Sabina Šturm TOKSIKOKINETIKA BISFENOLA A PRI OVCAH IN NJEGOV VPLIV NA SPOLNE ORGANE OVNOV V PUBERTETI Doktorska disertacija Ljubljana, 2022 UDK 636.3:543.645:612.014.46:616.64(043.3) Sabina Šturm, dr. vet. med. TOKSIKOKINETIKA BISFENOLA A PRI OVCAH IN NJEGOV VPLIV NA SPOLNE ORGANE OVNOV V PUBERTETI Doktorska disertacija TOXICOKINETICS OF BISPHENOL A IN SHEEP AND ITS EFFECTS ON REPRODUCTIVE ORGANS OF RAMS IN PUBERTY Doctoral dissertation Ljubljana, 2022 Sabina Šturm Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti Delo je bilo opravljeno v/na: – Infrastrukturnem centru za sonaravno rekultiviranje Vremščica Veterinarske fakultete Univerze v Ljubljani, – Inštitutu za patologijo, divjad, ribe in čebele Veterinarske fakultete Univerze v Ljubljani, – Kliniki za reprodukcijo in velike živali Veterinarske fakultete Univerze v Ljubljani, – Katedri za biofarmacijo in farmakokinetiko Fakultete za farmacijo Univerze v Ljubljani, – Oddelku za anatomijo, fiziologijo in biokemijo Švedske univerze za agronomijo v Uppsali (Švedska), – podjetju AnaPath v Liestalu (Švica). Javni zagovor je bil opravljen v Ljubljani, dne Mentorica: zn. svet. dr. Vesna Cerkvenik Flajs Somentorica: doc. dr. Tanja Švara Izjava o delu: Izjavljam, da je doktorska disertacija rezultat lastnega raziskovalnega dela, da so rezultati korektno navedeni in nisem kršila avtorskih pravic in intelektualne lastnine drugih. Izjavljam, da je elektronski izvod identičen tiskanemu. Člani strokovne komisije za oceno in zagovor: Predsednik: izr. prof. dr. Mitja Gombač Član: izr. prof. dr. Miran Brvar Član: prof. dr. Robert Roškar S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 5 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija IZVLEČEK Namen prvega sklopa doktorske naloge je bil preučiti toksikokinetične (TK) parametre pri ovci in ovnih pasme istrska pramenka po zaporednem dietarnem in podkožnem vnosu bisfenola A (BPA). Za določanje koncentracije prostega in celokupnega BPA v krvni plazmi, mleku, urinu in iztrebkih ovce ter za določanje koncentracije celokupnega BPA v krvni plazmi ovnov smo razvili in validirali tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti na obrnjeni stacionarni fazi ter s fluorescenčno detekcijo. V prvi, pilotni raziskavi, opravljeni na eni ovci v laktaciji s sesnim jagnjetom, smo na podlagi meritev koncentracije prostega in celokupnega BPA v krvni plazmi z neprostorsko TK analizo izračunali osnovne TK parametre po dietarnem in podkožnem vnosu v odmerku 100 µg/kg t. m./dan in ugotovili, da je način vnosa vplival na TK parametre prostega BPA pri ovci. Po dietarnem vnosu je bila izpostavljenost ovce prostemu BPA manjša in krajša – površina pod koncentracijsko krivuljo v krvni plazmi (AUC) je bila 1,28 µg h/l v primerjavi s podkožnim vnosom, pri katerem je bila AUC prostega BPA 33,3 µg h/l. TK profila celokupnega BPA pa sta si bila zelo podobna. Z razvojem prostorskega TK modela smo ocenili, da se je v mleko izločilo manj kot 0,1 % odmerka, ki ga je prejela ovca, ne glede na način vnosa. V urinu ovce smo izmerili zelo nizke vrednosti prostega BPA in visoke vrednosti celokupnega BPA. V iztrebkih ovce smo izmerili zelo nizke vrednosti prostega in celokupnega BPA. Po štirikrat manjšem odmerku, ki so ga prejeli ovni, smo v krvni plazmi določili tudi približno štirikrat manjšo najvišjo koncentracijo (Cmax) celokupnega BPA. Namen drugega sklopa doktorske naloge je bil preučiti vpliv dvomesečne dietarne izpostavljenosti v odmerku BPA 25 µg/kg t. m./dan na spolne organe ovnov v puberteti. Med tretirano skupino in kontrolno skupino ovnov nismo ugotovili statistično značilnih razlik v telesni masi, masi mod, pogostosti ali jakosti histopatoloških sprememb v modih in nadmodkih, v kvalitativnih lastnostih semenčic ter koncentraciji semenčic v nadmodkih in semenovodih. Prav tako nismo ugotovili statistično značilnih razlik v premeru in površini zvitih semenskih kanalčkov. Statistično značilno razliko smo ugotovili le pri višini zarodnega epitela zvitih semenskih cevk, ki je bila nižja pri tretiranih ovnih. Ključne besede: fenoli – analize; toksikokinetika; kromatografija, tekočinska; kemijske analize krvi; mleko – analize; urin – analize; feces – analize; reprodukcija; modo; nadmodek; ovce S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 6 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija ABSTRACT The aim of the first part of the doctoral dissertation was to study toxicokinetic (TK) parameters in a ewe and rams of the Istrian pramenka sheep breed after sequential dietary and/or subcutaneous administration of bisphenol A (BPA). A chemical analysis using high performance liquid chromatography with reversed stationary phase and fluorescence detection was developed and validated for the determination of free and total BPA in sheep’s blood plasma, milk, urine and feces. In an initial pilot study conducted on a lactating ewe with a suckling lamb, a non-compartmental TK analysis was performed for both the dietary and the subcutaneous route. In each case, 100 µg BPA/kg body weight/day was administered, and the free and total BPA in the blood plasma was determined. It was found that the administration route affected the TK parameters of free BPA. After dietary administration, the ewe’s exposure to free BPA was lower and shorter - the area under the blood plasma concentration curve (AUC) was 1.28 µg h/l, compared to subcutaneous administration, where the AUC of free BPA was 33.3 µg h/l. However, the TK profiles of total BPA were very similar. Moreover, with the development of the TK compartmental model, we estimated that the percentage of BPA excreted in milk was less than 0.1% of the received dose, regardless of the route of administration. In the urine of the ewe we also determined very low levels of free BPA and high levels of total BPA, while very low levels of both free and total BPA were also determined in the feces. After a fourfold reduction of the dose, which was administered to the rams, an approximately fourfold reduction of the maximum plasma concentration (Cmax) of total BPA in their blood plasma was also observed. The second part of the dissertation aimed to investigate the effect of a two-month dietary exposure of BPA to 25 µg/kg of body weight/day on the male reproductive organs of pubescent rams. We found no statistically significant difference between the treatment and control group of rams regarding body weight, testicular weight, frequency or severity of histopathological changes in the testes and epididymis, qualitative characteristics of spermatozoa, concentration of spermatozoa in the epididymis and in the ductus deferens. We also found no statistically significant difference in the diameter and surface area of the seminiferous tubules. The only statistically significant difference was a lower height of the germinal epithelium of the seminiferous tubules in the treated rams compared to the control rams. S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 7 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Key words: phenols – analysis; toxicokinetics; chromatography, high pressure liquid; blood chemical analysis; milk – analysis; urine – analysis; feces – analysis; reproduction; testis; epididymis; sheep S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 8 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija KAZALO VSEBINE IZVLEČEK ............................................................................................................................... 5 ABSTRACT .............................................................................................................................. 6 KAZALO VSEBINE ................................................................................................................ 8 KAZALO SLIK ...................................................................................................................... 10 KAZALO OKRAJŠAV IN SIMBOLOV ............................................................................. 11 1 UVOD ................................................................................................................................... 14 1.1 PREGLED LITERATURE ............................................................................................. 16 1.1.1 Kemični povzročitelji hormonskih motenj ............................................................... 16 1.1.2 Prežvekovalci kot model za preučevanje KPHM ..................................................... 17 1.1.3 Bisfenol A ................................................................................................................ 17 1.1.3.1 Kemijske lastnosti ............................................................................................. 17 1.1.3.2 Zgodovina in uporaba ........................................................................................ 18 1.1.3.3 Viri izpostavljenosti ........................................................................................... 18 1.1.3.4 Regulatorni vidiki .............................................................................................. 19 1.1.3.5 Analogi .............................................................................................................. 21 1.1.4 Metode za detekcijo BPA v bioloških vzorcih ......................................................... 21 1.1.4.1 Priprava vzorcev ................................................................................................ 21 1.1.4.2 Določitev koncentracije z inštrumentalno metodo ............................................ 23 1.1.5 Toksikokinetika BPA ............................................................................................... 23 1.1.5.1 Absorpcija in metabolizem ................................................................................ 24 1.1.5.2 Izločanje............................................................................................................. 25 1.1.6 Toksikodinamika BPA ............................................................................................. 26 1.1.6.1 Vpliv na moške spolne organe........................................................................... 26 1.2 HIPOTEZE ..................................................................................................................... 29 2 OBJAVLJENA ZNANSTVENA DELA ............................................................................ 30 2.1 PRELIMINARNA TOKSIKOKINETIČNA RAZISKAVA PRI MLEČNI OVCI V LAKTACIJI PO DIETARNEM IN PODKOŽNEM VNOSU BISFENOLA A .................. 30 2.2 DETERMINACIJA PROSTEGA IN CELOKUPNEGA BISFENOLA A V URINU IN IZTREBKIH OVCE Z METODO HPLC S FLUORESCENČNO DETEKCIJO ................ 41 S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 9 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 2.3 BAZIČNA RAZISKAVA DIETARNEGA VNOSA BISFENOLA A (BPA) OVNOM PASME ISTRSKA PRAMENKA IN UGOTAVLJANJE REPRODUKTIVNE TOKSIČNOSTI .................................................................................................................... 57 3 RAZPRAVA ......................................................................................................................... 76 4 SKLEPI ................................................................................................................................ 85 5 POVZETEK ......................................................................................................................... 86 6 SUMMARY .......................................................................................................................... 88 7 ZAHVALA ........................................................................................................................... 90 8 LITERATURA .................................................................................................................... 92 9 PRILOGE ........................................................................................................................... 108 S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 10 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija KAZALO SLIK Slika 1: Kemijska struktura BPA.............................................................................................. 18 Figure 1: Chemical structure of BPA ....................................................................................... 18 Slika 2: Ekstrakcijska kolona za ekstrakcijo na trdni fazi s selektivnim polnilom z MIP tehnologijo ................................................................................................................................ 22 Figure 2: Solid phase extraction column with selective filler with MIP technology ............... 22 Slika 3: Reakcija konjugacije aglikona BPA v BPAG ............................................................. 24 Figure 3: Conjugation reaction of aglycone BPA to BPAG ..................................................... 24 S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 11 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija KAZALO OKRAJŠAV IN SIMBOLOV 14C-BPA bisfenol A, označen z radioaktivnim izotopom ogljika z masnim številom 14; carbon-14 labeled bisphenol A AhR aril ogljikovodikov receptor; aryl hydrocarbon receptor AIC informacijski kriterij Akaike; Akaike information criterion CLARITY-BPA konzorcij, ki povezuje akademska in regulativna spoznanja o toksičnosti BPA; Consortium Linking Academic and Regulatory Insights on BPA Toxicity AUC površina pod koncentracijsko krivuljo; area under curve BPA bisfenol A; bisphenol A BPAG bisfenol A glukuronid; bisphenol A glucuronide BPF bisfenol F; bisphenol F BPS bisfenol S; bisphenol S CASA računalniško podprt sistem za analizo semenčic; c omputer assisted sperm analysis CDC center za nadzor bolezni; Center for Disease Control and Prevention Cmax najvišja ugotovljena plazemska koncentracija učinkovine; maximum determined plasma concentration of compound EC Evropska Komisija; European Commission ECHA Evropska agencija za kemikalije; European Chemical Agency EFSA Evropska agencija za varnost hrane; European Food Safety Agency ELISA encimski imunski test; enzyme-linked immunosorbent assay EPA Ameriška agencija za varstvo okolja; Environmental Protection Agency S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 12 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija ER estrogenski receptor Erα estrogenski receptorji tipa alfa ERβ estrogenski receptorji tipa beta ERRγ estrogenskemu receptorju podoben receptor gama; estrogen-related receptor γ FDA Ameriška Uprava za hrano in zdravila; Food and Drug Administration GC-MS/MS plinska kromatografija s tandemsko masno spektrometrično detekcijo; gas chromatography with tandem mass spectrometric detection HPLC tekočinska kromatografija visoke ločljivosti; high-performance liquid chromatography HPLC-FL tekočinska kromatografija visoke ločljivosti s fluorescenčno detekcijo; high-performance liquid chromatography with fluorescence detection HPLC-MS/MS tekočinska kromatografija visoke ločljivosti s tandemsko masno spektrometrično detekcijo; high performance liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection KPHM kemični povzročitelji hormonskih motenj LLE ekstrakcija tekoče-tekoče; liquid-liquid extraction LOD meja detekcije; limit of detection LOQ meja kvantifikacije; limit of quantification MAE ekstrakcija s pomočjo mikrovalov; microwave-assisted extraction MIP molekularno vtisnjeni polimeri; molecularly imprinted polymers S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 13 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija MISPE ekstrakcija na trdni fazi z molekularnim odtisom; molecularly imprinted solid phase extraction MSPD disperzija trdne faze v matriksu; matrix solid-phase dispersion NF - κB jedrni dejavnik kapa-B; nuclear factor kappa-B NOAEL najvišji testni odmerek brez opaznega škodljivega učinka; no-observed-adverse-effect level NOEC najvišja koncentracija brez opaznega učinka; no-observed-effect concentration PLE tekočinska ekstrakcija pod visokim pritiskom; pressurized liquid extraction PRX pregnanski X receptor; pregnane X receptor ROS reaktivne kisikove zvrsti; reactive oxygen species SBSE sorptivna ekstrakcija z mešalnimi palicami; s tir bar sorptive extraction SPE ekstrakcija na trdni fazi; s olid phase extraction SPME mikroekstrakcija na trdnem nosilcu; s olid phase microextraction TDI sprejemljiv dnevni vnos; tolerable daily intake TK toksikokinetika tmax čas, ko je bila dosežena najvišja ugotovljena plazemska koncentracija učinkovine (Cmax); time to peak compound concentration (Cmax) TR receptorji za ščitnične hormone; thyroid hormone receptor t-TDI začasno določen sprejemljiv dnevni vnos; temporary tolerable daily intake S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 14 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 1 UVOD BPA je sestavni del polikarbonatne plastike in epoksi premazov. Nahaja se v embalaži za hrano in pijačo, zaviralcih gorenja, lepilih, gradbenem materialu, elektronskih komponentah, papirju za račune in v številnih drugih proizvodih (1). Slaba lastnost BPA je njegova zmožnost vplivanja na hormonski sistem živali in ljudi, zaradi česar ga uvrščamo med kemične povzročitelje hormonskih motenj (KPHM). KPHM so vnesene snovi oziroma zmesi snovi, ki s spremembami v delovanju hormonskega sistema povzročijo škodljive učinke na zdravje v intaktnega organizma, njegovega potomstva oziroma (sub)populacije. Škodljivi vplivi BPA pri visokih odmerkih veljajo za nedvomno dokazane, medtem ko predstavljajo vplivi nizkih koncentracij, ki smo jim vsakodnevno izpostavljeni, kontroverzno področje (2). Zaradi uporabnosti BPA in množične svetovne proizvodnje plastike in epoksi premazov ugotavljamo BPA, ki izhaja iz plastične embalaže, v hrani in pijači ter v različnih okoljskih vzorcih. Izločanje BPA v okolje je nevarno za ves ekosistem (3), potencialno tudi za živali za proizvodnjo živil, ki bi lahko v