Oznaka poročila: ARRS-RPROJ-ZP-2015/134 ZAKLJUČNO POROČILO RAZISKOVALNEGA PROJEKTA A. PODATKI O RAZISKOVALNEM PROJEKTU 1.Osnovni podatki o raziskovalnem projektu 0i W1 нвдЉ Šifra projekta J1-4044 Naslov projekta Apoptotično delovanje alkilpiridinijevih spojin na celice pljučnega adenokarcinoma Vodja projekta 6905 Tom Turk Tip projekta J Temeljni projekt Obseg raziskovalnih ur 7158 Cenovni razred D Trajanje projekta 07.2011 - 06.2014 Nosilna raziskovalna organizacija 481 Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta Raziskovalne organizacije -soizvajalke 105 Nacionalni inštitut za biologijo 106 Institut "Jožef Stefan" 302 ONKOLOŠKI INŠTITUT LJUBLJANA 406 Univerza v Ljubljani, Veterinarska fakulteta Raziskovalno področje po šifrantu ARRS 1 NARAVOSLOVJE 1.03 Biologija Družbenoekonomski cilj Naravoslovne vede - RiR financiran iz drugih virov (ne iz 13,01 SUF) Raziskovalno področje po šifrantu FOS 1 Naravoslovne vede 1.06 Biologija B. REZULTATI IN DOSEŽKI RAZISKOVALNEGA PROJEKTA 2.Povzetek raziskovalnega projekta1 SLO V projektu smo opredelili bistvene premise, ki se tičejo toksičnosti sintetičnih analogov alkilpiridinijevih polimerov. Preiskušali smo jih v in vivo in v in vitro razmerah. Ugotovili smo, da so odmerki, ki so potrebni za citotoksično delovanje na celice rakastih linij nekajkrat manjši kakor za normalne celice, ti pa so bistveno manjši kakor za soroden analog v in vivo poskusih na podganah in miših. V prvih poskusih in vitro smo poleg citotoksičnosti na rakaste in normalne celice ugotavljali tudi vpliv APS8 na stopnjo apoptoze, kar smo dosegli z diferencialnim barvanjem in meritvami na pretočnem citometru. APS8 povzroči, da rakaste celice veliko prej in hitreje vstopajo v zgodnjo in tudi pozno fazo apoptoze kakor normalne celice. Preverjali smo tudi delovanje nikotina, ki v nastanku pljučnega karcinoma igra vlogo tumorskega promotorja z vezavo na nAChR in posledično aktivacijo holinergične zanke, ki prepreči apoptozo rakastih celic. Pričakovano smo ugotovili, da izpostavitev celic nikotinu zmanjša njihov prehod v apoptotične faze. Obseg inhibitornega učinka nikotina na apoptozo rakastih celic pa je manjši, če so bile celice predhodno izpostavljene APS8, kar potrjuje našo tezo da APS kot antagonisti nAChR delujejo na rakaste celice z izraženimi nAChR izrazito proapoptotično, na normalne celice, ki ne izražajo ali izražajo te receptorje v manjšem številu, pa skoraj ne vplivajo. Poskusi in vivo so pokazali, da ni indicev, ki bi kazali na vpletenost holinergičnih dejavnikov v toksičnost preiskušane spojine. Preiskušani analog je šibko toksičen, toksičnost se odrazi v relativno visokih odmerkih in je bolj posledica lize eritrocitov in hiperkalemije oz. poškodb pljučnega ožilja. To je nekako v skladu s pričakovanji in podobno rezultatom, ki smo jih že poznali iz poskusov z naravnimi alkilpiridinijevimi polimeri dobljenimi iz morske spužve.Ti rezultati so predstavljali temelj za nadaljne raziskave v okviru zastavljenega projekta tako in vitro kakor tudi in vivo. Težišče naših raziskav smo v nadaljevanju premaknili na raziskave signalnih poti in učinkov, ki so povezani z blokado nAChR in vodijo v apoptozo rakastih ne pa tudi normalnih celic. Ugotovili smo, da APS8, ki ga vnesemo intratumorsko, učinkovito zavre ali celo popolnoma zatre rast ksenograftov pljučnega adenokarcinoma na SCID miših, zaradi česar menimo, da bi bile spojine kot je APS( lahko učinkoviti kemoterapevtiki za tiste oblike raka, katerih celice na svoji površini izražajo veliko število nAChR, predvsem podtipa a7. ANG_ In the project we first determined the necessary premises regarding toxicity of alkylpyridinium polymers. We have tested them in vivo as well in vitro. We found that cytotoxic doses which effect cancer cells are much smaller than those that are effective against normal cells. In addition the later doses are much smaller than those which cause toxic effect in experimental animals. In the beginning of the project we performed in vitro cytotoxicity assays using cancer an normal cell lines. By means of differential cell staining and flow cytometry we studied the ability of APS8 to induce apoptosis. Cancer cells are more prone to enter the the early as well as late apoptosis if treated by APS8. Nicotine as an nAChR agonist has an important role as tumour promoter in the development of lung cancer. As anticipated we found that cell exposure to nicotine attenuates their transformation to apoptotic phases. This transformation is however attenuated if cells had been exposed to APS8 prior to nicotine treatment. This corroborates out thesis that APS8 are strong factor that enhance apoptosis in cancer cell lines which expresses nAChR but not in normal cells with low numbers of nAChR. Experiments in vivo revealed that there is little evidence to prove cholinergic system is involved in the toxicity mechanism of APS8. This compound is only moderately toxic, showing toxicity only in rather high doses. The toxicity is most probably due to the lytic effects that increase blood potassium levels/hyperkalemia and limited damage of the pulmonary bloodstream. This goes along the results already obtained by natural alkylpyridinium compounds. The obtained results were necessary starting point for further research in vitro as well as in vivo. The focus of our researc was shifted to the APS8 effects on signaling pathways, which are linked to the inhibition of nAChR and triggers apoptosis of cancer cells, while normal cells remain unaffected. We found that intra tumor injection of APS8 into human lung adenocarcinoma xenografts in SCID mice almost completely stop the tumor growth and in some cases even eliminates the entire tumor. This results make APS8 a promising candidate to develop new chemotherapeutic agent for treatment of those cancer forms whose cells express elevated nAChR numbers, predominantly those of the alpha 7 subtype. 3.Poročilo o realizaciji predloženega programa dela na raziskovalnem projektu2 Na samem začetku projekta smo opravili raziskave z izbranima alkilpiridinijevima analogoma APS8 in APS12-2 in vivo na poskusnih živalih. Te raziskave so opravili sodelavci projekta z Veterinarske fakultete UL, ki imajo za tovrstne poskuse ustrezna dovoljenja. Toksičnost analogov APS smo preverjali na miših in podganah. Rezultati so pokazali, da testirani analogi (APS-12-2, APS3 in APS8) niso zelo toksični (i.v. LD50 med 7.5 in 15 mg/kg miši) in v terapevtskih odmerkih ne povzročajo toksičnih učinkov na poskusnih živalih. Preliminarne poskuse na a7 podtipu nAChR je opravil ameriški partner na University of Florida v okviru bilateralnega projekta SLO-Usa. S sodelavci projekta z Nacionalnega inštituta za biologijo pa smo opravili večino poskusov na celičnih kulturah treh pljučnih celičnih linij. Dve od teh linij pripadata adenokarcinomskim rakastim celicam (A549) oz. skvamoznim rakastim celicam (SK-MES-1), ena pa je normalna celična linija pljučnih fibroblastov (MRC5), ki nam je rabila kot kontrola. Obe rakasti liniji celic pripadata tipu nedrobnih celic pljučnega raka (NSCLC). Z MTT testom smo določili kako izbrani sintetični alkilpiridinijev analog APS8 vpliva na rast in proliferacijo celic po 24, 48 in 72 urni izpostavljenosti. Koncentracije nad 100 nM statistično značilno znižajo preživetje rakastih pljučnih celičnih linij glede na kontrolo. APS8 močno inhibira rast rakastih celičnih linij A549 in SK-MES-1. Inhibicija je odvisna od koncentracije ter od časa izpostavljenosti. Celice normalne celične linije MRC-5 so bistveno bolj odporne na delovanje APS8, kajti tudi po inkubaciji s koncentracijo 1000nM APS8 je preživelo dobrih 80% celic. Preverili smo tudi vpliv nikotina na proliferacijo vseh treh celičnih linij. Nikotin pozitivno vpliva na vse vrste celic in pospešuje rast. Delež apoptotskih celic smo določili z analizo na pretočnem citometru. Po 48 urni izpostavitvi celic APS8, nikotinu in kombinaciji obeh smo celice obarvali z aneksinom V označenim s FITC ter s propidijevim jodidom, s čimer smo spremljali stopnjo apoptoze. Izpostavitev A549 celic APS8 povzroči od koncentracije odvisno apoptozo celic. Po dodatku nikotina se obarvanost celic spremeni, saj se delež živih celic zviša za približno 20% ob istočasni izpostavljenosti višjim koncentracijam APS8. Celice SK-MES-1 se po dodatku APS8 in nikotina obnašajo podobno kakor celice linije A549. Normalni pljučni fibroblasti MRC-5 so manj občutljivi na APS8. 