Imunohistokemični označevalci celičnega razmnoževanja Immunohistochemical markers of cellular proliferation Andrej Cor* Deskriptorji novotvorbe - patologija proliferacijska celica jedrni antigen imunohistokemija Izvleček. Glavni motiv za ugotavljanje prolifera-cijske aktivnosti celic, še zlasti v vzorcih človeških tumorjev, je hipoteza, da lahko s kvantifikacijo tega osnovnega biološkega procesa damo objektiven odgovor o kliničnem poteku bolezni in prognozi bolnikov obolelih za rakom. V zadnjem času se za ugotavljanje proliferacijske aktivnosti celic uporablja predvsem imunohistoke-mično barvanje s protitelesi proti antigenom, ki se pojavljajo samo v razmnožujočih se celicah. Najpogosteje uporabljeni protitelesi sta anti-PCNA in Ki-67. PCNA je pomožni protein DNA polimeraze d. PCNA pozitivna so jedra celic v fazi S celičega ciklusa. Protitelo Ki-67 prepozna antigene, ki se pojavijo v jedrih razmnožujočih se celic, ne pa tudi v mirujočih celicah faze G0 celičnega ciklusa. V članku so opisane glavne biološke lastnosti označevalcev anti-PCNA in Ki-67, njuna uporabnost v patologiji ter naše izkušnje pri delu z njima. Descriptors neoplasms-pathology proliferating cell nuclear antigen immunohistochemistry Abstract. The author undertook the study of cellular proliferation, particularly in human tumours, in order to test the hypothesis that the quantification of this fundamental biological process can provide objective information about the clinical course and prognosis of cancer. Recently, immunohystochemical staining with antibodies against proliferation-associated antigen has been used for determining the growth fraction. Anti-PCNA and Ki-67 are the most frequently employed markers. PCNA is DNA polymerise d auxiliary protein. During S phase of the cell cycle nuclei of the cells are PCNA positive. Antibody Ki-67 recognizes nuclear antigens, which are present solely in proliferating cells and are absent in resting cells during G0 phase. The paper gives an overview of the principal biological characteristics of immunohistochemical markers anti-PCNA and Ki-67, and presents their applications in pathology and the author's experience with these markers. Uvod Celična proliferacija je eden od osnovnih bioloških procesov. Lebland je razdelil celice glede na njihovo proliferacijsko sposobnost v tri tipe (1): - statične celice, ki imajo zelo majhno sposobnost proliferiranja ali pa je sploh nimajo, npr. nevroni centralnega živčevja; - pogojno obnovljive celice, ki v normalnih pogojih kažejo razmeroma majhno proliferacijsko sposobnost. Če pa se pojavi potreba, npr. po poškodbi, lahko izdatno rege-nerirajo. Take so celice ledvic, jeter, merokrinih in apokrinih žlez; - nenehno obnavljajoče se celice, ki se ves čas razmnožujejo in s tem nadomeščajo zelo številne propadajoče celice. Take so npr. celice povrhnjih epitelijev, kostnega mozga, zarodne celice v testisu in celice holokrinih žlez. Raziskave Howarda in Pelca, ki sta za opazovanje celic uporabila avtoradiografsko metodo, so vodila v odkritje celičnega ciklusa in njegovih faz (2). V celičnem ciklusu se iz- *Asist. dr. sc. Andrej Cor, dr. med., Inštitut za histologijo in embriologijo, Medicinska fakulteta Univerze v Ljubljani, Korytkova 2, 1105 Ljubljana. menjujeta interfaza in faza mitoze (M). Interfaza je sestavljena iz treh faz: G1, S in G2. Lajtha je predpostavil, da obstaja tudi t. i. G0 faza, v kateri celice niso v ciklusu, se pa lahko po delovanju določenega stimulusa vrnejo med proliferirajočo populacijo (3). Vsako celično populacijo lahko torej razdelimo na ciklični in neciklični del. Iz tega sledi tudi definicija proliferacijske ali rastne frakcije celične populacije kot razmerje med cikličnim delom populacije in vsoto cikličnega in necikličnega dela (4). Ker