Senta Frol1, Martin Hren2
Izbira primernih monoklonskih protiteles in optimizacija imunohistokemijske metode
za dokazovanje patološkega prionskega proteina v možganih bolnikov s sporadicno obliko Creutzfeldt-Jakobove bolezni3
Selection of Suitable Monoclonal Antibodies and Optimization of the Immunohistochemical Method for the Detection of Pathological Prion Protein in the Brains of Patients with Sporadic Creutzfeldt-Jakob Disease
IZVLEČEK_
KLJUČNE BESEDE: Creutzfeldt-Jakobova bolezen - diagnostika, prioni - analiza, protitelesa monoklonskc
Diagnostika prionskih bolezni temelji na imunohistokemijskem določanju ob uporabi protiteles proti prionskemu proteinu (PrP), ki ne razlikujejo med celično obliko PrP (PrPC) in patološko izoobliko (PrPSc). Zato zahteva ta metoda močne predobdelave za odstranjevanje PrPC in razkrivanje epitopa na PrPSc v parafinskih rezinah umrlih za prionsko boleznijo. Namen naše naloge je bil testirati monoklonska protitelesa proti PrPSc (MPt) V5B2, K4B3, _ A4/5 in E5/9, ki so jih pripravili na Zavodu RS za transfuzijo krvi, jih primerjati s kontrolni- 3 mi, komercialno dostopnimi MPt 3F4 in 6H4, ter poiskati enostavnejšo predobdelavo za razkrivanje epitopa na PrPSc.
Parafinske histološke rezine vzorcev možgan štirih umrlih za sporadično Creutzfeldt-Ja-kobovo boleznijo (sCJB) in dveh umrlih primerljive starosti, ki nista imela CJB, smo obdelali s prilagojeno standardno imunohistokemijsko metodo avidin-biotin kompleks (ABC) ob uporabi naših MPt, kontrolnih MPt in štirih predobdelav. Imunohistokemijsko reakcijo (IHR) z našimi MPt in PrPSc smo primerjali z IHR med kontrolnima MPt (3F4 in 6H4) in PrPSc z ozi-rom na jakost signala IHR in število pozitivnih reakcij. Ista MPt smo uporabili tudi na zaledenelih rezinah vzorcev dveh ne-CJB-možgan brez kakršnekoli predobdelave.
V nalogi smo pokazali, da so vsa štiri testirana MPt specifična za PrPSc, saj za razliko od dveh kontrolnih MPt niso prikazala PrPC v zaledenelih rezinah svežih ne-CJB-možgan. Prav tako smo pokazali, da se z močnejšimi predobdelavami histoloških rezin IHR izboljša, tako v jakosti kot tudi v številu pozitivnih reakcij (p < 0,05). Naše MPt V5B2 je občutljivejše od kontrolnega MPt 3F4 (p = 0,03) in je zmožno z manj intenzivno predobdelavo zanesljivo označiti PrPSc v možganih obolelih za CJB.
Z omenjenimi rezultati smo dokazali specifičnost vseh naših MPt za PrPSc. Pokazali smo, da se ta MPt med seboj razlikujejo po občutljivosti in da je za diagnostiko sCJB najbolj primerno MPt V5B2, primernejše tudi od dveh kontrolnih MPt. Domnevamo, da je MPt V5B2 primerno za izdelavo testov za dokazovanje PrPSc v zaledenelih rezinah potencialno okuženih tkiv ali pa v telesnih tekočinah.
1	Senta Frol, štud. med., Inštitut za patologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Korytkova 2, 1000 Ljubljana.
2	Martin Hren, štud. med., Inštitut za patologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Korytkova2, 1000 Ljubljana.
3	Delo je bilo nagrajeno s Prešernovim priznanjem za študente za leto 2001.
ABSTRACT_
KEY WORDS: Creutzfeldt-Jakob syndrome - diagnosis, prions - analysis, antibodies monoclonal
Reliable diagnosis of prion diseases is based on a positive immunohistochemical reaction (IHR) using antibodies against prion protein (PrP). Unfortunately, this does not distinguish between cellular PrP (PrPC) and the pathological isoform (PrPSc). Consequently, this method requires intensive pre-treatments to remove PrPC and retrieve the epitope of PrPSc in paraffin sections of the brains of patients with prion disease.
The aim of this study was to test anti-PrP monoclonal antibodies (MAb) V5B2, K4B3, A4/5 and E5/9, which were prepared at the Blood Transfusion Center of Slovenia, in order to compare them with commercially available MAb 3F4 and 6H4, and to design a simple antigen retrieval method to label PrPSc in immunohistochemistry.