500 nM koncentracija APS8 povzroči le 10% zmanjšano preživetje teh celic, hkratni dodatek nikotina pa zviša odstotek živih celic pri omenjeni koncentraciji APS8 za dodatnih 10%. Podobne rezultate smo dobili tudi pri 5x manjši koncentraciji (100 nM) in dvakrat višji koncentraciji APS8 (1000 nM). Drugi sklop raziskav je bil namenjen predvsem raziskavam vezave APS na nAChR in posledične inhibicije nekaterih podtipov nAChR, kot sta heteromerni nAChR, ki ga izražajo skeletne mišice in homomerni alfa 7 nAChR, ki ga izražajo živčne celice centralnega živčnega sistema in drobne ter nedrobne rakaste celice pljučnega skvamoznega karcinoma in adenokarcinoma. Ti podatki so pomembni zaradi opredelitve specifičnosti, morebitne toksičnosti preizkušanih snovi na živalih in delovanja na specifične podtipe nAChR, ki imajo različno vlogo pri nastanku rakastih obolenj oziroma za preživetje rakastih celic. Ugotovili smo, da je toksični učinek analoga APS3 posledica blokade mišičnega tipa nAChR, medtem ko je APS8 že v zelo nizki koncentraciji (1-3 nM) povzročil specifično in blokado alfa 7 nAChR, šele v okrog 100x višji koncentraciji pa tudi preprečil vezavo kompetitivnega inhibitorja, predstavnika kačjih triprstih toksinov - bungarotoksina, kar kaže na nekompetitiven način inhibicije. Na treh celičnih linijah - normalnih pljučnih humanih fibroblastih in dveh rakastih linijah pljučnega skvamoznega ali adenokarcinoma, SKMES-1 in A549, smo preiskušali delovanje alkilpiridinijevega analoga APS8. Ugotovili smo, da je analog toksičen za obe rakasti celični liniji, ne pa tudi za normalne fibroblaste. Analog v obeh rakastih linijah sproži apoptozo, ki je v glavnem posledica aktivacije proapoptotskih dejavnikov intrinzične poti apoptoze. Poleg tega APS aktivira tudi kaspazo 9 pa tudi kaspazo 8, kar bi lahko kazalo tudi na pot apoptoze, ki jo sprožijo ligandi preko receptorjev smrti. Vsekakor smo z uporabo bioloških čipov, s katerimi lahko opredelimo izražanje pro-in antiapototskih dejavnikov ugotovili, da se je v primeru obeh rakastih celičnih linij po inkubaciji z APS8 statistično značilno povečalo izražanje pro-apoptotskih dejavnikov in istočasno prav tako statistično značilno zmanjšalo izražanje anti-apoptoskih dejavnikov. Poleg tega smo ugotovili, da APS8 statistično značilno izniči antiapoptotski učinek nikotina, kar smo opazili na obeh rakastih celičnih linijah. Premik v smer apoptoze na rakastih celicah po izpostavitvi APS8 smo zasledili tudi s pretočno citometrijo in potrdili z meritvami spremembe mitohondrijskega potenciala. Teh učinkov pa nismo zasledili na normalnih humanih pljučnih fibroblastih (celična linija MRC5). Poleg učinka, ki ga ima APS8 na izražanje proapototskih dejavnikov v rakastih celicah smo v preliminarnih raziskavah tudi ugotovili, da APS8 negativno vpliva na proliferacijo celic rakastih linij in tudi zavira ožiljenje, kar dodatno odpira možnost za uporabo te in podobnih snovi v boju proti rakastim obolenjem, ki jih povzroča kajenje in s kajenjem povezane snovi v izpostavljenih dihalnih poteh. V nadaljevanju projekta smo raziskovali učinke APS8 na celice humanega adenokarcinoma (A549), kot modela za nedrobnoceličnega raka pljuč. APS8 po vezavi na nikotinske acetilholinske receptorje (nAChR) podtipa a7 sproži signalne poti, ki pripeljejo do apoptoze celic A549. Zato smo podrobneje raziskali z APS8-povzročeno celično signalizacijo in preverili izražanje receptorjev a7 nAChR.Vzpostavili smo protokol za detekcijo receptorja a7 nAChR: i) na ravni RNA s pomočjo verižne reakcije s polimerazo v realnem času neposredno na celičnih lizatih in ii) na ravni proteinov s prenosom celičnih proteinov po Westernu in uporabo ustreznih protiteles. Ugotovili smo povišano izražanje receptorja a7 nAChR pri celicah A549 na nivoju RNA in proteinov. Pri celicah raka prostate (Du145 in PC-3) ter celicah kolorektalnega raka (HT29 in LoVo) je izražanje receptorjev a7-nAChR bistveno manjše (tudi do 100-krat). S tehnologijo siRNA smo v celicah A549 prehodno utišali izražanje gena za receptor CHRNA7. Dosegli smo 98% utišanje na ravni RNA. Celice A549 in celice A549 z utišanim genom za receptor CHRNA7 smo obdelali z APS8 (6 ur) ter preverili celično viabilnost, morebitno citotoksičnost APS8 in aktivacijo kaspaz 3/7. Opazili smo, da APS8 zmanjša viabilnost A549 in sproži apoptozo preko aktivacije kaspaz 3/7, vendar v izbranih koncentracijah (0,02-10 |jM) in času delovanja ne delujejo citotoksično. Tak profil je značilen za snovi, ki povzročijo zaustavitev celičnega cikla. Enak učinek smo opazili tudi pri celicah z utišanim receptorjem, le da je do apoptoze prišlo šele pri 10 krat višji koncentraciji APS8. Z uporabo mikromrež s točkovno nanešenimi protitelesi smo podrobneje raziskali celično signaliziranje po vezavi APS8 na receptorje a7-nAChR v celicah A549. Ugotovili smo, da se po 5 minutah sprožijo signalne poti preko kinaz Erk1/2 in JNK ter transkripcijskega faktorja AP-1. Po 1 uri se poveča izražanje kinaze CDK6, ki ima ključno vlogo pri uravnavanju celičnega cikla. Po 24 urah se poveča izražanje mitohondrijskega proteina Smac/DIABLO, ki povzroči aktivacijo kaspaz preko poti citokrom c/Apaf-1/kaspaza 9. Ob vezavi agonistov na receptor a7 nAChR pride do masovnega vdora kalcijevih ionov v celico. Zato smo začeli z meritvami Ca2+ na fluorescenčnem mikročitalcu. Z raziskavami na celicah A549 in celicah A549 z utišanim genom CHRNA7, ki smo jih izpostavili APS8, acetilholinu (fiziološkemu agonistu) ter kombinaciji obeh, smo poskušali potrditi specifično vezavo APS8 na receptor a7 nAChR in vpliv te vezave na zmanjšanje znotrajcelične koncentracije Ca2+ ionov. V preteklem letu smo pokazali, da so nikotinski acetilholinski receptorji (nAChR) podtipa alfa 7 močno izraženi na površini celic humanega adenokarcinoma pljuč. Ti receptorji ob vezavi agonistov (acetilholin, nikotin ipd.) omogočijo selektiven vdor Ca2+ ionov v celice, ki povzroči depolarizacijo membrane in aktivacijo napetostno odvisnih Ca2+ kanalčkov ter MAPK signalnih poti. Nikotin in njegovi metaboliti na ta način aktivirajo transkripcijski faktor NF-kB, ki inducira vstop v S fazo celičnega cikla in proliferacijo rakavih celic.V zadnjem letu poteka projekta smo preverili hipotezo, ali lahko antagonisti nAChR, kot je APS8, z zaviranjem zgoraj opisane Ca2+ signalizacije preprečijo proliferacijo pljučnih rakavih celic. Meritve Ca2+ smo sprva opravljali na fluorescenčnem mikročitalcu, a smo se zaradi slabe ponovljivosti poskusov kasneje lotili merjenje Ca2+ s konfokalnim mikroskopom. Celice A549 in celice A549 z siRNA utišanim receptorjem a7 