mešljivo z vodo. pri konc., večjih od voskov. 20 %. • Vnetljivo in hlapno topilo. • Netoksično pri nizkih konc. • Za koncentriranje izvlečka potrebno malo energije. Aceton Srednje polarno • Raztaplja tako polarne • Vnetljiv. topilo, mešljivo kot nepolarne snovi. z vodo kot tudi • Hitro se upari. z nepolarnim heksanom. Kloroform Nepolarno • Brezbarven, topen v • Sedativni in karcinogeni topilo, primerno alkoholu. učinek. za izolacijo terpenov, maščob in olj. in Haque 2020). V preglednici 1 so predstavljene prednosti in slabosti ne- katerih pogosto uporabljenih topil. Velikost delcev rastlinskega materiala V splošnem velja, da manjša kot je velikost delcev, učinkovitejša bo ek- strakcija, saj lahko topilo bolje prodre v rastlinski material in difundira topljence. Če bodo delci predrobni, se bo preveč topila absorbiralo v trdni material, kar lahko oteži nadaljnji postopek filtracije. Temperatura Visoka temperatura poveča topnost in difuzijo ter s tem učinkovitost eks- trakcije. Vendar pa lahko previsoka temperatura poveča ekstrakcijo ne- želenih snovi oz. nečistoč ter povzroči razgradnjo termolabilnih spojin. 113 Katja Kramberger Čas ekstrakcije Učinkovitost ekstrakcije se bo s podaljševanjem trajanja ekstrakcije ve- čala, vendar ko se doseže ravnovesje med topljencem znotraj in zunaj rastlinskega materiala, daljšanje časa ekstrakcije ne bo več vplivalo na večji izkoristek. Razmerje topilo : rastlinski material Večje kot bo razmerje med topilom in rastlinskim materialom, večji bo izkoristek ekstrakcije, s tem da večje kot je razmerje, daljši bo proces kon- centriranja izvlečka (Zhang idr. 2018). Ekstrakcijske metode Destilacija Parna destilacija in hidrodestilacija sta dva najpogostejša načina za pri- dobivanje eteričnih olj, saj sta cenovno najugodnejša. Pri parni destilaciji para prodira v rastlinski material, kar omogoči uparitev hlapnih spojin. Hlapne spojine se v kondenzatorju, kamor doteka hladna voda, uteko- činijo in zberejo v zbirni posodi, kjer imamo na vrhu plast eteričnega olja, pod njo pa plast vode (Kumar in Tripathi 2011). Ta vodna faza, ki je stranski produkt destilacije, se imenuje hidrolat ali aromatična voda in vsebuje sledove eteričnega olja ter druge vodotopne spojine (Almeida idr. 2024). V primeru hidrodestilacije se material za nekaj časa namoči v vodi, potem se namočen material segreva, hlapne spojine pa se skupaj z vodno paro uparijo in pod refluksom kondenzirajo. Ker destilacija po- teka pri visoki temperaturi, je možen razpad nekaterih bioaktivnih spo- jin. Prisotnost vode lahko privede tudi do hidrolize estrov, polimerizacije aldehidov in razgradnje drugih spojin. S tega vidika je parna destilacija primernejša izbira za izolacijo eteričnih olj iz toplotno občutljivih rastlin. Slabosti omenjenih metod so slabi izkoristki eteričnega olja, izguba ne- katerih hlapnih spojin in dolg čas izolacije (Pheko-Ofitlhile in Makhzo- um 2024). Za destilacijo nadzemnih delov laškega smilja se največkrat uporablja hid rodestilacija v Clavengerjevi aparaturi, s katero lahko določimo tudi količino pridobljenega eteričnega olja, nekateri avtorji pa so uporabili tudi parno destilacijo v aparatu tipa spring (Maksimovic idr. 2017). Maceracija Maceracija je najpreprostejši način ekstrakcije, katere slabosti sta dolg čas ekstrakcije in slaba učinkovitost, saj poteka pri sobni temperaturi. 114 Tehnološki postopki pridobivanja pripravkov iz laškega smilja Ravno zaradi slednjega pa je tak način primeren za izolacijo termolabil- nih spojin. Učinkovitost maceracije lahko povečamo z dodatkom ultra- zvoka, mikrovalov ali s segrevanjem (Zhang idr. 2018). Pri postopku maceracije se grobo mlet material položi v posodo in prelije s topilom, tako da je popolnoma prekrit. Posodo se nato zapre in material pusti namakati vsaj tri dni pri sobni temperaturi, lahko tudi zaščitenega pred svetlobo. Vmes vsebino občasno premešamo. Po koncu ekstrakci- je se izvleček loči od namočenega rastlinskega materiala s filtracijo ali z odlivanjem. Topilo se lahko odstrani z izparevanjem (Abubakar in Haque 2020). Najpogosteje uporabljana topila za pripravo izvlečkov in izolacijo učin- kovin iz smilja so aceton, metanol ter etanol, v nekaterih raziskavah pa so uporabili tudi kloroform, petrol eter, diklorometan, dietil eter in hek- san. Izkoristki ekstrakcije so bili glede na objavljene podatke med 2,2 in 12,5 % (Maksimovic idr. 2017). Maceracija z lipidi (olji ali mastmi) je eden izmed postopkov pridobivan- ja aromatičnih maceratov, ki se pogosto uporabljajo za izdelavo domačih mazil in drugih kozmetičnih izdelkov. Na Korziki sveže cvetove smilja po- berejo in položijo v steklenico z oljčnim oljem. Nato steklenice zaprejo in jih postavijo na sonce za vsaj tri tedne. Po koncu ekstrakcije rastlinski material dobro odcedijo, da iz njega iztisnejo čim več učinkovin. Takšen macerat je bogat z nepolarnimi spojinami, macerirano olje pa je zaradi solarizacije bolj tekoče in vpojnejše ob nanosu na kožo. Lahko je osnova za pripravo drugih kozmetičnih izdelkov ali se kot takšno uporablja za masažo pri brazgotinah, modricah (Production Farm Est. Palneca b. l.). Priprava poparkov Pri pripravi poparkov gre za podobno načelo kot pri maceraciji, s tem da gre tukaj za bistveno krajše namakanje v topilu, ki je v večini prime- rov vroča voda. Poparke pripravimo tako, da fino mlet rastlinski material prelijemo z vročo ali vrelo vodo in ga pustimo namakati v vodi od pet do 15 minut. Po tem času poparek precedimo, da odstranimo rastlinski material. Ta metoda je primerna za izolacijo dobro (vodo)topnih spojin (Abubakar in Haque 2020). Priprava poparkov je zaradi visoke tempera- ture učinkovitejša od maceracije, lahko pa na tak način izgubimo nekaj toplotno občutljivih biokativnih spojin. Poparki se največkrat pripravljajo sveži, tik pred uporabo. Na tak način pripravljamo vse čaje, zelo priljubljene osvežilne napitke, ki so lahko pravi 115 Katja Kramberger čaji, pripravljeni iz listov čajevca, ali sadni ter zeliščni poparki, kot tudi zdravilne čaje, ki morajo biti ustrezne kakovosti in imeti točno predpisan način priprave (Rocha idr. 2020). Poparki iz smilja so najpogosteje pripravljeni izvlečki v ljudski medici- ni, njihovo kemijsko sestavo in učinke pa so preučevali tudi Catarina G. Pereira idr. (2017) ter Katja Kramberger idr. (2021). Catarina G. Pereira idr. (2017) so 1 g suhe rastline (ločene na korenine, vegetativne dele in cvetove) prelili z 200 ml vrele vode in poparek po petih minutah prece- dili (Pereira idr. 2017). V naših raziskavah na Univerzi na Primorskem, Fakutleti za vede o zdravju (UP FVZ) smo za pripravo poparka uporabili samo nadzemne dele rastline (liste, stebla in cvetove), poparek pa smo precedili po desetih minutah (Kramberger idr. 2021). Priprava prevretkov Pri tej metodi gre za kontinuirano ekstrakcijo z vročo vodo. Prevretek pripravimo tako, da dobro mlet rastlinski material prelijemo z vrelo vodo in ga še nekaj časa kuhamo na ognju, navadno ne dlje kot 15 minut (Abubakar in Haque 2020). Tovrstna ekstrakcija je sicer učinkovitejša od maceracije in priprave poparka, vendar pa ni primerna izbira za termo- labilne in hlapne spojine. V prevretkih so navadno prisotne tudi večje količine vodotopnih nečistoč (Zhang idr. 2018). Podobno kot poparki so tudi prevretki pogosto pripravljeni izvlečki v ljudski medicini. Catarina G. Pereira idr. (2017) so prevretke iz H. itali- cum subsp. picardii pripravili s petminutnim vretjem 1 g suhega materi- ala v vreli vodi. Prevretke so pripravili samo iz korenin ali iz vegetativnih delov ali samo iz cvetov (Pereira idr. 2017). Ekstrakcija po Soxhletu Ta vrsta ekstrakcije združuje uporabo ekstrakcije pod refluksom in per- kolacije – postopka ekstrakcije, kjer se topilo ves čas menjava s svežim. Soxhletov aparat (steklena aparatura podobna destilatorju) omogoča av- tomatizirano in kontinuirano ekstrakcijo z visoko učinkovitostjo (Zhang idr. 2018). Zmlet rastlinski material se napolni v porozno vrečko, skozi katero po kapljicah prehaja kondezirano topilo. Ko se ekstrakcijska poso- da napolni s kondenziranim topilom, se le-to skupaj z izvlečkom vrne v bučko, kjer se topilo ponovno upari in preko kondenzorja v tekoči obliki vrne v ekstrakcijsko posodo. Ekstrakcija poteka tako dolgo, dokler rast- linski material ni popolnoma ekstrahiran (Abubakar in Haque 2020). 116 Tehnološki postopki pridobivanja pripravkov iz laškega smilja Čas takšne ekstrakcije je posledično krajši in poraba topil je v primerjavi z maceracijo ali perkolacijo manjša. Ekstraktov tudi ni treba filtrirati, saj rastlinski material ostane v vrečki. Zaradi segrevanja pa lahko pride do razpada nekaterih občutljivih učinkovin (Zhang idr. 2018). Maja Molnar idr. (2017) so za ekstrakcijo 5 g cvetov laškega smilja upora- bili Soxhletov aparat in 150 ml n-heksana kot topila. Ekstrakcija je pote- kala osem ur, izkoristek pa je bil približno petodstoten (Molnar idr. 2017). Ekstrakcija z uporabo ultrazvoka Pri ekstrakciji z uporabo ultrazvoka, imenovani tudi ultrazvočna ekstrak- cija ali sonikacija, izkoriščamo energijo ultrazvoka pri frekvencah, večjih od 20 KHz. Ultrazvok povzroči kavitacijo topila in pospeši raztapljanje ter difuzijo topljenca kot tudi prenos toplote, kar izboljša učinkovitost ek- strakcije. Naslednje prednosti te metode so tudi majhna poraba topil in energije, skrajšanje časa ekstrakcije in uporaba nižjih temperatur. Meto- da je tako primerna za ekstrakcijo termolabilnih spojin, lahko pa energija ultrazvoka povzroči razpad nekaterih občutljivih spojin zaradi nastanka prostih radikalov (Zhang idr. 2018; Abubakar in Haque 2020). Brigida D‘Abrosca idr. (2013) so pripravili metanolni izvleček iz listov ali stebel laškega smilja s pomočjo ultrazvoka. Posamezna ekstrakcija je tra- jala eno uro. Dobljena izvlečka so prečistili, frakcionirali in izolirali posa- mezne bioaktivne spojine (D’Abrosca idr. 2013). V naši raziskavi (Kram- berger idr. 2020) smo pripravili izvlečke laškega smilja podvrst italicum in tyrrhenicum. Ekstrakcijo smo izvedli s hladno vodo v dveh korakih – 2,5 g suhega rastlinskega materiala smo prelili s 30 ml hladne vode in ga 60 minut ekstrahirali v ultrazvočni kadički, odlili ekstrakt in preostali rastlinski material ponovno ekstrahirali z 20 ml sveže hladne vode še 30 minut. Oba ekstrakta smo nato združili. Tak izvleček je imel sicer visoko vsebnost fenolnih spojin, njegovo antioksidativno delovanje pa je bilo šibko (Kramberger idr. 2020). Ekstrakcija s superkritičnim CO2 Alternativa konvencionalnim postopkom ekstrakcije je ekstrakcija s su- perkritičnimi tekočinami. Superkritična tekočina ima podobno topnost kot tekočina in podobno difuzivnost kot plin, zato lahko raztaplja širok nabor naravnih spojin. Najpogosteje se za tovrstno ekstrakcijo uporab- lja superkritični ogljikov dioksid – S-CO , ker ima nizko kritično tempe-2 raturo (31 °C), je selektiven, inerten, netoksičen in poceni. Zaradi svoje 117 Katja Kramberger nepolarnosti je S-CO idealen za izolacijo lipofilnih snovi, kot so lipidi in 2 eterična olja. Z ustreznim spreminjanjem parametrov tlaka in tempera- ture pa lahko izoliramo tudi polarnejše spojine. Pri milejših pogojih (P = 90–100 bar in T = 40–50 °C) tako dobimo eterična olja, pri ostrejših pa nepolarne in srednje polarne fenolne spojine (P = 600 bar; T = do 120 °C). Za izolacijo polarnejših polifenolov je treba dodati organski modifikator (npr. etanol, metanol) (Zhang idr. 2018). Ekstrakcija s superkritičnimi te- kočinami ima kar nekaj prednosti v primerjavi s tradicionalnimi postopki zaradi možnosti spreminjanja parametrov ekstrakcije, kar omogoča izo- lacijo različnih razredov spojin, tudi termolabilnih. Je okolju prijaznejša metoda, saj porabimo manj organskih topil, ter energetsko varčnejša, saj ni treba dovajati energije za odstranjevanje topil in koncentriranje konč- nih izvlečkov (Reverchon in De Marco 2006). Nekaj raziskav kemijske sestave laškega smilja je bilo narejenih tudi na izvlečkih s S-CO . Pogoji ekstrakcije so bili med 80 in 350 bar, med 35,86 2 in 64,14 °C in so trajali od 1,5 do štiri ure. Izkoristki eks trakcije so bili v območju 0,35 do 6,31 %. Spojine, ki so jih izolirali, so bile večinoma nepo- larni terpeni, predvsem mono- in seskviterpeni, ter drugi ogljikovodiki, kisline, estri in voski (Maksimovic idr. 2017). Stela Jokić idr. (2016) so upo- rabili tovrstno ekstrakcijo za selektivno izolacijo kumarina skopoletina iz cvetov laškega smilja. Največjo vsebnost skopoletina (1,933 mg/100 g) je imel izvleček, pripravljen pri 20 MPa in 40 °C (Jokić idr. 2016). Separacijske metode Surovi izvlečki, pripravljeni po zgoraj opisanih metodah, imajo kompleks- no kemijsko sestavo, saj vsebujejo številne bioaktivne spojine in druge izolirane spojine. Surove izvlečke je tako treba še frakcionirati in prečisti- ti, da dobimo aktivno frakcijo izvlečka oz. čisto bioaktivno spojino. Ločba temelji na fizikalnih in kemijskih razlikah med posameznimi spojinami v izvlečku. Za izolacijo čiste spojine iz kompleksnih rastlinskih vzorcev so najprimernejše razne kromatografske tehnike, predvsem kolonska kro- matografija (Zhang idr. 2018). Frakcionacija Za frakcionacijo izvlečka je navadno treba navlažiti posušen surovi iz- vleček oz. ga popolnoma raztopiti v vodi, prenesti v lij ločnik, pretresti in pustiti, da se posede. Nato se k izvlečku dodaja topila po naraščujoči po- larnosti; najprej npr. n-heksan, ki je najbolj nepolaren, nato kloroform, sledi srednje polaren aceton in nazadnje n-butanol. Najprej se izvlečku 118 Tehnološki postopki pridobivanja pripravkov iz laškega smilja Preglednica 2 Pregled različnih metod za ekstrakcijo naravnih spojin (prirejeno po Zhang idr. 2018) Metoda Topilo Temperatura Tlak Čas Volumen Polarnost organskega izoliranih topila spojin Maceracija Voda ali Sobna T Atm Dolg Velik Odvisno od nevodna topila topila Priprava Voda Voda s T Atm Kratek Nič Polarna poparka 70–100 °C Priprava Voda Segrevanje Atm Kratek Nič Polarna prevretka Ekstrakcija Organska Segrevanje Atm Dolg Srednji Odvisno od po Soxhletu topila topila Ekstrakcija z Voda in Sobna T ali Atm Kratek Srednji Odvisno od ultrazvokom nevodna segrevanje topila topila Superkritična Superkritični Blizu sobne T Visok Kratek Nič Nepolarna ekstrakcija CO2 do srednje polarna Destilacija Voda Segrevanje Atm Dolg Nič Nepolarna (eterična olja) doda količino najmanj polarnega topila, n-heksana, in vsebino močno pretrese. Ko se fazi ločita, se odstrani spodnjo vodno fazo, nepolarno fazo, ki predstavlja prvo frakcijo, pa se prelije v čisti vsebnik. Vodni fazi se ponovno doda enako količino n-heksana in po stresanju loči faze. Posto- pek ponavljamo, dokler po dodatku n-heksana ni več znatnega premika vodnega izvlečka v nepolarno fazo. Potem sledi dodatek polarnejšega to- pila, kloroforma. Nepolarno fazo po vsaki ločbi zbiramo, da dobimo nas- lednjo frakcijo izvlečka. Potem se preostalemu vodnemu izvlečku doda naslednje topilo, aceton, da dobimo tretjo frakcijo, in nazadnje n-buta- nol za četrto frakcijo. Po koncu vseh frakcionacij ostane vodna (peta) frakcija izvlečka (Abubakar in Haque 2020). Čiščenje in dodatna ločba Frakcionirane izvlečke nato očistimo oz. dodatno frakcioniramo z upo- rabo kromatografskih tehnik. Ločba spojin poteka glede na njihovo veli- kost, obliko in naboj. Sistem vsebuje mobilno fazo, ki je navadno enaka ekstrakcijskemu topilu, in stacionarno fazo. Vezava spojin na stacionarno fazo lahko temelji na mehanizmih adsorpcije, porazdeljevanja, afinitete vezave, ionske izmenjave ali velikostne izključitve (Abubakar in Haque 2020). 119 Katja Kramberger V začetnih fazah ločbe se najpogosteje uporablja adsorpcijsko kolonsko kromatografija, saj je preprosta, ima visoko kapaciteto in je stroškovno ugodna. Ločba poteka na osnovi razlik posameznih spojin za tvorbo in- terakcij s površino adsorbenta. Izbira ustreznega adsorbenta (stacionarne faze) kot tudi mobilne faze je ključnega pomena za doseganje dobre ločbe spojin in maksimalni izkoristek ciljnih spojin. V večini primerov stacio- narna faza vsebuje silikagel, ki je polarni adsorbent, na katerega se vežejo molekule z vodikovimi vezmi in interakcijami dipol–dipol. Polarne spo- jine se bodo torej dalj časa zadržale na koloni v primerjavi z nepolarnimi. Stacionarna faza so lahko tudi poliamidi, ki glede na sestavo mobilne faze tvorijo bodisi hidrofobne bodisi vodikove vezi. Če je mobilna faza voda, bodo poliamidi delovali kot nepolarna stacionarna faza. Poliamidna kro- matografija je primerna za izolacijo fenolnih kislin in flavonoidov (Zhang idr. 2018). Pogosto uporabljana stacionarna faza so tudi makroporozne smole brez ionskih funkcionalnih skupin, ki lahko selektivno adsorbira- jo skoraj vse naravne spojine. Lahko se uporabljajo samostojno ali samo kot stopnja v predpripravi izvlečka za odstranjevanje nečistoč ali v obo- gatitvi izvlečka s tarčnimi spojinami. Makroporozne smole imajo visoko kapaciteto adsorpcije, so relativno cenovno ugodne in enostavne za re- generacijo. Ločba temelji na elektrostatskih silah, vodikovih vezeh, tvorbi kompleksov in velikostni izključitvi. Ključni faktorji, ki vplivajo na ločbo, so torej površina, premer por in polarnost (Zhang idr. 2018). Ločba lahko temelji tudi na osnovi velikosti molekul. Po tem načelu de- lujeta membranska filtracija in gelska izključitvena kromatografija. Pri membranski filtraciji semipermeabilna membrana omogoča prehod majhnih molekul, večje molekule pa se zadržijo na membrani. Ta meto- da je zelo uporabna za koncentriranje izvlečkov in odstranjevanje nečis- toč. Pri gelski izključitveni kromatografiji se majhne molekule dlje časa zadržijo na koloni kot velike. Pogosta stacionarna faza je sephadex, ki je sestavljen iz premreženega dekstrana. Sephadex LH20 je hidroksipropi- liran derivat dekstrana, ki tvori tako hidrofobne kot hidrofilne interakcije, tako da je primeren za ločevanje širokega nabora spojin, bodisi v vodnih bodisi nevodnih topilih. Ionsko izmenjevalna kromatografija ločuje molekule glede na razlike v njihovem celokupnem naboju. S to metodo lahko torej ločimo tiste naravne spojine, ki lahko ionizirajo, npr. alkaloide in organske kisline. Stacionarna faza vsebuje ionsko izmenjevalne smole, ki privlačijo ena- ko nabite spojine, odbijajo pa tiste, ki imajo drugačen naboj. Kationsko 120 Tehnološki postopki pridobivanja pripravkov iz laškega smilja izmenjevalne smole tako vežejo alkaloide, anionsko izmenjevalne pa or- ganske kisline in fenole. S spreminjanjem ionske moči mobilne faze (s spremembo pH ali koncentracije soli) pa vplivamo na vezavo oz. sprosti- tev tarčnih spojin (Zhang idr. 2018). Kromatografske tehnike, ki so najpogosteje v uporabi za separacijo spo- jin v rastlinskih izvlečkih, so tankoplastna tekočinska kromatografija (angl. thin-layer chromatography – TLC), kolonska kromatografija (angl. column chromatography – CC), plinska kromatografija (angl. gas chro- matography – GC) in tekočinska kromatografija visoke zmogljivosti (angl. high-performance liquid chromatography – HPLC). Mehanizem ločbe pri posamezni metodi je lahko samo en ali jih je več. TLC je metoda, ki temelji samo na mehanizmu adsorpcije in je primerna predvsem za ločbo spojin z majhno molekulsko maso. Stacionarna faza je navadno silikagel, raztopljen v vodi. Raztopino silikagela se nato vli- je na stekleno ploščo ustreznih dimenzij, da tvori 1,5 mm debelo plast. Sledi sušenje pri 105 °C, da se silikagel strdi. Na trdno ploščico silikagela se nato nanese vzorec in se jo navpično položi v posodo z mobilno fazo. Spojine bodo na ploščici prepotovale različno dolgo pot glede na svojo topnost. Za vsako liso lahko izračunamo retencijski faktor, ki je razmer- je med prepotovano potjo spojine in prepotovano potjo topila. Rezultat lahko primerjamo z znano spojino. Spojine lahko s spatulo postrgamo s ploščice in jih ponovno ekstrahiramo. Prednosti te metode sta predvsem kratek čas ločbe in enostavnost. Ločba pri kolonski kromatografiji temelji na adsorpciji, velikostni izklju- čitvi in ionski izmenjavi. Kolona je sestavljena iz dolge steklene cevke premera 5–50 mm, ki ima na dnu ventil in filter iz steklene volne. Staci- onarna faza je lahko iz silikagela, sephadexa ali smole, mobilna faza pa je tekoča. Stacionarno fazo se napolni v kolono in na vrh slednje nanese izvleček. Sledi dodatek mobilne faze – topila z najmanjšo polarnostjo. Po eni uri se mobilno fazo izpusti iz kolone in zbere frakcije. Nato lahko sle- di še spiranje kolone z drugimi topili po naraščajoči polarnosti. Zbrane frakcije se nato lahko karakterizira. Z metodo plinske kromatografije ločujemo hlapne snovi na osnovi po- razdeljevanja med tekočo in plinasto fazo. Mobilna faza je v plinasti ob- liki, tekoče topilo pa je adsorbirano na površino inertnih trdnih delcev in služi kot stacionarna faza. Spojine, ki so topne v plinasti fazi, bodo za- pustile tekočino in se porazdelile v plinasto mobilno fazo ter potovale s hitrostjo pretoka mobilne faze. Spojine, ki so topne samo v tekoči fazi, 121 Katja Kramberger bodo ostale v stacionarni fazi. Spojine, ki so topne v obeh fazah, bodo potovale s srednjo hitrostjo. Mobilna faza je navadno inertni helij. Surovi izvleček, ki vsebuje hlapne snovi, se najprej raztopi v metanolu, nato se ga upari in injicira na začetek kromatografske kolone. Sledi potovanje po koloni skupaj s plinasto mobilno fazo (Abubakar in Haque 2020; Ingle idr. 2017). Metoda je predvsem kvantitativna, saj lahko določimo celokupno količino hlapnih spojin (Sahira Banu in Cathrine 2015). Za določanje ses- tave eteričnih olj in hidrolatov je detektor navadno masni spektrometer (MS) ali plamensko ionizirajoči detektor (angl. flame ionization detector – FID) (Almeida idr. 2024). HPLC je učinkovita metoda za ločbo spojin in temelji na mehanizmu adsorpcije. Ločimo lahko tako organske kot anorganske spojine. Sta- cionarna faza je sestavljena iz trdnih delcev, tesno stisnjenih v kolono. Stacionarna faza je navadno nepolarni C18, mobilna faza pa je polarna – mešanica vode in še nekega drugega topila, ki dobro raztaplja analite v vzorcu. Za elucijo analitov so potrebni visoki pritiski do 400 bar. Apa- ratura je sestavljena iz vsebnika za mobilno fazo, injektorja, črpalke in detektorja. Vzorec injiciramo in ga s pomočjo črpalke skupaj z mobilno fazo vodimo čez kolono, kjer poteka ločba spojin (Abubakar in Haque 2020; Ingle idr. 2017). Na koncu detektor zazna spojine in pošlje signal do računalnika. Osnovni detektor je navadno detektor UV-VIS, ki omogoča merjenje absorpcijskega spektra naenkrat samo pri eni valovni dolžini, ali detektor z nizom diod (angl. diode array detector – DAD), ki istočasno posname spektre v celotnem območju UV-VIS. Če želimo spojine iden- tificirati natančneje, za detekcijo izberemo masni detektor. Z metodo HPLC lahko ločimo in detektiramo nehlapne spojine oz. spojine, ki so občutljive na toploto. Metoda je lahko tako kvantitativna kot kvalitativna (Abubakar in Haque 2020; Sahira Banu in Cathrine 2015). Identifikacija bioaktivnih spojin Identiteto spojin lahko določimo s kromatografskimi metodami, sklop- ljenimi z masno spektrometrijo (npr. HPLC-MS, GC-MS), medtem ko je za določitev točne kemijske strukture novih spojin potrebna uporaba spektroskopskih metod, kot sta jedrna magnetna resonanca (angl. nu- clear magnetic resonance – NMR) in infrardeča (angl. infrared – IR) spe- ktroskopija. Osnovno načelo spektroskopskih metod je prehod elektro- magnetnega sevanja skozi organsko molekulo, ki absorbira del prejetega sevanja. Z merjenjem količine absorbiranega sevanja se lahko ustvari spekter, ki je specifičen za določene vezi v molekuli. Na podlagi posnetega 122 Tehnološki postopki pridobivanja pripravkov iz laškega smilja spektra in primerjavi le-tega s spektrom znane spojine se lahko določi strukturo preučevane molekule (Altemimi idr. 2017). Pogost in najosnovnejši način detekcije spojin je z UV-spektroskopijo. Metoda omogoča tako kvalitativno kot kvantitativno analizo spojin, pri- sotnih v rastlinskem izvlečku. Številni sekundarni presnovki absorbirajo svetlobo pri točno določeni valovni dolžini: flavonoidi pri 330 nm, fenol- ne spojine pri 280 nm, antocianini pri 520 in fenolne kisline pri 360 nm. Metoda UV-VIS sicer ni najselektivnejša, zato je primernejša za kvantifi- kacijo celokupnih polifenolnih spojin. Njene prednosti so kratek čas ana- lize, enostavnost in cenovna ugodnost v primerjavi z drugimi metodami (Abubakar in Haque 2020; Altemimi idr. 2017). Masna spektrometrija omogoča identifikacijo spojin na osnovi njihove kemijske strukture in molekulske mase. Gre za zmogljivo analitsko meto- do, ki se uporablja za identifikacijo neznanih spojin, kvantifikacijo zna- nih spojin in določanje kemijske strukture molekul. Organske molekule v vzorcu se najprej pretvori v visoko energijsko nabito ionizirano obliko, navadno z ionizacijo z razprševanjem, nato detektor posname spekter fragmentiranih ionov. Masni spekter je graf relativne pogostosti fragmen- tiranega iona glede na razmerje med maso in nabojem tega iona. Signal je relativna molekulska masa fragmentiranega iona glede na njegov na- boj. Na tak način lahko z veliko natančnostjo določimo relativno mole- kulsko maso in glede na vzorec fragmentacije tudi molekulsko formulo spojine (Abubakar in Haque 2020; Altemimi idr. 2017). Z jedrsko magnetno resonanco določamo predvsem magnetne lastnos- ti določenih atomskih jeder, največkrat vodikovega atoma ali protona, ogljikovega atoma in izotopov ogljika. Določimo lahko tudi postavitev atomov v molekuli. Z NMR lahko določimo razlike med različnimi atom- skimi jedri in s tem njihov položaj v molekuli. Določimo lahko, kateri ato- mi so prisotni v skupinah, vezanih na ta atom, in koliko jih je. S 13C-NMR identificiramo vrste ogljikovih atomov, ki so prisotni v spojini, s 1H-NMR pa, katere vrste vodika so prisotne in kako so vodikovi ioni med seboj povezani (Abubakar in Haque 2020; Altemimi idr. 2017; Sahira Banu in Cathrine 2015). Z metodo infrardeče spektroskopije poskušamo določiti prisotnost funk- cionalnih skupin v molekuli, določimo pa lahko tudi prisotnost enojnih, dvojnih in trojnih vezi. Organsko spojino obsevamo z IR-svetlobo, ki se absorbira pri določenih valovnih dolžinah. Svetloba IR ima dovolj ener- gije, da vzbudi molekulske vibracije na višje energijske ravni. Rezultat je 123 Katja Kramberger spekter, ki predstavlja delež transmitirane svetlobe. Valovna dolžina ab- sorpcijskih pasov je značilna za določeno vrsto kemijskih vezi, zato lahko z IR-spektroskopijo kvalitativno analiziramo organske spojine. Predvsem lahko potrdimo identiteto določene spojine, če posneti spekter primerja- mo z referenčnim, v pomoč pa nam je tudi pri določanju strukture novo- sintetiziranih molekul. Tekoči vzorci so identificirani na ploščah z natri- jevim kloridom, trdni vzorci pa s kalijevim bromidom in stisnjeni v tanek pelet (Abubakar in Haque 2020; Sahira Banu in Cathrine 2015). Viri Abubakar, A. R., in M. Haque. 2020. »Preparation of Medicinal Plants: Basic Extraction and Fractionation Procedures for Experimental Purposes.« Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences 12 (1): 1–10. https://doi.org /10.4103/jpbs.jpbs_175_19. Almeida, H. H. S., I. P. Fernandes, J. S. Amaral, A. E. Rodrigues in M.-F. Barre- iro. 2024. »Unlocking the Potential of Hydrosols: Transforming Essential Oil Byproducts into Valuable Resources.« Molecules 29 (19): 4660. Altemimi, A., N. Lakhssassi, A. Baharlouei, D. G. Watson in D. A. Lightfo- ot. 2017. »Phytochemicals: Extraction, Isolation, and Identification of Bioac tive Compounds from Plant Extracts.« Plants 6 (4): 42. D’Abrosca, B., E. Buommino, G. D’Angelo idr. 2013. »Spectroscopic Identi- fication and Anti-Biofilm Properties of Polar Metabolites from the Me- dicinal Plant Helichrysum italicum Against Pseudomonas aeruginosa.« Bioorganic and Medicinal Chemistry 21 (22): 7038–7046. Ingle, K. P., A. G. Deshmukh, D. A. Padole, M. S. Dudhare, M. P. Moharil in V. C. Khelurkar. 2017. »Phytochemicals: Extraction Methods, Identificati- on and Detection of Bioactive Compounds from Plant Extracts.« Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry 6 (1): 32–36. Jokić, S., M. Rajić, B. Bilić in M. Molnar. 2016. »Supercritical Extraction of Scopoletin from Helichrysum italicum (Roth) G. Don Flowers.« Phyto- chemical Analysis: PCA 27 (5): 290–295. Kramberger, K., Z. Jenko Pražnikar, A. Baruca Arbeiter, A. Petelin, D. Bandelj in S. Kenig. 2021. »A Comparative Study of the Antioxidative Effects of Helichrysum italicum and Helichrysum arenarium Infusions.« Antioxi- dants 10 (3): 380. Kramberger, K., D. Barlič-Maganja, D. Bandelj idr. 2020. »HPLC-DAD-ESI- -QTOF-MS Determination of Bioactive Compounds and Antioxidant Activity Comparison of the Hydroalcoholic and Water Extracts from Two Helichrysum italicum Species.« Metabolites 10 (10): 403. 124 Tehnološki postopki pridobivanja pripravkov iz laškega smilja Kumar, R., in Y. C. Tripathi. 2011. »Getting Fragrance from Plants.« V Training Manual on Extraction Technology of Natural Dyes & Aroma Therapy and Cultivation Value Addition of Medicinal Plant. Forest Research Institute. Maksimovic, S., V. Tadic, D. Skala in I. Zizovic. 2017. »Separation of Phyto- chemicals from Helichrysum italicum: An Analysis of Different Isolati-on Techniques and Biological Activity of Prepared Extracts.« Phytoche-mistry 138 (22): 9-28. Molnar, M., I. Jerković, D. Suknović idr. 2017. »Screening of Six Medicinal Plant Extracts Obtained by Two Conventional Methods and Supercriti-cal CO₂ Extraction Targeted on Coumarin Content, 2,2-Diphenyl-1-Pi-crylhydrazyl Radical Scavenging Capacity and Total Phenols Content.« Molecules 22 (3): 348. Pereira, C. G., L. Barreira, S. Bijttebier itd. 2017. »Chemical Profiling of Infu- sions and Decoctions of Helichrysum italicum subsp. picardii by UHPL-C-PDA-MS and in vitro Biological Activities Comparatively with Green Tea (Camellia sinensis) and Rooibos Tisane (Aspalathus linearis).« Jour-nal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 145 (11): 593-603. Pheko-Ofitlhile, T., in A. Makhzoum. 2024. »Impact of Hydrodistillation and Steam Distillation on the Yield and Chemical Composition of Essential Oils and Their Comparison with Modern Isolation Techniques.« Journal of Essential Oil Research 36 (2): 105–115. Production Farm Est. Palneca. B. l. »Triple Solar Maceration with the Helich- rysum italicum Essential Oil.« https://www.helichrysum-italicum.com /macerate. Reverchon, E., in I. De Marco. 2006. »Supercritical Fluid Extraction and Frac- tionation of Natural Matter.« The Journal of Supercritical Fluids 38 (2): 146–166. Rocha, C., A. P. Moura in L. M. Cunha. 2020. »Consumers’ Associations with Herbal Infusions and Home Preparation Practices.« Food Quality and Preference 86:104006. Sahira Banu, K., in L. Cathrine. 2015. »General Techniques Involved in Phytochemical Analysis.« International Journal of Advanced Research in Chemical Science 2 (4): 25–32. Zhang, Q.-W., L.-G. Lin in W.-C. Ye. 2018. »Techniques for Extraction and Isolation of Natural Products: A Comprehensive Review.« Chinese Me-dicine 13 (1): 20. 125 8 Bioaktivne spojine vodnih in organskih izvlečkov laškega smilja Katja Kramberger Fakulteta za vede o zdravju, Univerza na Primorskem © 2025 Katja Kramberger https://doi.org/10.26493/978-961-293-525-2.8 Uvod Ekstrakcija s topili je zelo pogost način ekstrakcije bioaktivnih spojin, saj je postopek precej enostaven in daje relativno dobre izkoristke. S to me- todo lahko, glede na izbiro ustreznega topila, izoliramo zelo širok nabor spojin. Ekstrakcija z organskimi topili je poleg hidrodestilacije najpogos- tejši postopek pridobivanja izvlečkov iz laškega smilja. Glavna skupina spojin, ki je prisotna v izvlečkih smilja, pridobljenih z ekstrakcijo z organskimi topili, so polifenoli. Gre za zelo kompleksno skupino sekundarnih presnovkov rastlin, saj je do danes znanih že prek 8.000 fenolnih spojin (Pandey in Rizvi 2009). Z organskimi topili lah- ko iz laškega smilja izoliramo: fenolne kisline in estre fenolnih kislin ter njihove derivate, flavonoide, acetofenone, floroglucinole, lignane, kumarine in kumarate. Drugi razredi spojin so še pironi, tremetoni, terpeni in lipidi. Najpogosteje uporabljana topila so aceton, metanol in etanol, nekateri raziskovalci so uporabili tudi kloroform, petrole- ter, diklorometan, dietil eter ali vodo (Maksimovic idr. 2017). Sestava izvlečka je tako močno pogojena z izbiro topila – v vodnih izvlečkih smilja so prisotne predvsem polarnejše fenolne spojine (npr. hidroksi- cimetne kisline in flavonoidi), v etanolnem ali metanolnem izvlečku so lahko prisotne tudi že manj polarne spojine (npr. tremetoni in terpeni), Bandelj, D., Z. Jenko Pražnikar in A. Petelin, ur. 2025. 127 Laški smilj. Založba Univerze na Primorskem Katja Kramberger CHO H OH COOH + H OH H2C CH O P 2 O P Eritroza-4-fosfat Fosfoenolpiruvat Galotanini COOH COOH + elagotanini HO OH O OH OH OH Galna kislina Dihidrošikimat HO O O COOH COOH COOH CH 3O Kumarini HO OH O CH2 OH Izokorizmat Šikimska kislina OH HO O HO O COOH COOH OH OH O OH OH O · NH 3 Izoflavonoidi Flavonoidi Fenilalanin Salicilna kislina PAL OH S CoA OH COOH HO O O OH OH HO Cimetna kislina Benzojska p-kumaroil CoA Stilbeni kislina OH HO O OH O glukoza CH3O OH O OH O HO HO O CH 3 O Auroni Fenilpropanoidni estri OH HO OH Fenilpropeni Katehin Lignani Kutin, + suberin, lignin Acilirani poliamini sporopolein Proantocianidini Slika 1 Biosintezne poti fenolnih spojin (prirejeno po Vogt 2010) v acetonskem izvlečku pa večinoma bolj nepolarne spojine (npr. pi- roni, tremetoni, santinoli). V nadaljevanju bomo podrobneje opisali kemijsko strukturo omenjenih kemijskih razredov in navedli predstav- nike, ki so zastopani v vodnih oz. organskih izvlečkih laškega smilja. 128 Bioaktivne spojine vodnih in organskih izvlečkov laškega smilja Kemijska klasifikacija fenolnih spojin Osnova vsem fenolnim spojinam je fenol – benzenov obroč, substituiran z eno ali več hidroksilnimi funkcionalnimi skupinami (Lin idr. 2016). Ve- činoma se nahajajo v konjugirani obliki, torej je na hidroksilno skupino vezana ena ali več enot sladkorja, lahko pa je sladkor vezan tudi nepo- sredno na aromatski obroč. Možne so tudi povezave z drugimi spojina- mi, npr. karboksilnimi ali organskimi kislinami, amini, lipidi ali drugimi fenoli (Pandey in Rizvi 2009). Fenolne spojine se v rastlinah sintetizirajo preko skupnega intermedia- ta, šikimske kisline. Šikimatna pot se začne z eritroza-4-fosfatom in fos- foenol-piruvatom (angl. phosphoenol pyruvate – PEP), ki sta produkta presnove sladkorjev, in sicer pentoza fosfatne poti in glikolize. Najprej nastane dihidrošikimat, nato šikimska kislina, iz nje pa fenilalanin. Fe- nilalanin se s fenilalanin-amonijak-liazo (angl. phenylalanine ammonia lyase – PAL) pretvori do prvega fenilpropanoida (C-C ), cimetne kisline. 