kinetika tumorskih celic neposredno vpliva na klinični potek in prognozo rakave bolezni, je določanje proliferacijske aktivnosti, poleg postavljanja diagnoze, ena od glavnih nalog patologa pri študiju vzorca tumorskega tkiva. Veliko časa in napora je bilo vloženega v poizkušanje kvantifikacije spremenljivk, ki odražajo tumorsko proliferacijsko aktivnost, ter korelacijam teh spremenljivk s sposobnostjo metastaziranja, s ponovitvijo tumorja ter z umrljivostjo za določenim tumorjem. Za ugotavljanje proliferacijske aktivnosti se uporabljajo številne metode: štetje mitoz, ugotavljanje indeksa vgradnje 3H-timidina in bromdeoksiuridina (BrdU), pretočna citometrič-na metoda, štetje posrebrenih nukleolarnih organizacijskih regij (Ag-NOR) in druge. V zadnjem času pa se za ugotavljanje proliferacijske aktivnosti celic vse več uporablja imu-nohistokemično ugotavljanje prisotnosti nekaterih antigenov, ki se pojavijo v jedrih celic samo v fazah celičnega ciklusa, ne pa tudi v fazi G0. Najpogosteje uporabljena imu-nohistokemična markerja sta anti-PCNA in Ki-67. Jedrni antigen proliferirajočih celic (PCNA) Leta 1978 je Miyachi s sodelavci opisal, da avtoimuni serum bolnikov s sistemskim eri-tematoznim lupusom vsebuje protitelesa, ki prepoznajo jedrni antigen v razmnožujočih se celicah (5). Ta antigen so poimenovali »proliferating cell nuclear antigen« ali PCNA. Molekula PCNA je 36 kDa velik kisli, nehistonski protein v jedru, ki deluje kot pomožni protein DNA polimeraze-d in je nujno potreben za sintezo DNA (6, 7). Imunoreaktivnost molekule PCNA se izraža skupaj z vgradnjo BrdU v DNA med fazo S celičnega ciklusa. PCNA je torej tesno povezan s podvojitvijo celice oz. s samo sintezo DNA, ki se vrši v jedru med fazo S. V prisotnosti PCNA DNA polimeraza-d katalizira podaljšanje oli-gonukleotidnih fragmentov v dolgo verigo DNA (8). Gen za PCNA je bil kloniran za mnoge živalske vrste, pa tudi za človeka (15). Človeški gen za PCNA je lokaliziran na kromosomu 20. Kljub variacijam na nivoju DNA, se PCNA molekula med človekom in podgano razlikuje samo v štirih aminokislinah. Približno 70% skladnost pa je tudi med človeškim in PCNA nižjih živalskih vrst. Ta relativna evolucijska konzervativnost kaže na pomembno vlogo PCNA v celičnem podvajanju (9). Za ugotavljanje prisotnosti PCNA na histoloških preparatih se uporabljajo številna protitelesa. Zdi se, da so epitopi, ki jih prepoznajo ta protitelesa, različni, prav tako pa je različna tudi občutljivost teh epitopov tako za fiksacijo kot tudi za različne postopke imu-nohistokemičnega barvanja. To je samo ena od razlag, zakaj se pojavljajo razlike med rezultati različnih avtorjev, čeprav so proučevali proliferacijsko aktivnost na tumorjih iste vrste. V patologiji najpogosteje uporabljeno in komercialno najbolj dostopno protitelo proti PCNA je PC-10. Sinteza in funkcija PCNA med celičnim ciklom Sinteza proteina PCNA se dramatično poveča tik pred sintezo DNA, to je pozno v fazi G1. Najvišjo vrednost doseže v fazi S, nato pa se zmanjša na bazalno vrednost v pozni fazi S. V zadnjem času se pojavljajo poročila, da je število imunoreaktivnih celic na PCNA, zlasti v nekaterih tumorjih, višje, kot bi pričakovali, oz. višje, kot je ugotovljena proliferacij-ska aktivnost z drugimi ustreznimi metodami, npr. vgradnjo BrdU (10). Del razlage je vtem, da je molekula PCNA vključena tudi v popravljanje DNA, saj so odkrili, da se pojavlja v vseh fazah celičnega ciklusa po obsevanju celic z UV-svetlobo (11). Proces reparacije DNA je namreč sestavljen iz dveh delov. V prvem delu endonukleaze encimsko izrežejo okvarjeni del DNA, v drugem delu pa sledi sinteza DNA, v katero je vključena predvsem polimeraza d s pomožnim proteinom PCNA (12). Regulacija ekspresije Regulacija ekspresije PCNA je