stik z BPA prišle prek kontaminirane vode, krme in okolja (4). Študije absorpcije, distribucije in izločanja BPA ter njegovega vpliva na zdravje ljudi so bile pretežno opravljene na laboratorijskih glodavcih, pri katerih so raziskovalci pogosto uporabljali nerealno visoke odmerke, parenteralni vnos ali vnos s sondo. Za opisane pristope nekateri raziskovalci domnevajo, da ne predstavljajo realnega vnosa BPA v organizem (5). Raziskovalce je zanimal tudi vpliv KPHM na zdravje živali, namenjenih za proizvodnjo živil. Ugotovili so, da nekateri KPHM lahko vplivajo na zdravstveno stanje takih živali. Uporaba alternativnih živalskih modelov pri preučevanju škodljivih učinkov KPHM je pomembna tudi zaradi ugotavljanja edinstvenosti škodljivih učinkov pri laboratorijskih živalih (6). Zanimivo je namreč, da se rezultati raziskav o vplivu BPA na različne organske sisteme močno razlikujejo že znotraj ene živalske vrste, npr. pri podganah različnih sojev (7). Eno izmed občutljivejših področij vplivanja BPA na zdravje predstavlja potencialen vpliv BPA na reproduktivno zdravje moških. Do sedaj so v nekaterih in vivo raziskavah, ki so preučevale toksičnost BPA na moške spolne organe in so bile večinoma opravljene na glodavcih, ugotovili vpliv BPA na spermatogenezo in seme živali (8), v drugih raziskavah pa tovrstnega škodljivega vpliva niso ugotovili (9). Naše raziskave smo izvedli na domačih ovcah ( Ovis aries) avtohtone slovenske pasme istrska pramenka. V prvem sklopu doktorske naloge smo preučevali TK BPA pri ovci v laktaciji z jagnjetom in ovnih. Oba postopka, postopek z ovco v laktaciji z jagnjetom in postopek z ovni, sta bila opravljena v Centru za sonaravno rekultiviranje Vremščica Univerze v Ljubljani S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 15 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Veterinarske fakultete. Postopek na ovci je bil izveden za določitev načina vnosa in odmerka v postopku z ovni. Poleg tega smo v postopku z ovco preučevali tudi izločanje BPA z urinom, iztrebki in mlekom. Ker je mleko pomembno živilo za ljudi, v literaturi pa nismo zasledili raziskav, ki bi že dokazale izločanje BPA z mlekom pri prežvekovalcih, smo postavili našo prvo hipotezo, da je BPA v vzorcih ovce mogoče zaznati po dietarnem in podkožnem vnosu. V postopku z ovni pa smo želeli dokazati notranjo izpostavljenost ovnov BPA, zato smo prvi dan postopka pridobili zaporedne vzorce krvne plazme ovnov. Postavili smo drugo hipotezo, da način vnosa in fiziološko obdobje živali vplivata na TK profil BPA. Predpogoj za preučevanje TK pa je bil razvoj kemijskih analiznih metod za določanje koncentracije prostega BPA in celokupnega BPA v kompleksnih bioloških vzorcih. Izraz prosti BPA se v doktorski nalogi in v objavljenih znanstvenih delih nanaša na aglikon oz. nekonjugirani BPA, medtem ko se izraz celokupni BPA nanaša na vsoto aglikona in konjugiranega BPA, katerega glavni del je metabolit, BPA glukuronid (BPAG). Izraz celokupni BPA je bil izbran zaradi načina priprave vzorcev, tj. z encimsko dekonjugacijo glukuronidne vezi z encimom ß-glukuronidaza iz Helix pomatia vrste HP-2, ki smo ga uporabili v nalogi in s katerim najpravilneje navedemo rezultate analize. V drugem sklopu doktorske naloge smo preučevali učinkovanje BPA na spolne organe ovnov v puberteti. Za ugotavljanje potencialnih škodljivih učinkov BPA smo opravili histopatološko preiskavo mod in nadmodkov, morfometrične meritve zvitih semenskih cevk in osnovne reprodukcijske teste semena. Poleg tega smo ugotavljali vpliv na telesno maso in maso mod ovnov. Vzorce za drugi sklop doktorske naloge smo pridobili iz postopka z ovni, ki jim je bila prvi dan odvzeta krvna plazma. Ovni so bili po dvomesečnem vsakodnevnem dietarnem vnosu BPA žrtvovani in raztelešeni. Med raztelesbo smo jim odvzeli moda, nadmodke in pripadajoče semenovode za prej navedene preiskave in teste. Glede na ugotovitve številnih raziskav, opravljenih na glodavcih, smo pričakovali, da bomo z izbranimi metodami dokazali škodljiv učinek BPA na spolne organe ovnov, zato je bila naša tretja hipoteza, da 64-dnevna izpostavljenost BPA s hrano v odmerku 25 µg/kg t. m. vpliva na morfološke značilnosti mod in osnovne parametre semena. S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 16 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 1.1 PREGLED LITERATURE V vseh večceličnih organizmih je nujen ustrezno delujoč hormonski sistem, ki zagotavlja usklajeno delovanje hormonov. Ti delujejo kot kemični prenašalci sporočil med organi in tkivi. Hormone izločajo žleze z notranjim izločanjem, ti se nato prenesejo do ciljnih celic, kjer se vežejo na celične receptorje. Za normalno delovanje organizma je potrebno usklajeno delovanje številnih hormonov, ki delujejo sinhrono, v pravih koncentracijah in ob pravem času. Na hormonski sistem lahko vplivajo snovi, ki motijo njegovo delovanje na različne načine; lahko spreminjajo sintezo, transport, metabolizem hormonov in/ali tekmujejo za vezavo na celičnih receptorjih oz. spreminjajo nivo receptorjev na ciljnih celicah. Spremembe lahko vključujejo povečano ali zmanjšano aktivnost ali spodbujanje aktivnosti v neprimernih časih. Te snovi imenujemo hormonski motilci (angl. endocrine disruptors). Nekateri hormonski motilci so prisotni v naravi in so rastlinskega izvora (fitoestrogeni), druge proizvajajo glive (mikoestrogeni) (10, 11). Naravne hormonske motilce poznamo že dolgo časa. Prvi podatki o mikoestrogenih so se v literaturi pojavili že leta 1920, ko so na farmah prašičev v ZDA poročali o zmanjšanju reproduktivne sposobnosti svinj, ki so bile krmljene s plesnivim žitom (12). Kasneje so ugotovili, da je razlog za zmanjšanje reproduktivne sposobnosti svinj uživanje mikoestrogenov, ki jih vsebuje plesen (13). Drugi hormonski motilci, ki so javnosti postali bolje znani šele sredi devetdesetih let prejšnjega stoletja, so narejeni sintetično in jih zaradi tega natančneje imenujemo kemični povzročitelji hormonskih motenj (KPHM) (2). Med te spadajo zelo različne antropogene snovi, kot so sestavine plastike, detergentov in goriv, konzervansi, obstojna organska onesnaževala, pesticidi in produkti gorenja (11). 1.1.1 Kemični povzročitelji hormonskih motenj KPHM je glede na definicijo Svetovne zdravstvene organizacije iz leta 2002 od zunaj vnesena snov oziroma zmes snovi, ki vpliva na delovanje hormonskega sistema in povzroči škodljive učinke na zdravje intaktnega organizma, njegovega potomstva oziroma (sub)populacije. Skladno z definicijo je za uvrstitev snovi med KPHM potreben dokaz vzročne povezave med izpostavljenostjo intaktnega organizma vneseni snovi in škodljivim učinkom po hormonskem načinu delovanja (2). Podobne definicije so podale tudi druge nacionalne in mednarodne organizacije, kot so Nemški zvezni urad za oceno tveganja (nem. Das Bundesinstitut für Risikobewertung; BfR), Evropska komisija (angl. European Commission; EC), Evropska S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 17 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija agencija za varnost hrane (angl. European Food Safety Agency; EFSA) in Ameriška agencija za varstvo okolja (angl. Environmental Protection Agency; EPA). Iz vseh definicij izhaja, da mora KPHM povzročiti škodljive učinke, kot so morfološke in funkcionalne spremembe celic, tkiv, organa ali organizma (14-17). Trenutno je na seznamu v Evropi priznanih KPHM, ki so ga leta 2020 na spletni strani edlists.org objavile nekatere evropske države (Belgija, Danska, Francija, Nizozemska, Švedska in Španija), več kot sto substanc, med njimi tudi BPA (18). 1.1.2 Prežvekovalci kot model za preučevanje KPHM Za preiskovanje KPHM so bili ustvarjeni protokoli, na podlagi katerih se sprejemajo regulatorne odločitve. V protokolih je skoraj ekskluzivno predpisana raba in vitro metod ali laboratorijskih glodavcev, rezultate pa uporabljajo za oceno tveganja za ljudi. Laboratorijski glodavci se v raziskavah uporabljajo zaradi relativno nizke cene, kratkih razvojnih obdobij ter številnih in velikih legel (19). Pri delu z laboratorijskimi glodavci so se pokazale tudi nekatere omejitve, kot sta majhnost živali in s tem neprimernost za odvzem večjih količin vzorcev. Poleg tega sta interpretacija in ekstrapolacija rezultatov zaradi razlik v fiziologiji glodavcev in ljudi lahko zelo zahtevni ali celo nemogoči. Raziskovalce je obenem zanimalo, kako splošne ali edinstvene so ugotovitve o KPHM pri laboratorijskih glodavcih, zaradi česar so se odločili za uporabo drugih modelnih organizmov, med katere spadajo prašiči (20), psi (21), primati (22), koze (23) in ovce (19, 24, 25). Nekatere druge raziskovalce je zanimalo, ali lahko KPHM v okolju, vključno s tistimi v krmi, vplivajo na reprodukcijsko zmogljivost rejnih živali (26, 27). Zaenkrat ni dovolj dokazov, da bi KPHM v neeksperimentalnih pogojih vplivali na reprodukcijo domačih živali (27). 1.1.3 Bisfenol A 1.1.3.1 Kemijske lastnosti Bisfenol A (2,2'-bis(4-hidroksifenil)propan ali 4,4'-izopropildendifenol, BPA) s CAS številko 80-05-7 je organska snov in spada med alkilfenole. Je zmerno hidrofoben (logP 3,25), slabo topen v vodi (89 mg/l) in izraža šibke kisle lastnosti (pKa = 9,7) (Slika 1) (28). Njegova molska masa znaša 228,29 g/mol (29). S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 18 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Slika 1: Kemijska struktura BPA Figure 1: Chemical structure of BPA 1.1.3.2 Zgodovina in uporaba BPA so po podatkih iz literature prvič sintetizirali že leta 1891 (30), vendar so ga šele v šestdesetih letih prejšnjega stoletja v industriji začeli uporabljati za proizvodnjo epoksi smol in polikarbonatne plastike (31). Ker je polikarbonatna plastika, ki vsebuje BPA, odporna na lomljenje in toploto ter je prozorna (32), je povpraševanje po BPA hitro naraščalo in še vedno narašča. Količina proizvedenega BPA naj bi samo v letu 2020 znašala 595307 ton (33). BPA se večinoma uporablja pri izdelavi polikarbonatih plastičnih materialov in epoksi smol, v manjši meri tudi pri proizvodnji zaviralcev gorenja, nenasičenih poliestrskih smol, polivinilklorida, poliakrilata in polisulfonskih smol. Najdemo ga v številnih izdelkih, kot so embalaža za hrano in pijačo, medicinski pripomočki, vodovodne cevi, barve, talne obloge, izolacije, tesnila, elektronika, tekstil, ogrevalni sistemi, pohištvo, papir, pesticidi, kozmetika, igrače in zobne plombe (29). Pred uporabo v industriji so iskali možnosti uporabe BPA v farmaciji. Leta 1934 sta Dodds in Lawson preizkušala sintetične snovi, ki bi lahko nadomestile drag naravni estrogen, in s pomočjo testa na podganah ugotovila, da ima BPA šibko estrogeno delovanje (34, 35). BPA je tako tudi ena izmed prvih poznanih sintetičnih snovi, ki posnema delovanje ženskega spolnega hormona estrogena. Ker sta Dodds in Lawson s sodelavci v tem obdobju odkrila tudi farmakološko aktivnejšo snov dietilstilbestrol (DES), se je za nekaj desetletij v farmacevtske namene obdržala zgolj slednja (36). 1.1.3.3 Viri izpostavljenosti Prisotnost BPA v naravnem okolju je povezana z antropogeno aktivnostjo, saj BPA v naravi ne nastaja. Največ BPA se v okolje izloči ob njegovi proizvodnji in obdelavi ter ob degradaciji polimerov (epoksi premazov in polikarbonatov). BPA iz polikarbonatov izhaja v večji meri s S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 19 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija hidrolizo polimerov, v manjši pa z difuzijo (37). Čeprav v okolju hitro razpada, se vanj neprestano izloča (38). Do danes so ga zaznali v hrani in pijači, vodi, tleh in celo v ozračju (39). Izpostavljenost ljudi in živali BPA je velika; rezultati raziskave Centra za nadzor bolezni (angl. Center for Disease Control and Prevention; CDC), ki je bila izvedena na več kot 2500 prebivalcih ZDA, so pokazali, da so v urinu pri več kot 92,6 % zaznali BPA (40). Prav tako so BPA zaznali v mleku doječih mater (41-47). Ljudje so BPA pretežno izpostavljeni z uživanjem hrane in pijače. Viri vnosa BPA pa so tudi zrak, prah, izdelki za osebno nego in termični papir (48, 49). Vnos je tako v manjši meri mogoč tudi z vdihavanjem ali skozi kožo (50). V literaturi nismo zasledili podatkov, v kolikšni meri so BPA izpostavljene živali. Gorecki in sod. so analizirali surovo meso rejnih živali in v njem ugotovili zgolj prosti BPA, ne pa drugih metabolitov monoglukuronida, diglukuronida in sulfata, ki bi nakazovali, da so bile rejne živali izpostavljene BPA (51). Pri maloštevilnih analizah hrane psov in mačk ter krme za živali (52-56) so ugotovili, da lahko živali s hrano zaužijejo BPA. V mokri hrani za pse v konzervah so namreč namerili 11‒206 ng/g BPA (53) in 5‒208 ng/g BPA (55), v mačjih konzervah 13‒136 ng/g BPA (53), v mokri mačji hrani 1,58 ng/g BPA, v vrečkah z mokro mačjo hrano 0,591 ng/g in v suhi mačji hrani 1,18 ng/g BPA (54). Na Kitajskem so ugotovili, da BPA prehaja tudi iz plastične embalaže v krmo za živali, saj so ga namerili v koncentracijah od 6,24 do 2443 ng/g BPA, odvisno od vrste plastične embalaže (52). 1.1.3.4 Regulatorni vidiki Zaradi vseprisotnosti, široke uporabe in skrbi za zdravje ljudi je BPA v delih sveta reguliran na nekaterih področjih uporabe in izdelkov (57). Evropska unija EFSA je kmalu po ustanovitvi leta 2006 določila vrednost sprejemljivega dnevnega vnosa1 (angl. tolerable daily intake; TDI) BPA na 50 µg BPA/kg t. m. Vrednost TDI je bila določena z uporabo 100-kratnega faktorja glede na vrednost najvišjega odmerka, pri katerem ni prišlo do opaznih neželenih učinkov (angl. no-observed-adverse-effect level; NOAEL). EFSA je svojo oceno tveganja za BPA posodobila v letih 2008 in 2010 in obakrat potrdila vrednost TDI iz leta 1 TDI je ocena količine onesnaževalca v hrani ali pitni vodi, izražena na podlagi t. m., ki se lahko zaužije vsak dan vse življenje brez znatnega tveganja za zdravje potrošnika na podlagi vseh znanih dejstev v času ocene (58). S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 20 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 2006 (59-61) ter leta 2010 podala mnenje, da je količina vnesenega BPA do te vrednosti varna ter da je verjetno izpostavljenost vseh skupin prebivalstva pod to mejo. Kljub temu je EFSA izrazila nekaj dvomov glede možnega vpliva BPA na dojenčke in ugotovila, da so glede tega potrebni zanesljivejši podatki (60, 61). Na podlagi tega mnenja je zaradi previdnosti januarja 2011 EC prepovedala uporabo BPA v plastičnih stekleničkah za hranjenje dojenčkov v EU (62). Leta 2015 je EFSA na podlagi novih podatkov in metod za BPA začasno zmanjšala vrednost sprejemljivega dnevnega vnosa (angl. temporary TDI; t-TDI) na 4 µg/kg t. m. do pridobitve rezultatov dalj časa trajajočih raziskav na podganah, ki so bile BPA izpostavljene prenatalno in postnatalno. Na podlagi Znanstvenega mnenja o tveganjih za javno zdravje glede prisotnosti bisfenola A v živilih iz leta 2015 so zaključili, da je izpostavljenost BPA po dietarnem in nedietarnem vnosu pod dovoljeno mejo, in sicer dva- do petkrat nižja od vrednosti t-TDI, odvisno od starostne skupine (63). V osnutku ponovne ocene BPA, napisanem 15. 12. 2021, je strokovni svet EFSA za materiale v stiku z živili, encime in pripomočke za predelavo predlagal novo vrednost TDI 0,04 ng/kg t. m./dan. V osnutku so zapisali, da je znižanje vrednosti TDI predvsem posledica rezultatov raziskav na živalih v obdobju med letoma 2013 in 2018, ki so pokazale na škodljive učinke BPA na imunski sistem. V raziskavah na živalih so opazili povečanje števila T celic pomagalk, ki igrajo ključno vlogo pri celičnih imunskih mehanizmih in ki lahko povzročijo alergijsko vnetje pljuč (64). Druge države Kanada je bila prva država, v kateri so omejili uporabo, uvoz, oglaševanje in prodajo izdelkov, ki vsebujejo BPA. Ta omejitev se je nanašala na polikarbonatne otroške stekleničke, pločevinke in drugo embalažo, v kateri je bila otroška hrana (65). V ZDA je Uprava za hrano in zdravila (angl. Food and Drug Administration; FDA) junija 2012 prepovedala uporabo BPA v otroških stekleničkah in skodelicah. Nato je junija 2013 prepovedala uporabo BPA v embalaži za pakiranje živil, ki se uporabljajo za otroško prehrano. FDA je leta 2008 za BPA določila vrednost NOAEL za peroralni vnos na 5 mg/kg t. m./dan (66), na podlagi česar so postavili vrednost TDI 50 µg/kg t. m./dan, ki velja še danes (67). V državah Afrike, JV Azije ter Južne in Srednje Amerike, ki spadajo med države v razvoju, omejitev uporabe BPA skoraj ni (68). S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 21 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 1.1.3.5 Analogi Omejevanje uporabe BPA je privedlo do iskanja alternativnih snovi. Namesto BPA se zaradi strukturne podobnosti najpogosteje uporabljata bisfenol F (BPF) in bisfenol S (BPS) (69, 70). Po podatkih Evropske agencije za kemikalije (angl. European Chemical Agency; ECHA) se v Evropi letno proizvede ali uvozi 1000–10000 milijonov ton BPS (71) in 10–100 ton BPF (72). BPS in BPF so dokazali v izdelkih za osebno nego (73), v izdelkih iz papirja in v živilih (69, 70). BPS se uporablja v čistilnih izdelkih, premazih za električne izdelke in različnih industrijskih aplikacijah kot sestavina fenolnih smol, v termičnem papirju, vključno z izdelki, ki se tržijo kot »papir brez BPA«. BPF je prisoten v vodovodnih ceveh, zobnih tesnilnih masah, premazih za rezervoarje in cevi, industrijskih tleh, premazih za ceste in mostove, strukturnih lepilih in malti. Poleg tega se uporablja tudi v embalaži za živila. BPF je tudi sestavni del epoksidnih smol (69, 70). Zaradi vse večje uporabe in strukturne podobnosti z BPA sta BPS in BPF pritegnila pozornost raziskovalcev, ki so ugotovili, da imajo lahko tudi analogi BPA škodljive učinke za zdravje, saj so lahko citotoksični, genotoksični in mutageni ter imajo lahko toksične učinke na reproduktivne organe (74-77). 1.1.4 Metode za detekcijo BPA v bioloških vzorcih Določitev vsebnosti BPA v bioloških vzorcih vključuje naslednje korake: zbiranje in hranjenje vzorcev, pripravo vzorcev, ki vključuje predpripravo, ekstrakcijo in čiščenje vzorcev ter določitev koncentracije z inštrumentalno analizno metodo (28). 