6 3 Fenilpropanoidna pot se nato nadaljuje do ključnega presnovka para- -kumaroil koencima A, ki je izhodiščna molekula za vse ostale fenolne spojine (Vogt 2010). Shema sinteznih poti različnih fenolnih spojin je prikazana na sliki 1. Fenolne spojine razvrščamo v različne razrede glede na število fenolnih obročev, ki so prisotni v molekuli, in na podlagi strukturnih elementov, ki povezujejo posamezne fenolne obroče med seboj. Glavni razredi so: fe- nolne kisline, flavonoidi, stilbeni in lignani. Fenolne kisline oz. fenolkar- boksilne kisline so aromatske organske spojine, ki v molekuli vsebujejo vsaj eno karboksilno in eno fenolno hidroksilno skupino. Navad no so de- rivati bodisi benzojske bodisi cimetne kisline, zato jih nadalje delimo na hidroksibenzojske in na hidroksicimetne kisline. Derivati benzojske ki- sline se lahko pojavljajo v prosti obliki ali v obliki estrov in glikozidov. Po- gosti predstavniki so salicilna, galna in vanilna kislina. Derivati cimetne kisline se v rastlinah največkrat pojavljajo v obliki estrov, zelo pogosti so, denimo, estri s kinsko kislino. Najpogostejše proste kisline so kavna, ferulna in p-kumarna kislina (Pandey in Rizvi 2009). Ester med kavno kislino in kinsko kislino je zelo razširjena klorogenska kislina oz. 5-kafe- oilkinska kislina. Obstaja več izomerov te spojine, npr. neoklorogenska, kriptoklorogenska kislina, in njihovih derivatov, npr. dikafeoilkinske in trikafeoilkinske kisline (Clifford idr. 2017). Flavonoidi so naslednja velika skupina fenolnih spojin, katerih osnovno strukturo sestavljata dva aromatska obroča, med seboj povezana s tremi ogljikovimi atomi. 129 Katja Kramberger 1 2 Flavon 1 4 3 1 2 3 2 4 3 4 3 ′ 1 2 4 2 β 5 ′ ′ 3 Izoflavon 6 4 1 ′ Flavanon 5 α ′ ′ 1 B 6 8 2 7 5 ′ A C Halkon 6 3 5 4 1 2 Osnovni skelet - flavan 4 3 7 1 1 2 2 3 3 4 Flavonol 4 Antocianin Auron Flavanol Slika 2 Osnovne kemijske strukture flavonoidov En obroč navadno nastane iz poliketidne verige acetatov (aktivirane malonilne kisline), drugi pa po šikimatni poti. Vsi flavonoidi (znanih je okoli 3.000) imajo enak biosintezni izvor, zato so njihove strukture zelo podobne. Osnova je 2-fenilkromanski skelet (flavan), med seboj pa se razlikujejo po oksidacijski stopnji piranovega obroča. Delimo jih na: fla- vanone (ketoskupina na 4. mestu piranovega obroča), flavanole (hidroksi skupina na 3. mestu piranovega obroča), flavone (dvojna vez med 2. in 3. mestom), flavonole (dvojna vez med 2. in 3. mestom ter hidroksi skupina na 3. mestu), izoflavone (benzenov obroč na 3. namesto 2. mestu pira- novega obroča) in antocianine (dve dvojni vezi v piranovem obroču in pozitivni naboj na kisiku – flavilijev kation) (slika 2). Spojine znotraj po- samezne skupine se razlikujejo glede na število in postavitev hidroksil- nih skupin in stopnjo alkilacije oz. glikozilacije (Pandey in Rizvi 2009). Sladkorna komponenta je lahko mono-, di- ali trisaharid, najpogostejši sladkorji pa so glukoza, galaktoza, ramnoza in arabinoza. Pri O-gliko- zidih, ki so najpogostejši, je lahko glikozilirana katera koli hidroksilna skupina, največkrat pa je na 7. ali 3. mestu. Posamezni monosaharidi so lahko acilirani, znanih je tudi nekaj sulfatov. Manj pogosti so C-glikozidi, pri katerih se ogljik sladkorja poveže s 6. ali 8. ogljikom aglikona. Nekate- ri glikozidi so tudi hkrati O- in C-glikozidi. Poleg omenjenih razredov fla- vonoidov poznamo še halkone, ki imajo piranski obroč odprt, in aurone, kjer je namesto piranskega furanski obroč (Beecher 2003). Stilbeni vse- bujejo dve fenilni skupini, povezani z metilenskim mostom. Najbolj pre- učevan stilben je resveratrol. Lignani so difenolne spojine, ki v strukturi 130 Bioaktivne spojine vodnih in organskih izvlečkov laškega smilja vsebujejo 2,3-dibenzilbutan, ki se tvori z dimerizacijo dveh ostankov ci- metnih kislin (Pandey in Rizvi 2009). Fenolne in druge spojine v izvlečkih laškega smilja Vodni izvlečki Kemijsko analizo vodnih izvlečkov smilja so preučevali Maja Kazazic idr. (2016), Catarina G. Pereira idr. (2017) ter Katja Kramberger idr. (2020). Maja Kazazic idr. (2016) so določili samo količino celokupnih fenolnih spojin v vodnem izvlečku, ki je za laški smilj znašala 1569,00 ±17,32 mg ekvivalentov galne kisline/100 g suhe mase (Kazazic idr. 2016). Catarina G. Pereira idr. (2017) so poleg kvantifikacije celokupnih fenolnih spojin in posameznih kemijskih razredov izvedli še identifikacijo posameznih spojin, prisotnih v poparkih ter prevretkih različnih delov rastline laške- ga smilja. Prevretki so vsebovali več celokupnih fenolnih spojin, največ jih je bilo v cvetovih. Prevladovale so klorogenska, kinska in dikafeoilkin- ske kisline ter flavonoida pinocembrin in gnafalin A (Pereira idr. 2017). Podobno sestavo poparkov smo določili tudi v naši raziskavi (Kramber- ger idr. 2020), kjer so prav tako prevladovali kafeoilkinske kisline in flavo- noidi. Naslednji po zastopanosti so bili pironi. Izvlečki, pripravljeni z ma- ceracijo v hladni vodi ob dodatku ultrazvoka, pa so vsebovali predvsem fenolne kisline (Kramberger idr. 2020). Etanolni izvlečki Etanol velja za najpogosteje uporabljano topilo za ekstrakcijo spojin iz laškega smilja. Z raziskavami kemijske sestave izvlečkov laškega smil ja so se začeli ukvarjati Maffei Facino idr. (1988), Maffei Facino idr. (1990), Pietta idr. (1991) ter Pietta idr. (1992), ki so izolirali predvsem flavonoide (npr. apigenin, luteolin, gnafalin, naringenin) in njihove glikozide (npr. glikozide kvercetina, kemferola, naringenina, luteolina in apigenina) (Maffei Facino idr. 1988; Maffei Facino idr. 1990; Pietta idr. 1991; Pietta idr. 1992). Zapesochnaya idr. (1990) ter Zapesochnaya idr. (1992) so izo- lirali predvsem hidroksicimetne kisline (kavno, p-kumarno, ferulno kisli- no) in njihove estre (npr. kafeoilkinske in dikafeoilkinske kisline) (Zape- sochnaya idr. 1990; Zapesochnaya idr. 1992). Daniela Rigano idr. (2013) ter Daniela Rigano idr. (2014) so iz etanolnega izvlečka izolirali predvsem derivate acetofenona, tremetone (acilbenzofurane). Med njimi sta po ak- tivnosti izstopala 12-acetoksitremeton in [2,3-dihidro-2-[1-(hidroksime- til)etenil]-5-benzofuranil]-etanon (Rigano idr. 2013; Rigano idr. 2014). 131 Katja Kramberger VODNI IN ORGANSKI IZVLEČKI Citrusin A Lignani Citrusin B Lipidi 12-acetoksitremeton Santinol A1 Neflavonoidi Tremetoni 12-hidroksitremeton Santinol A2 (bitalin A) NEFENOLNE Santinol A3 Santinol B SPOJINE Santinol C Arzanol Santinol D Pironi Mikropiron Helipiron Italipiron Terpeni Stirilpiron Ursolna kislina Epigalokatehin-3-O-galat Flavanoli Polifenoli Pinocembrin Flavanoni Naringenin Eriodiktiol Hesperetin FENOLNE Flavonoidi SPOJINE Miricetin Flavonoli Kvercetin Kemferol Gnafailin Tilirozid Acetofenoni Luteolin 3-prenil-4- Apigenin Flavoni hidroksiacetofenon Enostavni Kumarini fenoli Eskuletin 4-hidroksibenzojska kislina Hidroksi- Skopoletin benzojske Salicilna kislina kisline Vanilna kislina Galna kislina Fenolne kisline Hidroksi- Kavna kislina cimetne p-kumarna kislina kisline Ferulna kislina Klorogenska kislina Slika 3 Kemijski razredi fenolnih in nefenolnih spojin ter njihovi predstav- niki, zastopani v izvlečkih laškega smilja 132 Bioaktivne spojine vodnih in organskih izvlečkov laškega smilja Metanolni izvlečki Araceli Sala idr. (2001), Araceli Sala idr. (2002), Ariceli Sala, Maria Car- men Recio, Guillermo R. Schinella, Salvador Máñez, Rosa M. Giner in Jose-Luis Rios (2003) ter Araceli Sala, Maria Carmen Recio, Guillermo R. Schinella, Salvador Máñez, Rosa M. Giner, Miguel Cerdá-Nicolás in José Luis Rosí (2003) so preučevali metanolne izvlečke laškega smi- lja, iz katerih so izolirali flavonoide (pinocembrin, tilirozid, gnafalin) in acetofenone. Izmed acetofenonov sta bila 4-hidroksi-3-(2-hidroksi- -3-izopentenil)acetofenon in 4-hidroksi-3-(3-metil-2-butenil)acetofe- non najbolj biološko aktivna (Sala idr. 2001; Sala idr. 2002; Sala, Recio, Schinella idr. 2003; Sala, Recio, Schinella, Máñez idr. 2003). Ana Laura De La Garza idr. (2013) so iz metanolnih izvlečkov izolirali tudi številne fenolne kisline (galno, kavno, klorogensko kislino) in flavonoide, flava- none (naringenin in njegove glikozide), flavonole (kemferol in njegove glikozide ter miricetin glikozid), flavone (metoksiluteolin) in flavanole (epigalokatehin-3-O-galat) (De La Garza idr. 2013). Podobno sestavo so metanolnemu izvlečku določili tudi Angela Mari idr. (2014). V izvlečku so bile kavna, klorogenska in dikafeoilkinske kisline, od flavonoidov pa gli- kozidi kvercetina, kemferola in izoramnetina. Določili pa so še drimanski seskviterpen, 12-hidroksitremeton in gnafaliol (Mari idr. 2014). Brigida D’Abrosca idr. (2013) so v metanolnem izvlečku določili predvsem stiril- pirone, neolignane in oksineolignane, med katerimi sta bila citruzin A in citruzin B (D’Abrosca idr. 2013). Iz metanolnega izvlečka so Rosa Tundis idr. (2005) po frakcionaciji z n-heksanom izolirali tudi mono- in seskviterpene (α-terpinolen, trans--kariofilen in neril acetat) (Tundis idr. 2005). Acetonski izvlečki Najbolj preučevana spojina, značilna za laški smilj, je arzanol – prenilira- ni heterodimerni floroglucinol α-piron, ki so ga prvič izolirali Appendino idr. (2007) iz acetonskega izvlečka. Arzanol ima pleiotropno delovanje, aktivni pa so tudi nekateri drugi pironi, npr. helipiron in mikropiron (Rosa idr. 2007). Poleg pironov so bili v acetonskem izvlečku prisotni tudi številni tremetoni (Rosa idr. 2007; Appendino idr. 2007). Tagliatela-Sca- fati idr. (2013) so poleg pironov in tremetonov izolirali še nekatere druge manj polarne spojine, kot so seskviterpena neril acetat in ω-oleoiloksili-nalool, triterpenoid ursolna kislina in neobičajna skupina lipidov, ime- novana santinoli. Santinoli so angeolirani gliceridi, za katere je značilna razvejana acilna ali keto-acilna veriga. Gre za nov razred spojin, ki so bile 133 Katja Kramberger Preglednica 1 Seznam nekaterih najznačilnejših spojin, izoliranih iz laške- ga smilja Ime spojine Kemijska Ekstrakcijsko Izkoristek in razreda struktura* topilo** ekstrakcije*** Kavna kislina Metanol (De 0,0067 % (NS) (fenolna La Garza idr. (De La Garza idr. 2013), kislina) 2013; Mari idr. 0,00042 % (cvetovi) 2014), etanol (Mari idr. 2014), 0,0057– (Zapesochnaya idr. 0,015 % (nadzemni deli 1990), voda (Pereira ali cvetovi) (Pereira idr. idr. 2017) 2017) Klorogenska Metanol (De 0,104 % (NS) (De La kislina La Garza idr. Garza idr. 2013), (ester 2013; Mari idr. 0,045 % (cvetovi) (Mari fenolne 2014), etanol idr. 2014), kisline) (Zapesochnaya idr. 0,52–0,77 % (nadzemni 1990), voda (Pereira deli ali cvetovi) (Pereira idr. 2017) idr. 2017) Pinocembrin Aceton NA (NS) (Wollenweber (flavonoid) (Wollenweber idr. idr. 2005), 2005), NA (nadzemni deli) metanol (Sala idr. (Sala idr. 2002) 2002) Kvercetin Metanol (Mari idr. 0,015 % (cvetovi) (Mari (flavonoid) 2014), voda (Pereira idr. 2014), idr. 2017) 0,001–0,0015 % (nadzemni deli ali cvetovi) (Pereira idr. 2017) Naringenin Metanol 0,023 % (NS) (De La (flavonoid) Garza idr. 2013) Gnafalin Metanol 0,03 % (nadzemni deli) (flavonoid) (Schinella idr. 2007) Luteolin Etanol NA (cvetovi) (Maffei (flavonoid) Facino idr. 1988) 134 Bioaktivne spojine vodnih in organskih izvlečkov laškega smilja Ime spojine Kemijska Ekstrakcijsko Izkoristek in razreda struktura* topilo** ekstrakcije*** Tilirozid Metanol 0,0063 % (nadzemni (glikoziliran deli) (Schinella idr. flavonoid) 2007), 0,0015 % (cvetovi) (Mari idr. 2014) 4-hidroksi- Metanol 0,5 % (nadzemni deli) 3-(3-metil-2- (Sala idr. 2001) butenil) acetofenon (acetofenon) Skopoletin Kloroform NA (cvetovi) (Karasartov (kumarin) (Karasartov idr. idr. 1992), 1992), 0,001933 % (cvetovi) superkritični CO2 (Jokić idr. 2016) (Jokić idr. 2016) Arzanol Aceton 0,078 % (nadzemni deli) (piron) (Appendino idr. 2007), 0,064 % (nadzemni deli in cvetovi) (Rosa idr. 2007), 0,32 % (nadzemni deli) (Taglialatela- Scafati idr. 2013) Helipiron Aceton 0,025 % (nadzemni deli) (piron) (Appendino idr. 2007) 12-acetoksi Etanol (Rigano idr. 0,0026 % (cvetovi) tremeton 2013), aceton (Rosa (Rigano idr. 2014) (tremeton) idr. 2007) Ursolna Aceton 0,40 % (nadzemni deli) kislina (Taglialatela-Scafati (Taglialatela-Scafati idr. (triterpen) idr. 2013), metanol 2013), (Sala idr. 2001) NA (nadzemni deli) (Sala idr. 2001) Opombe * Slike 2D-struktur spojin smo pridobili iz prosto dostopne podatkovne baze PubChem. ** Navedeno je samo primarno topilo, ki so ga uporabili v postopku ekstrakcije. *** Izkoristke ekstrakcij smo izračunali iz navedenih mas izoliranih spojin glede na koli-čino izhodnega rastlinskega materiala. Navajamo tudi del rastline, ki je bil uporabljen za ekstrakcijo, če so to avtorji zapisali. NA – podatek ni na voljo, NS – ni specificirano. 135 Katja Kramberger izolirane samo iz laškega smilja, zato so jih poimenovali po začetniku raziskav te rastline, Leonardu Santiniju (Taglialatela-Scafati idr. 2013). Nasprotno so Wollenweber idr. (2005) iz acetonskega izvlečka izolirali predvsem flavonoide (galangin, gnafalin, pinocembrin in metilni etri ga- langina, kemferola, herbacetina, kvercetina in gosipetina) (Wollenweber idr. 2005). Izvlečki, pripravljeni z drugimi topili Tomás-Barberán idr. (1990) ter Karasartov idr. (1992) so za ekstrakcij- sko topilo uporabili kloroform. Tomás-Barberán idr. (1990) so za glavno bio aktivno spojino v tem izvlečku določili 4-hidroksi-3(izopoenten-2-il) acetofenon, Karasartov idr. (1992) pa so s kolonsko kromatografijo izo- lirali predvsem kumarine (eskuletin, skopoletin in izoskopoletin) in fla- vonoide (kemferol in 3,5,7-tihidroksi-8-metoksiflavon ter 3,5-dihidroksi- -6,7,8-trimetoksiflavon) (Tomás-Barberán idr. 1990; Karasartov idr. 1992). Antonia Nostro idr. (2000) so za ekstrakcijo uporabili dietil eter. Izvleček je vseboval predvsem kumarine in flavonoide, prisotni pa so bili tudi steroidi (Nostro idr. 2000). V preglednici 1 so zbrane nekatere najznačilnejše spojine, izolirane iz laš kega smilja. Navedeni so podatki o imenu in kemijski strukturi spo- jine, uporabljenem ekstrakcijskem topilu in izkoristku ekstrakcije (mase izolirane spojine glede na začetno maso rastlinskega materiala). Viri Appendino, G., M. Ottino, N. Marque idr. 2007. »Arzanol, an Anti-Inflamma- tory and Anti-HIV-1 Phloroglucinol Alpha-Pyrone from Helichrysum italicum Ssp. microphyllum.« Journal of Natural Products 70 (4): 608– 612. Beecher, G. R. 2003. »Overview of Dietary Flavonoids: Nomenclature, Occur- rence and Intake.« The Journal of Nutrition 133 (10): 3248S–3254S. Clifford, M. N., I. B. Jaganath, I. A. Ludwig in A. Crozier. 2017. »Chlorogenic Acids and the Acyl-Quinic Acids: Discovery, Biosynthesis, Bioavailabili- ty and Bioactivity.« Natural Product Reports 34 (12): 1391–1421. D’Abrosca, B., E. Buommino, G. D’Angelo idr. 2013. »Spectroscopic Identi- fication and Anti-Biofilm Properties of Polar Metabolites from the Me- dicinal Plant Helichrysum italicum Against Pseudomonas aeruginosa.« Bioorganic and Medicinal Chemistry 21 (22): 7038–7046. De La Garza, A. L., U. Etxeberria, M. P. Lostao idr. 2013. »Helichrysum and Grapefruit Extracts Inhibit Carbohydrate Digestion and Absorption, 136 Bioaktivne spojine vodnih in organskih izvlečkov laškega smilja Improving Postprandial Glucose Levels and Hyperinsulinemia in Rats.« Journal of Agricultural and Food Chemistry 61 (49): 12012–12019 Jokić, S., M. Rajić, B. Bilić in M. Molnar. 2016. »Supercritical Extraction of Scopoletin from Helichrysum italicum (Roth) G. Don Flowers.« Phyto-chemical Analysis 27 (5): 290–295. Karasartov, B. S., V. A. Kurkin in G. G. Zapesochnaya. 1992. »Coumarins and Flavonoids of the Flowers of Helichrysum Italicum.« Chemistry of Natu-ral Compounds 28 (5): 504–505. Kazazic, M., M. Djapo in E. Ademovic. 2016. »Antioxidant Activity of Water Extracts of Some Medicinal Plants from Herzegovina Region.« Internati-onal Journal of Pure and Applied Bioscience 4 (2): 85–90. Kramberger, K., D. Barlič-Maganja, D. Bandelj idr. 2020. »HPLC-DAD-ESI- -QTOF-MS Determination of Bioactive Compounds and Antioxidant Activity Comparison of the Hydroalcoholic and Water Extracts from Two Helichrysum italicum Species“. Metabolites 10 (10): 403. Lin, D., M. Xiao, J. Zhao idr. 2016. »An Overview of Plant Phenolic Compoun- ds and Their Importance in Human Nutrition and Management of Type 2 Diabetes.« Molecules 21 (10): 1374. Maffei Facino, R., M. Carini, M. Mariani in C. Cipriani. 1988. »Anti Erythe- matous and Photoprotective Activities in Guinea Pigs and in Man of Topically Applied Flavonoids from Helichrysum Italicum g. Don.« Acta Therapeutica 14 (4): 323–346. Maffei Facino, R., M. Carini, L. Franzoi, O. Pirola in E. Bosisio. 1990. »Phyto- chemical Characterization and Radical Scavenger Activity of Flavonoids from Helichrysum italicum G. Don (Compositae).« Pharmacological Re-search 22 (6): 709–721. Maksimovic, S., V. Tadic, D. Skala in I. Zizovic. 2017. »Separation of Phyto- chemicals from Helichrysum italicum: An Analysis of Different Isolati-on Techniques and Biological Activity of Prepared Extracts.« Phytoche-mistry 138:9–28. Mari, A., A. Napolitano, M. Masullo, C. Pizza in S. Piacente. 2014. »Identifi- cation and Quantitative Determination of the Polar Constituents in He-lichrysum italicum Flowers and Derived Food Supplements.« Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 96:249–255. Nostro, A., M. P. Germanò, V. D’Angelo, A. Marino in M. A. Cannatelli. 2000. »Extraction Methods and Bioautography for Evaluation of Medicinal Plant Antimicrobial Activity.« Letters in Applied Microbiology 30 (5): 379–384. Pandey, K. B., in S. I. Rizvi. 2009. »Plant Polyphenols as Dietary Antioxidants in Human Health and Disease.« Oxidative Medicine and Cellular Longe-vity 2 (5): 270–278. 137 Katja Kramberger Pereira, C. G., L. Barreira, S. Bijttebier idr. 2017. »Chemical Profiling of Infu- sions and Decoctions of Helichrysum italicum subsp. picardii by UHPL- C-PDA-MS and in vitro Biological Activities Comparatively with Green Tea (Camellia sinensis) and Rooibos Tisane (Aspalathus linearis).« Jour- nal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 145:593–603. Pietta, P., P. Mauri, R. M. Facino in M. Carini. 1992. »Analysis of Flavonoids by MECC with Ultraviolet Diode Array Detection.« Journal of Pharmaceut- ical and Biomedical Analysis 10 (10–12): 1041–1045. Pietta, P., P. Mauri, C. Gardana, R. M. Facino in M. Carini. 1991. »High-Per- formance Liquid Chromatographic Determination of Flavonoid Gluco- sides from Helichrysum italicum.« Journal of Chromatography A 537: 449–452. Rigano, D., C. Formisano, E. Pagano itd. 2014. »A New Acetophenone Deri- vative from Flowers of Helichrysum italicum (Roth) Don Ssp. italicum.« Fitoterapia 99:198–203. Rigano, D., C. Formisano, F. Senatore idr. 2013. »Intestinal Antispasmodic Effects of Helichrysum italicum (Roth) Don ssp. italicum and Chemical Identification of the Active Ingredients.« Journal of Ethnopharmacology 150 (3): 901–906. Rosa, A., M. Deiana, A. Atzeri idr. 2007. »Evaluation of the Antioxidant and Cytotoxic Activity of Arzanol, a Prenylated α-pyrone–phloroglucinol Etherodimer from Helichrysum italicum subsp. microphyllum.« Chemi- co-Biological Interactions 165 (2): 117–126. Sala, A., M. C. Recio, R. M. Giner idr. 2002. »Anti-Inflammatory and Antioxi- dant Properties of Helichrysum italicum.« The Journal of Pharmacy and Pharmacology 54 (3): 365–371. Sala, A., M. C. Recio, R. M. Giner, S. Máñez in J. L. Ríos. 2001. »New Ace- tophenone Glucosides Isolated from Extracts of Helichrysum italicum with Antiinflammatory Activity.« Journal of Natural Products 64 (10): 1360–1362. Sala, A., M. C. Recio, G. R. Schinella, S. Máñez, R. M. Giner in J.-L. Ríos. 2003. »A New Dual Inhibitor of Arachidonate Metabolism Isolated from Heli- chrysum italicum.« European Journal of Pharmacology 460 (2–3): 219– 226. Sala, A., M. C. Recio, G. R. Schinella, S. Máñez, R. M. Giner, M. Cerdá-Nicolás in J. L. Rosí. 2003. »Assessment of the Anti-inflammatory Activity and Free Radical Scavenger Activity of Tiliroside.« European Journal of Phar- macology 461 (1): 53–61. Schinella, G. R., H. A. Tournier, S. Máñez, P. M. de Buschiazzo, M. del Car- men Recio in J.-L. Ríos. 2007. »Tiliroside and Gnaphaliin Inhibit Human Low Density Lipoprotein Oxidation.« Fitoterapia 78 (1): 1–6. 138 Bioaktivne spojine vodnih in organskih izvlečkov laškega smilja Taglialatela-Scafati, O., F. Pollastro, G. Chianese idr. 2013. »Antimicrobial Phenolics and Unusual Glycerides from Helichrysum italicum subsp. microphyllum.« Journal of Natural Products 76 (3): 346–353. Tomás-Barberán, F., E. Iniesta-Sanmartín, F. Tomás-Lorente in A. Rumbero. 1990. »Antimicrobial Phenolic Compounds from Three Spanish Helich-rysum Species.« Phytochemistry 29 (4): 1093–1095. Tundis, R., G. A. Statti, F. Conforti idr. 2005. »Influence of Environmental Fa- ctors on Composition of Volatile Constituents and Biological Activity of Helichrysum italicum (Roth) Don (Asteraceae).« Natural Product Rese-arch 19 (4): 379–387. Vogt, T. 2010. »Phenylpropanoid Biosynthesis.« Molecular Plant 3 (1): 2–20. Wollenweber, E., M. Christ, R. H. Dunstan, J. N. Roitman in J. F. Stevens. 2005. »Exudate Flavonoids in Some Gnaphalieae and Inuleae (Asteraceae).« Zeitschrift Füur Naturforschung C 60 (9–10): 671–678. Zapesochnaya, G. G., T. V. Dzyadevich in B. S. Karasartov. 1990. »Phenolic Compounds of Helichrysum italicum.« Chemistry of Natural Compoun-ds 26 (3): 342–343. Zapesochnaya, G. G., V. A. Kurkin, T. V. Kudryavtseva idr. 1992. »Dicaffe- olyquinic Acids from Helichrysum italicum and Achillea cartilaginea.« Chemistry of Natural Compounds 28 (1): 40–44. 139 9 Bioaktivne spojine hidrolata in eteričnega olja laškega smilja Dunja Bandelj Matjaž Hladnik Fakulteta za matematiko, naravo- Fakulteta za matematiko, naravo- slovje in informacijske tehnologije, slovje in informacijske tehnologije, Univerza na Primorskem Univerza na Primorskem Katja Kramberger Fakulteta za vede o zdravju, Univerza na Primorskem © 2025 Dunja Bandelj, Katja Kramberger in Matjaž Hladnik https://doi.org/10.26493/978-961-293-525-2.9 Bioaktivne spojine v eteričnem olju laškega smilja Eterična olja so visoko koncentrirane tekočine oljnega videza, ki imajo kompleksno kemijsko sestavo. Gre za zmesi hlapnih, močno dišečih li- pofilnih spojin, ki imajo nizko vrelišče, so pri sobnih pogojih v tekočem agregatnem stanju in imajo nižjo gostoto od vode. Topijo se v etanolu in lipofilnih topilih, v vodi so slabo topna, pa vendar dovolj, da dajejo blago aromo aromatičnim vodam (Dhifi idr. 2016). Glavna sestavina ete- ričnih olj so organske spojine iz razreda terpenov oz. terpenoidov. Gre za spojine, ki imajo v svoji kemijski strukturi eno ali več enot izoprena, 2-metil-1,3-butadiena (C H ). Enote izoprena so navadno oksidirane do 5 8 alkoholov, aldehidov, kislin, etrov, estrov in ketonov – v tem primeru jih imenujemo terpenoidi, če so v strukturi prisotni samo ogljikovodiki, pa jih imenujemo terpeni. Spojine so lahko ciklične ali aciklične. Najpogos- tejši terpeni v eteričnih oljih so mono- in seskviterpenoidi – spojine z dvema oz. s tremi enotami izoprena. Te spojine se v rastlini sintetizirajo po različnih biokemijskih poteh, se vključujejo v procese komunikacije Bandelj, D., Z. Jenko Pražnikar in A. Petelin, ur. 2025. 141 Laški smilj. Založba Univerze na Primorskem Dunja Bandelj, Katja Kramberger in Matjaž Hladnik ETERIČNA OLJA Mircen Aciklični Limonen Monoterpeni Monociklični p-cimen α-pinen Biciklični β-pinen TerpenI β-farnezen Aciklični γ-kurkumen Seskviterpeni Monociklični ar-kurkumen triciklični Bi- in Italicen β-selinen β-kariofilen γ-selinen α-selinen Linalool Neril propionat Aciklični Nerol Geraniol Neril acetat Geranil acetat 1,8-cineol Monoterpenoidi Monociklični α-terpineol Endo-fenhol Biciklični Terpenoidi Aciklični Seskviterpenoidi Monociklični triciklični Bi- in 10-epi-γ-eudezmol Eudezm-5-en-11-ol Italicen eter Alifatski ketoni Beta-diketoni Italidion II Italidion I Italidion III Druge spojine Izobutil angelat Alifatski estri Slika 1 Shematska delitev kemijskih spojin, prisotnih v eteričnem olju laškega smilja 142 Bioaktivne spojine hidrolata in eteričnega olja laškega smilja in obrambe v rastlinskih celicah ter tkivih in prispevajo k značilni aromi ter biološkim učinkom eteričnih olj. Novejše raziskave razkrivajo vlogo terpenov pri nastanku celičnih membran in njihovi stabilizaciji pri vi- sokih temperaturah, kontroli celičnega cikla, regulaciji izražanja genov, regulaciji signalne transdukcije, sodelujejo pri transportu elektronov in fotosintezi, modifikaciji proteinov ter ščitijo pred infekcijami (Holstein in Hohl 2004; Jeong idr. 2018). Nekatere monoterpenske in seskviterpenske spojine delujejo insekticidno, zato so uporabne pri varstvu pred rastlino- jedi in patogeni, vendar so raziskave na tem področju omejene (Cheng idr. 2007). Zaradi lipofilnosti in majhne velikosti molekul spojine zlahka prehajajo v biološke membrane in izkazujejo terapevtske učinke, zato se številne raziskave usmerjajo v raziskovanje njihovega delovanja pro- ti okužbam, raku in vnetnim procesom (Durczyńska in Żukowska 2024; Siddiqui idr. 2024). Glavna skupina kemijskih spojin v eteričnem olju laškega smilja so terpe- ni in terpenoidi – predvsem mono- in seskviterpeni oz. mono- in seskvi- terpenoidi, druga skupina pa so spojine iz razreda β-diketonov, imenova-ne tudi italidioni, saj se pojavljajo samo v vrsti H. italicum (Maksimovic idr. 2017; Morone-Fortunato idr. 2010). Izmed monoterpenov sta v eterič- nem olju najbolj zastopana α-pinen in limonen ter od monoterpenoidov nerol, neril acetat in neril propanoat. Med seskviterpeni prevladujejo α- in β-selinen, γ-kurkumen in trans-β-kariofilen, med seskviterpenoidi pa stereoizomer rosifoliola – eudezm-5-en-11-ol (slika 1). Hlapne spojine, prisotne v rastlini oz. eteričnem olju, so odgovorne tudi za rastlinin zna- čilen vonj. V nasprotju z značilnim vonjem sveže rastline, ki spominja na kari, eterično olje laškega smilja navadno nima takšnega vonja (Appendi- no idr. 2015; Charles in Simon 1991). Povezava med posameznimi spoji- nami in vonjem je slabo raziskana, najverjetneje pa so za grenko, lesnato noto eteričnega olja odgovorne nehlapne spojine, ki se med destilacijo razgradijo (Charles in Simon 1991). Aromo karija pripisujejo kurkume- nom (Tzanova idr. 2018) in diketonu 4,6-dimetiloktan-3,5-dionu (Andre- ani idr. 2019), ki pa so v eteričnem olju različno zastopani. Največ raziskav laškega smilja je opravljenih prav v zvezi s kemijsko sestavo eteričnega olja. V preglednici 1 so predstavljene sestava eterične- ga olja različnih podvrst laškega smilja in raziskave, ki so jih raziskovalci izvajali v različnih državah. Čeprav ISO-standard, ki bi reguliral kakovost eteričnega olja laškega smil ja, uradno ne obstaja (Aćimović idr. 2024), se kot kriterij pogosto 143 Dunja Bandelj, Katja Kramberger in Matjaž Hladnik Preglednica 1 Predstavitev poglavitnih biokemijskih spojin eteričnega olja po raziskavah Država Vodilne spojine Podvrsta/izvor rastlin Avtorji raziskave Črna gora neril acetat (28,2 %) subsp. italicum/Črna Kladar idr. (2015) γ gora-kurkumen (18,8 %) neril propionat (9,1 %) ar-kurkumen (8,3 %) Črna gora β-eudezmen (21,65 %) subsp. italicum/Črna Oliva idr. (2020) β gora-bisabolen (19,90 %) α-pinen (16,9 %) neril acetat (10,66 %) kopaen (4,45 %) limonen (3,24 %) β-kariofilen (11,5 %) Hrvaška 1. Parna destilacija: subsp. italicum/ Jažo idr. (2022) α Hrvaška-pinen (0,09–6,6 %) limonen (0,08–2,53 %) neril acetat (6,38–12,26 %) β-selinen (1,85–4,46 %) ar-kurkumen (0–6,92 %) γ-kurkumen (0–9,66 %) α-selinen (3,45–11,23 %) italidion I (5,73–13,30 %) italidion II (3,17–12,07 %) italidion III (2,14–7,21 %) 2. Vodna destilacija: α-pinen (1,75–5,06 %) limonen (0,82–3,31 %) neril acetat (5,45–10,84 %) β-selinen (0,26–3,09 %) ar-kurkumen (0–6,92 %) γ-kurkumen/ α-selinen (0–3,58 %) italidion I (2,03–5,67 %) italidion II (3,16–5,55 %) italidion III (4,48–5,60 %) Francija 1. Genotip 1 (Bonifaccio): subsp. microphyllum*/ Perrini idr. (2009) (Korzika) Korzika neril acetat (55,7 %) neril propanoat (12,7 %) nerol (4,4 %) ar-kurkumen (3,9 %) γ-kurkumen (2,5 %) 2. Genotip 2 (Porto Vecchio): neril acetat (41,5 %) nerol (13,1 %) γ-kurkumen (8,2 %) neril propanoat (5,6 %) rosifoliol (3,8 %) Nadaljevanje na naslednji strani Opomba *Po novejši klasifikaciji podvrsta subsp. tyrrhenicum. 144 Bioaktivne spojine hidrolata in eteričnega olja laškega smilja Nadaljevanje s prejšnje strani Država Vodilne spojine Podvrsta/izvor rastlin Avtorji raziskave Srbija neril acetat (5,5 %) subsp. italicum/Bosna Aćimović idr. α in Hercegovina-pinen (11,8 %) (2021) italicen (4,2 %) β-kariofilen (6,7 %) γ-kurkumen (13,6 %) ar-kurkumen (5 %) β-selinen (12,2 %) α-selinen (4,3 %) limonen (2,6 %) Srbija α-pinen (29,77 %) subsp. italicum/Bosna Nebrigić idr. limonen (2,77 %) in Hercegovina (2023) α-kubeben (2,76 %) himahelen (5,40 %) trans-kariofilen (7,43 %) β-pačulen (3,14 %) α-murolen (21,50 %) neril acetat (3,3 %) α-kurkumen (4 %) Srbija γ-kurkumen (16,3–20,5 %) subsp. italicum/ni Aćimović idr. β določen (2024)-selinen (6,8–9,1 %) trans-kariofilen (6,5–7,1%) neril acetat (5,9–8,1%) ar-kurkumen (5,6–8,4%) α-pinene (4,6–6,8%) italicen (4,6–5,1%) limonen (1,4–2,2 %) Bosna in α-pinen (15,96–17,98%) subsp. italicum/Bosna Džananović Hercegovina in Hercegovina Jaganjac idr. (2021) limonen (2,23–3,26 %) neril acetat (7,55–10,68 %) italicen (2,71–3,62 %) β-kariofilen (4,96–5,44 %) β-kurkumen (14,39–20,62 %) β-selinen (8,51–10,24 %) α-selinen (4,10–5,73 %) Bosna in α-pinen (15,7 %) subsp. italicum/Bosna Talić idr. (2019) Hercegovina in Hercegovina γ-kurkumen (12,8 %) 4,6,9-trimetildec-8-en-3,5-dion (8,7 %) neril acetat (6,9 %) limonen (6,4 %) β-selinen (5,3 %) trans-kariofilen (3,9 %) α-selinen (3,6 %) Nadaljevanje na naslednji strani 145 Dunja Bandelj, Katja Kramberger in Matjaž Hladnik Nadaljevanje s prejšnje strani Država Vodilne spojine Podvrsta/izvor rastlin Avtorji raziskave Bolgarija 1. Francoski genotip: subsp. microphyllum*/ Mollova idr. (2020) neril acetat (33,8 %) Francija γ-kurkumen (8,8 %) rosifoliol (5,46 %) geranil propionat (4,98 %) ar-kurkumen (4,31 %) italidion I (3,56 %) α-eudezmol (3,19 %) limonen (3,02 %) α-pinen (1,98 %) 2. Bosanski genotip: α-pinen (20,84 %) γ subsp. italicum/Bosna -kurkumen (16,53 %) β in Hercegovina-selinen (5.59 %) ar-kurkumen (4,39 %) trans-kariofilen (4,35%) β-diketon italidion I (4,32%) α-selinen (4,28 %) neril acetat (3,81 %) limonen (2,02 %) Bolgarija α-pinen (5,59–19,52 %) subsp. italicum/ Tzanova idr. (2018) limonen (1,72–4,45 %) Korzika neril acetat (12,01–20,60 %) α-kopaen (5,42–12,83 %) citronelol izobutanoat (12,99–25,76 %) eudezm-5–en-11-ol (1,92– 8,14 %) Italija 1. Obalni genotipi: subsp. microphyllum*/ Melito idr. (2016) (Sardinija) neril acetat (33,1– 83,4 %) Sardinija limonen (0–15,7 %) eudezm-7-(11)-en-4-ol (0–32,1 %) γ-kurkumen (0–4,4 %) neril propionate (0–14,1 %) 2. Gorski genotipi: neril acetat (1,1–56,9 %) limonen (0–8,6 %) eudezm-7-(11)-en-4-ol 0-(46,1 %) γ-kurkumen (1,4–10,6 %) neril propionat (0–12,5 %) Nadaljevanje na naslednji strani 146 Bioaktivne spojine hidrolata in eteričnega olja laškega smilja Nadaljevanje s prejšnje strani Država Vodilne spojine Podvrsta/izvor rastlin Avtorji raziskave Italija γ-kurkumen (11,08–28,94 %) subsp. tyrrhenicum/ Juliano idr. (2019) (Sardinija) Sardinija linalol (11–14 %) eudezm-5-en-11-ol (7–9,8 %) limonen (1,1–7,3 %) 4,6-dimetiloktan-3,5-dion (0,9–1,6 %) neril-acetat (0–33,6 %) α-pinen (0,25–0,42 %) α-cedren (0,14–4,17 %) Italija limonen (1,2–7,7 %) subsp. italicum/Elba Leonardi idr. (Elba) (2013) nerol (3–12,8 %) neril acetat (6,7–45,9 %) neril propanoat (2,7–7,7 %) γ-kurkumen (1,7–5,9 %) eudezm-5-en-11-ol (1,8–17,2 %) α-pinen (1–32,9 %) Italija 1. Toskanski vzorci: subsp. italicum/ Bianchini idr. Francija limonen (2,0–10,7 %) (Korzika) neril acetat (0,3–22 %) (Toskana) Toskana, Korzika (2003) α-pinen (4,1–53,5 %) neril propionat (0,3–5,8 %) β-kariofilen (5,7–11 %) γ-kurkumen (1,4–4,9 %) β-selinen (7,2–12,5 %) eudezm-5-en-11-ol (0–6,6 %) 2. Korziški vzorci: α-pinen (0,8–1,4 %) limonen (2,6–4,7 %) neril acetat (33,7–38,9 %) neril propionat (3,4–5,9 %) γ-kurkumen (3,9–13,6 %) eudezm-5-en-11-ol (2,8–6,1 %) Francija limonen (5,1–7,3 %), subsp. italicum/ Bianchini idr. (Korzika) Korzika (2001) neril acetat (34,5–42,5 %) neril propionat (4,8–6,7 %) eudezm-5-en-11-ol (0,8–5,1 %) ar-kurkumen (2,3–4,6 %) γ-kurkumen (5,1–12,9 %) 4,6,9-trimetildec-8-en-3,5 dion (3,7–4,5 %) nerol (2,6–3,4 %) italicen (2,4–3,4 %) α-pinen (0,7–2,9 %) Nadaljevanje na naslednji strani 147 Dunja Bandelj, Katja Kramberger in Matjaž Hladnik Nadaljevanje s prejšnje strani Država Vodilne spojine Podvrsta/izvor rastlin Avtorji raziskave Italija nerol (1,4–7,6 %), subsp. italicum/ Paolini idr. (2006) (Toskana, neril acetat (14,9–44,5 %), Toskana, arhipelag arhipelag) neril propionat (3–16,4 %), 4,6,9-trimetildec-8-en-3,5-dion (0,3–19,8 %), 2,4,6,9-tetrametildec-8-en-3,5- dion (0,6–6,2 %), 2,4,6,9-tetrametildec-8-en-3,5- dion (0,4–8 %), eudezm-5-en-11-ol (1,1– 7,6 %), γ-kurkumen (5,4–13,7 %), α-pinen (0,1–8,6 %), limonen (0,2–10,4 %), Italija Različni genotipi: subsp. italicum/Italija Morone-Fortunato neril acetat (0,4–32 %), idr. (2010) β-kariofilen (0–18,6 %), γ-kurkumen (0–41 %), β-selinen (2,3–28 %), 4, 6, 9-trimetildec-8-en-3,5- dion (5,5–11,0 %), 5, 7, 10-trimetilundec-9-en-4, 6-dion (2,6–6,9 %), 4, 6-dimetiloktan-3, 5-dion (0,2–2,4 %) α-pinen (0-3,6 %) Alžirija α-cedren (13,61 %) ni določena/Alžirija Djihane idr. (2017) α-kurkumen (11,41 %) geranil acetat (10,05 %) limonen (6,07 %) nerol (5,04 %) neril acetat (4,91 %) α-pinen (3,78 %) omenja vsebnost monoterpena neril acetata, ki je pomembna sestavina kozmetičnih produktov. Zaželeno je, da je le-ta zastopan z več kot 30 % (Tzanova idr. 2018). Nerol in njegovi estri so značilni za genotipe laškega smilja podvrste microphyllum (kasneje klasificirana kot podvrsta tyrrhe- nicum), kjer dosežejo 40–50 % vseh komponent v eteričnemu olju (Mo- rone-Fortunato idr. 2010). Visoka vsebnost neril acetata je značilna za eterična olja s Korzike in Sardinije. V Bolgariji, kjer ravno tako gojijo kor- ziški smilj, so detektirali med 12,02 do 20,60 % neril aceteta, zato Milena Tzanova idr. (2018) menijo, da je vsebnost te spojine povezana s talnimi in podnebnimi dejavniki ter fenološko fazo. V Sloveniji je korziški smilj 148 Bioaktivne spojine hidrolata in eteričnega olja laškega smilja Slika 2 Vsebnost (%) spojin neril acetata in γ-kurkumena glede na geograf- sko območje in podvrsto laškega smilja po posameznih raziskavah. Oznake območij vzorčenja laškega smilja: DZA (Alžirija), BIH (Bosna in Hecegovina), FRA (Francija), Krz (Korzika), MNE (Črna gora), Tsk (Toskana), Elb (Elba), Srd (Sardinija), ITA (Italija) v kolekcijskem nasadu UP FAMNIT dosegel zavidljivo visoko vsebnost nerila acetata (40–70 %), kar nakazuje vpliv genotipa na sintezo te spoji- ne. Pregled vsebnosti neril acetata v eteričnem olju glede na geografsko lokacijo in podvrsto laškega smilja je predstavljen na sliki 2. Zelo zaželene spojine so tudi β-diketoni, ker imajo pomembno antioksi-dativno sposobnost in so odgovorni za protivnetno delovanje. Višjo vseb- nost β-diketonov (italidionov) so Irene Morone-Fortunato idr. (2010) odkrili pri podvrsti italicum in menijo, da imajo genotipi z višjo koncen- tracijo seskviterpenov običajno nižjo vsebnost β-diketonov. Irene Morone-Fortunato idr. (2010) poudarjajo, da raznolikost kemijskih profilov eteričnega olja usmerja nadaljno uporabo. Nerol in njegovi deri- vati se, denimo, uporabljajo v kozmetiki zaradi sladkega, rožnatega von- ja. Med njimi je pomemben neril acetat, ki ga zaznamuje značilen vonj, ki spominja na pomarančo in vrtnico. Pinen ima svež vonj iglavcev, limo- nen diši po limoni. Kurkumen se zaradi značilnega zeliščnega vonja, ki spominja na kari, uporablja v živilski industriji (Tzanova idr. 2018). Alfa in β-selinen, prav tako seskviterpena, sta uporabna kot feromona zaradi sladko-lesnega in zeliščnega vonja. Kemijska sestava eteričnih olj se lahko zelo spreminja glede na vrsto rast line, rastlinski organ, geografsko lego, podnebje, čas nabiranja. Ti de- javniki vplivajo na sestavo eteričnega olja, njegovo aromo in druge last- nosti (Siddiqui idr. 2024). V nadaljevanju bomo podrobneje opisali vpliv 149 Dunja Bandelj, Katja Kramberger in Matjaž Hladnik omenjenih dejavnikov na