kompleksna. Ekspresija PCNA je regulirana na transkrip-cijskem in potranskripcijskem nivoju. Čeprav je bila promotorska regija že mapirana, je transkripcijska kontrola še razmeroma nejasna (13). Zdi se, da je izredno pomembna regulacija na potranskripcijskem nivoju. Za sintezo proteina PCNA mora biti PCNA-mRNA stabilizirana. Samo na ta način je nato prepisana v protein (14, 15). Številne celice, tudi tiste v fazi G0, neprestano sintetizirajo PCNA-mRNA, vendar pa jo zelo hitro tudi razgradijo, ne da bi prišlo do sinteze proteina PCNA. Za stabilnost oz. nestabilnost PCNA-mRNA je odgovoren gen za PCNA, in sicer njegov intron 4 (11). Odstranitev introna 4 vodi v nenormalno visoke vrednosti PCNA tudi v celicah, ki so v fazi G0. Pri stabilizaciji molekule PCNA-mRNA pa lahko sodelujejo tudi številni drugi dejavniki, med njimi predvsem rastni faktorji in onkogeni (13, 16). Pomemben razlog za preveliko imunoreaktivnost na PCNA je tudi dolg polovični čas razgradnje molekule PCNA, ki je okoli 20 ur. Zato je v tkivih, kjer je celični ciklus kratek (npr. v črevesnih resicah), število celic, ki so imunoreaktivne na PCNA, skoraj 100% (7, 17). Torej lahko tudi nekatere celice, ki niso v fazah celičnega ciklusa, kažejo imunoreaktivnost na PCNA. Še zlasti pa je povečana imunoreaktivnost na PCNA vidna v normalnih tkivih ob tumorskih spremembah. Ena od možnih razlag je, da se to zgodi zaradi rastnih faktorjev, ki jih izločajo tumorske celice. Le-ti nato povzročijo stabilnost PCNA-mRNA (10). Vse to kaže, da je molekula PCNA sicer neobhodno potrebna za celično delitev, vendar pa ne samozadostna za proliferacijo (11). Ki-67 Protitelesa proti Ki-67 so prvi opisali Gerdes in sodelavci, ko so poizkušali narediti protitelo proti Reed-Sterenbergovim celicam, specifičnim za Hodgkinov limfom (19). Ugotovili so, da se je protitelo vezalo na jedra razmnožujočih se celic, ne glede na tip celice. Antigen, ki ga protitelesa Ki-67 prepoznajo, je v jedrih celic, ki so v fazah G1, S, G2 in M, ni pa ga v jedrih celic, ki so v fazi G0 celičnega ciklusa (20). Po mitozi se antigen Slika 1. Imunohistokemično pobarvana jedra celic ščitničnega tumorja s protitelesom anti-PCNA (povečava 40-krat). zelo hitro razgradi, ali pa epitop zelo hitro izgubi svoje antigenske lastnosti. Polovični čas razgradnje antigena je ena ura ali manj (21). Potencialno sposobnost ugotavljanja proliferacijske aktivnosti celic z merjenjem odstotka Ki-67 pozitivnih celic so nato dokazali v številnih raziskavah različnih tumorjev, pa tudi v netumorskih tkivih. Pokazali so, da je Ki-67 pomemben označevalec ne le za ugotavljanje celične aktivnosti, pač pa ima tudi prognostično vrednost (22-27). Velika pomankljivost protitelesa Ki-67 je v tem, da je uporabno samo na svežem materialu ali na zaledenelih rezinah, ne pa tudi na rutinskih histoloških preparatih, zato so bile retrospektivne študije nemogoče. Vzrok za to pomankljivost je občutljivost antigen-skega epitopa na rutinsko histopatološko fiksacijo s formalinom ali alkoholom. Gerdes in sodelavci so klonirali in sekvencionirali del gena Ki-67 ter z imunizacijo miši z rekom-binantami produkta tega gena odkrili nova protitelesa. Poimenovali so jih MIB 1-3 (28). To so bila tri protitelesa, ki naj bi bila ekvivalentna klasičnemu protitelesu Ki-67, a naj bi delovala na parafinskih rezinah. Na zaledenelih rezinah so imela ta protitelesa enak imunohistokemični rezultat kot klasično protitelo Ki-67. Rezultati uporabe na parafinskih rezinah pa so razočarali. MIB-2 je bil na parafinskih rezinah popolnoma neuporaben, MIB-1 in MIB-3 pa sta prikazala samo celice, ki so bile v fazi mitoze (29). Velik napredek v imunohistokemični tehniki je pomenilo odkritje, da lahko s segrevanjem v mikrovalovni pečici razkrijemo antigene in jih tako naredimo