1.1.4.1 Priprava vzorcev Za določanje BPA v bioloških vzorcih je ključen korak priprava vzorcev, ki je večinoma dolgotrajna in delovno intenzivna (78, 79). Priprava vzorcev je v veliki meri odvisna od vrste vzorca. Za predpripravo trdnih vzorcev se običajno uporablja homogenizacija, za predpripravo tekočih vzorcev pa se uporabljata filtracija in/ali centrifugiranje. Poleg tega je za posebne vzorce potrebna posebna predpriprava, npr. vzorci z visoko vsebnostjo beljakovin lahko zahtevajo njihovo odstranitev z obarjanjem (28). Za ekstrakcijo in čiščenje BPA v bioloških vzorcih se uporabljajo različni pristopi, najpogosteje so to ekstrakcija s topilom (angl. solvent extraction; SE), ekstrakcija tekoče-tekoče (angl. liquid-liquid extraction; LLE) in ekstrakcija na trdni fazi (angl. solid phase extraction; SPE). Drugi pristopi so še ekstrakcija s pomočjo mikrovalov (angl. microwave-assisted extraction, S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 22 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija MAE), tekočinska ekstrakcija pod visokim pritiskom (angl. pressurized liquid extraction; PLE), disperzija trdne faze v matriksu (angl. matrix solid-phase dispersion; MSPD), mikroekstrakcija na trdnem nosilcu (angl. solid-phase microextraction; SPME) in sorptivna ekstrakcija z mešalnimi palicami (angl. stir bar sorptive extraction; SBSE) (28). Od leta 2000 so se metode priprave vzorcev precej razvile, k temu sta v veliki meri prispevali tako uporaba nanostrukturnih tekočin, imenovanih supramolekularna topila, ki združujejo ekstrakcijo in čiščenje v eni fazi (80, 81), kot tudi uporaba selektivnih sorbentov, kot so molekularno vtisnjeni polimeri (angl. molecularly imprinted polymers; MIPs) (Slika 2). To so sintetični, po meri izdelani polimeri z vnaprej določeno strukturno selektivnostjo za določen analit ali skupino strukturno povezanih spojin. Nosilce MIP dobimo s polimerizacijo funkcionalnih in zamreženih monomerov okoli vzorčne molekule, pri čemer nastane močno zamrežen tridimenzionalni mrežni polimer (82, 83). Nastali vtisnjeni polimeri so zelo stabilni, robustni in odporni proti fizikalno-kemijskim spremembam, kot so sprememba vrednosti pH, temperature in topil, zato tehnika molekularnega vtiskovanja predstavlja obetavno in ugodno alternativo za premagovanje težav, povezanih z biomolekulami, kot so protitelesa, encimi in druge receptorske molekule (84). Nosilci MIP lahko omogočijo izolacijo in čiščenje analitov v enem koraku ter zagotovijo čistejše ekstrakte v primerjavi s klasično SPE (28). Uporaba MIP v ekstrakciji na trdni fazi oz. tako imenovana ekstrakcija na trdni fazi z molekularnim odtisom (MISPE) je daleč najnaprednejša uporaba MIP (79). Slika 2: Ekstrakcijska kolona za ekstrakcijo na trdni fazi s selektivnim polnilom z MIP tehnologijo Figure 2: Solid phase extraction column with selective filler with MIP technology S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 23 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 1.1.4.2 Določitev koncentracije z inštrumentalno metodo Za določitev koncentracije BPA v kompleksnih bioloških vzorcih je potrebna uporaba visoko občutljivih in selektivnih analiznih metod. Zato se za določanje koncentracije BPA v slednjih uporabljajo predvsem kromatografske metode, in sicer najpogosteje tekočinska kromatografija visoke ločljivosti s fluorescenčno detekcijo (HPLC-FL), tekočinska kromatografija visoke ločljivosti s tandemsko masno spektrometrično detekcijo (HPLC-MS/MS) in plinska kromatografija s tandemsko masno spektrometrično detekcijo (GC-MS/MS). Tekočinska kromatografija je v primerjavi s plinsko kromatografijo enostavnejša, saj zanjo ni potrebna visoka temperaturna obstojnost analitov oz. ni potreben dodaten korak derivatizacije vzorcev, vendar plinska kromatografija zaradi dolgih kromatografskih kolon običajno omogoča boljšo resolucijo. Druge tehnike, kot so tekočinska kromatografija visoke ločljivosti z elektrokemično detekcijo, kapilarna elektroforeza (angl. capillary electrophoresis), imunoanaliza (ELISA in imunokromatografske metode), in nekatere nove metode, kot so senzorji, se uporabljajo v manjši meri (28, 78). Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti s fluorescenčno detekcijo HPLC-FL se zaradi svoje visoke specifičnosti in selektivnosti šteje za primerno potrditveno metodo za organske ostanke ali kontaminante, ki kažejo nativno fluorescenco, in za molekule, ki kažejo fluorescenco po kateri koli transformaciji ali derivatizaciji (85). Nativno fluorescenco z vzbujevalno in emisijsko valovno dolžino 275 oziroma 305 nm kaže tudi BPA, kar smo uporabili tudi pri naših meritvah. Običajne inštrumentalne meje za kvantifikacijo BPA s to metodo so v območju med 5 in 50 ng/ml. Metoda je tako primerna za določanje BPA v zelo različnih vzorcih. Uporabili so jo že za določanje BPA v pijači, vinu, hrani za živali, sadju, zelenjavi, medu in ribah (53, 86-91). Običajne meje detekcije za določanje BPA v hrani in pijači so bile med 0,1 in 2 ng/ml oz. med 1 in 5 ng/g (28). 1.1.5 Toksikokinetika BPA TK je veda, ki proučuje vplive organizma na toksin, torej vplive na njegovo sprostitev, absorpcijo, presnovo v telesu in izločanje iz telesa. Določitev absorpcije, porazdelitve v tkivih, metabolizma in izločanja BPA so prvi pogoj za oceno tveganja, saj so ti parametri temeljni pri ugotavljanju toksičnosti. Ti procesi so odvisni od načina vnosa BPA v organizem (92). S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 24 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 1.1.5.1 Absorpcija in metabolizem Pri ljudeh, primatih in glodavcih se BPA po peroralnem vnosu v veliki meri in hitro absorbira iz gastrointestinalnega trakta (93-97); v raziskavi Völkla in sod. se je po peroralnem vnosu z urinom izločilo 97 % vnesenega odmerka pri moških in 84 % vnesenega odmerka pri ženskah (93, 94). Rezultati raziskav na ljudeh so sovpadali z rezultati raziskav na opicah (95). Po peroralni aplikaciji je absolutna biološka uporabnost pri primatih 0,9-1,9 %, pri podganah pa 2,8 % (98). BPA se iz gastrointestinalnega trakta prenese v jetra, kjer se s pomočjo jetrnih encimov pretvori v metabolite (3). Glavni metabolit, ki nastane z mehanizmom konjugacije z glukuronsko kislino pod vplivom encimov UDP-glukuroniltransferaz, je BPAG (Slika 3) (93, 99). Slika 3: Reakcija konjugacije aglikona BPA v BPAG Figure 3: Conjugation reaction of aglycone BPA to BPAG Poleg glukuronidiranja je eden od procesov metabolizma BPA tudi sulfatiranje, ki poteka z encimi sulfotransferazami (100). Sulfatiranje je manj pomembna metabolna pot (101) in pri primatih predstavlja manj kot 20 %, pri podganah pa manj kot 5 % metabolizma BPA (61). Pri ljudeh so v raziskavi, izvedeni na 30 prostovoljcih, ugotovili, da je BPAG v urinu predstavljal 69,5 % vnesenega odmerka, z 21 % mu je sledil BPA-sulfat, najmanj (9,5 %) pa je bilo prostega BPA (102). Provencher in sod. pa so v nedavni raziskavi na prostovoljcih ugotovili, da se je z urinom v obliki BPAG izločilo 94,6 % odmerka BPA, v obliki BPA-sulfata 3,7 % odmerka in v obliki prostega BPA 1,7 % odmerka (103). Poleg BPAG in BPA-sulfata nastanejo pri visokih koncentracijah vnesenega BPA še nekateri drugi metaboliti, in sicer 5-hidroksi BPA, 3-hidroksi BPA in BPA-O-kinon. Do njihovega nastanka pride ob nasičenju encimov, ki katalizirajo reakcijo glukuronidacije (104). S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 25 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija BPAG in BPA-sulfat nista več estrogensko aktivna, medtem ko so za oksidativne metabolite BPA v in vitro raziskavah ugotovili enako estrogensko aktivnost kot pri prostem BPA (101). V primerjavi s peroralnim vnosom je biološka uporabnost BPA večja pri parenteralnih vnosih, kot so podkožni, intravenski in intraperitonealni vnos (105). Raziskovalci menijo, da peroralni vnos s sondo ni enak dietarnemu vnosu (106). Dietarni vnos BPA so uporabili v raziskavi s psi (21), primati (107), na ljudeh (108, 109) ter v eni raziskavi z ovcami (5), kjer so ugotovili, da se TK parametri razlikujejo glede na način vnosa. Pri dietarnem vnosu se BPA absorbira skozi sluznico ustne votline in iz želodca ter črevesja, medtem ko se pri peroralnem vnosu s kapsulami ali sondo absorbira le v prebavnem traktu. Biološka uporabnost BPA po dietarnem vnosu je bila prav tako večja v primerjavi s peroralnim vnosom s sondo (21). 1.1.5.2 Izločanje Pri ljudeh in primatih se BPAG zaradi povečane hidrofilnosti izloča predvsem skozi ledvice z urinom (61), razpolovni čas (t1/2) pri ljudeh je manj kot 6 ur (108). Pri glodavcih se BPAG izloča v žolč in iz žolča v črevo, kjer se iz črevesja v krvni obtok reabsorbira v prosti obliki (enterohepatični cikel). Opisani cikel se večkrat ponovi. Izločanje BPA pri glodavcih v večji meri poteka z iztrebki. Pri podganah je t1/2 med 19 in 78 urami. Zaradi počasnega izločanja so glodavci dlje časa izpostavljeni prostemu BPA (110). Izločanje v mleko Raziskave, v katerih so preučevali prenos BPA v mleko, so zelo redke. Vse in vivo raziskave so bile opravljene na glodavcih (111-114). Doerge in sod. so raziskovali prenos BPA v mleko podgan po ponavljajočem peroralnem vnosu in ugotovili 0,19 µg/l prostega BPA in 1,6 µg/l celokupnega BPA eno uro po vnosu 100 µg BPA/kg t. m. Na podlagi rezultatov so izračunali, da mladiči z mlekom prejmejo zgolj 1/300 odmerka, ki so ga dali materam (113). Da bi se raziskovalci izognili kontaminaciji vzorcev zaradi vsesplošne razširjenosti BPA v okolju, so v raziskavi uporabili z izotopom označen BPA. Odmerek 100 µg/kg t. m. je bil izbran zato, da je bil znotraj linearnega TK območja in da je bil čim bližje območju predlagane izpostavljenosti ljudi, vendar dovolj visok za merjenje proste in konjugirane oblike. Raziskovalci menijo, da je prenos BPA v mleko omejen s serumskimi ravnmi prostega BPA, čeprav se lipofilna oblika prostega BPA učinkovito porazdeli v mleko (koeficient porazdelitve mleko/serum je 1,3). Ta vrednost je podobna razmerju mleko/serum S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 26 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija vrednosti 2,5, o kateri so poročali v raziskavi Yoo in sod., kjer so podganam namestili intravensko infuzijo in jim BPA vnašali do stacionarnega stanja v krvni plazmi (111). Koncentracije prostega BPA v raziskavi Doerge in sod. (113) so bile podobne koncentracijam (2000 nM) iz raziskave Okabayashija in Watanabeja, ki so jih v mleku izmerili 2 uri po peroralnem vnosu BPA podganam Sprague–Dawley (112). V raziskavi so Doerge in sod. glede na porazdelitveni koeficient, ki je bil manjši za konjugirano kot za prosto obliko BPA, domnevali, da konjugirana oblika BPA slabo prehaja v mleko (porazdelitveni koeficient = 0,062) (113). Podobno vrednost (0,06) bi dobili iz meritev skupne radioaktivnosti v mleku in krvni plazmi pri podganah F344 v laktaciji eno uro po peroralnem vnosu 500 μg 14C-BPA/kg t. m. (115). 1.1.6 Toksikodinamika BPA Zaradi visoke proizvodnje, uporabe v širokem razponu izdelkov in posledične razširjenosti v okolju ter izpostavljenosti ljudi je BPA danes eden izmed najbolj raziskanih KPHM (116). BPA se lahko veže na oba estrogenska receptorja: na estrogenski receptor alfa (Erα) in beta (Erβ) s tem, da je njegova afiniteta do Erβ večja (117). Njegova estrogenska aktivnost je približno pet velikostnih redov nižja od estrogenske aktivnosti 17β-estradiola (118, 119). BPA v in vitro testih kaže tudi antiandrogensko delovanje (101, 120). Prav tako je opisano njegovo delovanje na pregnanske X receptorje (PRX) (35), estrogenskemu receptorju podobne receptorje gama (ERRγ) (36), aril ogljikovodikove receptorje (AhR) (121), na membranske estrogenske receptorje ter s proteinom G sklopljene receptorje 30. BPA je tudi antagonist receptorju za ščitnične hormone (TR) (57, 122). Iz navedenih rezultatov raziskav izhaja, da BPA lahko deluje na različne organske sisteme in tkiva. V raziskavah so ugotovili, da lahko vpliva na presnovo in na imunski, živčni in reproduktivni sistem (123). 1.1.6.1 Vpliv na moške spolne organe Vpliv BPA na moške spolne organe so ugotavljali številni raziskovalci v epidemioloških, in vitro ter in vivo raziskavah. S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 27 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Epidemiološke raziskave V epidemiološki raziskavi, opravljeni na Kitajskem, so ugotovili, da so imeli delavci, ki so bili izpostavljeni visokim dozam BPA na delovnem mestu v proizvodnji BPA, manjši libido in večje težave z erekcijo in ejakulacijo (124). V naslednji raziskavi so ugotovili, da imajo moški z višjimi koncentracijami BPA v urinu nižjo koncentracijo semena, nižji odstotek gibljivih semenčic in nižji odstotek vitalnih semenčic (125). Meeker in sod. so med preučevanjem neplodnih parov ugotovili, da sta večja fragmentacija DNA semenčic in manjša kvaliteta semena povezani z višjo koncentracijo BPA v urinu teh moških (126). Po drugi strani Goldstone in sod. (127) ter Mendiola in sod. (128) niso ugotovili nobene povezave med višjimi vrednostmi BPA in reprodukcijskimi parametri. In vitro raziskave In vitro raziskave, pretežno opravljene na celičnih kulturah Sertolijevih celic podgan, so pokazale, da BPA negativno vpliva na njihovo vitalnost in celo povzroča apoptozo (129). Wang in sod. menijo, da je apoptoza Sertolijevih celic, ki so bile izpostavljene BPA, posledica delovanja BPA na PTEN/AKT signalno pot (130). Medtem so Qi in sod. dokazali, da BPA lahko povzroči apoptozo Sertolijevih celic z aktivacijo JNK/p38 MPAK signalne poti in da translokacija NF- κB in Fas/FasL sistema igra ključno vlogo v sproženju apoptoze (131). Poleg tega so Wang in sod. ugotovili, da po izpostavitvi podganjih Sertolijevih celic BPA (50 in 70 μM na dan) pride do povečanega nastanka reaktivnih kisikovih zvrsti (angl. reactive oxygen species; ROS) in disfunkcije mitohondrijev (132). Barbonetti in sod. so enak rezultat dobili, ko so seme moških izpostavili BPA v koncentraciji 300 μM (133). In vivo raziskave V literaturi so najštevilčnejše prav in vivo raziskave na živalih v postopkih, med katerimi prevladujejo raziskave na glodavcih. Kljub temu da velja, da so zarodki, novorojenčki in dojenčki najbolj občutljivi za škodljive učinke BPA (134), so bile nekatere raziskave opravljene tudi na glodavcih v kasnejših obdobjih življenja, v puberteti in v odrasli dobi (135-160). V teh raziskavah so ugotovili zmanjšanje absolutne in/ali relativne mase mod in/ali nadmodkov (135-141) oz. povečanje mase mod (142), manjši premer zvitih semenskih cevk (136, 140, 143), nižjo višino zarodnega epitela zvitih semenskih cevk (142, 144, 145) ali večje število apoptotičnih celic (146-149). S histopatološko preiskavo so v modih ugotovili zmanjšanje S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 28 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija števila Leydigovih celic (136, 138), degeneracijo Leydigovih celic in zarodnih celic (141), zmanjšano število zarodnih celic (146, 147), odluščene zarodne celice (143, 150), nekrozo zarodnega epitela (151) in citoplazemsko vakuolizacijo zarodnih celic (145). V nekaterih raziskavah so ugotovili vpliv BPA na kakovost in količino semena, in sicer je BPA zmanjšal gibljivost semenčic v nadmodku, število semenčic, proizvodnjo semenčic, zaloge semena in tranzitni čas semena ter povzročil poškodbe DNK semenčic (135, 145, 152-155). Poleg tega je BPA porušil prooksidativno-antioksidativno ravnovesje v tkivu mod in nadmodka odraslih podgan (135, 137, 153, 156). Eden izmed razlogov za različne rezultate opisanih raziskav je lahko uporaba protokolov raziskav, ki so si bili med seboj zelo različni. V raziskavah so bili uporabljeni odmerki v širokem razponu (0,0002 do 960 mg/kg t. m. (135, 136), v različnih časovnih izpostavljenostih (od 6 dni do 48 tednov) (142, 150) in pri različnih načinih vnosa (pitna voda, dajanje v žrelo, podkožno, intraperitonealno) (144, 150, 152, 157). Poleg tega so raziskovalci uporabili različne soje podgan (Wistar, Sprague-Dawley, albino) (137, 144, 153) in mišk (Kunming, Pzh: SFIS, CD-1 miške, švicarsko-albinske miške, ICR miške, C57BL/6 miške) (146, 147, 150, 158-160), ki so prav tako različno dovzetne za učinke estrogenih snovi (7). Le dve in vivo raziskavi sta bili izvedeni na drugih vrstah sesalcev, na navadnih marmozetkah ( Callithrix jacchus) (22) in kozah ( Capra hircus) (161). Navadne marmozetke so v omenjeni raziskavi prejemale BPA v odmerku 2,5, 12,5 ali 25 μg/kg t. m./dan. V skupini opic, ki je prejemala 12,5 μg/kg t. m. BPA/dan, so ugotovili povečano število odluščenih zarodnih celic v lumnih zvitih semenskih cevk in edem intersticija; v skupini opic, ki je prejemala 25 μg/kg t. m. BPA/dan, pa so ugotovili vakuolizacijo Sertolijevih celic in zmanjšanje števila primarnih spermatocitov in okroglih ter podolgovatih spermatid (22). Odrasli kozli so BPA prejemali v odmerku 25 mg/kg t. m./dan, BPA je bil v tej raziskavi uporabljen za pozitivno kontrolo, glavna preučevana snov pa je bila rastlinski izvleček lepega slaka ( Ipomoea carnea). Edini ugotovljeni spremembi pri kozlih, izpostavljenih BPA, sta bili vakuolarna degeneracija celic rete testis in zmanjšana integriteta celične membrane semenčic (161). S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 29 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 1.2 HIPOTEZE Zastavili smo si tri delovne hipoteze: 1. V vzorcih mleka ovce je BPA mogoče zaznati po dietarnem in podkožnem vnosu. 2. Način vnosa in fiziološko obdobje živali vplivata na TK profil BPA. 3. 