Sections of paraffin-embedded brain tissue for four cases of sporadic Creutzfeldt-Jakob disease (sCJD) and of two deceased patients of similar age who had not had CJD were treated with a modified standard ABC immunohistochemical method using our MAb, control MAb and four pre-treatments. The IHR of our MAb was compared with the IHR of the control MAb (3F4 and 6H4) with regard to the intensity of IHR and the number of positive reactions. The same MAb were tested on the frozen sections of two brains not affected by CJD without any pre-treatment.
The results showed that all four tested MAbs were specific for PrPSc since, unlike the two control MAbs, they did not react with PrPC in the frozen sections of non-CJD brain. An improvement in IHR at more intense section pre-treatments of tissues was also demonstrated in terms of intensity and the number of positive reactions (p<0.05). Our MAb V5B2 is more _ sensitive than the control MAb 3F4 (p = 0.03). It does not need an equally intense pre-treat-4 ment as MAb 3F4 to label PrPSc in CJD-affected brain.
The obtained results confirmed the hypothesis on the specificity of our MAb for PrPSc. Furthermore, we found that MAbs differ in terms of sensitivity and that MAb V5B2 is best suited for the diagnosis of CJD, even more so than the two control MAbs. MAb V5B2 is assumed to be suitable for the development of tests capable of detecting native PrPSc in frozen sections of potentially infected tissues, or in the bodily fluids of patients with prion diseases.
UVOD Prion
Danes velja, da prionske bolezni povzročajo prioni. Prion je po hipotezi Stanleyja B. Pru-sinerja definiran kot beljakovinski kužni delec, brez nukleinske kisline (1, 2). Sama zamisel je v začetku povzročila mnogo dvomov - nekateri so mrzlično iskali sledove kakršnekoli nukleinske kisline, da bi dokazali obstoj neke vrste počasnega virusa. Dandanes je eksperimentalnih dokazov preprosto preveč, da bi se jim dalo oporekati, poglavje o prionskih boleznih pa nas je s svojo svojs-tvenostjo naučilo tudi strpnosti do idej, ki se v začetku zdijo nesprejemljive. Prusiner je
leta 1997 za prionsko hipotezo prejel Nobelovo nagrado za medicino (1-3).
Prion (PrPSc) je patološka izoforma prion-skega glikoproteina, ki je v svoji fiziološki obliki normalno prisoten na celični membrani različnih celic, vendar je najmočneje izražen v možganih. S poskusi na miškah je dokazano, da je njegova prisotnost nujno potrebna za razvoj prionskih bolezni (2).
Prpc in prpSc se ne razlikujeta v aminoki-slinskem zaporedju, razlikujeta pa se po svoji terciarni strukturi. Približno 40 % molekule PrPC ima obliko a-vijačnice, zelo majhen del je v obliki P-nagubanega lista, medtem ko je v PrPSc le približno 30 % molekule v obliki a-vijačnice in kar 45 % v obliki P-nagubanega lista (2).
Kužnost prionov je neuničljiva z običajnimi metodami, ki sicer uničijo vse ostale povzročitelje kužnih bolezni (formalin, X-žarki, UV-žarki, običajno avtoklaviranje, nukleaze) (4). Njihova odpornost je tudi razlog za nastanek iatrogenih oblik prionskih bolezni, kjer prihaja do prenosa prionov z običajno steriliziranimi kirurškimi instrumenti in stereotaktičnimi elektrodami ter s kadavrskimi tkivi.
Prionske bolezni
Prionske bolezni so edinstvene zaradi njihove pojavnosti v različnih oblikah, tako pato genetskih kot tudi kliničnih in histo-patoloških. To so namreč edine, do tega trenutka znane bolezni, ki se pojavljajo v spo-radični, dedni in kužni obliki, vsaka s svojimi posebnostmi, vendar z enakim etiološkim dejavnikom. Prav tako so dedne prionske bolezni edine dedne bolezni, ki so lahko prenosne oz. kužne.
Prionske bolezni, ki so jih opisali pri ljudeh: Creutzfeldt-Jakobova bolezen (CJB), usodna družinska nespečnost (FFI - fatalna familiarna insomnia), Gerstmann-Straus-sler-Scheinkerjev sindrom (GSS), kuru (4, 5), nova različica CJB (vCJB) (6). Pri živalih so najbolj proučene prionske bolezni: praskavec, BSE (1, 4) itn. Številni posredni dokazi kažejo, da naj bi prišlo do prenosa govejih prionov na človeka (6-9).
Diagnostika prionskih bolezni -pomen imunohistokemije
Zaradi narave prionskih bolezni in njihovega povzročitelja je njihova natančna diagnostika tako pri človeku kot tudi pri živalih neizmernega pomena. Najpomembnejše je namreč preprečevanje prenosa prionov s človeka na človeka (možnost iatro-gene oblike CJB) in z goveda na človeka (vCJB). Dodaten problem pri preprečevanju prenosa je dolga inkubacijska doba teh bolezni, v kateri je možen prenos bolezni, preden se pojavijo klinični znaki. Patohistološke spremembe v možganih so nespecifične, torej na podlagi le-teh ni možna zanesljiva diagnoza prionskih bolezni (10).
Zadnje desetletje je metoda izbire za potrditev klinične diagnoze prionskih bolez-
ni imunohistokemija, to je prepoznavanje antigenov v tkivnih rezinah s pomočjo specifičnih protiteles. Metoda se uporablja na histoloških rezinah vzorcev možgan umrlih za prionskimi boleznimi in je visoko specifična (10-12).
Pri imunohistokemijski metodi pa se srečujemo predvsem z dvema težavama. Prva je zakritje epitopov na molekuli priona po fik-saciji možgan v formalinu (13). Zato je treba razkriti vezno mesto za protitelo, kar je klasični korak pri imunohistokemijski obdelavi kateregakoli tkiva, ki je bilo dlje časa fiksirano. Druga težava je dejstvo, da do današnjega dne še niso opisali protitelesa, ki bi bilo specifično za PrPSc in ne bi hkrati označilo tudi v možganih prisotnega PrPC. Da bi obšli obe težavi, so raziskovalci preizkušali razne načine predobdelave tkiva (10,12-14). Pri tem so izkoristili odpornost prionov na delovanje pro-teoliznih encimov, s katerimi so najprej uničili PrPC, da so nato lahko prikazali samo preostali PrPSc tudi z nespecifičnimi protitelesi. Multicentrična študija, ki je bila opravljena leta 1997 v Veliki Britaniji, narekuje uporabo avtoklaviranja (10 minut pri 121°C), mravljične kisline (5 minut, 96% HCOOH) in 4M-gvanidijevega tiocianata (2uri pri 4°C) kot najboljšo kombinacijo predobdelav, ki reši obe težavi, s katerimi se srečujemo pri dokazovanju prionov z imunohistokemijsko metodo (14).
S protitelesi, specifičnimi za PrPSc, bi se izognili zamudnim in zahtevnim predobde-lavam, ki večkrat uničijo histološko rezino. Takšna protitelesa bi lahko uporabili tudi za razvoj metod, ki bi predstavljale hitrejšo, enostavnejšo in zato tudi cenejšo diagnostiko BSE v klavnicah.
NAMEN RAZISKAVE
Na Zavodu RS za transfuzijo krvi v Ljubljani so z imunizacijo miši BALB/c s 13-aminoki-slinskim peptidom, izbranim iz primarne strukture humanega PrP, ki je bil vezan na nosilno molekulo, dobili izredno dober imunski odziv. Izolirali so paleto MPt-s (15-17),ki so jih nato testirali tudi s pomočjo IHR na parafinskih histoloških rezinah vzorcev mož-gan dvanajstih bolnikov, ki so v Sloveniji umrli zaradi sporadične obilke CJB (sCJB) v obdobju od leta 1988 do leta 2001, in na
5
enakem številu ne-CJB-možganov primerljive starosti. Štiri MPt-a z oznakami V5B2, K4B3, A3/4 in E9/5, ki so označila le PrPSc v CJB-možganih in nobene strukture v ne-CJB-možganih, smo izbrali z namenom, da dokaže-mo njihovo specifičnost za PrPSc z imuno-histokemijsko metodo ter da standardiziramo enostavno imunohistokemijsko metodo za dokazovanje prionov s temi MPt. Ta metoda bo omogočila zanesljivo diagnostiko prionskih bolezni.
MATERIAL IN METODE
Imunohistokemijska reakcija na parafinskih rezinah sCJB-in ne-CJB-možgan
Izbrana MPt-a smo testirali in standardizirali na parafinskih rezinah vzorcev velikih in malih možgan štirih bolnikov, ki so umrli za sCJB. Za kontrolo smo uporabili vzorce mož-gan dveh umrlih primerljive starosti, ki niso vsebovali prionov. IHR naših MPt-s smo primerjali z dvema komercialno dostopnima MPt, 3F4 (Senetek, ZDA) in 6H4 (Prionics, Švica), ki ne razlikujeta med PrPC in PrPSc.
Po štirinajstdnevni fiksaciji v 10 % forma-linu smo po en vzorec iz malih in velikih možganov eno uro razkuževali v 96 % mravljični kislini (18). Na ta način smo preprečili vnos prionov v laboratorij in morebitno okužbo tehničnih delavcev. Po tridesetminutnem izpiranju v tekoči vodi smo vzorce dehidrira-li v naraščajočih koncentracijah etanola (70 %, 95 % in 100 %) in ksilolu ter jih vklopili v pa-rafin. Z mikrotomom smo odrezali 10 |i debele histološke rezine in jih postavili na adheziv-na predmetna stekelca firme Menzel. Sledilo je sušenje histoloških rezin v termostatu na 59°C čez noč. Ohlajene rezine smo depara-finirali v treh izmenjavah ksilola po 5 minut, nato smo jih rehidrirali po 3 minute v pada-
jočih koncentracijah etanola (100%, 95 % in 70 %) in sprali v destilirani vodi. Pred uporabo primarnih protiteles smo histološke rezine razdelili v štiri skupine in jih obdelali na štiri načine (angl. pre-treatment - PT), z namenom razkriti epitope na PrPSc in uničiti PrPC (tabela 1).
Nadaljnji postopek je potekal avtomatično v stroju Ventana Nexes firme Ventana iz ZDA, ki uporablja avidin-biotin kompleks imunohistokemijsko metodo.
Prvi korak v stroju je 4-minutna blokada endogene peroksidaze s peroksidom, ki je razredčen v pufru. Primarna MPt smo uporabili v obliki supernatanta v koncentraciji 1-2 |g/ml. Komercialni protitelesi, 3F4 in 6H4, smo uporabili v enaki koncentraciji. Inkubacija primarnih MPt na histoloških rezinah je trajala 20 minut pri temperaturi 38°C, ki je delovna temperatura za celotno IHR. Nato je sledila inkubacija s komercialnimi biotiniliranimi sekundarnimi kozjimi protitelesi proti mišjim imunoglobulinom 8 minut. Tako povečano molekulo smo označili z avidinom, ki se je vezal na biotin 8 minut. Komercialno pripravljena raztopina peroksi-daze se je v osmih minutah vezala na avidin. Mesto vezave primarnega MPt-a smo pokazali s 3,3-diaminobezidinom (DAB), ki se je oboril kot rjavo barvilo. Obarjanje DAB-a je omogočila reakcija med peroksidazo, ki je vezana na avidin, in peroksidom, ki ga je stroj nakapal na histološko rezino neposredno pred DAB. Stroj je med posameznimi fazami dela histološke rezine močno izpiral s pufri, tako da so bila vsa protitelesa, ki se niso vezala, odstranjena. Vsi reagenti, razen protiteles proti PrP, ki so vključeni v sistem avtomatične IHR, so izdelki firme Ventana. Njihova natančna sestava nam ni znana.
Za kontrolo samega postopka IHR smo pri seriji rezin iz vseh testiranih vzorcev možgan izpustili primarno MPt.
6
Tabela 1. Tkivne predobdelave, ki smo jih uporabili na parafinskih rezinah malih in velikih možgan bolnikov s sporadično CJB.
PT I - brez kakršnekoli predobdelave PT II - 5 minut v 96% mravljični kislini
PT III - 10 minut v mikrovalovni pečici v EDTA-pufru (temperatura 97°C, pH = 8), sledi 15 minut hlajenja na sobni temperaturi, zatem še 5 minut v 96 % mravljični kislini na sobni temperaturi PT IV - 30 minut avtoklaviranja v malem avtoklavu v citratnem pufru pH = 7,3 na temperaturi 121°C, zatem hlajenje 5 minut v hladni destilirani vodi, potem še 5 minut v 96°% mravljični kislini
Zaradi lažjega ocenjevanja lokalizacije IHR smo jedra v histoloških rezinah kontra-stirali 4 minute z Mayerjevim hematoksilinom.
Nato smo histološke rezine pokrili s krovnimi stekelci v stroju RCM (angl. robot coverslipping machine) 2000 tovarne Medite-Meisai, Japonska.
Imunohistokemijska reakcija v za-ledenelih rezinah ne-CJB-možgan
Na zaledenelih rezinah malih možganov dveh umrlih, ki nista imela CJB, smo izvedli imunohistokemijsko reakcijo z istimi MPt-i (V5B2, K4B3, A3/4, E9/5, 3F4 in 6H4) brez uporabe kakršnekoli predobdelave.
Sveže vzorce malih možgan smo postavili na kovinske podložke, pokrite s krioprotektiv-nim medijem, ki ščiti tkivo pred poškodbo pri zmrzovanju. Pet minut smo jih zamrzovali v kriostatu na temperaturi -25°C. Nato smo, prav tako v kriostatu, rezali 10 |i debele rezine, jih postavili na predmetna stekelca, ki so tovarniško prevlečena z adhezivno snovjo. Po sušenju na zraku eno uro smo jih inkubirali v normalnem konjskem serumu. Sledila je inkubacija s primarnimi MPt v koncentraciji 1-2 |g/ml, dve uri na sobni temperaturi. Biotinilirano konjsko sekundarno protitelo proti mišjim imunoglobulinom (Vector Laboratories, ZDA) smo razredčili 1: 1500 in ga nanesli na histološke rezine za 90 minut, nato je sledilo 60 minut inkubacije histoloških rezin z avidin-biotin-peroksidaznim kompleksom (ABC Elite Standard Kit, Vector Laboratories, ZDA). IHR smo vizualizirali z DAB v prisotnosti H2O2. Po večkratnem izpiranju smo kontrastirali jedra z Mayerjevim hematoksilinom. Histološke rezine smo trajno pokrili z DePeX (Chema, Nemčija) in krovnimi stekelci.
REZULTATI
IHR med anti-PrPsc MPt in PrPsc na parafinskih histoloških rezinah vzorcev iz štirih CJB-in dveh ne-CJB-možgan
Nobeno od naših MPt-s ni reagiralo s PrPC, ne glede na predobdelavo. Tudi komercialni MP, 3F4 in 6H4, nista kazali imunoreaktivnosti s PrPC pod enakimi pogoji. Imunoreaktivnost vseh MPt s PrPSc je naraščala od PT I do PT
IV. Jakost IHR pri MPt V5B2 in K4B3 je močnejša že pri šibkejših PT (PT I in II) v primerjavi z MPt A3/4, E9/5, 3F4 in 6H4. MPt V5B2 in K4B3 sta najmočneje označila PrPSc ob uporabi PT III, kar je zadosten signal za diagnozo CJB. Komercialno MPt 3F4, ki sicer ni označilo PrPSc ob uporabi dveh šibkejših PT I in II in je ob uporabi PT III označilo le žariščno PrPSc, je ob uporabi najmočnejšega PT IV označilo PrPSc nekoliko močneje kot V5B2 in K4B3 (tabela 2, slika 1). Pomanjkljivost te predobdelave je, da hudo okvari histološke rezine zaradi daljšega kuhanja le-teh.
Tabela 2. Jakost imunohistokemijske reakcije med posameznimi protitelesi in PrPSc v histoloških preparatih možgan 4 bolnikov, umrlih za sCJB. Podani so razponi ocen jakosti IHR, ugotovljeni na možganskih rezinah 4 primerov CJB.
PrP Sc
	PT I	PT II	PT III	PT IV
V5B2	0-1	1	1-2	1-3
K4B3	0-1	1	1-2	1-3
A3/4	0-1	0-1	0-1	1-2
E9/5	0	0-1	0-1	1-2
3F4	0	0	0-1	2-3
6H4	0-1	0-1	0-2	2
Legenda: 0- brez vidne IHR; 1- blaga IHR; 2-zmerna IHR; 3- močna IHR; PT I-IV, različne predobdelave rezin (glej tabelo 1).
Nobeno MPt ne označi PrPSc po PT I (a, č, f). Po PT III V5B2 najbolje označi PrPSc (b) v primerjavi s 3F4 (d) in 6H4 (g). PT IV najbolj pojača IHR med V5B2 in PrPSc (c), nekoliko manj, vendar tudi med 3F4 in PrPSc (e), medtem ko ta predobdelava ne vpliva bistveno na IHR med 6H4 in PrPSc (h). PT IV močno poškoduje histološke rezine (c, e, h).
Merilo na sliki h predstavlja 30 | za slike a, b, č, d, f, g, in 60 | za slike c, e, h.
Na histoloških rezinah vzorca velikih možgan umrlega, ki ni imel kliničnih znakov okvare osrednjega živčevja in v katerih mikroskopski pregled ni pokazal nobenih sprememb, ter vzorca velikih možgan umrlega, ki je imel Alzheimerjevo bolezen (negativna kontrola), ki smo jih testirali pod enakimi pogoji in z enakimi MPt-i, nismo opazili vzorca IHR, ki bi bil značilen za katerikoli
7
Slika 1. Prikaz jakosti IHR z V5B2,3F4 in 6H4 po PT I, PTIII in PTIV v histoloških rezinah malih možgan s sinaptičnim vzorcem odlaganja PrPSc.
način odlaganja PrPSc, prav tako pa ni bilo nikjer opaziti IHR na PrPC.
Kontrola imunohistokemijske metode, ki smo jo opravili na vseh testiranih vzorcih tako, da smo iz postopka izpustili primarno mono-klonsko protitelo, je pokazala, da se nobena druga kemikalija v postopku IHR ni vezala na histološke rezine.
IHR med anti-PrPsc MPt in PrPc na zaledenelih histoloških rezinah ne-CJB-možgan
Nobeno od štirih MPt, pripravljenih na ZTK, ni v zaledenelih rezinah ne-CJB-možgan pri-
kazalo PrPC, medtem ko sta obe komercialni MPt (3F4 in 6H4) označili PrPC (slika 2). Zaradi prevelikega tveganja za okužbo nismo opravili pregleda zaledenelih rezin svežih CJB- možgan. Jakost IHR med 3F4 in PrPC je bila zmerna v nevropilu skorje malih možgan in močna v Purkinjevih celicah, medtem ko MPt 6H4 ni označilo PrPC v Purkinjevih celicah, ampak je le blago označilo PrPC v nevropilu skorje malih možgan (slika 2).
(a) V5B2 ne označi nobene strukture v za-ledeneli rezini skorje malih ne-CJB-možgan, kot tudi ne K4B3 (d) in A3/4 (e). Imunoreak-tivnost s temi MPt je popolnoma enaka
9
Slika 2. Prikaz IHR z V5B2,3F4 in 6H4 na zaledenelih rezinah ne-CJB možgan, v katerih je le PrPC.
imunoreaktivnosti v histološki rezini na sliki b, ko smo iz imunohistokemijske reakcije izpustili primarno protitelo (-K). (c) 3F4 je močno reagiral s PrPC v Purkinjevih celicah (puščica) in za spoznanje šibkeje s PrPC v ostalih strukturah skorje malih možgan. (č) Reakcija med 6H4 in PrPC v zaledeneli rezini malih možgan je le blago pozitivna. To MPt ne označi Purkinjevih celic.
Merilo na sliki e predstavlja 120 |i in velja za vse slike.
S pomočjo t-parjenja smo izračunali t-vrednosti primerjave jakosti IHR pri uporabi MPt V5B2 in 3F4 (tabela 3). Na podlagi teh rezultatov smo lahko podali relativno oceno kvalitete obeh MPt-s pri uporabi v imunohi-stokemiji. Ugotovili smo, da je MPt V5B2 boljše (bolj občutljivo) kakor kontrolno MPt 3F4 (p = 0,03). To lahko trdimo s 97 % zanesljivostjo.
Tabela 3. Povprečne vrednosti IHR (rezultati vseh PT) za MPt 3F4 in MPt V5B2 ter korelacija med obema rezultatoma. SDD — standardna deviacija; povprečna jakost IHR od 0 do 3.
MPt
3F4
V5B2
Povprečna jakost IHR Napaka SD
0,8125	1,4375
0,5896	0,2772
Korelacija med MPt V5B2/3F4 t=—2,24 p=0,03 1 —p = 0,97
RAZPRAVLJANJE
Uspešna in zanesljiva diagnostika prionskih bolezni je najpomembnejše orodje za preprečevanje njihovega širjenja. Pri izpopolnjevanju tega orodja so raziskovalci v preteklih letih postavili na prvo mesto imunohistokemijo, ki ima zaradi nespecifičnih in nestalnih patohi-stoloških sprememb jasne prednosti pred klasično histologijo (5, 11). Imunohistokemija je tudi potrdilna diagnostična metoda (19, 20). Glavni težavi, s katerimi se v imunohistokemi-ji srečujemo, sta nespecifičnost dostopnih protiteles za PrPSc in zakritje epitopov na molekuli priona zaradi fiksacije tkiva v forma-linu (21, 22). Priporočene predobdelave možganskega tkiva, s katerimi se izognemo obema težavama, so dokaj zapletene in zamud-
ne ter so zaradi tega neprimerne za rutinsko vsakodnevno diagnostiko. Prav tako so te pre-dobdelave neprimerne za diagnostiko prionov v telesnih tekočinah (23, 24). V telesnih tekočinah sicer ni težav zaradi zakritja epitopa (ni fiksacije v formalinu), vendar problem predstavlja nespecifičnost MPt, saj je znano, da je PrPC izražen tudi na eritrocitih, trombocitih, limfocitih in granulocitih (25).
S protitelesi, ki bi razlikovala med obema izooblikama PrP oz. bi bila specifična za PrPSc, bi se zapletenost imunohistokemijskih predobdelav na parafinskih rezinah možgan umrlih za CJB zmanjšala, saj bi morali samo še razkriti epitope na PrPSc, ne bi pa bilo več treba uničevati PrPC. Taka protitelesa bi omogočila enostavno diagnostiko prionov v svežem možganskem tkivu (BSE) in v telesnih tekočinah (vCJB) brez strahu pred lažno pozitivnimi rezultati in bi omogočila izdelavo hitrih testov, ki bi poenostavili diagnostiko prionskih bolezni (24).
Upoštevajoč vsa ta dejstva, smo v naši raziskavi skušali dokazati specifičnost testi-ranih MPt za PrPSc tudi z imunohistokemijsko metodo in jo optimirati na takšen način, da bi bila njihova uporaba čim bolj preprosta, kljub temu pa bi dosegli enako občutljivost, kot jo imajo komercialno dostopna protitelesa z zahtevnejšimi in zamudnejšimi predobde-lavami (10).
Na podlagi dobljenih rezultatov sklepamo, da so vsa naša MPt specifična za PrPSc, saj niso reagirala s PrPC v njegovi nativni obliki. Treba pa se je zavedati, da imunohistokemija ni visoko občutljiva metoda in da zaradi tega še vedno obstaja možnost vezave naših MPt na majhno število molekul PrPC, ki je premajhno za zaznavo z IHR. To je treba ugotoviti z drugimi metodami. Prav tako moramo omeniti, da nismo imeli pogojev, da bi opravili IHR z našimi MPt-i in nativno kužnino v zalede-nelih rezih CJB-možgan.
Glede na to, da na podlagi našega poskusa menimo, da sta naši MPt-i V5B2 in K4B3 specifični za PrPSc in da v parafinskih rezinah zanesljivo prikažeta odlaganje PrPSc tudi ob uporabi enostavnejše predobdelave (PT III), ki ne uničuje histoloških rezin, lahko trdimo, da sta primernejši za uporabo v diagnostiki prionskih bolezni na parafinskih rezinah od komercialnih protiteles.
ZAKLJUČKI
Rezultati raziskovalne naloge potrjujejo hipotezo, da so štiri MPt (V5B2, K4B3, A3/4 in E9/5), ki so jih pripravili na Zavodu RS za transfuzijo krvi, specifična za PrPSc v primerjavi s komercialnima MPt, 3F4 in 6H4, ki ne razlikujeta med PrPC in PrPSc.
Menimo, da je PT III najprimernejša predobdelava za diagnostiko prionskih bolezni pri ljudeh na parafinskih histoloških rezinah, ker je enostavna, ne poškoduje histoloških rezin in omogoča zanesljivo IHR med MPt V5B2 in PrPSc v možganih umrlih za CJB. V primeru negativne reakcije ob močnem kliničnem sumu na CJB pa predlagamo uporabo PT IV, ki bo z MPt V5B2 ta sum zanesljivo potrdila ali ovrgla.
V Sloveniji izdelana MPt bi bila zaradi svoje specifičnosti idealna za izdelavo hitrih testov, ki bi omogočili hitro in zanesljivo dokazovanje prionov v možganih govedi,
organov, namenjenih transplantacijam in v tkivnih tekočinah. Treba je še dokazati, da se ta protitelesa vežejo na nativno kužnino.
ZAHVALA
Zahvaljujeva se mentoricama, doc. dr. Mari Popovi}, dr. med. in doc. dr. Vladki Curin - Ser-bec, dipl. ing. kem., za pomoč pri izvedbi naloge, voljo pri popravljanju najinega dela in vztrajanju pri delu z nama.
Zahvalila bi se rada tudi doc. dr. Mari Bresjanac, dr. med., ki je ročno izvedla imuno-histokemijo na zaledenelih rezinah. Dr. Vesni Galvani in Elviru Mujkiču se zahvaljujemo za pomoč pri izbiri ustreznih statističnih metod in svetovanju pri obdelavi zbranih podatkov. Hvala dr. Ruth Rupreht za pomoč pri izdelavi slik. Hvala tudi Andreju Bergauerju za njegovo potrpežljivost pri urejanju in opremljanju izdelanih slik.
LITERATURA
1.	Prusiner SB. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science 1982; 216:136-44.	_
2.	Prusiner SB. Prions. Proc Natl Acad Sci 1998; 95:13363-83.	1 1
3.	Popovi} M. Nobelova nagrada za medicino 1997. Stanley B. Prusiner - oče priona. Proteus 1998; 6 (60): 275.
4.	Popovi} M. Prionske bolezni pri človeku. Med Razgl 1997; 36: 181-9.
5.	Ironside JW. Prion diseases in man. J Pathol 1998; 186: 227-34.
6.	Collinge J, Sidle KCL, Meads J, Ironside JW, Hill AF. Molecular analysis of prion strain variation and the aetiology of »new variant« CJD. Nature 1996; 383: 685-90.
7.	Hill AF, Desbruslais M, Joiner S, Sidle KCL, Gowland I, Collinge J, Doey LJ, Lantos P. The same prion strain causes vCJD and BSE. Nature 1997; 389: 448-50.
8.	Bruce ME, Will RG, Ironside JW, McConnell I, Drummond D, Suttie A, McCardle L, Chree A, Hope J, Birkett C, Cousens S, Fraser H, Bostock CJ. Transmissions to mice indicate that »new variant« CJD is caused by the BSE agent. Nature 1997; 389: 498-501.
9.	Scott MR, Will R, Ironside JW, Nguyen HOB, Tremblay P, DeArmond SJ, Prusiner SB. Compelling transgenetic evidence for transmission of bovine spongiform encephalopathy prions to humans. PNAS1999; 96 (26): 15137-42.
10.	Hayward PAR, Bell JE, Ironside JW. Prion protein immunocytochemistry: reliable protocols for the investigation of Creutzfeldt-Jakob disease. Neuropathology and Applied Neurobiology 1994; 20: 375-83.