nAChR smo naložili s Fluo-4 fluorescentnim indikatorjem za Ca2+ in jih nato obdelali s fiziološkim agonistom acetilholinom, s specifičnim agonistom a7 nAChR, z nikotinom, z APS8 oziroma posameznimi kombinacijami. Preverili smo različne koncentracije spojin in različne časovne intervale izpostavljenosti. Ugotovili smo, da se celice A549 različno odzivajo na acetilholin in nikotin (odzove se približno 40% celic; odziv traja le nekaj sekund). Pri specifičnem agonistu pa je bil ta odziv še manjši. APS8 v testiranih koncentracijah ni povzročil vdora Ca2+ v celice. Po predhodni inkubaciji celic z APS8 se celice na acetilholin odzovejo v bistveno manjši meri, zato sklepamo, da APS8 blokira vdor Ca2+. S tem smo pokazali, da bi APS8 lahko uporabili pri zdravljenju nedrobnoceličnega raka pljuč, kot specifičnega zaviralca celične proliferacije. Nadaljevali smo tudi raziskave in vivo na SCID miškah, ki smo jih na kožo vstavili presadke humanega pljučnega adenokacinoma celične linije A549. Tumorske celice so v histološki analizi in markiranju s protitelesi kazale veliko število nAChR. Ker so preliminarni rezultati pokazali, da že enkratni intratumorski vnos v koncentraciji 4mg/kg sprva popolnoma zavre rast tumorjev, a čez približno 30 dni pride do remisije tumorjev, smo s poskusi nadaljevali tako, da smo v določenih časovnih intervalih doziranje APS8 trikrat ponovili in tako pri petih od šestih tumorjev njihovo rast ustavili. Po približno 45 dneh od prve aplikacije so tumorji začeli ponovno rasti, vendar je bila rast počasnejša. Menimo, da APS8 deluje kot izredno dober kemoterapevtik in da je remisija tumorjev povezana le z lastnostmi SCID miši, ki so imunonekompetentne in ne morejo v celoti odstraniti majhnega števila preživelih tumorskih celic. Iz teh celic nato lahko zraste nov tumor, kar se pri miškah z neokvarjenim imunskim sistemom verjetno ne bi zgodilo. 4.Ocena stopnje realizacije programa dela na raziskovalnem projektu in zastavljenih raziskovalnih ciljev3 Ocenjujemo, da sta realizacija programa in realizacija zastavljenih ciljev projekta potekala v skladu z načrtovanimi poskusi znotraj terminskega okvira. Zaradi tega smo kar nekaj časa razmišljali tudi o prijavi patenta, česar pa zaradi pomanjkanja denarja nismo mogli realizirati. Tako smo se na koncu raje odločili za objavo članka v vrhunski reviji s področja molekularne biologije raka, ki je v pripravi. Zaradi kompleksnosti signalnih poti in njihovih povezav z delovanjem ligandov, ter novih vprašanj, ki so se porajala ob dobljenih rezultatih, smo med samim raziskovanjem cilje projekta nekoliko prilagodili oziroma razširili. Predvsem smo vpeljali nekatere metode, kot je utišanje genov za nekatere podtipe nAChR s specifičnimi siRNA v rakastih celičnih linijah, kar nam bo dalo odgovore na vprašanje ali so v teh celicah nAChR dejansko predvideni receptorji prav ti receptorji, katerih blokada sproži apoptozo v rakastih celicah. Z metodama RT PCR in prenosom po Westernu pa smo poskušali opredeliti obseg ekspresije teh receptorjev na površini rakastih in normalnih celic, kar bi nam lahko dalo odgovore glede povezave med količino izraženih nAChR in obsegom apoptoze v različnih tipih celic (rakastih in normalnih). Ocenjujemo, da smo v projektu realizirali večino zastavljenih ciljev. Zaradi dragih raziskav, ki vključujejo uporabo mikromrež in bioloških čipov ter obsežno bioinformacijsko analizo, nismo bolj podrobno pojasnili celične signalizacije, ki vodi v apoptozo tumorskih celic, ko te izpostavimo APS8. S temi raziskavami bi lahko nadaljevali le s povečanim obsegom raziskovalnih sredstev ali vsaj s podaljšanjem projekta v sedanjem obsegu, pri čemer bi bile tovrstne raziskave zastavljene kot glavni cilj projeka. Prav tako nismo v celoti realizirali raziskav, ki smo jih nameravali opraviti z ameriškim partnerjem v okviru bilateralnega projekta, ki je med trajanjem našega projekta potekel. Opravili smo elektrofiziološke meritve na alfa7 podtipu nAChR, ne pa tudi na nekaterih drugih podtipih, ki bi bili lahko vpleteni v celično signalizacijo, proliferacijo in apoptozo nekaterih rakastih celic. Vsekakor moramo poudariti, da so najbolj obetavne raziskave tiste, pri katerih smo na imunonekompetetnih miškah z inokuliranimi tumorji humanega adenokarcinoma z večkratnimi ponavljujočimi se odmerki APS8 rast teh tumorjev popolnoma zavrli oz. odpravili. 5.Utemeljitev morebitnih sprememb programa raziskovalnega projekta oziroma sprememb, povečanja ali zmanjšanja sestave projektne skupine4 V okviru projekta le-tega skoraj nismo spreminjali, zaradi boljše izvedbe projekta smo na podlagi dobljenih rezultatov opravili le nekaj manjših dodatnih raziskav na nekaterih celičnih linijah, ki jih sprva nismo predvideli. Nekatere načrtovane raziskave (predvsem tiste z zunanjim ameriškim partnerjem) zaradi poteka in neobnovitve bilateralnega projekta nismo v celoti opravili. Glede financiranja projekta je med njegovim trajanjem zaradi varčevanja vlade na področju znanosti v letu 2012 najprej prišlo do prevedbe razredov, v konkretnem primeru iz razreda D v razred C. V letu 2013 pa smo izkoristili možnost, da smo na račun zmanjšanja raziskovalnih ur in povečanja deleža za materialne stroške, ponovno spremenili razred projekta iz razreda C nazaj v razred D. 6.Najpomembnejši znanstveni rezultati projektne skupine5 Znanstveni dosežek 1. COBISS ID 2854223 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Alkilpiridinijev polimer APS8 blokira alfa 7 nAChR in sproži apoptozo v nedrobnih celicah pljučnega karcinoma ANG APS8, a polymeric alkylpyridinium salt blocks [alpha]7 nAChR and induces apoptosis in non-small cell lung carcinoma Opis SLO APS8, sintetični analog naravnih alkilpiridinijevih polimerov, z definirano dolžino alkilnih verig in znano velikostjo molekule. APS8 je nekompetitivni inhibitor a7 nikotinskih acetilholinskih receptorjev (nAChRs), ki jih blokira v nanomolarnih koncentracijah, torej takih, ki so prenizke, da bi bile citotoksične. V članku smo pokazali, da APS8 inhibira rast nedrobnih rakastih celic pljučnega karcinoma in v njih aktivira signalne poti, ki vodijo v apoptozo. APS8 ni toksičen za normalne pljučne fibroblaste. APS8 vsaj delno izniči proliferativen in antiapoptotičen učinek nikotina v NSCLC celičnih linijah. Naši rezultati nakazujejo na možnost, da bi bili APS8 ali podobni analogi primerni za razvoj novih protirakastih zdravil, kar še posebej velja za nekatere oblike pljučnega raka. ANG APS8, a synthetic analog of naturally occuring poly-APS with defined alkyl chain length and molecular size, non-competitively inhibits a7 nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) at nanomolar concentrations that are too low to be generally cytotoxic. In the present study we show that APS8 inhibits NSCLC tumor cell growth and activates apoptotic pathways. APS8 was not toxic for normal lung fibroblasts. Furthermore, in NSCLC cells, APS8 reduced the adverse anti-apoptotic, proliferative effects of nicotine. Our results suggest that APS8 or similar compounds might be considered as lead compounds to develop antitumor therapeutic agents for at least certain types of lung cancer. Objavljeno v MDPI; Marine drugs; 2013; Vol. 11, no. 7; str. 2574-2594; Impact Factor: 3.512;Srednja vrednost revije / Medium Category Impact Factor: 2.577; A': 1; WoS: DX; Avtorji / Authors: Zovko Ana, Viktorsson Kristina, Lewensohn Rolf, Kološa Katja, Filipič Metka, Xing Hong, Kem William R., Paleari Laura, Turk Tom Tipologija 1.01 Izvirni znanstveni članek 