64-dnevna izpostavljenost BPA s hrano, v odmerku 25 µg/kg t. m., vpliva na morfološke značilnosti mod in osnovne parametre semena. S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 30 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 2 OBJAVLJENA ZNANSTVENA DELA 2.1 PRELIMINARNA TOKSIKOKINETIČNA RAZISKAVA PRI MLEČNI OVCI V LAKTACIJI PO DIETARNEM IN PODKOŽNEM VNOSU BISFENOLA A Preliminary toxicokinetic study of BPA in lactating dairy sheep after repeated dietary and subcutaneous administration Sabina Šturm1, Iztok Grabnar2, Andrej Škibin1, Milan Pogačnik1, Vesna Cerkvenik-Flajs1 1Veterinarska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija 2Fakulteta za farmacijo, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija Scientific Reports: 10: e6498 (9 str.), doi: 10.1038/s41598-020-63286-z © 2020 Springer Nature Limited S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 31 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Izvleček Prehrana je glavni način izpostavljenosti ljudi BPA, eno od pomembnejših živil je mleko. Namen naše preliminarne raziskave je bil ovrednotiti izpostavljenost BPA in njegovo razpoložljivost v ovčjem mleku po večkratnem dietarnem in podkožnem vnosu relativno nizkega dnevnega odmerka (100 µg/kg t. m./dan) ovci v postopku. Z razvojem toksikokinetičnega modela smo na podlagi meritev krvne plazme in mleka ocenili odstotek izločenega BPA v mleko, ki je bil manjši od 0,1 % ne glede na način vnosa. Na podlagi toksikokinetičnega modela smo tudi ugotovili, da se BPA pri ovcah iz krvi v mleko verjetno prenese v večji meri v prosti (nekonjugirani) obliki. Na podlagi te ugotovitve in izvedene meritve domnevamo, da se prosti BPA verjetno naknadno presnovi v mlečni žlezi. Odstotek odmerka BPA, izločenega v mleko, je minimalen ne glede na način vnosa ovci v postopku. S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 32 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 33 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 34 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 35 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 36 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 37 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 38 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 39 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 40 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 41 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 2.2 DETERMINACIJA PROSTEGA IN CELOKUPNEGA BISFENOLA A V URINU IN IZTREBKIH OVCE Z METODO HPLC S FLUORESCENČNO DETEKCIJO Determination of free and total bisphenol A in the urine and feces of orally and subcutaneously dosed sheep by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection Sabina Šturm, Andrej Škibin, Milan Pogačnik, Vesna Cerkvenik-Flajs Veterinarska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija Journal of environmental science and health, Part B: 55(7): 655–68, doi: 10.1080/03601234.2020.1759329 © 2020 Informa UK Limited S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 42 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Izvleček V raziskavi smo razvili analizno metodo, ki je omogočila preučevanje izločanja prostega BPA, celokupnega BPA in njegovega glavnega metabolita BPAG. Vzorce urina in iztrebkov smo pridobili iz postopka, v katerem smo eni ovci pasme istrska pramenka pet dni zaporedoma vnašali 100 μg/kg BPA. Vsebnost prostega BPA in celokupnega BPA v vzorcih smo izmerili s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC) na obrnjeni stacionarni fazi ter s fluorescenčno detekcijo. Zaradi dobrega izkoristka, natančnosti in občutljivosti sta se metodi izkazali za uporabni tudi za nadaljnje ekotoksikološke raziskave prostega BPA, BPAG in celokupnega BPA. Rezultate smo primerjali z vrednostmi, ki so jih raziskovalci ugotovili v živalskih izločkih na farmah. S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 43 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 44 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 45 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 46 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 47 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 48 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 49 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 50 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 51 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 52 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 53 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 54 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 55 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 56 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 57 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 2.3 BAZIČNA RAZISKAVA DIETARNEGA VNOSA BISFENOLA A (BPA) OVNOM PASME ISTRSKA PRAMENKA IN UGOTAVLJANJE REPRODUKTIVNE TOKSIČNOSTI Basic exploratory study of bisphenol A (BPA) dietary administration to Istrian Pramenka rams and male toxicity investigation Sabina Šturm1, Klaus Weber2, Primož Klinc1, Ellinor Spörndly-Nees3, Azadeh Fakhrzadeh4, Tanja Knific1, Andrej Škibin1, Věra Fialová5, Yoshimasa Okazaki2, Tanja Razinger2, Jürgen Laufs2, Robert Kreutzer2, Milan Pogačnik1, Tanja Švara1, Vesna Cerkvenik-Flajs1 1Veterinarska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija 2AnaPath, Hammerstrasse 49, 4410 Liestal, Švica 3Oddelek za anatomijo, fiziologijo in biokemijo, Švedska univerza za agronomijo, P.O. Box 7011, 75007 Uppsala, Švedska 4Iranski raziskovalni inštitut za informacijsko znanost in tehnologijo (IranDoc) Provinca Teheran, št. 1090, Enghelab, Teheran 13157 73314, Iran 5Biopharm, Raziskovalni inštitut za biofarmacijo in veterinarska zdravila, Pohoří-Chotouň 90, 254 01 Jílové u Prahy, Češka republika Toxics: 10: e224 (17 str.), doi: 10.3390/toxics10050224 © 2022 MDPI S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 58 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Izvleček BPA je okoljsko onesnaževalo, ki povzroča endokrine motnje. Po poročanju raziskovalcev ima BPA vpliv na reproduktivno toksičnost različnih živali v postopkih. V tej raziskavi smo ugotavljali, ali dolgotrajna dvomesečna izpostavljenost 25 µg/kg t. m. (majhen odmerek) BPA vpliva na spermatogenezo ali kakovost sperme pri mladih ovnih pasme istrska pramenka, ki so bili BPA izpostavljeni s hrano. Ocenili smo telesno maso in maso mod, histopatologijo mod in nadmodkov ter analizirali semenčice. Čeprav je bilo med obema skupinama nekaj razlik, te niso bile velike ali statistično značilne. Edina statistično značilna razlika je bila nižja višina zarodnega epitela zvitih semenskih cevk pri tretiranih ovnih v primerjavi s kontrolnimi ovni. Poleg ugotavljanja toksičnosti so bile po prvem dajanju določene koncentracije BPA v krvni plazmi tretiranih ovnov in izračunani toksikokinetični parametri celokupnega BPA. V tej raziskavi nismo odkrili večjih sprememb, ki bi nakazovale na motnje v reprodukciji pri ovnih. S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 59 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 60 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 61 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 62 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 63 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 64 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 65 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 66 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 67 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 68 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 69 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 70 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 71 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 72 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 73 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 74 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 75 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 76 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 3 RAZPRAVA Preučevanje TK BPA pri ovci in ovnih Širša javnost in raziskovalci so zadnja leta vse bolj zaskrbljeni zaradi možnega vpliva tudi zelo nizkih odmerkov KPHM, in sicer predvsem na prostoživeče živali in ljudi (162). Ena izmed bolje preučevanih snovi, ki spada med KPHM, je BPA. V literaturi ni veliko raziskav o absorpciji, distribuciji in izločanju preučevane snovi pri sesalcih, še posebej v naravnem okolju in pri koncentracijah, ki so v njem lahko prisotne. V prvem sklopu doktorske naloge smo zato preučevali pot BPA skozi organizem in njegovo izločanje v okolje pri ovci v laktaciji s sesnim jagnjetom po dietarnem in podkožnem vnosu (prva raziskava) in pri ovnih po dietarnem vnosu (druga raziskava). Predpogoja za izvedbo TK analiz sta bila razvoj in validacija kemijskih analitskih metod v bioloških vzorcih ovce in ovnov, ki sta omogočila dokazovanje zelo nizkih koncentracij BPA v vzorcih. Glede na razpoložljivo inštrumentalno opremo smo na podlagi dostopne literature razvili metodo za HPLC-FL, s katero smo v bioloških vzorcih določali tako prosti kot celokupni BPA. Za izolacijo celokupnega BPA smo vzorce predhodno dekonjugirali z encimom β- glukuronidaza. Pri določevanju tako prostega kot celokupnega BPA, smo vzorce krvne plazme, mleka in iztrebkov ekstrahirali z organskim topilom acetonitrilom, v katerem je BPA dobro topen in ki dobro obarja proteine in denaturira encime. Vzorce urina pa smo redčili z vodo (prosti BPA) oz. s pufrom s pH vrednostjo 4,8 (celokupni BPA) in direktno nanesli na SPE kolonice. Za čiščenje prostega BPA v urinu in iztrebkih smo izvedli dvostopenjsko SPE, najprej s polnilom Chromabond HR-X, s sferičnim, hidrofobnim kopolimerom polistirena in divinilbenzena (PS/DVB) (Macherey-Nagel, Düren, Nemčija), nato pa še z visoko selektivnim sorbentom MIP v ekstrakcijskih kolonicah AFFINIMIP SPE (AFFINISEP, Petit-Couronne, Francija). Za čiščenje prostega BPA v krvni plazmi in mleku smo zaradi manjšega biološkega ozadja uporabili le SPE z MIP sorbentom, za čiščenje celokupnega BPA pa smo pri vseh matriksih uporabili dvostopenjsko SPE, z obema zgoraj navedenima sodobnima sorbentoma. SPE smo izvedli po postopku Deceunincka in sod., ki je bil razvit za analizo prostega BPA v S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 77 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija živilih (163). Izpustili pa smo zadnji del njihove metode in sicer predkolonsko derivatizacijo, ki je zaradi uporabljene HPLC ni bilo potrebno izvesti, pri fluorescenčni detekciji pa smo izkoristili tudi dejstvo, da BPA izkazuje nativno fluorescenco. Pri analiznem delu smo uporabljali sistem nadzora kakovosti in se pri tem opirali na smernice za analitske metode in interpretacijo rezultatov, ki veljajo v Evropski uniji (164). Analitske metode smo validirali po naslednjih parametrih: linearnosti, izkoristku, preciznosti, meji detekcije (LOD) in meji kvantifikacije (LOQ). Linearnost ugotavljanja prostega in celokupnega BPA je bila dobra, saj je bil kvadrat korelacijskega koeficienta r2 večji ali enak 0,99 za vse vrste matriksov. Izkoristek za prosti BPA v vzorcih krvne plazme, mleka, urina in iztrebkov se je gibal med 41,6 in 88,4 %, izkoristek za celokupni BPA pa se je gibal med 42,0 in 67,6 %. LOD za prosti BPA v krvni plazmi je bila 0,05 µg/l, v mleku 0,1 µg/l, v urinu 0,1 µg/l in iztrebkih 2 µg/kg. LOD za celokupni BPA v krvni plazmi je bila 0,4 µg/l, v mleku 0,2 µg/l, v urinu 10 µg/l in iztrebkih 1 µg/kg. LOQ za prosti BPA v krvni plazmi je bila 0,25 µg/l, v mleku in urinu 0,5 µg/l, v iztrebkih pa 2 µg/kg. LOQ za celokupni BPA v krvni plazmi je bila 1 µg/l, v mleku 0,5 µg/l, v urinu 100 µg/l in v iztrebkih 2 µg/kg. V raziskavi, ki smo jo opravili na eni ovci s sesnim jagnjetom, smo ugotavljali vpliv različnih poti vnosa BPA na TK parametre BPA v krvni plazmi, mleku, urinu in iztrebkih ovce. Vpliv vnosa na TK parametre smo preučevali, ker smo želeli v raziskavi z ovni uporabiti najrealnejši možen vnos, ki smo mu načeloma izpostavljeni ljudje, tj. s hrano. Med raziskovalci namreč poteka razprava o tem, ali bi bilo za raziskave, ki ugotavljajo škodljiv vpliv KPHM, treba opustiti peroralni vnos s sondo (106). Vzrok za razpravo so raziskave, pri katerih so ugotovili, da se BPA lahko absorbira že v ustni votlini, ki je pri vnosu BPA po sondi izvzeta (5, 21). Absorpcija snovi pri t. i. dietarnem vnosu namreč poteka učinkovito tudi preko sluznice ustne votline, kar vodi do hitrega prenosa v arterije, ki to snov prenašajo v tkiva. Pomembno je, da se kemikalije, ki se absorbirajo po tej poti, izognejo metabolizmu prvega prehoda v črevesju in jetrih. Poleg tega je peroralni vnos po sondi povzročil stresni odziv (165) pri živalih v postopkih, kar je pri preučevanju KPHM še posebej problematično. Ker pa za tako nizke odmerke BPA (velikostnega reda 100 µg/kg t. m. BPA/dan), kot smo jih želeli uporabiti, v literaturi nismo našli podatka, ali bomo BPA v krvni plazmi ovc z uporabljeno analitsko metodo sploh lahko zaznali, smo v raziskavo vključili še podkožni vnos. S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 78 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija V raziskavi z ovco smo ugotovili, da je bila po dietarnem vnosu Cmax prostega BPA v krvni plazmi 2,15 µg/l dosežena v 0,33 ure (tmax). AUC je bila 1,28 µg h/l. TK parametri prostega BPA po podkožnem vnosu so se razlikovali od parametrov po dietarnem vnosu, in sicer je bila Cmax prostega BPA v krvni plazmi 6,41 µg/l dosežena v dveh urah. AUC je bila 33,3 µg h/l. Podkožni vnos je povzročil večjo in daljšo izpostavljenost prostemu BPA v primerjavi z dietarnim vnosom. Naši rezultati so podobni raziskavi Guignarda in sod., v kateri so prav tako pri ovcah primerjali dietarni in podkožni vnos (166). V naši raziskavi je bila Cmax prostega BPA pri podkožnem vnosu trikrat višja kot pri dietarnem vnosu, v njihovi raziskavi pa je bila Cmax prostega BPA pri podkožnem vnosu 4,6 ± 1,5-krat višja kot pri dietarnem vnosu. V raziskavi Guignarda in sod. je bila Cmax po dietarnem vnosu dosežena zelo hitro, v 0,12 ure pri dveh ovcah in v 0,20 ure pri drugih dveh, medtem ko je bila Cmax po podkožnem vnosu dosežena po 2 urah pri treh ovcah in po 1 uri pri eni ovci. Rezultati naše raziskave so bili podobni rezultatom njihove raziskave tudi glede TK parametrov BPAG v krvni plazmi. V primerjavi s prostim BPA je časovni potek koncentracije BPAG pri obeh načinih izpostavljenosti zelo podoben (166). Za BPAG sicer velja, da nima biološke aktivnosti (101). Guignard in sod. so izračunali, da je biološka razpoložljivost BPA lahko kar 30-krat nižja ob dietarnem vnosu v primerjavi s podkožnim vnosom (166). Glede na pridobljene rezultate lahko potrdimo del hipoteze, da način vnosa vpliva na TK profil BPA, in sicer da dietarni vnos povzroči manjšo in krajšo izpostavljenost prostemu BPA. Izmerjene koncentracije prostega in celokupnega BPA v krvni plazmi ovce, skupaj z meritvami prostega in celokupnega BPA v mleku, so nam služile kot osnova za TK model, ki smo ga razvili za oceno izločanja BPA v ovčje mleko. S TK modelom smo ocenili delež odmerka, izločenega z mlekom, ki je bil manj kot 0,1 % tako za prosti kot za celokupni BPA ne glede na način vnosa. Ta rezultat je primerljiv z rezultati raziskave, ki so jo opravili Snyder in sod. Pri podganah so 8 ur po vnosu ugotovili le majhen delež 14C-BPA (0,63 +/- 0,13 µg/equiv/mL) (114). S TK modelom smo na podlagi nižje vrednosti informacijskega kriterija Akaike (AIC) ugotovili, da se najverjetneje v mlečno žleze prenese le prosti BPA. Ker pa smo v mleku zaznali tudi celokupni BPA, ki smo ga na isti časovni točki izmerili več kot prostega BPA, domnevamo, da se v mlečni žlezi prosti BPA metabolizira v BPAG. Prav tako so Doerge in sod. pri glodavcih posredno dokazali, da se v mlečno žlezo v večji meri prenese prosti BPA, v manjši meri pa BPAG (113). Domnevamo, da bi se lahko prosti BPA v mlečni žlezi v BPAG metaboliziral s S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 79 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija pomočjo encima uridin 5′-difosfo-glukuronoziltransferaze (UDP-glukuronoziltransferaze). V posameznih raziskavah so v tkivu dojk žensk namreč ugotovili prisotnost encimov UDP-glukuronoziltransferaz (UGT) (167-169). Rezultati raziskave Streetove in sod. pa potrjujejo sposobnost glukuronidacije BPA v tkivu dojk pri ženskah, čeprav so aktivnosti glukuronidacije veliko nižje (za več kot 100000-krat) v primerjavi s tistimi, ki so bile ugotovljene v jetrih (170). V literaturi nismo zasledili raziskav, ki bi ugotavljale prisotnost UGT v mlečni žlezi ovc, domnevamo pa, da so mlečne žleze vseh sesalcev verjetno opremljene s primerljivimi mehanizmi razstrupljanja. V vzorcu mleka ovce smo po dietarnem vnosu ocenili prisotnost prostega BPA na 0,05 µg/l in izmerili 0,78 µg/l celokupnega BPA. Po podkožnem vnosu smo v vzorcu mleka ovce izmerili 0,87 µg/l prostega BPA in 1,89 µg/l celokupnega BPA. Prvo hipotezo, da je v vzorcih mleka ovce mogoče zaznati BPA po dietarnem in podkožnem vnosu, smo tako potrdili. V prvi raziskavi smo ovci odvzeli tudi vzorce urina in iztrebkov. Ker nismo imeli na razpolago metaboličnih kletk, nismo mogli zajeti vsega urina in iztrebkov, zato deleža vnesenega odmerka BPA v teh biološkim materialih nismo mogli izračunati. Smo pa na podlagi zaporednih meritev po vnosu BPA kljub temu ugotovili, da se je BPA, ne glede na način vnosa, večinoma izločil z urinom kot BPAG, le majhen del pa se ga je izločil kot prosti BPA. V eni časovni točki, tj. štiri ure po prvem dietarnem vnosu, smo v vzorcih urina ovce izmerili 15,81 µg/l prostega BPA in 15157 µg/l celokupnega BPA, v vzorcih iztrebkov pa sta bila prosti in celokupni BPA manjša od LOD (< 1 µg/kg). Podobno smo 4–4,5 ure po prvem podkožnem vnosu v vzorcih urina ovce izmerili 11,53 µg/l prostega BPA in 13846 µg/l celokupnega BPA, v vzorcih iztrebkov pa sta bila prosti in celokupni BPA prav tako manjša od LOD (< 1 µg/kg). Da se BPA večinoma izloča skozi ledvice v obliki BPAG, so ugotovili tudi v drugih raziskavah, opravljenih na ovcah (171, 172), opicah (92), in prašičih (173). Pri podganah je bil delež BPAG, izločenega z urinom, zgolj 6,5 % (97) zaradi enterohepatične poti BPA, ki se pri tej živalski vrsti večinoma izloča z iztrebki. Omejitev naše raziskave je bila posredno določanje BPAG z metodo encimske