11.	Bell JE, Ironside JW. Neuropathology of spongiform encephalopathies in humans. British Medical Bulletin 1993; 49 (4): 738-77.
12.	Kitamoto T, Ogomori K, Tateishi J, Prusiner SB. Methods in laboratory investigation. Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids. Laboratory Investigation 1987; 57 (2): 230-6.
13.	Everbroeck BV, Pals P, Martin JJ, Cras P. Antigen retrieval in prion protein immunohistochemistry. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry 1999; 47 (11): 1465-70.
14.	Bell JE, Gentleman SM, Ironside JW, McCardle L, Lantos PL, Doey L, Lowe J, Fergusson J, Luthert P, McQuaid S, Allen IV. Prion protein immunocytochemistry - UK five centre consensus report. Neuropathology and Applied Neurobiology 1997; 23: 26-35.
15.	Curin Serbec V, Hartman Pretnar K, Vranac T, Sprohar M, Popovi} M, Voljč B, Jung M. Site-directed monoclonal antibody specifically recognizes PrP (Sc). Vox Sang 78 (Suppl 1), 0057.
16.	Curin Serbec V. Antibodies capable to selectively detect prion PrPSc isoforms. USA 09/576,724; EP 00 111 108.7 (2000).
17.	Popovi} M. Prioni in anti-prioni. ISIS 2001; 40-2.
18.	Herbert Budka, Adriano Aguzzi, Paul Brown, Jean-Marie Brucher, Orso Bugiani, John Collinge, Heino Diringer, et al. Tissue Handling in suspected Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) and other human spongiform encephalo-paties (prion diseases). Brain Pathol 1995; 5: 319-22.
19.	Kretzschmar HA, Ironside JW, DeArmond SJ, Tateishi J. Diagnostic criteria for sporadic Creutzfeld-Jakob disease. Arch Neurol 1996; 53: 913-20.
20.	Yokoyama T. The immunodetection of the abnormal isoform of prion protein. Histochem J1999; 31: 209-12.
21.	MacDonald ST, Sutherland K, Ironside JW. A quantitative and qualitative analysis of prion protein immunohi-stochemical staining in Creutzfeldt-Jakob disease using four anti- prion protein antibodies. Neurodegeneration 1996; 5: 87-94.
22.	Takahashi H, Takahashi RH, Hasegawa H, Horiuchi M, Shinagawa M, Yokoyama T, Kimura K, et al. Characterization of antibodies raised against bovine-PrP-peptides. JNeurovirol 1999; 5: 300-7.
23.	Ironside JW, Head MW, Bell JE, McCardle L, Will RG. Laboratory diagnosis of variant Creutzfeldt-Jakob disease. Histopathology 2000; 37 (1): 1-9.
24.	Shaked GM, Shaked Y, Kariva Z, Halimi M, Avraham I, Gabizon R. A protease resistant PrP isoform is present in urine of animals and humans affected with prion diseases. J Biol Chem 2001; 276: 31478-82.
25.	Brown P. Transfusion medicine and spongioform encephalopathy. Transfusion 2001; 41:433-6.
Prispelo 5.4.2002
12
Obvestilo uredništva!
V 1. številki 41. letnika revije Medicinski razgledi je v članku avtorjev Sente Frol in Martina Hrena z naslovom Izbira primernih protiteles in optimizacija imunohistokemijske metode za dokazovanje patološkega prionskega proteina v možganih bolnikov s sporadično
obliko Creutzfeldt-Jakobove bolezni žal prišlo do zamenjave slike 2 na strani 9. Pravilno sliko s pripadajočim besedilom ponovno objavljamo.
Za zamenjavo se avtorjema in bralcem opravičujemo.
Uredništvo Medicinskih razgledov
236
A	B
C ■ .» "V ■	e
D	E
Slika 2. Prikaz IHR z V5B2,3F4 in 6H4 na zaledenelih rezinah ne-CJB možgan, v katerih je le PrPC. Slika a - V5B2 ne oznaci nobene strukture v zaledeneli rezini skorje malih ne-CJB možgan, kot tudi ne K4B3 (slika d) in A3/4 (slika e). Imunoreaktivnost s temi MPt-i je popolnoma enaka imunoreaktivnosti v histološki rezini na sliki b, ko smo iz imunohistokemijske reakcije izpustili primarno protitelo (-K). Slika c- 3F4 je močno reagiral s PrPC v Purkinjevih celicah (puScica) in za spoznanje Sibkeje s PrPC v ostalih strukturah skorje malih možgan. Slika c - Reakcija med 6H4 in PrPC v zaledeneli rezini malih možgan je le blago pozitivna. Merilo na sliki e predstavlja 120 m in velja za vse slike.