dostopne za delovanje protiteles (30). Zdi se, da formalinska fiksacija ne uniči antigena, pač pa ga samo zamaskira. Čeprav mehanizem delovanja mikrovalovne pečice še ni popolnoma pojasnjen, pa nam omogoča uspešno razkritje antigena (31). Uporaba nove imunohistokemične tehnike je omogočila označitev jeder razmnožujočih se celic s protitelesi MIB-1 in MIB-3 tudi na parafinskih rezinah. Rezultati so se ujemali s tistimi, dobljenimi s klasičnim protitelesom Ki-67 na zaledenelih rezinah (32). Imunohistokemično barvanje s protitelesom MIB-1 daje rezultat, ki je kombinacija zelo močnega imunohistokemičnega signala, kljub segrevanju v mikrovalovni pečici, ob relativno ohranjeni morfologiji. To omogoča dobro razpoznavanje celičnih in tkivnih podrobnosti ob lahki identifikaciji pozitivnih in negativnih celic. Metoda je primerna tudi za retrospektivne študije na arhivskem materialu. Uporabnost imunohistokemičnih označevalcev celičnega razmnoževanja in naše izkušnje Z uporabo imunohistokemičnih označevalcev lahko z razmeroma enostavno kvantifikacijo imunoreaktivnih in nereaktivnih celic ugotovimo stopnjo proliferacijske aktivnosti preiskovanega tkiva. Oba imunohistokemična označevalca sta se izkazala kot uporabna v številnih študijah in skoraj ni tipa tumorja, na katerih ne bi bila uporabljena (22,23,26, 33-36). Številni avtorji so pokazali ne samo njuno diagnostično vrednost, pač pa tudi uporabnost v napovedovanju poteka bolezni, povezanost s ponovljivostjo tumorjev, njihovim me-tastaziranjem in seveda z umrljivostjo (37-39). Medtem ko zahtevata metodi ugotavljanja vgradnje 3H-timidina in BrdU določen čas za vključitev obeh v fazi S celičnega cikla, je prednost imunohistokemičnih označevalcev v enostavnosti in razmeroma hitro dobljenih rezultatih. Za razliko od pretočne citome-trične metode omogoča imunohistokemična metoda ohranitev morfološke slike, to pa je zlasti pri majhnih lezijah s spremenjeno proliferacijsko aktivnostjo (npr. pri »in situ« karcinomu) izredno pomembno. Na Inštitutu za histologijo in embriologijo Medicinske fakultete v Ljubljani smo leta 1994 uvedli metodi barvanja z obema omenjenima proliferacijskima označevalcema, kot tudi metode za kvantifikacijo imunohistokemično obarvanih preparatov. Oba označevalca smo uporabili za razlikovanje ščitničnih tumorjev ter preizkusili njuno natančnost, občutljivost in specifičnost (40) (slika 1). V sodelovanju z Inštitutom za patologijo Medicinske fakultete smo oba markerja uporabili za diferenciacijo sprememb v grlu (41) in različnih neoplastičnih in neneoplastičnih bolezni jeter (slika 2). Naše raziskave so pokazale, da je Ki-67 uporabnejši označevalec celične proliferacijske aktivnosti kot PCNA. Podobno kot nekateri drugi raziskovalci (10) smo tudi mi opazili prekomerno pozitivnost v preparatih obarvanih z anti-PCNA. Odstotki pozitivnih celic ugotovljenih z anti-PCNA in Ki-67 v posameznih serijah tumorjev so bili sicer v ko-relaciji, vendar pa so bili odstotki PCNA pozitivnih jeder vedno bistveno višji od odstotkov Ki-67 pozitivnih jeder. Prav tako smo imeli v preparatih obarvanih z anti-PCNA težave z določitvijo meje med pozitivnimi in negativnimi jedri, medtem ko je bila razlika v preparatih obarvanih z MIB-1 jasna. Prekomerna pozitivnost na anti-PCNA je po našem mnenju posledica številnih zgoraj navedenih dejavnikov, ki vplivajo na izražanje molekule PCNA tudi v celicah, ki so v fazi G . Slika 2. Imunohistokemično obarvana jedra hepatocitov s protitelesom Ki-67 (povečava 40-krat). Sklep Uporaba protiteles PCNA in Ki-67 kot označevalcev celične proliferacijske aktivnosti je razmeroma enostavna, daje pa ob ohranjeni morfološki sliki izredno pomembne informacije o celicah, ki so v fazah podvojitve, o njihovem položaju v tkivu in s tem tudi o njihovi funkciji. Še zlasti pa sta oba označevalca pomembna za ugotavljanje proliferacijske aktivnosti tumorskih celic. Na ta način lahko dobimo o tumorjih nove podatke, ki so nam v pomoč v diagnostiki, pri napovedovanju poteka bolezni in pri odločanju o ustreznem zdravljenju. Razlaga rezultatov pa zahteva natančno analizo vseh vzrokov za pozitiven in negativen rezultat, to pa je mogoče samo ob natančnem poznavanju imuno-histokemične reakcije in biologije antigena, ki ga protitelesa prepoznajo. Poenostavljanje bi nas vodilo v napačno sklepanje. Literatura 1. Lebland CP. Classification of cell population on the basis of their proliferative behavior. Monogr Natl Cancer Inst 1963; 14: 19-145. 2. Howard A, Pelc SR. Nuclear incorporation of 32P as demonstrated by autoradiographs. Exp Cell Res 1951; 2: 178-87. 3. Lajtha LG. On the concept of the cell cycle. J Cell Physiol 1963; 62: Suppl 1: 143-5. 4. Mendelson ML. The growth fraction: A new concept applied to tumours. Science 1963; 132: 1496-6. 5. Miyachi K, Fritzler MJ, Tan EM. Autoantibody to a nuclear antigen in proliferating cells. J Immunol 1978; 121: 2228-34. 6. Prelich G, Tan CK, Kostura M. Functional identity of proliferating cell nuclear antigen and a DNA poli-merase-d auxiliary protein. Nature 1987; 326: 517-20. 7. Bravo R, Frank R, Blundel PA, Macdonald-Bravo H. Cyclin/PCNA is the auxiliary protein of DNA po-limerase-d. Nature 1987; 326: 515-6. 8. Prelich G, Stilman B. Coordinated leading and lagging strand synthesis during SV40 DNA replication in vivo requires PCNA. Cell 1988; 53: 117-26. 9. Baserga R. Growth regulation of the PCNA gene. J Cell Sci 1991; 98: 433-6. 10. Hall PA, Coates PJ, Goodlab RA, Hart IR, Lane DP. Proliferating cell nuclear antigen expression in non-cycling cells may be induced by growth factors in vivo. Br J Cancer 1994; 70: 244-7. 11. Hall PA, McKee PH, Menage HP, Dover R, Lane DP. High levels of p53 in UV-irradiated normal human skin. Oncogene 1993; 8: 203-7. 12. Shivji MK, Kenny MK, Wood RD. Proliferating cell nuclear antigen is required for DNA excision repair. Cell 1992; 69: 367-74. 13. Traveli S, Ku DH, Rizzo MG et al. Structure of the human gene for the proliferating cell nuclear antigen. J Biol Chem 1989; 264: 7466-72. 14. Ottavio L, Chang CD, Rizzo MG et al. Importance of introns in the growth regulation of mRNA levels of the proliferating cell nuclear antigen gene. Mol Cell Biol 1990; 10: 303-9. 15. Jaskulski D, Gati C, Traveli S, Calabreta B, Baserga R. Regulation of the proliferating cell nuclear antigen cyclin and thymidine kinase mRNA levels by growth factors. J Biol Chem 1988; 263: 1075-9. 16. Mercer WE, Shields MT, Lin D, Appela E, Ullrich S. Growth supresion induced by wild-type p53 protein is accompanied by selective down-regulation of proliferating-cell nuclear antigen expression. Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 1958-62. 17. Scott RJ, Hall PA, Haldane JS. A comparison of immunohistochemical markers of cell proliferation with experimentally determined growth fraction. J Pathol 1991; 165: 173-8. 18. McCormick D, Hall PA. The complexities of proliferating cell nuclear antigen. Histopathology 1992; 21: 591-4. 19. Gerdes J, Schwab U, Lemke H, Stein H. Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation. Int J Cancer 1983; 31: 13-20. 20. Gerdes J, Lemke H, Baisch H et al. Cell cycle analysis of a cell proliferation associated nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67. J Immunol 1984; 133: 1710-5. 21. Bruno S, Crissman HA, Bauer KD, Darzynkievicz Z. Changes in cell nuclei during S phase: progresi-ve chromatin condensation and altered expression of the proliferation-associated nuclear proteins Ki-67, cyclin (PCNA), p105 and p34. Exp Cell Res 1991; 196: 99-106. 22. Burger PC, Shibita T, Kleihues P. The use of the monoclonal antibody Ki-67 in the identification of proliferating cells. Am J Surg Pathol 1986; 10: 611-7. 23. Gatter KC, Dunnil MS, Gerdes J, Stein H, Masson DJ. New approach to assessing lung tumors in man. J Clin Pathol 1986; 39: 590-3. 24. Gerdes J, Van Baarlen J, Pileri S et al. Tumor cell growth fraction in Hodgkin's disease. Am J Pathol 1987; 128: 390-3. 25. Chilosi M, Iannucci A, Menestrina F et al. Immunohistochemical evidence of active thymocyte proliferation in thymoma. Its posible role in the pathogenesis of autoimune disease. Am J Pathol 1987; 128: 464-70. 26. Raymond WA, Leong AS, Bolt JW, Milos-Jose JS, Growth fractions in human prostatic carcinoma determined by Ki-67 immunostaining. J Pathol 1988; 156: 161-7. 27. Koudevitz P, Braun-Falco O, Ernst M et al. Tumor cell growth fractions in human malignant melanomas and the correlation to histopathologic tumor grading. Am J Pathol 1989; 134: 1063-8. 28. Gerdes J, Li L, Schlueter C et al. Immunobiochemical and molecular biologic characterizatioin of the cell proliferation-associated nuclear antigen that is defined by monoclonal antibody Ki-67. Am J Pathol 1991; 138: 867-73. 29. Cattoretti G, Becker MHG, Key G et al. Monoclonal antibodies against recombinants parts of the Ki-67 antigen (MIB-1 and MIB-3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed sections. J Pathol 1992; 168: 357-63. 30. Shi SR, Key ME, Klara KI. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhen-cement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. J Histochem Cytochem 1991; 39: 741-8. 31. McKee PH, Hobbs C, Hall PA. Antigen retrieval by microwave irradiation lowers immunohistological detection thresholds. Histopathology 1993; 23: 377-9. 32. Cattoretti G, Pileri S, Paravicini C et al. Antigen anmasking of formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. J Pathol 1993; 171: 83-98. 33. Connolly KM, Bogdanffy MS. Evaluation of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) as an endoge-nus marker of cell proliferation in rat liver: A dual stain comparison with 5-bromo-2-deoxyuridine. J Histoc-hem Cytochem 1993; 41: 1-6. 34. Diebold J, Lai MD, Löhrs U. Analysis of proliferative activity in colorectal mucosa by immunohistoc-hemical detection of proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Virchows Arch 1992; 62: 283-9. 35. Freeman J, Kellock DB, Yu CCW, Crocker J, Levison DA, Hall PA. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and nuclear organiser regions in Hodgkin's disease: Correlation with morphology. J Clin Pathol 1993; 46: 446-9. 36. Leonardi E, Girlando S, Serio G et al. PCNA and Ki-67 expression in brest carcinoma: Correlations with clinical and biological variables. J Clin Pathol 1992; 45: 416-9. 37. Nielsen AL, Nyholm HCJ. Proliferative activity as revealed by Ki-67 in uterine adenocarcinoma of en-dometrioid type: Comparison of tumours from patients with and without previous oestrogen therapy. J Pathol 1993; 171: 199-205. 38. Gillett CE, Barnes DM, Camplejohn RS. Comparison of three cell cycle associated antigens as marker of proliferative activity and prognosis in brest carcinoma. J Clin Pathol 1993; 46: 1126-8. 39. Schönborn I, Zchiesche W, Minguilon C et al. Prognostic value of proliferating cell nuclear antigen and c-erB-2 compared with conventional histopathological factors in brest cancer. J Cancer Res Clin Oncol 1995; 121: 115-22. 40. Cör A. Uporabnost nekaterih testov proliferacijske aktivnosti tirocitov za diferencialno patohistolo{ko diagnostiko {~itni~nih tumorjev. Doktorska disertacija. Ljubljana: Medicinska fakulteta Univerze v Ljubljani, 1995. 41. Kambic V, Gale N. Epithelial hyperplastic lessions of the larynx. New York: Elsevier, 1995: 134—9. Prispelo 3.10.1995