dekonjugacije. Posledično je bila določena koncentracija BPAG v vzorcih urina v naši raziskavi najverjetneje višja od realne koncentracije v vzorcih, saj smo dekonjugacijo opravili z encimom ß-glukuronidaza iz Helix pomatia vrste HP-2, ki ima tako glukuronidazno (≥ 100.000 U/ml) kot sulfatazno (≤ 7.500 U/ml) aktivnost. To so dokazali tudi Lacroix in sod., saj je bila S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 80 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija koncentracija neposredno izmerjenega BPAG v njihovi raziskavi nižja od koncentracije BPAG, pridobljene z encimsko dekonjugacijo (171). In vivo raziskave, v katerih so določali vsebnost BPA v iztrebkih, so bile opravljene le na opicah (92) in podganah (97). Pri opicah se je BPA v veliko manjšem deležu izločil z iztrebki (1,8–3,1 %) kot pri podganah (78–82 %). Pri obeh vrstah živali so v vzorcih iztrebkov zaznali le prosti BPA (92, 97). V naši raziskavi so bile ugotovljene koncentracije prostega BPA v iztrebkih podobno nizke kot pri opicah. Prav tako smo v iztrebkih zaznali primerljivo količino celokupnega BPA in prostega BPA, kar posredno nakazuje na to, da je delež BPAG, ki se izloči z iztrebki, tudi pri ovcah zelo majhen. Izločki živali (gnojnica in gnoj), namenjenih za proizvodnjo živil, se v nekaterih kmetijskih praksah še vedno odlagajo neposredno na kmetijske površine. Ker smo v naši raziskavi ugotovili, da se BPA pri ovcah izloča pretežno z urinom, bi uporaba gnojnice (sestavljene iz urina in iztrebkov) lahko negativno vplivala na tla in življenje v tleh. V večini raziskav je sicer koncentracija brez opaznega učinka (angl. no-observed-effect concentration; NOEC) za kopenske nevretenčarje visoka; za kolobarnike ( Enchytraeus crypticus) je ≥100 mg/kg suhe mase, za skakače ( Folsomia candida) pa je ≥ 500 mg/kg suhe mase (174). Vendar pa so raziskave z nižjimi odmerki BPA pri kopenskih nevretenčarjih še zelo redke. Ena izmed njih je raziskava Babićeve in sod., v kateri so dokazali, da že izpostavljenost koncentraciji 0,023 µg/l BPA pri deževnikih ( Eisenia fetida) povzroča degenerativne spremembe v celični strukturi jajčnikov (175). V raziskavi, ki smo jo opravili na ovnih, smo uporabili štirikrat nižji odmerek (25 µg/kg t. m./dan) kot v raziskavi z ovco. Pričakovali smo, da bomo glede na rezultate prve raziskave z našo analitsko metodo in koncentriranjem vzorcev lahko zaznali tudi štirikrat nižje vrednosti BPA v krvni plazmi. Žal so bile ugotovljene koncentracije prostega BPA prenizke, da bi lahko ocenili izpostavljenost ovnov tej obliki BPA. Kljub temu da prostega BPA nismo izmerili, pa so bile izmerjene koncentracije celokupnega BPA dovolj visoke, da smo na njihovi podlagi lahko naredili osnovno neprostorsko TK analizo. Ker smo v prvi raziskavi na ovci v laktaciji uporabili enako metodologijo in živalsko vrsto, vendar štirikrat višji odmerek, je rezultate zanimivo primerjati z našo drugo raziskavo z ovni. Cmax za celokupni BPA je v raziskavi z ovco znašala 43,46 µg/l, kar je približno štirikrat višja povprečna Cmax kot v raziskavi z ovni (10,93 +/- 1,9 µg/l). Prav tako je bil tmax v prvi raziskavi pri ovci dosežen v 0,33 ure, v drugi raziskavi pri šestih ovnih med 0,33–1 uro, zgolj pri enem ovnu pa šele po šestih urah. Pri vseh ovnih smo S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 81 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija ugotovili drugi koncentracijski vrh približno po šestih urah po dietarnem vnosu BPA. Drugega koncentracijskega vrha pa nismo zaznali v prvi raziskavi z ovco v laktaciji. Tudi Guignard in sod. niso zaznali drugega koncentracijskega vrha (5, 166). Do pojava drugega koncentracijskega vrha celokupnega BPA po šestih urah bi po naših ugotovitvah lahko prišlo zaradi potencialno prisotne enterohepatične cirkulacije. Drugega dela druge hipoteze, ki se nanaša na vpliv fiziološkega obdobja živali, tj. vpliva starosti in spola živali na TK profil BPA nismo morali ne potrditi, ne zavreči, saj so bile vrednosti prostega BPA v krvni plazmi ovnov prenizke, da bi jih lahko uporabili v TK analizi in posledično medsebojna primerjava TK profilov ovce in ovnov ni bila mogoča. Preučevanje vpliva BPA na spolne organe ovnov v puberteti Namen drugega sklopa doktorske naloge je bil pridobiti podatke o vplivu BPA na spolne organe ovnov in s tem ugotoviti vpliv na njihovo reproduktivno sposobnost. Rezultati naše raziskave, v kateri so bili ovni izpostavljeni 25 μg//kg t. m. BPA/dan po prehranski poti in pri katerih smo ob koncu dvomesečne izpostavljenosti ugotavljali vpliv BPA na telesno maso, absolutno maso mod, vpliv na histopatologijo mod in nadmodkov, nekatere morfometrične značilnosti zvitih semenskih cevk in vpliv na kvaliteto ter kvantiteto semena, prispevajo k boljšemu poznavanju toksičnosti nizkih odmerkov BPA na moško reprodukcijo. Prva posebnost naše druge raziskave je bila uporaba eksperimentalnega živalskega modela, ki v primerjavi z dostopnimi podatki v znanstveni literaturi niso bile miške ali podgane, druga posebnost je bila uporaba dietarnega vnosa, tretja posebnost pa je bila uporaba relativno nizkega odmerka BPA, in sicer tako nizkega, da po mnenju nekaterih raziskovalcev predstavlja realen vnos BPA za ljudi (5, 116). Ovni so bili v raziskavi izbrani iz dveh razlogov. Eden je bil ugotavljanje, kako splošne so ugotovitve rezultatov raziskav, opravljenih na glodavcih, drugi pa njihova velikost, ki nam je omogočila zadostno količino odvzetih bioloških materialov, da smo lahko potrdili notranjo izpostavljenost BPA. Odmerek 25 μg//kg t. m. BPA/dan smo v raziskavi izbrali, ker je v številnih raziskavah, vključno z nedavno izvedenimi raziskavami konzorcija, ki povezuje akademska in regulativna S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 82 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija spoznanja o toksičnosti BPA (angl. Consortium Linking Academic and Regulatory Insights on BPA Toxicity; CLARITY-BPA), opisan kot nizek odmerek (176). Poleg tega pa smo na podlagi predhodne raziskave na eni ovci in opcijsko večjim koncentriranjem vzorcev krvi za inštrumentalno analizo presodili, da bomo po tem odmerku lahko dokazali notranjo izpostavljenost prostemu BPA. Odmerek 25 µg/kg telesne mase pri povprečnem odraslem človeku s 60 kg telesne mase pomeni izpostavljenost 1,5 mg BPA na dan, česar nekateri raziskovalci sicer nimajo za nizko izpostavljenost BPA (177). V naši raziskavi smo pri ovnih, izpostavljenih BPA, ugotovili nižjo telesno maso in maso mod v primerjavi z ovni iz kontrolne skupine, vendar pa razlika ni bila statistično značilna. V preostalih raziskavah, v katerih so preučevali vpliv BPA na moške spolne organe glodavcev v puberteti ali v odraslem obdobju, so bili rezultati zelo različni. Tako je bil najnižji odmerek, ki je povzročil nižjo telesno maso mišk/podgan, 0,05 mg/kg t. m./dan (140), najvišji odmerek pa 960 mg/kg t. m./dan (136). Najnižji in najvišji odmerek, povezan z manjšo maso mod, je bil 0,0002 mg/kg t. m./dan (139) oziroma 960 mg/kg t. m./dan (136). V literaturi za najobčutljivejšo preiskavo, s katero se dokazuje toksičnost za moško reprodukcijo pri živalih v postopkih, velja histopatološka preiskava mod in nadmodkov (178). V naši raziskavi s to preiskavo nismo ugotovili morfoloških sprememb, ki so značilne za KPHM in ki bi se pri ovnih, izpostavljenih BPA, pojavljale pogosteje kot pri ovnih iz kontrolne skupine. Histopatološko preiskavo mod z upoštevanjem faz spermatogeneze (179-181) smo opravili po priporočilih za oceno mod in nadmodkov na reproduktivno toksičnost (178, 182). Ugotovili smo, da so bile zvite semenske cevke normalno razvite in so imele vse zarodne celice in ohranjene stopnje spermatogeneze. Izjema sta bila dva ovna – eden iz kontrolne skupine in drugi iz tretirane skupine, ki sta bila ob koncu postopka v obdobju peripubertete. To je bil tudi razlog, da smo ju izključili iz statistične analize rezultatov. V literaturi smo zasledili le eno raziskavo, v kateri so uporabili primerljivo živalsko vrsto. V tej raziskavi so bili odrasli kozli 120 dni izpostavljeni 1000-krat večjemu odmerku BPA kot ovni v naši raziskavi, edina histopatološka sprememba, ki jo je povzročil BPA, pa je bila vakuolarna degeneracija rete testisa (161). Glede na fotografijo, ki prikazuje opisane spremembe, menimo, da je prišlo do napačne interpretacije pri histopatološki preiskavi in da v resnici ne gre za vakuolizacijo rete testisa, temveč za heterotopno maščobno tkivo v vezivu rete testisa, in da histopatoloških S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 83 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija sprememb, ki bi nakazovale na toksičnost BPA, v tej raziskavi niso ugotovili. V raziskavah na glodavcih, ki so bili BPA izpostavljeni v času pubertete ali v odraslem obdobju, so rezultati zelo različni; Jin in sod. so ugotovili zmanjšanje števila spermatogonijev, spermatocit in spermatid že pri odmerku 0,002 mg BPA/kg t. m./dan (149), medtem ko Li in sod. po odmerku 160 mg BPA/kg t. m./dan niso ugotovili histopatoloških sprememb (136). V raziskavah konzorcija CLARITY-BPA pri podganah, ki so bile izpostavljene BPA v odmerkih 2, 5, 25, 250, 2500 in 25000 μg/kg t. m., niso ugotovili histopatoloških sprememb, za katere bi lahko trdili, da jih je povzročil BPA, kljub temu da so bile podgane BPA izpostavljene že od 6. dneva brejosti pa do 21. dne po rojstvu ali do konca postopka, tj. eno oz. dve leti (9, 183). Zanimivo je, da v večini in vivo raziskav na glodavcih, pri katerih so ugotavljali reproduktivno toksičnost, histopatološka preiskava sploh ni bila izvedena (135, 152, 156, 158, 184-186), lahko pa je bila izvedena, vendar niso bile upoštevane smernice za določanje histopatoloških sprememb za ugotavljanje toksičnosti (136, 143, 147, 150, 151). V naši raziskavi niti v modih niti v tkivu nadmodkov nismo ugotovili sprememb, ki bi nakazovale na toksično delovanje BPA na moda ali nadmodke. Kot v modih smo tudi v nadmodkih sicer v obeh skupinah ugotovili minimalne spremembe, vendar nobena izmed teh ni bila pogosteje prisotna pri ovnih, izpostavljenih BPA. Kljub temu da v priporočilih za oceno mod in nadmodkov na reproduktivno toksičnost izpostavljajo pomembnost histopatološke preiskave nadmodkov, so v raziskavah na glodavcih le redko poročali o rezultatih te preiskave. Le v treh raziskavah na odraslih glodavcih so poročali o spremembah v nadmodkih, glavna opisana sprememba pa je bila pomanjkanje semenčic v lumnih kanalčkov nadmodkov (140, 152). Poleg histopatološke preiskave mod in nadmodkov smo na zvitih semenskih cevkah mod opravili tudi morfometrične meritve premera cevk, površine cevk in višine zarodnega epitela v zvitih semenskih cevkah. Presenetljivo je bila višina zarodnega epitela v zvitih semenskih cevkah nižja pri ovnih, ki so bili izpostavljeni BPA. Razlog za opisano razliko bi bil lahko manjše število zarodnih celic v zvitih semenskih cevkah. V naši raziskavi morfologija, gibljivost, parametri smeri in hitrosti gibanja semenčic ter integriteto celične membrane semenčic med skupinama ovnov niso bili statistično značilno različni. Rezultate naše raziskave zaradi razlik v metodologiji težko primerjamo z rezultati raziskav na glodavcih. V naši raziskavi smo namreč nadmodke zaradi njihove velikosti razdelili S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 84 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija na posamezne dele (glava, telo, rep nadmodka) in analize semena izvedli na vsakem delu nadmodka in na semenovodu. Pri glodavcih, kjer je nadmodek manjši, je vsak nadmodek predstavljal le en vzorec. Sicer so rezultati raziskav na glodavcih o vplivu BPA na seme zelo različni. Podobno kot v naši raziskavi sta dve raziskavi na glodavcih, ki so ju izvedli Qiu in sod. (145) ter Liu in sod. (155), poročali o odsotnosti morfoloških napak semenčic. Variabilni so bili tudi rezultati raziskav, v katerih so ugotavljali spremembo gibanja semenčic. V nekaterih raziskavah se je gibljivost zmanjšala (135, 151, 157, 186), v drugih pa se ni spremenila (155). V primerjavi z raziskavami na glodavcih, v katerih so večinoma poročali o zmanjšanju števila semenčic (135, 141, 145, 149, 151, 154, 157, 158, 184, 186, 187), pa v naši raziskavi BPA ni statistično značilno vplival na koncentracijo semenčic v posameznem delu nadmodka ali v semenovodu. Na podlagi vseh rezultatov smo tretjo hipotezo, da dvomesečna izpostavljenost BPA s hrano v odmerku 25 µg/kg telesne mase/dan vpliva na morfološke značilnosti mod in osnovne parametre semena ovnov, zavrnili. Ker smo ugotovili nekatere razlike, ki bi lahko nakazovale na škodljive učinke BPA, ki z izjemo nižjega zarodnega epitela zvitih semenskih cevk niso bile statistično značilne, menimo, da bi bila za zanesljivo potrditev naših rezultatov potrebna raziskava z večjim številom živali v postopku. Kljub temu pa smo v toksikoloških raziskavah večinoma zasledili, da pri večjih živalskih vrstah uporabljajo zgolj štiri živali istega spola na skupino (188). To bi lahko pomenilo, da so štiri živali za relevantnost rezultatov postopka dovolj, lahko pa tudi, da rezultati takih preiskav niso zanesljivi. S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 85 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 4 SKLEPI  V vzorcih mleka ovce, izpostavljene BPA, smo po dietarnem in podkožnem vnosu zaznali prosti in celokupni BPA. Na podlagi tega menimo, da je prenos BPA v mleko pri prežvekovalcih možen, a je minimalen. Poleg tega smo na podlagi TK modela ugotovili, da BPA v mlečno žlezo ovce v večji meri prehaja v prosti, nekonjugirani obliki. Glede na to ugotovitev in glede na izmerjene vrednosti BPA-konjugata in celokupnega BPA v mleku domnevamo, da se prosti BPA verjetno naknadno presnovi v mlečni žlezi.  TK parametri po dietarnem in podkožnem vnosu BPA so različni. Dietarni vnos je v naši raziskavi povzročil manjšo in krajšo izpostavljenost prostemu BPA, medtem ko način vnosa ni vplival na TK parametre celokupnega BPA.  V tkivu mod in nadmodkov nismo ugotovili histopatoloških sprememb, ki bi nakazovale, da BPA deluje toksično. BPA pa bi lahko vplival na koncentracijo semenčic v nadmodku in semenovodu, vendar razlike v naši raziskavi niso bile statistično značilne in bi bile za njihovo potrditev potrebne dodatne raziskave z večjim številom živali. Edina statistično značilna razlika med skupinama je bila nižja višina zarodnega epitela zvitih semenskih cevk pri ovnih, izpostavljenih BPA. S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 86 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 5 POVZETEK BPA je kemična snov, ki se globalno proizvaja in uporablja v velikih količinah. Zaradi široke uporabe je v okolju zelo razširjen. Dokazan je bil v atmosferi, vodi in odplakah, pitni vodi, hrani in celo v stanovanjskem prahu. Kljub temu da ima kratko razpolovno dobo, je v okolju stalno prisoten zaradi neprekinjenega vnosa. V organizem ljudi in živali se najpogosteje vnese s hrano in pijačo, v manjši meri tudi skozi kožo ali z vdihavanjem. Zaradi šibke estrogenske aktivnosti in sposobnosti vezave na številne druge receptorje je poznavanje njegovih TK lastnosti zelo pomembno. Doktorsko disertacijo smo izvedli na domačih ovcah ( Ovis aries). V prvem sklopu naloge smo preučevali TK parametre pri ovci in ovnih pasme istrska pramenka po zaporednem dietarnem in podkožnem vnosu BPA. Namen tega sklopa je bil preučiti absorpcijo in eliminacijo BPA in ovrednotiti vpliv vnosa na TK parametre BPA. Razvili in validirali smo kemijske analitske metode za določanje prostega in celokupnega BPA v kompleksnih bioloških vzorcih – v krvni plazmi, mleku, urinu in iztrebkih. Za določanje BPA smo vzorce očistili in ekstrahirali s pomočjo sodobnega sorbenta MIP, ki je selektivno vezal preiskovani analit. Za določanje celokupnega BPA oz. posredno BPAG smo vzorce pred tem dodatno dekonjugirali z encimom ß-glukuronidaza in uporabili še dodatno SPE z nosilcem Chromabond HR-X. Prav tako smo ta nosilec uporabili za osnovno čiščenje urina in iztrebkov. Uvedene metode smo validirali po osnovnih parametrih, ki so ustrezni glede na smernice za analitske metode in interpretacijo rezultatov v EU, zato menimo, da je razvoj metod uspešen. Rezultati neprostorske TK analize so pokazali, da sta TK profila BPA v krvni plazmi ovce v laktaciji s sesnim jagnjetom različna. Dietarni vnos BPA je povzročil manjšo in krajšo izpostavljenost prostemu BPA, AUC je bila 1,28 µg h/l, v primerjavi s podkožnim vnosom, pri katerem je bila AUC prostega BPA 33,3 µg h/l. TK profila celokupnega BPA oz. BPAG pa sta si bila zelo podobna. V vzorcih mleka smo po šestih urah od dietarnega vnosa ocenili prisotnost prostega BPA na 0,05 µg/l in izmerili 0,78 µg/l celokupnega BPA, po podkožnem vnosu pa smo izmerili 0,87 µg/l prostega BPA in 1,89 µg/l celokupnega BPA. S tem smo potrdili, da se BPA izloča v mleko prežvekovalcev. Poleg tega smo na podlagi meritev prostega in celokupnega BPA v krvni plazmi in mleku razvili prostorski TK model, s katerim smo ocenili izločanje BPA v mleko ovce. Delež izločenega BPA v mleko je bil ne glede na način vnosa manjši od 0,1 % prejetega vnosa. S prostorskim TK modelom smo ugotovili, da se BPA najverjetneje izloča v mleko S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 87 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija predvsem v prosti, nekonjugirani obliki. V urinu ovce smo po dietarnem vnosu izmerili zelo nizke vrednosti prostega BPA (≤ 16,55 µg/l) in visoke vrednosti celokupnega BPA (≤ 15157 µg/l), katerega največji del je bil najverjetneje BPAG. V iztrebkih ovce pa smo izmerili zelo nizke vrednosti prostega BPA (≤ 45,25 µg/kg) in celokupnega BPA (≤ 53,4 µg/kg). Po štirikrat manjšem odmerku, ki so ga prejemali ovni v drugi raziskavi, smo v krvni plazmi določili približno štirikrat nižjo Cmax celokupnega BPA. V drugem sklopu doktorske naloge smo ugotavljali vpliv BPA na spolne organe ovnov, ki so BPA prejemali v puberteti. Med skupinama nismo ugotovili statistično značilnih razlik v pojavnosti in intenziteti histopatoloških sprememb