2. COBISS ID 3598970 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Toksičnost sintetične alikilpiridinijeve soli (APS3) je posledica specifične blokade nikotinskih acetilholinskih receptorjev ANG Toxicity of the synthetic polymeric 3-alkylpyridinium salt (APS3) is due to specific block of nicotinic acetylcholine receptors Toksičen učinek polimerne 3-alkilpiridinijeve soli (APS3) iz sredozemske vrste spužve reniera sarai smo preiskušali in vitro in in vivo na sesalcih. srednja letalna doza te spojine za miši je bila 7.25 mg/kg, za podgane pa 20 mg/kg. Pri podganah je intravenozni vnos APS3 v odmerkih 7.25 oz 20 Opis SLO mg/kg povzročil najprej občutno znižanje srednjega arterijskega tlaka, ki pa mu je sledilo povečanje tlaka s spremljujočo tahikardijo. Poleg tega je večkratni kumulativni vnos APS3 (do 60 mg/kg) pri podganah povzročil blokado mišične kontrakcije in vivo z mediano inhibitorno dozo (37.5 mg/kg). pri intramuskularnem vnosu je APS3 povzročil tudi padec mišičnega akcijskega potenciala. Poskusi in vitro so potrdili inhibitorni učinek APS3 na živčno mišični preparat (mišjo hemidiafragmo) z IC50 = 20.3 uM , ne da bi bila ob tem prizadet odgovor mišice, ki jo stimuliramo direktno. APS3 učinkovito inaktivira z acetilholinom sproženi tok v oocitah afriške krempljičarke z vstavljenimi mišičnimi heteromernimi nAChR (a12ß^) iz električnega skata (IC50=0.19 pM). Rezultati kažejo, da APS3 blokira mišični tip nAChR, kar je verjetno tudi razlog za toksični učinek APS3 in vivo. ANG The in vivo and in vitro toxic effects of the synthetic polymeric 3-alkylpyridinium salt (APS3), from the Mediterranean marine sponge Reniera sarai, were evaluated on mammals, with emphasis to determine its mode of action. The median lethal doses of APS3 were 7.25 and higher that 20mg/kg in mouse and rat, respectively. Intravenous administration of 7.25 and 20mg/kg APS3 to rat caused a significant fall followed by an increase in mean arterial blood pressure accompanied by tachycardia. In addition, cumulative doses of APS3 (up to 60 mg/kg) inhibited rat nerve-evoked skeletal muscle contraction in vivo, with a median inhibitory dose (ID(50)) of 37.25mg/kg. When administrated locally by intramuscular injection to mouse, APS3 decreased the compound muscle action potential recorded in response to in vivo nerve stimulation, with an ID(50) of 0.5mg/kg. In vitro experiments confirmed the inhibitory effect of APS3 on mouse hemidiaphragm nerve-evoked muscle contraction with a median inhibitory concentration (IC(50)) of 20.3 pM, without affecting directly elicited muscle contraction. The compound inhibited also miniature endplate potentials and nerve-evoked endplate potentials with an IC(50) of 7.28 pM in mouse hemidiaphragm. Finally, APS3 efficiently blocked acetylcholine-activated membrane inward currents flowing through Torpedo nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) incorporated to Xenopus oocytes, with an IC(50) of 0.19 pM. In conclusion, our results strongly suggest that APS3 blocks muscle-type nAChRs, and show for the first time that in vivo toxicity of APS3 is likely to occur through an antagonist action of the compound on these receptors. Objavljeno v North-Holland Publishing; Toxicology; 2013; Vol. 303, no. 1; str. 25-33; Impact Factor: 3.745;Srednja vrednost revije / Medium Category Impact Factor: 2.771; A': 1; WoS: TU, YO; Avtorji / Authors: Grandič Marjana, Araoz Romulo, Molgo Jordi, Turk Tom, Sepčić Kristina, Benoit Evelyne, Frangež Robert Tipologija 1.01 Izvirni znanstveni članek 3. COBISS ID 3587706 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Nekompetitivni acetilholinesterazni inhibitor APS12-2 je močen antagonist nikotinskih acetilholinskih receptorjev na progastih mišicah. ANG The non-competitive acetylcholinesterase inhibitor APS 12-2 is a potent antagonist of skeletal muscle nicotinic acetylcholine receptors Opis SLO Preiskušali smo delovanje APS 12-2 na preparatu mišje hemidiafragme. APS12-2 koncentracijsko odvisno blokira z živčnimi impulzi sproženo mišično krčenje (IC50=0.74 pM), ne da bi istočasno blokiral direktno stimulirano krčenje. APS12-2 prav tako blokira z acetilholinom sproženi tok v oocitah afriške krempljičarke z vstavljenimi mišičnimi heteromernimi nAChR (a12ß!^) iz električnega skata (IC50=0.0005 pM), kar kaže na večjo občutljivost teh receptorjev v primerjavi z nekoliko drugačnimi mišjimi (a12ß!Y£) nAChR. Rezultati prispevka kažejo, da APS12-2 blokira prenos signalov z živca na mišico zaradi blokade nAChR v motorični ploščici. ANG In the present work the effects of APS12-2 were studied on isolated mouse phrenic nerve-hemidiaphragm muscle preparations, using twitch tension measurements and electrophysiological recordings. APS12-2 in a concentration dependent manner blocked nerve-evoked isometric muscle contraction (IC50=0.74 pM), without affecting directly-elicited twitch tension up to 2.72 pM. The compound (0.007-3.40 pM) decreased the amplitude of miniature endplate potentials until a complete block by concentrations higher than 0.68 pM, without affecting their frequency. Full size endplate potentials, recorded after blocking voltage-gated muscle sodium channels, were inhibited by APS12-2 in a concentration-dependent manner (IC50=0.36 pM) without significant change in the resting membrane potential of the muscle fibers up to 3.40 pM. The compound also blocked acetylcholine-evoked inward currents in Xenopus oocytes in which Torpedo (a12ßlYб) muscle-type nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) have been incorporated (IC50=0.0005 pM), indicating a higher affinity of the compound for Torpedo (а12ßlYб) than for the mouse (a12ß1Y£) nAChR. Our data show for the first time that APS12-2 blocks neuromuscular transmission by a non-depolarizing mechanism through an action on postsynaptic nAChRs of the skeletal neuromuscular junction. Objavljeno v Academic Press.; Toxicology and applied pharmacology; 2012; Vol. 265, no. 2; str. 221-228; Impact Factor: 3.975;Srednja vrednost revije / Medium Category Impact Factor: 2.768; A': 1; WoS: TU, YO; Avtorji / Authors: Grandič Marjana, Araoz Romulo, Molgo Jordi, Turk Tom, Sepčić Kristina, Benoit Evelyne, Frangež Robert Tipologija 1.01 Izvirni znanstveni članek 4. COBISS ID 2500687 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Vezava naravnih in sintetičnih 3-alkilpiridinijevih polimerov na lipidne dvosloje in permeabilizacija membran. ANG Binding and permeabilization of lipid bilayers by natural and synthetic 3-alkylpyridinium polymers Opis SLO Naravni 3-alkilpirdinijevi polimeri iz morske spužve reniera sarai so membransko aktivne snovi, ki kažejo selektivno toksičnost proti nedrobnim pljučnim rakastim celicam in povzročajo stabilno transfekcijo sesalskih celic. V luči možne uporabe omenjenih snovi kot kemoterapevtikov in/ali transfekijskih orodij smo preiskusili serijo sintetičnih analogov APS na naravnih in umetnih lipidnih dvoslojih. Testirani analogi so bili stabilni v širokem temperaturnem in pH območju in pri različnih ionskih jakostih raztopine. izkazalo se je, da preferirajo urejena membranska stanja, večjo membransko aktivnost pa kažejo analogi z daljšimi alkilnimi verigami in večjim obsegom polimerizacije osnovnih gradnikov. ANG Naturally occurring 3-alkylpyridinium polymers from the marine sponge Reniera sarai are membrane-active compounds exerting a selective cytotoxicity towards non small cell lung cancer cells, and stable transfection of nucleated mammalian cells. In view of their possible use as chemotherapeutics and/or transfection tools, three poly-APS based synthetic compounds were tested on their activity using natural and artificial lipid membranes. The tested compounds were found to be very stable over a wide range of temperature, ionic strength, and pH, and to prefer the solid-ordered membrane state. Their membrane-damaging activity increases with the length of their alkyl chains and the degree of polymerization. Objavljeno v Pergamon; Bioorganic & Medicinal Chemistry; 2012; Vol. 20, issue 5; str. 1659-1664; Impact Factor: 2.903;Srednja vrednost revije / Medium Category Impact Factor: 2.608; WoS: CQ, DX, EE; Avtorji / Authors: Grandič Marjana, Zovko Ana, Frangež Robert, Turk Tom, Sepčić Kristina Tipologija 1.01 Izvirni znanstveni članek 5. COBISS ID 3364218 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Toksični in letalni kardiovaskularni učinki sintetičnih 1,3 dodecilpiridinijevih polimerov na glodalce in vivo. ANG In vivo toxic and lethal cardiovascular effects of a synthetic polymeric 1,3-dodecylpyridinium salt in rodents Opis SLO APS12-2 je eden od številnih sistetičnih analogov naravnih polimernih alkilpiridinijevih soli iz morske spužve Reniera sarai. Ker so te snovi potencialni kandidati za zdravljenje nedrobno celičnega pljučnega raka smo raziskali morebitne toksične in letalne učinke tega analoga in vivo. Srednja letalna doza je 11.5 mg na kg miši. Elektrokardiograme, arterijski krvni tlak in respiratorno aktivnost smo merili v splošni anesteziji na podganah, ki smo jih predhodno farmakološko vagotomizirali in ventilirali z umetno respiracijo. Na eni skupini poskusnih živali smo ugotavljali tudi mišično kontrakcijo, ki smo jo prožili preko ustreznega motoričnega živca. Vnos APS12-2 v koncentraciji 8 mg/kg je povzročil progresivni padec arterijskega krvnega tlaka, kar sta spremljali tudi bradikardija in miokardna ishemija, prišlo pa je tudi do pojava ventrikularnih ekstrasistol in atrioventrikularnega bloka 2. stopnje. Podobno sta se elektrokardiogram in arterijski pritisk spreminjala tudi pri poskusnih živalih, ki so predhodno dobile atropin in suportivno umetno dihanje, kar kaže na to, da hipoksija in holinergični sistem nista vpletena v toksične učinke APS12-2. Vnos APS12-2 v subletalnih odmerkih (med 4 in 5.5 mg/kg) je prav tako povzročil padec krvnega tlaka, čemur pa je sledilo malenkostno povečanje nad kontrolno vrednostjo. Poleg tega APS12-2 tudi lizira podganje eritrocite "in vitro", verjetno pa tudi "in vivo", kar povzroči hiperkalemijo, s čimer si lahko pojasnemo kardiotoksične učinke, saj drugih patoloških sprememb na srčni mišici nismo zaznali. ANG APS12-2 is one of a number of synthetic analogues of the polymeric alkylpyridinium salts from the marine sponge Reniera sarai. As it is a potential candidate for treating non small cell lung cancer, we have studied its possible toxic and lethal effects in a whole organism. The median lethal dose (LD50) of APS12-2 in mice was shown to be 11.5 mg/kg. Electrocardiograms, arterial blood pressure and respiratory activity were recorded under general anesthesia in untreated, pharmacologically vagotomized and artificially ventilated rats injected with APS12-2. In one group, the in vivo effects of APS12-2 were studied on nerve-evoked muscle contraction. Administration of APS12-2 at a dose of 8 mg/kg produced a progressive reduction of arterial blood pressure to a mid-circulatory value, accompanied by bradycardia, myocardial ischemia and ventricular extrasystoles, and second degree atrio-ventricular block. Similar electrocardiogram and arterial blood pressure changes caused by APS12-2 (8 mg/kg) were observed in animals pretreated with atropine and in artificially ventilated animals, indicating that hypoxia and cholinergic effects do not play a crucial role in the toxicity of APS12-2. Application of APS12-2 at sublethal doses (4 and 5.5 mg/kg) caused a decrease of arterial blood pressure, followed by increase slightly above control values. In addition, APS12-2 induced lysis of rat erythrocytes in vitro, and probably also in vivo since hyperkalemia and decreased hematocrit were observed. Hyperkalemia probably plays an important role in APS12-2 cardiotoxicity, since no evident changes in pathohistology of the heart were found. Objavljeno v Academic Press.; Toxicology and applied pharmacology; 2011; Vol. 255, No. 1; str. 86-93; Impact Factor: 4.447;Srednja vrednost revije / Medium Category Impact Factor: 2.716; A': 1; WoS: TU, YO; Avtorji / Authors: Grandič Marjana, Sepčić Kristina, Turk Tom, Juntes Polona, Frangež Robert Tipologija 1.01 Izvirni znanstveni članek 7.Najpomembnejši družbeno-ekonomski rezultati projektne skupine6 Družbeno-ekonomski dosežek 1. COBISS ID 268099328 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Čudovite oblike ANG Amazing forms Opis SLO Učbenik Čudovite oblike je namenjen gimnazijskemu programu biologije in obravnava temeljne anatomske oblike gliv, rastlin in živali ter njihovo fiziološko delovanje na ravni organizma. Učbenik je napisan tako da anatomski in fiziološki ustruj organizmov podaja na primerjalen način. Dijaki/dijakinje tako dobijo vpogled kako se enake ali vsaj podobne rešitve delovanja organizmov razvijejo kljub velikim razlikam v njihovi morfologiji in samem načinu življenja. ANG The textbook Amazing forms is a high school biology textbook covering basic anatomic and physiological principles of fungi, plants and animals. The textbook is written in a way students get a comparative insight and learn that same or similar functional solutions are found in organisms which otherwise substantially differ in terms of morphology and way of life. Šifra D.10 Pedagoško delo Objavljeno v Rokus Klett; 2013; 272 str.; Avtorji / Authors: Lenasi Helena, Kreft Marko, Turk Tom, Dermastia Marina, Dermastia Marina Tipologija 2.04 Srednješolski, osnovnošolski ali drugi učbenik z recenzijo 2. COBISS ID 259405312 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Kjer se življenje začne --- ANG Where the life begins--- Opis SLO Učbenik »Kjer se življenje začne« obravnava vsebine iz biologije celice in genetike za gimnazije. Avtorji v skladu z učnim načrtom in opaznim osebnim pristopom na zanimiv in ilustrativen način podajajo vsebine, ki so za gimnazijce nedvomno težke, a jih avtorji predstavijo tako, da omogočajo razumevanje kompleksnih pojavov v življenju celice tudi tistim dijakom, ki jih biološke vsebine sicer ne zanimajo. Prav zato sta združenje evropskih založnikov šolske literature (European Education Publishing Group, EEPG) in združenje IARTEM (International Association for Research on Textbooks and Educational Media) na frankfurtskem knjižnem sejmu leta 2012 učbeniku podelilo bronasto priznanje (Best European Schoolbook Awards) v kategoriji srednješolskih učbenikov. ANG The textbook »Where the life begins« includes chapters on cell biology and genetics for the high school students. The authors used a personalized and innovative approach to explain complex cell life which is usually abstract and difficult to understand for the high school students, especially those which are not interested in biology. This didactic approach was recognized by the jury of European Education Publishing Group (EEPG) and International Association for the Research on Textbooks and Educational Media (IARTEM). According to their decision in 2012 at the Frankfurter book fair the textbook was awarded bronze medal in the highschool textbook category. Šifra E.02 Mednarodne