biokemijsko sestavo in kakovost eteričnega olja laškega smilja. Dejavniki, ki vplivajo na biokemijsko sestavo in kakovost eteričnega olja Na kemijsko sestavo ali kemotip in na vsebnost posameznih biološko aktiv- nih spojin eteričnega olja vplivajo genetska osnova rastlin, različni okoljski dejavniki (tla, nadmorska višina, podnebne razmere, padavine) ter načini pridelave in predelave rastlinskega materiala (Maksimovic idr. 2017). Na sestavo eteričnega olja laškega smilja pa poleg genetske osnove ter okoljskih dejavnikov vplivajo tudi termin in način žetve, priprava rastlinskega mate- riala na destilacijo, način destilacije in pogoji med njo. Ti dejavniki vplivajo tudi na aromo in biološke učinke eteričnega olja (Siddiqui idr. 2024). Genetika Sara Melito idr. (2013) poročajo o vplivu genetike na raznolikost kemoti- pov, ki so jo odkrili pri preučevanju 50 populacij na Sardiniji s primerjavo presnovkov v eteričnem olju in z analizo označevalcev AFLP. Pri devetih spojinah (kariofilen, eudezm-5-en-11-ol, neril propionat, nerolidol, ne- ril acetat, cis-β-gvajen, trans-β-gvajen, α-kadinen, γ-terpinen) so odkrili korelacijo z genetsko skupino. Povezavo med genetsko različnimi rastli- nami (analiza z označevalci AFLP) ter kemotipom so raziskovali tudi Ire- ne Morone-Fortunato idr. (2010) v Italiji in zaključili, da obstajajo naj- manj tri različne skupine: 1. genotipi, bogati z neroli in njihovimi estri, 2. genotipi, kjer prevladujeta β- in α-selinen, 3. genotipi s prevlado γ-kurkumena. Poudarjajo tudi, da ločevanje in razmejitev podvrst laškega smilja zgolj na osnovi kemijske sestave eteričnega olja ni primerna, saj se določene kemijske spojine pojavljajo v višjih koncentracijah v različnih podvrstah. Npr., nerol in neril acetat se pojavljata v subsp. italicum in subsp. tyrre- henicum. Nadmorska višina, podnebne razmere in tla Raziskava laškega smilja podvrste microphyllum (po novejši klasifika- ciji thyrrenicum) na Sardiniji (Melito idr., 2016) je pokazala statistično značilno razliko v sestavi hlapnih spojin eteričnega olja glede na gor- ski ali obalni habitat, vendar avtorji poudarjajo, da za kemijsko sestavo 150 Bioaktivne spojine hidrolata in eteričnega olja laškega smilja eteričnega olja ni odgovorno zgolj rastišče. Ugotovili so tudi, da je ne- rolidol pozitivno povezan s povprečno zimsko temperaturo, medtem ko na vsebnost italicena, bergamotena, nerola in kurkumena pozitivno vpli- vajo spomladanske in poletne padavine. Primerjava biokemijske sestave eteričnega olja glede na nadmorsko višino je pokazala, da gre v primeru italicena, γ-kurkumena, ar-kurkumena, nerola in geraniola za pozitivno korelacijo, medtem ko je bila pri limonenu, kariofilenu, nerolidolu in cis- -β-gvajenu opažena negativna korelacija z nadmorsko višino. Sara Meli-to idr. (2016) menijo, da podnebje vpliva predvsem na seskviterpene in da je njihova koncentracija manj odvisna od temperature. Sanja Ćavar Željković idr. (2015) pa so pri preučevanju hrvaškega laškega smilja ugo- tovile, da imajo več oksigeniranih spojin rastline višjih nadmorskih višin z močnejšim sončnim sevanjem, medtem ko je skupina monoterpenov pokazala ravno obraten trend. Vpliv podnebja so potrdili tudi Milica Aćimović idr. (2024) v Srbiji. Ugo- tovili so, da so v eteričnem olju α-pinen, neril acetat in italicen pozitivno povezani s temperaturo ter negativno s padavinami, enako tudi β-diketo- ni in skupni italidioni. Trans-kariofilen, γ-kurkumen in ar-kurkumen so bili negativno povezani s temperaturo, rahlo pozitivno korelacijo pa so zaznali s padavinami. Po njihovem mnenju korziški tip eteričnega olja, bogat z neril acetatom, prevladuje v območjih s toplimi in deževnimi zi- mami ter z vročimi in sušnimi poletji (sredozemsko podnebje), medtem ko se balkanski tip, bogat z γ- in ar-kurkumenom, pojavlja v območjih z vročimi poletji, manj deževnimi jesenmi ter mrzlimi zimami (celinsko podnebje). Ange Bianchini idr. (2009) so preučevali povezave med bio- kemijsko sestavo eteričnega olja in karakteristikami tal (anorganska se- stava, tekstura, kislost) ter ugotovili korelacijo s teksturo in kislostjo tal. Geografski izvor Povzetek razlikovanja eteričnih olj laškega smilja glede na geografski izvor so nazorno povzeli Tonka Ninčević idr. (2019). V korziškem ete- ričnem olju prevladujejo oksigenirane spojine (neril acetat, neril pro- panoat, alifatski ketoni in β-diketoni) in nizke vsebnosti ogljikovodikov (limonen, γ-kurkumen, α-kurkumen). V eteričnih oljih iz držav bivše Jugoslavije prevladujejo α-pinen (22 %), γ-kurkumen (10 %), β-selinen (6 %), neril acetat (6 %), β-kariofilen (5 %), na obali Jadranskega morja pa sta najpogostejši komponenti α-pinen (25-30%) in neril acetat (4-14 %). V grških eteričnih oljih je najpogostejša spojina geraniol (36 %), sledita geranil acetat (15 %) in nerolidol (12 %), toskanska eterična olja pa so 151 Dunja Bandelj, Katja Kramberger in Matjaž Hladnik bogata z α-pinenom (33-39 %), neril acetatom (10-22 %), seskviterpen- skimi ogljikovodiki (23-39 %) ter z β-selinenom, α-selinenom in β-kario- filenom. Milica Aćimović idr. (2024) poročajo še o γ-kurkumen kemotipu, v katerem je ta spojina zastopana v več kot 15 % in se kot dominantna po- javlja v eteričnih oljih Hrvaške, Srbije, Bosne in Hercegovine, Črne gore, Bolgarije ter tudi Italije, Francije, Portugalske, ZDA. Pregled vsebnosti γ-kurkumena v eteričnem olju glede na geografsko lokacijo in podvrsto laškega smilja je predstavljen na sliki 2. Čas in način žetve Ange Bianchini idr. (2001) so ugotovili, da eterično olje, pridobljeno iz prvih vegetativnih poganjkov v začetku vegetacije, vsebuje višje koncen- tracije treh neterpenskih ketonov (pentan-3-on, 2-metilpentan-3-on, 4-metilheksan-3-on) in dveh β-diketonov (3,5-dimetilheptan-2,4-dion, 4,6-dimetiloktan-3,5-dion) ter nižje koncentracije neril acetata, neril propanoata, γ-kurkumena, 4,6,9-trimetildec-8-en-3,5-diona. Sestavo eteričnega olja v odvisnosti od časa žetve so raziskovali tudi v Bosni in Hercegovini, kjer so prvo žetev opravili v februarju, nato v maju, juniju, avgustu in oktobru. Stanislava Talić idr. (2019) so ugotovili, da se po cve- tenju značilno zniža koncentracija limonena, α-, β-, in γ-selinena, γ-kur- kumena in neril acetata, poveča pa se vsebnost estrov. Vsebnost β-dike-tonov je bila najvišja februarja, ko je dosegala celo 31,9 %, nato pa se je zniževala do 11 % v mesecu oktobru. Ana Matin idr. (2021) so na Hrva- škem preučevali pridelke in kemijsko sestavo eteričnega olja julijske ter oktobrske žetve. Ugotovili so večji izplen eteričnega olja v poletni žetvi, in sicer 0,19 % ± 0,01, v jesenski pa 0,16 % ± 0,04. Pri primerjavi obdobja žetve so v jeseni pridobljenem eteričnem olju odkrili višjo koncentracijo α-pinena, linalola in nerola ter italidionov, večjo vsebnost neril acetata in γ-kurkumena pa so detektirali pri poletni žetvi. Večina raziskav kaže, da v zgodnjih stadijih razvoja rastline prevladujejo monoterpeni, medtem ko so seskviterpeni prisotni med in po cvetenju. Slednji so tudi manj obču- tljivi na temperaturne spremembe, zato so v poletnih mesecih prisotni v višjih koncentracijah (Jažo idr. 2022). Na kemijsko sestavo eteričnega olja vpliva tudi način žetve (ročno ali strojno) (Giannakoula idr. 2024). V eteričnem olju strojno obranega laš- kega smilja so ugotovili višjo vsebnost γ-kurkumena, pri ročno obranem pa višjo vsebnost α-pinena in neril acetata. Pri strojnem obiranju se naj-verjetneje zaradi večjih poškodb rastlinskih tkiv tvorijo škodljive reak- tivne kisikove spojine, ki povzročajo peroksidacijo lipidnih membran v 152 Bioaktivne spojine hidrolata in eteričnega olja laškega smilja rastlinskih celicah. Na splošno imajo boljše kakovostne lastnosti eterična olja laškega smilja, pridobljena z ročnim nabiranjem. Sušenje Tudi proces sušenja požetega laškega smilja lahko vpliva na sestavo ete- ričnega olja ter posledično na antioksidativno in encimsko delovanje. Vladislava Nebrigić idr. (2023) so preučevali sestavine v eteričnem olju, pridobljenem iz sveže rastlinske mase, iz naravno sušenega in liofilizi- ranega laškega smilja. Raziskava je pokazala, da sušenje zniža koncen- tracije monoterpenov (npr. α-pinen: 29,77 % svež/2,43 % sušen/10,46 % liofiliziran) in poviša vsebnost seskviterpenov v eteričnem olju, hkrati se s sušenjem zniža tudi antioksidativna aktivnost. Način in trajanje destilacije Sestava eteričnega olja je odvisna tudi od trajanja in pogojev destilacije rastlinskega materiala. Petrović idr. (2024) so raziskovali kemijsko sesta- vo eteričnega olja v odvisnosti od dolžine industrijske parne destilacije hrvaškega laškega smilja v 15-minutnih intervalih. Kemijska analiza je bila osredotočena na določene hlapne spojine – monoterpene in seskvi- terpene. Ugotovili so, da se vsebnost bolj hlapnih, monoterpenskih spojin (α-pinena in limonena) z dolžino destilacije zmanjšuje. Pri α-pinenu se je vsebnost v intervalu 30 minut od začetne destilacije do 120 minut zni- žala s 25,90 na 6,61 %, limonena pa s prvotnih 4,55 na 1,52 %. Tudi vseb- nost neril acetata se je z dolžino destilacije zniževala, s prvotnih 7,33 na 5,69 %. Obraten trend je bil opažen pri seskviterpenih in seskviterpens kih oksidih, ki veljajo za manj hlapne spojine; vsebnost γ-kurkumena se je, denimo, s prvotnih 14,55 zvišala na 18,81 %. Rezultati raziskave kažejo na pomembnost dolžine destilacije. Pričakovati je, da se bo vsebnost mono- terpenov in angelata med destilacijo zniževala, vsebnost seskviterpenov in seskviterpenskih oksidov pa proti koncu destilacije zviševala. Razisko- valci menijo, da je s krajšim časom destilacije možno pridobiti eterično olje, ki je bogatejše z monoterpeni in zato primernejše za parfumsko ter kozmetično industrijo. Jažo idr. (2022) so primerjali tri metode destilacije: vodno, parno in de- stilacijo, podprto z mikrovalovi. Za slednjo je značilno, da mikrovalov- na energija med hidrodestilacijo znatno skrajša čas ekstrakcije in zniža stroške energije. Optimiziranje moči in trajanja izpostavljenosti mikro- valovom naj bi izboljšalo kakovost eteričnega olja ter izkoristek. Razi- skovalci poročajo, da je s parno destilacijo moč pridobiti eterična olja, 153 Dunja Bandelj, Katja Kramberger in Matjaž Hladnik bogata z necikličnimi spojinami z najvišjimi koncentracijami ketonov. Z destilacijo, podprto z mikrovalovi, pa se pridobi eterična olja s spojinami s kompleksno strukturo. Vodna destilacija daje vmesne rezultate glede funkcionalnih skupin in strukturne kompleksnosti izoliranih spojin, kar je najverjetneje posledica transformiranja spojin. Razlike so bile tudi v iz- koristku; z vodno paro je bil izplen najvišji (0,31 %), sledila je destilacija, podprta z mikrovalovi (0,15 %), in nazadnje parna destilacija (0,12 %). Te raziskave dokazujejo, kako pomembno vlogo ima izbira metode ekstrak- cije v praksi. Bioaktivne spojine v hidrolatu laškega smilja Hidrolati so stranski produkti destilacije in so posledično sestavljeni pre- težno iz vode, ki je kondenzirala med procesom destilacije, v kateri pa so tudi raztopljene majhne količine eteričnega olja (navadno manj kot 1 g/L), odtod tudi ime aromatična voda. V nasprotju z eteričnimi olji gre za manj koncentrirane izvlečke z blago aromo, ki ob stiku s kožo ne povzročajo kontaktnega dermatitisa ali glavobola ob vdihovanju, zato se jih kot take lahko uporablja neposredno na koži ali tudi zaužije. Kljub široki uporabi pa njihova kemijska sestava in lastnosti niso dobro razi- skane (Jakubczyk idr. 2021). V splošnem je v hidrolatih pričakovati po- larne, oksigenirane, hidrofilne, aromatične sestavine eteričnega olja, ki z vodo tvorijo vodikove vezi. Hidrolati, pridobljeni na začetku in v zadnjem delu destilacije, se razlikujejo po vonju in kemični sestavi. To je posledica vsebnosti različnih terpenoidov z nizkim in visokim vreliščem. Aromat- ski profil hidrolatov se lahko bistveno razlikuje od profila eteričnega olja, ker v njih ni prisotnih veliko hidrofobnih, v vodi netopnih izoprenoidnih spojin (Rao 2013). V znanstveni skupnosti so hidrolati opredeljeni kot odpadni produkti parne destilacije. V zadnjem času so jih številni razi- skovalci ponovno preučili in analizirali njihovo biološko delovanje, pred- vsem protimikrobno in protiglivično sposobnost (D’Amato idr. 2018). V primerjavi z eteričnim oljem so objavljene kemijske karakterizacije in raziskave hidrolatov laškega smilja izjemno redke. Ferraz idr. (2022) so v hidrolatu laškega smilja s Portugalske identificirali sedem bioak- tivnih spojin iz razreda monoterpenov, in sicer: α-terpineol, 1,8-cineol, endo-borneol, terpinen-4-ol, δ-terpineol, α-terpineol in karvakrol. V Sloveniji so bili analizirani vzorci hidrolata eno- in dvoletnih rastlin la- škega smilja, ki jih vzdružujejo na Inštitutu za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije, ter treh hrvaških populacij (Kunc idr. 2022). Prevladujoče kemijske spojine v slovenskih vzorcih so bile pentan-3-on, 3-oktanon, 154 Bioaktivne spojine hidrolata in eteričnega olja laškega smilja 2,2-dimetilnon-5-en-3-on ter α-terpineol, v hrvaških pa 2,6-oktadien- -1-ol, 2,2-dimetilnon-5-en-3-on in α-terpineol. Zastopanost posame-znih spojin se je prav tako nekoliko razlikovala med vzorci eno- in dvo- letnih rastlin. Pri enoletnih rastlinah so bile najbolj zastopane spojine: 2,2-dimetilnon-5-en-3-on (13,1 %), 3-oktanon (12,3 %), pentan-3-on (10,1 % ), α-terpineol (9,1 %) in 3-ciklopenten-1-etanol (8,6 %). V obeh analiziranih vzorcih so se pojavljale štiri prevladujoče bioaktivne spoji- ne, ki so bile pri enoletnih rastlinah v višjih koncentracijah. Najbolj za- stopane spojine v dvoletnih rastlinah so bile 2,2-dimetilnon-5-en-3-on (8,9 %), 3-oktanon (8,0 %), α-terpineol (7,7 %), 2,6-oktadien-1-ol (7,4 %) in pentan-3-on (7,43 %). Vseh identificiranih spojin je bilo skupno 19 pri enoletnih in 21 pri dvoletnih rastlinah. V Turčiji so Erbaş idr. (2023) primerjali hidrolate ekotipov laškega smilja iz Bosne in Hercegovine ter s Korzike. V bosanskem hidrolatu je bila najbolj zastopana spojina β-himahalen (20,9 %), sledila sta ji ar-kurkumen (13,6 %) in neril ace-tat (13,0 %). V korziškem hidrolatu pa prevladuje nerol (23,7 %), sledita mu β-fenhil alkohol (18,4 %) in neril acetat (10,8 %). Milica Aćimović idr. (2024) pa v hidrolatih laškega smilja, pridelanega v Srbiji, poročajo o višji vsebnosti skupnih β-diketonov – italidiona I (vsota vseh izomer od 18,7 do 27,8 %) in 4,6-dimetiloktan-3,5-diona (vsota vseh izomer med 8,6 in 13,9 %). Skupno so v hidrolatu potrdili 20 β-diketonov in njihovih izome-rov (med 29,7 in 46,4 %). Med njimi je bilo 15 italidionov (med 19,2 % in 29,1 %). Ugotovili so tudi, da so tako skupni β-diketoni kot tudi skupni italidioni močno negativno povezani s temperaturami ter pozitivno po- vezani s padavinami, kar je ravno nasprotno ugotovitvam pri eteričnemu olju. β-diketoni so dragocene spojine z dobrim antioksidativnim poten-cialom, delujejo proti raku in mikroorganizmom, zato je njihova uporaba pri zdravljenju precej razširjena. Te spojine so prisotne v številnih rastli- nah, npr. v ingverju, kurkumi, šentjanževki. Italidioni, skupina izome- rov β-diketonov, pa so bili odkriti samo pri laškemu smilju. Te spojine so dobro topne v vodi, zato je pričakovati njihove višje koncentracije v hidrolatu (Aćimović idr. 2024). Avtorji poudarjajo, da raznolikost v vseb- nosti biološko aktivnih molekul italidionov omogoča široko in različno uporabo hidrolatov v kozmetičnih formulacijah ter pri zdravljenju vnetij. Milica Aćimović idr. (2024) so mnenja, da na kemijsko sestavo hidrola- ta močno vpliva sestava eteričnega olja. Na sestavo hidrolata med dru- gim vpliva tudi način priprave vzorca za analizo (npr. neposredna ana- liza ali predhodna ekstrakcija z organskimi topili). Nina Kunc idr. (2022) so na tak način v vzorcih hidrolata slovenskega laškega smilja določili 155 Dunja Bandelj, Katja Kramberger in Matjaž Hladnik še prisotnost 1,8-cineola (31,5–55,5 %), α-terpineola (12,9–16,6 %), terpi-nen-4-ola (13,6-15,1 %), linaloola (8,4–11,2 %), eugenola (2,6–4,7 %) in 4,6,9-trimetil-8-decen-3,5-diona (2,7–4,4 %). Viri Aćimović, M., J. Ljujić, J. Vulić idr. 2021. »Helichrysum italicum (Roth) G. Don Essential Oil from Serbia: Chemical Composition, Classification and Bi- ological Activity-May It Be a Suitable New Crop for Serbia?« Agronomy 11 (7): 1282. Aćimović, M., J. Stanković Jeremić, M. Todosijević idr. 2024 »The Influence of Weather Conditions on the Immortelle Volatile Constituents from Es- sential Oil and Hydrosol with a Focus on Italidiones and Its Molecular Docking Anti-Inflammatory Potential.« Natural Product Communicati- ons 19 (9). https://doi.org/10.1177/1934578X24128473. Andreani, S., A. Uehara, P. Blagojević, N. Radulović, A. Muselli in N. Baldo- vini. 2019. »Key Odorants of Industrially-Produced Helichrysum itali- cum subsp. italicum Essential Oil.« Industrial Crops and Products 132: 275–282. Appendino, G., O. Taglialatela-Scafati, A. Minassi, F. Pollastro, M. Ballero in A. Maxia. 2015. »Helichrysum italicum: The Sleeping Giant of Mediter- ranean Herbal Medicine.« HerbalGram 105:36–47. Bianchini, A., P. Tomi, J. Costa in A.-F. Bernardini. 2001. »Composition of He- lichrysum italicum (Roth) G. Don fil. subsp. italicum Essential Oils from Corsica (France).« Flavour and Fragrance Journal 16 (1): 30–34. Bianchini, A., F. Santoni, J. Paolini, A.-F. Bernardini, D. Mouillot in J. Costa. 2009. »Partitioning the Relative Contributions of Inorganic Plant Com- position and Soil Characteristics to the Quality of Helichrysum italicum subsp. italicum (Roth) G. Don fil. Essential Oil. « Chemistry and Biodi- versity 6 (7): 1014–1033. Bianchini, A., P. Tomi, A.-F. Bernardini idr. 2003. »A Comparative Study of Volatile Constituents of Two Helichrysum italicum (Roth) Guss. Don Fil Subspecies Growing in Corsica (France), Tuscany and Sardinia (Italy).« Flavour and Fragrance Journal 18 (6): 487–491. Charles , D. J., in J. E. Simon. 1991. »Volatile Compounds of the Curry Plant.« HortScience 26 (1): 69–70. Cheng, A.-X., Y.-G. Lou, Y.-B. Mao, S. Lu, L.-J. Wang in X.-Y. Chen. 2007. »Plant Terpenoids: Biosynthesis and Ecological Functions.« Journal of Integrative Plant Biology 49 (2): 179–186. Ćavar Željković, S., Šolić M. E. in M. Maksimović. 2015 »Volatiles of Helich- rysum italicum (Roth) G. Don from Croatia.« Natural Product Research 29 (19): 1874–1877. 156 Bioaktivne spojine hidrolata in eteričnega olja laškega smilja D’Amato, S., A. Serio, C. Chaves López in A Paparella. 2018. »Hydrosols: Bio- logical Activity and Potential as Antimicrobials for Food Applications.« Food Control 86:126–137. Dhifi, W., S. Bellili, S. Jazi, N. Bahloul in W. Mnif. 2016. »Essential Oils’ Che- mical Characterization and Investigation of Some Biological Activities: A Critical Review.« Medicines 3 (4): 25. Djihane, B., N. Wafa, S. Elkhamssa, H. J. Pedro, A. E. Maria in Z. Mohamed Mihoub. 2017. »Chemical Constituents of Helichrysum. italicum (Roth) G. Don Essential Oil and Their Antimicrobial Activity Against Gram-Po-sitive and Gram-Negative Bacteria, Filamentous Fungi and Candida al-bicans.« Saudi Pharmaceutical Journal 25 (5): 780–787. Durczyńska, Z., in G. Żukowska. 2024. »Properties and Applications of Essen- tial Oils: A Review.« Journal of Ecological Engineering 25 (2): 333–340. Džananović Jaganjac, J., Z. Ademović, B. Šarić Kundalić in E. Horozić. 2021. »Chemical Composition and Antioxidant and Antimicrobial Activity of Helichrysum italicum (Roth) G. Don. Essential Oil from Bosnia and Herzegovina.« Technologica Acta 14 (1): 21–26. Erba ş, S., M. Mutlucan in Ü. Erdoğan. 2023. »The Scent Compounds of Im- mortelle Ecotypes (Helichrysum italicum (Roth) G. Don.) Grown in Tür-kiye and Its New Products (Absolute and Concrete).« South African Jou-rnal of Botany 158:301–311. Ferraz, C. A., A. C. A. Sousa, D. Caramelo, F. Delgado, A. P de Oliveira in M. Ramiro Pastorinho. 2022. »Chemical Profile and Eco-Safety Evaluation of Essential Oils and Hydrolates from Cistus ladanifer, Helichrysum ita-licum, Ocimum basilicum and Thymbra capitata.« Industrial Crops and Products 175:114232. Giannakoula, A. E., C. Dimitriadis in V. Garitsis. 2024. »The Impact of Harve- sting Method and Harvesting Month on the Quality of Helichrysum ita-licum (Roth) G. Don. Essential Oils and Oxidative Stress.« International Journal of Environmental Studies 81 (5): 2107–2116. Holstein, S. A., in R. J. Hohl. 2004. »Isoprenoids: Remarkable Diversity of Form and Function.« Lipids 39 (4): 293–309. Jakubczyk, K., A. Tuchowska in K. Janda-Milczarek. 2021. »Plant hydrolates –Antioxidant Properties, Chemical Composition and Potential Applica-tions.« Biomedicine and Pharmacotherapy 142:112033. Jažo, Z., M. Glumac, I. Drventić idr. 2022. »The Essential Oil Composition of Helichrysum italicum (Roth) G. Don: Influence of Steam, Hydro and Microwave-Assisted Distillation.« Separations 9 (10): 280. Jeong, A., K. F. Suazo, W. G. Wood, M. D. Distefano in L. Li. 2018. »Isopre- noids and Protein Prenylation: Implications in the Pathogenesis and 157 Dunja Bandelj, Katja Kramberger in Matjaž Hladnik Therapeutic Intervention of Alzheimer‘s disease.« Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 53 (3): 279–310. Juliano, C., M. Marchetti, P. Campagna in M. Usai. 2019. »Antimicrobial Activity and Chemical Composition of from Helichrysum microphyllum Cambess. subsp. tyrrhenicum Bacch., Brullo & Giusso collected in So- uth-West Sardinia.« Saudi Journal of Biological Sciences 26 (5): 897–905. Kladar, N. V., G. T. Anačkov, M. M. Rat idr. 2015. »Biochemical Characteriza- tion of Helichrysum italicum (Roth) G. Don subsp. italicum (Asterace- ae) from Montenegro: Phytochemical Screening, Chemotaxonomy, and Antioxidant Properties.« Chemistry and Biodiversity 12 (3): 419–431. Kunc, N., A. Frlan, D. Baričevič, N. Kočevar Glavač in M. Kokalj Ladan. 2022. »Essential Oil and Hydrosol Composition of Immortelle (Helichrysum italicum).« Plants 11 (19): 2573. Leonardi, M., K. E. Ambryszewska, B. Melai idr. 2013. »Essential-oil Compo- sition of Helichrysum italicum (ROTH) G. Don ssp. italicum from Elba Island (Tuscany, Italy).« Chemistry and Biodiversity 10 (3): 343–355. Maksimovic, S., V. Tadic, D. Skala in I. Zizovic. 2017. »Separation of Phyto- chemicals from Helichrysum italicum: An Analysis of Different Isolati- on Techniques and Biological Activity of Prepared Extracts.« Phytoche- mistry 138:9–38. Matin, A., I. Pavkov, M. Grubor idr. 2021. »Influence of Harvest Time, Method of Preparation and Method of Distillation on the Qualitative Properties of Organically Grown and Wild Helichrysum italicum Immortelle Essen- tial Oil.« Separations 8 (10): 167. Melito, S., A. Sias, G. L. Petretto, M. Chessa, G. Pintore in A. Porceddu. 2013. »Genetic and Metabolite Diversity of Sardinian Populations of Helich- rysum italicum.« PLoS One 8 (11): e79043. Melito, S., G. L. Petretto, J. Podani idr. 2016. »Altitude and Climate Influence Helichrysum italicum subsp. microphyllum Essential Oils Compositi- on.« Industrial Crops and Products 80:242–250. Mollova, S., H. Fidan, D. Antonova idr. 2020. »Chemical Composition and Antimicrobial and Antioxidant Activity of Helichrysum italicum (Roth) G. Don Subspecies Essential Oils. « Turkish Journal of Agriculture and Forestry 44 (4): 371–378. Morone-Fortunato, I., C. Montemurro, C. Ruta idr. 2010. »Essential Oils, Ge- netic Relationships and in vitro Establishment of Helichrysum Italicum (Roth) G. Don ssp. italicum from Wild Mediterranean Germplasm.« In- dustrial Crops and Products 32 (3): 639–649. Nebrigić, V., M. Terzić, S. Đurović idr. 2023. »Influence of Drying Process on Chemical Composition, Antioxidant and Enzyme-Inhibitory Activity of 158 Bioaktivne spojine hidrolata in eteričnega olja laškega smilja Helichrysum italicum Essential Oils.« Journal of Herbal Medicine 40 (1): 100680. Ninčević, T., M. Grdiša, Z. Šatović in M. Jug-Dujaković. 2019. »Helichrysum italicum (Roth) G. Don: Taxonomy, Biological Activity, Biochemical and Genetic Diversity.« Industrial Crops and Products 138:111487. Oliva, A., S. Garzoli, M. Sabatino idr. 2020. »Chemical Composition and An- timicrobial Activity of Essential Oil of Helichrysum italicum (Roth) G. Don fil. (Asteraceae) from Montenegro.« Natural Product Research 34 (3): 445–448. Paolini, J., J.-M. Desjobert, J. Costa idr. 2006. »Composition of Essential Oils of Helichrysum italicum (Roth) G. Don fil subsp. italicum from Tuscan Archipelago Islands.« Flavour and Fragrance Journal 21 (5): 805–808. Perrini, R., I. Morone-Fortunato, E. Lorusso in P. Avato. 2009. »Glands, Es- sential Oils and in vitro Establishment of Helichrysum italicum (Roth) G. Don ssp. microphyllum (Willd.) Nyman.« Industrial Crops and Products 29 (2–3): 395–403. Petrović, M., V. Petrović, Z. Mlinar idr. 2024. »Duration of Steam Distillati- on Affects Essential Oil Fractions in Immortelle (Helichrysum itali-cum).« Horticulturae 10 (2): 183. Rao, B. R. R. 2013. »Hydrosols and Water-Soluble Essential Oils: Medicinal and Biological Properties.« V Recent Progress in Medicinal Plants Essen-tial Oils, uredila J. N. Govil in S. Bhattacharya, zv. 36, Essential Oils I. Studium Press. Siddiqui, T., M. Umar Khan, V. Sharma in K. Gupta. 2024. »Terpenoids in Es- sential Oils: Chemistry, Classification, and Potential Impact on Human Health and Industry.« Phytomedicine Plus 4 (2): 100549. Talić, S., L. Odak, A. Martinović Bevanda, N. Crnjac in M. Paštar. 2019. »He- lichrysum italicum (Roth) G. Don subsp. italicum from Herzegovina: Volatile Composition, Variations During Seasons, Total Polyphenols, Acetylcho-Linesterase Inhibition and Antioxidant Activity.« Croatica Chemica Acta 92 (1): 69–77. Tzanova, M., N. Grozeva, M. Gerdzhikova, V. Atanasov, S. Terzieva in R. Pro- danova. 2018. »Biochemical Composition of Essential Oil of Corsican Helichrysum italicum (Roth) G. Don, Introduced and Cultivated in South Bulgaria.« Bulgarian Journal of Agricultural Science 24 (6): 1071–1077. 159 Sklop 3 Biološki učinki laškega smilja 10 Biološka dostopnost in uporabnost zaužitih fenolnih spojin v laškem smilju ∙ 163 Zala Jenko Pražnikar in Ana Petelin 11 Antioksidativno in protivnetno delovanje laškega smilja ∙ 181 Saša Kenig in Zala Jenko Pražnikar 12 Interakcije laškega smilja z mikroorganizmi ∙ 199 Katja Kranjc in Karin Šik Novak 13 Učinki laškega smilja na presnovo ∙ 215 Zala Jenko Pražnikar in Ana Petelin 14 Uporaba laškega smilja v dermatologiji ∙ 227 Saša Kenig 161 10 Biološka dostopnost in uporabnost zaužitih fenolnih spojin v laškem smilju Zala Jenko Pražnikar Ana Petelin Fakulteta za vede o zdravju, Fakulteta za vede o zdravju, Univerza na Primorskem Univerza na Primorskem © 2025 Zala Jenko Pražnikar in Ana Petelin https://doi.org/10.26493/978-961-293-525-2.10 Uvod Izsledki znanstvenih in strokovnih člankov kažejo na pozitivno povezavo med vnosom fenolnih spojin in znižanim tveganjem za razvoj različnih kroničnih nenalezljivih obolenj, kot so sladkorna bolezen tipa 2, različ- na srčno-žilna obolenja, določena rakava in druga obolenja (Konic Ristic idr. 2015). A treba je poudariti, da je učinkovitost fenolnih spojin poveza- na z njihovo biološko uporabnostjo in/ali s tvorbo njihovih presnovkov (Del Rio idr. 2013). Da bi lahko ocenili učinkovitost fenolnih spojin pri preprečevanju bolezni in izboljšanju zdravja pri ljudeh, je treba razumeti in poznati presnovno pot posamezne fenolne spojine od zaužitja do se- krecije presnovkov. Ker biološka uporabnost bioaktivnih spojin, izolira- nih iz laškega smilja, ni bila pogosto predmet raziskav, bo v pričujočem poglavju obravnavana tudi biološka uporabnost fenolnih spojin, izolira- nih iz drugih rastlinskih izvlečkov. V splošnem je biološka uporabnost fenolov odvisna od količine bioaktiv- ne spojine, ki se sprosti v prebavnem sistemu (od biološke dostopnosti), od same presnove bioaktivne spojine (biotransformacije) in od učinko- vitosti absorpcije preko črevesnih celic oz. enterocitov (Lingua idr. 2018). A treba se je zavedati, da preden fenolne spojine dosežejo krvno-žilni Bandelj, D., Z. Jenko Pražnikar in A. Petelin, ur. 2025. 163 Laški smilj. Založba Univerze na Primorskem Zala Jenko Pražnikar in Ana Petelin sistem, interagirajo s številnimi makro- in mikromolekulami v lumnu črevesnega trakta, v enterocitih, krvnem obtoku in kasneje tudi jetrnih celicah. Poleg tega so v interakciji še z drugimi sočasno zaužitimi hranili, s prebavnimi encimi in prenašalnimi molekulami. Vse omenjene inte- rakcije imajo pomemben vpliv na funkcijo in na farmakokinetične para- metre posamezne bioaktivne molekule. Znanstvena dognanja nakazujejo, da so v splošnem med fenoli v največji meri biološko razpoložljivi izoflavoni, sledijo jim fenolne kisline, flava- noli, flavanoni in flavonoli, zadnji pa so antociani in proantocianidi. Bio- loška uporabnost flavonoidov, hidrofilnih spojin, je izjemno nizka zaradi slabše absorpcije iz lumna črevesja v črevesne celice (Shivashankara in Acharya 2010). Interakcije med fenolnimi spojinami in molekulami v lumnu črevesnega trakta Interakcije med fenoli in hranili, ki jih sočasno zaužijemo, vplivajo pred- vsem na biološko dostopnost fenolov v črevesnem traktu in lahko ali po- večajo ali zmanjšajo absorpcijo bioaktivne spojine. A ne smemo zane- mariti dejstva, da kljub temu, da številne fenolne spojine do tarčnih tkiv ne pridejo v zadostnih količinah, da bi lahko delovale ugodno na zdrav- je, pozitivne učinke na zdravje lahko sprožijo preko interakcij s sočasno zaužitimi hranili, prebavnimi encimi, z različnimi transporterji in preko črevesne mikrobne združbe. Znano je, da fenoli v črevesnem traktu interagirajo s prehranskimi vlak- ninami. Pri sami interakciji gre za tvorbo vodikovih vezi med hidroksil- nimi skupinami fenolov in etrskimi vezmi vlaknin ter za tvorbo hidro- fobnih interakcij med hidrofobnimi regijami obeh vrst molekul (Pinelo idr. 2006). Ker pa so si fenolne spojine zelo različne po kemijski sestavi in enako velja za prehranske vlaknine, se te interakcije lahko med različni- mi molekulami precej razlikujejo. Zaradi vezave fenolnih spojin na pre- hranske vlaknine pri neprocesiranih rastlinskih živilih večina fenolnih spojin ne doseže krvno-žilnega sistema in se skupaj z vlakninami pre- makne v debelo črevo. Zmanjšana biološka uporabnost fenolnih spojin zaradi interakcij s prehranskimi vlakninami navadno ne vodi do izostan- ka ugodnega učinka fenolne spojine na zdravje, a je učinek v bist veno večji meri posreden, in sicer preko črevesne mikrobne združbe (Duda- -Chodak idr. 2015). Fenolne spojine komplekse tvorijo tudi s škrobom, večinoma preko vodi- kovih vezi (Cohen idr. 2011; Chai idr. 2013). Fenolno-škrobni kompleksi 164 Biološka dostopnost in uporabnost zaužitih fenolnih spojin so pomembni za sam transport in zaščito fenolnih spojin. Npr., pokazano je bilo, da je škrobni kompleks bioaktivno spojino genistein zavaroval v neugodnem okolju želodca in jo prenesel do tankega črevesja, kjer je nato amilaza razgradila škrob in bioaktivna substanca se je v nespremenjeni obliki sprostila (Cohen idr. 2011). Interakcije med škrobom in fenoli pa vplivajo tudi na zmanjšano in upočasnjeno razgradnjo škroba. V klinič- ni raziskavi je bila dokazana negativna povezava med količino fenolnih spojin v obarvanem krompirju in glikemičnim indeksom, kar je potrdilo, da kompleksi med fenolnimi spojinami in škrobom značilno zmanjšajo oz. upočasnijo presnovo škroba (Ramdath idr. 2014). Vnos prehranskih maščob in micelizacija sta ključna dejavnika, ki pove- čujeta biološko dostopnost in posledično uporabnost fenolnih spojin. Številne raziskave so bile opravljene v povezavi s kvercetinom, kjer je bilo nedvoumno dokazano, da vnos maščob pozitivno korelira z absorpcijo kvercetina (Lesser idr. 2004). Poleg tega da maščobe povečujejo biološko uporabnost fenolnih spojin, na drugi strani fenolne spojine preko inte- rakcij v micelih izrivajo oz. zmanjšujejo količino akumuliranega hole- sterola v micelih in posledično vplivajo na manjši privzem holesterola s strani enterocitov (Athayde Moncorvo Collado idr. 2016). Ta mehanizem je bil dokazan in vitro za katehine črnega čaja (Ikeda idr. 2010) in fenolne spojine jabolk (Ogino idr. 2007). Zato so fenolne spojine tako uspešne pri zniževanju holesterola. Poleg interakcij z vlakninami, s škrobom in z maščobami fenolne spojine interagirajo tudi s proteini. Tudi v tem primeru so ključne vodikove vezi in hidrofobne interakcije (Brudzynski in Maldonado-Alvarez 2015). Zelo preučene so interakcije med fenolnimi spojinami in proteini mleka – tako katehini kot kurkumin tvorijo interakcije s kazeini (Bourassa idr. 2013; Ye idr. 2013). Je pa treba razumeti, da interakcija vpliva tako na fenolne spojine kot na proteine. Proteinom se navadno podaljša čas presnove, lahko pa se jim tudi zmanjša ali celo poveča aktivnost (Guri idr. 2014). Pri interakciji med proteini in fenolnimi spojinami je pomembno izpostaviti interakcijo med albuminom in arzanolom, protivnetno fenolno spojino laškega smilja. Dokazano je bilo (in silico), da arzanol preko interakcije z albuminom, beljakovino, zaščiti pred denaturacijo in ji poveča stabilnost (Bojilov idr. 2023). Na drugi strani pa je bilo pokazano, da proteini mleka znižajo antioksidativni potencial flavonoidom (Korir idr. 2014), ker fe- nolne spojine v interakciji s proteini ne morejo več učinkovito sprejeti/ oddati elektronov in/ali vodikovih atomov. Je pa v interakciji s proteinom 165 Zala Jenko Pražnikar in Ana Petelin fenolna spojina zaščitena do same absorpcije in s tem je ohranjen tudi njen antioksidativni potencial. Poleg vseh makrohranil fenolne spojine v črevesnem traktu interagirajo tudi s kovinskimi ioni, jih vežejo, pri čemer se posledično zniža biološ- ka uporabnost tako fenolnih spojin kot kovinskih ionov, a se hkrati zniža tudi tvorba prostih reaktivnih zvrsti, kar je z zdravstvenega vidika ugod- no. Klorogenska kislina in rutin tvorita komplekse z železovimi ioni, kar rezultira v zmanjšani biološki uporabnosti tako fenolnih spojin kot žele- zovih ionov (Miranda idr. 2013). Podobni kompleksi so bili dokazani tudi z drugimi fenolnimi spojinami in tudi z bakrovimi ter s cinkovimi ioni (Escudero idr. 2014). Pri kelaciji železovih ionov so bili učinkoviti tudi izvlečki laškega smilja, v največji meri tisti, pripravljeni z etil-acetatom z visoko vsebnostjo klorogenske kisline, nekoliko manj pa izvlečki, pri- pravljeni s kloroformom in heksanom (Bojilov idr. 2023). Interakcije med fenolnimi spojinami, prebavnimi encimi črevesnega trakta in prenašalnimi molekulami Kot je bilo že predhodno povedano, fenolne spojine interagirajo s prote- ini, zato je pričakovano, da so fenolne spojine v interakciji tudi s prebav- nimi encimi črevesnega trakta, kar lahko vodi do upočasnitve prebave in upočasnitve absorpcije makrohranil. Je pa treba razumeti, da se različne fenolne spojine vežejo na različne predele encima, zato ne vodijo vse in- terakcije do inhibicije encimske aktivnosti. Poleg omenjenega je za sam učinek vedno pomembno tudi razmerje med fenolnimi spojinami in en- cimi (Xu idr. 2016). Številne raziskave so pokazale inhibitorni učinek fenolnih spojin na α-amilazo (Shodehinde idr. 2015) in s tem povezano upočasnitev presnove ogljikovih hidratov ter zmanjšano absorpcijo monosaharidov. Zdravstveni učinki fenolnih spojin v povezavi z inhibicijo α-amilaze v črevesnem traktu so povezani tudi z znižanjem absorpcije glukoze, iz- boljšanjem razmerja glukoze/inzulina itd. Tu se lahko navežemo tudi na laški smilj, saj so Ana Laura de la Garza idr. (2013) preučevali učin- kovanje metanolnega izvlečka laškega smilja na presnovo in absorpcijo ogljikovih hidratov in vivo. Izvleček je znižal vrednosti glukoze v krvi na tešče po obroku ter izboljšal hiperinzulinemijo na modelu na inzulin od- pornih podgan. Dodatno je izvleček inhibiral aktivnost encimov α-ami- laze in α-glukozidaze in vitro, znižal pa je tudi presnovo maltoze in zavrl privzem metilglukozida v celicah Caco-2. Podobno so potrdili tudi San- dra Gonçalves idr. (2017) za metanolni izvleček H. italicum in Catarina 166 Biološka dostopnost in uporabnost zaužitih fenolnih spojin Guerreiro Pereira idr. (2017) za vodne izvlečke (poparke in prevretke) cvetov H. italicum subsp. picardii (Gonçalves idr. 2017; Guerreiro Pereira idr. 2017). V obeh primerih so raziskovalci zaznali inhibitorno delovanje izvlečkov laškega smilja na α-glukozidazo. Podobno kot na α-amilazo številne fenolne spojine inhibitorno delujejo tudi na lipaze in na tak način vplivajo na zakasnelo/zmanjšano absorpci- jo maščob ter posledično na ugodnejši lipidni profil v serumu (Garza idr. 2011). Izvedenih je bilo veliko raziskav in vitro, kjer so raziskovalci za šte- vilne fenolne spojine dokazali inhibitorno delovanje na lipaze. Omeniti velja katehine črnega čaja (Yuda idr. 2012), luteolin (Ramirez idr. 2016) in klorogensko ter kavno kislino (Raghavendra idr. 2007). Tudi v tem prime- ru so ključne molekularne značilnosti posameznih fenolnih spojin, pri čemer velja izpostaviti število in lego hidroksilnih skupin, stopnjo poli- merizacije, glikozilacij itd. (Buchholz in Melzig 2015). Tudi proteaze so lahko v interakciji s fenolnimi spojinami, pri čemer gre večinoma za nekompetitivno inhibicijo fenolnih spojin na proteaze pepsin, tripsin in kimotripsin (Li idr. 2016). Posledično zaznamo počas- nejšo presnovo zaužitih proteinov (Stojadinovic idr. 2013). Dodatni mehanizem, preko katerega lahko fenolne spojine vplivajo na prebavo in presnovo, je preko interakcije s prenašalnimi molekulami oz. transporterji hranil. V različnih eksperimentalnih modelih je bilo poka- zano, da določene fenolne spojine, kot je npr. tilirozid, inhibirajo prenos glukoze preko transporterjev GLUT2 in SGLT1 (Goto idr. 2012). Fenol- ne spojine interagirajo tudi z intestinalnim transporterjem holesterola (NPC1L1) in posledično neposredno preprečijo privzem holesterola. V modelu in vitro, v celicah Caco-2 je bilo pokazano, da številne fenolne spojine – luteolin, kvercetin, daidzein, apigenin, kurkumin in druge – na eni strani inhibirajo izražanja gena NPC1L1 ter hkrati preko neposredne interakcije s transporterjem zavirajo privzem holesterola (Feng idr. 2010; Kim idr. 2013). Mehanizmi transporta fenolnih spojin v ali iz enterocitov Vse prehransko zaužite fenolne spojine morajo preiti črevesni epitelij, da dosežejo krvno-žilni ali limfni sistem. Torej, po zaužitju in po vseh inter- akcijah z različnimi molekulami, kot smo opisali v predhodnih poglavjih, sledi prehod fenolne spojine preko epitelija črevesa. Biološka dostopnost fenolnih spojin je torej ključna glede nadaljnje biološke uporabnosti v enterocitih in kasneje v celotnem organizmu (Estudante idr. 2013). 