v modih in nadmodkih. Prav tako nismo ugotovili statistično značilnih razlik v premeru in površini zvitih semenskih cevk. Ugotovili pa smo statistično značilno nižjo višino zarodnega epitela zvitih semenskih cevk pri tretiranih ovnih. Telesna masa in masa mod sta bili povprečno malo nižji v tretirani skupini ovnov, vendar razlike med skupinama niso bile statistično značilne. Na semenu smo opravili osnovne teste – pogledali smo morfologijo semenčic, koncentracijo semena, integriteto celične membrane semenčic in s sistemom CASA določili hitrost in smer gibanja semenčic. Statistično značilnih razlik med skupinama nismo ugotovili. Glede na rezultate lahko zaključimo, da BPA ni (bistveno) vplival na spolne organe ovnov. Za potrditev odsotnosti vpliva BPA na spolne organe ovnov pa bi bile potrebne nadaljnje raziskave z večjim številom živali. S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 88 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 6 SUMMARY BPA is a chemical that is produced and used globally in large quantities. Due to its widespread use, it is very common in the environment. It has been detected in the atmosphere, water and sewage, drinking water, food, and even in house dust. Although it has a short half-life, it is constantly present in the environment due to its continuous release. Humans and animals most commonly ingest BPA through food and beverages, and are to a lesser extent exposed to BPA through the skin or by inhalation. Since it has weak estrogenic activity and the ability to bind to a number of receptors, it is important to know its TK properties. This doctoral dissertation was prepared on domestic sheep ( Ovis aries). In the first part, TK parameters were studied in a ewe and rams of the Istrian pramenka breed after sequential dietary and subcutaneous administration of BPA. The aim was to study the absorption and elimination of BPA and to evaluate the influence of the administration route on the TK parameters of BPA. For the purpose of studying the TK parameters, chemical analytical methods for the determination of free and total BPA in complex biological samples - blood plasma, milk, urine and feces - were developed and validated. For the determination of BPA, samples were cleaned and extracted using an MIP sorbent that selectively bound the analyte of interest. For the determination of total BPA or indirectly BPAG, the samples were further deconjugated with ß- glucuronidase enzyme, and an additional SPE with Chromabond HR-X carrier was carried out. The latter carrier was also used for basic cleaning of urine and feces. The methods were validated against basic parameters that are appropriate according to the EU guidelines for analytical methods and interpretation of results. We therefore consider the development of the methods to be successful. The results of noncompartmental TK analysis showed that the TK profiles of BPA in blood plasma of the lactating ewe with a suckling lamb varied. Dietary administration of BPA resulted in a lower and shorter exposure to free BPA – AUC was 1.28 µg h/L, compared with subcutaneous administration, where the AUC of free BPA was 33.3 µg h/L. However, the TK profiles of total BPA and BPAG were very similar. In milk samples, 0.05 µg/l of free BPA was estimated and 0.78 µg/l of free BPA was measured six hours after dietary and subcutaneous administration. At the same sampling point after dietary and subcutaneous administration 0.87 µg/l and 1.89 µg/l of total BPA were measured in milk samples, respectively. These results confirm that BPA is excreted into ruminant milk. In addition, based on the measurements of free and total BPA in blood plasma and milk, we developed a S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 89 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija compartmental TK model to estimate the excretion of BPA into sheep milk. The percentage of BPA excreted in milk was less than 0.1% of the administered dose, regardless of the route of administration. Using a compartmental TK model, we estimated that BPA was most likely excreted in the free, unconjugated form. Very low levels of free BPA (≤ 16.55 µg/L) and high levels of total BPA (≤ 15,157 µg/L) were measured in the urine of sheep after dietary intake, of which the largest fraction was most likely BPAG. However, very low levels of free (≤ 45.25 µg/kg) and total (≤ 53.4 µg/kg) BPA were measured in sheep feces. After a fourfold reduction of the dose, which was received by rams in the second study, we observed an approximately fourfold reduction in the Cmax of total BPA in blood plasma. In the second part of the doctoral dissertation we investigated the effect of BPA on the reproductive organs of rams exposed to BPA during puberty. We found no statistically significant differences between the two groups in the incidence and intensity of histopathological changes in the testes and epididymis. We also found no statistically significant differences in the diameter and surface area of the seminiferous tubules. We did find a statistically significant lower height of the germinal epithelium of the seminiferous tubules in the treated rams. Body weight and testicular weight were on average slightly lower in the treated group of rams, but differences between the groups were not statistically significant. Basic tests were performed on semen – we analyzed the morphology of the spermatozoa, semen concentration, integrity of the spermatozoal cell membrane, and determined movement speed and direction of spermatozoa using CASA. No statistically significant differences were found between the two groups. According to the results, it can be concluded that BPA did not (significantly) affect the reproductive organs of rams. However, further studies with a larger number of animals would be needed to confirm the absence of an effect of BPA on the reproductive organs of rams. S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 90 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 7 ZAHVALA Iskreno se zahvaljujem mentorici zn. svet. dr. Vesni Cerkvenik Flajs za profesionalnost, prijaznost, razumevanje, usmeritve in neskončno mero potrpežljivosti. Hvaležna sem za priložnost, da sem lahko delo opravljala pod Vašim skrbnim mentorstvom. Zahvaljujem se somentorici doc. dr. Tanji Švara za strokovno pomoč in številne napotke ter usmeritve pri raziskovalnem delu ter spodbudo in prijazne besede v težkih trenutkih. Zahvaljujem se predstojniku izr. prof. dr. Mitju Gombaču za ponujeno priložnost in pomoč pri reševanju težav, kadar je bilo treba. Zahvaljujem se članom komisije izr. prof. dr. Mitju Gombaču, prof. dr. Robertu Roškarju in izr. prof. dr. Miranu Brvarju, ki so s svojim pregledom in predlogi pomembno izboljšali to delo. Zahvaljujem se Javni agenciji za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije za financiranje v okviru usposabljanja mladega raziskovalca ter Programski skupini P4-0092 pod vodstvom zn. svet. dr. Matjaža Ocepka za dodatno financiranje. Zahvaljujem se prof. dr. Iztoku Grabnarju za pomoč pri toksikokinetičnih izračunih in modeliranju ter ge. Věri Fialova za toksikokinetične izračune. Zahvaljujem se izr. prof. dr. Primožu Klincu in Mateji Bogataj za čas, napotke in pomoč pri izdelavi protokolov, obdelavi in analizi reprodukcijskih testov. Hvala za pomoč pri obdelavi vzorcev tudi takrat še študentkama Anji in Lenki ter drugim študentom, ki so kakorkoli sodelovali pri delu na Vremščici ali na Kliniki za reprodukcijo. Hvala tudi predstojniku Klinike za reprodukcijo izr. prof. dr. Janku Mrkunu za sprejem in možnost izdelave dela doktorske naloge na kliniki. Hvala dr. Ellinor Spörndly-Nees s Švedske univerze za agronomijo Uppsala za sprejem in pomoč pri učenju prepoznavanja faz spermatogeneze in uvod v histopatološko oceno mod v raziskavah reproduktivne toksičnosti. Hvala tudi dr. Azadeh Fakardesh z Iranskega raziskovalnega inštituta za informacijsko znanost in tehnologijo (IranDoc) za izvedbo morfometričnih analiz. Hvala dr. Klausu Webru in podjetju AnaPath v Švici, ki so omogočili recenzijo rezultatov histopatološke analize mod in nadmodkov ter organizirali delovno skupino za patologijo. S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 91 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Hvala ekipi, ki je opravila poskuse na ICSR Vremščica, predvsem izvajalcu poskusov Andreju Škibinu, dr. vet. med., ter oskrbnikom Petri, Hasanu in Atifu ter vodji poskusa prof. dr. Milanu Pogačniku. Hvala tudi vsem, ki ste se z mano kadarkoli odpravili na Vremščico. Hvala sodelavcem z Inštituta za patologijo, divjad, ribe in čebele – Juretu Omahnu, Benjaminu Cerku, Gregorju Frelihu, Ireni Mubi, Vilmi Lindner, Stanki Galuf, asist. Marku Cvetku, asist. Kristini Tekavec, asist. Tamari Dolenšek, doc. dr. Tanji Švara in izr. prof. dr. Mitju Gombaču ter dr. Tomislavu Pallerju z NVI Enota Ljubljana za pomoč pri raziskavah. Hvala asist. dr. Tanji Knific za napotke in nasvete pri spopadanju z raziskovalnimi izzivi in za pomoč pri statistični obdelavi ter interpretaciji rezultatov. Hvala asist. dr. Jani Brankovič za izkazano zaupanje s sodelovanjem pri postopku in hvala prof. dr. Milki Vrecl Fazarinc za strokovne usmeritve in nasvete. Hvala Marjani Jus, prof. slo., za lektoriranje doktorske naloge, knjižničarkama ge. Stanislavi Ujc in ge. Slavici Sekulič za pregled literature ter ge. Biljani Grubišič za pomoč pri birokratskih postopkih. Zahvaljujem se tudi vsem sodelavcem z Veterinarske fakultete, ki so mi kakorkoli pomagali pri hrambi, procesiranju, odvzemu in transportu vzorcev, potnih nalogih, birokratskih in računalniških težavah. Hvala Kristini, Tanji, Tamari, Bojanu in Janu za pogovore, nasvete in motivacijo ob kavicah. Še posebej hvala »cimri« Kristini za spodbudo, pomoč, tolažbo in prijateljstvo. Hvala Brini za grafično pomoč v kriznih trenutkih. Hvala Luku za lektoriranje angleškega besedila. Hvala Alji in Juretu, ker sta navijala zame. Hvala Juretu za računalniško pomoč v kriznih trenutkih. Hvala Marinki, Ivanki, Vinkotu in Jožu za zgled in podporo. Na koncu se zahvaljujem staršema Jerneji in Iztoku ter bratu Klemenu, ker me podpirate, verjamete vame, in ker imam to srečo, da se lahko brezpogojno zanesem na vas. Hvala staršema tudi za omogočeno skoraj dve desetletji dolgo šolanje. In za konec iskrena hvala Mihu za ljubezen, razumevanje in spodbudo, za praznovanje uspehov in tolažbo, ko kaj ni šlo tako, kot bi si želela. Brez tebe, Ottija in Omnivarja mi ne bi uspelo. S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 92 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 8 LITERATURA 1. Staples CA, Dorn PB, Klecka GM, O'Block ST, Harris LR. A review of the environmental fate, effects, and exposures of bisphenol A. Chemosphere 1998; 36(10): 2149–73. doi: 10.1016/s0045-6535(97)10133-3 2. Perharič L. Hormonski motilci. In: Kemikalije v okolju in rak. XXIV. seminar in memoriam dr. Dušana Reje: konferenčni zbornik. Ljubljana : Zveza slovenskih društev za boj proti raku in Onkološkega inštituta Ljubljana in Nacionalnega inštituta za javno zdravje, 2016: 27–39. 3. Michałowicz J. Bisphenol A--sources, toxicity and biotransformation. Environ Toxicol Pharmacol 2014; 37(2): 738–58. doi: 10.1016/j.etap.2014.02.003 4. Mercogliano R, Santonicola S. Investigation on bisphenol A levels in human milk and dairy supply chain: a review. Food Chem Toxicol 2018; 114: 98–107. doi: 10.1016/j.fct.2018.02.021 5. Guignard D, Gauderat G, Gayrard V, et al. Characterization of the contribution of buccal absorption to internal exposure to bisphenol A through the diet. Food Chem Toxicol 2016; 93: 82–8. doi: 10.1016/j.fct.2016.04.004 6. Magnusson U. Environmental endocrine disruptors in farm animal reproduction: research and reality. Reprod Domest Anim 2012; 47 (4): 333–7. doi: 10.1111/j.1439-0531.2012.02095.x 7. Hossaini A, Dalgaard M, Vinggaard AM, Pakarinen P, Larsen JJ. Male reproductive effects of octylphenol and estradiol in Fischer and Wistar rats. Reprod Toxicol 2003; 17(5): 607–15. doi: 10.1016/j.reprotox.2003.05.001 8. Hass U, Christiansen S, Boberg J, Rasmussen MG, Mandrup K, Axelstad M. Low-dose effect of developmental bisphenol A exposure on sperm count and behaviour in rats. Andrology 2016; 4(4): 594–607. doi: 10.1111/andr.12176 9. Dere E, Anderson LM, Huse SM, et al. Effects of continuous bisphenol A exposure from early gestation on 90 day old rat testes function and sperm molecular profiles: a CLARITY-BPA consortium study. Toxicol Appl Pharmacol 2018; 347: 1–9. doi: 10.1016/j.taap.2018.03.021 10. Darbre PD. Endocrine disruption and human health: overview and scope. 2nd ed. Boston : Academic Press, 2019. 11. Darbre PD. The history of endocrine-disrupting chemicals. Curr Opin Endocr Metab Res 2019; 7: 26–33. doi: 10.1016/j.coemr.2019.06.007 12. McNutt SH, Purwin P, Murray C. Vulvovaginitis in swine: preliminary report. J Am Vet Med Assoc 1928; 73(4): 484–92. S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 93 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 13. Bennett JW, Klich M. Mycotoxins. Clin Microbiol Rev 2003; 16(3): 497–516. doi: 10.1128/cmr.16.3.497-516.2003 14. BfR. No health risk for consumers from Bisphenol A exposure - the BfR endorses the conclusion of the new EFSA assessment [online]. Berlin : German federal institute for risk sssessment, 2015. https://www.bfr.bund.de/en/a-z_index/bisphenol_a-129760.html (1. maj 2022) 15. EC. What are endocrine disruptors? [online]. Belgium : European Commission, 1999. https://ec.europa.eu/environment/chemicals/endocrine/definitions/endodis_en.htm (1. maj 2022) 16. European Food Safety Authority. Scientific opinion on the hazard assessment of endocrine disruptors: scientific criteria for identification of endocrine disruptors and appropriateness of existing test methods for assessing effects mediated by these substances on human health and the environment. EFSA J (Online) 2013; 11(3): e3132 (84 str.) doi: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2013.3132 17. EPA. Research on endocrine disruptors [online]. Durham : United States Environmental Protection Agency, 2021. https://www.epa.gov/chemical-research/research-endocrine-disruptors (1. maj 2022) 18. The Danish Environmental Protection Agency. Endocrine disruptor lists, List I: substances identified as endocrine disruptors at EU level Denmark [online]. Odense : The Danish Environmental Protection Agency, 2022. https://edlists.org/the-ed- lists/list-i-substances-identified-as-endocrine-disruptors-by-the-eu (1. maj 2022) 19. Magnusson U. Can farm animals help to study endocrine disruption? Domest Anim Endocrinol 2005; 29(2): 430–5. doi: 10.1016/j.domaniend.2005.02.034 20. Ljungvall K, Karlsson P, Hultén F, et al. Delayed effects on plasma concentration of testosterone and testicular morphology by intramuscular low-dose di(2-ethylhexyl)phthalate or oestradiol benzoate in the prepubertal boar. Theriogenology 2005; 64(5): 1170–84. doi: 10.1016/j.theriogenology.2005.02.003 21. Gayrard V, Lacroix MZ, Collet SH, et al. High bioavailability of bisphenol A from sublingual exposure. Environ Health Perspect 2013; 121(8): 951–6. doi: 10.1289/ehp.1206339 22. Vijaykumar T, Singh D, Vanage GR, Dhumal RV, Dighe VD. Bisphenol A-induced ultrastructural changes in the testes of common marmoset. Indian J Med Res 2017; 146(1): 126–37. doi: 10.4103/ijmr.IJMR_927_15 23. Lyche JL, Oskam IC, Skaare JU, et al. Effects of gestational and lactational exposure to low doses of PCBs 126 and 153 on anterior pituitary and gonadal hormones and on puberty in female goats. Reprod Toxicol 2004; 19(1): 87–95. doi: 10.1016/j.reprotox.2004.05.005 S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 94 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 24. Evans NP, North T, Dye S, Sweeney T. Differential effects of the endocrine-disrupting compounds bisphenol-A and octylphenol on gonadotropin secretion, in prepubertal ewe lambs. Domest Anim Endocrinol 2004; 26(1): 61–73. doi: 10.1016/j.domaniend.2003.09.005 25. Sweeney T, Fox J, Robertson L, et al. Postnatal exposure to octylphenol decreases semen quality in the adult ram. Theriogenology 2007; 67(5): 1068–75. doi: 10.1016/j.theriogenology.2006.12.010 26. Sweeney T. Is exposure to endocrine disrupting compounds during fetal/post-natal development affecting the reproductive potential of farm animals? Domest Anim Endocrinol 2002; 23(1-2): 203–9. doi: 10.1016/s0739-7240(02)00157-1 27. Magnusson U, Persson S. Endocrine disruptors in domestic animal reproduction: a clinical issue? Reprod Domest Anim 2015; 50 (3): 15–9. doi: 10.1111/rda.12563 28. Ballesteros-Gómez A, Rubio S, Pérez-Bendito D. Analytical methods for the determination of bisphenol A in food. J Chromatogr A 2009; 1216(3): 449–69. doi: 10.1016/j.chroma.2008.06.037 29. NIH, PubChem. Compound Summary: bisphenol A [online]. N. Bethesda : National library of medicine, National center for biotechnology information, 2022. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/bisphenol-A (1. maj 2022) 30. Dianin A. Condensation products of ketones and phenols. Russ J Phys Chem 1892; 23: 488–517. 31. ECHA. Bisfenol A [online]. Helsinki : European Chemicals Agency, 2020. https://echa.europa.eu/sl/hot-topics/bisphenol-a (12. 4. 2020) 32. ChemicalSafety.org. BPA (Bisphenol A) [online]. Washington : American Chemistry Council, 2022. https://www.chemicalsafetyfacts.org/bpa-bisphenol-a/ (12. 4. 2022) 33. Mordor Intelligence. Bisphenol A (BPA) market - growth, trends, covid-19 impact, and forecasts (2022 - 2027) [online]. Hyderbad : Mordor Intelligence, 2022. https://www.mordorintelligence.com/industry-reports/bisphenol-a-bpa-market (5. 5. 