nagrade Objavljeno v Rokus Klett; 2012; 297 str.; Avtorji / Authors: Dermastia Marina, Komel Radovan, Turk Tom Tipologija 2.04 Srednješolski, osnovnošolski ali drugi učbenik z recenzijo 3. COBISS ID 2611535 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Protirakasto delovanje sintetičnih alkilpiridinijevih polimerov ANG Anti-cancer activity of synthetic analogues of poly-APS Opis SLO Eden od možnih načinov zdravljenja raka, je uporaba zdravil, ki pospešijo programirano celično smrt in blokirajo proliferacijo rakastih celic. Antagonisti a7 nACh receptorjev (npr. a-bungarotoksin in metililkakonitin) lahko oslabita proliferativni učinek agonistov kot je nikotin. Pokazali smo, da imajo sintetični analogi polimernih alkilpiridinijevih soli veliko afiniteto do a7 nACh receptorjev, saj jih blokirajo v zelo nizkih koncentracijah (0.1 ng/ml). Sintetični analog APS8 je močno toksičen za NSCLC A549 (rakasto adenokarcinomsko celično linijo). Rast tumorjev preprečuje premosorazmerno s koncentracijo. Kot kontrolo smo uporabili normalno celično linijo pljučnih fibroblastov (MRC5), ki so bistveno manj občutljive, saj APS8 vpliva na njihovo rast le v zelo visokih koncentracijah. ANG One of the therapeutical approaches against cancer is to use drugs enhancing cell death and blocking cell proliferation of cancer cells. a7 nAChR antagonists (a-bungarotoxin or methyllycaconitine) can attenuate the proliferative effects of agonists like nicotine. We have shown that synthetic analogues of poly-APS have high affinity for nAChRs. They inhibit alpha a7 nAChRs with concentration as low as 0.1 ng/ml and are therefore strong antagonists of a7 nAChR. A synthetic analogue APS8 shows a significant toxicity towards NSCLC (A549 cell line). It inhibits tumor cell growth in a concentration dependent manner. As a control we tested the effect of APS8 on normal lung fibroblast cells (MRC5) which did not show alterations in growth until high concentrations of APS8 were used. Šifra B.03 Referat na mednarodni znanstveni konferenci Objavljeno v European Cell Death Organization; Programme & abstract book; 2011; Str. 265; Avtorji / Authors: Zovko Ana, Kološa Katja, Nunić Jana, Lah Turnšek Tamara, Filipič Metka, Turk Tom Tipologija 1.12 Objavljeni povzetek znanstvenega prispevka na konferenci 4. COBISS ID 2612047 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Sintetični analogi alkilpiridinijevih polimerov z blokado nAChR sprožijo apoptozo v adenokarcinomskih celicah. ANG Synthetic analogues of poly-APS induces apotosis [!] in lung adenocarcinoma cells by blocking nACh receptors Opis SLO Pokazali smo da APS8 inhibirajo a7 nAChRs, nanje delujejo močno antagonistično, s čimer bi lahko sprožili regresijo tumorja. APS8 imajo značilno selektivno toksičnost za NSCLC, ne vplivajo pa na normalne pljučne fibroblaste MRC5. Aktivacijo apoptoze z APS8 v NSCLC smo kvantitativno opredelili s sistemom barvil aneksin V-FITC/propidium jodid in fluorescentno pretočno citometrijo. Barvanje DNA z akridin oranžnim in etidijevim bromidom nam je dalo vpogled v apoptotično delovanje APS8. Preučevali smo tudi mehanizem, s katerim APS8 povzroči apoptozo v NSCLC. APS8 v teh celicah sproži ekspresijo proapoptotičnih proteinov družine Bcl-2, medtem ko se ekspresija apoptotičnih proteinov zmanjša. APS8 sproži tudi prekomerno izražanje receptorjev smrti. Naši rezultati kažejo, da so v potek apoptoze v primeru izpostavitve celic APS8 vpletene signalne poti tako intrinzične kakor tudi ekstrinzične poti. Sprožitev apoptoze v rakastih celicah s pomočjo APS8, uvršča to spojino med potencialno uporabna in nova sredstva za zdravljenje pljučnega raka. ANG We have shown that APS8 inhibits a7 nAChRs indicating that it is a strong a7 nAChRs antagonist and can thus induce tumor regression. APS8 has significant selective cytotoxicity towards NSCLC cells while has no influence on normal lung fibroblast cells MRC5. Evidence of apoptosis activation by APS8 in NSCLC was quantitatively analyzed by annexin V-FITC/propidium iodide uptake analysis with fluorescent cytometry. Cell morphology of APS8 induced apoptosis was investigated with a combination of the fluorescent DNA-binding dyes acridine orange and ethidium bromide. We investigated mechanism underlying the apoptotic activity of APS8. Traetment of NSCLC with APS8 up regulates pro- apoptotic proteins from Bcl-2 family while anti-apoptotic proteins are down-regulated. APS8 markedly increased the expression levels of death receptors. Our results imply that both intrinsic and extrinsic pathway of apoptosis are activated by APS8. Apoptosis of cancer cells induced with nAChR antagonist APS8 may be a new and promising method in lung cancer treatment. Šifra B.03 Referat na mednarodni znanstveni konferenci Objavljeno v MAC' 11 Singapore; 2011; Str. 66; Avtorji / Authors: Zovko Ana, Filipič Metka, Kološa Katja, Lah Turnšek Tamara, Turk Tom Tipologija 1.12 Objavljeni povzetek znanstvenega prispevka na konferenci 5. COBISS ID 1510779 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Protitumorska učinkovitost sintetičnega alkilpiridinijevega polimera 8 na tumorski vsadek humanega pljučnega adenokarcinoma A549 ANG Antitumour effectiveness of synthetic alkylpyridinium polymer 8 on human lung adenocarcinoma A549 tumour xenograft Opis SLO Presadke humanega adenokarcinoma celične linije A549 smo vsadili z subkutanim injiciranjem celične suspenzije (107 celic/100 pl) v levi bok SCID miši. Ko so tumorji dosegli velikost 40 mm3, smo miškam vbrizgali 2 oz. 4 mg/kg APS8. Protitumorsko učinkovitost smo ocenili z obsegom zapoznele tumorske rasti. Vbrizganje APS8 v koncentraciji 4mg/kg z direktno intratumorsko aplikacijo se je odrazilo v 26 dnevni zakasnitvi tumorske rasti v primerjavi s kontrolno skupino. Manjši, sistemsko vnešeni odmerki niso bili učinkoviti pri preprečevanju tumorske rasti. V uporabljenih odmerkih APS8 ni povzročil toksičnih oz. stranskih učinkov na poskusnih živalih. rezultati preliminarne raziskave kažejo, da deluje lokalno vbrizganje APS8 antitumorsko na humane presadke pljučnega adenokarcinoma A549 linije. ANG Human lung A549 xenograft tumors were induced by subcutaneously injection of cell suspension (107 cells/100 pl) in the right flank of SCID mice. When tumors were grown up to 40 mm3, mice were treated with intratumoral or intravenous injection of APS8 (2 mg/kg and 4mg/kg). Anti tumor effectiveness was assessed by tumor growth delay assay. Treatment of mice bearing A549 tumors with intratumoral administration of APS8 at the dose of 4 mg/kg showed good anti tumor effect resulting in tumor growth delay of 26 days compared to the control group. Systemic treatments and intratumoral treatment with lower dose of APS8 did not result in significant tumor growth delay. Treatment with polyAPS8 at the selected doses did not result in any systemic or local side effects. The results of our preliminary study demonstrate that local administration of APS8 has good anti tumor effect on human lung xenograft A549 tumors. Šifra B.03 Referat na mednarodni znanstveni konferenci Objavljeno v Association of Radiology and Oncology; Book of abstracts; 2013; Str. 129; Avtorji / Authors: Kranjc Simona, Serša Gregor, Berne Sabina, Turk Tom, Čemažar Maja Tipologija 1.12 Objavljeni povzetek znanstvenega prispevka na konferenci 8.Drugi pomembni rezultati projetne skupine7 ZOVKO, Ana. Biološke aktivnosti sintetičnih alkilpiridinijevih polimerov : doktorska disertacija = Biological activities of synthetic alkylpyridinium polymers : doctoral dissertation. Ljubljana: [A. Zovko], 2012. XIX, 124 f., [18] f. pril., ilustr. [COBISS.SI-ID 2536015] Mentor Tom Turk. Doktorska disertacija Ane Zovko pokriva del raziskav omenjenih v projektu. Na osnovi svojega dela je dr. Zovko dobila podoktorsko štipendijo na Inštitutu Karolinska v Stockholmu. S tamkajšnji raziskovalci smo že navezali stike in začeli dokaj uspešno sodelovanje, ki ga bomo v bodočnosti nadgradili s prijavo evropskega projekta. 9.Pomen raziskovalnih rezultatov projektne skupine8 9.1.Pomen za razvoj znanosti9 SLO_ Pljučni rak je nasplošno še vedno ena od najhujših oblik raka, katerega smrtnost je zelo velika. Večina oblik pljučnega raka je tesno povezana s kajenjem. Poznavanje različnih tipov celic pljučnega raka, njihovih receptorjev in signalnih poti v teh celicah, ki preprečujejo apoptozo in pospešujejo proliferacijo in angiogenezo je ključnega pomena za razvoj novih zdravil, ki bi bila tudi ustrezno selektivna za posamezne podtipe pljučnega raka. Z rezultati in objavami našega projekta smo prispevali k poznavanju mehanizmov, ki rakaste celice obvarujejo pred programirano celično smrtjo. Pokazali smo na vlogo nAChR in nikotina in hkrati odkrili način kako z naravnimi in sintetičnimi antagonisti nAChR, predvsem alfa 7 podtipa preusmeriti rakave celice v apoptozo, pri tem pa čim manj škoditi zdravim celicam. S poskusi in vivo na imunonekompetentnih miškah pa smo pokazali, da se z direktnim vnosom enega od uporabljenih alkilpiridinijevih analogov v tumorsko tkivo, da učinkovito zavreti ali celo popolnoma eliminirati tumorske vsadke humanega pljučnega adenokarcinoma. ANG_ Lung cancer remains one of the most invasive cancers and cause high percent of death among patients with cancer. most of the lung cancer forms are tightly linked to smoking. Knowledge about different cancer cells, their receptors and signaling pathways, which prevent apoptosis, enhance proliferation and angiogenesis is basic key leading to the development of suitable compounds, which would be effective for certain lung cancer types. Results and publication raised from our project work we contributed to the knowledge of mechanisms, which prevent cancer cells to become apoptotic. We revealed the role of nicotine and nAChR and also showed how natural or synthetic nAChR antagonists, above all those which are specific for alpha 7 subtype, trigger signaling pathways which cause programmed cell death in cancer cells, while normal cells remain largely unaffected. Experiments in vivo using imunononcompetent mice showed that direct intra tumor injection of one of the alkylpyridinium analogues strongly decrease or even completely stop or eliminate human adenocarcinoma tumors in experimental animals. 9.2. Pomen za razvoj Slovenije10 SLO_ Seveda je težko opredeliti kaj naše raziskave pomenijo za razvoj Slovenije. Pomenijo ravno toliko kot pomenijo za razvoj znanosti. Nedvomno je problematika pljučnega raka, zdravljenja le-tega in nenazadnje razvoj tovrstnih rakastih obolenj v tesni povezavi s kajenjem, pereče tako v Sloveniji kakor drugod po svetu. Domače znanje o mehanizmih, ki so vpleteni v programirano celično smrt, proliferacijo rakastih celic in angiogenezo, je nedvomno pomembno tudi v širšem prostoru. če kot slovenski znanstveniki lahko prispevamo k razjasnitvi teh mehanizmov, to nedvomno prispeva tudi k ugledu Slovenije v svetu. ANG It is hard to define how our research contributes to the development of Slovenia. Our answer is no more or no less than it contributes to the science in general. We can only say that many different aspects of of lung cancer, its treatment and a fact that different lung cancer subtypes are tightly linked to smoking is not only a Slovenian but a worldwide problem. Domestic knowledge about this phenomena, mechanisms involved in programmed cell death, proliferation of cancer cells and angiogenesis is with no doubt important not only for Slovenia but in much broader context. In this regard our research of lung cancer also contributes to the recognition of Slovenia and its science. 10.Samo za aplikativne projekte in podoktorske projekte iz gospodarstva! Označite, katerega od navedenih ciljev ste si zastavili pri projektu, katere konkretne rezultate ste dosegli in v kakšni meri so doseženi rezultati uporabljeni Cilj F.01 Pridobitev novih praktičnih znanj, informacij in veščin Zastavljen cilj DA NE Rezultat 1 - Uporaba rezultatov 1 - F.02 Pridobitev novih znanstvenih spoznanj Zastavljen cilj DA NE Rezultat 1 v Uporaba rezultatov 1 - F.03 Večja usposobljenost raziskovalno-razvojnega osebja Zastavljen cilj DA NE Rezultat 1 v Uporaba rezultatov 1 - F.04 Dvig tehnološke ravni Zastavljen cilj DA NE Rezultat 1 - Uporaba rezultatov 1 - F.05 Sposobnost za začetek novega tehnološkega razvoja Zastavljen cilj DA NE Rezultat 1 - Uporaba rezultatov 1 - F.06 Razvoj novega izdelka Zastavljen cilj DA NE Rezultat 1 - Uporaba rezultatov 1 - F.07 Izboljšanje obstoječega izdelka Zastavljen cilj DA NE Rezultat 1 v Uporaba rezultatov 1 - F.08 Razvoj in izdelava prototipa Zastavljen cilj DA NE Rezultat 1 - Uporaba rezultatov 1 v F.09 Razvoj novega tehnološkega procesa oz. tehnologije Zastavljen cilj DA NE Rezultat 1 v Uporaba rezultatov 1 v F.10 Izboljšanje obstoječega tehnološkega procesa oz. tehnologije Zastavljen cilj DA NE Rezultat 1 v Uporaba rezultatov 1 v F.11 Razvoj nove storitve Zastavljen cilj DA NE Rezultat 1 - Uporaba rezultatov 1 v F.12 Izboljšanje obstoječe storitve Zastavljen cilj DA NE Rezultat 1 v Uporaba rezultatov 1 v F.13 Razvoj novih proizvodnih metod in instrumentov oz. proizvodnih procesov Zastavljen cilj DA NE Rezultat 1 v Uporaba rezultatov 1 v F 14 Izboljšanje obstoječih proizvodnih metod in instrumentov oz. proizvodnih procesov Zastavljen cilj DA NE Rezultat 1 v Uporaba rezultatov 1 v F.15 Razvoj novega informacijskega sistema/podatkovnih baz Zastavljen cilj DA NE Rezultat 1 v Uporaba rezultatov 1 v F.16 Izboljšanje obstoječega informacijskega sistema/podatkovnih baz Zastavljen cilj DA NE Rezultat 1 v Uporaba rezultatov 1 v F.17 Prenos obstoječih tehnologij, znanj, metod in postopkov v prakso Zastavljen cilj DA NE Rezultat 1 - Uporaba rezultatov 1 v F is Posredovanje novih znanj neposrednim uporabnikom (seminarji, forumi, konference) Zastavljen cilj DA NE Rezultat I - Uporaba rezultatov I - F.19 Znanje, ki vodi k ustanovitvi novega podjetja ("spin off") Zastavljen cilj DA NE Rezultat I v Uporaba rezultatov I - F.20 Ustanovitev novega podjetja ("spin off") Zastavljen cilj DA NE Rezultat I - Uporaba rezultatov I - F.21 Razvoj novih zdravstvenih/diagnostičnih metod/postopkov Zastavljen cilj DA NE Rezultat I v Uporaba rezultatov I - F.22 Izboljšanje obstoječih zdravstvenih/diagnostičnih metod/postopkov Zastavljen cilj DA NE Rezultat I - Uporaba rezultatov I - F.23 Razvoj novih sistemskih, normativnih, programskih in metodoloških rešitev Zastavljen cilj DA NE Rezultat I v Uporaba rezultatov I - F 24 Izboljšanje obstoječih sistemskih, normativnih, programskih in metodoloških rešitev Zastavljen cilj DA NE Rezultat I - Uporaba rezultatov I - F.25 Razvoj novih organizacijskih in upravljavskih rešitev Zastavljen cilj DA NE Rezultat I v Uporaba rezultatov I - F.26 Izboljšanje obstoječih organizacijskih in upravljavskih rešitev Zastavljen cilj DA NE Rezultat I v Uporaba rezultatov I - F.27 Prispevek k ohranjanju/varovanje naravne in kulturne dediščine I Zastavljen cilj DA NE Rezultat 1 v Uporaba rezultatov 1 - F.28 Priprava/organizacija razstave Zastavljen cilj DA NE Rezultat 1 - Uporaba rezultatov 1 - F.29 Prispevek k razvoju nacionalne kulturne identitete Zastavljen cilj DA NE Rezultat 1 - Uporaba rezultatov 1 - F.30 Strokovna ocena stanja Zastavljen cilj DA NE Rezultat 1 v Uporaba rezultatov 1 - F.31 Razvoj standardov Zastavljen cilj DA NE Rezultat 1 - Uporaba rezultatov 1 - F.32 Mednarodni patent Zastavljen cilj DA NE Rezultat 1 - Uporaba rezultatov 1 - F.33 Patent v Sloveniji Zastavljen cilj DA NE Rezultat 1 - Uporaba rezultatov 1 - F.34 Svetovalna dejavnost Zastavljen cilj DA NE Rezultat 1 v Uporaba rezultatov 1 - F.35 Drugo Zastavljen cilj DA NE Rezultat 1 v Uporaba rezultatov 1 - Komentar ll.Samo za aplikativne projekte in podoktorske projekte iz gospodarstva! Označite potencialne vplive oziroma učinke vaših rezultatov na navedena področja Vpliv Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.01 Razvoj visokošolskega izobraževanja G.01.01. Razvoj dodiplomskega izobraževanja O o o o G.01.02. Razvoj podiplomskega izobraževanja o o o o G.01.03. Drugo: o o o o G.02 Gospodarski razvoj G.02.01 Razširitev ponudbe novih izdelkov/storitev na trgu O O O O G.02.02. Širitev obstoječih trgov o o o o G.02.03. Znižanje stroškov proizvodnje o o o o G.02.04. Zmanjšanje porabe materialov in energije O O O O G.02.05. Razširitev področja dejavnosti o o o o G.02.06. Večja konkurenčna sposobnost o o o o G.02.07. Večji delež izvoza o o o o G.02.08. Povečanje dobička o o o o G.02.09. Nova delovna mesta o o o o G.02.10. Dvig izobrazbene strukture zaposlenih O O O O G.02.11. Nov investicijski zagon o o o o G.02.12. Drugo: o o o o G.03 Tehnološki razvoj G.03.01. Tehnološka razširitev/posodobitev dejavnosti O O O O G.03.02. Tehnološko prestrukturiranje dejavnosti O O O O G.03.03. Uvajanje novih tehnologij o o o o G.03.04. Drugo: o o o o G.04 Družbeni razvoj G.04.01 Dvig kvalitete življenja o o o o G.04.02. Izboljšanje vodenja in upravljanja o o o o G.04.03. Izboljšanje delovanja administracije in javne uprave O O O O G.04.04. Razvoj socialnih dejavnosti o o o o G.04.05. Razvoj civilne družbe o o o o G.04.06. Drugo: o o o o G.05. Ohranjanje in razvoj nacionalne naravne in kulturne dediščine in identitete O O O O G.06. Varovanje okolja in trajnostni razvoj O O O O G.07 Razvoj družbene infrastrukture Informacijsko-komunikacijska G.07.01. infrastruktura O o o o G.07.02. Prometna infrastruktura o o o o G.07.03. Energetska infrastruktura o o o o G.07.04. Drugo: o o o o G.08. Varovanje zdravja in razvoj zdravstvenega varstva O O O O G.09. Drugo: o o o o Komentar 12.Pomen raziskovanja za sofinancerje11 Sofinancer 1. Naziv Naslov Vrednost sofinanciranja za celotno obdobje trajanja projekta je znašala: EUR Odstotek od utemeljenih stroškov projekta: % Najpomembnejši rezultati raziskovanja za sofinancerja Šifra 1. 2. 3. 4. 5. Komentar Ocena 13.Izjemni dosežek v letu 201412 13.1. Izjemni znanstveni dosežek 13.2. Izjemni družbeno-ekonomski dosežek C. IZJAVE Podpisani izjavljam/o, da: • so vsi podatki, ki jih navajamo v poročilu, resnični in točni • se strinjamo z obdelavo podatkov v skladu z zakonodajo o varstvu osebnih podatkov za potrebe ocenjevanja ter obdelavo teh podatkov za evidence ARRS • so vsi podatki v obrazcu v elektronski obliki identični podatkom v obrazcu v pisni obliki • so z vsebino zaključnega poročila seznanjeni in se strinjajo vsi soizvajalci projekta Podpisi: zastopnik oz. pooblaščena oseba raziskovalne organizacije: in Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta Tom Turk ŽIG Kraj in datum: Ljubljana liQ.3.2015 Oznaka poročila: ARRS-RPROJ-ZP-2015/134 1 Napišite povzetek raziskovalnega projekta (največ 3.000 znakov v slovenskem in angleškem jeziku) Nazaj 2 Napišite kratko vsebinsko poročilo, kjer boste predstavili raziskovalno hipotezo in opis raziskovanja. Navedite ključne ugotovitve, znanstvena spoznanja, rezultate in učinke raziskovalnega projekta in njihovo uporabo ter sodelovanje s tujimi partnerji. Največ 12.000 znakov vključno s presledki (približno dve strani, velikost pisave 11). Nazaj 3 Realizacija raziskovalne hipoteze. Največ 3.000 znakov vključno s presledki (približno pol strani, velikost pisave 11) Nazaj 4 V primeru bistvenih odstopanj in sprememb od predvidenega programa raziskovalnega projekta, kot je bil zapisan v predlogu raziskovalnega projekta oziroma v primeru sprememb, povečanja ali zmanjšanja sestave projektne skupine v zadnjem letu izvajanja projekta, napišite obrazložitev. V primeru, da sprememb ni bilo, to navedite. Največ 6.000 znakov vključno s presledki (približno ena stran, velikost pisave 11). Nazaj 5 Navedite znanstvene dosežke, ki so nastali v okviru tega projekta. Raziskovalni dosežek iz obdobja izvajanja projekta (do oddaje zaključnega poročila) vpišete tako, da izpolnite COBISS kodo dosežka - sistem nato sam izpolni naslov objave, naziv, IF in srednjo vrednost revije, naziv FOS področja ter podatek, ali je dosežek uvrščen v A'' ali A'. Nazaj 6 Navedite družbeno-ekonomske dosežke, ki so nastali v okviru tega projekta. Družbeno-ekonomski rezultat iz obdobja izvajanja projekta (do oddaje zaključnega poročila) vpišete tako, da izpolnite COBISS kodo dosežka - sistem nato sam izpolni naslov objave, naziv, IF in srednjo vrednost revije, naziv FOS področja ter podatek, ali je dosežek uvrščen v A'' ali A'. Družbeno-ekonomski dosežek je po svoji strukturi drugačen kot znanstveni dosežek. Povzetek znanstvenega dosežka je praviloma povzetek bibliografske enote (članka, knjige), v kateri je dosežek objavljen. Povzetek družbeno-ekonomskega dosežka praviloma ni povzetek bibliografske enote, ki ta dosežek dokumentira, ker je dosežek sklop več rezultatov raziskovanja, ki je lahko dokumentiran v različnih bibliografskih enotah. COBISS ID zato ni enoznačen, izjemoma pa ga lahko tudi ni (npr. prehod mlajših sodelavcev v gospodarstvo na pomembnih raziskovalnih nalogah, ali ustanovitev podjetja kot rezultat projekta ... - v obeh primerih ni COBISS ID). Nazaj 7 Navedite rezultate raziskovalnega projekta iz obdobja izvajanja projekta (do oddaje zaključnega poročila) v primeru, da katerega od rezultatov ni mogoče navesti v točkah 6 in 7 (npr. ni voden v sistemu COBISS). Največ 2.000 znakov, vključno s presledki. Nazaj 8 Pomen raziskovalnih rezultatov za razvoj znanosti in za razvoj Slovenije bo objavljen na spletni strani: http://sicris.izum.si/ za posamezen projekt, ki je predmet poročanja Nazaj 9 Največ 4.000 znakov, vključno s presledki Nazaj 10 Največ 4.000 znakov, vključno s presledki Nazaj 11 Rubrike izpolnite / prepišite skladno z obrazcem "izjava sofinancerja" http://www.arrs.gov.si/sl/progproj/rproj/gradivo/, ki ga mora izpolniti sofinancer. Podpisan obrazec "Izjava sofinancerja" pridobi in hrani nosilna raziskovalna organizacija -izvajalka projekta. Nazaj 12 Navedite en izjemni znanstveni dosežek in/ali en izjemni družbeno-ekonomski dosežek raziskovalnega projekta v letu 2014 (največ 1000 znakov, vključno s presledki). Za dosežek pripravite diapozitiv, ki vsebuje sliko ali drugo slikovno gradivo v zvezi z izjemnim dosežkom (velikost pisave najmanj 16, približno pol strani) in opis izjemnega dosežka (velikost pisave 12, približno pol strani). Diapozitiv/-a priložite kot priponko/-i k temu poročilu. Vzorec diapozitiva je objavljen na spletni strani ARRS http://www.arrs.gov.si/sl/gradivo/, predstavitve dosežkov za pretekla leta pa so objavljena na spletni strani http://www.arrs.gov.si/sl/analize/dosez/. Nazaj Obrazec: ARRS-RPROJ-ZP/2015 v1.00a 2D-4E-B2-9A-FD-20-08-22-B1-4D-98-1A-7E-2B-BD-1E-6A-6D-49-F1