167 Zala Jenko Pražnikar in Ana Petelin Na bio loško dostopnost fenolnih spojin vpliva več dejavnikov, od kemij- sko-fizikalnih lastnosti fenolne spojine in količine fenolne spojine v za- užitem rastlinskem izvlečku do samega matriksa ter dejavnikov, poveza- nih z gostiteljem (Velderrain-Rodríguez idr. 2014). Ko je fenolna spojina enkrat sproščena v lumnu tankega črevesa – kar velja za hidrofilne fenol- ne kisline, glikozilirane fenolne spojine in lipofilne fenolne spojine –, se prenese v enterocite preko različnih transportnih mehanizmov in tran- sporterjev, ki so pomembni tudi za prenos hranil in/ali ksenobiotikov (Li idr. 2015). V splošnem poznamo pasivno difuzijo, olajšano difuzijo, pa- racelularni transport preko tesnih stikov pa tudi primarni in sekundarni aktivni trans port (Anderson 2001). Majhne fenolne spojine, ki so hidrofobne ali nevtralne, se večinoma pre- našajo s pasivno difuzijo (Kobayashi idr. 2013), podobno kot maščobe in vitamini, topni v maščobah (Goncalves idr. 2015). Za arzanol, glavno protivnetno spojino laškega smilja, je bilo dokazano, da lahko učinkovito prehaja preko monosloja celične kulture črevesnih celic Caco-2 s pasivno difuzijo (Rosa idr. 2011). Hidrofobne in nevtralne fenolne spojine lahko v enterocite prosto prehajajo tudi preko tesnih stikov – pri tem govorimo o paracelularnem transportu (McClements in Xiao 2012). Določene fenol- ne spojine z nabojem, a majhno molekulsko maso, kot sta klorogenska in galna kislina, prav tako izkoriščajo paracelularni transport, a je hitrost prehoda zaradi naboja molekule bistveno manjša kot v primeru nevtral- nih ali hidrofobnih fenolnih spojin. Poleg pasivnega transporta in para- celularnega prenosa poznamo še aktivni transport in olajšano difuzijo. Fenolne spojine, ki izkoriščajo ta način transporta, se absorbirajo v obliki glikozidov. V splošnem ločimo tri kategorije glikozidnih polifenolov: (a) glikozilirane fenolne spojine, (b) aglikone s pozitivnim nabojem in (c) nevtralne ali hidrofobne aglikone. Glikozilirane fenolne spojine izkoriš- čajo klasični model za absorpcijo sladkorjev – večinoma vstopajo preko transporterja GLUT2 (npr. glikoziliran kvercetin) ali transporterja SGLT1 (glikoziliran katehin) (Matsson in Bergström 2015; Martel idr. 2010). Ag- likoni pa izkoriščajo druge, najrazličnejše transportne proteine (MATE1 (SLC47A1), MCT1 (SLC16A1), OCT1 itd.). Npr., ferulna in hidroksiben- zojska kislina vstopata preko transporterja SLC16A1 (Estudante idr. 2013), ki je izražen tako v tankem kot v debelem črevesju (Iwanaga idr. 2006). Je pa treba poudariti, da se večina fenolnih spojin le v majhni meri (5– 10 %) ali sploh ne absorbira v tankem črevesu in posledično doseže debelo 168 Biološka dostopnost in uporabnost zaužitih fenolnih spojin črevo. Torej, neabsorbirane in kompleksnejše fenolne spojine potujejo dalje do debelega črevesa (Konishi idr. 2004), kjer so podvržene hidro- lizaciji s črevesnimi encimi. Nato so bodisi absorbirane preko različnih mehanizmov bodisi presnovljene s strani črevesne mikrobne združbe (Marín idr. 2015). Črevesna mikrobna združba lahko fenolne spojine pre- tvori v presnovke z nizko molekulsko maso, ki so biološko razpoložljivi za gostitelja in po absorpciji zanj tudi koristni. Kot primer lahko omenimo ferulno kislino (derivat hidroksicimetne kisline), ki se med drugim pre- snavlja tudi v nevroprotektivno hidroferulno kislino, ki je bila zaznana v možganih podgan (Serreli in Deiana 2019). Nadalje je bilo ugotovljeno, da sta presnovka kemferola in kvercetina, 3,4-dihidroksifenilocetna kisli- na in p-hidroksifenilocetna kislina, ki ju proizvaja mikrobna združba de- belega črevesa, odgovorna za anksiolitični učinek (Vissiennon idr. 2012), itd. Pred in med samo absorpcijo se fenolne spojine lahko dodatno konjugi- rajo, z reakcijami metilacije, sulfatacije in glukuronidacije, kar še enkrat sledi v jetrih (Lippolis idr. 2023). To so procesi razstrupljanja fenolnih spojin, ki povečajo hidrofilnost molekul in tudi olajšajo njihovo izločanje z urinom. Proces konjugacije je izjemno učinkovit, zato so aglikoni skoraj popolnoma odsotni v krvnem obtoku (Crozier idr. 2010). Fenolne spojine celice tankega ali debelega črevesja zapustijo preko različnih transpor- terjev: (a) preko P-glikoproteina MDR1 (angl. multidrug resistance prote- in 1), ki se izraža v celicah črevesnega epitelija, iz katerih črpa tudi dolo- čene toksine in učinkovine nazaj v črevesno svetlino oz. lumen črevesja, s čimer zmanjšuje njihovo absorpcijo (Estudante idr. 2013); (b) preko družine proteinov, povezanih z odpornostjo na več spojin (angl. multid- rug resistance-associated protein, MRP1 in MRP2), pri čemer MRP2 sode- luje pri izločanju kvercetina in naringenina (Nait Chabane idr. 2009); (c) preko rezistentnega proteina, izoliranega pri raku na dojki (angl. breast cancer resistance protein – BCRP). Vsi ti prenašalci sodelujejo tudi pri iz- ločanju aglikonov. Presnova fenolnih spojin Po absorpciji fenolne spojine njihovi presnovki potujejo skozi portalno veno v jetra, kjer se podvržejo biotransformaciji. Ta proces pospešuje njihovo izločanje in krajša razpolovno dobo v plazmi. Reakcije biotrans- formacije delimo v fazo I in fazo II. Faza I je poznana kot modifikacij- ska faza in vključuje različne strukturne spremembe, vključujoč tiolaci- jo, hidroksilacijo, aminacijo ali karboksilacijo. Hidroksilacijo katalizira 169 Zala Jenko Pražnikar in Ana Petelin naddružina encimov citokromov P450, ki se nahajajo v jetrih, tankem čre- vesju in nekaterih drugih organih. Funkcija naddružine citokromov P450 je kataliza oksidacije organskih snovi, kar vodi v razgradnjo teh snovi, med njimi tudi ksenobiotikov, v različne presnovke. Med najbolj zastopa- nimi citokromi v jetrih je družina citokrom P3A, in sicer citokrom P3A4, ki sodeluje pri presnovi > 50 % kliničnih zdravil in je najbolj zastopan v jetrih, mikrosomih in črevesnem epiteliju (Shimada idr. 1994). Med po- gosto zastopane oblike citokroma v jetrih pa uvrščamo še ostale izoforme citokroma, npr. citokrom P2C9, ki sodeluje pri presnovi spojine varfarin, znanemu zaviralcu vitamina K, ki se uporablja kot peroralni antikoagu- lant (Ulvestad idr. 2013). Interakcije posameznih polifenolnih spojin z zdravili še niso dobro dokumentirane. V raziskavi Kimure idr. (2010) so sistematično ovrednotili inhibitorne učinke 60 prehranskih polifenolov na aktivnosti CYP3A4 in CYP2C9. Ugotovili so, da imajo nekatere fenolne spojine (med njimi tudi naringenin, kvercetin in miricetin, ki se nahajajo v laškem smilju) potencial inhibicije presnove kliničnih zdravil (Kimura idr. 2010). Sočasno zaužitje kvercetina in valsartana povzroči spremem- be farmakokinetičnih lastnosti valsartana, kar je posledica zaviralnega učinka kvercetina na encim CYP3A4 (Challa idr. 2013). Fazi I sledi faza II, ki jo imenujemo tudi konjugacijska faza. Zanjo so značilne reakcije glukuronacije, metilacije, sulfatacije ali kombinacije vseh treh (Cardona idr. 2013). Glavni encimi, ki sodelujejo v tej fazi, so UDP-glukuroniltrans- feraza, sulfattransferaza, glutation-S-transferaza idr. Vse te reakcije še dodatno zmanjšajo bioaktivnost spojin, potencialno toksičnost, obenem pa povečajo njihovo polarnost in olajšajo izločanje. Porazdelitev in izločanje fenolnih spojin Po zaključku obeh presnovnih faz se presnovki, vezani na plazemske be- ljakovine, npr. albumin, lahko prenesejo v različne organe in tkiva, kjer se izražajo njihovi značilni biološki učinki. Nekateri presnovki se prenesejo v ledvice in se izločijo z urinom, medtem ko se drugi skozi žolč vrnejo v črevesje. Tam lahko presnovke enterociti ponovno absorbirajo in tran- sportirajo nazaj v jetra, po t. i. enterohepatični cirkulaciji (Teng in Chen 2019). Farmakokinetika fenolnih spojin, zaznanih v vodnih izvlečkih laškega smilja Pri farmakokinetiki nas v največji meri zanima maksimalna koncentracija fenolne spojine v serumu ali drugi telesni tekočini (c ), čas, ko spojina max 170 Biološka dostopnost in uporabnost zaužitih fenolnih spojin doseže maksimalno koncentracijo (t ), in razpolovni čas spojine (t ), max 1/2 ki nakazuje, koliko časa bo neka spojina aktivna. Farmakokinetični para- metri se razlikujejo za vsako spojino in so med drugim odvisni od različ- nih dejavnikov, kot npr. od same strukture spojine, odmerka, sočas nega zaužitja z drugimi spojinami, interakcije s spojinami itd. Ker so za oralni vnos najzanimivejši vodni izvlečki laškega smilja, se bomo v tem podpoglavju v največji meri osredotočili na fenolne kisline in flavonoide, ki so najpogosteje zastopani v vodnih izvlečkih. V vodnih izvlečkih laškega smilja namreč prevladujejo hidroksicimetne kisline (kavna kislina, kafeoilkinske kisline – klorogenska kislina in di-kafeoil- kinske kisline) in flavonoidi (derivati naringenina, kemferola, miricetina in kvercetina), pri čemer se v manjši meri pojavljajo tudi acetofenoni in tremetoni (Kramberger idr. 2021). Podobno so ugotovili Catarina Guer- reiro Pereira idr. (2017), ki so v poparkih in prevretkih iz laškega smilja v največji meri določili mono- in dikafeoilkinske kisline ter flavonoid gna- falin. Podobno navajajo tudi Karača idr. (2018), in sicer da vodni izvlečki cvetov laškega smilja najpogosteje vsebujejo kafeoilkinske kisline (kloro- genska kislina in njeni derivati) ter kavno kislino. Najprej se bomo osredotočili na hidroksicimetne kisline. Adriana Farah idr. (2008) so pokazali, da več kot 30 % zaužitih komponent cimetne kisli- ne detektiramo v plazmi, kar kaže na dobro absorpcijo in presnovo spojin (Farah idr. 2008). Preostali dve tretjini dosežeta debelo črevo, kjer se fe- nolne kisline nadalje presnovijo s pomočjo črevesne mikrobne združbe in nato absorbirajo (Stalmach idr. 2010). Tudi farmakokinetični podatki in vivo so pokazali, da se hidroksicimetne kisline po peroralni uporabi hitro absorbirajo, pri čemer sta bila t in t v razponu 0,07–1,7 ure oz. 1/2 max 0,03–1,5 ure (Veras idr. 2022). Klorogenska kislina se po zaužitju v manj- šem deležu absorbira že v zgornjih prebavilih, podobno kot cimetna. Preostali del pa encimi (esteraze) hidrolizirajo na klorogensko ter kin- sko kislino, ki se delno absorbirata v tankem črevesju (Ludwig idr. 2013). Velik delež klorogenske kisline pa preide v debelo črevo, kjer se nadalje presnovi in nato absorbira v obtok (Monteiro idr. 2007). Kot ugotavljajo Angélique Stalmach idr. (2010), je bila večina klorogenskih spojin hitro odstranjena iz krvnega obtoka z vrednostmi razpolovnega časa izločan- ja (t ) 0,3–1,9 ure (Stalmach idr. 2010). Kar se tiče kavne kisline, velja 1/2 izpostaviti, da se le-ta v živilih nahaja v esterificirani obliki, zaradi če- sar jo telo težje absorbira (Manach idr. 2005). Absorbira se lahko v debe- lem črevesju po hidrolizi s pomočjo črevesne mikrobne združbe. Njena 171 Zala Jenko Pražnikar in Ana Petelin maksimalna plazemska koncentracija je zaznana približno eno uro po zaužitju (Manach idr. 2005; Scalbert in Williamson 2000). Takoj po ab- sorpciji je kavna kislina podvržena trem glavnim procesom encimske ko- njugacije: metilaciji, sulfataciji in glukuronidaciji. Izločanje poteka pred- vsem z urinom (Manach idr. 2005). Med presnovke, ki jih najpogosteje zaznamo v krvi po rednem uživanju kave ali zelenega kavnega ekstrakta, uvrščamo ferulno, izoferulno in kavno kislino (Lafay idr. 2006; Monteiro in Azevedo 2010). Drugače se obnašajo flavanoidi. Zanje sta namreč v splošnem značilni nizki absorpcija in biološka uporabnost, poleg tega se hitro izločijo bodi- si z urinom ali žolčem. Z običajno prehrano njihova plazemska koncen- tracija redko preseže koncentracije več kot 1 µM (Scalbert in Williamson 2000). Se pa biološka uporabnost razlikuje med različnimi vrstami flavo- noidov. Izmed flavonoidov imajo izoflavoni najboljšo absorpcijo, sledijo jim flavanoli, flavanoni (naringenin), flavonoli (kemferol, kvercetin, miri- cetin) in antocianidini. Najhitreje se izločajo antocianidini, najpočasneje pa flavonoli. Za kvercetin (flavanol) je značilno, da se izloča zelo počasi (t v plazmi je 11–28 ur, v povprečju 16 ur), enako velja za kemferol (t 1/2 1/2 v plazmi je v povprečju 28 ur) (Manach idr. 2005), najverjetneje zaradi močne vezave na serumski albumin (Dufour in Dangles 2005). O farmakokinetičnih lastnostih drugih bioaktivnih spojin laškega smilja, sploh arzanola in drugih pironov, je zelo malo znanega. Zaključek Tekom poglavja smo spoznali, da je biološka uporabnost fenolnih spo- jin odvisna od količine bioaktivne spojine, ki se sprosti v prebavnem sis- temu (od biološke dostopnosti), od same presnove bioaktivne spojine (biotransformacije) in od učinkovitosti absorpcije preko črevesnih celic oz. enterocitov. Za številne fenolne spojine, ki jih najdemo v poparkih laškega smilja, je bilo dokazano, da preden dosežejo krvno-žilni sistem, interagirajo s številnimi makro- in mikromolekulami v lumnu črevesnega trakta, enterocitih, krvnem obtoku in kasneje tudi jetrnih celicah. Pod- vrženi so številnim presnovnim potem, vključno z encimskimi modifi- kacijami, s presnovo preko črevesne mikrobne združbe in kasneje tudi s presnovnimi potmi faze II (slika 1). Izpostaviti velja, da so med fenol- nimi spojinami na splošno najrazpoložljivejši izoflavoni, sledijo jim fe- nolne kisline, flavanoli, flavanoni in flavonoli, zadnji pa so antociani in proantocianidi. Biološka uporabnost flavonoidov je izjemno nizka zaradi slabše absorpcije iz lumna črevesja v črevesne celice. A ne glede na vse, 172 Biološka dostopnost in uporabnost zaužitih fenolnih spojin Fenolne spojine Absorpcija preko enterocitov v krvni obtok • pasivna in olajšana difuzija Konjugacija – faza II • paracelularni transport metilacija, sulfatacija • primarni in sekundarni aktivni transport in glukuronidacija Encimske modifikacije metilacija, sulfatacija Krvo-žilni sistem in glukuronidacija ter esterifikacija Presnova mikrobne združbe esterifikacija, dehidroksi- lacija, redukcija, dekarboksilacija Izločanje Biološki Interakcija z makrohranili, mikrohranili in prebavnimi encimi učinki Izločanje Slika 1 Presnovne poti zaužitih fenolnih spojin zdravju koristne učinke zaužitih fenolnih spojin lahko zaznamo ali zaradi interakcije fenolnih spojin z encimi prebavnega trakta, ali zaradi absorbi- rane fenolne spojine, ki v organizmu deluje protivnetno, ali zaradi njenih antioksidativnih lastnosti, ali zaradi kelacijskih sposobnosti, itd., lahko pa je učinek fenolne spojine tudi posreden, npr. preko presnovkov čre- vesne mikrobne združbe. Viri Anderson, J. M. 2001. »Molecular Structure of Tight Junctions and Their Role in Epithelial Transport.« News in Physiological Sciences 16 (3): 126–130. Athayde Moncorvo Collado, A. de, F. G. Dupuy, R. D. Morero in C. Minahk. 2016. »Cholesterol Induces Surface Localization of Polyphenols in Mo-del Membranes thus Enhancing Vesicle Stability Against Lysozyme, but Reduces Protection of Distant Double Bonds from Reactive-Oxygen Species.« Biochimica et Biophysica Acta 1858 (7): 1479–1487. Bojilov, D., S. Manolov, S. Ahmed idr. 2023. »HPLC Analysis and In Vitro and In Silico Evaluation of the Biological Activity of Polyphenolic Compo-nents Separated with Solvents of Various Polarities from Helichrysum italicum.« Molecules 28 (17): 6198. Bourassa, P., J. Bariyanga in H. A. Tajmir-Riahi. 2013. »Binding Sites of Res- veratrol, Genistein, and Curcumin with Milk α- and β-Caseins.« Journal of Physical Chemistry B 117 (5): 1287–1295. Brudzynski, K., in L. Maldonado-Alvarez. 2015. »Polyphenol-Protein Com- plexes and Their Consequences for the Redox Activity, Structure and 173 Zala Jenko Pražnikar in Ana Petelin Function of Honey: A Current View and New Hypothesis; A Review.« Polish Journal of Food and Nutrition Sciences 65 (2): 71–80. Buchholz, T., in M. F. Melzig. 2015. »Polyphenolic Compounds as Pancreatic Lipase Inhibitors.« Planta Medica 81 (10): 771–783. Cardona, F., C. Andrés-Lacueva, S. Tulipani, F. J. Tinahones in M. I. Queipo- -Ortuño. 2013. »Benefits of Polyphenols on Gut Microbiota and Impli- cations in Human Health.« Journal of Nutritional Biochemistry 24 (8): 1415–1422. Chai, Y., M. Wang in G. Zhang. 2013. »Interaction Between Amylose and Tea Polyphenols Modulates the Postprandial Glycemic Response to High- -Amylose Maize Starch.« Journal of Agricultural and Food Chemistry 61 (36): 8608–8615. Challa, V. R., P. R. Babu, S. R. Challa, B. Johnson in C. Maheswari. 2013. »Pharmacokinetic Interaction Study Between Quercetin and Valsartan in Rats and in vitro Models.« Drug Development and Industrial Pharma- cy 39 (6): 865–872. Cohen, R., B. Schwartz, I. Peri in E. Shimoni. 2011. »Improving Bioavailabili- ty and Stability of Genistein by Complexation with High-Amylose Corn Starch.« Journal of Agricultural and Food Chemistry 59 (14): 7932–7938. Crozier, A., D. Del Rio in M. N. Clifford. 2010. »Bioavailability of Dietary Fla- vonoids and Phenolic Compounds.« Molecular Aspects of Medicine 31 (6): 446–467. Del Rio, D., A. Rodriguez-Mateos, J. P. Spencer, M. Tognolini, G. Borges in A. Crozier. 2013. »Dietary (Poly)Phenolics in Human Health: Structures, Bioavailability, and Evidence of Protective Effects Against Chronic Dise- ases.« Antioxid Redox Signal 18 (14): 1818–1892. Duda-Chodak, A., T. Tarko, P. Satora in P. Sroka. 2015. »Interaction of Dietary Compounds, Especially Polyphenols, with the Intestinal Microbiota: A Review.« European Journal of Nutrition 54 (3): 325–341. Dufour, C., in O. Dangles. 2005. »Flavonoid-Serum Albumin Complexation: Determination of Binding Constants and Binding Sites by Fluorescence Spectroscopy.« Biochimica et Biophysica Acta 1721 (1–3): 164–173. Escudero, L. B., C. M. Fusari, J. C. Altamirano, A. B. Camargo in R. G. Wu- illoud. 2014. »Stability of Iron-Quercetin Complexes in Synthetic Wine Under In Vitro Digestion Conditions.« Journal of Food Science 79 (10): C1933– C1938. Estudante, M., J. G. Morais, G. Soveral in L. Z. Benet. 2013. »Intestinal Drug Transporters: An Overview.« Advanced Drug Delivery Reviews 65 (10): 1340–1356. 174 Biološka dostopnost in uporabnost zaužitih fenolnih spojin Farah, A., M. Monteiro, C. M. Donangelo in S. Lafay. 2008. »Chlorogenic Acids from Green Coffee Extract Are Highly Bioavailable in Humans.« Journal of Nutrition 138 (12): 2309–2315. Feng, D., L. Ohlsson in R. D. Duan. 2010. »Curcumin Inhibits Cholesterol Up- take in Caco-2 Cells by Down-Regulation of NPC1L1 Expression.« Lipids in Health and Disease 9:40. Garza, A. L. de la , F. I. Milagro, N. Boque, J. Campión in J. A. Martínez. 2011. »Natural Inhibitors of Pancreatic Lipase as New Players in Obesity Treat ment.« Planta Medica 77 (8): 773–85. Garza, A. L. de la, U. Etxeberria, M. P. Lostao idr. 2013. »Helichrysum and Grapefruit Extracts Inhibit Carbohydrate Digestion and Absorption, Improving Postprandial Glucose Levels and Hyperinsulinemia in Rats.« Journal of Agricultural and Food Chemistry 61 (49): 12012–12019. Goncalves, A., S. Roi, M. Nowicki idr. 2015. »Fat-Soluble Vitamin Intestinal Absorption: Absorption Sites in the Intestine and Interactions for Ab-sorption.« Food Chemistry 172:155–160. Gonçalves, S., E. Moreira, C. Grosso, P. B. Andrade, P. Valentão in A. Roma- no. 2017. »Phenolic Profile, Antioxidant Activity and Enzyme Inhibitory Activities of Extracts from Aromatic Plants Used in Mediterranean Diet.« Journal of Food Science and Technology 54 (1): 219–227. Goto, T., M. Horita, H. Nagai idr. 2012. »Tiliroside, a Glycosidic Flavonoid, Inhibits Carbohydrate Digestion and Glucose Absorption in the Gastro-intestinal Tract.« Molecular Nutrition Food Research 56 (3): 435–445. Guerreiro Pereira, C., L. Barreira, S. Bijttebier idr. 2017. »Chemical Profiling of Infusions and Decoctions of Helichrysum italicum subsp. picardii by UHPLC-PDA-MS and in vitro Biological Activities Comparatively with Green Tea (Camellia sinensis) and Rooibos Tisane (Aspalathus li-nearis).« Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 145 (11): 593–603. Guri, A., S. Haratifar in M. Corredig. 2014. »Bioefficacy of Tea Catechins As- sociated with Milk Caseins Tested Using Different in vitro Digestion Mo-dels.« Food Digestion 5 (1–3): 8–18. Ikeda, I., T. Yamahira, M. Kato in A. Ishikawa. 2010. »Black-Tea Polyphenols Decrease Micellar Solubility of Cholesterol in vitro and Intestinal Ab-sorption of Cholesterol in Rats.« Journal of Agricultural and Food Che-mistry 58 (15): 8591–8595. Iwanaga, T., K. Takebe, I. Kato, S. Karaki in A. Kuwahara. 2006. »Cellular Expression of Monocarboxylate Transporters (MCT) in the Digestive Tract of the Mouse, Rat, and Humans, with Special Reference to slc5a8.« Biomedical Research 27 (5): 243–254. 175 Zala Jenko Pražnikar in Ana Petelin Karača, S., K. Trifkovic A. Bušić idr. 2018. »The Functional Potential of Im- mortelle (Helichrysum italicum) Based Edible Films Reinforced with Proteins and Hydrogel Particles.« LWT 99:387–395. Kim, B., Y. Park, C. J. Wegner, B. W. Bolling in J. Lee. 2013. »Polyphenol- -Rich Black Chokeberry (Aronia melanocarpa) Extract Regulates the Expression of Genes Critical for Intestinal Cholesterol Flux in Caco-2 Cells.« Jour nal of Nutritional Biochemistry 24 (9): 1564–1570. Kimura, Y., H. Ito, R. Ohnishi in T. Hatano. 2010. »Inhibitory Effects of Polyphenols on Human Cytochrome P450 3A4 and 2C9 Activity.« Food and Chemical Toxicology 48 (1): 429–435. Kobayashi, S., M. Shinohara, T. Nagai in Y. Konishi. 2013. »Transport Mecha- nisms for Soy Isoflavones and Microbial Metabolites Dihydrogenistein and Dihydrodaidzein Across Monolayers and Membranes.« Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 77 (11): 2210–2217. Konic Ristic, A., P. Kroon in M. Glibetic. 2015. »Modulation of Platelet Fun- ction with Dietary Polyphenols: A Promising Strategy in the Prevention of Cardiovascular Disease.« Agro Food Industry Hi-Tech 26:15–18. Konishi, Y., Y. Hitomi in E. Yoshioka. 2004. »Intestinal Absorption of P-Co- umaric and Gallic Acids in Rats After Oral Administration.« Journal of Agricultural and Food Chemistry 52 (9): 2527–2532. Korir, M. W., F. N. Wachira, J. K. Wanyoko, R. M. Ngure in R. Khalid. 2014. »The Fortification of Tea with Sweeteners and Milk and Its Effect on in vitro Antioxidant Potential of Tea Product and Glutathione Levels in an Animal Model.« Food Chemistry 145:145–153. Kramberger, K., S. Kenig, Z. Jenko Pražnikar, N. Kočevar Glavač in D. Barlič- -Maganja. 2021. »A Review and Evaluation of the Data Supporting Inter- nal Use of Helichrysum italicum.« Plants 10 (8): 1738. Lafay, S., A. Gil-Izquierdo, C. Manach, C. Morand, C. Besson in A. Scalbert. 2006. »Chlorogenic Acid Is Absorbed in Its Intact Form in the Stomach of Rats.« Journal of Nutrition 136 (5): 1192–1197. Lesser, S., R. Cermak in S. Wolffram. 2004. »Bioavailability of Quercetin in Pigs Is Influenced by the Dietary Fat Content.« Journal of Nutrition 134 (6): 1508–11. Li, Y., F. Q. Lu, Y. Feng, Z. D. He in X. L. Wu. 2016. »Binding Interaction Betwe- en (−)-Epigallocatechin-3-Gallate (EGCG) of Green Tea and Pepsin.« Acta Alimentaria 45:129–140. Li, Z., H. Jiang, C. Xu in L. Gu. 2015. »A Review: Using Nanoparticles to En- hance Absorption and Bioavailability of Phenolic Phytochemicals.« Food Hydrocolloids 43:153–164. 176 Biološka dostopnost in uporabnost zaužitih fenolnih spojin Lingua, M. S., D. A. Wunderlin in M. V. Baroni. 2018. »Effect of Simulated Digestion on the Phenolic Components of Red Grapes and Their Corre-sponding Wines.« Journal of Functional Foods 44:86–94. Lippolis, T., M. Cofano, G. R. Caponio, V. De Nunzio in M. Notarnicola. 2023. »Bioaccessibility and Bioavailability of Diet Polyphenols and Their Mo-dulation of Gut Microbiota.« International Journal of Mulecular Sciences 24 (4): 3813. Ludwig, I. A., M. Paz de Peña, C. Concepción in C. Alan. 2013. »Catabolism of Coffee Chlorogenic Acids by Human Colonic Microbiota.« Biofactors 39 (6): 623–632. Manach, C., G. Williamson, C. Morand, A. Scalbert in C. Rémésy. 2005. »Bi- oavailability and Bioefficacy of Polyphenols in Humans: I. Review of 97 Bioavailability Studies.« American Journal of Clinical Nutrition 81 (1): 230S–242S. Marín, L., E. M. Miguélez, C. J. Villar in F. Lombó. 2015. »Bioavailability of Dietary Polyphenols and Gut Microbiota Metabolism: Antimicrobial Properties.« BioMed Research International. https://doi.org/10.1155 /2015/905215. Martel, F., R. Monteiro in C. Calhau. 2010. »Effect of Polyphenols on the Inte- stinal and Placental Transport of Some Bioactive Compounds.« Nutriti-on Research Reviews 23 (1): 47–64. Matsson, P., in C. A. Bergström. 2015. »Computational Modeling to Predict the Functions and Impact of Drug Transporters.« In Silico Pharmaco-logy 3 (1): 8. McClements, D. J., in H. Xiao. 2012. »Potential Biological Fate of Ingested Nanoemulsions: Influence of Particle Characteristics.« Food Function 3 (3): 202–220. Miranda, L., H. Deußer in D. Evers. 2013. »The Impact of in vitro Digestion on Bioaccessibility of Polyphenols from Potatoes and Sweet Potatoes and Their Influence on Iron Absorption by Human Intestinal Cells.« Food Function 4 (11): 1595–1601. Monteiro, M., A. Farah, D. Perrone, L. C. Trugo in C. Donangelo. 2007. »Chlo- rogenic Acid Compounds from Coffee are Differentially Absorbed and Metabolized in Humans.« Journal of Nutrition 137 (10): 2196–2201. Monteiro, R., in I. Azevedo. 2010. »Chronic Inflammation in Obesity and the Metabolic Syndrome.« Mediators of Inflammation. https://doi.org/10 .1155/2010/289645. Nait Chabane, M., A. Al Ahmad, J. Peluso, C. D. Muller in G. Ubeaud. 2009. »Quercetin and Naringenin Transport Across Human Intestinal Caco-2 Cells.« Journal of Pharmacy and Pharmacology 61 (11): 1473–1483. 177 Zala Jenko Pražnikar in Ana Petelin Ogino, Y., K. Osada, S. Nakamura, Y. Ohta, T. Kanda in M. Sugano. 2007. »Ab- sorption of Dietary Cholesterol Oxidation Products and Their Down- stream Metabolic Effects Are Reduced by Dietary Apple Polyphenols.« Lipids 42 (2): 151–161. Pinelo, M., A. Arnous in A. S. Meyer. 2006. »Upgrading of Grape Skins: Signi- ficance of Plant Cell-Wall Structural Components and Extraction Tech- niques for Phenol Release.« Trends in Food Science and Technology 17 (11): 579–590. Raghavendra, M. P., P. R. Kumar in V. Prakash. 2007. »Mechanism of Inhibi- tion of Rice Bran Lipase by Polyphenols: A Case Study with Chlorogenic Acid and Caffeic Acid.« Journal of Food Science 72 (8): E412–9. Ramdath, D. D., E. Padhi, A. Hawke, T. Sivaramalingam in R. Tsao. 2014. »The Glycemic Index of Pigmented Potatoes is Related to Their Polyphenol Content.« Food and Function 5 (5): 909–915. Ramirez, G., A. Zamilpa, M. Zavala, J. Perez, D. Morales in J. Tortoriello. 2016. »Chrysoeriol and Other Polyphenols from Tecoma Stans with Lipase In- hibitory Activity.« Journal of Ethnopharmacology 185. https://doi.org /10.1016/j.jep.2016.03.014. Rosa, A., F. Pollastro, A. Atzeri idr. 2011. »Protective Role of Arzanol Against Lipid Peroxidation in Biological Systems.« Chemistry and Physics of Li- pids 164 (1): 24–32. Scalbert, A., in G. Williamson. 2000. »Dietary Intake and Bioavailability of Polyphenols.« Journal of Nutrition 130 (8): 2073S–85S. Serreli, G., in M. Deiana. 2019. »In vivo Formed Metabolites of Polyphenols and Their Biological Efficacy.« Food and Function 10 (11): 6999–7021. Shimada, T., H. Yamazaki, M. Mimura, Y. Inui in F. P. Guengerich. 1994. »In- terindividual Variations in Human Liver Cytochrome P-450 Enzymes Involved in the Oxidation of Drugs, Carcinogens and Toxic Chemicals: Studies with Liver Microsomes of 30 Japanese and 30 Caucasians.« Jour- nal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 270 (1): 414–423. Shivashankara, K., in S. Acharya. 2010. »Bioavailability of Dietary Polyphe- nols and the Cardiovascular Diseases.« Open Nutraceuticals Journal 3:227–241. Shodehinde, S. A., A. O. Ademiluyi, G. Oboh in A. A. Akindahunsi. 2015. »Contribution of Musa Paradisiaca in the Inhibition of α-Amylase, α-Glucosidase and Angiotensin-I Converting Enzyme in Streptozotocin Induced Rats.« Life Sciences 133 (2): 8–14. Stalmach, A., H. Steiling, G. Williamson in A. Crozier. 2010. »Bioavailability of Chlorogenic Acids Following Acute Ingestion of Coffee by Humans with an Ileostomy.« Archives of Biochemistry and Biophysics 501 (1): 98–105. 178 Biološka dostopnost in uporabnost zaužitih fenolnih spojin Stojadinovic, M., J. Radosavljevic, J. Ognjenovic idr. 2013. »Binding Affinity Between Dietary Polyphenols and β-Lactoglobulin Negatively Corre-lates with the Protein Susceptibility to Digestion and Total Antioxidant Activity of Complexes Formed.« Food Chemistry 136 (3–4): 1263–1671. Teng, H., in L. Chen. 2019. »Polyphenols and Bioavailability: An Update.« Critical Reviews in Food Science and Nutrition 59 (13): 2040–2051. Ulvestad, M., I. B. Skottheim, G. S. Jakobsen idr. 2013. »Impact of OATP1B1, MDR1, and CYP3A4 Expression in Liver and Intestine on Interpatient Pharmacokinetic Variability of Atorvastatin in Obese Subjects.« Clinical Pharmacology and Therapeutics 93 (3): 275–282. Velderrain-Rodríguez, G. R., H. Palafox-Carlos, A. Wall-Medrano idr. 2014. »Phenolic Compounds: Their Journey After Intake.« Food and Function 5 (2): 189–197. Veras, K. S., F. N. S. Fachel, B. V. de Araújo, H. F. Teixeira in L. S. Koester. 2022. »Oral Pharmacokinetics of Hydroxycinnamic Acids: An Updated Revi-ew.« Pharmaceutics 14 (12): 2663. Vissiennon, C., K. Nieber, O. Kelber in V. Butterweck. 2012. »Route of Admi- nistration Determines the Anxiolytic Activity of the Flavonols Kaempfe-rol, Quercetin and Myricetin: Are They Prodrugs?« Journal of Nutritional Biochemistry 23 (7): 733–740. Xu, W., R. Shao in J. Xiao. 2016. »Is There Consistency Between the Binding Affinity and Inhibitory Potential of Natural Polyphenols as α-Amyla-se Inhibitors?« Critical Reviews in Food Science and Nutrition 56 (10): 1630–1639. Ye, Jianhui, F. Fan, X.-Q. Xu in Y.-R. Liang. 2013. »Interactions of Black and Green Tea Polyphenols with Whole Milk.« Food Research International 53 (1): 449–455. Yuda, N., M. Tanaka, M. Suzuki, Y. Asano, H. Ochi in K. Iwatsuki. 2012. »Polyphenols Extracted from Black Tea (Camellia sinensis) Residue by Hot-Compressed Water and Their Inhibitory Effect on Pancreatic Lipase in vitro.« Journal of Food Science 77 (12): H254– H261. 179 11 Antioksidativno in protivnetno delovanje laškega smilja Saša Kenig Zala Jenko Pražnikar Fakulteta za vede o zdravju, Fakulteta za vede o zdravju, Univerza na Primorskem Univerza na Primorskem © 2025 Saša Kenig in Zala Jenko Pražnikar https://doi.org/10.26493/978-961-293-525-2.11 Uvod Povišane ravni kisikovih reaktivnih zvrsti (angl. reactive oxygen species – ROS) in kazalnikov vnetja zaznamo pri številnih kroničnih nenalezljivih obolenjih, mednje sodijo debelost, presnovni sindrom, sladkorna bole- zen tipa 2, srčno-žilna obolenja idr. Ker so tako ROS kot vnetni bioozna- čevalci vključeni v samo patogenezo navedenih obolenj, so intervenci- je, ki regulirajo vnetje in vplivajo na antioksidativni potencial, izjemno zanimive (Sies 2015; Dludla idr. 2017). Vedno več je dokazov, da lahko specifični rastlinski izvlečki in tudi eterična olja dopolnjujejo terapevtsko delovanje nesteroidnih in tudi steroidnih protivnetnih zdravil (Bacchi idr. 2012), pri čemer vključujejo tako neposredne protivnetne učinke, vplivajo pa tudi na signalne kaskade, ravni citokinov, regulatorne tran- skripcijske faktorje pa tudi posredno učinkujejo preko nevtralizacije ROS in reaktivnih dušikovih zvrsti. Omenjene reaktivne zvrsti imajo namreč ključno vlogo pri razvoju in ojačanju vnetnih odzivov (Ramsey idr. 2020). Laški smilj ima zaradi številnih fenolnih spojin z izraženimi antioksida- tivnimi lastnostmi in protivnetnim delovanjem izjemen potencial tako za nevtralizacijo reaktivnih dušikovih in kisikovih zvrsti kot za zniževanje vnetja. V pričujočem poglavju bodo predstavljene raziskave, ki so pre- učevale antioksidativni in protivnetni potencial izvlečkov laškega smilja, Bandelj, D., Z. Jenko Pražnikar in A. Petelin, ur. 2025. 181 Laški smilj. Založba Univerze na Primorskem Saša Kenig in Zala Jenko Pražnikar eteričnega olja laškega smilja ali specifičnih bioaktivnih spojin, izolira- nih iz laškega smilja. Določanje antioksidativnega potenciala Antioksidativni potencial rastlinskih izvlečkov je mogoče meriti na šte- vilne različne načine. Antioksidante namreč delimo na eksogene – pri- sotne v izvlečkih ali hrani nasploh – ter endogene – tiste, ki jih tvori or- ganizem sam. Zato je lahko antioksidativni potencial izvlečka odvisen od samega antioksidativnega delovanja bioaktivnih spojin, ki so v izvlečku prisotne, lahko pa določene bioaktivne spojine povzročijo odziv orga- nizma, s katerimi telo poviša lastno, endogeno sposobnost borbe proti oksidativnemu stresu (Osredkar 2012). Zdrav organizem ima številne možnosti tvorbe endogenih antioksidantov, ki so lahko encimski, npr. katalaza (CAT), glutation peroksidaza (GPx), glutation reduktaza (GR) in superoksid dismutaza (SOD), ter neencimske beljakovine, predvsem tiste, ki vežejo železo in težke kovine. Možna je tudi tvorba številnih dru- gih spojin, kot so glutation, sečna kislina, bilirubin, melatonin in poli- amini (Miro ńczuk-Chodakowska idr. 2018); ti so pomembnejši v vodnih okoljih, v celičnih membranah pa imajo pomembno vlogo koencim Q in α-lipoična kislina (Rizzo idr. 2010). Med mehanizme, s katerimi se or-ganizem bori proti oksidativnemu stresu, uvrščamo tudi beljakovine, s katerimi telo odstranjuje oksidativne poškodbe, predvsem so to različni encimi, ki odpravljajo poškodbe na molekuli DNA. Antioksidativni potencial lahko torej določamo in vitro z merjenjem an- tioksidativnega delovanja samega izvlečka. Tu sta primerni in najpogos- teje uporabljeni metodi test DPPH, ki temelji na zmanjšanju absorban- ce radikala 2,2’-difenil-1-pikrilhidrazila ob prisotnosti antioksidantov (Molyneux 2004), ali test ABTS, pri katerem sprožimo nastajanje obar- vanega radikala 2,2’-azobis (3-etilenbenzotiazolin-6-sulfonske kisline), prisotnost antioksidantov pa to reakcijo zavira (Re idr. 1999). Po drugi strani pa lahko odziv celic merimo tako, da celice za določen čas izposta- vimo izvlečkom, nato pa merimo količine endogenih antioksidantov. Količine neencimskih antioksidantov določamo s kromatografskimi ali z imunokemijskimi metodami. Pogosto merimo tudi izražanje ali aktiv- nost encimskih antioksidantov, pri čemer izražanje določamo na ravni mRNA z uporabo kvantitativne verižne reakcije s polimerazo (qPCR) ali na proteinski ravni s testom ELISA. Če želimo določiti encimsko aktiv- nost, uporabimo ustrezen kolorimetrični test, pri katerem lahko nastaja obarvan produkt ali izginja obarvan substrat. 182 Antioksidativno in protivnetno delovanje laškega smilja Kadar nas zanima, ali rastlinski izvleček poveča zmožnost celic za spo- padanje z oksidativnim stresom, lahko celice najprej izpostavimo iz- branemu izvlečku, nato pa oksidativni stres umetno sprožimo z znanim povzročiteljem nastanja ROS, npr. s terc-butil hidroperoksidom (tBOOH) ali z vodikovim peroksidom. Za tak namen je najpogosteje uporabljena metoda uporaba reagenta DCFH-DA (2’,7’-diklorodihidrofluorescein diacetat). Z uporabo reagenta znotraj celic, ob oksidaciji, povzročeni z znotrajceličnimi ROS, nastane produkt, ki močno fluorescira (Rastogi idr. 2010), ob večji prisotnosti endogenih antioksidantov pa je izmerje- na fluorescenca nižja. Če pričakujemo, da bo izvleček preprečeval oksi- dativne poškodbe celičnih membran ali lipoproteinskih delcev, lahko spremljamo obseg lipidne peroksidacije. Za merjenje uporabljamo me- todo TBARS, pri kateri produkti lipidne peroksidacije reagirajo s tiobuti- rično kislino (TBA) in tvorijo obarvan produkt (Schimke in Papies 1986). V raziskavah in vivo se za določanje odziva telesa na uživanje izvlečkov uporablja iste metode, le da se celokupen antioksidativni potencial ali pa prisotnost posameznega encimskega ali neencimskega endogenega antioksidanta določa v krvnem serumu preiskovancev ali živalskih mo- delov. Antioksidativno delovanje laškega smilja – dokazi raziskav in vitro V znanstveni literaturi je mogoče najti številne raziskave, v katerih so pri- merjali in vitro antioksidativni potencial na različne načine pripravljenih izvlečkov laškega smilja. Tako so Kladar idr. (2015) ugotovili, da ima eta- nolni izvleček višji antioksidativni potencial od eteričnega olja (Kladar idr. 2015), dobro delovanje pa je imel tudi izvleček, pripravljen s super- kritičnim ogljikovim dioksidom (Poli idr. 2003). Metanolni izvleček je bil učinkovit pri preprečevanju encimske in neencimske lipidne peroksi- dacije (Schinella idr. 2002). Izvleček, pripravljen z namakanjem sušene rastline v vroči vodi, je imel nižji antioksidativni potencial kot etanolni izvleček, vendar primerljiv z metanolnim izvlečkom. Če smo rastlino na- makali v hladni vodi, se vanjo niso izlužile take spojine, ki bi delovale iz- razito antioksidativno (Kramberger idr. 2020). Večinoma se rezultati uje- majo z vsebnostjo fenolnih spojin – za dve ključni antioksidativni spojini v izvlečkih laškega smilja, arzanol in klorogensko kislino, smo pokazali, da se v vodnih izvlečkih klorogenska kislina nahaja v primerljivih kon- centracijah kot v izvlečkih, pripravljenih z organskimi topili, medtem ko so z arzanolom bogatejši slednji. Nasprotno imajo eterična olja šibkejše 183 Saša Kenig in Zala Jenko Pražnikar antioksidativno delovanje zaradi pomanjkanja spojin z elektron-donor- sko funkcionalno skupino. Nadalje so izvlečke laškega smilja primerjali tako z drugimi vrstami iz rodu Helichrysum kot z različnimi rastlinami, ki jim je že priznan status medicinske rastline. Etanolni izvleček laškega smilja je imel višji antiok- sidativni potencial kot druge sorodne rastline (Kladar idr. 2015), vod- ni izvleček pa višji od enako pripravljenega izvlečka peščenega smilja (Kramberger idr. 2021). Pri primerjavi laškega in peščenega smilja smo ugotovili, da laški smilj vsebuje skoraj 50-krat več derivatov arzanola in ostalih pironov, mnogo več hidroksicimetnih kislin ter nekaterih flavo- noidov, npr. kemferola ter kvercetina in njegovih derivatov (Kramberger idr. 2021). Laški smilj je imel višji antioksidativni potencial od izvlečkov islandskega lišaja, navadnega lovorja in travniške ivanjščice, primerljiv z navadnim trpotcem, vendar nižji od krvavega mlečnika, regrata in polj- skega maka (Kazazic in Djapo 2016). Za pripravo izvlečkov lahko uporabimo različne dele rastlin. Za laški smilj se je pokazalo, da bo antioksidativni potencial višji, če uporabimo zelene dele rastline in ne samo socvetij (Kramberger idr. 2021). Rezultat je skla- den s kemijsko analizo – socvetja namreč vsebujejo manj flavonoidov in fenolnih kislin ter več taninov kot zeleni deli rastline (W ęglarz idr. 2022). Višji antioksidativni potencial od eteričnega olja sta imela tudi etanolni in vodni izvleček, pripravljena iz odpadne vode po destilaciji eteričnega olja (Chiocchio idr. 2023; Dzamic idr. 2019). To je izrednega pomena, saj nam nakazuje, da je mogoče s pridom izkoristiti celotno rast lino. Kljub temu da je večina nasadov v prvi vrsti namenjena pridobivanju eterične- ga olja za kozmetično industrijo, z izkoriščanjem odpadnih delov lahko zmanjšamo odpad in povečamo hektarski donos. S spremljanjem antiok- sidativnega potenciala rastlin laškega smilja, ki so bile požete med ma- jem in koncem junija, smo pokazali, da so imeli vodni izvlečki najvišji antioksidativni potencial v sredini junija (Kramberger idr. 2021). Pri tem je treba poudariti, da je bilo to izmerjeno le v eni sezoni in bi bili rezulta- ti ob različnih okolijskih pogojih lahko drugačni, kljub temu pa rezultat nakazuje pomembnost izbire časa žetja. Antioksidativno delovanje laškega smilja – dokazi raziskav na celičnih in živalskih modelih Pri zaužitju izvlečka je pomembno predvideti, ali bo po absorpciji v čre- vesju ohranil svoje lastnosti, saj vemo, da se le določene spojine absor- birajo v krvni obtok in lahko pred oksidativnim stresom ščitijo notranje 184 Antioksidativno in protivnetno delovanje laškega smilja organe. Na modelu, pripravljenem iz črevesnih celic, je bilo pokazano, da izvleček laškega smilja ohrani antioksidativno delovanje tudi po prehodu čez celični monosloj (Furger idr. 2022). Z uporabo celičnih modelov smo ugotovili, da izvleček laškega smilja deluje zaščitno pred oksidativnim stresom, sproženim s tBOOH (Kram- berger idr. 2021). Tako kožne kot črevesne in limfocitne celice, ki so bile izpostavljene izvlečku smilja, so namreč po dodatku tBOOH vsebovale manj ROS. Delno je to mogoče pripisati povišanemu izražanju antioksi- dativnih encimov, saj je laški smilj v kožnih celicah povzročil povišano izražanje SOD, GR in CAT, pri črevesnih celicah izražanje SOD, pri lim- focitih pa izražanje GR in SOD (Kramberger idr. 2021). Za arzanol, ki je bil ena ključnih antioksidativnih spojin, izoliranih iz laškega smilja, so Rosa idr. (2011) pokazali, da deluje zaščitno pred z bakrovimi ioni spro- ženo lipidno peroksidacijo lipoproteinskih delcev nizke gostote (angl. low density lipoprotein – LDL), kar je pomembno, saj ravno oksidirani delci LDL močno pospešujejo proces ateroskleroze (Rosa idr. 2011). Ista spojina je preprečila tudi oksidacijo maščobnih kislin ter holesterola v membranah fibroblastov in črevesnih celic (Rosa idr. 2011) ter lipidno peroksidacijo, določano z metodo TBARS v kožnih celicah (Piras idr. 2024). Po izpostavitvi oligodendrocitov klorogenski kislini (La Rosa idr. 2023) so izmerili znižane količine ROS, v jetrnih celicah pa povišano tvor- bo glutationa (Granado-Serramo idr. 2007). Pri primerjavi eteričnega olja laškega smilja z nekaterimi drugimi eteričnimi olji, in sicer iz klinčkov, kopaibe in zimzelene gaulterije (Cebollada idr. 2024), se je izvleček iz laškega smilja izkazal za najučinkovitejšega pri lovljenju radikala duši- kovega oksida (NO), merjenega z Griesovim reagentom. Prav tako je bila po izpostavitvi laškemu smilju najnižja vrednost NO-radikala izmerjena v celicah, pri katerih je bila proizvodnja NO sprožena z IFN-γ (Cebollada idr. 2024). Raziskav na živalskih modelih, ki bi preučevale antioksidativne učinke izvlečkov iz laškega smilja, ni, a nekaj uporabnih informacij lahko vseeno dobimo iz preučevanja posameznih bioaktivnih spojin, ki so značilne za laški smilj. Izražanje SOD se je npr. povišalo v nevronih pri podganah, ki jim je bila pet dni intraperitonealno dodajana klorogenska kislina, hkrati pa je bilo opaženo tako zmanjšanje koncentracije ROS kot lipidne pe- roksidacije (Lee idr. 2020). Povišanje koncentracij glutationa so izmerili pri podganah, ki so klorogensko kislino uživale teden dni (Liu idr. 2020). Izražanje antioksidativnih encimov CAT in SOD se je izrazito povišalo 185 Saša Kenig in Zala Jenko Pražnikar tudi v možganskem tkivu pri podganah, ki so štiri dni prejemale tiliro- zid (Alkholifi idr. 2023). Pri miših s stimulirano mikoplazemsko pljučnico je dodajanje pinocembrina z nosnimi kapljicami zmanjšalo oksidativni stres – v pljučih sta se znižali količina NO ter aktivnost mieloperoksida- ze in dveh označevalcev oksidativnega stresa, reduciranega glutationa in malondialdehida, povišalo pa se je izražanje SOD. S tem so se izboljšali tudi simptomi pljučnice (Qian in Xue 2022). Ista spojina je skoraj enake učinke povzročila tudi v srčnem tkivu in krvnem obtoku pri podganah po sprožitvi motenj srčnega ritma z izoproterenolom (Chen idr. 2022). Antioksidativno delovanje – klinične raziskave Antioksidativno delovanje laškega smilja pri ljudeh smo preučevali na UP. Ko so preiskovanci, stari 40–65 let, z vsaj dvema komponentama pre- snovnega sindroma, uživali skodelico vodnega izvlečka laškega smilja (1 g suhe rastline/2 dL vroče vode) zaporednih 28 dni, se je nekoliko poviša- la sposobnost lovljenja prostih radikalov, izmerjena v njihovih krvnih se- rumih. Ta je še narasla v 14 dneh po koncu intervencije, torej po zaključe- nem vsakodnevnem uživanju. Ob tem se je v njihovih limfocitih izrazito povišalo izražanje GR, nekoliko pa tudi izražanje SOD (Kenig idr. 2022). Antioksidativno delovanje rastlinskih bioaktivnih spojin v telesu ima raz- lične funkcionalne posledice, delujejo npr. hepatoprotektivno, nevrop- rotektivno, predvsem pa lahko znižujejo vnetje. V raziskavah in vivo so zato večinoma spremljane te funkcionalne spremembe, ne pa samo an- tioksidativno delovanje; v nadaljevanju je zato podrobneje predstavljeno protivnetno delovanje laškega smilja. Protivnetno delovanje Vnetje je v splošnem odziv (navadno lokalen) na poškodbo v tkivu, pri čemer je fiziološki pomen vnetne reakcije odstranitev povzročitelja vne- tja ter popravilo prizadetega tkivnega območja. Najprej se v odzivu na okužbo ali poškodbo aktivira prirojena ali naravna imunost, in sicer z akutnim vnetjem. Na mestu vnetja so prvi nevtrofilci, njim sledijo mono- citi, ki hitro dozorijo v makrofage. Vnetne procese sprožijo različni medi- atorji vnetja, citokini in kemokini ter tudi ROS, ki jih proizvajajo nevtro- filci in makrofagi. Razlikujemo akutno vnetje, ki je povsem naraven mehanizem obrambe našega organizma, in kronično vnetje, ki se pojavi, ko so njegovi povzro- čitelji prisotni daljši čas. Povzročitelji so lahko virusi, bakterije, alergeni ali vztrajajoča aktivacija provnetnih molekul. Kronično vnetje vzdržujejo 186 Antioksidativno in protivnetno delovanje laškega smilja predvsem dolgoživi tkivni makrofagi in monociti, ki iz krvnih žil vstopajo v vnetišče, kjer dozorijo v makrofage. Znano je, da kronično vnetje izčr- pava imunski sitem in povzroča poškodbe tkiv ter je značilno za vrsto različnih bolezenskih stanj z avtoimunsko etiologijo, a je tudi sestavni del patologij različnih kroničnih nenalezljivih bolezni (Libby 2007). Celično in molekularno gledano je vnetje izredno kompleksen biološki proces, ki vključuje odziv številnih encimov; izpostaviti velja fosfolipazo A (PLA ), ki je ključen encim za sproščanje arahidonske maščobne kisli-2 2 ne iz fosfolipidnega dvosloja, ter ciklooksigenazo-1 in -2 (COX-1 in COX- 2), 5-lipoksigenazo (5-LO) in mikrosomalno PGE-sintazo (mPGES), ki 2 sodelujejo pri sintezi prostaglandinov, tromboksanov in levkotrienov, pomembnih mediatorjev vnetja (Kothavade idr. 2013). Dodatno pri vne- tnem odzivu zaznamo izraženi tudi tirozin-kinazo (TK) in protein-kinazo C (PKC) (Dias 2021). Povečano sproščanje arahidonske maščobne kisline in tvorjenje vnetnih mediatorjev v končni fazi vodita do tvorbe ter sproš- čanja citokinov in kemokinov iz aktiviranih celic (monocitov, makrofa- gov in tudi limfocitov). Pri celotnem procesu ne moremo mimo jedrnega faktorja kapa B (NFκB), ki se v celicah hitro odzove v primeru imunskih in vnetnih reakcij ter doseže svoj učinek z izražanjem provnetnih mole- kul (Lee in Burckart 1998). Med citokini so izrazito provnetni IL-1, TNF- -α, IL-2, IFN-γ in IL-12. Citokina IL-1 (α in β) in TNF-α nastajata v vne-tišču in sinergistično spodbujata vnetne procese. Prvi, bodisi sam ali pa v kombinaciji z drugim, stimulira tudi nastajanje prostaglandina PGE , s 2 čimer znižuje prag bolečine. Učinki citokinov so pogosto pleiotropni, kar pomeni, da imajo posamezni med njimi različne, lahko celo nasprotujo- če si učinke. Pogosto delujejo tako, da sprožijo točno določeno zaporedje nastajanja in izločanja ostalih citokinov, pri čemer lahko nato učinkujejo antagonistično, aditivno ali sinergistično (Dinarello 2000). Na podlagi epidemioloških raziskav je bilo pokazano, da lahko s pre- hrano – tako preventivno kot tudi terapevtsko – učinkovito vplivamo na kronično vnetje nizke stopnje. Preko številnih modelov ex vivo in in vivo je bilo pokazano, da so prav številne fenolne spojine ene izmed glavnih komponent prehrane s protivnetnimi lastnostmi. Določeni flavono- idi lahko delujejo neposredno na specifične encime, ki se odzovejo na vnet ne procese in tako znižajo vnetno stanje, ali pa delujejo posredno preko vezave na NFκB in posledično vplivajo na spremenjeno izražanje specifičnih genov. Za kvercetin je bilo npr. pokazano, da inhibira delova- nje tako COX kot 5-LO in na tak način vpliva na zmanjšano produkcijo 187 Saša Kenig in Zala Jenko Pražnikar prostaglandinov, tromboksanov in levkotrienov; na drugi strani pa inhi- bira tudi delovanje NF κB, kar rezultira v znižanem izražanju genov, ki so prav tako povezani z vnetim stanjem (Krauth idr. 2023). Ker je laški smilj bogat rezervoar bioaktivnih spojin s protivnetnim delo- vanjem, je bilo njegovo protivnetno učinkovanje pogosto predmet števil- nih raziskav – tako izvlečkov laškega smilja kot poparkov in tudi eterič- nega olja. Določanje provnetnih in protivnetnih biooznačevalcev Pri raziskovanju protivnetnih lastnosti rastlinskih izvlečkov in eteričnih olj se lahko poslužujemo različnih modelov in vitro in in vivo ali pa izve- demo klinične raziskave na ljudeh. Pri modelih in vitro se v raziskavah največkrat uporabljajo stimulirani oz. aktivirani monociti ali nevtrofilci (predhodno izolirani iz človeške ali živalske krvi), ki jih nato izpostavimo fenolnim spojinam ali rastlinskim izvlečkom ter merimo aktivnost posa- meznih encimov in/ali tvorbo levkotrienov, prostaglandinov ali trombo- ksanov. Poleg tega se v raziskavah poslužujemo tudi specifičnih celičnih linij; kot model za primarne monocite in/ali makrofage se pogosto upo- rablja celična linija THP-1 (Nile in Park 2013). Večkrat uporabljana je tudi celična linija makrofagov RAW 264.7 (Ni idr. 2020). Z razvojem »omik« lahko protivnetno delovanje na celičnih linijah raziskujemo tudi preko analize celičnega transkriptoma, proteoma ali metaboloma. Pri tem lah- ko uporabimo različne celične linije, pogosto se odločamo ali za celične linije imunskega sistema ali črevesne ali kožne celične linije – celice, ki so v največji meri v stiku z bioaktivnimi spojinami rastlinskih izvlečkov tudi v realnem okolju. Pri preučevanju protivnetnega delovanja specifičnih bioaktivnih spojin ali izvlečkov se lahko raziskovalci osredotočijo le na posamezno kompo- nento vnetja. Kot primer izpostavljamo denaturacijo beljakovin – proces, ki pogosto spremlja vnetje. Preučevanje protektivne oz. zaščitne vloge rastlinskih izvlečkov v primeru toplotno povzročene denaturacije albu- mina je le eden izmed modelov, ki je bil uporabljen pri preučevanju iz- vlečkov laškega smilja v povezavi s protivnetnim delovanjem (Bojilov idr. 2023). Najpogosteje uporabljen model in vivo za preučevanje organskih izvleč- kov laškega smilja in eteričnega olja je živalski model, odziven na akutno sprožitev vnetnega procesa (Nile in Park 2013). V splošnem se za spro- žitev vnetnega odgovora pri modelnih organizmih (miših, podganah) 188 Antioksidativno in protivnetno delovanje laškega smilja uporabljajo provnetni dejavniki, npr. lipopolisaharid ali formalin, upo- rabljajo se tudi ocetna kislina in drugi sprožilci vnetja. Najbolj preučeni modeli in vivo tako vključujejo s karagenanom povzročen plevritis pri podganah, s histaminom induciran edem na podganjih/mišjih šapah in s formalinom induciran edem v mišjih ušesih (Morris 2003; Sala idr. 2002; Sala, Recio, Schinella idr. 2003; Sala, Recio, Schinella, Máñez idr. 2003). Pri preučevanju učinkovanja izvlečkov laškega smilja ali eteričnega olja pa nato spremljamo protivnetno delovanje ali posamezne bioaktivne spojine ali celotnega izvlečka oz. eteričnega olja po zaužitju ali intraperi- tonealnem vnosu. Lahko merimo velikost edema, otekline, rdečine ali pa določamo aktivnost specifičnih encimov ali tvorbo vnetnih mediatorjev, pri čemer vedno primerjamo netretiran živalski model s tretiranim. Klinične raziskave, ki so preučevale protivnetno delovanje laškega smil- ja, so se osredotočale na posameznike s presnovnim sindromom, pri ka- terih je prisotno kronično vnetje nizke stopnje (Petelin idr. 2022), ali pa na preiskovance z bakterijskim ali nebakterijskim vnetjem prostate (Di Vico idr. 2020; Galeone idr. 2012). V kolikor preučujemo protivnetno de- lovanje posameznih rastlinskih izvlečkov ali njihovih bioaktivnih spojin, vedno iščemo posameznike s povišano ravnjo vnetnih biooznačevalcev. Protivnetno delovanje laškega smilja – dokazi raziskav in vitro V raziskavah in vitro so raziskovalci večinoma preučevali zgolj posamez- ne bioaktivne spojine, izolirane iz laškega smilja, in ne celotnega izvleč- ka. Ko govorimo o izoliranih posameznih spojinah laškega smilja, lahko z gotovostjo trdimo, da je v organskih izvlečkih laškega smilja arzanol glavna protivnetna spojina. Učinkuje tako, da zavira številne encime, ki se odzivajo na vnetje, najmočneje mPGES-1 (Bauer idr. 2011). Zavira pa tudi jedrni transkripcijski faktor NFκB, kar so raziskovalci dokazali na stimuliranih monocitih, izoliranih iz človeške krvi (Kothavade idr. 2013; Appendino idr. 2007). Arzanol se je poleg tega najmočneje vezal na albu- min in zaščitil beljakovine pred samo denaturacijo, kar je tudi pomem- ben protivnetni mehanizem (Bojilov idr. 2023). Nima pa protivnetnih lastnosti le arzanol; aktivacijo NFκB je zaviral tudi helipiron (Appendino idr. 2007). Druge spojine s protivnetnim delovanjem laškega smilja so še acetofenoni in flavonoidi (pinocembrin, gnafalin). Araceli Sala, Carmen M. Recio, Guillermo R. Schinella, Salvador Máñez idr. (2003) so pokazali, da sta tako 4-hidroksi-3-(3-metil-2-butenil)acetofenon kot 4-hidroksi- -3-(2-hidroksi-3-izopentenil)acetofenon sposobna zavreti tvorbo lev- kotriena B4, medtem ko je samo prvi zaviral delovanje encima COX-1. 189 Saša Kenig in Zala Jenko Pražnikar Flavonoida gnafalin in pinocembrin, izolirana iz metanolnega izvlečka H. italicum, sta tudi zavrla tvorbo levkotriena B4, medtem ko je flavono- id tilirozid spodbujal presnovo arahidonske kisline. Ne smemo pa mimo fenolnih kislin, ki imajo tudi dokazano protivnetne lastnosti – gre za klo- rogenske in kavne kisline, katerih učinke so raziskovali številni razisko- valci iz najrazličnejših rastlinskih izvlečkov. Luyen idr. (2015) so poro- čali o protivnetnem delovanju klorogenske kisline na mišjih makrofagih RAW264.7, stimuliranih z lipopolisaharidom (Luyen idr. 2015). Izkazalo se je, da je klorogenska kislina inhibitorno delovala na COX-2, pri čemer je bila opažena tudi zmanjšana tvorba TNF-α (Huss idr. 2002). Dodatno so Yu idr. (2010) poročali o značilni inhibiciji krompirjeve 5-LO s kavno kislino, kar kaže, da tudi kavna kislina deluje protivnetno (Yu idr. 2010). Protivnetno delovanje vodnega izvlečka laškega smilja je bilo na pod- lagi celostne transkriptomske analize raziskano le v eni raziskavi in vi- tro, in sicer Katje Kramberger idr. (2022), ki smo jo izvedli na UP FVZ v sodelovan ju z Medicinsko fakulteto Univerze v Ljubljani. Analiza trans- kriptoma primarnih črevesnih celic CCD112CoN po tretiranju celic s poparkom H. italicum subsp. italicum je poleg drugih bioloških poti pokazala tudi na spremenjeno signaliziranje z interlevkini (Kramberger idr. 2022). Poparek laškega smilja je v največji meri vplival na povečano izražanje gena IL33, ki kodira z jedrom povezan citokin iz družine IL-1. Raziskave na genetsko spremenjenih miših z debelostjo in diabetesom (ob/ob) so pokazale, da rekombinantni IL-33 zmanjša adipoznost, zniža glukozo na tešče in izboljša toleranco za glukozo ter inzulin, kar nakazu- je, da ima IL-33 zaščitno vlogo pri razvoju vnetja maščobnega tkiva pri debelosti (Miller idr. 2010). Molofsky idr. (2015) predvidevajo, da IL-33 ohranja arhitekturo in funkcijo celic z izraženimi receptorji za IL-33, kar zmanjšuje infiltracijo adipoznega tkiva z vnetnimi limfociti in mieloidni- mi celicami, ki povzročajo rezistenco na inzulin in presnovni sindrom. Izpostaviti pa velja, da je bilo protivnetno delovanje dokazano tudi za eterično olje laškega smilja. In sicer je bilo na mišjih celicah mikroglije (BV-2) pokazano zmerno inhibitorno delovanje eteričnega olja laškega smilja na 5-LO in presnovo arahidonske kisline (Cebollada idr. 2024). Protivnetno delovanje eteričnega olja laškega smilja lahko pripišemo α-pinenu (Rufino idr. 2014) in limonenu (Souza idr. 2003), monoterpe-noma z dokazanim protivnetnim delovanjem, ki sta v precejšnem deležu prisotna v eteričnem olju laškega smilja. 190 Antioksidativno in protivnetno delovanje laškega smilja Protivnetno delovanje laškega smilja – dokazi raziskav in vivo Na živalskih modelih in vivo so raziskovalci v največji meri preučevali protivnetno delovanje spojin, ki so bile učinkovite v testih in vitro. Julia Bauer idr. (2011) so potrdili protivnetno delovanje arzanola in vivo, saj je le-ta močno zavrl vnetni odgovor na s karagenanom povzročen plevritis pri podganah (Bauer idr. 2011). V veliki meri in statistično značilno je zni- žal tvorbo eksudata, infiltracijo celic ter vrednosti prostaglandina E2, F1α in levkotriena B4. Protivnetno delovanje in vivo so Araceli Sala idr. (2002) potrdili tudi za metanolne izvlečke H. italicum oz. posamezne frakci- je izvlečka, ki so zavrli z 12-O-tetradekanoilforbol-13-acetatom (TPA) povzročen edem v mišjih ušesih oz. s PLA2 ali s serotoninom povzročen edem v mišjih šapah. Preučevali so tudi vpliv izvlečkov na kronično vne- tje tako, da so večkrat nanesli 2 µg TPA na uho miši. Metanolni izvleček je statistično značilno zmanjšal edem in infiltracijo levkocitov. Izmed flavo- noidov je bil tilirozid najučinkovitejši na modelu kroničnega vnetja (Sala, Recio, Schinella idr. 2003). Na modelu kroničnega vnetja tako 4-hidroksi- -3-(2-hidroksi-3-izopentenil)acetofenon kot 12-hidroksitremeton nista preprečila nastanka edema, sta pa oba znižala aktivnost mieloperoksi- daze (Sala, Recio, Schinella idr. 2003). Vzporedno so raziskovalci testirali tudi protibolečinsko delovanje 4-hidroksi-3-(2-hidroksi-3-izopentenil) acetofenona ob aplikaciji ocetne kisline mišim. Omenjeni acetofenon je zmanjšal število zvijanj miši v primerjavi s kontrolo tako po peroralnem kot intraperitonealnem vnosu, pri čemer je bil učinek podoben aspirinu. Aplikacija ocetne kisline namreč povzroči sproščanje prostaciklina, ki ga sintetizira COX-1, analgetični učinek pa je posledica zaviranja delovanja tega encima (Sala, Recio, Schinella idr. 2003). Protivnetno delovanje laškega smilja – klinične raziskave Protivnetno delovanje laškega smilja je bilo preučevano v nekaj kliničnih raziskavah. Graziana Galeone idr. (2012) so preučevali protivnetno delo- vanje Proxelan®-a (Sala Bolognese, Italija) v obliki svečk pri preiskovan- cih z vnetjem prostate v primerjavi z zdravljenjem z antiobiotiki (Galeo- ne idr. 2012). V medicinskem izdelku Proxelan® sicer ni bil le laški smilj, temveč tudi bosvelija (Boswellia serrata), azijska penica (Centella asia- tica) in semena buče (Cucurbita pepo). Učinkovitost zdravljenja z izdel- kom Proxelan® in antibiotiki je bilo primerljivo, a je pri preiskovancih, ki so bili deležni Proxelan®-a, prišlo do dvakratnega izboljšanja simptomov, povezanih s kroničnim vnetjem prostate, in urinarnih simptomov glede na skupino, ki je prejemala antibiotik (p = 0,028). Proxelan® so preučevali 191 Saša Kenig in Zala Jenko Pražnikar tudi Di Vico idr. (2020), in sicer pri bolnikih z diagnosticiranim nebakte- rijskim vnetjem prostate ali s sindromom kronične bolečine v medenici. Po enomesečni intervenciji so raziskovalci opazili značilno zmanjšanje urinskih simptomov in bolečine ter boljšo kakovost življenja preiskovan- cev (v vseh primerih je p < 0,05). Dodatno je bilo ugotovljeno, da se je po končani raziskavi levkocitospermija značilno znižala, koncentracije IL-6 so se znižale za približno 12 %, medtem ko se vrednosti IL-8 niso stati- stično značilno spremenile. Proxelan® se je v raziskavi izkazal za učinko- vitega pri lajšanju bolečine, najverjetneje preko zniževanja vnetja. V raziskavi, ki smo jo izvedli na UP (Petelin idr. 2022), je bila preučevana učinkovitost poparka laškega smilja (v primerjavi s peščenim smiljem) na integriteto črevesne stene in s tem povezanim vnetjem (Petelin idr. 2022). Dokazano je bilo, da enomesečna intervencija z vsakodnevnim uživanjem poparka laškega smilja značilno zmanjša propustnost čreves- ja in vnetje na podlagi merjenih serumskih biooznačevalcev. Značilno so se znižale serumska koncentracija zonulina kot tudi vrednosti prov- netnih citokinov IL-6, IL-1β in MCP-1; na drugi strani pa so se značil-no povišale serumske vrednosti IL-33 (Petelin idr. 2022). Učinki IL-33 so pleiotropni, IL-33 lahko deluje tako pro- kot protivnetno (Molofsky idr. 2015). Njegovo delovanje v povezavi s presnovnimi boleznimi je zašči- tno, saj najverjetneje vpliva na preprečevanje vnetja v maščobnem tkivu (Miller idr. 2010). Poleg neposrednega vpliva poparka laškega smilja na vnetne procese smo Ana Petelin idr. (2022) dokazali tudi učinkovitost po- parka laškega smilja na integriteto črevesne stene in na sestavo črevesne mikrobne združbe, kar posredno pripomore z znižanju vnetja oz. vne- tnih biooznačevacev (Petelin idr. 2022). V celotni raziskavi so bili poparki laškega smilja primerjani s poparki peščenega smilja, pri čemer je imel poparek slednjega bistveno manjši učinek na vnetne biooznačevalce kroničnega vnetja in na biooznačevalec črevesne integritete (Petelin idr. 2022). Večjo učinkovitost laškega smilja gre najverjetneje pripisati priso- tnosti arzanola, izjemno močni protivnetni molekuli, ki je ne zaznamo v peščenem smilju. Je pa učinek poparka smilja na vnetje kompleksen proces, pri čemer ne smemo zanemariti učinkovanja bioaktivnih spojin laškega smilja preko črevesne mikrobne združbe. Zaključek Z različnimi metodami je bilo torej pokazano, da izvlečki iz laškega smil- ja izkazujejo odlično antioksidativno delovanje, kar je glede na njihovo kemijsko sestavo tudi pričakovano (slika 1). Pomembna je ugotovitev, da 192 Antioksidativno in protivnetno delovanje laškega smilja Dokazi na celičnih modelih In drugih raziskavah in vitro • Kisikove reaktivne zvrsti, NO • Lipidna peroksidacija • Provnetni biooznačevalci • Provnetni dejevniki (5-LO, COX-2) (mPGES-1, NF κB, derivati • Lipidna peroksidacija arahidonske kisline, LO-1) • Denaturacija beljakovin • Antioksidativni encimi (SOD, GR, CAT) • Antioksidativen potencial • Protivnetni biooznačevalci (IL-33) Dokazi kliničnih raziskav Dokazi na živalskih modelih na ljudeh • Kisikove reaktivne zvrsti • Kisikove reaktivne zvrsti, NO, lipidna • Provnetni biooznačevalci peroksidacija (IL-6, IL-1β, MCP-1) • Provnetni biooznačevalci (COX-1, prostaglandini, levkotrieni) • Antioksidativni encimi • Infiltracija levkocitov (GR, SOD) • Protivnetni biooznačevalci • Antioksidativni encimi (SOD, CAT) (IL-33) • Glutation Slika 1 Antioksidativno in protivnetno delovanje laškega smilja na celičnih in živalskih modelih ter v okviru kliničnih raziskav. Legenda CAT – katalaza; COX – ciklooksigenaza; GR – glutation reduktaza; IL – interlev-kin; LO – lipooksigenaza; MCP – monocitni kemoatraktivni protein; mPGES-1 – mikro-somalna sintaza prostaglandinov; NFκB – jedrni faktor kapa B; NO – radikal dušikovega oksida; SOD – superoksid dizmutaza se antioksidativno delovanje odrazi tudi pri raziskavah in vivo. Prav tako lahko zaključimo, da izvlečki laškega smilja delujejo protivnetno, tako na celičnih modelih kot na živalskih modelih in tekom kliničnih raziskav (slika 1). Delno je lahko tako delovanje neposredna posledica lovljenja prostih radikalov, možni pa so tudi drugi mehanizmi. Zaviranje kronič- nega vnetja je pomembno, saj je to povezano z razvojem številnih kro- ničnih nenalezljivih bolezni, značilnih za današnjo družbo. Nadaljevanje raziskovanja učinkov laškega smilja, predvsem v kliničnih raziskavah, je torej priporočljivo. Viri Alkholifi, F., S.Devi, M. Aldawsari idr. 2023. »Effects of Tiliroside and Lisuri- de Co-Treatment on the PI3K/Akt Signal Pathway: Modulating Neuro-inflammation and Apoptosis in Parkinson’s Disease.« Biomedicines 11 (10): 2735. Appendino, G., M. Ottino, N. Marquez idr. 2007. »Arzanol, an Anti-In- flammatory and Anti-HIV-1 Phloroglucinol Alpha-Pyrone from Helich- 193 Saša Kenig in Zala Jenko Pražnikar rysum italicum ssp. microphyllum.« Journal of Natural Products 70 (4): 608–612. Bacchi, S., P. Palumbo, A. Sponta in M. F. Coppolino. 2012. »Clinical Pharma- cology of Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs: A Review.« Anti-In- flammatory and Anti-Allergy Agents in Medical Chemistry 11 (1): 52–64. Bauer, J., A. Koeberle, F. Dehm idr. 2011. »Arzanol, a Prenylated Heterodi- meric Phloroglucinyl Pyrone, Inhibits Eicosanoid Biosynthesis and Ex- hibits Anti-Inflammatory Efficacy In Vivo.« Biochemical Pharmacology 81 (2): 259–268. Bojilov, D., S. Manolov, S. Ahmed idr. 2023. »HPLC Analysis and In Vitro and In Silico Evaluation of the Biological Activity of Polyphenolic Compo- nents Separated with Solvents of Various Polarities from Helichrysum italicum.« Molecules 28 (17): 6198. Cebollada, P., N. G. M. Gomes, P. B. Andrade and V. López. 2024. »An In- tegrated in vitro Approach on the Enzymatic and Antioxidant Mecha- nisms of Four Commercially Available Essential Oils (Copaifera offici- nalis, Gaultheria fragrantissima, Helichrysum italicum, and Syzygium aromaticum) Traditionally Used Topically for Their Anti-Inflammatory Effects.« Frontiers in Pharmacology 14. https://doi.org/10.3389/fphar .2023.1310439. Chen, X., W. Wan, Q. Ran idr. 2022. »Pinocembrin Mediates Antiarrhythmic Effects in Rats with Isoproterenol-Induced Cardiac Remodeling.« Euro- pean Journal of Pharmacology 920:174799. Chiocchio, I., M. Mandrone, M. Tacchini, A. Guerrini in F. Poli. 2023. »Phyto- chemical Profile and In Vitro Bioactivities of Plant-Based By-Products in View of a Potential Reuse and Valorization.« Plants 12 (4): 795. Di Vico, T., J. Durante, C. Polito idr .2020. »Pumpkin Seeds, Centella Asiatica, Boswellia, Helichrysum, Acetate Vitamin E, Melaleuca Alternifolia and Hyaluronic Acid Phytocomplex Monotherapy Effects in Patients with Chronic Pelvic Pain Syndrome.« Minerva Urologica e Nefrologica 72 (2): 236–242. Dias, M. C., D. C. G.A Pinto in A. M. S. Silva. 2021. »Plant Flavonoids: Che- mical Characteristics and Biological Activity.« Molecules 26 (17): 5377. Dinarello, C. A. 2000. »Proinflammatory Cytokines.« Chest Journal 118 (2): 503–508. Dludla, P. V., E. Joubert, C. J. F. Muller, J. Louw in R. Johnson. 2017. »Hyperglycemia-Induced Oxidative Stress and Heart Disease-Cardiop- rotective Effects of Rooibos Flavonoids and Phenylpyruvic Acid-2- O-β- -D-Glucoside.« Nutrition and Metabolism 14 (1): 45. Dzamic, A., K. Mileski, A. Ciric, M. Ristic, M. Soković in P. Marin. 2019. »Es- sential Oil Composition, Antioxidant and Antimicrobial Properties of 194 Antioksidativno in protivnetno delovanje laškega smilja Essential Oil and Deodorized Extracts of Helichrysum italicum (Roth) G. Don.« Journal of Essential Oil Bearing Plants 22 (2): 493–503. Furger, C., C. Gironde, M. Rigal, C. Dufour in D. Guillemet. 2022. »Cell-Based Antioxidant Properties and Synergistic Effects of Natural Plant and Algal Extracts Pre and Post Intestinal Barrier Transport.« Antioxidants 11 (3): 565. Galeone, G., R. Spadavecchia, M. T. Balducci in V. Pagliarulo. 2012. »[The role of Proxelan in the treatment of chronic prostatitis. Results of a randomi-zed trial].« Minerva Urologica e Nefrologica 64 (2): 135–141. Granado-Serrano, A. B., M. A. Martín, M. Izquierdo-Pulido, L. Goya, L. Bravo in S. Ramos. 2007. »Molecular Mechanisms of (-)-Epicatechin and Chlo-rogenic Acid on the Regulation of the Apoptotic and Survival/Prolifera-tion Pathways in a Human Hepatoma Cell Line.« Journal of Agricultural and Food Chemistry 55 (5): 2020–2027. Huss, U., T. Ringbom, P. Perera, L. Bohlin in M. Vasänge. 2002. »Screening of Ubiquitous Plant Constituents for COX-2 Inhibition with a Scintillation Proximity Based Assay.« Journal of Natural Products 65 (11): 1517–1521. Kazazic, M., in M. Djapo. 2016. »Antioxidant Activity of Water Extracts of Some Medicinal Plants from Herzegovina Region.« International Jour-nal of Pure and Applied Bioscience 4 (2): 85–90. Kenig, S., K. Kramberger, K. Šik Novak idr. 2022. »Helichrysum italicum (Roth) G. Don and Helichrysum arenarium (L.) Moench Infusions in Re-versing the Traits of Metabolic Syndrome: A Double-Blind Randomized Comparative Trial.« Food and Function 13 (14): 7697–7706. Kladar, N. V., G. T. Anačkov, M. M. Rat idr. 2015. »Biochemical Characteriza- tion of Helichrysum italicum (Roth) G. Don subsp. italicum (Asterace-ae) from Montenegro: Phytochemical Screening, Chemotaxonomy, and Antioxidant Properties.« Chemistry and Biodiversity 12 (3): 419–431. Kothavade, P. S., D. M. Nagmoti, V. D. Bulani in A. R. Juvekar. 2013. »Arzanol, a Potent mPGES-1 Inhibitor: Novel Anti-Inflammatory Agent.« Scientific World Journal: 986429. Kramberger, K., Z. Jenko Pražnikar, A. Baruca Arbeiter, A. Petelin, D. Bandelj in S. Kenig. 2021. »A Comparative Study of the Antioxidative Effects of Helichrysum italicum and Helichrysum arenatium Infusions.« Antioxi-dants 10 (3): 380. Kramberger, K., D. Barlič-Maganja, D. Bandelj idr. 2020. »HPLC-DAD-ESI- -QTOF-MS Determination of Bioactive Compounds and Antioxidant Activity Comparison of the Hydroalcoholic and Water Extracts from Two.« Metabolites 10 (10): 403. Kramberger, K., D. Barlič-Maganja, Z. J. Pražnikar idr. 2022. »Whole Tran- scriptome Expression Array Analysis of Human Colon Fibroblasts Cul- 195 Saša Kenig in Zala Jenko Pražnikar ture Treated with Helichrysum italicum Supports Its Use in Traditional Medicine.« Journal of Ethnopharmacology 296 (1): 115505. Krauth, V., F. Bruno, S. Pace idr. 2023. »Highly Potent and Selective 5-Lipoxy- genase Inhibition by New, Simple Heteroaryl-Substituted Catechols for Treatment of Inflammation.« Biochemical Pharmacology 208 (9): 115385. La Rosa, G., C. Sozio, L. Pipicelli idr. 2023. »Antioxidant, Anti-Inflammatory and Pro-Differentiative Effects of Chlorogenic Acid on M03-13 Human Oligodendrocyte-Like Cells.« International Journal of Molecular Scien- ces 24 (23): 16731. Lee, J. I., in G. J. Burckart. 1998. »Nuclear Factor Kappa B: Important Tran- scription Factor and Therapeutic Target.« Journal of Clinical Pharmaco- logy 38 (11): 981–993. Lee, T. K., I. J. Kang, B. Kim idr. 2020. »Experimental Pretreatment with Chlo- rogenic Acid Prevents Transient Ischemia-Induced Cognitive Decline and Neuronal Damage in the Hippocampus through Anti-Oxidative and Anti-Inflammatory Effects.« Molecules 25 (16): 3578. Libby, P. 2007. »Inflammatory Mechanisms: The Molecular Basis of In- flammation and Disease.« Nutrition Reviews 65 (3): S140–S146. Liu, D., H. Wang, Y. Zhang in Z. Zhang. 2020. »Protective Effects of Chloro- genic Acid on Cerebral Ischemia/Reperfusion Injury Rats by Regulating Oxidative Stress-Related Nrf2 Pathway.« Drug, Design, Development and Therapy 14:51–60. Luyen, B. T., B. H. Tai, N. P. Thao idr. 2015. »Anti-Inflammatory Components of Chrysanthemum Indicum Flowers.« Bioorganic and Medicinal Che- mistry Letters 25 (2): 266–269. Miller, A. M., D. L. Asquith, A. J. Hueber idr. 2010. »Interleukin-33 Induces Protective Effects in Adipose Tissue Inflammation During Obesity in Mice.« Circulaton Research 107 (5): 650–658. Mirończuk-Chodakowska, I., A. M. Witkowska in M. E. Zujko. 2018. »Endo- genous Non-Enzymatic Antioxidants in the Human Body.« Advances in Medical Sciences 63 (1): 68–78. Molofsky, A. B., A. Savage in R. M. Locksley. 2015. »Interleukin-33 in Tissue Homeostasis, Injury and Inflammation.« Immunity 42 (6): 1005–1019. Molyneux, P. 2004. »The Use of the Stable Free Radical Diphenylpicryl- hydrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant.« Songklanakarin Journal of Science and Technology 26 (2): 211–219. Morris, C. J. 2003. »Carrageenan-Induced Paw Edema in the Rat and Mouse.« Methods in Molecular Biology 225:115–121. 196 Antioksidativno in protivnetno delovanje laškega smilja Ni, L., L. Wang, X. Fu idr. 2020. »In Vitro and In Vivo Anti-Inflammatory Acti- vities of a Fucose-Rich Fucoidan Isolated from Saccharina Japonica.« International Journal of Biological Macromolecules 156:717–729. Nile, S. H., in S. W. Park. 2013. »Optimized Methods for In Vitro and In Vivo Anti-Inflammatory Assays and Its Applications in Herbal and Synthetic Drug Analysis.« Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 13 (1): 95–100. Osredkar, J. 2012. »Oksidativni stres.« Zdravniški vestnik 81 (5): 393–406. Petelin, A., K. Šik Novak, M. Hladnik idr. 2022. »Helichrysum italicum (Roth) G. Don and Helichrysum arenarium (L.) Moench Infusion Consumption Affects the Inflammatory Status and the Composition of Human Gut Mi-crobiota in Patients with Traits of Metabolic Syndrome: A Randomized Comparative Study.« Foods 11 (20): 3277. Piras, F., V. Sogos, F. Pollastro, G. Appendino in A. Rosa. 2024. »Arzanol, a Natural Phloroglucinol α-Pyrone, Protects HaCaT Keratinocytes Against H.« Journal of Applied Toxicology 44 (5): 720–732. Poli, F., M. Muzzoli, G. Sacchetti, G. Tassinato, R. Lazzarin in A. Bruni. 2003. »Antioxidant Activity of Supercritical CO2 Extracts of Helichrysum itali-cum.« Pharmaceutical Biology 41 (5): 379–383. Qian, J., in M. Xue. 2022. »Pinocembrin Relieves Mycoplasma Pneumoniae Infection-Induced Pneumonia in Mice Through the Inhibition of Oxi-dative Stress and Inflammatory Response.« Applied Biochemistry and Biotechnology 194 (12): 6335–48. Ramsey, J. T., B. C. Shropshire, T. R. Nagy, K. D. Chambers, Y. Li in K. S. Ko- rach. 2020. »Essential Oils and Health.« Yale Journal of Biology and Me-dicine 93 (2): 291–305. Rastogi, R. P., S. P. Singh, D. P. Häder in R. P. Sinha. 2010. »Detection of Re- active Oxygen Species (ROS) by the Oxidant-Sensing Probe 2’,7’-Di-chlorodihydrofluorescein Diacetate in the Cyanobacterium Anabaena Variabilis PCC 7937.« Biochemical and Biophysical Research Communi-cations 397 (3): 603–707. Re, R., N. Pellegrini, A. Proteggente, A. Pannala, M. Yang in C. Rice-Evans. 1999. »Antioxidant Activity Applying an Improved ABTS Radical Cati-on Decolorization Assay.« Free Radical Biology and Medicine 26 (9–10): 1231–1237. Rizzo, A. M., P. Berselli, S. Zava idr. 2010. »Endogenous Antioxidants and Radical Scavengers.« Advances in Experimental Medicine and Biology 698:52–67 Rosa, A., F. Pollastro, A. Atzeri idr. 2011. »Protective Role of Arzanol Against Lipid Peroxidation in Biological Systems.« Chemistry and Physics of Li-pids 164 (1): 24–32. 197 Saša Kenig in Zala Jenko Pražnikar Rufino, A. T., M. Ribeiro, F. Judas idr. 2014. »Anti-Inflammatory and Chon- droprotective Activity of (+)-α-Pinene: Structural and Enantiomeric Se- lectivity.« Journal of Natural Products 77 (2): 264–2639. Sala, A., M. C. Recio, G. R. Schinella, S. Máñez, R. M. Giner in J. L. Ríos. 2003. »A New Dual Inhibitor of Arachidonate Metabolism Isolated from Heli- chrysum italicum.« European Journal of Pharmacology 460 (2–3): 219– 26. Sala, A., M. Recio, R. M. Giner idr. 2002. »Anti-Inflammatory and Antioxidant Properties of Helichrysum Italicum.« Journal of Pharmacy and Pharma- cology 54 (3): 365–71. Sala, A., M. C. Recio, G. R. Schinella idr. 2003. »Assessment of the Anti-In- flammatory Activity and free Radical Scavenger Activity of Tiliroside.« European Journal of Pharmacology 461 (1): 53–61. Schimke, I., in B. Papies. 1986. »Methodological Aspects of the Determina- tion of Thiobarbituric Acid-Reactive Substances in Plasma.« Zeitschrift für medizinische Laboratoriumsdiagnostik 27 (2): 71–75. Schinella, G. R., H. A. Tournier, J. M. Prieto, P. Mordujovich de Buschiazzo in J. L. Ríos. 2002. »Antioxidant Activity of Anti-Inflammatory Plant Ex- tracts.« Life Sciences 70 (9): 1023–2033. Sies, H. 2015. »Oxidative Stress: A Concept in Redox Biology and Medicine.« Redox Biology 4:180–283. Souza, M. C., A. C. Siani, M. F. Ramos, O. J. Menezes-de-Lima in M. G. He- nriques. 2003. »Evaluation of Anti-Inflammatory Activity of Essential Oils from Two Asteraceae Species.« Pharmazie 58 (8): 582–586. Węglarz, Z., O. Kosakowska, E. Pióro-Jabrucka idr. 2022. »Antioxidant and Antibacterial Activity of Helichrysum italicum (Roth) G. Don. from Cen- tral Europe.« Pharmaceuticals 15 (6): 735. Yu, G., P. N. Praveen Rao, M. A. Chowdhury idr. 2010. »Synthesis and Bio- logical Evaluation of N-Difluoromethyl-1,2-Dihydropyrid-2-One Acetic Acid Regioisomers: Dual Inhibitors of Cyclooxygenases and 5-Lipoxy- genase.« Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 20 (7): 2168–2173. 198 12 Interakcije laškega smilja z mikroorganizmi Katja Kranjc Karin Šik Novak Fakulteta za vede o zdravju, Fakulteta za vede o zdravju, Univerza na Primorskem Univerza na Primorskem © 2025 Katja Kranjc in Karin Šik Novak https://doi.org/10.26493/978-961-293-525-2.12 Uvod Odpornost mikroorganizmov na protimikrobna sredstva je globalni prob lem, ki lahko pomembno vpliva na zdravje ljudi, živali in okolja. Po- jav in širjenje protimikrobne odpornosti ogrožata učinkovitost zdravil, ki se uporabljajo za zdravljenje nalezljivih bolezni. Poleg tega lahko odpor- nost na antibiotike v živinoreji prispeva k prenosu odpornih patogenov z živali na človeka preko prehranske verige in okolja. V luči teh izzivov se raziskovalci vse bolj osredotočajo na iskanje novih protimikrobnih učin- kovin naravnega izvora, ki bi lahko zmanjšale to tveganje in proti katerim še ni dokazane odpornosti. Rastline iz družine nebinovk predstavljajo obsežno skupino rastlin, ki so znane po svoji uporabi v tradicionalni me- dicini za zdravljenje različnih bolezni in zdravstvenih težav. Med njimi je tudi laški smilj, katerega uporaba ni tuja pri pospeševanju celjenja ran ter lajšanju simptomov ob vnetju respiratornega in prebavnega trakta. Učinkovitost pripisujejo predvsem vsebnosti bioaktivnih učinkovin, kot so flavonoidi, terpeni in polifenoli. V tem poglavju bomo povzeli rezulta- te raziskav o protimikrobnem delovanju pripravkov iz laškega smilja in njihovih potencialnih pozitivnih vplivih na sestavo črevesne mikrobne združbe. Bandelj, D., Z. Jenko Pražnikar in A. Petelin, ur. 2025. 199 Laški smilj. Založba Univerze na Primorskem Katja Kranjc in Karin Šik Novak Protimikrobni učinek pripravkov iz laškega smilja Za določanje protimikrobnega učinka laškega smilja in vitro se najpogos- teje uporabljata (a) metoda redčenja v tekočem mediju in (b) metoda di- fuzije v agarju (Balouiri idr. 2016). Protimikrobni učinek se določa gle- de na minimalno inhibitorno koncentracijo (angl. minimum inhibitory concentration – MIK) ali minimalno baktericidno koncentracijo (angl. minimum bactericidal concentration – MBK). MIK predstavlja najnižjo koncentracijo testirane spojine, ki vidno zavira rast mikroorganizma, MBK pa najnižjo koncentracijo, ki povzroči smrt mikroorganizma (An- drews 2001). Na splošno pri testiranju fitokemikalij velja, da so učinko- vita protimikrobna sredstva, če je določena vrednost MIK v razponu od 0,1 do 1,0 mg/mL (Simões idr. 2009). Pri metodi difuzije v agarju, kjer se protimikrobna učinkovitost ocenjuje glede na premer cone inhibicije, pa je opredelitev naslednja: < 10 mm – brez protimikrobnega učinka; 10–15 mm – šibek protimikrobni učinek; 16–20 mm – zmeren protimikrobni učinek; > 20 mm – močan protimikrobni učinek (Pirvu idr. 2014). Pregled literature kaže, da je primerljivost rezultatov omejena zaradi raz- ličnih pristopov k metodologiji testiranja protimikrobne učinkovitosti ter zaradi razlik v izbiri testnih mikroorganizmov. Takšna variabilnost rezul- tatov poudarja pomen določitve kemijske sestave testiranega pripravka, saj lahko le na ta način zagotovimo njegovo ponovljivo in učinkovito delovanje. Eden ključnih dejavnikov, ki vpliva na kemijsko sestavo in s tem na protimikrobni potencial, je poreklo rastlinskega materiala. Npr., eterična olja laškega smilja s Korzike, ki so bogata z neril acetatom, imajo drugačen protimikrobni profil kot eterična olja iz Bosne, kjer prevladu- jeta α-pinen in γ-kurkumen (Genčić idr. 2021). Sestava eteričnega olja je odvisna tudi od dela rastline, iz katerega je pripravljeno; v eteričnem olju iz zelenih delov rastline sta bili dominantni spojini neril acetat in α-pi-nen, v socvetju pa neril acetat in nerol. Eterični olji sta se razlikovali tudi po bioloških aktivnostih; olje iz zelenih delov rastline je imelo višji anti- oksidativni potencial, medtem ko je eterično olje iz socvetja pokazalo iz- razitejšo protimikrobno učinkovitost (W ęglarz idr. 2022). Na izkoristek in delež bioaktivnih spojin pomembno vplivajo tudi dejavniki, kot sta sam postopek in pa pogoji priprave končnega izdelka. Kljub številnim pripravkom iz laškega smilja se največ raziskav protimik- robnega delovanja osredotoča na eterična olja, alkoholne izvlečke in posamezne bioaktivne učinkovine. V preglednici 1 so povzete najno- vejše raziskave o testiranju eteričnega olja laškega smilja, vključno 200 Interakcije laškega smilja z mikroorganizmi z uporabljenimi metodami in glavnimi ugotovitvami. Raziskave kažejo, da so ključne učinkovine eteričnega olja, ki prispevajo k protimikrobne- mu delovanju, neril acetat, α-pinen in γ-kurkumen (Šovljanski idr. 2024). Nekatere raziskave poročajo o večji učinkovitosti eteričnega olja proti po Gramu pozitivnim bakterijam v primerjavi s po Gramu negativnimi. Slednje pripisujejo razlikam v sestavi celične stene bakterij ter prisotno- sti oksigeniranih monoterpenov v eteričnem olju, kot sta nerol in gera- niol (Djihane idr. 2017; Mollova idr. 2020; Węglarz idr. 2022; Zheljazkov idr. 2022). Tudi Mastelic idr. (2005) navajajo, da ima terpenoidna frakcija eteričnega olja, ki vsebuje geraniol, geranil in neril acetat, močnejši pro- timikrobni učinek kot frakcija neoksigeniranih terpenov. Protimikrob- ni učinek eteričnega olja se je pokazal v zvezi s številnimi medicinsko pomembnimi mikroorganizmi, vključno z bakterijami Staphylococcus aureus in na meticilin odpornim S. aureus (angl. methicillin-resistant S. aureus – MRSA), Staphylococcus epidermidis, Listeria monocytogenes, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmo- nella enterica, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Hae- mophilus influenzae idr. (preglednica 1). To nakazuje potencial laškega smilja kot učinkovite alternative ali dopolnitve terapijam pri okužbah, ki jih povzročajo tudi proti antibiotikom odporni bakterijski sevi. Eterično olje laškega smilja iz Francije, ki je vsebovalo visok delež neril acetata (32,7–33,8 %) in γ-kurkumena (11,6–14,2 %), se je pokazalo za učinkovito pri zaviranju tvorbe biofilma S. aureus na različnih površinah, ki prihaja- jo v stik s hrano. To je ključnega pomena, saj z zunajceličnimi polisahari- di obdani mikroorganizmi izkazujejo večjo odpornost proti dejavnikom okolja in protimikrobnim sredstvom. Aplikacija eteričnega olja je poleg tega uspešno zavirala rast bakterij E. coli in S. aureus na zelenjavi, kar nakazuje njegov potencial za izboljšanje varnosti živil in preprečevanje okužb, povezanih s hrano (Cui idr. 2016). Med predstavniki kraljestva gliv je bil protimik robni učinek eteričnega olja največkrat testiran na kvasov- ki Candida albicans, vendar se rezultati raziskav precej razlikujejo. Razli- ke v rezultatih pripisujejo različni kemijski sestavi eteričnih olj, različnim eksperimentalnim pogojem in testiranim sevom (Šovljanski idr. 2024). Poleg eteričnega olja se je protimikrobna učinkovitost pokazala tudi za hidrolat laškega smilja. Njegov učinek ni bil omejen zgolj na neposredno zaviranje rasti, temveč tudi na preprečevanje adhezije s hrano prenoslji- vih patogenih bakterij (Bezek idr. 2022). V kmetijsko-živilskem sektorju se cvetovi laškega smilja lahko uporabljajo za začinjanje in aromatiziran- je živil, kot so pekovski izdelki in brezalkoholne pijače, ter kot naravni 201 Katja Kranjc in Karin Šik Novak konzervans. Raziskave so pokazale protimikrobni učinek na potencialne povzročitelje kvarjenja živil, kot so bakterije Micrococcus luteus, Bacil- lus cereus in P. aeruginosa), glivi Aspergillus niger in Alternaria alterna- ta (Djihane idr. 2017) ter insekti (Aedes albopictus (Diptera: Culicidae)) (Conti idr. 2010). Izvlečki laškega smilja, pripravljeni s topili, kot sta dietil eter ali etanol, so se pokazali za učinkovite pri zaviranju rasti S. aureus, MRSA in kariogene bakterije Streptococcus mutans. Poleg tega so imeli izvlečki zaviralni učinek na delovanje encimov, ki veljajo za pomembne virulentne dejavnike (koagulaza, DNAza, termonukleaza in lipaza) (Nostro idr. 2001; Nostro idr. 2004). Metanolni izvlečki rastlinskega ma- teriala iz Kalabrije in s Sardinije so, podobno kot eterično olje, pokazali večjo učinkovitost proti po Gramu pozitivnim bakterijam in glivam (Tun- dis idr. 2005). Raziskave prav tako potrjujejo protimikrobni učinek posa- meznih izoliranih frakcij. Derivati stirilpironov in kinske kisline, derivata aminofloroglucinola, derivat acetofenona ter ursolna kislina, pridobljeni iz metanolnega izvlečka, so se izkazali za učinkovite proti bakterijam P. aeruginosa in S. epidermidis (D’Abrosca idr. 2013; D’Abrosca 2016). Med testiranimi fenolnimi spojinami, ki vključujejo kumarate, benzofura- ne, pirone in heterodimerne floroglucinole, so se samo slednji pokazali za učinkovite proti MRSA (Taglialatela-Scafati idr. 2013). Kot učinkovit tradicionalni pripravek se je pokazal tudi poparek, saj je preprečil pre- hajanje bakterije Salmonella infantis skozi celični monosloj Caco-2, kar nakazuje potencial laškega smilja pri zaščiti črevesne sluznice pred okužbami (Kramberger idr. 2024). Čeprav redkeje, v literaturi zasledimo tudi protivirusno delovanje izvlečkov laškega smilja (Nostro idr. 2003) ter učinkovin, kot je arzanol (Appendino idr. 2007). Učinki čaja iz smilja na črevesno mikrobno združbo Ena izmed najpomembnejših ločnic med človekovim zunanjim in notran jim okoljem je naš prebavni trakt, v katerem se takoj po rojstvu ob- likuje kompleksna mikrobna združba (Moeller idr. 2018). Za naše zdravje je vzajemen odnos s črevesno mikrobno združbo zelo pomemben, saj ta ohranja integriteto črevesne stene (Salvucci 2016), uravnava prebavo, sintezo in absorpcijo številnih hranil ter presnovkov. Črevesno mikrob- no združbo lahko spreminjamo z intervencijami, kot je transplantacija zdrave mikrobne združbe posameznikom z različnimi boleznimi, poleg tega pa tudi s spremembo prehrane in prehranskega statusa (Zmora idr. 2019). Poleg spremenjenega vnosa makrohranil (Wu idr. 2011) lahko na sestavo črevesne mikrobne združbe vplivamo z vnosom prebiotikov, 202 Interakcije laškega smilja z mikroorganizmi ati kumenom ot O j a er al. N as ak ot mor in ot p . S. a acillu o k P. a il aceta Ba n kumenom ur enci a k e bil v r itr oti . ne b O k ur -k ije ali gliv ot s in je n -k a E ezult d 19,67 do 10,0 mm e ner azal tidin-k ter i ni bilo učink er za in v eu γan ve 9–12 mm ozitiv ol o ok it e n ak ur ta sev obni učinek za t o z amo pr . c s 10 µg/mL ve/r obni p a his obni učinek E tr obni učinek n u p ejš E ganizme jalj it e bil o at S. a eu ne b orj ov og acij s am oti ad oor tiv ce j . cerN ul azan s , b elinen p got otimikr or otimikr otimikr otimikr ga a 5 µg/mL t B O -pinenom in ar -s ok o Gr O pr U ane o bile sa ic s btil , on amu ji s il dpD s, tir ovit ebitn p a os ije s t in e bil eu e. gino s sdn es in s e K az o Gr u .le ur ter az . d i , vi je is an a . u o, o u otr no a em u yphim er ca gino A en C C Sa CM 3807, eu Cu P T e T ae an C 25922, da T er a T A C urer P. a ia C . f a C di A s A . mono C 16025, s T is E CM 1959, ic is P. a L C si an S. aP. a eu ev T i A C s pneumon ter C ur A btil ien ol u sa u lmonell C 10231, il cc CM 5671, en C . c Sa S. a S. cer as C 25923, s s T E C 10231 co p. CM 8186, eum C a C A C C 25922, C 11778, is T CM 4223, to ogino C CM 8223 C 14169, C 14579, s s br T C C C er itic ubs C CC ganiz gr T T s A A s ep CM 8271, acillu TT an ol a s lis BA ic tio oor i A s A gillu eu eu Str P. a icans oc ic i C i As C 27853, C 13311, C 19115, lb C 27853, ol an ur cans ur lb ica se ol C C eu C ikr per C ter tereu . c sa ur sa TC sin enes CM C A C CM ium . og C C Yer TCsa C 9763, gino ia da cyt C icill u lis lmonell s A C 25923, T C 16404 di C 19659, gino Pr vz E α je imelo tak pr sim α inhibit Pr p cono zbis Pr mikr 2,33 do 14,67 mm P občutljiv ne E MIK za bil in ium . . C ia B B a . ga smilj M T bi u T T . a T . a op . c E A A cer A C aur As S. a A al S. a 4224, 4501, en en C kr trE 25923, cer 27853 ke ja e ki ki ki gi odo e aš e v e v e v da u z dis da u z dis da u z disodilucij očem odolo zij zij zij a iz l et eto arj eto arj eto arjek oločanj M M difu ag M difu ag M difu ag D MIK z met mikrv t gojišču ga olj il O vine il e: obni obni obni ične e E go bij e: ner er in ta ce , e: ner av er O tlin s tlin s ne: e:-pinen otimikr otimikr ancij zik otimikr v iz Sr est α as a (21,04 %), as os orbij il aceta alen (10,8 %), e s ne in H alen (9,9 %), ak alen (10,99 %), valce vn O iz Fr ga iz r ga iz r O iz B vo in pr-pinen vo in pr os ak O iz K ak vo in pr laO iz Sr kumen (5,8–14,0 %) ta α -pinen (11,5%), ta ta idelo-him α ur es es e, B obni učinek et ljene ljene es obni učinek E ke: -him β-him-k e in g av av β β d pr ojine v E ko s vaš ko s ko s alnih E av ancij p ipr ipr ci a (14,89 %), ner isk ga o otimikr , pr , pr e t (15,6%), otimikr emijs emijs emijs az O O joče s ene omer Pr zik kumen (13,11–19,98 %), en r kumen or t (14,87 %), t (12,37 %), kumen (11,3%) ladu ur eklom iz Hr ur eklom iz Fr adinen (5,51 %); v E il acetaur idoblj ev am oločiti pr-k oločiti k or-k oločiti k or-pinen (13,74 %), -k oločiti k-k N D pr γ (9,75–14,45 %), ar D učinek E p γ (6,23 %) D učinek E p in s K Pr aceta D-limonen (5,23 %); v E α δ aceta D-limonen (4,92 %) D učinek k nerγ dnica 1 o ov ki le , letazk ović or ems eg vi in vi . (2024) . (2024) . (2022) vt er etr helj Pr A Z idr P idr Z idr SerSer (2022) 203 Katja Kranjc in Karin Šik Novak ati a o i P. i o d s an elo e ptr s e v nimi, eu anj je o a ob a prji s ejš tiv ur i v u hilu g/mL). ajm ga K = 16 e bil zdn S. a enim iz K za vs ta bil am i čemer s ije višle o O jas O s u ne tj ter , pr aemop o Gr os obni učinek idoblj aka n a E H am ij tanek biofilm ije občutljiv e bil močnejš , prje n a n g/mL) in n ne b ter ezult as ter o Gr O . aj za 52,63 %. a ni biloan ejš o bile p ja j ti MIK in MB tiv ak (MIK = 0,625 m ak otimikrev a g ga ve/r o občutljiv vet obni učinek E e b sa no salj it avi s p avi z E . st nižal n ne b oc evih vs ednos u nead ov gino e z ploš večj C 25923 (MIK = 1; MBN občutljiv u aj C tline ek ali p got va vr eh s imerj g/mL). Pr imerj otimikr am aj O j a s ozitiv T O iz s U N se (MIK = 0,312 m aer E vs N p pr z n A m E pr ras Pr niz bile vr Gr 454,50 µL/mL em SM 4690, SM C . . i B ii Lvi ia S. TC zen C ano C zi ster i s A D C SM 20566 C TC pi Li eu T ia iv qu ae TC C 13076, A C 13315, s s C 29212, e D C C s eC 25923, ur C 27853, C D C 27853, i A T T ster uC ia C T enesT ae C ol T A S. a ium A i A A Li cc acilluA fluenz T s . c A og B lis C 19111, cos A ur en E di sa er ser C 27853, C caeu ain sa iti T do C or au C 12228 fluenz a a ae ur ar T AC C 25923, dp gino ter A yphim s h . fT s in s p gino s pneumon C 33090, u Rho C iell E S. a u u C A C 25922, sa T C 8739, er C 11778, enes a en a T bs Tis er cc ganiz C A C oteu C hilu hilu T s le og T Tid co gino P. a K Pr a A P. a oor to i A u eu cyt i A s A C 6633, cu C 19119, C 6939, ol er ur ol ep lmonell lmonell eu C C C ikr noiderm aemop aemop . c a meticilin o . c T T T M H H 8978, Str E P. a S. a n 43300 E 10536, Sa Sa 14028, 13048, cer A mono in A Aep ja e e e K em K gi odo e e e anj odo odo odilucij očem odilucij očem dnoodilucij očem odolo et ek ekek oločanj oločanj aceplj a tr oločanj M D MIK z met mikr v t gojišču D MIK in MB z met mikr v t gojišču in n n gojišče D MIK in MB z met mikrv t gojišču O - ni in il av alne op ljene sid ur av vr ci av-k est iprγ -pinen otimikr tiok t (21,2 %), ar otimikr ipr e: α e s in obni e: ner ativ obni in kumen ljenih iz e E ga ga vn , pr omer , pr alne E , an ol (4,5–15,7 %), , pr , pr bij O tr O vo vo vo la ta il aceta ta ta es es es i e in g ko s ni učinek k e: ner ko s ko s av an sk ki učinek E eklom iz Sr ziv ni učinek E tr isk eklom iz cenor elinen (12,2 %), ijs-s emijs emijs or emijs ziv je s azβ ter adhe adžar šn ak ej en r t (16,4 - 20,3 %), ner oti adhe tlin s p kumen (15,9 %) tlin s p as otib oti am oločiti k O iz M oločiti k-pinen (4,1–10,4 %) oločiti k N D in pr E kur D pr ras aceta α D pr iz r(13,6 %), (11,8 %) je s pr . an o ev z vić , let ar alj or ázs idr gl . (2022) . (2021) ad vt al ę N A B (2022) W idr Aćimo idr 204 Interakcije laškega smilja z mikroorganizmi - a i ati ot sa a . s che orn C is – ejš oti gillu nimid oti a k i – Es anj ovit s (MIK = e bilo per o pr s ol t pr azal eu o z mono-g/mL). V nim As ozitiv a inhibit . ciderm os ne j at eklom iz ovit gillu ok ur os oti u p aln a (MIK = 2,5–5 or s; E. ep og a učink e bilo m ovit ozitiv per li e p S. a am , b cas; S As O o bil u p ezult a nižj ta s oti O s p aeeu eni, j amo pr o Gr oti O s am e s . Učink . E (18,0 mm). s fur ve/r erp o (MIK ≥ 5 m o s e bilo učink u it bij je bil eklom iz Bs a a E im p o Gr e ju ijam or ensis ensis occ ovita pr ov g/mL). E kvit ovit ovit er an li licc oc a; MIK – minim es ter cans at tirco got oti p bi g/mL). asi ancij vom in pr asi O iz Sr O s p ter acij U E učink 0,6 m in s učink tes pr bak al m E učink br Fr nek se brylo En tr C iiph – n is at) . ta lis TC e an ol C oncen A S. btil ca is enes ias – S , u P. lis is ae a k id og aum s s . feu ev ca er C 10231, C 16404, Eur C ae C C 9431, T i; icidn ter b C 13076, . f iderm C 8739 T. a C ter a C acillu C 8739, S. cer A T ac C (klinični iz un ter , E T B C s A A ac T eje; S . ep A T si ak ob a Sia ob i A a icans i A 9027, ien orme a bis ol ic lb ol il if cter jev em cinet nter . c il ter C 6538, СС ba aln C 11778 a lute . c . a as E C 10231 C , A , E C C 6538, C E C lo T АТ T cin C a en T s br ganiz A py A s ar T sa s Ayces cer A eu , S s am eu oor gillu C 6633, gino rium mon C C 12228 C 19606 C 13048, eu cans C 9763, K – minimrom ur C C C C u ikr lmonell C per sa bi . cer i – T T T T Tha M B 19433 aur A A A Sa al S. a A aer A As Fu un ; MBcc ejSa ja e . j gi odo enese – e s; C ogia e vis da an cyt odilucij očem odolo zij icev rju et ek oločanj eto lb M D MIK z met mikr v t gojišču M difu aga. cer; S da a ia mono il disa O e tlin ster om obni an e E as C Ligino ancij-pinen – – u in αer av er vine: ner e, Fr otimikr enes est eklom r go icansas a gij og vo t lb e s el or ce ta . a cyt netnim učink er vn es vo in pr C la O s pdomon otiv s; d s O iz B ta-pinen (1,9–20,8 %), t (9,2–35,0 %), es α euseu kumen (10,0–16,8 %) . mono ne in HP L e in g ur os – vo me ko s s cer e; av ljenih E . alnih E-k an sais il aceta γ av tr ci isk eza er Bid emijs ipr e t je s az ov obnim in pr acillu gino B ično olj u e: ner šn omer er er t (3,8–33,9 %), kumen (8,8–16,5 %) s – iderm ej en r bij ancij ih k ur eu otimikr P. a am ceniti p oločiti ks ep-k N O – et a; u O pr štir in Sr (1,7–19,9 %), D učinek pr iz Fr aceta γ je s pr . cercc . an o B i; E acijco a: ol tr evlo , let va alj a chy or . (2020) gend hi ad ollo vt enčić idrap N A G (2021) M idr Le ric koncenSt 205 Katja Kranjc in Karin Šik Novak ki lahko vplivajo na presnovo maščob in homeostazo glukoze gostitelja ter izboljšajo črevesno disbiozo, kar je bilo pokazano pri miših z debe- lostjo (Sung idr. 2017). Poparki laškega smilja in peščenega smilja so bo- gati s polifenolnimi spojinami, ki delujejo kot prebiotiki, saj so odporni na prebavo gostitelja in jih lahko fermentirajo črevesni mikroorganizmi (Plamada in Vodnar 2021). Povezava med črevesno mikrobno združbo in prebiotiki je dvosmerna, saj prebiotiki vplivajo na njeno sestavo, hkrati pa omogočajo nadaljnjo presnovo polifenolov in tvorbo bioaktivnih spo- jin (Fraga idr. 2019). Intervencije, usmerjene v sestavo črevesne mikrob- ne združbe, se zdijo obetaven pristop za izboljšanje presnovnega zdravja, povezanega z debelostjo. Učinki na raznolikost črevesne mikrobne združbe V klinični raziskavi pri posameznikih z vsaj dvema komponentama presnovnega sindroma smo ugotovili, da je štiritedenska intervencija z uživanjem 2 dL čaja iz laškega ali peščenega smilja na dan pomembno vplivala na spremembe v sestavi črevesne mikrobne združbe (Petelin idr. 2022). Čeprav sta splošna struktura in pestrost črevesne mikrobne združbe preiskovancev tekom štiritedenske intervencije ostali stabilni, se je po uživanju obeh vrst smilja rahlo, a pomembno zmanjšala α-ra-znolikost črevesne mikrobne združbe, določena s Shannonovim indek- som. Podobno so ugotovili Natalia S. Klimenko idr. (2018) pri kratkotrajni spremembi prehrane z nizkim vnosom prehranskih vlaknin, ki je vplivala na zmanjšano α-raznolikost. V nasprotju s klinično raziskavo Ane Pete- lin idr. (2022), pri kateri se je zmanjšana α-raznolikost pojavila hkrati z znižanjem ravni provnetnih biooznačevalcev, pa so drugi raziskovalci ugotovili povezavo med zmanjšano biotsko raznovrstnostjo v črevesju in različnimi boleznimi, ki so povezane z debelostjo (Le Chatelier idr. 2013). Učinki na črevesno mikrobno združbo na ravni debel Po intervenciji z laškim smiljem smo opazili značilno nižjo zastopanost debla Proteobacteria, s čimer bi lahko potencialno razložili znižanje ravni provnetnih biooznačevalcev, saj višjo zastopanost debla Proteoba- cteria opazimo pri številnih boleznih z vnetnim fenotipom (Rizzatti idr. 2017). Poleg debla Proteobacteria sta najpomembnejši debli, vključeni v presnovo prehranskih vlaknin in polifenolov, Bacteroidota in Firmicutes (Candela idr. 2010). Po intervenciji z laškim in s peščenim smiljem smo opazili značilno znižanje relativne zastopanosti določenih rodov iz debla Firmicutes. Polifenoli in njihovi presnovki naj bi vplivali na zmanjšano 206 Interakcije laškega smilja z mikroorganizmi zastopanost bakterij iz debla Firmicutes v črevesju ter s tem na povišanje razmerja med debloma Bacteroidota in Firmicutes (Rastmanesh 2011). Poleg tega so ugotovili, da je bilo razmerje Firmicutes/Bacteriodota pri posameznikih z debelostjo višje kot pri posameznikih z normalno teles- no maso (Koliada idr. 2017); ugotovitve nakazujejo, da bi morda lahko smilj na ta način vplival na izgubo telesne mase. Podobno so ugotovili pri zeliščnih pripravkih in funkcionalnih živilih proti debelosti, ki naj bi vplivali na višjo zastopanost debla Bacteroidota (in rodov Akkermansia, Lactobacillus in Bacteroides) ter nižjo zastopanost debla Firmicutes in nižje razmerje med debloma Firmicutes in Bacteroidota (Lyu idr. 2017). Učinki na črevesno mikrobno združbo na ravni rodov Po intervenciji z laškim smiljem smo opazili nižjo zastopanost rodov Ruminococcaceae uncultured in Lachnospiraceae UCG-001, za katera so ugotovili, da sta povezana s telesno maščobo in z višjim ITM (Gomez-A- rango idr. 2016; Pataky idr. 2016). Po drugi strani pa smo po intervenci- ji opazili nižjo zastopanost bakterij iz rodu Clostridiales vadin BB60, ki proizvajajo kratkoverižne maščobne kisline (angl. short chain fatty acids) (Harrison idr. 2018), za katere je bilo pokazano, da so negativno pove- zane z debelostjo, dislipidemijo in inzulinsko rezistenco pri miših (Gao idr. 2009); pri ženskah pa so ugotovili njihovo negativno povezavo z in- deksom telesne mase, s telesno maso in z obsegom pasu (Gao idr. 2020). Po intervenciji s peščenim smiljem smo opazili nižjo zastopanost rodov Lachnospiraceae UCG-010, Blautia in Ruminococcaceae Incertae sedis. Čeprav bakterije iz družine Lachnospiraceae proizvajajo kratkoverižne maščobne kisline, ki so ugodne za naše zdravje, so bili različni rodovi povezani z različnimi prebavnimi in drugimi boleznimi. Znano je, da rod Blautia spodbuja izločanje provnetnih citokinov v gostiteljskih celicah (Tuovinen idr. 2013) in je povezan z dolgoverižnimi triacilgliceroli, mo- teno presnovo glukoze ter s sladkorno boleznijo tipa 1 (Kostic idr. 2015). Nižjo zastopanost rodu Blautia so opazili tudi po intervenciji z izvlečkom iz črnega čaja in rdečega vina v črevesnem ekosistemu in vitro (Kemper- man idr. 2013). Bakterije iz družine Lachnospiraceae (predvsem Blautia) in bakterije iz rodu Ruminococcaceae Incertae sedis imajo ključno vlo- go pri presnovi neprebavljivih ogljikovih hidratov (Costabile idr. 2017). Čeprav ima produkcija kratkoverižnih maščobnih kislin koristne učinke (Koh idr. 2016), pa višji vnos ogljikovih hidratov prispeva k višjemu ener- gijskemu vnosu in vpliva na serumske ravni glukoze na tešče. Poleg tega smo po intervenciji s peščenim smiljem opazili tudi nižjo zastopanost 207 Katja Kranjc in Karin Šik Novak rodov Christensenellaceae R-7 in Faecalibacterium, ki naj bi imela ugodne učinke na gostitelja, kar bi lahko pojasnilo močnejši protivnetni učinek po intervenciji z laškim smiljem v primerjavi s peščenim smiljem. Rod Faecalibacterium je ključen pri produkciji protivnetnih spojin (Lopez-Si- les idr. 2017; Quévrain idr. 2016) in njegova zastopanost je znižana pri različnih vnetnih boleznih (Walters idr. 2014). Negativna povezava med rodom Christensenellaceae in indeksom telesne mase pa je bila prepoz- nana kot kazalnik pomembne povezave med črevesnim mikrobiomom in presnovnimi boleznimi (Lozano idr. 2022). Zmanjšana zastopanost bakterijskih rodov, ki proizvajajo protivnetno kratkoverižno maščobno kislino butirat, bi lahko oslabila integriteto črevesne stene. Intervencija s peščenim smiljem ni imela učinka na se- rum ske ravni zonulina in njegovi učinki na vnetne biooznačevalce so bili šibkejši v primerjavi z laškim smiljem, verjetno zaradi pomembnejšega znižanja relativne zastopanosti specifičnih rodov iz debla Firmicutes, ki proizvajajo kratkoverižne maščobne kisline. Po drugi strani pa se je zastopanost rodov Prevotella 9 in Parabacteroides po intervenciji s pe- ščenim smiljem povišala, a razlika ni bila statistično značilna. Bakterije iz vrste Prevotella so bile pozitivno povezane s produkcijo kratkoverižne maščobne kisline propionata, ki ima pomembno vlogo pri znižanju seru- mskega holesterola in vpliva na zmanjšano jetrno lipogenezo (Chambers idr. 2015); nižje ravni triacilglicerolov in jetrnih encimov po intervenciji s peščenim smiljem smo opazili tudi v klinični raziskavi. Spremembe v se- stavi črevesne mikrobne združbe, ki jih je nemogoče označiti le kot dobre ali slabe, poudarjajo kompleksnost črevesnega mikrobioma. Poleg tega je bil učinek na črevesno mikrobno združbo po intervenciji relativno skro- men, kar je pričakovano glede na veliko variabilnost med posamezniki in glede na kratko trajanje intervencije. Zaključek Za zaključek lahko povzamemo, da se je protimikrobna učinkovitost pripravkov iz laškega smilja pokazala v zvezi s širokim spektrom mikro- organizmov, vključno z na antibiotike odpornimi bakterijami. Poleg ete- ričnega olja protimikrobni potencial izkazujejo tudi alkoholni izvlečki, hidrolat in posamezne bioaktivne učinkovine. Raziskave nakazujejo tudi koristi laškega smilja v kmetijsko-živilskem sektorju, kjer se uporablja kot začimba in lahko hkrati služi kot naravni konzervans. Kljub obetavnim rezultatom pa je primerljivost med raziskavami otežena zaradi variabil- nosti v kemijski sestavi in metodologiji testiranja končnega produkta ter 208 Interakcije laškega smilja z mikroorganizmi tudi v izbiri testnega mikroorganizma. Poleg protimikrobnega učinka imajo poparki laškega in peščenega smilja učinek na sestavo črevesne mikrobne združbe ter delujejo kot prebiotiki. Njuni učinki na regulacijo telesne mase bi bili lahko tesno povezani z njunim učinkom na črevesno mikrobno združbo, a v zvezi s tem je potrebnih več dolgoročnih raziskav. Viri Aćimović, M., J. Ljujić, J. Vulić idr. 2021. »Helichrysum italicum (Roth) G. Don Essential Oil from Serbia: Chemical Composition, Classification and Bi-ological Activity; May It Be a Suitable New Crop for Serbia?« Agronomy 11 (7): 1282. Andrews, J. M. 2001. »Determination of Minimum Inhibitory Concentra- tions.« Journal of Antimicrobial Chemotherapy 48 (1): 5–16. Appendino, G., M. Ottino, N. Marquez idr. 2007. »Arzanol, an Anti-Inflamma- tory and Anti-HIV-1 Phloroglucinol α-Pyrone from Helichrysum itali-cum ssp. microphyllum.« Journal of Natural Products 70 (4): 608–612. Balázs, V. L., R. Filep, F. Répás idr. 2022. »Immortelle (Helichrysum italicum (Roth) G. Don) Essential Oil Showed Antibacterial and Biofilm Inhibi-tory Activity Against Respiratory Tract Pathogens.« Molecules 27 (17): 5518. Balouiri, M., M. Sadiki in S. Koraichi Ibnsouda. 2016. »Methods for in vitro Evaluating Antimicrobial Activity: A Review.« Journal of Pharmaceutical Analysis 6 (2): 71–79. Bezek, K., K. Kramberger in D. Barlič-Maganja. 2022. »Antioxidant and Anti- microbial Properties of Helichrysum italicum (Roth) G. Don Hydrosol.« Antibiotics 11 (8): 1017. Candela, M., S. Maccaferri, S. Turroni, P. Carnevali in P. Brigidi. 2010. »Fun- ctional Intestinal Microbiome, New Frontiers in Prebiotic Design.« In-ternational Journal of Food Microbiology 140 (2): 93–101. Chambers, E. S., A. Viardot, A. Psichas idr. 2015. »Effects of Targeted Deli- very of Propionate to the Human Colon on Appetite Regulation, Body Weight Maintenance and Adiposity in Overweight Adults.« Gut 64 (11): 1744–1754. Conti, B., A. Canale, A. Bertoli, F. Gozzini in L. Pistelli. 2010. »Essential Oil Composition and Larvicidal Activity of Six Mediterranean Aromatic Plants Against the Mosquito Aedes Albopictus (Diptera: Culicidae).« Parasitology Research 107 (6): 1455–1461. Costabile, A., T. Bergillos-Meca, P. Rasinkangas, K. Korpela, W. M. de Vos in G. R. Gibson. 2017. »Effects of Soluble Corn Fiber Alone or in Synbiotic Combination with Lactobacillus rhamnosus GG and the Pilus-Deficient 209 Katja Kranjc in Karin Šik Novak Derivative GG-PB12 on Fecal Microbiota, Metabolism, and Markers of Immune Function: A Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled, Crossover Study in Healthy Elderly (Saimes Study).« Frontiers in Immu- nology 8:1443. Cui, H., W. Li, C. Li in L. Lin. 2016. »Synergistic Effect Between Helichrysum italicum Essential Oil and Cold Nitrogen Plasma Against Staphylococcus aureus Biofilms on Different Food-Contact Surfaces.« International Jou- rnal of Food Science and Technology 51 (11): 2493–2501. D’Abrosca, B., E. Buommino, P. Caputo idr. 2016. »Phytochemical Study of Helichrysum italicum (Roth) G. Don: Spectroscopic Elucidation of Unu- sual Amino-Phlorogucinols and Antimicrobial Assessment of Secon- dary Metabolites from Medium-Polar Extract.« Phytochemistry 132 (5): 86–94. D’Abrosca, B., E. Buommino, G. D’Angelo idr. 2013. »Spectroscopic Identifi- cation and Anti-Biofilm Properties of Polar Metabolites from the Medi- cinal Plant H. Italicum against Pseudomonas Aeruginosa.« Bioorganic and Medicinal Chemistry 21 (22): 7038–46. Djihane, B., N. Wafa, S. Elkhamssa, J. P. De Haro, M. Angeles Esteban in M. M. Zerroug. 2017. »Chemical Constituents of Helichrysum italicum (Roth) G. Don Essential Oil and Their Antimicrobial Activity Against Gram-Po- sitive and Gram-Negative Bacteria, Filamentous Fungi and Candida Al- bicans.« Saudi Pharmaceutical Journal 25 (5): 780–787. Fraga, C. G., K. D. Croft, D. O. Kennedy in F. A. Tomás-Barberán. 2019. »The Effects of Polyphenols and Other Bioactives on Human Health.« Food and Function 10 (2): 514–528. Gao, B., M. Zhong, Q. Shen idr. 2020. »Gut Microbiota in Early Pregnancy Among Women with Hyperglycaemia vs. Normal Blood Glucose.« BMC Pregnancy and Childbirth 20 (1): 284. Gao, Z, J. Yin, J. Zhang idr. 2009. »Butyrate Improves Insulin Sensitivity and Increases Energy Expenditure in Mice.« Diabetes 58 (7): 1509–1517. Genčić, M. S., J. M. Aksić, M. Z. Živković Stošić idr. 2021. »Linking the Antimi- crobial and Anti-Inflammatory Effects of Immortelle Essential Oil with Its Chemical Composition: The Interplay Between the Major and Minor Constituents.« Food and Chemical Toxicology 158:112666. Gomez-Arango, L. F., H. L. Barrett, H. D. McIntyre idr. 2016. »Connections Between the Gut Microbiome and Metabolic Hormones in Early Preg- nancy in Overweight and Obese Women.« Diabetes 65 (8): 2214–2223. Harrison, C. A., D. Laubitz, C. L. Ohland idr. 2018. »Microbial Dysbiosis As- sociated with Impaired Intestinal Na+/H+ Exchange Accelerates and Exacerbates Colitis in Ex-Germ Free Mice.« Mucosal Immunology 11 (5): 1329–1341. 210 Interakcije laškega smilja z mikroorganizmi Kemperman, R. A., G. Gross, S. Mondot idr. 2013. »Impact of Polyphenols from Black Tea and Red Wine/Grape Juice on a Gut Model Microbio-me.« Food Research International 53 (2): 659–669. Klimenko, N. S., A. V. Tyakht, A. S. Popenko idr. 2018. »Microbiome Respon- ses to an Uncontrolled Short-Term Diet Intervention in the Frame of the Citizen Science Project.« Nutrients 10 (5): 576. Koh, A., F. De Vadder, P. Kovatcheva-Datchary in F. Bäckhed. 2016. »From Di- etary Fiber to Host Physiology: Short-Chain Fatty Acids as Key Bacterial Metabolites.« Cell 165 (6): 1332–1345. Koliada, A., G. Syzenko, V. Moseiko idr. 2017. »Association Between Body Mass Index and Firmicutes/Bacteroidetes Ratio in an Adult Ukrainian Population.« BMC Microbiology 17 (1): 120. Kostic, A. D., D.Gevers, H. Siljander idr. 2015. »The Dynamics of the Human Infant Gut Microbiome in Development and in Progression Toward Type 1 Diabetes.« Cell Host and Microbe 17 (2): 260–273. Kramberger, K., K. Bezek Kranjc, Z. Jenko Pražnikar, D. Barlič-Maganja in S. Kenig. 2024. »Protective Capacity of Helichrysum italicum Infusion Against Intestinal Barrier Disruption and Translocation of Salmonella Infantis.« Pharmaceuticals 17 (10): 1398. Le Chatelier, E., T. Nielsen, J. Qin idr. 2013. »Richness of Human Gut Micro- biome Correlates with Metabolic Markers.« Nature 500 (7464): 541–546. Lopez-Siles, M., S. H Duncan, L. J. Garcia-Gil in M. Martinez-Medina. 2017. »Faecalibacterium Prausnitzii: From Microbiology to Diagnostics and Prognostics.« The ISME Journal 11 (4): 841–852. Lozano, C. P, L. R. Wilkens, Y. B. Shvetsov idr. 2022. »Associations of the Di- etary Inflammatory Index with Total Adiposity and Ectopic Fat Through the Gut Microbiota, LPS, and C-Reactive Protein in the Multiethnic Co-hort-Adiposity Phenotype Study.« American Journal of Clinical Nutriti-on 115 (5): 1344–1356. Lyu, M., Y.-F. Wang, G.-W. Fan, X.-Y. Wang, S.-Y. Xu in Y. Zhu. 2017. »Balancing Herbal Medicine and Functional Food for Prevention and Treatment of Cardiometabolic Diseases Through Modulating Gut Microbiota.« Fron-tiers in Microbiology 8:2146. Mastelic, J., O. Politeo, I. Jerkovic in N. Radosevic. 2005. »Composition and Antimicrobial Activity of Helichrysum italicum Essential Oil and Its Terpene and Terpenoid Fractions.« Chemistry of Natural Compounds 41 (1): 35–40. Moeller, A. H., T. A. Suzuki, M. Phifer-Rixey in M. W. Nachman. 2018. »Tran- smission Modes of the Mammalian Gut Microbiota.« Science 362 (6413): 453–457. 211 Katja Kranjc in Karin Šik Novak Mollova, S., H. Fidan, D. Antonova idr. 2020. »Chemical Composition and Antimicrobial and Antioxidant Activity of Helichrysum italicum (Roth) G. Don Subspecies Essential Oils.« Turkish Journal of Agriculture and Forestry 44 (4): 371–378. Nostro, A., M. A. Cannatelli, G. Crisafi, A. D. Musolino, F. Procopio in V. Alonzo. 2004. »Modifications of Hydrophobicity, in vitro Adherence and Cellular Aggregation of Streptococcus mutans by Helichrysum italicum Extract.« Letters in Applied Microbiology 38 (5): 423–427. Nostro, A., G. Bisignano, M. A. Cannatelli, G. Crisafi, M. P. Germanò in V. Alonzo. 2001. »Effects of Helichrysum italicum Extract on Growth and Enzymatic Activity of Staphylococcus Aureus.« International Journal of Antimicrobial Agents 17 (6): 517–520. Nostro, A., M. A. Cannatelli, A. Marino idr. 2003. »Evaluation of Antiherpesvi- rus-1 and Genotoxic Activities of Helichrysum italicum Extract.« The New Microbiologica 26 (1): 125–128. Pataky, Z., L. Genton, L. Spahr idr. 2016. »Impact of Hypocaloric Hyperpro- teic Diet on Gut Microbiota in Overweight or Obese Patients with Non- alcoholic Fatty Liver Disease: A Pilot Study.« Digestive Diseases and Sci- ences 61 (9): 2721–2731. Petelin, A., K. Šik Novak, M. Hladnik idr. 2022. »Helichrysum italicum (Roth) G. Don and Helichrysum arenarium (L.) Moench Infusion Consumption Affects the Inflammatory Status and the Composition of Human Gut Mi- crobiota in Patients with Traits of Metabolic Syndrome: A Randomized Comparative Study.« Foods 11 (20): 3277. Petrović, L., M. Skorić, B. Šiler idr. 2024. »Patterns of Genetic Variation of Ne- peta Nuda L. from the Central Balkans: Understanding Drivers of Che- mical Diversity.« Plants 13 (11): 1483. Pirvu, L., C. Hlevca, I. Nicu in C. Bubueanu. 2014. »Comparative Studies on Analytical, Antioxidant, and Antimicrobial Activities of a Series of Ve- getal Extracts Prepared from Eight Plant Species Growing in Romania.« Journal of Planar Chromatography 27 (5): 346–356. Plamada, D., in D. C. Vodnar. 2021. »Polyphenols-Gut Microbiota Interrela- tionship: A Transition to a New Generation of Prebiotics.« Nutrients 14 (1): 137. Quévrain, E., M. A. Maubert, C. Michon idr. 2016. »Identification of an Anti- -Inflammatory Protein from Faecalibacterium Prausnitzii, a Commen- sal Bacterium Deficient in Crohn’s Disease.« Gut 65 (3): 415–425. Rastmanesh, R. 2011. »High Polyphenol, Low Probiotic Diet for Weight Loss Because of Intestinal Microbiota Interaction.« Chemico-Biological Inte- ractions 189 (1–2). https://doi.org/10.1016/j.cbi.2010.10.002. 212 Interakcije laškega smilja z mikroorganizmi Rizzatti, G., L. R. Lopetuso, G. Gibiino, C. Binda in A. Gasbarrini. 2017. »Pro- teobacteria: A Common Factor in Human Diseases.« BioMed Research International 2017:9351507. Salvucci, E. 2016. »Microbiome, Holobiont and the Net of Life.« Critical Revi- ews in Microbiology 42 (3): 485–494. Servi, E. Y., and H. Servi. 2022. »Chemical Composition and Antibacterial Activity of Helichrysum arenarium (Roth) G. Don Commercial Essential Oil from Serbia.« Natural Products and Biotechnology 2 (1): 14–22. Simões, M., R. N. Bennett in E. A. S. Rosa. 2009. »Understanding Antimicro- bial Activities of Phytochemicals against Multidrug Resistant Bacteria and Biofilms.« Natural Product Reports 26 (6): 746–757. Sung, M. M., T. T. Kim, E. Denou idr. 2017. »Improved Glucose Homeostasis in Obese Mice Treated with Resveratrol is Associated with Alterations in the Gut Microbiome.« Diabetes 66 (2): 418–425. Šovljanski, O., M. Aćimović, A. Tomić idr. 2024. »Antibacterial and Antifun- gal Potential of Helichrysum arenarium (Roth) G. Don Essential Oil.« Antibiotics 13 (8): 722. Taglialatela-Scafati, O., F. Pollastro, G. Chianese idr. 2013. »Antimicrobial Phenolics and Unusual Glycerides from Helichrysum italicum subsp. microphyllum.« Journal of Natural Products 76 (3): 346–353. Tundis, R., G. A. Statti, F. Conforti idr. 2005. »Influence of Environmental Fa- ctors on Composition of Volatile Constituents and Biological Activity of Helichrysum arenarium (Roth) Don (Asteraceae).« Natural Product Re-search 19 (4): 379–387. Tuovinen, E., J. Keto, J. Nikkilä, J. Mättö in K. Lähteenmäki. 2013. »Cytokine Response of Human Mononuclear Cells Induced by Intestinal Clostri-dium Species.« Anaerobe 19:70–76. Walters, W. A., Z. Xu in R. Knight. 2014. »Meta-Analyses of Human Gut Mi- crobes Associated with Obesity and IBD.« FEBS Letters 588 (22): 4223– 4233. W ęglarz, Z., O. Kosakowska, E. Pióro-Jabrucka idr. 2022. »Antioxidant and Antibacterial Activity of Helichrysum italicum (Roth) G. Don. from Cen-tral Europe.« Pharmaceuticals 15 (6): 735. Wu, G. D., J. Chen, C.Hoffmann idr. 2011. »Linking Long-Term Dietary Pa- tterns with Gut Microbial Enterotypes.« Science 334 (6052): 105–108. Zeremski, T., O. Šovljanski, V. Vukić idr. 2024. »Combination of Chromato- graphic Analysis and Chemometric Methods with Bioactivity Evalua-tion of the Antibacterial Properties of Helichrysum italicum Essential Oil.« Antibiotics 13 (6): 499. 213 Katja Kranjc in Karin Šik Novak Zheljazkov, V. D., I. Semerdjieva, E. Yankova-Tsvetkova idr. 2022. »Chemical Profile and Antimicrobial Activity of the Essential Oils of Helichrysum arenarium (L.) Moench. and Helichrysum italicum (Roth.) G. Don.« Plants 11 (7): 951. Zmora, N., J. Suez in E. Elinav. 2019. »You Are What You Eat: Diet, Health and the Gut Microbiota.« Nature Reviews: Gastroenterology and Hepatology 16 (1): 35–56. 214 13 Učinki laškega smilja na presnovo Zala Jenko Pražnikar Ana Petelin Fakulteta za vede o zdravju, Fakulteta za vede o zdravju, Univerza na Primorskem Univerza na Primorskem © 2025 Zala Jenko Pražnikar in Ana Petelin https://doi.org/10.26493/978-961-293-525-2.13 Uvod Debelost je velik javnozdravstveni problem, pomembno vpliva na kako- vost življenja, skrajšuje življenjsko dobo in zvišuje tveganje za obolev- nost. Še posebej zaskrbljujoče je, da se je pandemija debelosti v zadnjem desetletju močno razmahnila in doživela nadaljnjo rast ter poslabšanje po pandemiji covida-19 (Gammone in D’Orazio 2021). Debelost, zlasti visceralna debelost, negativno vpliva na skoraj vse fiziološke funkcije te- lesa, kar vodi do povečanega tveganja za razvoj sladkorne bolezni tipa 2, dislipidemije, srčno-žilnih bolezni, različnih vrst raka, mišično-skeletnih obolenj, nealkoholne maščobne bolezni jeter in presnovnega sindroma (Khanna idr. 2022). Zdravljenje debelosti ni enostavno, ključni so multidisciplinaren pristop in spremembe na različnih področjih življenja. A sprememba življenj- skega sloga od posameznika zahteva disciplino, saj gre za dolgotrajen proces, in zato velika večina posameznikov z debelostjo obupa. Posledič- no raziskovalci iščemo različne alternativne strategije, ki bi proces izgube telesne mase pospešile, povečale motivacijo posameznikov z debelostjo in bile hkrati varne. Farmacevtska industrija sicer razvija številna zdravila za zdravljenje debelosti, a le nekaj izmed njih je odobrila Agencija za hrano in zdra- vila (Food and Drug Administration), saj so preiskovanci z debelostjo Bandelj, D., Z. Jenko Pražnikar in A. Petelin, ur. 2025. 215 Laški smilj. Založba Univerze na Primorskem Zala Jenko Pražnikar in Ana Petelin v številnih kliničnih raziskavah poročali o hudih stranskih učinkih. Odo- brena zdravila za zdravljenje debelosti so orlistat, fentermin/topiramat, naltrekson/bupropion, liraglutid, semaglutarid idr. A kljub določenim zdravilom so v zadnjem času vse bolj zaželeni naravni izvlečki z bioaktivnimi spojinami, ki imajo potencial za pospešitev izgu- be telesne mase. Zanimanje za živila in pijače z bioaktivni spojinami, ki bi lahko pripomogle k preprečevanju pridobivanja telesne mase oz. k iz- gubljanju slednje, je naraslo sorazmerno s porastom epidemije debelosti (Gregersen idr. 2009). Bioaktivne spojine v teh živilih lahko delujejo na različne biološke poti v telesu, predvsem na zaviranje apetita in hitrejše doseganje sitosti ter na pospešeno presnovo v mirovanju na račun ter- mogeneze in oksidacije maščob (Sunkara in Verghese 2014). S tega vidika je izredno zanimiv tudi laški smilj oz. čaj laškega smilja. Učinki laškega smilja na presnovo v mirovanju Učinke laškega smilja na presnovo v mirovanju smo preučevali le na UP tekom pilotne klinične raziskave (Kenig idr. 2021). Glavna ugotovitev omenjene raziskave je bila, da poparek laškega smilja spodbuja β-oksi-dacijo maščobnih kislin pri zdravih moških preiskovancih, kar je bilo dodatno potrjeno tudi v hepatocitih in vitro (Kenig idr. 2021). Dokazan akutni učinek poparka laškega smilja na povečano presnovo v mirovanju lahko pripišemo številnim bioaktivnim spojinam poparka laškega smilja, hidroksicimetnim kislinam in njihovim derivatom, derivatom arzanola in flavonoidom ter tudi njihovim sinergističnim učinkom. V dotični pilotni raziskavi smo dokazali, da že enkratno zaužitje poparka laškega smilja v primerjavi z zaužitjem vode enake količine in tempera- ture vodi do značilno večje porabe energije v mirovanju (za 4 %) in zna- čilno spodbujene β-oksidacije maščobnih kislin (za 12 %) v dveh urah po zaužitju. Omenjeni rezultat je v skladju s kliničnimi raziskavami, ki so preučevale antiobesogene učinke klorogenske kisline (Soga idr. 2013; Thom 2007; Park idr. 2017), pri čemer je treba razmejiti med kroničnim in akutnim učinkom. Za klorogensko kislino je bilo pokazano, da inhibira cAMP fosfodiesterazo, kar vodi do povečane količine cAMP in z adenozin fosfatom aktivirane protein-kinaze (AMPK), glavnega senzorja energijske presnove, kar posledično rezultira tudi v povečani β-oksidaciji maščobnih kislin (Bruckbauer in Zemel 2014). Ker je učinek poparka laškega smilja zaznan po dveh urah od samega zaužitja in ker je bila po 2,3 ure zaznana tudi najvišja koncentracija klorogenske kisline v krvnem obtoku (Monteiro idr. 2007), je predlagani mehanizem eden izmed zelo verjetnih. 216 Učinki laškega smilja na presnovo Z namenom potrditve učinkov poparka laškega smilja na presnovo lipi- dov oz. β-oksidacijo maščobnih kislin smo v nadaljevanju izvedli tudi poskuse na hepatocitih HepG2 (Kenig idr. 2021). Ugotovili smo, da je 24- urno tretiranje celic s poparkom laškega smilja povečalo izražanje genov CPT1 in CPT2 ter znižalo izražanje gena ACACA; omenjeni geni oz. njiho- vi proteinski produkti sodelujejo pri presnovi maščob. Karnitin-palmitoil transferaze (CPT) imajo ključno vlogo pri prenosu aktiviranih maščobnih kislin v matriks mitohondrija, kjer v nadaljevanju poteka oksidacija maš- čobnih kislin, ACACA pa je pomemben protein, ki nadzira hitrost sinteze malonil-CoA, negativnega regulatorja β-oksidacije. Torej, poparek laške-ga smilja na eni strani vpliva na povečano oksidacijo maščobnih kislin preko proteinov CPT, na drugi strani pa na zmanjšano tvorbo proteina ACACA, kar posledično vodi do zmanjšanja količine malonil-CoA, kar v končni fazi spet spodbudi oksidacijo maščobnih kislin. Kljub različnim mehanizmom je viden ugoden učinek uživanja poparka laškega smilja na presnovo maščobnih kislin, predvsem na β-oksidacijo maščobnih kislin. Učinek poparka laškega smilja na β-oksidacijo maščobnih kislin je bil dodatno potrjen tekom analize transkriptoma primarnih črevesnih ce- lic (Kramberger idr. 2021). Izpostaviti velja, da je poparek laškega smil ja vplival na povečano izražanje gena LRPRC, pri čemer so Shi Lei idr. (2016) pokazali, da protein LRPRC spodbuja privzem palmitata in njegovo oksi- dacijo v hepatocitih miši, torej pospešuje β-oksidacijo (Lei idr. 2016). Po-leg tega je bilo povečano izražanje po tretiranju celic s poparkom laškega smilja zaznano tudi za gen LIPA, ki kodira lipazo A, encim, ki hidrolizira holesterolne estre in triacilglicerole v lizosomih. Torej, tudi v primarnih črevesnih celicah so se po tretmaju s poparkom laškega smil ja začeli v večji meri izražati geni, ki so aktivirali procese, ki v splošnem spodbujajo presnovo maščob in tudi β-oksidacijo maščobnih kislin. Na podlagi zapisanega lahko ugotovimo, da so učinki poparka laškega smilja z vidika pospešitve presnove, predvsem presnove maščob, zani- mivi tako z vidika akutnosti kot z vidika dolgoročne uporabe, pri čemer je opazno tkivno specifično delovanje. Učinki laškega smilja na antropometrične parametre in na krvni tlak Kliničnih raziskav, ki bi preučevale učinke laškega smilja (izvlečka ali po- parka celotne rastline) na antropometrične meritve in krvni tlak, je malo, je pa v nasprotju s tem več kliničnih raziskav, ki so preučevale njegove po- samezne izolirane bioaktivne spojine. Do sedaj edina klinična raziskava, 217 Zala Jenko Pražnikar in Ana Petelin ki je preučevala učinke poparka laškega smilja na antropometrične para- metre in krvni tlak, je raziskava Saše Kenig idr. (2022), v kateri so udele- ženci v štiritedenski intervenciji poleg svojih običajnih prehranjevalnih navad uživali še 2 dcl poparka čaja iz laškega smilja. Rezultati klinič- ne raziskave so pokazali, da se preiskovancem po končani intervenciji zmanjšajo telesna masa, indeks telesne mase (ITM), odstotek maščob- ne mase v telesu ter stopnja visceralne debelosti (Kenig idr. 2022). Vse te učinke lahko pripišemo dejstvu, da poparek laškega smilja spodbuja β-oksidacijo maščobnih kislin, kar je bilo pokazano tudi v akutni pilotni raziskavi pri zdravih moških preiskovancih in dodatno potrjeno tudi v hepatocitih in vitro (Kenig idr. 2021) ter razloženo v predhodnem pog- lavju. Rezultati so tudi v skladu z učinki posameznih bioaktivnih spo- jin, ki so zastopane v laškem smilju. Ena takih je klorogenska kislina. V raziskavi, kjer so posamezniki s prekomerno telesno maso in debelostjo uživali kavo, obogateno s klorogensko kislino, so v primerjavi s posa- mezniki, ki so uživali instant kavo, izgubili več telesne mase in maščob v telesu (Thom 2007). Podobno so pokazali tudi Wakatabe idr. (2019) v svoji raziskavi, kjer so se preiskovancem s prekomerno telesno maso, ki so tri mesece uživali kavo iz zelenih kavnih zrn, obogateno s klorogensko kislino, statistično značilno zmanjšali telesna masa, obseg pasu in stop- nja visceralne maščobe v primerjavi s kontrolno skupino (Watanabe idr. 2019). V raziskavi Raquel Revuelta-Iniesta in Emada Al-Dujailija (2014) pa se je posameznikom, ki so dva tedna uživali črno kavo, obogateno s klorogensko kislino, poleg ITM in abdominalne maščobe izboljšal tudi sistolični krvni tlak v primerjavi s posamezniki, ki so uživali samo črno kavo (Revuelta-Iniesta in Al-Dujaili 2014). Poleg klorogenske kisline naj omenimo še ostale bioaktivne spojine, ki so med bolj zastopanimi v laškem smilju, te so kvercetin, miricetin, na- ringenin in kemferol. Osemtedenska intervencija z uživanjem 150 mg kvercetina je učinkovala na zmanjšanje obsega pasu, ne pa na ITM pri zdravih moških z različnimi genotipi ApoE (Pfeuffer idr. 2013). Nadalje je raziskava na db/db miših s pomanjkanjem leptinskih receptorjev, ki so jih 14 tednov hranili z miricetinom (400 mg/kg), pokazala, da se je miškam po intervenciji zmanjšala telesna masa (Hu idr. 2018). Podob- ne učinke na izgubo telesne mase je imelo tudi 40-dnevno dodajanje kemferola (0,5 mg/kg/dan) miškam z debelostjo (Romero-Juárez idr. 2023). 218 Učinki laškega smilja na presnovo Učinki laškega smilja na presnovo glukoze oz. na glukostazo Številne raziskave so dokazale inhibitoren učinek fenolnih spojin na α-a-milazo, na encim prebavnega sistema (Shodehinde idr. 2015) in s tem povezano upočasnitev presnove ogljikovih hidratov ter zmanjšano ab- sorpcijo monosaharidov. Zdravstveni učinki fenolnih spojin v povezavi z inhibicijo α-amilaze v črevesnem traktu so torej povezani z zmanjša-njem absorpcije glukoze (in tudi drugih monosaharidov), izboljšanjem razmerja med glukozo in inzulinom itd. Inhibitorni učinek na α-amila-zo lahko pripišemo tudi izvlečkom laškega smilja, saj so de la Garza idr. (2013) dokazali, da je metanolni izvleček laškega smilja znižal vrednos- ti glukoze v krvi na tešče po obroku ter izboljšal hiperinzulinemijo na živalskem modelu na inzulin odpornih podgan (de la Garza idr. 2013). Raziskovalci so nedvomno potrdili antidiabetične učinke metanolnega izvlečka in vivo. Poleg tega je metanolni izvleček laškega smilja inhibi- ral aktivnost encimov α-amilaze in α-glukozidaze in vitro, znižal pa je tudi presnovo maltoze in zavrl privzem metilglukozida preko receptor- ja SGLT1 v celicah Caco-2. Podobno so potrdili tudi Sandra Gonçalves idr. (2017) za metanolni izvleček H. italicum ter Catarina Guerreiro Pe- reira idr. (2017) za vodne izvlečke (poparke in prevretke) cvetov H. ita- licum subsp. picardii (Gonçalves idr. 2017; Guerreiro Pereira idr. 2017). V obeh primerih so raziskovalci zaznali inhibitorno delovanje izvlečkov laškega smilja na α-glukozidazo. Na podlagi navedenih raziskav lahko ugotovimo, da imajo metanolni in vodni izvlečki (poparki in prevretki) laškega smilja spodbudno antidiabe- tično delovanje, in bi uživanje poparkov laškega smilja lahko priporočili tako posamzenikom s sladkorno boleznijo kot tistim s prekomerno teles- no maso, z debelostjo ali presnovnim sindromom. Kljub zelo spodbudnim rezultatom raziskav in vitro ter in vivo pa značilno pomembnega učinka poparka laškega smilja na serumske vrednosti glukoze pri posameznikih s prekomerno telesno maso ni bilo zaznati v klinični raziskavi (Kenig idr. 2022). Bistveno večji učinek na serumske koncentracije glukoze je imel pe- ščeni smilj (Kenig idr. 2022). Izpostaviti velja, da rezultati raziskav in vitro ter in vivo niso vedno ponovljivi tekom klinične raziskave, saj imamo v re- alnem sistemu bistveno več dejavnikov, ki lahko vplivajo na končni rezul- tat, in te dejavnike tudi bistveno težje nadziramo. Poleg tega so lahko rezul- tati različni, če preučujemo poparek laškega smilja na osebah s sladkorno boleznijo ali asimptomatskih osebah z ravnmi serumske glukoze znotraj referenčnih vrednosti. 219 Zala Jenko Pražnikar in Ana Petelin Učinki laškega smilja na lipidni profil Podobno kot na α-amilazo številne fenolne spojine inhibitorno deluje-jo tudi na lipaze, encime, ki razgrajujejo triacilglicerole, in na tak način vplivajo na zakasnelo/zmanjšano absorpcijo maščob ter posledično na ugodnejši lipidni profil v serumu (de la Garza idr. 2011). Izvedenih je bilo veliko raziskav in vitro, kjer so raziskovalci za številne fenolne spojine do- kazali inhibitorno delovanje na lipaze. Omeniti velja tudi klorogensko ter kavno kislino, zelo zastopani bioaktivni spojini v metanolnih in vodnih izvlečkih laškega smilja (Raghavendra idr. 2007). Kot je bilo že predhodno povedano, je analiza transkriptoma primar- nih črevesnih celic po tretmaju s poparkom laškega smilja pokazala na spremenjeno izražanje številnih genov, ki imajo pomembno vlogo pri presnovi lipidov (Kramberger idr. 2022). Izpostavljeno je bilo poveča- no izražanje gena LRPRC, ki nosi zapis za protein LRPRC, ki spodbuja privzem palmitata in njegovo oksidacijo v hepatocitih miši. Predhodno je bilo omenjeno tudi povečano izražanje gena LIPA po tretmaju s po- parkom laškega smilja. Gen kodira lipazo A, encim, ki hidrolizira hole- sterolne estre in triacilglicerole v lizosomih. Povečana izraženost je bila zaznana tudi za gen ABCA12, ki kodira transporter ATP-vezavne kasete in je udeležen v transportu lipidov ter homeostazi holesterola. Na dru- gi strani pa sta bila gena PRKAR1A in ANXA6 med najzavrtejšimi geni po tretiran ju celic s poparkom laškega smilja, če primerjamo izraženost genov s kontrolnimi, netretiranimi celicami. Gen PRKAR1A kodira re- gulatorno podenoto tipa 1α od cAMP-odvisne protein-kinaze, ki inhi-bira kinazno aktivnost katalitske podenote encima (Bossis in Stratakis 2004). Aneksin A6 (ANXA6) je protein za vezavo lipidov, ki je močno izražen v jetrih, kjer regulira homeostazo holesterola in signalnih poti, pomembnih za fiziologijo jeter (Meier idr. 2016). Laia Cubells idr. (2007) so pokazali, da povišano izražanje proteina ANXA6 povzroči sekvestra- cijo in znižan izvoz holesterola iz poznih endosomov (Cubells idr. 2007). Kopičenje holesterola v lizosomih je pomembna tarča za preprečeva- nje presnovnih bolezni, za katere je značilen vnetni odziv, kar nakazuje, da bi bilo uživanje izvlečkov iz smilja lahko koristno tudi s tega vidika (Hendrikx idr. 2014). Torej, če povzamemo glavne ugotovitve omenjene raziskave in vitro, lahko zatrdimo, da ima poparek laškega smilja po- membno vlogo pri presnovi in regulaciji homeostaze maščobnih kislin ter holesterola. 220 Učinki laškega smilja na presnovo Hepatoprotektivni učinki laškega smilja Hepatoprotektivni učinek laškega smilja smo pokazali v raziskavi Saše Kenig idr. (2022), kjer je prišlo do znižanja serumskih koncentracij je- trnih encimov AST in ALT (Kenig idr. 2022). Med posameznimi bioak- tivnimi spojinami, zastopanimi v laškem smilju, so raziskovalci Fatemeh Naeini idr. (2021) preučevali hepatoprotektiven učinek naringenina ter kvercetina pri posameznikih z nealkoholno maščobno jetrno boleznijo. Enomesečno dodajanje 100 mg narigenina na dan se je pokazalo kot ko- ristno za zdravljenje nealkoholne maščobne jetrne bolezni preko vpliva na energijsko ravnovesje, presnovo glukoze in lipidov, oksidativni stres ter vnetje preko različnih mehanizmov (Naeini idr. 2021). Podobno so ugotovili tudi Zahra Namkhah idr. (2021), katerih ugotovitve so pokazale, da enomesečni dnevni vnos 200 mg naringenina (zjutraj in zvečer po 100 mg) ugodno vpliva na lipidni profil in stopnjo zamaščenosti jeter, čeprav se serumske vrednosti jetrnih encimov AST in ALT niso značilno znižale (Namkhah idr. 2021). Raziskava na kvarcetinu je dodatno pokazala, da trimesečno dodajanje 500 mg kvercetina posameznikom z nealkoholno maščobno jetrno boleznijo ugodno vpliva na zmanjšanje steatoze jeter (Li idr. 2024). Nadalje so raziskave na živalskih modelih pokazale, da ima tudi klorogenska kislina številne hepatoprotektivne učinke (Xue idr. 2023). Učinkovanje čaja laškega smilja - klinične raziskave Vnetje Presnova v mirovanju β-oksidacija maščobnih kislin Integriteta črevesne stene Telesna masa, indeks Ugodna črevesna telesne mase, visceralno mikrobna združba maščevje β-oksidacija maščobnih kislin Hepatoprotektivno delovanje AST, ALT Slika 1 Učinkovanje poparka laškega smilja na populaciji s presnovnim sindromom 221 Zala Jenko Pražnikar in Ana Petelin Zaključek Če povzamemo ugotovitve vseh navedenih raziskav, lahko sklepamo, da ima laški smilj velik potencial za posameznike z debelostjo, presnovnim sindromom in tudi drugimi kroničnimi obolenji. Pokazano je namreč bilo, da laški smilj učinkovito pospeši presnovo, predvsem presnovo ma- ščob, vpliva pa tako na presnovne poti maščobnih kislin kot tudi na pre- snovne poti holesterola. Poleg omenjenega kaže tudi hepatoprotektivne učinke, predvsem v nižanju serumskih koncentracij jetrnih encimov (AST in ALT), zaradi česar je koristen tudi za osebe z zamaščenostjo jeter. Nenazadnje je zanimiv tudi z vidika učinkovanja na črevesno mikrobno združbo in prepustnost črevesne stene, kar je bilo natančneje pojasnjeno v prejšnjem poglavju (slika 1). Izpostaviti velja, da rezultati raziskav na celičnih in živalskih modelih niso vedno ponovljivi tekom kliničnih raziskav, kar je bilo vidno v po- vezavi z učinkovanjem laškega smilja na homeostazo glukoze. A hkrati velja poudariti, da je izvedenih še premalo kliničnih raziskav, da bi lahko z gotovostjo trdili, da laški smilj učinkuje na glukozno homeostazo pri posameznikih z debelostjo. So pa njegovi organski izvlečki zanimivi tudi v povezavi z drugimi presnovnimi potmi. Italijanski farmakolog Benigni idr. (1962) je na podganah preučeval izvlečke cvetov smilja, pripravljene z organskim topilom v odmerku 5 mg/dan. Pokazal je, da je tak izvleček značilno podaljšal življenje podgan, ki so jim kirurško odstranili nadled- vične žleze, kar nakazuje, da ima izvleček kortizonu podobno delovanje (Benigni idr. 1962). Telesu lastni glukokortikoidi predstavljajo pomem- ben del človeške presnove in sodelujejo v celi vrsti fizioloških procesov, tudi pri uravnavanju vnetja in imunskega sistema. Vplivajo pa tudi na presnovo kosti in mišic ter uravnavajo ravnovesje mineralov in vode v telesu. Dodatno so Sandra Gonçalves idr. (2017) preučevali izvlečke laš- kega smilja na aktivnost encimov, povezanih z Alzheimerjevo boleznijo (Gonçalves idr. 2017). Raziskovalci so ugotovili, da je izvleček zaviral ace- tilholin esterazo (78,2 %) in tirozinazo (74,1 %). Torej, vidno je, da je laški smilj zanimiv z različnih zdravstvenih vidikov in potrebne so nadaljnje raziskave, da bomo natančneje razumeli tudi mehanistične poti. Viri Benigni, R., C. Capra in P. E. Cattorini. 1962. Piante medicinali: chimica far- macologia e terapia. Inverni and Della Beffa. Bossis, I., in C. A. Stratakis. 2004. »Minireview: PRKAR1A: Normal and Ab- normal Functions.« Endocrinology 145 (12): 5452–5458. 222 Učinki laškega smilja na presnovo Bruckbauer, A., in M. B. Zemel. 2014. »Synergistic Effects of Polyphenols and Methylxanthines with Leucine on AMPK/Sirtuin-Mediated Metabolism in Muscle Cells and Adipocytes.« PLoS One 9 (2): e89166. Cubells, L., S. Vilà de Muga, F. Tebar idr. 2007. »Annexin A6-Induced Alterati- ons in Cholesterol Transport and Caveolin Export from the Golgi Comp-lex.« Traffic 8 (11): 1568–1589. Gammone, M. A., in N. D’Orazio. 2021. »COVID-19 and Obesity: Overlap- ping of Two Pandemics.« Obes Facts 14 (6): 579–585. Garza, A. L. de la, F. I. Milagro, N. Boque, J. Campión in J. A. Martínez. 2011. »Natural Inhibitors of Pancreatic Lipase as New Players in Obesity Treat ment.« Planta Medica 77 (8): 773–785. Garza, A. L. de la, U. Etxeberria, M. P. Lostao idr. 2013. »Helichrysum and Grapefruit Extracts Inhibit Carbohydrate Digestion and Absorption, Improving Postprandial Glucose Levels and Hyperinsulinemia in Rats.« Journal of Agricultural and Food Chemistry 61 (49): 12012–12019. Gonçalves, S., E. Moreira, C. Grosso, P. B. Andrade, P. Valentão in A. Roma- no. 2017. »Phenolic Profile, Antioxidant Activity and Enzyme Inhibitory Activities of Extracts from Aromatic Plants Used in Mediterranean Diet.« Journal of Food Science and Technology 54 (1): 219–227. Gregersen, N. T., C. Bitz, I. Krog-Mikkelsen idr. 2009. »Effect of Moderate Intakes of Different Tea Catechins and Caffeine on Acute Measures of Energy Metabolism Under Sedentary Conditions.« British Journal of Nutrition 102 (8): 1187–1194. Guerreiro Pereira, C., L. Barreira, S. Bijttebier idr. 2017. »Chemical Profiling of Infusions and Decoctions of Helichrysum italicum subsp. picardii by UHPLC-PDA-MS and in vitro Biological Activities Comparatively with Green Tea (Camellia sinensis) and Rooibos Tisane (Aspalathus li-nearis).« Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 145 (11): 593–603. Hendrikx, T., S. M. Walenbergh, M. H. Hofker in R. Shiri-Sverdlov. 2014. »Ly- sosomal Cholesterol Accumulation: Driver on the Road to Inflammati-on during Atherosclerosis and Non-Alcoholic Steatohepatitis.« Obesity Reviews 15 (5): 424–433. Hu, T., X. Yuan, G. Wei, H. Luo, H. J. Lee in W. Jin. 2018. »Myricetin-Indu- ced Brown Adipose Tissue Activation Prevents Obesity and Insulin Re-sistance in Db/Db Mice.« European Journal of Nutrition 57 (1): 391–403. Kenig, S., K. Kramberger, A. Petelin idr. 2021. »Helichrysum italicum ssp. ita- licum Infusion Promotes Fat Oxidation in Hepatocytes and Stimulates Energy Expenditure and Fat Oxidation after Acute Ingestion in Humans: A Pilot Study.« Plants 10 (8): 1516. 223 Zala Jenko Pražnikar in Ana Petelin Kenig, S., K. Kramberger, K. Šik Novak idr. 2022. »Helichrysum italicum (Roth) G. Don and Helichrysum arenarium (L.) Moench Infusions in Re- versing the Traits of Metabolic Syndrome: A Double-Blind Randomized Comparative Trial.« Food and Function 13 (14): 7697–7706. Khanna, D., S. Khanna, P. Khanna, P. Kahar in B. M. Patel. 2022. »Obesity: A Chronic Low-Grade Inflammation and Its Markers.« Cureus 14 (2): e22711. Kramberger, K., D. Barlič-Maganja, Z. J. Pražnikar idr. 2022. »Whole Tran- scriptome Expression Array Analysis of Human Colon Fibroblasts Cul- ture Treated with Helichrysum italicum Supports Its Use in Traditional Medicine.« Journal of Ethnopharmacology 296 (1): 115505. Kramberger, K., Z. Jenko Pražnikar, A. Baruca Arbeiter idr. 2021. »A Com- parative Study of the Antioxidative Effects of Helichrysum italicum and Helichrysum arenatium Infusions.« Antioxidants 10 (3): 380. Lei, S., R. Z. Sun, D. Wang idr. 2016. »Increased Hepatic Fatty Acids Uptake and Oxidation by LRPPRC-Driven Oxidative Phosphorylation Reduces Blood Lipid Levels.« Frontiers in Physiology 7:270. Li, N., C. Cui, J. Xu, M. Mi, J. Wang in Y. Qin. 2024. »Quercetin Intervention Re- duced Hepatic Fat Deposition in Patients with Nonalcoholic Fatty Liver Disease: A Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled Crossover Clinical Trial.« American Journal of Clinical Nutrition 120 (3): 507–517. Meier, E. M., L. Rein-Fischboeck, R. Pohl idr. 2016. »Annexin A6 Protein is Downregulated in Human Hepatocellular Carcinoma.« Molecular and Cellular Biochemistry 418 (1–2): 81–90. Monteiro, M., A. Farah, D. Perrone, L. C. Trugo in C. Donangelo. 2007. »Chlo- rogenic Acid Compounds from Coffee are Differentially Absorbed and Metabolized in Humans.« Journal of Nutrition 137 (10): 2196–22201. Naeini, F., Z. Namkhah, H. Tutunchi idr. 2021. »Effects of Naringenin Supple- mentation in Overweight/Obese Patients with Non-Alcoholic Fatty Li- ver Disease: Study Protocol for a Randomized Double-Blind Clinical Trial.« Trials 22 (1): 801. Namkhah, Z., F. Naeini, S. Mahdi Rezayat, Mehdi Yaseri, S. Mansouri in M. Javad Hosseinzadeh-Attar. 2021. »Does Naringenin Supplementation Improve Lipid Profile, Severity of Hepatic Steatosis and Probability of Liver Fibrosis in Overweight/Obese Patients with NAFLD? A Randomi- sed, Double-Blind, Placebo-Controlled, Clinical Trial.« International Journal of Clinical Practice 75 (11): e14852. Park, I., R. Ochiai, H. Ogata idr. 2017. »Effects of Subacute Ingestion of Chlo- rogenic Acids on Sleep Architecture and Energy Metabolism Through Activity of the Autonomic Nervous System: A Randomised, Placebo- 224 Učinki laškega smilja na presnovo -Controlled, Double-Blinded Cross-Over Trial.« British Journal of Nutri-tion 117 (7): 979–984. Pfeuffer, M., A. Auinger, U. Bley idr. 2013. »Effect of Quercetin on Traits of the Metabolic Syndrome, Endothelial Function and Inflammation in Men with Different APOE Isoforms.« Nutrition, Metabolism and Cardiovas-cular Diseases 23 (5): 403–409. Raghavendra, M. P., P. R. Kumar in V. Prakash. 2007. »Mechanism of Inhibi- tion of Rice Bran Lipase by Polyphenols: A Case Study with Chlorogenic Acid and Caffeic Acid.« Journal of Food Science 72 (8): E412– E419. Revuelta-Iniesta, R., in E. Al-Dujaili. 2014. »Consumption of Green Coffee Re- duces Blood Pressure and Body Composition by Influencing 11β-HSD1 Enzyme Activity in Healthy Individuals: A Pilot Crossover Study Using Green and Black Coffee.« BioMed Research International: 482704. Romero-Juárez, P. A., D. B. Visco, R. Manhães-de-Castro idr. 2023. »Dietary Flavonoid Kaempferol Reduces Obesity-Associated Hypothalamic Mi-croglia Activation and Promotes Body Weight Loss in Mice with Obesi-ty.« Nutritional Neuroscience 26 (1): 25–39. Shodehinde, S. A., A. O. Ademiluyi, G. Oboh in A. A. Akindahunsi. 2015. »Contribution of Musa Paradisiaca in the Inhibition of α-Amylase, α-Glucosidase and Angiotensin-I Converting Enzyme in Streptozotocin Induced Rats.« Life Sciences 133 (2): 8–14. Soga, S., N. Ota in A. Shimotoyodome. 2013. »Stimulation of Postprandial Fat Utilization in Healthy Humans by Daily Consumption of Chlorogenic Acids.« Bioscience Biotechnology and Biochemistry 77 (8): 1633–1636. Sunkara, R., in M. Verghese. 2014. »Functional Foods for Obesity Manage- ment.« Food and Nutrition Sciences 5 (14): 1359–1369. Thom, E. 2007. »The Effect of Chlorogenic Acid Enriched Coffee on Gluco- se Absorption in Healthy Volunteers and Its Effect on Body Mass When Used Long-Term in Overweight and Obese People.« Journal of Interna-tional Medical Research 35 (6): 900–908. Watanabe, T., S. Kobayashi, T. Yamaguchi, M. Hibi, I. Fukuhara in N. Osaki. 2019. »Coffee Abundant in Chlorogenic Acids Reduces Abdominal Fat in Overweight Adults: A Randomized, Double-Blind, Controlled Trial.« Nutrients 11 (7): 1617. Xue, H., M. Wei in L. Ji. 2023. »Chlorogenic Acids: A Pharmacological Syste- matic Review on Their Hepatoprotective Effects.« Phytomedicine 118 (1): 154961. 225 14 Uporaba laškega smilja v dermatologiji Saša Kenig Fakulteta za vede o zdravju, Univerza na Primorskem © 2025 Saša Kenig https://doi.org/10.26493/978-961-293-525-2.14 Laški smilj je javnosti dobro znan predvsem kot sestavina kozmetičnih izdelkov, saj ima značilen prijeten vonj in številne ugodne učinke za kožo. Ti so poznani predvsem iz tradicionalne rabe, potrjujejo pa jih tudi znanstvene raziskave. Ena od prvih omemb rastlin iz rodu družine Heli- chrysum sega v 2. stoletje pred našim štetjem: opisana je uporaba smilja, pomešanega z medom, za lajšanje opeklin ter ugrizov strupenih živali (Scarborough 1978). Tradicionalna raba je popisana predvsem v Franciji, Španiji in Italiji, kjer so največja naravna nahajališča te rastline. Omenja se za spopadanje z različnimi kožnimi stanji, npr. hematomi in brazgoti- nami, alopecijo ter različnimi kožnimi vnetnimi stanji, pa tudi za pomoč pri celjenju ran, pri čemer je najpogosteje uporabljeno eterično olje (An- tunes Viegas idr. 2014). Prve klinične raziskave na ljudeh je izvedel itali- janski znanstvenik Leonardo Santini, ki je že okrog leta 1940 preučeval uporabnost smilja pri luskavici (Santini 1952), v zadnjih dveh desetletjih pa so bile z znanstvenimi pristopi preučene še številne druge aplikacije te rastline. Za nekatere učinke so dobro pojasnjeni tudi mehanizmi de- lovanja. Pri tem je treba upoštevati, da se lahko mehanizmi delovanja pri neposrednem nanosu na kožo ali pri zaužitju pripravkov razlikujejo. Pri uživanju se nekatere bioaktivne snovi namreč slabo absorbirajo iz čre- vesja v krvni obtok, nekatere pa v črevesju presnavlja naravno prisotna Bandelj, D., Z. Jenko Pražnikar in A. Petelin, ur. 2025. 227 Laški smilj. Založba Univerze na Primorskem Saša Kenig mikrobiota. Pri nanosu na kožo to ne velja, učinkujejo lahko vse prisotne bioaktivne spojine. Celjenje rane Med najbolje raziskanimi možnimi delovanji laškega smilja je njego- va uporabnost za pospešitev celjenja ran. Celjenje ran poteka v več fa- zah (Guyton in Hall 2011). Začne se s skrčitvijo žil, nato se tvori beli čep, sestav ljen iz trombocitov, v naslednji fazi pa se aktivira kaskada strjevanja krvi in ob sodelovanju številnih krvnih faktorjev se tvori rde- či čep. Ta faza je namenjena preprečevanju nadaljnje krvavitve. Skoraj sočasno se začne vnetna faza, v kateri na mesto rane s krvjo prispejo imunske celice, ki preprečujejo okužbe ter odstranjujejo poškodovane ali odmrle celice. Zatem se mora kožno tkivo regenerirati, kar vključuje migracijo nepoškodovanih fibroblastov, ti se namnožijo in pospešeno proizvajajo komponente zunajceličnega matriksa. Ključni komponen- ti zunajceličnega matriksa v koži sta beljakovini kolagen, ki koži daje trdnost, ter elastin, zahvaljujoč kateremu je koža elastična, od ogljiko- vih hidratov pa je pomembna hialuronska kislina, ki veže veliko vode in torej služi hidriranosti kože. V začetnih fazah celjenja je pomembna predvsem tvorba kolagena. Sledijo tudi delitev epitelijskih kožnih celic ter ustrezna razporeditev in povezovanje komponent zunajceličnega matriksa. Učinke izvlečkov na celjenje rane lahko testiramo s testi in vitro ter in vivo, pri čemer se s testi in vitro lahko preučuje posamezne faze celjen- ja. Merimo lahko npr. učinke na aktivnost posameznih modulatornih encimov; to so najpogosteje tisti, ki izgrajujejo ali razgrajujejo kompo- nente zunajceličnega matriksa. S celičnimi modeli lahko preučimo, če izvlečki delujejo na delitev celic, ki so v koži pomembne, to so fibroblas- ti, kožne epitelijske celice (keratinociti) in kožne matične celice; slednje se nahajajo na bazalni membrani, ki razmejuje epitelijsko plast (epi- dermis) in vezivno plast kože (dermis). Testiramo lahko tudi migracij- sko sposobnost različnih kožnih celic. Za preučevanje podrobnejšega mehanizma delovanja lahko z metodo PCR ali ELISA merimo izražanje posamez nih celičnih beljakovin ali pripadajočih molekul mRNA, npr. encimov, ki sodelujejo pri tvorbi kolagena, elastina in hialuronske ki- sline, samih komponent zunajceličnega matriksa, različnih rastnih fak- torjev, ki spodbujajo celično delitev, ter vnetnih faktorjev. Ker je celjenje rane komplek sen proces, je dejanski učinek na celjenje mogoče izmeriti le in vivo, na ljudeh ali živalskih modelih. Učinek na kaskado strjevanja 228 Uporaba laškega smilja v dermatologiji krvi lahko določimo tako, da odvzamemo krvni vzorec, ga pomešamo z izvlečki ter merimo čas strjevanja krvi ali protrombinski čas. Raziskave in vitro Pri vrednotenju delovanja laškega smilja na posamezne faze celjenja se je pokazalo, da eterično olje zavira encimsko aktivnost kolagenaze in elastaze (Fraternale idr. 2019). Ta učinek je mogoče pripisati limonenu in α-pinenu, saj sta ti dve spojini, v enaki koncentraciji, kot je prisotna v izvlečku, izkazali podobno zaviranje encimske aktivnosti, takega učinka pa ni bilo mogoče ugotoviti za nerol, neril acetat ali linalool. V zanimivi raziskavi so Carmen Gaidau idr. (2023) pripravili nanovlakna iz ribjih lusk – te vsebujejo podobne komponente zunajceličnega matrik- sa kot človeška koža –, nanje pa so nanesli EDTA, eterično olje smilja ali sivke. Nanovlakna s smiljem so najmočneje pospešila migracijo fib- roblastov, prav tako pa je naneseno olje delovalo izrazito protimikrob- no, kar je pomembno, saj so okužbe ran eden pomembnejših vzrokov za podaljšanje časa celjenja (Gaidau idr. 2023). Migracijo fibroblastov ter kožnih matičnih celic je pospešil tudi hidrolat iz laškega smilja, ob izpostavitvi se je nekoliko povečala tudi njihova proliferacija (Serra idr. 2023). V fibroblastih je vodno-alkoholni izvleček laškega smilja povzročil povišanje izražanja fibroblastnega rastnega faktorja FGF-2 ter hialuro- nan sintaze-2, znižal pa izražanje metaloproteinaze 9, ki služi razgradnji kolagena (Pekmezci in Türkoğlu 2023). V dinamičnem celičnem mode-lu, v katerem je zahvaljujoč nenehnemu pretoku/izmenjavi gojišča mo- goča komunikacija med več celičnimi vrstami, je bilo pokazano, da ob izpostaviti hidrolatu iz laškega smilja kožne matične celice izražajo več biooznačevalcev matičnih celic, kar kaže na boljšo regeneracijsko spo- sobnost kože (Serra idr. 2024). Podobno kot je bilo za antioksidativno in protivnetno delovanje pokazano, da se v odpadni vodi po destilaciji na- haja dovolj bioaktivnih spojin, da je učinek občuten, velja tudi pri posa- meznih fazah procesa celjenja (Addis idr. 2020). Pokazalo se je namreč, da izvleček iz odpadne vode prvih 72 h sicer nima vpliva na preživetje in delitev fibroblastov, dolgotrajna izpostavitev pa pospeši njihovo pro- liferacijo. Izmerjena migracijska sposobnost pri uporabi izvlečka v raz- ličnih koncentracijah ni bila konsistentno povečana, se je pa ob sočasni uporabi izvlečka iz laškega smilja in ognjiča pokazal izrazit sinergistični učinek (Addis idr. 2020). Nekaj uporabnih informacij lahko dobimo tudi iz raziskave, ki je sicer potekala na črevesnih fibroblastih, vendar ravno tako podpira uporabo laškega smilja za celjenje ran (Kramberger idr. 229 Saša Kenig 2022). Z analizo celotnega transkriptoma je bilo pokazano, da izvleček vpliva na izražanje številnih genov, ki so povezani s celjenjem, in sicer npr. s hemostazo, z migracijo fibroblastov, reorganizacijo citoskeleta ter medceličnimi povezavami in povezavami med celicami ter zunajcelič- nim matriksom, ki se morajo tvoriti ob zaprtju rane. Poleg tega so celice, izpostavljene izvlečku, tvorile snovi za pospeševanje koagulacije. Ko smo gojišče, v katerem so rasle celice in bile izpostavljene izvlečku, pomešali s krvnim vzorcem, je krvni strdek nastal hitreje, skrajšan pa je bil tudi protrombinski čas (Kramberger idr. 2022). Raziskave in vivo V raziskavi na živalskem modelu podgan s sladkorno boleznijo tipa II (Andjić idr. 2022) so primerjali kontrolno mazilo z mazilom, v katerega so dodali eterično olje laškega smilja, pri celjenju kirurško inducirane rane. Podgane s sladkorno boleznijo so izbrali zato, ker je pri sladkorni bolezni zaradi hiperglikemije cirkulacija oslabljena, celjenje pa posledično po- časnejše. Po 21 dneh nanašanja mazila je bila rana popolnoma zaprta le v primeru uporabe mazila z laškim smiljem. Ob tem je histopatološka ana- liza pokazala, da je bila po uporabi takega mazila na mestu rane povečana količina hidroksiprolina; to je aminokislina, ki je značilna za kolagen in torej nakazuje izboljšano tvorbo te ključne komponente zunajceličnega matriksa. Znižan je bil tudi sistemski oksidativni stres, ki se zaradi same rane izrazito poviša. Največja razlika se je pokazala pri analizi vezivne plasti kože – pri kontrolni skupini je ta plast vsebovala večje količine fib- roblastov, vendar manjšo vsebnost zunajceličnih strukturnih beljakovin. To pomeni, da so se celice, odgovorne za proizvodnjo strukturnih belja- kovin, sicer že namnožile, njihov učinek pa še ni bil viden. Poleg tega je bilo v kontrolni skupini na mestu rane še vedno veliko več makrofagov, kar kaže na to, da se proces vnetja še ni zaključil. Uporaba mazila z laškim smiljem je torej pospešila proces celjenja, pomembno pa je tudi, da ob uporabi raziskovalci niso zaznali nikakršnih negativnih učinkov na kožo, npr. otekline, rdečice ali srbečice (Andjić idr. 2022). Med spojinami, za- služnimi za celjenje rane, lahko izpostavimo apigenin. Ko so pripravek s to spojino nanašali na kirurško inducirano rano pri testnih živalih, je bila v primerjavi s kontrolo po koncu zdravljenja povečana natezna trdnost predhodno ranjene kože, povečala se je tudi količina hidroksiprolina. S testom in vitro so potrdili tudi zaviralni učinek apigenina na aktivnost hialuronidaze in kolagenaze (Süntar idr. 2013). 230 Uporaba laškega smilja v dermatologiji Zaenkrat obstaja le ena raziskava, v kateri so preučevali laški smilj za cel- jenje rane pri ljudeh. Ko so pacienti po operaciji prsnega koša najprej de- set dni uživali po dve kapljici eteričnega olja smilja na dan, nato pa so jim olje nanašali na kožo dva do tri mesece, so se občutno zmanjšali lokalno vnetje, edem, hematomi in brazgotina (Voinchet in Giraud-Robert 2007). Poleg tega so pacienti olje dobro prenašali. Drugi ugodni učinki na kožo Poleg celjenja rane je laški smilj preučevan predvsem v kontekstu rege- neracije kože in njene zaščite pred poškodbami, ki jih povzroča zunanje okolje. Za uporabo v kozmetičnih izdelkih nas zanima predvsem zaščita rožene plasti kože. To je najbolj zunanja kožna plast, ki predstavlja raz- mejitev med zunanjim in notranjim okoljem ter je zato okoljskim dejav- nikom najmočneje podvržena. Sestavljajo jo diferencirani keratinociti, obdani z različnimi lipidnimi molekulami – ceramidi, holesterolom, maš čobnimi kislinami ter glikosfingolipidi. Beljakovinsko ogrodje oz. ovojnico, ki ščiti kožne celice in sodeluje pri organizaciji lipidnih mole- kul, izgrajujejo predvsem filigrin, lorikrin in involukrin. Motnje v sestavi te plasti so povezane s patologijami kože, npr. z luskavico ter atopijskim dermatitisom (Mescher 2024). Poleg epidermalne lipidne plasti ima pri zaščiti rožene plasti pomembno vlogo sebum, ki ga izločajo žleze lojnice in je pretežno sestavljen iz različnih lipidnih molekul, med katerimi je najbolje zastopan skvalen. Če razmišljamo o mehanizmih delovanja laškega smilja pri zaščiti in re- generaciji kože, lahko rečemo, da ta vpliva na sorodne dogodke kot pri ce- ljenju rane, npr. na proizvodnjo kolagena, celično delitev in preprečeva- nje oksidativnega stresa. Ker je antioksidativno in protivnetno delovan je podrobno opisano v ločenem poglavju, ga tu posebej ne izpostavljamo, seveda pa imajo izvlečki laškega smilja tovrstne učinke tudi na kožo. Ar- zanol, izoliran iz laškega smilja, je npr. kožne keratinocite HaCaT zaščitil pred s peroksidom sproženim oksidativnim stresom in lipidno peroksi- dacijo (Piras idr. 2024). Lipidno peroksidacijo je izvleček zavrl tudi na umetno pripravljenih liposomih (Combes idr. 2017). V poskusih in vitro je bilo pokazano, da izvleček laškega smilja lahko prepreči razgradnjo skvalena, povzročeno z izpostavitvijo sevanju UV ali okolijskim polutan- tom (Combes idr. 2017). Kot posledico protivnetnega delovanja lahko omenimo zavrtje pojava edema, sproženega z 12-O-tetradekanoilforbol 13-acetatom na mišjih ušesih (Sala idr. 2001). Na podobnem modelu, kjer so nastanek edema sprožili mišim na šapah, se je kot najmočnejša 231 Saša Kenig protivnetno delujoča spojina, izolirana iz laškega smilja, izkazal tilirozid in nekoliko manj pinocembrin (Sala idr. 2003). V primerjavi dveh različ- nih izvlečkov, od katerih je bil prvi bogat s fenolnimi kislinami, drugi pa s skupnimi fenoli in flavonoidi, so se pri testih in vitro pokazali še drugi ugodni učinki za kožo. Oba izvlečka sta močno zavrla aktivnost kolage- naze, elastaze in hialuronidaze, celo bolje od uporabljenih pozitivnih kontrol. Za izvleček s fenolnimi kislinami je bila pokazana tudi antitirozi- nazna aktivnost, kar bi lahko prispevalo k zmanjševanju pigmentnih peg na koži. Enak učinek je za izvleček mogoče predvidevati tudi zato, ker je učinkovito absorbiral žarke UVA in UVB (Jakupović idr. 2023). Prve klinične raziskave je, kot omenjeno uvodoma, izvedel italijanski zdravnik Leonardo Santini. Pri pacientih, ki so bolehali za bronhitisom in astmatičnim kašljem, je ob uporabi prevretka iz laškega smilja opazil izboljšanje nepovezanih stanj, kot sta luskavica in artritis (Santini 1952). Iz nadaljnjega mnogoletnega kliničnega opazovanja je zaključil, da je ak- tivnost prevretka in sirupa iz laškega smilja podobna učinkom kortizo- na. Zdravljenje s petodstotnim prevretkom posušenih cvetov smilja je v manjši klinični raziskavi privedlo do izboljšanja simptomov luskavice pri vseh preiskovancih, dva meseca po koncu zdravljenja pa je prišlo do po- novnega poslabšanja (povzeto po Appendino idr. 2007). Izrazit ugoden učinek eteričnega olja laškega smilja je bil pokazan pri obnovi rožene plasti kože (Lemaire idr. 2023). Pri primerjavi eteričnega olja laškega smilja in čistega neril acetata na izrezane koščke kože je bilo ugotovljeno, da sam neril acetat povzroči preko 40 % enakih učinkov na izražanje genov kot eterično olje, predvsem so bili to geni, povezani z diferenciacijo keratinocitov, s stiki med epitelijskimi celicami, sintezo ce- ramidov in z lokalizacijo lipidnih molekul. Ko so koščke kože, ki so vse- bovali vse kožne plasti, izpostavili eteričnemu olju laškega smilja, neril acetatu ali kontrolnemu gojišču, je bila po petih dneh po uporabi laškega smilja v roženi plasti količina involukrina dvakrat višja kot pri kontroli, pri neril acetatu pa 1,5-krat višja. Podobno je bila povečana količina li- pidov v medceličnih prostorih. Pri analizi količin posamičnih ceramidov je masna spektroskopija pokazala povišane vsebnosti za osem od izmer- jenih devet ceramidov. Eterično olje laškega smilja je sintezo ceramidov povišalo za 70–160 %, neril acetat pa je učinkoval sorodno, a manj izra- zito, saj so bile izmerjene vrednosti povišane za 50–130 % (Lemaire idr. 2023). 232 Uporaba laškega smilja v dermatologiji Zaradi visoke vsebnosti flavonoidov je etanolni izvleček deloval foto- protektivno in je zavrl nastanek eritema po izpostavitvi kože žarkom UVB (Maffei Facino idr. 1988). Ko so na kožo hrčkov nanesli osemodstotno raztopino etanolnega izvlečka ali dveodstotno raztopino flavonoidne frakcije, sta po izpostavitvi sevanju obe popolnoma zavrli pojav rdečice, delovanje pa so tako pripisali flavonoidom – apigeninu, glikozil-apigeni- nu, luteolinu, gnafalinu, naringenin, glikozil-naringeninu in glikozilhal- konu. Podobno se je pokazalo pri raziskavi na ljudeh. Če so flavonoidno frakcijo izvlečka laškega smilja aplicirali ljudem deset minut pred ali po izpostavitvi sevanju UVB, je izvleček popolnoma preprečil nastanek rde- čice. Pripisali so mu zaščitni faktor približno 5 (Maffei Facino idr. 1988). Corinne Granger idr. (2020) so preučevali učinke nočne kreme z melato- ninom, s karnozinom in z izvlečkom laškega smilja. Zanimalo jih je, če lahko taka krema zniža poškodbe kože zaradi okoljskih dejavnikov, ubla- ži klinične znake staranja ali deluje pomirjajoče na kožo. Navlaženost in transepidermalna izguba vode sta se izboljšali že po eni uri uporabe. Število gub se je zmanjšalo za 18,9 %, število temnih lis za 5,5 % in število UV-lis za 13,2 %. Po sedmih dneh se je zmanjšalo tudi zbadanje, ki ga je povzročila mlečna kislina, in 86,7 % preiskovancev je poročalo, da je bila njihova koža bolj pomirjena (Granger idr. 2020). V raziskavi Combesa idr. (2017) si je 51 prostovoljcev nanašalo formulacijo z eteričnim oljem la- škega smilja na kožo obraza dvakrat dnevno, vzorce sebuma pa so zbirali ob začetku, po štirih in osmih tednih. V prvem mesecu se je vrednost skvalen monoperoksida znižala za 28 %, kar kaže na zmanjšanje oksida- tivnih poškodb, vrednosti vitamina E pa so se povišale za 71 %. Opazno je bilo tudi zmanjšanje obočesnih gub. Avtorji zaključujejo, da eterično olje smilja lahko zaščiti kožo pred oksidativnim stresom, ki je posledica UV-sevanja in onesnaženega zraka. Eterično olje je učinkovalo bolje od vitamina E, njuna kombinacija pa je imela še močnejši učinek, iz česar lahko sklepamo, da je njuno delovaje dopolnjujoče (Combes idr. 2017). Če želimo doseči optimalno delovanje izvlečka, ni vseeno, v kakšen pripravek ga vključimo. V eni od raziskav si je 25 zdravih preiskovancev na podlaket nanašalo emulgel ali kremo z izvlečkom laškega smilja in konoplje 28 zaporednih dni, dvakrat dnevno. Kot kontrolo so uporabili emulgel in kremo brez dodanih izvlečkov. Vsi proizvodi so sicer izboljša- li hidriranost kože, a najizraziteje emulgel z izvlečkoma, medtem ko pri merjenju transepitelne izgube vode ni bilo razlik med kontrolnimi pro- izvodi in tistimi z dodanim izvlečkom. Ob uporabi niso zaznali niti dra- ženja kože niti neželenih sprememb pH-ja. Zanimivo je, da se je emul gel 233 Saša Kenig Zaščita pred UV-žarki Zaščita pred UV-žarki Preprečevanje staranja kože Poroženela plast Regeneracija poroženele plasti, povečana sinteza ceramidov Boljša hidriranost kože, manj gub Vrhnjica Pospešeno celjenje rane Zaviranje razgradnje kolagena Usnjica Povečana delitev in migracija fibroblastov ter matičnih celic  Hitrejše zaprtje rane, manjše Podkožje lokalno vnetje Slika 1 Učinki laškega smilja na kožo »Different layers of skin« by Hxtran is licensed under CC BY-SA 4.0 z izvlečkom v primerjavi s kontrolnim emulgelom in obema kremama bolje izkazal tudi pri senzorni analizi, saj so ga preiskovanci ocenili kot najmanj mastnega in lepljivega (Tadić idr. 2021). Pred izgubo vode je kožo zaščitil tudi obliž, impregniran z izvlečkom, pridobljenim s superkr- itičnim CO . Najbolje je deloval obliž iz polipropilenskega blaga, pri kate-2 rem so pri impregnaciji poleg superkritičenga CO dodali tudi etanol, saj 2 se je tako na obližu obdržalo več aktivnih snovi. Pri uporabi takega obliža se je znižal tudi eritemski indeks na koži, ki je bila predhodno nadražena z natrijevim lavril-sulfatom. Impregnacija obliža je delovala tudi proti- mikrobno (Maksimovic idr. 2023). V eni od raziskav sta popisana dva pri- mera kontaktnega dermatitisa pri uporabi eteričnega olja laškega smilja. V obeh primerih sta bila uporabljena v čisti obliki, zato je potrebno opo- zorilo, da različna eterična olja lahko dražijo kožo in jih je treba ustrezno redčiti (Barbaud idr. 2023). Skupno rezultati raziskav kažejo na varno in smiselno uporabo smilja v dermatoloških pripravkih. Bioaktivne spojine delujejo protivnetno, spodbujajo tvorbo in preprečujejo razgradnjo zunajceličnega matriksa ter pospešujejo delitev kožnih celic in njihovo migracijo po poškodbah. Kljub temu je treba poudariti, da tako za celjenje ran, predvsem pa za preprečevanje znakov staranja kože primanjkuje več dobro zasnovanih kliničnih raziskav. 234 Uporaba laškega smilja v dermatologiji Viri Addis, R., S. Cruciani, S. Santaniello idr. 2020. »Fibroblast Proliferation and Migration in Wound Healing by Phytochemicals: Evidence for a Novel Synergic Outcome.« International Journal of Medical Sciences 17 (8): 1030–1042. Andjić, M., N. Draginić, A. Kočović idr. 2022. »Immortelle Essential Oil-Ba- sed Ointment Improves Wound Healing in a Diabetic Rat Model.« Bio-medicine and Pharmacotherapy 150:112941. Antunes Viegas, D. A. Palmeira-de-Oliveira, L. Salgueiro, J. Martinez-de-O- liveira in R. Palmeira-de-Oliveira. 2014. »Helichrysum italicum: From Traditional Use to Scientific Data.« Journal of Ethnopharmacology 151 (1): 54–65. Appendino, G., M. Ottino, N. Marquez idr. 2007. »Arzanol, an Anti-Inflamma- tory and Anti-HIV-1 Phloroglucinol α-Pyrone from Helichrysum itali-cum ssp. microphyllum.« Journal of Natural Products 70 (4): 608–612. Barbaud, A., F. Kurihara, N. Raison-Peyron idr. 2023. »Allergic Contact Der- matitis from Essential Oil in Consumer Products: Mode of Uses and Va-lue of Patch Tests with an Essential Oil Series; Results of a French Study of the DAG (Dermato-Allergology Group of the French Society of Der-matology).« Contact Dermatitis 89 (3): 190–197. Combes, C., M. Legrix, V. Rouquet idr. 2017. »166 Helichrysum italicum Es- sential Oil Prevents Skin Lipids Peroxidation Caused by Pollution and UV.« Journal of Investigative Dermatology 137 (10): S221. Fraternale, D., G. Flamini in R. Ascrizzi. 2019. »In Vitro Anticollagenase and Antielastase Activities of Essential Oil of Helichrysum italicum subsp. italicum (Roth) G. Don.« Journal of Medicinal Food 22 (10): 1041–1046. Gaidau, C., M. Râp ă, M. Stanca idr. 2023. »Fish Scale Gelatin Nanofibers with Helichrysum italicum and Lavandula Latifolia Essential Oils for Bioacti-ve Wound-Healing Dressings.« Pharmaceutics 15 (12): 2692. Granger, C., A. Brown, S. Aladren in M. Narda. 2020. »Night Cream Conta- ining Melatonin, Carnosine and Helichrysum italicum Extract Helps Reduce Skin Reactivity and Signs of Photodamage: Ex Vivo and Clinical Studies.« Dermatology and Therapy 10 (6): 1315–1329. Guyton, A. C., in J. E. Hall. 2011. Guyton and Hall Textbook of Medical Physi- ology. 12. izd. Elsevier. Jakupović, L., I. Bačić, J. Jablan idr. 2023. »Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin- -Based Helichrysum italicum Extracts: Antioxidant and Cosmeceutical Activity and Biocompatibility.« Antioxidants 12 (4): 855. Kramberger, K., D. Barlič-Maganja, Z. Jenko Pražnikar idr. 2022. »Whole Transcriptome Expression Array Analysis of Human Colon Fibroblasts 235 Saša Kenig Culture Treated with Helichrysum italicum Supports Its Use in Traditio- nal Medicine.« Journal of Ethnopharmacology 296 (1): 115505. Lemaire, G., M. Olivero, V. Rouquet idr. 2023. »Neryl Acetate, the Major Com- ponent of Corsican Helichrysum italicum Essential Oil, Mediates Its Bio- logical Activities on Skin Barrier.« PloS One 18 (3): e0268384. Maksimovic, S., M. Stankovic, S. Roganovic idr. 2023. »Towards a Modern Approach to Traditional Use of Helichrysum italicum in Dermatological Conditions: In vivo Testing Supercritical Extract on Artificially Irritated Skin.« Journal of Ethnopharmacology 301 (6): 115779. Maffei Facino, R., M. Carini, M. Mariani in C. Cipriani. 1988. »Anti-Erythe- matous and Photoprotective Activities in Guinea Pigs and Man of To- pically Applied Flavonoids from Helichrysum italicum G. Don.« Acta Therapeutica 14 (4): 323–345. Mescher, A. L. 2024. Junqueira’s Basic Histology: Text and Atlas. 17. izd. McGraw Hill. Pekmezci, E., in M. Türkoğlu. 2023. »The Effects of Helichrysum italicum Extract on the Extracellular Matrix of the Skin.« Acta Medica Academica 52 (3): 182–187. Piras, F., V. Sogos, F. Pollastro, G. Appendino in A. Rosa. 2024. »Arzanol, a Natural Phloroglucinol α-Pyrone, Protects HaCaT Keratinocytes against H2O2-Induced Oxidative Stress, Counteracting Cytotoxicity, Reactive Oxygen Species Generation, Apoptosis, and Mitochondrial Depolariza- tion.« Journal of Applied Toxicology: JAT 44 (5): 720–732. Sala, A., M. C. Recio, R. M. Giner, S. Máñez in J. L. Ríos. 2001. »New Ace- tophenone Glucosides Isolated from Extracts of Helichrysum italicum with Antiinflammatory Activity.« Journal of Natural Products 64 (10): 1360–1362. Sala, A., M. C. Recio, G. R. Schinella idr. 2003. »Assessment of the Anti-In- flammatory Activity and Free Radical Scavenger Activity of Tiliroside.« European Journal of Pharmacology 461 (1): 53–61. Santini, L. 1952. »Rassegna clinico-statistica sulle proprietà terapeutiche dell elicrisio (Helichrysum italicum).« Minerva Medica 43 (28): 714–719. Scarborough, J. 1978. »Theophrastus on Herbals and Herbal Remedies.« Jour nal of the History of Biology 11 (2): 353–385. Serra, D., E. Bellu, G. Garroni idr. 2023. »Hydrolat of Helichrysum italicum Promotes Tissue Regeneration During Wound Healing.« Physiological Research 72 (6): 809–818. Serra, D., S. Cruciani, G. Garroni idr. 2024. »Effect of Helichrysum italicum in Promoting Collagen Deposition and Skin Regeneration in a New Dyna- mic Model of Skin Wound Healing.« International Journal of Molecular Sciences 25 (9): 4736. 236 Uporaba laškega smilja v dermatologiji Süntar, I., E. Küpeli Akkol, H. Keles, E. Yesilada in S. D. Sarker. 2013. »Explo- ration of the Wound Healing Potential of Helichrysum graveolens (Bieb.) Sweet: Isolation of Apigenin as an Active Component.« Journal of Ethno-pharmacology 149 (1): 103–110. Tadić, V. M., A. Žugić, M. Martinović idr. 2021. »Enhanced Skin Performance of Emulgel vs. Cream as Systems for Topical Delivery of Herbal Actives (Immortelle Extract and Hemp Oil).« Pharmaceutics 13 (11): 1919. Voinchet, V., in A. M. Giraud-Robert. 2007. »Utilisation de l’huile Essenti- elle d’hélichryse Italienne et de l’huile Végétale de Rose Musquée Après Intervention de Chirurgie Plastique Réparatrice et Esthétique.« Phytothérapie 5 (2): 67–72. 237 Recenziji Pričujoča monografija Laški smilj predstavlja pomemben mejnik za po- dročje pridelave zdravilnih in aromatičnih rastlin v Sloveniji. Zasluga za njen nastanek gre entuziastičnim urednicam, ki so zadnjih deset let us- pešno združevale svoje osebno zanimanje z znanstveno-raziskovalnim in s poljudnim delom. Posebna vrednost monografije ni le v združevanju najpomembnejših področij, potrebnih za razumevanje in spoznavanje te zanimive rastline, temveč tudi v tem, da predstavlja odlično osnovo za nadaljnje nadgrajevanje znanja o tej in še številnih drugih zdravilnih in aromatičnih rastlinah. Knjiga bo vsem bralcem potrdila, da laški smilj predstavlja zakladnico različnih koristnih spojin, rastlina pa s trendom ekološke pridelave kmetijskih rastlin v Sloveniji pridobiva na vrednosti. Uporaba monografije bo zagotovo obogatila delo zeliščarjev, raziskoval- cev in strokovnjakov omenjenega področja in bo prispevala k nadaljnje- mu razvoju stroke. Z natančnim pregledom znanstvenih objav v vsakem poglavju povzema dosedanje raziskave obravnavanega področja. Prav tako pa bo delo uporabno tudi za učitelje, dijake ter študente naravoslov- nih smeri. Zaključim naj z iskrenimi čestitkami vsem sodelujočim za do- sego dolgoletnega cilja in vztrajnost pri pripravi monografije. Izr. prof. dr. Andreja Čerenak Laški smilj v širšem sredozemskem prostoru že stoletja velja za drago- ceno aromatično rastlino s številnimi tradicionalnimi načini uporabe. Zaradi svojih bioloških aktivnosti in številnih aromatičnih spojin je v ospredju zanimanja sodobne fitoterapevtske znanosti in industrije ter v zadnjem obdobju privlači raziskovalce z genetskega, biokemijskega, far- makološkega in agronomskega vidika. Znanstvena monografija Laški smilj, ki so jo uredile Dunja Bandelj, Zala Jenko Pražnikar in Ana Petelin, predstavlja izjemno celovit, interdiscipli- naren in poglobljen prispevek k poznavanju rastlinske vrste Helichrysum italicum, v slovenskem prostoru poznane kot laški smilj. Monografija, ki združuje delo številnih strokovnjakov s področij genetike, botanike, ag- ronomije, biokemije in farmacije, bralca popelje skozi vse ključne vidi- ke raziskovanja te aromatične in zdravilne rastline – od zgodovinskega Bandelj, D., Z. Jenko Pražnikar in A. Petelin, ur. 2025. 239 Laški smilj. Založba Univerze na Primorskem Recenziji in etnofarmakološkega ozadja preko genetske ter kemične karakterizaci- je vse do sodobne uporabe v prehrani, fitoterapiji in industriji. Monografija je razdeljena v tri večje sklope. Prvi del se posveča botaniki in genetiki rastline ter agronomskemu in tržnemu potencialu. Avtorji na- tančno razložijo nomenklaturo, podvrstno raznolikost in kompleksnost taksonomije laškega smilja, kar je ključno za razumevanje njegove eko- loške plastičnosti in potencialne uporabnosti. Posebej izstopa poglavje o genetskih, genomskih in transkriptomskih raziskavah, kjer so avtorji prvi na svetu razvili mikrosatelitske biooznačevalce za identifikacijo in selek- cijo ustreznih genotipov – gre za znanje, ki ima neposreden pomen za nadzor kakovosti in sledenje izvoru surovine. V drugem sklopu se avtorji posvetijo tehnološkim vidikom pridelave in predelave smilja ter kemijski analizi njegovih izvlečkov. S prikazom postopkov pridelave, razmnoževanja, spravila, destilacije in kemijske karakterizacije sestavin (predvsem eteričnih olj, fenolnih spojin, hi- drolatov) monografija postane dragoceno praktično orodje za vse, ki se ukvarjajo s pridelavo in predelavo zdravilnih rastlin. Avtorji ne prezrejo pomembnosti ekoloških dejavnikov na sintezo sekundarnih presnovkov in njihove raznolikosti v odvisnosti od genotipa in okolja, kar predstavlja redko sistematično obravnavo te tematike v slovenskem prostoru. Tretji sklop obravnava biološke učinke laškega smilja na celičnih in ži- valskih modelih kot tudi v nekaj kliničnih raziskavah. Avtorji znanstve- no utemeljeno predstavijo antioksidativno, protivnetno, protimikrobno in presnovno delovanje smiljevih spojin, pri čemer upoštevajo rezultate tako raziskav in vitro kot tudi in vivo. Zelo dragoceno je tudi poglavje, ki se dotika uporabe laškega smilja v dermatologiji, kjer avtorji nakazujejo smeri za razvoj naravnih kozmetičnih izdelkov. Monografija je v celotnem obsegu poglavij podprta s številnimi litera- turnimi viri, kar utrjuje znanstveno verodostojnost publikacije. Ima tudi jasno aplikativno vrednost: poleg osnovnih znanstvenih spoznanj avtorji obravnavajo aktualne izzive gojenja smilja v slovenskih razmerah, po- dajo konkretne smernice za njegovo pridelavo, razmnoževanje, zaščito pred škodljivci in boleznimi ter predlagajo ukrepe za izboljšanje kako- vosti končnih izdelkov. Izpostavljen je pomen nadzora kakovosti in av- tentičnosti ter opozorila glede nevarnosti poneverb, kar je pomembno zaradi visokega tržnega potenciala eteričnega olja iz smilja. Znanstvena monografija Laški smilj je dragocen prispevek k slovenski znanstveni literaturi na področju zdravilnih rastlin. Odlikuje jo jasno 240 Recenziji strukturirana vsebina, jezikovna natančnost, znanstvena doslednost ter izrazita interdisciplinarnost, zaradi česar bo v pomoč tako raziskoval- cem, študentom in pridelovalcem kot tudi strokovnjakom s področja fitoterapije, kozmetologije in kmetijstva. Gre za delo, ki ga lahko z goto- vostjo označimo kot referenčno literaturo za vsa prihodnja preučevanja te rastlinske vrste. Izr. prof. dr. Lovro Žiberna 241 Monografija Laški smilj (Helichrysum italicum (Roth) G. Don) predstavlja pomemben mejnik za področje pridelave zdravilnih in aromatičnih rastlin v Sloveniji. Zasluga za njen nastanek gre entuziastičnim urednicam, ki so zadnjih deset let uspešno združevale svoje osebno zanimanje z znanstvenoraziskovalnim in s poljudnim delom. Knjiga bo vsem bralcem potrdila, da laški smilj predstavlja zakladnico različnih koristnih spojin, rastlina pa s trendom ekološke pridelave kmetijskih rastlin v Sloveniji pridobiva na vrednosti. Andreja Čerenak Monografija, ki združuje delo številnih strokovnjakov s področij genetike, botanike, agronomije, biokemije in farmacije, bralca popelje skozi vse ključne vidike raziskovanja te aromatične in zdravilne rastline – od zgodovinskega in etnofarmakološkega ozadja preko genetske in kemične karakterizacije vse do so­ dobne uporabe v prehrani, fitoterapiji in industriji. Lovro Žiberna Založba Univerze na Primorskem hippocampus.si