2022) 34. Dodds EC, Lawson W. Synthetic oestrogenic agents without the phenanthrene nucleus. Nature 1936; 137: 996. doi: 10.1038/137996a0 35. Dodds EC, Lawson W, Dale HH. Molecular structure in relation to oestrogenic activity. Compounds without a phenanthrene nucleus. Proc R Soc Lond B 1938; 125(839): 222–32. doi: 10.1098/rspb.1938.0023 36. Dodds EC, Goldberg L, Lawson W, Robinson R. Oestrogenic activity of certain synthetic compounds. Nature 1938; 141: 247–8. doi: 10.1038/141247b0 S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 95 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 37. Mercea P. Physicochemical processes involved in migration of bisphenol A from polycarbonate. J Appl Polym Sci 2009; 112(2): 579–93. doi: 10.1002/app.29421 38. Corrales J, Kristofco LA, Steele WB, et al. Global assessment of bisphenol A in the environment: review and analysis of its occurrence and bioaccumulation. Dose Response 2015; 13(3): e1559325815598308 (23 str.) doi: 10.1177/1559325815598308 39. Huang YQ, Wong CK, Zheng JS, et al. Bisphenol A (BPA) in China: a review of sources, environmental levels, and potential human health impacts. Environ Int 2012; 42: 91–9. doi: 10.1016/j.envint.2011.04.010 40. Calafat AM, Ye X, Wong LY, Reidy JA, Needham LL. Exposure of the U.S. population to bisphenol A and 4-tertiary-octylphenol: 2003-2004. Environ Health Perspect 2008; 116(1): 39–44. doi: 10.1289/ehp.10753 41. Otaka H, Yasuhara A, Morita M. Determination of bisphenol A and 4-nonylphenol in human milk using alkaline digestion and cleanup by solid-phase extraction. Anal Sci 2003; 19(12): 1663–6. doi: 10.2116/analsci.19.1663 42. Sun Y, Irie M, Kishikawa N, Wada M, Kuroda N, Nakashima K. Determination of bisphenol A in human breast milk by HPLC with column-switching and fluorescence detection. Biomed Chromatogr 2004; 18(8): 501–7. doi: 10.1002/bmc.345 43. Kuruto-Niwa R, Tateoka Y, Usuki Y, Nozawa R. Measurement of bisphenol A concentrations in human colostrum. Chemosphere 2007; 66(6): 1160–4. doi: 10.1016/j.chemosphere.2006.06.073 44. Ye X, Kuklenyik Z, Needham LL, Calafat AM. Measuring environmental phenols and chlorinated organic chemicals in breast milk using automated on-line column-switching-high performance liquid chromatography-isotope dilution tandem mass spectrometry. J Chromatogr B 2006; 831(1/2): 110–5. doi: 10.1016/j.jchromb.2005.11.050 45. Ye X, Bishop AM, Needham LL, Calafat AM. Automated on-line column-switching HPLC-MS/MS method with peak focusing for measuring parabens, triclosan, and other environmental phenols in human milk. Anal Chim Acta 2008; 622(1/2): 150–6. doi: 10.1016/j.aca.2008.05.068 46. Mendonca K, Hauser R, Calafat AM, Arbuckle TE, Duty SM. Bisphenol A concentrations in maternal breast milk and infant urine. Int Arch Occup Environ Health 2014; 87(1): 13–20. doi: 10.1007/s00420-012-0834-9 47. Yi B, Kim C, Yang M. Biological monitoring of bisphenol A with HLPC/FLD and LC/MS/MS assays. J Chromatogr B 2010; 878(27): 2606–10. doi: 10.1016/j.jchromb.2010.02.008 48. Geens T, Aerts D, Berthot C, et al. A review of dietary and non-dietary exposure to bisphenol-A. Food Chem Toxicol 2012; 50(10): 3725–40. doi: 10.1016/j.fct.2012.07.059 S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 96 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 49. Lu S, Yu Y, Ren L, Zhang X, Liu G, Yu Y. Estimation of intake and uptake of bisphenols and triclosan from personal care products by dermal contact. Sci Total Environ 2018; 621: 1389–96. doi: 10.1016/j.scitotenv.2017.10.088 50. Vandenberg LN, Hauser R, Marcus M, Olea N, Welshons WV. Human exposure to bisphenol A (BPA). Reprod Toxicol 2007; 24(2): 139–77. doi: 10.1016/j.reprotox.2007.07.010 51. Gorecki S, Bemrah N, Roudot AC, et al. Human health risks related to the consumption of foodstuffs of animal origin contaminated by bisphenol A. Food Chem Toxicol 2017; 110: 333–9. doi: 10.1016/j.fct.2017.10.045 52. Wang R, Huang Y, Dong S, Wang P, Su X. The occurrence of bisphenol compounds in animal feed plastic packaging and migration into feed. Chemosphere 2021; 265: e129022 (10 str.) doi: 10.1016/j.chemosphere.2020.129022 53. Kang JH, Kondo F. Determination of bisphenol A in canned pet foods. Res Vet Sci 2002; 73(2): 177–82. doi: 10.1016/s0034-5288(02)00102-9 54. Maršálek P, Kovaříková S, Lueerssen F, Večerek V. Determination of bisphenol A in commercial cat food marketed in the Czech Republic. J Feline Med Surg 2022; 24(2): 160–7. doi: 10.1177/1098612x211013745 55. Cerkvenik-Flajs V, Volmajer Valh J, Gombač M, Švara T. Analysis and testing of bisphenol A, bisphenol A diglycidyl ether and their derivatives in canned dog foods. Eur Food Res Technol 2018; 244(1): 43–56. doi: 10.1007/s00217-017-2930-2 56. Schecter A, Malik N, Haffner D, et al. Bisphenol A (BPA) in U.S. food. Environ Sci Technol 2010; 44(24): 9425–30. doi: 10.1021/es102785d 57. Dunder L. Exposure to bisphenol A (BPA) and metabolic disruption. Uppsala : Uppsala University, 2021. Doktorska disertacija 58. Farlex. The free dictionary [online]. Feasterville : Farlex, 2022. https://medical-dictionary.thefreedictionary.com/tolerable+daily+intake (1. maj 2022) 59. European Food Safety Agency. Toxicokinetics of bisphenol A: scientific opinion of the panel on food additives, flavourings, processing aids and materials in contact with food (AFC). EFSA J (Online) 2008; e759 (10 str.) doi: 10.2903/j.efsa.2008.759 60. European Food Safety Agency. Statistical re-analysis of the Biel maze data of the Stump et al ( 2010 ) study : “developmental neurotoxicity study of dietary bisphenol A in Sprague-Dawley rats.”. EFSA J (Online) 2010; 8(9): e1836 (67 str.) doi: 10.2903/j.efsa.2010.1836 61. European Food Safety Agency. Scientific opinion on bisphenol A: evaluation of a study investigating its neurodevelopmental toxicity, review of recent scientific literature on its toxicity and advice on the Danish risk assessment of bisphenol A. EFSA J (Online) 2010; 8(9): e1829 (116 str.) doi: 10.2903/j.efsa.2010.1829 S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 97 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 62. Commission Directive 2011/8/EU of 28 January 2011 amending Directive 2002/72/EC as regards the restriction of use of bisphenol A in plastic infant feeding bottles. Off J Eur Union (Online) 2011; L26: e11–4. https://eur- lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2011:026:0011:0014:EN:PDF (1. 4. 2020) 63. European Food Safety Agency. Scientific opinion on the risks to public health related to the presence of bisphenol A (BPA) in foodstuffs. EFSA J (Online) 2015; 13(1): e3978 (1040 str.) doi: 10.2903/j.efsa.2015.3978 64. EFSA. Bisphenol A: EFSA draft opinion proposes lowering the tolerable daily intake [online]. Parma : European Food Safety Agency, 2022. https://www.efsa.europa.eu/en/news/bisphenol-efsa-draft-opinion-proposes- lowering-tolerable-daily-intake (1. maj 2022) 65. Government of Canada. Bisphenol A (BPA) risk management approach: performance evaluation for BPA-health component [online]. Quebec : Government of Canada, 2018. https://www.canada.ca/content/dam/eccc/documents/pdf/pded/bpa/Bpa- performance-evaluation-report.pdf (14. 4. 2022) 66. Department of health and human services. Memorandum [online]. Washington : Pulic Health Service, 2014. https://www.fda.gov/media/90546/download (20. 8. 2021) 67. Vom Saal FS, Vandenberg LN. Update on the health effects of bisphenol A: overwhelming evidence of harm. Endocrinology 2021; 162(3): ebqaa171 (25 str.) doi: 10.1210/endocr/bqaa171 68. Baluka SA, Rumbeiha WK. Bisphenol A and food safety: lessons from developed to developing countries. Food Chem Toxicol 2016; 92: 58–63. doi: 10.1016/j.fct.2016.03.025 69. Rochester JR. Bisphenol A and human health: a review of the literature. Reprod Toxicol 2013; 42: 132–55. doi: 10.1016/j.reprotox.2013.08.008 70. Lehmler HJ, Liu B, Gadogbe M, Bao W. Exposure to bisphenol A, bisphenol F, and bisphenol S in U.S. adults and children: the national health and nutrition examination survey 2013-2014. ACS Omega 2018; 3(6): 6523–32. doi: 10.1021/acsomega.8b00824 71. EFSA. Assessment of new information on Bisphenol S (BPS) submitted in response to the Decision 1 under REACH Regulation (EC) No 1907/2006 [online]. Parma : European Food Safety Authority, 2020. https://www.efsa.europa.eu/en/supporting/pub/en-1844 (20. 6. 2022) 72. ECHA. Substance infocard: Bisphenol F [online]. Helsinki : European Chemicals Agency, 2022. https://echa.europa.eu/sl/substance-information/- /substanceinfo/100.140.161 (20. 6. 2022) S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 98 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 73. Liao C, Kannan K. A survey of bisphenol A and other bisphenol analogues in foodstuffs from nine cities in China. Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess 2014; 31(2): 319–29. doi: 10.1080/19440049.2013.868611 74. Kose O, Rachidi W, Beal D, Erkekoglu P, Fayyad-Kazan H, Kocer Gumusel B. The effects of different bisphenol derivatives on oxidative stress, DNA damage and DNA repair in RWPE-1 cells: a comparative study. J Appl Toxicol 2020; 40(5): 643–54. doi: 10.1002/jat.3934 75. Yamasaki K, Noda S, Imatanaka N, Yakabe Y. Comparative study of the uterotrophic potency of 14 chemicals in a uterotrophic assay and their receptor-binding affinity. Toxicol Lett 2004; 146(2): 111–20. doi: 10.1016/j.toxlet.2003.07.003 76. Lee S, Kim C, Shin H, Kho Y, Choi K. Comparison of thyroid hormone disruption potentials by bisphenols A, S, F, and Z in embryo-larval zebrafish. Chemosphere 2019; 221: 115–23. doi: 10.1016/j.chemosphere.2019.01.019 77. Park C, Song H, Choi J, et al. The mixture effects of bisphenol derivatives on estrogen receptor and androgen receptor. Environ Pollut 2020; 260: e114036 (9 str.) doi: 10.1016/j.envpol.2020.114036 78. Sun F, Kang L, Xiang X, et al. Recent advances and progress in the detection of bisphenol A. Anal Bioanal Chem 2016; 408(25): 6913–27. doi: 10.1007/s00216-016-9791-6 79. Cerkvenik-Flajs V, Šturm S. A rapid analysis of bisphenol A using MISPE coupled with HPLC-FLD in tissues of food-producing animals. MethodsX 2021; 8: e101351 (14 str.) doi: 10.1016/j.mex.2021.101351 80. Ballesteros-Gómez A, Sicilia MD, Rubio S. Supramolecular solvents in the extraction of organic compounds. A review. Anal Chim Acta 2010; 677(2): 108–30. doi: 10.1016/j.aca.2010.07.027 81. Rubio S. Twenty years of supramolecular solvents in sample preparation for chromatography: achievements and challenges ahead. Anal Bioanal Chem 2020; 412(24): 6037–58. doi: 10.1007/s00216-020-02559-y 82. Tamayo FG, Turiel E, Martín-Esteban A. Molecularly imprinted polymers for solid-phase extraction and solid-phase microextraction: recent developments and future trends. J Chromatogr A 2007; 1152(1-2): 32–40. doi: 10.1016/j.chroma.2006.08.095 83. Gallego-Gallegos M, Muñoz-Olivas R, Cámara C. Different formats of imprinted polymers for determining organotin compounds in environmental samples. J Environ Manage 2009; 90 [suppl 1]: S69–76. doi: 10.1016/j.jenvman.2008.07.020 84. Kandimalla VB, Ju H. Molecular imprinting: a dynamic technique for diverse applications in analytical chemistry. Anal Bioanal Chem 2004; 380(4): 587–605. doi: 10.1007/s00216-004-2793-9 S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 99 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 85. Commission Implementing Regulation (EU) 2021/808 of 22 March 2021 on the performance of analytical methods for residues of pharmacologically active substances used in food-producing animals and on the interpretation of results as well as on the methods to be used for sampling and repealing Decisions 2002/657/EC and 98/179/EC. Off J Eur Union (Online) 2021; L180: e84–109. https://eur-lex.europa.eu/eli/reg_impl/2021/808/oj (1. 4. 2022) 86. Kang J-H, Kondo F, Katayama Y. Importance of control of enzymatic degradation for determination of bisphenol A from fruits and vegetables. Anal Chim Acta 2006; 555(1): 114–7. doi: 10.1016/j.aca.2005.08.050 87. Inoue K, Murayama S, Takeba K, Yoshimura Y, Nakazawa H. Contamination of xenoestrogens bisphenol A and F in honey: safety assessment and analytical method of these compounds in honey. J Food Compost Anal 2003; 16(4): 497–506. doi: 10.1016/S0889-1575(03)00018-8 88. Braunrath R, Cichna M. Sample preparation including sol-gel immunoaffinity chromatography for determination of bisphenol A in canned beverages, fruits and vegetables. J Chromatogr A 2005; 1062(2): 189–98. doi: 10.1016/j.chroma.2004.11.009 89. Braunrath R, Podlipna D, Padlesak S, Cichna-Markl M. Determination of bisphenol A in canned foods by immunoaffinity chromatography, HPLC, and fluorescence detection. J Agric Food Chem 2005; 53(23): 8911–7. doi: 10.1021/jf051525j 90. Brenn-Struckhofova Z, Cichna-Markl M. Determination of bisphenol A in wine by sol-gel immunoaffinity chromatography, HPLC and fluorescence detection. Food Addit Contam 2006; 23(11): 1227–35. doi: 10.1080/02652030600654382 91. Nerín C, Philo MR, Salafranca J, Castle L. Determination of bisphenol-type contaminants from food packaging materials in aqueous foods by solid-phase microextraction-high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A 2002; 963(1-2): 375–80. doi: 10.1016/s0021-9673(02)00554-x 92. Kurebayashi H, Harada R, Stewart RK, Numata H, Ohno Y. Disposition of a low dose of bisphenol a in male and female cynomolgus monkeys. Toxicol Sci 2002; 68(1): 32–42. doi: 10.1093/toxsci/68.1.32 93. Völkel W, Colnot T, Csanady GA, Filser JG, Dekant W. Metabolism and kinetics of bisphenol a in humans at low doses following oral administration. Chem Res Toxicol 2002; 15(10): 1281–7. doi: 10.1021/tx025548t 94. Völkel W, Bittner N, Dekant W. Quantitation of bisphenol A and bisphenol A glucuronide in biological samples by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Drug Metab Dispos 2005; 33(11): 1748–57. doi: 10.1124/dmd.105.005454 S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 100 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 95. Doerge DR, Twaddle NC, Woodling KA, Fisher JW. Pharmacokinetics of bisphenol A in neonatal and adult rhesus monkeys. Toxicol Appl Pharmacol 2010; 248(1): 1–11. doi: 10.1016/j.taap.2010.07.009 96. Doerge DR, Twaddle NC, Vanlandingham M, Fisher JW. Pharmacokinetics of bisphenol A in neonatal and adult Sprague-Dawley rats. Toxicol Appl Pharmacol 2010; 247(2): 158–65. doi: 10.1016/j.taap.2010.06.008 97. Kurebayashi H, Betsui H, Ohno Y. Disposition of a low dose of 14C-bisphenol A in male rats and its main biliary excretion as BPA glucuronide. Toxicol Sci 2003; 73(1): 17–25. doi: 10.1093/toxsci/kfg040 98. WHO. Toxicological and health aspects of bisphenol A [online]. Ottawa; World Health Organization, 2011. https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/44624/97892141564274_eng.pdf?se quence=1&isAllowed=y (1. 4. 2020) 99. Hanioka N, Naito T, Narimatsu S. Human UDP-glucuronosyltransferase isoforms involved in bisphenol A glucuronidation. Chemosphere 2008; 74(1): 33–6. doi: 10.1016/j.chemosphere.2008.09.053 100. Kim YH, Kim CS, Park S, Han SY, Pyo MY, Yang M. Gender differences in the levels of bisphenol A metabolites in urine. Biochem Biophys Res Commun 2003; 312(2): 441–8. doi: 10.1016/j.bbrc.2003.10.135 101. Gramec Skledar D, Peterlin Mašič L. Bisphenol A and its analogs: do their metabolites have endocrine activity? Environ Toxicol Pharmacol 2016; 47: 182–99. doi: 10.1016/j.etap.2016.09.014 102. Ye X, Kuklenyik Z, Needham LL, Calafat AM. Quantification of urinary conjugates of bisphenol A, 2,5-dichlorophenol, and 2-hydroxy-4-methoxybenzophenone in humans by online solid phase extraction-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Anal Bioanal Chem 2005; 383(4): 638–44. doi: 10.1007/s00216-005-0019-4 103. Provencher G, Bérubé R, Dumas P, et al. Determination of bisphenol A, triclosan and their metabolites in human urine using isotope-dilution liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr A 2014; 1348: 97–104. doi: 10.1016/j.chroma.2014.04.072 104. Ficko U. Primerjava vsebnosti bisfenola A v plastenkah z gazirano in negazirano vodo. Ljubljana : Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, 2012. Diplomska naloga 105. European Commission. Safety of the use of bisphenol A in medical devices. Luxemburg : European Commission, 2015: 166 str. doi: 10.2772/75546 106. Vandenberg L, Welshons W, vom Saal F, Toutain P, Myers J. Should oral gavage be abandoned in toxicity testing of endocrine disruptors? Environ Health 2014; 13(1): 46. doi: 10.1186/1476-069X-13-46 S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 101 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 107. Vom Saal FS, VandeVoort CA, Taylor JA, Welshons WV, Toutain PL, Hunt PA. Bisphenol A (BPA) pharmacokinetics with daily oral bolus or continuous exposure via silastic capsules in pregnant rhesus monkeys: relevance for human exposures. Reprod Toxicol 2014; 45: 105–16. doi: 10.1016/j.reprotox.2014.01.007 108. Thayer KA, Doerge DR, Hunt D, et al. Pharmacokinetics of bisphenol A in humans following a single oral administration. Environ Int 2015; 83: 107–15. doi: 10.1016/j.envint.2015.06.008 109. Teeguarden JG, Twaddle NC, Churchwell MI, et al. 24-hour human urine and serum profiles of bisphenol A: evidence against sublingual absorption following ingestion in soup. Toxicol Appl Pharmacol 2015; 288(2): 131–42. doi: 10.1016/j.taap.2015.01.009 110. EFSA. Opinion of the Scientific Panel on food additives, flavourings, processing aids and materials in contact with food (AFC) related to 2,2-BIS(4-HYDROXYPHENYL) PROPANE (Bisphenol A). EFSA J (Online) 2006; e428 (75 str.) https://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/pub/428 (1. 4. 2022) 111. Yoo SD, Shin BS, Lee BM, et al. Bioavailability and mammary excretion of bisphenol a in Sprague-Dawley rats. J Toxicol Environ Health A 2001; 64(5): 417–26. doi: 10.1080/152873901753170740 112. Okabayashi K, Watanabe T. Excretion of bisphenol A into rat milk. Toxicol Mech Methods 2010; 20(3): 133–6. doi: 10.3109/15376511003646689 113. Doerge DR, Vanlandingham M, Twaddle NC, Delclos KB. Lactational transfer of bisphenol A in Sprague-Dawley rats. Toxicol Lett 2010; 199(3): 372–6. doi: 10.1016/j.toxlet.2010.09.022 114. Snyder RW, Maness SC, Gaido KW, Welsch F, Sumner SC, Fennell TR. Metabolism and disposition of bisphenol A in female rats. Toxicol Appl Pharmacol 2000; 168(3): 225–34. doi: 10.1006/taap.2000.9051 115. Kurebayashi H, Nagatsuka S, Nemoto H, Noguchi H, Ohno Y. Disposition of low doses of 14C-bisphenol A in male, female, pregnant, fetal, and neonatal rats. Arch Toxicol 2005; 79(5): 243–52. doi: 10.1007/s00204-004-0628-2 116. Vandenberg LN, Chahoud I, Heindel JJ, Padmanabhan V, Paumgartten FJ, Schoenfelder G. Urinary, circulating, and tissue biomonitoring studies indicate widespread exposure to bisphenol A. Environ Health Perspect 2010; 118(8): 1055–70. doi: 10.1289/ehp.0901716 117. Wetherill YB, Akingbemi BT, Kanno J, et al. In vitro molecular mechanisms of bisphenol A action. Reprod Toxicol 2007; 24(2): 178–98. doi: 10.1016/j.reprotox.2007.05.010 118. Chen MY, Ike M, Fujita M. Acute toxicity, mutagenicity, and estrogenicity of bisphenol-A and other bisphenols. Environ Toxicol 2002; 17(1): 80–6. doi: 10.1002/tox.10035 S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 102 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 119. Sohoni P, Sumpter JP. Several environmental oestrogens are also anti-androgens. J Endocrinol 1998; 158(3): 327–39. doi: 10.1677/joe.0.1580327 120. Lee HJ, Chattopadhyay S, Gong EY, Ahn RS, Lee K. Antiandrogenic effects of bisphenol A and nonylphenol on the function of androgen receptor. Toxicol Sci 2003; 75(1): 40–6. doi: 10.1093/toxsci/kfg150 121. Krüger T, Long M, Bonefeld-Jørgensen EC. Plastic components affect the activation of the aryl hydrocarbon and the androgen receptor. Toxicology 2008; 246(2): 112–23. doi: 10.1016/j.tox.2007.12.028 122. Thomas P, Dong J. Binding and activation of the seven-transmembrane estrogen receptor GPR30 by environmental estrogens: a potential novel mechanism of endocrine disruption. J Steroid Biochem Mol Biol 2006; 102(1-5): 175–9. doi: 10.1016/j.jsbmb.2006.09.017 123. Ma Y, Liu H, Wu J, et al. The adverse health effects of bisphenol A and related toxicity mechanisms. Environ Res 2019; 176: e108575 (17 str.) doi: 10.1016/j.envres.2019.108575 124. Li DK, Zhou Z, Miao M, et al. Relationship between urine bisphenol-A level and declining male sexual function. J Androl 2010; 31(5): 500–6. doi: 10.2164/jandrol.110.010413 125. Li DK, Zhou Z, Miao M, et al. Urine bisphenol-A (BPA) level in relation to semen quality. Fertil Steril 2011; 95(2): 625–30. doi: 10.1016/j.fertnstert.2010.09.026 126. Meeker JD, Ehrlich S, Toth TL, et al. Semen quality and sperm DNA damage in relation to urinary bisphenol A among men from an infertility clinic. Reprod Toxicol 2010; 30(4): 532–9. doi: 10.1016/j.reprotox.2010.07.005 127. Goldstone AE, Chen Z, Perry MJ, Kannan K, Louis GM. Urinary bisphenol A and semen quality, the LIFE study. Reprod Toxicol 2015; 51: 7–13. doi: 10.1016/j.reprotox.2014.11.003 128. Mendiola J, Jørgensen N, Andersson AM, et al. Are environmental levels of bisphenol A associated with reproductive function in fertile men? Environ Health Perspect 2010; 118(9): 1286–91. doi: 10.1289/ehp.1002037 129. Tomza-Marciniak A, Stepkowska P, Kuba J, Pilarczyk B. Effect of bisphenol A on reproductive processes: a review of in vitro, in vivo and epidemiological studies. J Appl Toxicol 2018; 38(1): 51–80. doi: 10.1002/jat.3480 130. Wang C, Fu W, Quan C, et al. The role of Pten/Akt signaling pathway involved in BPA-induced apoptosis of rat Sertoli cells. Environ Toxicol 2015; 30(7): 793–802. doi: 10.1002/tox.21958 131. Qi S, Fu W, Wang C, et al. BPA-induced apoptosis of rat Sertoli cells through Fas/FasL and JNKs/p38 MAPK pathways. Reprod Toxicol 2014; 50: 108–16. doi: 10.1016/j.reprotox.2014.10.013 S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 103 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 132. Wang C, Qi S, Liu C, et al. Mitochondrial dysfunction and Ca(2+) overload in injured Sertoli cells exposed to bisphenol A. Environ Toxicol 2017; 32(3): 823–31. doi: 10.1002/tox.22282 133. Barbonetti A, Castellini C, Di Giammarco N, Santilli G, Francavilla S, Francavilla F. In vitro exposure of human spermatozoa to bisphenol A induces pro-oxidative/apoptotic mitochondrial dysfunction. Reprod Toxicol 2016; 66: 61–7. doi: 10.1016/j.reprotox.2016.09.014 134. Spörndly-Nees E, Boberg J, Ekstedt E, et al. Low-dose exposure to bisphenol A during development has limited effects on male reproduction in midpubertal and aging Fischer 344 rats. Reprod Toxicol 2018; 81: 196–206. doi: 10.1016/j.reprotox.2018.08.007 135. Chitra KC, Latchoumycandane C, Mathur PP. Induction of oxidative stress by bisphenol A in the epididymal sperm of rats. Toxicology 2003; 185(1-2): 119–27. doi: 10.1016/s0300-483x(02)00597-8 136. Li YJ, Song TB, Cai YY, et al. Bisphenol A exposure induces apoptosis and upregulation of Fas/FasL and Caspase-3 expression in the testes of mice. Toxicol Sci 2009; 108(2): 427–36. doi: 10.1093/toxsci/kfp024 137. El-Beshbishy HA, Aly HA, El-Shafey M. Lipoic acid mitigates bisphenol A-induced testicular mitochondrial toxicity in rats. Toxicol Ind Health 2013; 29(10): 875–87. doi: 10.1177/0748233712446728 138. Nakamura D, Yanagiba Y, Duan Z, et al. Bisphenol A may cause testosterone reduction by adversely affecting both testis and pituitary systems similar to estradiol. Toxicol Lett 2010; 194(1-2): 16–25. doi: 10.1016/j.toxlet.2010.02.002 139. Sakaue M, Ohsako S, Ishimura R, et al. Bisphenol-A affects spermatogenesis in the adult rat even at a low dose. J Occup Health 2001; 43(4): 185–90. doi: 10.1539/joh.43.185 140. Kazemi S, Feizi F, Aghapour F, Joorsaraee GA, Moghadamnia AA. Histopathology and histomorphometric investigation of bisphenol A and nonylphenol on the male rat reproductive system. N Am J Med Sci 2016; 8(5): 215–21. doi: 10.4103/1947-2714.183012 141. Srivastava S, Gupta P. Alteration in apoptotic rate of testicular cells and sperms following administration of bisphenol A (BPA) in Wistar albino rats. Environ Sci Pollut Res Int 2018; 25(22): 21635–43. doi: 10.1007/s11356-018-2229-2 142. Ullah A, Pirzada M, Jahan S, et al. Bisphenol A and its analogs bisphenol B, bisphenol F, and bisphenol S: comparative in vitro and in vivo studies on the sperms and testicular tissues of rats. Chemosphere 2018; 209: 508–16. doi: 10.1016/j.chemosphere.2018.06.089 S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 104 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 143. Gurmeet K, Rosnah I, Normadiah MK, Das S, Mustafa AM. Detrimental effects of bisphenol A on development and functions of the male reproductive system in experimental rats. Excli J 2014; 13: 151–60. 144. Ogo FM, Siervo G, Goncalves GD, et al. Low doses of bisphenol A can impair postnatal testicular development directly, without affecting hormonal or oxidative stress levels. Reprod Fertil Dev 2017; 29(11): 2245–54. doi: 10.1071/rd16432 145. Qiu LL, Wang X, Zhang XH, et al. Decreased androgen receptor expression may contribute to spermatogenesis failure in rats exposed to low concentration of bisphenol A. Toxicol Lett 2013; 219(2): 116–24. doi: 10.1016/j.toxlet.2013.03.011 146. Jiang X, Yin L, Zhang N, et al. Bisphenol A induced male germ cell apoptosis via IFNβ-XAF1-XIAP pathway in adult mice. Toxicol Appl Pharmacol 2018; 355: 247–56. doi: 10.1016/j.taap.2018.07.009 147. Tian J, Ding Y, She R, et al. Histologic study of testis injury after bisphenol A exposure in mice. Toxicol Ind Health 2017; 33(1): 36–45. doi: 10.1177/0748233716658579 148. Wang P, Luo C, Li Q, Chen S, Hu Y. Mitochondrion-mediated apoptosis is involved in reproductive damage caused by BPA in male rats. Environ Toxicol Pharmacol 2014; 38(3): 1025–33. doi: 10.1016/j.etap.2014.10.018 149. Jin P, Wang X, Chang F, et al. Low dose bisphenol A impairs spermatogenesis by suppressing reproductive hormone production and promoting germ cell apoptosis in adult rats. J Biomed Res 2013; 27(2): 135–44. doi: 10.7555/JBR.27.20120076 150. Toyama Y, Suzuki-Toyota F, Maekawa M, Ito C, Toshimori K. Adverse effects of bisphenol A to spermiogenesis in mice and rats. Arch Histol Cytol 2004; 67(4): 373–81. 151. Karnam SS, Ghosh RC, Mondal S, Mondal M. Evaluation of subacute bisphenol - A toxicity on male reproductive system. Vet World 2015; 8(6): 738–44. doi: 10.14202/vetworld.2015.738-744 152. Wisniewski P, Romano RM, Kizys MM, et al. Adult exposure to bisphenol A (BPA) in Wistar rats reduces sperm quality with disruption of the hypothalamic-pituitary-testicular axis. Toxicology 2015; 329: 1–9. doi: 10.1016/j.tox.2015.01.002 153. De Flora S, Micale RT, La Maestra S, et al. Upregulation of clusterin in prostate and DNA damage in spermatozoa from bisphenol A–treated rats and formation of DNA adducts in cultured human prostatic cells. Toxicol Sci 2011; 122(1): 45–51. doi: 10.1093/toxsci/kfr096 154. Tiwari D, Vanage G. Mutagenic effect of bisphenol A on adult rat male germ cells and their fertility. Reprod Toxicol 2013; 40: 60–8. doi: 10.1016/j.reprotox.2013.05.013 155. Liu C, Duan W, Li R, et al. Exposure to bisphenol A disrupts meiotic progression during spermatogenesis in adult rats through estrogen-like activity. Cell Death Dis 2013; 4(6): e676 (10 str.) doi: 10.1038/cddis.2013.203 S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 105 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 156. D'Cruz SC, Jubendradass R, Mathur PP. Bisphenol A induces oxidative stress and decreases levels of insulin receptor substrate 2 and glucose transporter 8 in rat testis. Reprod Sci 2012; 19(2): 163–72. doi: 10.1177/1933719111415547 157. Liu X, Wang Z, Liu F. Chronic exposure of BPA impairs male germ cell proliferation and induces lower sperm quality in male mice. Chemosphere 2021; 262: e127880 (9 str.) doi: 10.1016/j.chemosphere.2020.127880 158. Dobrzyńska MM, Radzikowska J. Genotoxicity and reproductive toxicity of bisphenol A and X-ray/bisphenol A combination in male mice. Drug Chem Toxicol 2013; 36(1): 19–26. doi: 10.3109/01480545.2011.644561 159. Al-Hiyasat AS, Darmani H, Elbetieha AM. Effects of bisphenol A on adult male mouse fertility. Eur J Oral Sci 2002; 110(2): 163–7. doi: 10.1034/j.1600-0722.2002.11201.x 160. Wang HF, Liu M, Li N, Luo T, Zheng LP, Zeng XH. Bisphenol A impairs mature sperm functions by a CatSper-relevant mechanism. Toxicol Sci 2016; 152(1): 145–54. doi: 10.1093/toxsci/kfw070 161. Gotardo AT, Pavanelli EL, Carvalho HF, et al. Endocrine disrupter action in ruminants: a study of the effects of Ipomoea carnea in adult male goats. Small Rumin Res 2014; 119(1): 81–7. doi: 10.1016/j.smallrumres.2014.02.003 162. Gore AC, Chappell VA, Fenton SE, et al. EDC-2: the Endocrine Society's Second Scientific Statement on endocrine-disrupting chemicals. Endocr Rev 2015; 36(6): e1– 150. doi: 10.1210/er.2015-1010 163. Deceuninck Y, Bichon E, Durand S, et al. Development and validation of a specific and sensitive gas chromatography tandem mass spectrometry method for the determination of bisphenol A residues in a large set of food items. J Chromatogr A 2014; 1362: 241–9. doi: 10.1016/j.chroma.2014.07.105 164. Commission Decision 2002/657/EC of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results. Off J Eur Commun (Online) 2002; L221: e8–36. https://op.europa.eu/en/publication-detail/-/publication/ed928116-a955-4a84-b10a-cf7a82bad858/language-en (1. 4. 2022) 165. Balcombe JP, Barnard ND, Sandusky C. Laboratory routines cause animal stress. Contemp Top Lab Anim Sci 2004; 43(6): 42–51. 166. Guignard D, Gayrard V, Lacroix MZ, Puel S, Picard-Hagen N, Viguie C. Evidence for bisphenol A-induced disruption of maternal thyroid homeostasis in the pregnant ewe at low level representative of human exposure. Chemosphere 2017; 182: 458–67. doi: 10.1016/j.chemosphere.2017.05.028 S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 106 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 167. Court MH, Zhang X, Ding X, Yee KK, Hesse LM, Finel M. Quantitative distribution of mRNAs encoding the 19 human UDP-glucuronosyltransferase enzymes in 26 adult and 3 fetal tissues. Xenobiotica 2012; 42(3): 266–77. doi: 10.3109/00498254.2011.618954 168. Starlard-Davenport A, Lyn-Cook B, Radominska-Pandya A. Identification of UDP-glucuronosyltransferase 1A10 in non-malignant and malignant human breast tissues. Steroids 2008; 73(6): 611–20. doi: 10.1016/j.steroids.2008.01.019 169. Haakensen VD, Biong M, Lingjærde OC, et al. Expression levels of uridine 5'- diphospho-glucuronosyltransferase genes in breast tissue from healthy women are associated with mammographic density. Breast Cancer Res 2010; 12(4): eR65 (11 str.) doi: 10.1186/bcr2632 170. Street CM, Zhu Z, Finel M, Court MH. Bisphenol-A glucuronidation in human liver and breast: identification of UDP-glucuronosyltransferases (UGTs) and influence of genetic polymorphisms. Xenobiotica 2017; 47(1): 1–10. doi: 10.3109/00498254.2016.1156784 171. Lacroix MZ, Puel S, Collet SH, et al. Simultaneous quantification of bisphenol A and its glucuronide metabolite (BPA-G) in plasma and urine: applicability to toxicokinetic investigations. Talanta 2011; 85(4): 2053–9. doi: 10.1016/j.talanta.2011.07.040 172. Gauderat G, Picard-Hagen N, Toutain PL, et al. Bisphenol A glucuronide deconjugation is a determining factor of fetal exposure to bisphenol A. Environ Int 2016; 86: 52–9. doi: 10.1016/j.envint.2015.10.006 173. Gayrard V, Lacroix MZ, Grandin FC, et al. Oral systemic bioavailability of bisphenol A and bisphenol S in pigs. Environ Health Perspect 2019; 127(7): e77005 (12 str.) doi: 10.1289/ehp4599 174. Staples C, Friederich U, Hall T, et al. Estimating potential risks to terrestrial invertebrates and plants exposed to bisphenol A in soil amended with activated sludge biosolids. Environ Toxicol Chem 2010; 29(2): 467–75. doi: 10.1002/etc.49 175. Babić S, Barišić J, Bielen A, et al. Multilevel ecotoxicity assessment of environmentally relevant bisphenol A concentrations using the soil invertebrate Eisenia fetida. J Hazard Mater 2016; 318: 477–86. doi: 10.1016/j.jhazmat.2016.07.017 176. Prins GS, Patisaul HB, Belcher SM, Vandenberg LN. CLARITY-BPA academic laboratory studies identify consistent low-dose bisphenol A effects on multiple organ systems. Basic Clin Pharmacol Toxicol 2019; 125 [suppl 3]: 14–31. doi: 10.1111/bcpt.13125 177. Völkel W. Why did researchers not use realistic doses in animal studies of bisphenol A? Arch Toxicol 2017; 91(3): 1519–22. doi: 10.1007/s00204-016-1840-6 178. Lanning LL, Creasy DM, Chapin RE, et al. Recommended approaches for the evaluation of testicular and epididymal toxicity. Toxicol Pathol 2002; 30(4): 507–20. doi: 10.1080/01926230290105695 S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 107 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 179. Berndston WE, Desjardins C. The cycle of the seminiferous epithelium and spermatogenesis in the bovine testis. Am J Anat 1974; 140(2): 167–79. doi: 10.1002/aja.1001400204 180. Clermont Y, Leblond CP. Spermiogenesis of man, monkey, ram and other mammals as shown by the periodic acid-Schiff technique. Am J Anat 1955; 96(2): 229–53. doi: 10.1002/aja.1000960203 181. Šturm S, Švara T, Spörndly-Nees E, et al. Seminiferous epithelium cycle staging based on the development of the acrosome in ram testis. J Toxicol Pathol 2021; 34(4): 331–8. doi: 10.1293/tox.2021-0025 182. Creasy DM. Evaluation of testicular toxicology: a synopsis and discussion of the recommendations proposed by the Society of Toxicologic Pathology. Birth Defects Res (Part B) 2003; 68(5): 408–15. doi: 10.1002/bdrb.10041 183. Camacho L, Lewis SM, Vanlandingham MM, et al. A two-year toxicology study of bisphenol A (BPA) in Sprague-Dawley rats: CLARITY-BPA core study results. Food Chem Toxicol 2019; 132: e110728 (21 str.) doi: 10.1016/j.fct.2019.110728 184. Cao T, Cao Y, Wang H, et al. The effect of exposure to bisphenol A on spermatozoon and the expression of tight junction protein occludin in male mice. Dose Response 2020; 18(2): e1559325820926745 (6 str.) doi: 10.1177/1559325820926745 185. D'Cruz SC, Jubendradass R, Jayakanthan M, Rani SJ, Mathur PP. Bisphenol A impairs insulin signaling and glucose homeostasis and decreases steroidogenesis in rat testis: an in vivo and in silico study. Food Chem Toxicol 2012; 50(3-4): 1124–33. doi: 10.1016/j.fct.2011.11.041 186. Chitra KC, Ramachandra Rao K, Mathur PP. Effect of bisphenol A and co-administration of bisphenol A and vitamin C on epididymis of adult rats: a histological and biochemical study. Asian J Androl 2003; 5(3): 203–8. 187. Kourouma A, Peng D, Chao Q, et al. Bisphenol A induced reactive oxygen species (ROS) in the liver and affect epididymal semen quality in adults Sprague-Dawley rats. J Toxicol Environ Health Sci 2014; 6(4): 103–12. doi: 10.5897/JTEHS2014.0309 188. OECD. Test No. 409: repeated dose 90-day oral toxicity study in non-rodents, OECD guidelines for the testing of chemicals [online]. Paris : OECD Publishing, 1998. doi: 10.1787/9789264070721-en S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 108 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 9 PRILOGE PRILOGA 1: Dopolnilno gradivo prve objave z naslovom Preliminarna toksikokinetična raziskava pri mlečni ovci v laktaciji po dietarnem in podkožnem vnosu bisfenola A S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 109 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 110 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija PRILOGA 2: Dopolnilno gradivo tretje objave z naslovom Bazična raziskava dietarnega vnosa bisfenola A (BPA) ovnom pasme istrska pramenka in ugotavljanje reproduktivne toksičnosti S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 111 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 112 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 113 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 114 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 115 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 116 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija S. Šturm: Toksikokinetika bisfenola A pri ovcah in njegov vpliv na spolne organe ovnov v puberteti. 117 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija