MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Matej Skočaj Molekularna biologija (gradivo za vaje) za študente Univerze v Ljubljani, Biotehniške fakultete, Oddelka za biologijo, Univerzitetni študijski program 1. stopnje Mikrobiologija Vodja vaj: dr. Matej Skočaj (matej.skocaj@bf.uni-lj.si) MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Avtor: Matej Skočaj Recenzent: Uroš Petrovič Založnik: Oddelek za biologijo, Biotehniške fakultete, Univerze v Ljubljani Kraj izida: Ljubljana Leto izida: 2019 Navedba izdaje: Elektronska izdaja ISBN: 978-961-6822-55-8 (pdf) Kataložni zapis o publikaciji (CIP) pripravili v Narodni in univerzitetni knjižnici v Ljubljani COBISS.SI-ID=298579456 ISBN 978-961-6822-55-8 (pdf) 1 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. VARNOST IN RED V LABORATORIJU – PRAVILA ► V laboratorij vstopamo v haljah, ki so namenjene samo delu v laboratoriju. Vsa ostala oblačila shranimo v laboratoriju. Nošenje kratkih hlač/ kril in odprte obutve ni dovoljeno. Torbe, nahrbtnike in oblačila ne polagamo na površino delovnih pultov. Na pultu imamo lahko samo gradivo za vaje, pisalo, vžigalnik in flomaster. ►V laboratoriju je strogo prepovedano vnašanje in uživanje hrane in pijač. Prav tako ni dovoljeno nanašanje dekorativne/ negovalne kozmetike in kajenje. Ob delu se z rokami ne dotikamo obraza. ► Pri večini vaj je obvezna uporaba zaščitnih rokavic. Z zamazanimi rokavicami se ne dotikamo čistih površin. Po končanem delu si skrbno umijemo ali razkužimo roke. ► Pri delu z organizmi upoštevamo načela aseptičnega dela, z njimi delamo previdno, ob plamenu plinskega gorilnika ali v laminariju. Pipetiranje z usti je strogo prepovedano. Organizmov ne smemo odnašati z vaj. Kontaminiran material (material, ki je bil v stiku z živimi organizmi) odlagamo v odlagalnike ali na označeno mesto (in ga pozneje avtoklaviramo). ►Pri delu z gorilnikom pazimo, da nam plamen ne ožge kože, las ali halje. Dolge lase spnemo. Pozorni smo tudi pri uporabi etanola za obžiganje. Po končanem delu se prepričamo, da so gorilniki ugasnjeni. ►Pri delu z organizmi pazimo, da jih ne razširjamo po mizi, po tleh in po obleki (npr. razlite mikrobne kulture). Z rokami se jih ne dotikamo. Če pride kužnina v stik s kožo ali delovno površino, površino razkužimo in obvestimo asistentko. Kontaminirano delovno površino pokrijemo s papirnato brisačo in jo prelijemo z razkužilom (največkrat uporabimo 70% etanol). Razkužilo pustimo delovati najmanj 20 minut, nato ga pobrišemo in brisačke odložimo na označeno mesto za avtoklaviranje. Kontaminirano mesto na telesu ali obleki razkužimo in nato speremo z vodo. ► Vse encime in tudi nekatere reagente za molekularno biologijo (začetni oligonukleotidi, pufri...) imamo med uporabo vedno na ledu, takoj ko jih ne potrebujemo več, jih shranimo v zamrzovalnik oziroma hladilnik. Pred uporabo jih vedno premešamo z vibracijskim mešalom in na kratko centrifugiramo. ►Za delo z nevarnimi snovmi, kot so kisline, baze in organska topila, uporabljamo digestorij. Vse nevarne odpadke odložimo v označene posode. Gele, obarvane z etidijevim bromidom, odložimo v označen odlagalnik (ne v navadne smeti). 2 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. ►Vse aparature uporabljamo po navodilih asistenta. Samovoljna uporaba aparatur ni dovoljena. ► Pri delu pazimo, da čimbolj zmanjšamo nastajanje aerosolov. Pravilno uporabljamo pipete, nikoli jih ne obračamo tako, da je nastavek s tekočino višje kot bat, prav tako na pult ne odlagamo pipet z nataknjenimi nastavki. Pred in po opravljenem delu pospravimo za seboj in razkužimo delovne površine. ►Vse vzorce moramo označiti tako, da jih lahko nedvoumno identificiramo. Na gojiščih kultur organizmov morajo biti navedeni ime organizma, oznaka skupine, datum in pogoji gojenja. Na vzorcih DNA, proteinov in podobnega mora biti oznaka vsebine, oznaka skupine in datum. ►Študent/-ka se mora seznaniti z mestom in uporabo varnostne opreme (aseptično milo, dezinfekcijsko sredstvo, gasilni aparat...). Obiskovalcem je vstop v laboratorij prepovedan. ►Na vsakih vajah bosta določena dežurna študenta, ki bosta pomagala pri izvedbi vaje. Poskrbela bosta, da bo ves kontaminiran material predan v avtoklaviranje ter vsi vzorci označeni, vsa nacepljena gojišča dana v inkubacijo in vsi vzorci primerno shranjeni (npr. zamrznjeni). Prav tako bosta nadzirala pospravljanje vajalnice in razkuževanje delovnih pultov po končani vaji ter preverila, če so vsi gorilniki zaprti. ► Mobilni telefoni morajo biti na vajah izklopljeni in pospravljeni v torbe (ne v žepe)! ►Študent/-ka mora izkazati poznavanje vaj za nazaj (teorija in praksa) in biti seznanjen/-a z naslednjo vajo. Sprotno preverjanje znanja bo na začetku vsake vaje. Obisk vseh vaj je obvezen. ►Neupoštevanje pravil in navodil asistenta vodi k takojšnji izključitvi z vaj. Seznanjen/-a sem in razumem zgoraj navedena pravila. Ravnal/-a se bom po njih. Ime in priimek (tiskane črke): Podpis: 3 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. 4 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. KAZALO LABORATORIJSKIH VAJ 1. Izolacija plazmida pET21c(+) + OlyA iz seva DH5α bakterije Escherichia coli ............ 6 2. Izolacija kromosomske DNA iz seva BL21 (DE3) bakterije Escherichia coli .............. 11 3. Elektroforeza plazmidne in kromosomske DNA v agaroznem gelu ............................. 17 4. Priprava para začetnih oligonukleotidov za preverjanje prisotnosti zaporedja za T7 RNA polimerazo na izolirani kromosomski DNA iz seva BL21 (DE3) bakterije Escherichia coli in verižna reakcija s polimerazo ............................................................... 21 5. Priprava para začetnih oligonukleotidov za pomnoževanje zaporedja, ki kodira za fluorescenčni protein OlyA-mCherry in verižna reakcija s polimerazo ........................... 27 6. Rezanje (i) pomnoženega zaporedja, ki kodira za fluorescenčni protein OlyA- mCherry in (ii) izoliranega plazmida pET21c(+) + OlyA .................................................. 33 7. Ligacija odprtega plazmidnega vektorja pET21c(+) in rezanega fragmenta OlyA- mCherry .................................................................................................................................. 39 8. Priprava in transformacija kompetentnih celic BL21 (DE3) bakterije Escherichia coli z ligacijsko mešanico pET21c(+) + OlyA-mCherry ............................................................ 43 9. Izolacija rekombinantnega proteina OlyA-mCherry-His6............................................. 47 10. Elektroforezno ločevanje proteinov (NaDS-PAGE) ..................................................... 52 11. Priprava suspenzije in ugotavljanje števila bakteriofagov M13.................................. 55 Priloge: .................................................................................................................................... 63 Literatura: .............................................................................................................................. 69 5 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. 1. VAJA Izolacija plazmida pET21c(+) + OlyA iz seva DH5α bakterije Escherichia coli Teorija: Izolacija plazmidne DNA z detergentom cetiltrimetilamonijev bromid (CTAB) je časovno dokaj kratka metoda, a je v dobljeni raztopini DNA prisotnih še nekaj nečistoč. Kvaliteta pridobljene DNA je še vedno dovolj ustrezna za nadaljnjo uporabo v večini metod molekularne biologije. Celice s pomočjo detergenta Triton in lizocima naluknjamo, tako da se plazmidna DNA (ne pa tudi kromosomska) iz celic sprosti. Glavna stopnja čiščenja je obarjanje plazmidne DNA z detergentom CTAB. Pri tem postopku večina nečistoč ostane v supernatantu. Nato iz vzorca odstranimo CTAB s pomočjo obarjanja DNA v prisotnosti etanola in soli ter spiranjem DNA z 80% etanolom (1). Plazmidni vektor pET21c(+) je velik 5541 bp in je izpeljanka plazmidnega vektorja pBR322 ter se v celicah nahaja v približno 40 kopijah. Selekcijo celic, ki so plazmid sprejele, omogoča gen, ki posreduje odpornost proti antibiotiku ampicilinu. pET21c(+) je ekspresijski vektor, kar pomeni, da v njega lahko vključimo izbrano in pomnoženo nukleotidno zaporedje, ki ga želimo izraziti (7. vaja). Izražanje rekombinantnega proteina omogočata promotorsko in terminatorsko zaporedje T7. Rekombinatni protein se izrazi kot protein z C-terminalnim repkom, ki je sestavljen iz šestih histidinov (histidinski repek ali repek His6) in ki v nadaljevanju omogoča izolacijo rekombinantnih proteinov z nikelj-afinitetno kromatografijo (9. vaja). Rekombinantni proteini, ki imajo v svoji strukturi repek His6 imajo namreč visoko afiniteto do niklja, ki je vezan na agarozni nosilec. Na ta način se znebimo vseh proteinov, ki jih ne potrebujemo in izoliramo čiste rekombinantne proteine (2). Bakterijski sev: DH5α + pET21c(+) + OlyA6 Genotip:xF– end A1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG purB20 φ80d lacZΔM15 Δ( lacZYA-argF) U169, hsdR17( r – + K mK ), λ– A B Slika 1: Strukturni formuli detergentov cetiltrimetilamonijev bromid (A) in Triton-X-100 (3,4). 6 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Postopek: 1. Dan: 1. S cepilno zanko prenesite bakterijsko kulturo iz trajnika (-80 °C) na trdno gojišče LBAp. 2. Dan: 1. S cepilno zanko prenesite 1 bakterijsko kolonijo v 50 ml gojišča LBAp. Inkubirajte preko noči pri 37 °C v rotacijskem stresalniku pri 180 obratov/min. 3. Dan: Pričetek vaje 1. Odpipetirajte 1,5 ml bakterijske kulture v 1,5 ml mikrocentrifugirko in centrifugirajte 1 min pri maksimalnem številu obratov. 2. Odlijte supernatant in ga naknadno popolnoma odstranite z avtomatsko pipeto. 3. Usedlino bakterij resuspendirajte v 200 µl pufra STET, dodajte lizocim (50 mg/ml), tako, da bo njegova končna koncentracija 1 mg/ml in nato dobro premešajte na vibracijskem mešalu. Inkubirajte 5 min pri sobni temperaturi. 4. Suspenzijo v nadaljevanju inkubirajte 45 s v vreli vodi in vzorce nato ohladite na ledu. 5. Centrifugirajte 10 min pri maksimalnem številu obratov in odstranite usedlino s sterilnim zobotrebcem. 6. Dodajte 8 µl 5% detergenta CTAB in premešajte. 7. Centrifugirajte 5 min pri maksimalnem številu obratov. 8. S pipeto previdno odstranite supernatant. Usedlino resuspendirajte v 300 µl 1,2 M NaCl in dobro premešajte na vibracijskem mešalu. 9. Plazmidno DNA oborite na tak način, da suspenziji dodate 750 µl 96% etanola (sobna T). Premešajte tako, da mikrocentrifugirko nekajkrat obrnete in inkubirajte še dodatnih 10 min na ledu. 10. Centrifugirajte 15 min pri maksimalnem številu obratov in 4 °C. 11. S pipeto previdno odstranite supernatant in pri tem pazite, da ne odstranite tudi oborjene plazmidne DNA, ki je običajno prilepljena na steno, na dnu mikrocentrifugirke. 7 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. 12. Oborino plazmidne DNA dvakrat sperite in sicer tako, da previdno dodate 1 ml 80% etanola, ki ga nato s pipeto previdno odstranite. Ko drugič odstranite 80% etanol, centrifugirajte 5 s in nato popolnoma odstranite preostali etanol, ki je s stene spolzel na dno mikrocentrifugirke. Če se po dodajanju 80% etanola oborina DNA odlepi od dna mikrocentrifugirke, centrifugirajte dodatni 2 min pred odstranjevanjem etanola. 13. Posušite oborino plazmidne DNA pri 37 °C v topli sobi. 14. Z metodo viseče kaplje resuspendirajte plazmidno DNA v 50 µl pufra TE z dodano RNAzo A (30 µg/ml). 15. Spektrofotometrično določite koncentracijo plazmidne DNA in sicer tako, da v 1 ml sterilne vode odpipetirate 1 µl vzorca plazmidne DNA. 16. Vzorce plazmidne označite in plazmidno DNA shranite v zmrzovalniku pri -20 °C. Vzorce DNA in proteinov, ki jih bomo na vajah iz Molekularne biologije pridobili bomo vedno označili na sledeči način: datum, vsebina, skupina, pult in inicialke posameznika. Gojišča, raztopine in pufri: 1. Gojišče LB: 25 g gojišča Luria-Bertani (Difco) v 1000 ml vode 2. Antibiotiki: Ap – ampicilin (100 mg/ml) v gojišču 100 µg/ml 3. Pufer STET: 8% saharoza (w/v), 0,1% Triton-X-100, 50 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH = 8 4. Raztopina lizocima: 50 mg/ml v pufru TE 5. 5% raztopina detergenta CTAB (w/v) 6. 1,2 M raztopina NaCl 7. 80% in 96% raztopina etanola 8. Sterilna voda 9. Pufer TE: 1 mM Tris-HCl, 0,5 M EDTA, pH =8 10. RNAza A (1 mg/ml) Material: 1,5 ml mikrocentrifugirke, namizna centrifuga, pipete in pipetni nastavki, vibracijsko mešalo, ledena kopel, sterilni zobotrebci, rokavice, plovci, stojala, odlagalniki, kuhalnik, lonec, mešalo, pincete, čaša z alkoholom, parafilm, kvarčne kivete (UV) 8 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Vprašanja: 1. Zakaj bakterijsko kulturo vedno pripravimo iz ene same bakterijske kolonije? 2. Zakaj moramo pri postopku izolacije plazmidne DNA paziti na čas inkubacije vzorcev z lizocimom? 3. Kako spektrofotometrično zaznamo proteinske nečistoče? 4. Zakaj nas moti prisotnost proteinov v vzorcu DNA? 9 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. 5. Zakaj je potrebno odstraniti molekule RNA iz vzorcev DNA? 6. S pomočjo spleta ugotovite, kaj pomenijo posamezne oznake v genotipu seva DH5α. 10 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. 2. VAJA Izolacija kromosomske DNA iz seva BL21 (DE3) bakterije Escherichia coli Teorija: Velikost bakterijske kromosomske DNA je med posameznimi vrstami zelo različna. Najmanjši do sedaj opisan bakterijski genom, ki je bil izoliran iz obligatne znotrajcelične bakterije Carsonella ruddii, je velik 180 kbp, medtem ko je velikost največjega bakterijskega genoma 13 Mbp in pripada bakteriji Sorangium cellulosum, ki jo prištevamo med miksobakterije. Velikost kromosomalne DNA E. coli je približno 4,6 Mbp (5). Kromosomsko DNA iz bakterijskih celic sprostimo tako, da popolnoma razgradimo celično steno in membrano. Pri tem je potrebno med postopkom izolacije ves čas paziti, da na molekule kromosomske DNA deluje čim manj strižnih sil, kar v praksi pomeni, da vzorcev ne bomo mešali z uporabo vibracijskega mešala. Zunajcelični matriks, ki obdaja bakterije, bomo sprali s pufrom TSE, z encimom lizocimom pa bomo razgradili celično steno. V naslednji fazi bomo s pufrom GES povzročili popolno lizo celic, hkrati pa bomo oborili tudi proteine, ki jo bomo na koncu odstranili s fenolno ekstrakcijo (6). Izolirano kromosomsko DNA bomo uporabili na 4. vaji, kjer bomo z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) in parom specifičnih začetnih oligonukleotidov preverjali uspešnost izolirane kromosomske DNA s pomnoževanjem zaporedja, ki ima zapis za T7 RNA polimerazo. Bakterijski sev: BL21 (DE3) Genotip: B F– ompT gal dcm lon hsdS – – B( rB mB ) λ(DE3 [ lacI lacUV5- T7p07 ind1 sam7 nin5]) [ malB+]K-12(λS) A B LIZ OCIM RAZRAHLJA VDOR STRUKTUR VODE PLAZEMSKA O CELIČNE MEMBRANA STENE CELIČNA STENA LIZA CELICE VDOR VODE VDOR VODE Slika 2: (A) Mehanizem reakcije, ki jo katalizira lizocim; NAG, N-acetil glukozomain; NAM; N- acetilmuraminska kislina (7) in (B) posledična liza bakterijske celice, povzeto po (8). 11 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Postopek: 1. Dan: 1. S cepilno zanko prenesite 1 bakterijsko kolonijo seva BL21 (DE3) v 10 ml gojišča LB. Inkubirajte preko noči pri 37 °C v rotacijskem stresalniku pri 180 obratih/min. 2. Dan: 1. Precepite 500 µl kulture v 50 ml svežega in na 37 °C ogretega gojišča. Bakterijsko kulturo inkubirajte 2,5 – 3 h pri 37 °C v rotacijskem stresalniku pri 180 obratih/min, dokler bakterije ne dosežejo zgodnje eksponentne faze rasti (OD600 = 0,4 – 0,6). Pričetek vaje 2. Odpipetirajte 1,5 ml bakterijske kulture v 2 ml mikrocentrifugirko in centrifugirajte 1 min pri maksimalnem številu obratov. 3. Odlijte supernatant in ga naknadno popolnoma odstranite z avtomatsko pipeto. 4. Usedlino bakterij resuspendirajte v 1,5 ml pufra TSE in dobro premešajte na vibracijskem mešalu. 5. Centrifugirajte 1 min pri maksimalnem številu obratov, odlijte supernatant in ga naknadno popolnoma odstranite z avtomatsko pipeto. 6. Usedlino bakterij resuspendirajte v 35 µl lizocima (50 mg/ml), ki je pripravljen v pufru TE. Dobro premešajte na vibracijskem mešalu in inkubirajte 30 min v vodni kopeli pri 37 °C. 7. Dodajte 500 µl raztopine GES. Močno premešajte, da se suspenzija zbistri in nato inkubirajte še 10 min v ledeni kopeli. 8. Ob previdnem mešanju dodajte 250 µl ohlajene (4 °C) raztopine amonijevega acetata in inkubirajte še dodatnih 10 min na ledeni kopeli. 9. V digestoriju (obvezna uporaba rokavic! ) dodajte 500 µl mešanice kloroform/izoamilalkohol in dobro premešajte. 10. Ločite vodno fazo od kloroforma s 3 min centrifugiranjem pri maksimalnem številu obratov. 11. V digestoriju (obvezna uporaba rokavic! ) previdno odpipetirajte in prenesite zgornjo vodno fazo v svežo 2 ml mikrocentrifugirko. V interfazi je sluzasta oborina proteinov in celične stene, ki jo lahko odstranite s sterilnim zobotrebcem, in nato odpipetirate in prenesete še preostalo vodno raztopino. Vodni raztopini dodajte 500 µl mešanice 12 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. fenol/kloroform/izoamilalkohol. Dobro premešajte in centrifugirajte v 3 min pri maksimalnem številu obratov. 12. V digestoriju (obvezna uporaba rokavic! ) previdno odpipetirajte in prenesite zgornjo vodno fazo v svežo 1,5 ml mikrocentrifugirko in ji dodajte 500 µl mešanice kloroform/izoamilalkohol. Premešajte in centrifugirajte 3 min pri maksimalnem številu obratov. 13. V digestoriju (obvezna uporaba rokavic! ) previdno odpipetirajte in prenesite zgornjo vodno fazo v svežo mikrocentrifugirko in ocenite/zmerite volumen vodne raztopine. 14. Oborite kromosomsko DNA tako, da dodate vodni raztopini 0,54 volumna hladnega 2-propanola. Mikrocentrifugirko previdno obračajte, dokler se DNA ne obori. 15. Centrifugirajte 5 s (short spin) in z pipeto odstranite ves supernatant. Pri tem pazite, da ne odstranite kromosomske DNA. 16. Oborino kromosomske DNA sperite trikrat in sicer tako, da dodate 1 ml 80% etanola, ki ga nato previdno odstranite s pipeto. Ko tretjič odstranite 80% etanol, centrifugirajte 2 s in nato popolnoma odstranite preostali etanol, ki je spolzel s stene na dno mikrocentrifugirke. 17. Posušite oborino kromosomske DNA pri 37 °C v topli sobi. Pri tem bodi pazljivi, da se DNA ne presuši. 18. Resuspendirajte kromosomsko DNA v 30 µl pufra TE z dodano RNAzo A (50 µg/ml) in inkubirajte 30 min (ali preko noči) v vodni kopeli pri 37 °C. 3. Dan (ali še isti dan): 19. Spektrofotometrično določite koncentracijo kromosomske DNA in sicer tako, da v 1 ml sterilne vode dodate 1 µl izolirane kromosomske DNA. 17. Vzorce kromosomske DNA primerno označite in shrani na -20 °C. Gojišča, raztopine in pufri: 1. Gojišče LB: 25 g gojišča Luria-Bertani (Difco) v 1000 ml vode 2. Pufer TSE: 300 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM EDTA (pH 8) 3. Pufer TE (pH 8): 10 mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM EDTA (pH 8) 4. Raztopina lizocima: 50 mg/ml v pufru TE 5. Pufer GES: 5 M gvanidinijev izotiocianat, 100 mM EDTA (pH 8), 0,5% raztopina N- lavrilsarkozin; (60 g gvanidin izotiocianat, 20 ml 0,5 M EDTA, 5 ml 10% raztopine N- lavrilsarkozina, dopolni do 100 ml z vodo). 6. Raztopina amonijevega acetata (10 M): 77 g amonijevega acetata in dopolni do 100 ml, filtriraj; uporablja se 7,5 M raztopina 7. Mešanica kloroform/izoamilalkohol v/v 24:1 13 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. 8. Mešanica fenol/kloroform/izoamilalkohol v/v/v 25/24/1 9. 2-propanol 10. 80% etanol 11. Sterilna voda 12. RNAza A (1 mg/ml) Material: 1,5 in 2 ml mikrocentrifugirke, namizna centrifuga, pipete in pipetni nastavki, vibracijsko mešalo, vodna kopel (37 °C), ledena kopel, sterilni zobotrebci, rokavice, plovci, stojala, odlagalniki, mešalo, pincete, čaša z alkoholom, parafilm, 2 ml mikrocentrifugirke z volumni 50 – 500 µl (za določanje volumna vodne faze po fenolni ekstrakciji) 14 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Vprašanja: 1. Kaj dosežemo s spiranjem bakterij s pufrom TSE? 2. Zakaj vzorec DNA po obarjanju spiramo z 80% etanolom? 3. Kakšne načine lize celic poznamo? 4. Zakaj moramo pri delu s kromosomsko DNA paziti na strižne sile, pri delu s plazmidno DNA pa ne? 15 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. 5. S pomočjo spleta ugotovite, kaj pomenijo posamezne oznake v genotipu seva BL21 (DE3). 16 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. 3. VAJA Elektroforeza plazmidne in kromosomske DNA v agaroznem gelu Teorija: S pomočjo agarozne elektroforeze ločujemo molekule DNA, v velikostnem razredu 50 bp – 20.000 bp. Molekule DNA v gelu potajujejo različno hitro, kar je odvisno predvsem od velikosti, pri čemer velja, da se manjše molekule skozi agarozno mrežo pomikajo hitreje. Hitrost potovanja molekul DNA je odvisna tudi od oblike DNA, in ali je v enoverižni ali v dvoverižni obliki. Potek potovanja molekul DNA v agaroznem gelu spremljamo s pomočjo barvil, ki jih dodamo vzorcu DNA tik pred nanosom v jamico agaroznega gela. Ti barvili sta bromfenol modro in ksilen cianol. DNA zaznamo s pomočjo etidijevega bromida. Zaradi strukturne podobnosti z bazami v nukleinskih kislinah ima ta molekula sposobnost vgraditve med bazne pare nukleinskih kislin. Pod UV svetlobo nato zaznamo fluoresciranje DNA zaradi vgrajenega etidijevega bromida. Agaroza je sicer linearni polisaharid, zgrajen iz disaharida agarobioze in D-galaktoze ter iz monosaharida 3,6 anhidro-L-galaktopiranoze. Agaroza v gelu zavzame vijačno strukturo, ki jo omogočajo vodikove vezi in je posledično supernavita. Ker se nanjo biomolekule ne absorbirajo, se agarozo uporablja tudi pri pripravi kromatografskih nosilcev za ločevanje bioloških molekul (9). DNA: plazmidna DNA pET21c(+) + OlyA (izolirana na 1. vaji) in kromosomska DNA BL21 (DE3) (izolirana na 2. vaji) Slika 3: Slika agaroznega gela, z ločeno plazmidno in kromosomska DNA (osebni arhiv; Jerneja Ambrožič Avguštin). Postopek: PRIPRAVA AGAROZNEGA GELA IN AGAROZNA ELEKTROFOREZA Uspešnost izolacije plazmidne in kromosomske DNA boste preverili z agarozno gelsko elektroforezo na 0,8% agaroznem gelu s 0,5-kratnim pufrom TBE, ki mu dodamo barvilo etidijev bromid. Pripravili bomo dva agarozna gela, na enem bomo ločevali plazmidno DNA, na drugem pa kromosomsko DNA. 17 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. 1. Pri pripravi agaroznih gelov je nujno potrebna uporaba rokavic! V vsako od dveh erlenmajeric pripravite po 40 ml 0,5-kratnega elektroforeznega pufra TBE. Dodajte ustrezno količino agaroze za pripravo 0,8% gela. Raztopite agarozo ob segrevanju v mikrovalovni pečici. Erlenmajerici naj bosta v mikrovalovni pečici toliko časa, da se agaroza popolnoma raztopi. 2. Ohladite raztopini agaroze pod tekočo hladno vodo. 3. Medtem, ko se erlenmajerici z raztopljenima geloma ohlajata, pripravite nosilca za gela s primernima glavničkoma. Nekoliko ohlajeni agarozi dodajte 1 µl etidijevega bromida (10 mg/ml) v končni koncentraciji 0,5 µg/ml in jo zlijte v nosilec. Dobro premešajte in razlijte agarozo po nosilcih za gela. Po 30 – 45 minutah sta gela strjena. Obvezno delajte z rokavicami, ki jih po razlitju gela zamenjate. 4. Po 30 – 45 min prenesite agarozna gela v elektroforezni kadički in vanje nalijte 400 ml 0,5-kratnega elektroforeznega pufra TBE in iz njiju odstranite glavnika. Gela mora biti prekrita s pufrom. Zamenjajte rokavice. 5. Na parafilm nanesite 1 µl 6-kratnega nanašalnega pufra in 5 µl vzorca plazmidne in kromosomske DNA. Mešanico nanašalnega pufra in vzorca vnesite v jamico gela. V agarozni gel. Poleg vzorcev vnesite v eno luknjico še 4 µl standardne DNA. Priključite vir napetosti na 100 V in izvedite elektroforezo (30 – 45 min). Po elektroforezi osvetlite gel z UV transluminatorjem (G-Box Chemi, Syngene) in ga fotografirajte. 6. Preostanek vzorce DNA shranite do nadaljnjega v zmrzovalniku pri -20 °C. Gojišča, raztopine in pufri: 1. 0,8% agaroza v 0,5-krantem TBE 2. 5-kratni TBE – Tris-boratni elektroforezni pufer; 0,45 M Tris-borat (54 g Tris, 27,5 g borove kisline), 10 mM EDTA (pH 8) 3. Etidijev bromid – 10 mg/ml 4. 6-kratni nanašalni pufer – 0,25% raztopina bromfenol modro, 0,25% raztopina ksilen cinaol, 40% saharoza (w/v) 5. Sterilna voda 6. DNA lestvici Gene Ruler 1 kb DNA ladder Material: 1,5 ml mikrocentrifugirke, erlenmajerice (150 ml), valji (100 in 500 ml), lonec, parafilm, električni napajalnik, elektroforezna banjica, nosilec za gel, glavnik (15 zob), mizica z libelo, vodna kopel, sistem za ulivanje agaroznih gelov, namizna centrifuga, mešalo, odlagalniki, kuhalnik, pipete in pipetni nastavki, rokavice 18 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Vprašanja: 1. Od česa je odvisna hitrost potovanja DNA v agaroznem gelu? 2. Katero metodo bi uporabil za ločevanje molekul DNA, ki so manjše od 100 bp? 3. Zakaj smo vzorcem DNA pred nanosom v jamice gela dodali nanašalni pufer? 4. Kaj pričakujemo, da bomo po končni elektroforezi plazmidne DNA videli v agaroznem gelu pod UV svetlobo? Nariši? 5. Katere oblike DNA pričakujemo največ? 19 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. 6. Kako bi pripravil 100 µl raztopine standardne DNA Lambda/ Hind III v koncentraciji 50 ng/ml iz koncentrirane raztopine 237 µg/ml? Pri tem upoštevajmo, da je v končnem volumnu raztopine standardne DNA tudi 1/5 volumna nanašalnega pufra. 7. Kako bi pripravil 250 ml pudra STET (sestava je napisana pri 1. vaji), če imamo na razpolago saharozo v prahu, tekoči 100% Triton-X-100, 1 M EDTA in 2 M Tris-HCl? 8. Kako bi pripravili naslednje pufre: -Depurinacijska raztopina: 500 ml M (Tris) = 121 g/mol 0,2 M HCl M (NaCl) = 58,44 g7mol M (HCl) = 36,4 g/mol -Denaturacijska raztopina: 500 ml 1,5 M NaCl 0,5 m NaOH -Nevtralizacijska raztopina: 500 ml Koncentrirana raztopina 1 M Tris HCl je 36,2% 1,5 M NaCl ρ(HCl) = 1,18 g/mol S HCl izravnaj pH na 7,4 M (NaOH) = 40 g/mol 20 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. 4. VAJA Priprava para začetnih oligonukleotidov za preverjanje prisotnosti zaporedja za T7 RNA polimerazo na izolirani kromosomski DNA iz seva BL21 (DE3) bakterije Escherichia coli in verižna reakcija s polimerazo Teorija: Verižna reakcija s polimerazo je metoda pomnoževanja fragmenta DNA, ki leži med dvema regijama z znanim nukleotidnim zaporedjem. Za pomnoževanje izbranega zaporedja je potrebno oblikovati začetna oligonukleotida, ki sta komplementarna regiji 5' oz. 3' izbranega zaporedja DNA. Reakcija obsega tri faze: (i) denaturacija dvoverižne DNA, (ii) vezava začetnih oligonukleotidov in (iii) podaljševanje verige DNA s polimerazo. Celoten cikel reakcije nato ponavljamo, tako da iz ene molekule tarčne DNA teoretično dobimo 2število ciklov molekul. V reakciji uporabljamo posebno polimerazo – Taq DNA-polimerazo, ki je termostabilna in se ohrani med fazo denaturacije. Izolirana je bila iz termofilne bakterije Thermus aquaticus. Encim ima tudi višji temperaturni optimum od večine encimov, ki jih uporabljamo v molekularni biologiji, zato reakcija podaljševanja poteka pri 72 °C. Faza vezave začetnih oligonukleotidov poteka 5 °C pod temperaturo tališča vezave med začetnim oligonukleotidom in tarčno molekulo DNA. V vzorec DNA, ki vsebuje tarčno zaporedje dodamo začetna oligonukleotida, encim Taq DNA-polimerazo, vse štiri deoksiribonukleozid- trifosfate (dNTP-je), Mg2+ ione ter primešamo pufer, ki omogoča optimalno delovanje encima. Metoda je uporabna tako za raziskovalne namene kot tudi v diagnostiki (10). DNA: kromosomska DNA BL21 (DE3) (izolirana na 2. vaji) Slika 4: Shema poteka verižne reakcije s polimerazo, povzeto po (11). 21 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Postopek: 1. Glede na priloženo nukleotidno zaporedje dela kromosoma E. coli, ki vsebuje zaporedje 16S rRNA in ki ga želimo pomnožiti, izberite zaporedje nukleotidov, po katerem boste oblikovali 5' in 3' začetna oligonukleotida. Pri tem upoštevajte:  3' konca obeh začetnih oligonukleotidov ne smeta biti komplementarna, da ne pride do nastanka oligonukleotidnih dimerov.  Preverite, če je znotraj posameznega začetnega oligonukleotida možen nastanek sekundarnih struktur.  Začetna oligonukleotida naj vsebujeta približno 50% (± 10%) baznih parov GC.  Dolžini začetnih oligonukleotidov naj bo nad 17 nukleotidov, optimalna dolžina je 20-24 nukleotidov.  Temperaturi tališč obeh začetnih oligonukleotidov se ne smeta razlikovati za več kot 5 °C. 2. Preračunajte koliko posamezne komponente potrebujete za reakcijsko mešanico, v kateri bo končni volumen 20 µl. Preglednica 1: Reagenti za verižno reakcijo s polimerazo. Reagent Volumen [µl] Začetna konc. Končna konc. Pufer Taq (NH4)2SO4 2 µl 10-kratni 1-kratni MgCl2 1,6 µl 25 mM 2 mM Mešanica dNTP 1,6 µl 1,25 mM vsakega 100 µM vsakega MQ Smerni začetni oligonukleotid 10 µM 200 nM Protismerni začetni oligonukleotid 10 µM 200 nM matrica 1 µl 0,5 ng/µl Polimeraza Taq 0,2 5 U/µl 0,05 U/µL 3. V nadaljevanju 1 posameznik pripravi osnovno zmes (master mix) za PCR za celotno delovno skupino na enem pultu, kar pomeni, da v 1,5 ml mikrocentrifugirki zamešate reakcijsko mešanico za toliko posameznikov kot jih sedi za vašim pultom, pri tem pa upoštevajte še dodatni volumen za negativno kontrolo in dodatni volumen za rezervo (če vas za enim delovnim pultom sedi 5, pripravite osnovno zmes za 7 reakcij). Pri negativni kontroli boste namesto vzorca kromosomske DNA dodali 22 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. ustrezen volumen destilirane vode. Osnovno zmes se vedno pripravlja na ledu. V 1,5 ml mikrocentrifugirko odpipetirajte vse reagente razen matrice (kromosomske DNA). 4. Ko je osnovna zmes pripravljena si vsak posameznik na ledu v 0,2 ml mikrocentrifugirko odpipetira 19 µl osnovne mešanice in šele nato dodate svojo izolirano kromosomsko DNA. Ne pozabite označiti svoje mikrocentrifugirke (na vrhu in na trupu mikrocentrifugirke). 5. Mikrocentrifugirke PCR dajte v aparaturo za PCR in izvedite verižno reakcijo s polimerazo po programu, ki je podan v preglednici 2. 6. Izračunajte čas podaljševanja DNA, če veste, da je hitrost dodajanja nukleotidov polimeraze Taq je 1000 nukleotidov/minuto. Preglednica 2: Pogoji za pomnoževanje zaporedja za T7 RNA polimerazo z verižno reakcijo s polimerazo. Denaturacija DNA 95 °C 5 min Denaturacija DNA 95 °C, 30 s Prileganje 55 °C, 30 s 30 ciklov Podaljševanje DNA 72 °C, ___s Podaljševanje DNA 72 °C, 2 min Konec 4 °C 7. Računanje temperature tališča, Tm (v °C): Tm = 2×(A+T) 4×(G+C) Zaporedje smernega začetnega oligonukleotida: Tm smernega začetnega oligonukleotida = Zaporedje protismernega začetnega oligonukleotida: Tm protismernega začetnega oligonukleotida = 23 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Nukleotidno zaporedje za T7 RNA polimerazo (2652 nt): 750421 5'- ATGAACACGATTAACATCGCTAAGAACGACTTCTCTGACATCGAACTGGCTGCTATCCCGTTCAACACTC TGGCTGACCATTACGGTGAGCGTTTAGCTCGCGAACAGTTGGCCCTTGAGCATGAGTCTTACGAGATGGG TGAAGCACGCTTCCGCAAGATGTTTGAGCGTCAACTTAAAGCTGGTGAGGTTGCGGATAACGCTGCCGCC AAGCCTCTCATCACTACCCTACTCCCTAAGATGATTGCACGCATCAACGACTGGTTTGAGGAAGTGAAAG CTAAGCGCGGCAAGCGCCCGACAGCCTTCCAGTTCCTGCAAGAAATCAAGCCGGAAGCCGTAGCGTACAT CACCATTAAGACCACTCTGGCTTGCCTAACCAGTGCTGACAATACAACCGTTCAGGCTGTAGCAAGCGCA ATCGGTCGGGCCATTGAGGACGAGGCTCGCTTCGGTCGTATCCGTGACCTTGAAGCTAAGCACTTCAAGA AAAACGTTGAGGAACAACTCAACAAGCGCGTAGGGCACGTCTACAAGAAAGCATTTATGCAAGTTGTCGA GGCTGACATGCTCTCTAAGGGTCTACTCGGTGGCGAGGCGTGGTCTTCGTGGCATAAGGAAGACTCTATT CATGTAGGAGTACGCTGCATCGAGATGCTCATTGAGTCAACCGGAATGGTTAGCTTACACCGCCAAAATG CTGGCGTAGTAGGTCAAGACTCTGAGACTATCGAACTCGCACCTGAATACGCTGAGGCTATCGCAACCCG TGCAGGTGCGCTGGCTGGCATCTCTCCGATGTTCCAACCTTGCGTAGTTCCTCCTAAGCCGTGGACTGGC ATTACTGGTGGTGGCTATTGGGCTAACGGTCGTCGTCCTCTGGCGCTGGTGCGTACTCACAGTAAGAAAG CACTGATGCGCTACGAAGACGTTTACATGCCTGAGGTGTACAAAGCGATTAACATTGCGCAAAACACCGC ATGGAAAATCAACAAGAAAGTCCTAGCGGTCGCCAACGTAATCACCAAGTGGAAGCATTGTCCGGTCGAG GACATCCCTGCGATTGAGCGTGAAGAACTCCCGATGAAACCGGAAGACATCGACATGAATCCTGAGGCTC TCACCGCGTGGAAACGTGCTGCCGCTGCTGTGTACCGCAAGGACAAGGCTCGCAAGTCTCGCCGTATCAG CCTTGAGTTCATGCTTGAGCAAGCCAATAAGTTTGCTAACCATAAGGCCATCTGGTTCCCTTACAACATG GACTGGCGCGGTCGTGTTTACGCTGTGTCAATGTTCAACCCGCAAGGTAACGATATGACCAAAGGACTGC TTACGCTGGCGAAAGGTAAACCAATCGGTAAGGAAGGTTACTACTGGCTGAAAATCCACGGTGCAAACTG TGCGGGTGTCGATAAGGTTCCGTTCCCTGAGCGCATCAAGTTCATTGAGGAAAACCACGAGAACATCATG GCTTGCGCTAAGTCTCCACTGGAGAACACTTGGTGGGCTGAGCAAGATTCTCCGTTCTGCTTCCTTGCGT TCTGCTTTGAGTACGCTGGGGTACAGCACCACGGCCTGAGCTATAACTGCTCCCTTCCGCTGGCGTTTGA CGGGTCTTGCTCTGGCATCCAGCACTTCTCCGCGATGCTCCGAGATGAGGTAGGTGGTCGCGCGGTTAAC TTGCTTCCTAGTGAAACCGTTCAGGACATCTACGGGATTGTTGCTAAGAAAGTCAACGAGATTCTACAAG CAGACGCAATCAATGGGACCGATAACGAAGTAGTTACCGTGACCGATGAGAACACTGGTGAAATCTCTGA GAAAGTCAAGCTGGGCACTAAGGCACTGGCTGGTCAATGGCTGGCTTACGGTGTTACTCGCAGTGTGACT AAGCGTTCAGTCATGACGCTGGCTTACGGGTCCAAAGAGTTCGGCTTCCGTCAACAAGTGCTGGAAGATA CCATTCAGCCAGCTATTGATTCCGGCAAGGGTCTGATGTTCACTCAGCCGAATCAGGCTGCTGGATACAT GGCTAAGCTGATTTGGGAATCTGTGAGCGTGACGGTGGTAGCTGCGGTTGAAGCAATGAACTGGCTTAAG TCTGCTGCTAAGCTGCTGGCTGCTGAGGTCAAAGATAAGAAGACTGGAGAGATTCTTCGCAAGCGTTGCG CTGTGCATTGGGTAACTCCTGATGGTTTCCCTGTGTGGCAGGAATACAAGAAGCCTATTCAGACGCGCTT GAACCTGATGTTCCTCGGTCAGTTCCGCTTACAGCCTACCATTAACACCAACAAAGATAGCGAGATTGAT GCACACAAACAGGAGTCTGGTATCGCTCCTAACTTTGTACACAGCCAAGACGGTAGCCACCTTCGTAAGA CTGTAGTGTGGGCACACGAGAAGTACGGAATCGAATCTTTTGCACTGATTCACGACTCCTTCGGTACCAT TCCGGCTGACGCTGCGAACCTGTTCAAAGCAGTGCGCGAAACTATGGTTGACACATATGAGTCTTGTGAT GTACTGGCTGATTTCTACGACCAGTTCGCTGACCAGTTGCACGAGTCTCAATTGGACAAAATGCCAGCAC TTCCGGCTAAAGGTAACTTGAACCTCCGTGACATCTTAGAGTCGGACTTCGCGTTCGCGTAA -3' 753072 PRIPRAVA AGAROZNEGA GELA IN GELSKA ELEKTROFOREZA Uspešnost PCR boste preverili z agarozno gelsko elektroforezo na 0,8% agaroznem gelu z 0,5- kratnim elektroforeznim pufrom TBE, ki mu dodate barvilo etidijev bromid. 1. Pri pripravi agaroznega gela je nujno potrebna uporaba rokavic! Pripravi 40 ml 0,5-kratnega elektroforeznega pufra TBE. Dodajte ustrezno količino agaroze za pripravo 0,8% gela. Raztopite agarozo ob segrevanju v mikrovalovni pečici. Erlenmajerica naj bo v mikrovalovni pečici toliko časa, da se agaroza popolnoma raztopi. 2. Ohladite raztopino agaroze pod tekoče hladno vodo. 24 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. 3. Medtem, ko se erlenmajerica z raztopljenim gelom ohlaja, pripravite nosilec za gel s primernim glavničkom. Nekoliko ohlajeni agarozi dodajte 1 µl etidijevega bromida (10 mg/ml) v končni koncentraciji 0,5 µg/ml in jo zlijte v nosilec. Dobro premešajte in razlijte agarozo po nosilcih za gela. Po 30 – 45 minutah je gel strjen. Obvezno delajte z rokavicami, ki jih po razlitju gela zamenjajte. 4. Po 30 – 45 min, ko je gel strjen, ga prenesite v elektroforezno kadičko, vanjo nalijte 400 ml 0,5-kratnega elektroforeznega pufra TBE in odstranite glavniček. Gel mora biti prekrit s pufrom. Zamenjajte rokavice. 5. Na parafilm nanesite 1 µl 6-kratnega nanašalnega pufra in 5 µl pomnožkov. Mešanico nanašalnega pufra in vzorca vnesite v jamico gela. V agarozni gel poleg vzorcev vnesite še 4 µl standardne DNA. Priključite na vir napetosti na 100 V in izvedite elektroforezo (30 - 45 min). Po elektroforezi preverite, če je bila verižna reakcija s polimerazo uspešna (lisa na gelu). Gel osvetlite z UV transluminatorjem (G- Box Chemi, Syngene) in ga fotografirajte. 6. Preostanek vzorcev DNA do nadaljnjega shranite v zmrzovalniku pri -20 °C. Ne pozabite vzorcev označiti! Gojišča, raztopine in pufri: 1. Pufer Taq (NH4)2SO4 2. 25 mM MgCl2 3. 1,25 mM Mešanica dNTP 4. Polimeraza Taq 5. 0,8% agaroza v 0,5-krantem TBE 6. 5-kratni TBE – Tris-boratni elektroforezni pufer; 0,45 M Tris-borat (54 g Tris, 27,5 g borove kisline), 10 mM EDTA (pH 8) 7. Etidijev bromid – 10 mg/ml 8. 6-kratni nanašalni pufer – 0,25% raztopina bromfenol modro, 0,25% raztopina ksilen cinaol, 40% saharoza (w/v) 9. Sterilna voda 10. DNA lestvici Gene Ruler 1 kb DNA ladder 11. Par začetnih oligonukleotidov Material: 1,5 in 0,2 ml mikrocentrifugirke, erlenmajerice (150 ml), valj (100 in 500 ml), led, parafilm, električni napajalnik, elektroforezna banjica, nosilec za gel, glavnik (15 zob), mizica z libelo, centrifuga, mešalo, odlagalniki, pipete in pipetni nastavki, rokavice 25 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Vprašanja: 1. Katere molekule/sestavine so nujno potrebne za PCR? 2. Kakšne vrste vezi se tvorijo med začetnimi oligonukleotidi in matričnim zaporedjem DNA? 3. Ali bi lahko PCR potekal s človeško rekombinantno DNA-polimerazo? 4. Naštej nekaj aplikacij PCR? 26 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. 5. VAJA Priprava para začetnih oligonukleotidov za pomnoževanje zaporedja, ki kodira za fluorescenčni protein OlyA-mCherry in verižna reakcija s polimerazo Teorija: Na prejšnjih vajah smo spoznali, kako z reakcijo PCR preverjamo prisotnost določenih zaporedij, kar po koncu reakcije lahko preverimo z uporabo agarozne elektroforeze. Z oblikovanjem specifičnih začetnih oligonukleotidov pa lahko izbrano pomnoženo zaporedje vključimo v odprt plazmidni vektor ali kakšen drugi vektor za kloniranje. Pri tem moramo paziti, da v skrajni del zaporedja, ki ga želimo pomnožiti, vstavimo tudi ustrezna restrikcijska mesta, ki bodo kompatibilna z izbranim plazmidnim vektorjem, hkrati pa moramo tudi zagotoviti, da izbrani restrikcijski encimi ne bodo rezali znotraj tarčnega zaporedja. Pri oblikovanju takšnih začetnih oligonukleotidov je potrebno zagotoviti, da se ohrani genetski kod in da zagotovimo, da se zaporedje, ki ga bomo izražali, prične s kodonom start in konča z zaporedjem stop (12,13). Protein, ki ga bomo izrazili bo imel na svojem C-terminalnem delu repek His6, kar bomo po izolaciji proteina izkoristili za njegovo čiščenje z ionsko-izmenjevalno kromatografijo. DNA: zaporedje za protein OlyA-mCherry Slika 5: Poglavitni elementi ekspresijskega vektorja za E. coli. Povzeto po (13). Slika 6: Elementi DNA, potrebni za sintezo rekombinantnega OlyA-mCherry; TM, trombinsko mesto. 27 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Postopek: 1. Zaporedje, ki kodira za OlyA-mCherry (1152 bp) bomo po reakciji z verižno reakcijo s polimerazo vključili v odprt plazmidni vektor pET21c(+) (6. vaja), kar pomeni, da moramo v zaporedje, ki kodira za izbrani protein vključiti zaporedji, ki ju bo prepoznal ustrezen par restrikcijskih encimov. Ti dve restrikcijski mesti morata biti kompatibilni z mestom mestom za kloniranje na izbranem ekspresijskim plazmidu in morata hkrati ustrezati pogoju, da teh zaporedij ni znotraj zaporedja, ki kodira za OlyA-mCherry. Katera restrikcijska mesta imate na voljo, si lahko ogledate na strani 63, kjer je prikazana plazmidna mapa plazmidnega vektorja pET21c(+). 2. Pri oblikovanju ustreznih oligonukleotidnih začetnikov je potrebno tudi preveriti, ali (i) zaporedje, ki ga želimo izraziti ali (ii) plazmidni vektor že vsebujeta kodona start in stop. 3. V končni začetni oligonukleotid bomo dodali še nukleotidno zaporedje CTGGTTCCGCGCGGCAGC, ki kodira za aminokislinsko zaporedje LVPR↓GS, ki ga prepozna proteaza trombin (kjer nakazuje puščica), kar nam omogoča, da repek His6 po izolaciji rekombinantnih proteinov odrežemo. Nukleotidno zaporedje za OlyA-mCherry (1152 nt): 5'-ATGGCGTACGCCCAATGGGTCATCATTATCATCCACAACGTCGGATCTCAAGACGTGAAGATCAAGAACCTC AAGGCTTCCTGGGGGAAGCTTCACGCTGACGGTGACAAAGACGCTGAAGTCTCAGCAAGCAACTACGAAGGAAAG ATCGTCAAGCCTGACGAGAAGCTCCAGATCAACGCCTGCGGCAGATCAGATGCCGCCGAAGGCACGACCGGAACC TTCGATCTTGTCGACCCTGCCGATGGCGACAAGCAGGTCCGCCACTTCTACTGGGACTGCCCCTGGGGCAGCAAA ACCAACACTTGGACCGTTAGCGGCTCCAACACCAAGTGGATGATCGAGTACTCTGGGCAGAACTTGGACAGCGGT GCCCTCGGCACCATCACCGTCGACACCTTGAAGAAGGGGAACGGCAGCGAAGGCAAAAGCAGCGGCAGCGGCATG GTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCC GTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTG AAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCC TACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTG ATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAG GTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCC TCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGC CACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAAC ATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCAC TCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAG -3' Zaporedje smernega začetnega oligonukleotida: Tm smernega začetnega oligonukleotida = Zaporedje protismernega začetnega oligonukleotida: Tm protismernega začetnega oligonukleotida = 28 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. 1. Preračunajte, koliko posamezne komponente potrebujete za reakcijsko mešanico, v kateri bo končni volumen 20 µl. Preglednici 3: Reagenti za verižno reakcijo s polimerazo. Reagent Volumen [µl] Začetna konc. Končna konc. 10-kratni pufer 2 µl 10-kratni 1-kratni MgCl2 1,6 µl 25 mM 2 mM Mešanica dNTP 1,6 µl 1,25 mM vsakega 100 µM vsakega MQ Smerni začetni oligonukleotid 10 µM 200 nM Protismerni začetni oligonukleotid 10 µM 200 nM matrica 1 µl DNA polimeraza Q5 0,2 5 U/µl 0,05 U/µL 2. V nadaljevanju 1 posameznik pripravi osnovno zmes za PCR za celotno skupino, kar pomeni, da v 1,5 ml mikrocentrifugirki zamešate reakcijsko mešanico za toliko posameznikov, kot jih sedi za vašim pultom, s tem da upoštevate še dodatni volumen za rezervo. Reakcijo za negativno kontrolo boste zamešali v 0,2 ml mikrocentrifugirki, kjer boste namesto matrične DNA dodali ustrezen volumen destilirane vode. Osnovno zmes se vedno pripravlja na ledu. V 1,5 ml mikrocentrifugirko odpipetirajte vse sestavine in sicer po vrstnem redu, ki sledi preglednici 3. 3. Ko je osnovna zmes pripravljena, si vsak posameznik na ledu v 0,2 ml mikrocentrifugirko odpipetira 20 µl mešanice. Ne pozabite označiti svoje mikrocentrifugirke (na vrhu in na trupu mikrocentrifugirke). 4. Mikrocentrifugirke PCR dajte v aparaturo za PCR in izvedite verižno reakcijo s polimerazo po programu. 5. Izračunajte čas podaljševanja DNA, če veste, da je hitrost dodajanja nukleotidov polimeraze Q5 1000 nukleotidov/minuto. Preglednica 4: Pogoji za pomnoževanje zaporedja za OlyA-mCherry z verižno reakcijo s polimerazo. Denaturacija DNA 95 °C 5 min Denaturacija DNA 95 °C, 30 s Prileganje 55 °C, 30 s 30 ciklov Podaljševanje DNA 72 °C, ___ s Podaljševanje DNA 72 °C, 2 min Konec 4 °C 29 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. PRIPRAVA AGAROZNEGA GELA IN AGAROZNA ELEKTROFOREZA Uspešnost PCR boste preverili z agarozno gelsko elektroforezo na 0,8% agaroznem gelu z 0,5- kratnim pufrom TBE, ki mu dodate barvilo etidijev bromid. 1. Pri pripravi agaroznega gela je nujno potrebna uporaba rokavic! Pripravi 40 ml 0,5-kratnega elektroforeznega pufra TBE. Dodaj ustrezno količino agaroze za pripravo 0,8% gela. Raztopite agarozo ob segrevanju v mikrovalovni pečici. Erlenmajerica naj bo v mikrovalovni pečici toliko časa, da se agaroza popolnoma raztopi. 2. Ohladite raztopino agaroze pod tekoče hladno vodo. 3. Medtem, ko se erlenmajerica z raztopljenim gelom ohlaja, pripravite nosilec za gel s primernim glavničkom. Nekoliko ohlajeni agarozi dodajte 1 µl etidijevega bromida (10 mg/ml) v končni koncentraciji 0,5 µg/ml in jo zlijte v nosilec. Dobro premešajte in razlijte agarozo po nosilcih za gela. Po 30 – 45 minutah je gel strjen. Obvezno delajte z rokavicami, ki jih po razlitju gela zamenjajte. 4. Ko je gel po 30 – 45 strjen, ga prenesite v elektroforezno kadičko, vanjo nalijte 400 ml 0,5-kratnega pufer TBE in odstranite glavniček. Gel mora biti prekrit s pufrom. Zamenjajte rokavice. 5. Na parafilm nanesite 1 µl 6-kratnega nanašalnega pufra in 5 µl pomnožkov. Mešanico nanašalnega pufra in vzorca vnesite v jamico gela. V agarozni gel poleg vzorcev vnesite še 4 µl standardne DNA. Priključite na vir napetosti na 100 V in izvedite elektroforezo (30 - 45 min). Po elektroforezi preverimo, če je bila verižna reakcija s polimerazo uspešna (lisa na gelu). Gel osvetlite z UV transluminatorjem (G- Box Chemi, Syngene) in ga fotografirajte. 6. Preostanek vzorcev DNA do nadaljnjega shranite v zmrzovalniku pri -20 °C. Ne pozabite označiti vzorcev! Gojišča, raztopine in pufri: 12. Pufer Taq (NH4)2SO4 13. 25 mM MgCl2 14. 1,25 mM Mešanica dNTP 15. Polimeraza Taq 16. 0,8% agaroza v 0,5-krantem TBE 17. 5-kratni TBE – Tris-boratni elektroforezni pufer; 0,45 M Tris-borat (54 g Tris, 27,5 g borove kisline), 10 mM EDTA (pH 8) 18. Etidijev bromid – 10 mg/ml 19. 6-kratni nanašalni pufer – 0,25% raztopina bromfenol modro, 0,25% raztopina ksilen cinaol, 40% saharoza (w/v) 20. Sterilna voda 21. DNA lestvici Gene Ruler 1 kb DNA ladder 22. Par začetnih oligonukleotidov 30 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Material: 1,5 in 0,2 ml mikrocentrifugirke, erlenmajerice (150 ml), valj (100 in 500 ml), led, parafilm, električni napajalnik, elektroforezna banjica, nosilec za gel, glavnik (15 zob), mizica z libelo, centrifuga, mešalo, odlagalniki, pipete in pipetni nastavki, rokavice 31 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Vprašanja: 1. Oglejte si sliko 6 in utemeljite, zakaj so v shemi plazmidnega vektorja nakazani posamezni DNA elementi. 2. Kako bi v bakterijske celice vnesli plazmidni vektor, ki je večji od 10.000 bp? 3. Kateri so izvorni organizmi, iz katerih so pridobili zaporedja za fluorescenčne proteine? 4. Kakšne selekcijske markerji bi v teoriji lahko vseboval plazmidni vektor? 5. Zakaj za pripravo DNA konstruktov za izražanje uporabljamo drugačno polimerazo kot pri diagnostičnemu PCR? 32 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. 6. VAJA Rezanje (i) pomnoženega zaporedja, ki kodira za fluorescenčni protein OlyA-mCherry in (ii) izoliranega plazmida pET21c(+) + OlyA Teorija: Restrikcijske endonukleaze (restriktaze) so encimi, ki režejo DNA znotraj prepoznavnega zaporedja ali ob njem. DNA lahko torej z njihovo pomočjo usmerjeno režemo. Kot velja za vse encime, moramo tudi tukaj paziti, da reakcije teče vsaj blizu optimuma encimskega delovanja. Pravilno ionsko koncentracijo, vrednost pH in koncentracijo morebitnih aktivatorjev uravnamo s pomočjo restrikcijskega pufra, ki ga dodamo v restrikcijsko mešanico. Prav tako je treba paziti na količino dodanega encima in na temperaturo, pri kateri reakcija poteka. Pri določanju koncentracije encima v mešanici in časa inkubacije moramo biti pozorni na to, kako encim prepoznava in reže zaporedja ob koncih molekul DNA, ter na število prepoznavnih mest v molekuli DNA (14). DNA: fragment OlyA-mCherry-linker-trombin-His6 (namnožen na 5. vaji) in izolirana plazmidna DNA pET21c(+) + OlyA (izolirana na 1. vaji). Slika 7: Potek eksperimentov pri 7. in 8. laboratorijski vaji, povzeto po (15). Restrikcijski endonukleazi in njuni prepoznavni zaporedji: Nde I CA↓TATG Neisseria denitrificans GTAT↑AC Xho I C↓TCGAG Xanthomonas holcicola GAGCT↑C 33 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Postopek: Delali bomo v parih, eden izmed para bo pripravil (rezal) fragment OlyA-mCherry, drugi pa plazmidni vektor. Najprej bomo pripravili 2 agarozna gela. 1. V dve 1,5 ml mikrocentrifugirki odpipetirajte toliko vzorca DNA, da bo vsaka raztopina vsebovala 2 µg vektorja pET21c(+) + OlyA in 1 µg pomnoženega zaporedja OlyA- mCherry. 2. Ugotovite količino restrikcijske endonukleaze, ki jo boste dodali vzorcema DNA, če 1 µl encima razgradi 2 µg plazmidne DNA in 0,4 µg produkta PCR v 15 min. 3. Količina restrikcijske endonukleaze ne sme presegati 1/10 končnega volumna restrikcijske mešanice. 4. Če je potrebno, vzorcu DNA dodajte sterilno vodo, in sicer ga dopolnite do volumna, ki je za količino encima in za 1/10 volumna manjši od končnega volumna restrikcijske mešanice. 5. Dodajte 1/10 končnega volumna 10-kratnega restrikcijskega pufra, ki ustreza restrikcijski endonukleazi. 6. Dodajte ustrezno količino restrikcijske endonukleaze, rahlo premešajte na vibracijskem mešalu in centrifugirajte 5 s. Preglednica 5: Reagenti za rezanje plazmidnega vektorja pET21c(+) + OlyA in fragmenta OlyA-mCherry. pET21c(+) + OylA OlyA-mCherry DNA Nde I Xho I Restrikcijski pufer ddH2O Skupni V 7. Restrikcijsko mešanico inkubirajte 10 min v vodni kopeli pri 37 °C. 8. Pripravite dva 0,8% agarozna gela. 9. Če je vzorec DNA popolnoma razrezan, inaktivirajte restrikcijsko endonukleazo s povišano temperaturo in sicer tako, da inkubirate restrikcijsko mešanico 10 min pri 65 °C. 34 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. PRIPRAVA AGAROZNEGA GELA IN AGAROZNA ELEKTROFOREZA Uspešnost rezanje fragmentov DNA boste preverili z agarozno gelsko elektroforezo na dveh 0,8% agaroznih gelih z 0,5-kratnim elektroforeznim pufrom TBE, ki mu dodate barvilo etidijev bromid. 1. Pri pripravi agaroznega gela je nujno potrebna uporaba rokavic! Pripravi 40 ml elektroforeznega pufra 0,5-kratnega TBE. Dodajte ustrezno količino agaroze za pripravo 0,8% gela. Raztopite agarozo ob segrevanju v mikrovalovni pečici. Erlenmajerico naj bo v mikrovalovno pečico toliko časa, da se agaroza popolnoma raztopi. 2. Ohladite raztopino agaroze pod tekoče hladno vodo. 3. Medtem, ko se erlenmajerica z raztopljenim gelom ohlaja, pripravite nosilec za gel s primernim glavničkom. Nekoliko ohlajeni agarozi dodajte 1 µl etidijevega bromida (10 mg/ml) v končni koncentraciji 0,5 µg/ml in jo zlijte v nosilec. Dobro premešajte in razlijte agarozo po nosilcih za gela. Po 30 – 45 minutah je gel strjen. Obvezno delajte z rokavicami, ki jih po razlitju gela zamenjajte. 4. Po 30 – 45, min ko je gel strjen, ga prenesite v elektroforezno kadičko, vanjo nalijte 400 ml 0,5-kratnega pufer TBE in odstranite glavniček. Gel mora biti prekrit s pufrom. Zamenjajte rokavice. 5. Na parafilm nanesite ves reakcijski volumen rezanega plazmida pET21c(+) + OlyA in ustrezen volumen 6-kratnega nanašalnega pufra in ves reakcijski volumen rezanega produkta PCR (OlyA-mCherry) in ustrezen volumen 6-kratnega nanašalnega pufra. Mešanico nanašalnega pufra in vzorca DNA vnesite v jamico gela. V agarozni gel poleg vzorcev vnesite še 4 µl standardne DNA. Priključi na vir napetosti na 100 V in izvedite elektroforezo (30 - 45 min). Po elektroforezi osvetlite gel osvetlite z UV transluminatorjem (G-Box Chemi, Syngene) in ga fotografirajte. 6. Po agarozni elektroforezi s skalpelom izrežite iz gela približno 5500 bp velik fragment odprtega plazmida pET21c(+) in 1200 bp velik fragment OlyA- mCherry-His6 ter ju shranite v mikrocentrifugirkah pri 4 °C v hladilniku. Mikrocentrifugirki predhodno stehtajte prav tako pa tudi po dodatku gela v katerem sta fragmenta DNA. Določite maso izrezanih koščkov gela. Vzorce natančno označite, ker jih boste potreboval za ligacijo (8. vaja). Gojišča, raztopine in pufri: 1. Nde I, restrikcijska endonukleaza 2. Xho I, restrikcijska endonukleaza 3. 10-kratni restrikcijski pufer 4. Sterilna, dva-krat destilirana sterilna voda 5. Agaroza, 0,8% v 0,5-kratnem TBE 6. DNA lestvici Gene Ruler 1 kb DNA ladder 35 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. 7. 5-kratni pufer TBE - Tris-boratni elektroforezni pufer; 0,45 M Tris-borat (54 g Tris, 27,5 g borove kisline), 10 mM EDTA (pH 8) 8. Etidijev bromid, 10 mg/ml 9. 6-kratni nanašalni pufer – 0,25% raztopina bromfenol modro, 0,25% raztopina ksilen cinaol, 40% saharoza (w/v) Material: 1,5 in 0,2 ml mikrocentrifugirke, erlenmajerice (150 ml), valj (100 in 500 ml), led, parafilm, električni napajalnik, elektroforezna banjica, nosilec za gel, glavnik (15 zob), mizica z libelo, centrifuga, mešalo, odlagalniki, pipete in pipetni nastavki, rokavice 36 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Vprašanja: 1. Zakaj je potrebno po rezanju plazmidnega vektorja njegovo čiščenje na agaroznem gelu? 2. Kaj je razlog, da reakcijo restrikcije izvajamo pri 37 °C? 3. Zakaj količina dodanega encima ne sme presegati 10% končnega volumna restrikcijske mešanice? 4. Zakaj so restriktaze občutljive na daljšo inkubacijo pri višjih temperaturah? 37 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. 5. Kromosomsko DNA E. coli boste rezali z Bam HI in Eco RI. Zatem boste restrikcijsko mešanico vneseli v jamice agaroznega gela, ki sprejmejo do 30 µl vzorca. V gel je potrebno vnesti 10 µg DNA. Koncentracija DNA je 1 µg/µl, restrikcijski pufer je 10- krat koncentriran, za popolno restrikcijo potrebujete 2,5 U Eco RI in 3 U Bam HI na 1 µg kromosomske DNA. Elektroforezni nanašalni pufer je 6-krat koncentriran. Izračunajte količine posameznih sestavin restrikcijske mešanice. 38 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. 7. VAJA Ligacija odprtega plazmidnega vektorja pET21c(+) in rezanega fragmenta OlyA-mCherry Teorija: Kloniranje in subkloniranje predstavljata skupek postopkov, ki jih uporabljamo, da želeno DNA vstavimo v primeren vektor. DNA-ligaza, ki zleplja dve molekuli DNA (vektor in fragment), je zelo občutljiva na prisotnost nečistoč v vzorcu, zato moramo DNA pred ligacijsko reakcijo dodatno očistiti. Ker so odprti plazmidni vektorji (pET21c(+)) in fragmenti OlyA- mCherry v agaroznem gelu, jih moramo najprej ločiti od agaroze. Za ta namen si bomo pomagali s komercialnim kitom »GeneJET Gel Extraction Kit«. Agarozne blokce, v katerih je tudi tarčna DNA, bomo najprej raztopili, nato pa raztopino nanesli v komercialno kolono. V prisotnosti visokih koncentracij soli se DNA veže v koloni na membrano iz silikatnega gela, nečistoče pa se sperejo iz kolone. Absorbirano DNA na silikatni membrani dodatno speremo in sprostimo iz kolone s pufrom ali z vodo (16). Pri ligacijski reakciji moramo, podobno kot pri rezanju DNA, paziti na pogoje, v katerih je encim aktiven. Ligacijo izvajamo pri nižjih temperaturah od temperaturnega optimuma, saj s tem omogočimo lažji nastanek vodikovih vezi med lepljivimi konci vektorja in inserta ter zmanjšamo verjetnost nastanka povezav med večjim številom molekul DNA. Po transformaciji bakterijskih celic z ligacijsko mešanico sledi še selekcija oziroma identifikacija tistih kolonij, ki vsebujejo plazmid z rekombinantno DNA. Uporabili bomo direktno selekcijo. DNA: OlyA-mCherry (1200 bp) in pET21c(+) (5500 bp), pridobljeni na 7. vaji Slika 8: Shematski prikaz izolacije DNA iz agaroznih blokcev s komercialnim kompletom »GeneJET Gel Extraction Kit«, povzeto po (17). 39 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Postopek: PRIPRAVA VEKTORJA IN FRAGMENTA DNA ZA KLONIRANJE 1. Vzorcem fragmentov DNA, izrezanih iz agaroznega gela, dodajte 1 volumne pufra za vezavo (Binding Buffer) in premešaj. Pri tem upoštevajte, da 100 mg gela zavzema 100 µl. 2. Vzorce, izrezane iz gela, inkubirajte 10 min pri 50 - 60 °C, da se agaroza popolnoma raztopi. Vmes nekajkrat premešajte na način, da mikrocentrifugirko pretresete, kar bo pospešilo raztapljanje agaroze. Po končanem raztapljanju premešajte vsebino mikrocentrifugirke na vibracijskem mešalu. Po inkubaciji preverite barvo raztopine. Vezava DNA na silikatno membrano v koloni je odvisna od vrednosti pH. Pri pH ≥7,5 se adsorpcija močno zmanjša. Povišano vrednost pH zaznamo s spremembo barve vzorca iz rumeno v vijoličasto. Če barva vzorca ni rumena, dodajte 10 µl 3 M Na-acetat (pH 5). 3. V kolono prenesite do 800 µl raztopljenega gela in centrifugirajte 1 min pri maksimalnem številu obratov. Spraznite zbiralno epruveto in jo vstavite nazaj v kolono. Če je v mikrocentrifugirki ostalo še raztopljenega gela postopek ponovite. 4. V kolono dodajte 700 µl pufra za spiranje (Wash Buffer), v katerega se je že predhodno dodalo etanol. Centrifugirajte 1 min pri maksimalnem številu obratov. Spraznite zbiralno epruveto in jo vstavite nazaj v kolono. 5. Centrifugirajte 1 min pri maksimalnem številu obratov, da se popolnoma znebite pufra za spiranje. 6. Kolono prenesite v čisto mikrocentrifugirko. Natančno v sredino silikatne membrane v koloni nanesite 30 µl pufra za elucijo DNA (Elution Buffer) ali sterilne vode in inkubirajte 1 minuto pri sobni temperaturi, nato centrifugirajte 1 minuto. Odstranite kolono in zaprite mikrocentrifugirko z izprano DNA. 7. Mikrocentrifugirko s čisto DNA ustrezno označite in spektrofotometrično določite koncentracijo DNA. LIGACIJA LINEARIZIRANE DNA VEKTORJA IN FRAGMENTA DNA 1. Pripravili boste 20 µl ligacijske mešanice v mikrocentrifugirki. Tipično se za ligacijo uporablja 25 ng DNA prečiščenega vektorja in ustrezno količino fragmenta v molskem razmerju 1:3. 2. Količino fragmenta se izračuna po naslednji formuli: 25 𝑛𝑔 ∗ (𝑣𝑒𝑙𝑖𝑘𝑜𝑠𝑡 𝑖𝑛𝑠𝑒𝑟𝑡𝑎 𝑣 𝑏𝑝) ∗ 3 𝐾𝑜𝑙𝑖č𝑖𝑛𝑎 𝑓𝑟𝑎𝑔𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎 = 𝑣𝑒𝑙𝑖𝑘𝑜𝑠𝑡 𝑣𝑒𝑘𝑡𝑜𝑟𝑗𝑎 𝑣 𝑏𝑝 40 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. 3. Mešanici DNA vektorja in fragmenta dodajte sterilno vodo. Količino sterilne vode dodamo toliko, da volumen ligaze ne presega 1/10 končnega volumna ligacijske mešanice. 4. Dodajte 1/10 končnega volumna 10-krantega koncentriranega pufra za T4 DNA-ligazo. Preglednica 6: Reagenti za ligacijo plazmidnega vektorja pET21c(+) in fragmenta OlyA-mCherry. Vzorec Kontrola Vektor Fragment DNA Ligacijski pufer ddH2O T4 DNA ligaza Končni V 5. Ligacijsko mešanico premešajte in centrifugirajte v centrifugi 1-2 s. Inkubirajte preko noči v vodni kopeli pri 16 °C. 6. Vzporedno vsaka delovna skupina pripravi tudi 10 µl kontrolne ligacijske mešanice. Postopek je enak zgoraj opisanemu postopku, le da namesto fragmenta dodate sterilno vodo in uporabite polovični volumen vzorca DNA vektorja, pufra z ATP za T4 DNA- ligazo in T4 DNA-ligaze. Gojišča, raztopine in pufri: 1. Kit » GeneJET Gel Extraction Kit « - pufri za vezavo, spiranje in elucijo; kolone 2. 3 M Na-acetat (pH 5) 3. 10-kratni pufer z ATP za T4 DNA-ligazo 4. T4 DNA-ligaza 5. Sterilna, 2-krat destiliran voda Material: Pipete in pipetni nastavki, 1,5 ml mikrocentrifugirke, čaša z alkoholom, pinceta, odlagalniki, mešalo, centrifuga, plovci, ledena kopel, vodna kopel 16 °C, vodna kopel 50-60 °C, kuhalnik, lonec, termoblok ali vodna kopel 41 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Vprašanja: 1. Kaj bi naredili, če bi volumen mešanice fragmenta DNA in vektorja presegel 17 µl in če njuna koncentracija v ligacijski mešanici ne bi bila dovolj visoka? 2. Zakaj je potrebno paziti, da volumen T4 DNA ligaze ne presega 1/10 volumna končne ligacijske mešanice? 3. Kaj nam bo povedal rezultat negativne kontrole? 4. Zakaj reakcijo ligacije izvajamo pri 16 °C? 42 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. 8. VAJA Priprava in transformacija kompetentnih celic BL21 (DE3) z ligacijsko mešanico pET21c(+) + OlyA-mCherry Teorija: Transformacija kompetentnih celic je eden izmed načinov vnosa DNA v bakterijske celice. DNA vstopi v celice direktno iz raztopine, kar je razlika od konjugacije ali transdukcije, kjer je DNA del bakterije oz. virusa. Da je transformacija celic čim bolj uspešna, je celice potrebno pripraviti na poseben način, kar poviša učinkovitost vnosa DNA v celice. Za pripravo kompetentnih celic – to je celic, ki so v takem fiziološkem stanju, da so sposobne sprejemati tujo DNA z učinkovitostjo 107 do 109 celic na µg DNA v raztopini – je pomembno tudi, da je bakterijska kultura v zgodnji logaritemski fazi rasti. Postopek, ki ga bomo uporabili pri 8. vaji temelji na inkubaciji celic v CaCl2 in hitrem zamrzovanju. Oba koraka v postopku povečata prepustnost bakterijske celične stene in membrane. Med samim postopkom transformacije še enkrat izpostavimo bakterijske celice temperaturnemu šoku v prisotnosti plazmidne DNA (18– 20). Bakterijski sev: BL21 (DE3) Genotip: B F– ompT gal dcm lon hsdS – – B( rB mB ) λ(DE3 [ lacI lacUV5- T7p07 ind1 sam7 nin5]) [ malB+]K-12(λS) DNA: ligacijska mešanica pET21c(+) + OlyA-mCherry Slika 9: Shema transformacije in selekcije bakterijskih celic povzeto po (21). 43 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. PRIPRAVA KOMPETENTNIH CELIC 1. Dan: 1. S cepilno zanko prenesite bakterijsko kulturo Bl21 (DE3) iz trajnika (-80 °C) na trdno gojišče LB. 2. Dan: 1. S cepilno zanko prenesite 1 bakterijsko kolonijo v 10 ml gojišča LB. Inkubirajte preko noči pri 37 °C v rotacijskem stresalniku pri 180 obratih/min. 3. Dan: 1. Precepite 2 ml prekonočne kulture v 3-krat 100 ml svežega, na 37 °C ogretega LB (za vsak pult ena kultura). Inkubirajte precepljene kulture pri 37 °C v rotacijskem stresalniku pri 180 obratih/min da zrastejo do optične gostote pri 600 nm A600=0,375 (približno 2 uri, kar ustreza koncentraciji 108 bakterij/ml). Pričetek vaje 2. 100 ml kulture prelijte v dve 50 ml centrifugirki in inkubirajte v ledeni kopeli 10 min. 3. Ohlajeni kulturi centrifugirajte 10 min pri 4 °C in 8000 obratih/min. 4. Popolnoma odstranite supernatant in usedlino celic resuspendirajte v 6 ml ohlajenega (0 °C) CaCl2. Inkubirajte v 30 min v ledeni kopeli. 5. Ponovite postopek 3. 6. Popolnoma odstranite supernatant in v vsaki centrifugirki resuspendirajte usedlino celic v 300 µl ohlajenega (0 °C) CaCl2 z 20% glicerolom in shranite v ledeni kopeli. 7. Odpipetirajte 3-krat po 100 µl kompetentnih celic v 3 mikrocentrifugirke in inkubirajte v ledeni kopeli. TRANSFORMACIJA KOMPETENTNIH CELIC 1. Pripravite transformacijsko mešanico v mikrocentrifugirki in sicer zamešajte 10 µl ligacijske mešanice (20-250 ng DNA) in 100 µl pripravljenih kompetentnih celic. Vsaka delovna skupina pripravi tudi dve kontroli in sicer k 100 µl kompetentnih celic dodajte (i) vso kontrolno ligacijsko mešanico, kar je kontrola ligacije in (ii)10 µl sterilne vode, kar je kontrola transformacije. Transformacijsko mešanico inkubirajte v ledeni kopeli 20 minut, nato v vodni kopeli pri 42 °C natančno 90 s. 44 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. 2. Transformacijski mešanici dodajte 200 µl gojišča LB in tako transformirane bakterije inkubirajte 45 min pri 37 °C na rotacijskem stresalniku pri 180 obratih/minuto. 3. Razmažite po 110 µl transformacijske mešanic na plošče LBAp. 4. Kontrola: na ploščo LBAp razmažite 10 µl kompetentnih celic. 5. Vse agrske plošče inkubirajte 24 h pri 37 °C. Gojišča, raztopine in pufri: 1. Gojišče LB: 25 g gojišča Luria-Bertani (Difco) v 1000 ml vode 2. Agarske plošče LB in LBAp 3. 0,1 M raztopina CaCl2 4. 0,1 M raztopina CaCl2 z dodatkom 20% glicerola 5. etanol Material: Pipete (10 ml), 50 ml centrifugirke (6-krat), 4-krat ledena kopel s soljo, mešalo, 1,5 ml mikrocentrifugirke, čaše z etanolom, pipete in pipetni nastavki, odlagalniki, pincete, kopel 42 °C 45 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Vprašanja: 1. Zakaj je potrebno za pripravo kompetentnih celic paziti na fazo rasti bakterijske kulture? 2. Kakšne kontrole transformacije bi še lahko naredili? 3. Kaj vpliva na učinkovitost transformacije? 4. Kako bi pripravil 0,1 M CaCl2 z 20% glicerolom in koncentriranega 87% glicerola? 5. Razložite pojme direktna selekcija, inercijska inaktivacija in α-komplementacija. 46 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. 9. VAJA Izolacija rekombinantnega proteina OlyA-mCherry-His6 Teorija: Ker vsebuje tipična celica E. coli več kot 4000 različnih proteinov, je potrebno rekombinantni protein, ki ga izražamo, učinkovito ločiti od preostalih proteinov in komponent celice. Rekombinantni proteini se tipično proizvajajo kot proteini z N- ali C-terminalnim histidinskim repkom, ki omogoča vezavo rekombinantnih proteinov na Ni2+ ali Co2+ ione, ki so vezani na komercialne agarozne kroglice, na katera sta kationa vezana v obliki kompleksa Ni2+- ali Co2+- NTA. Ko inkubiramo celični lizat s tako pripravljenimi kroglicami, se na kroglice vežejo le rekombinantni proteini, ostali ostanejo prosti v raztopini. Po centrifugiranju v mikrocentrifugirki (mogoča je tudi kolonska izvedba), se kroglice z vezanimi proteini posedejo. Supernatant odpipetiramo in nato dodamo raztopino z imidazolom, ki se kompetitivno veže na Ni2+- ali Co2+ ione, rekombinantni proteini pa posledično izpadejo v raztopino. Po centrifugiranju jih dobimo v topni frakciji, ki jih iz mikrocentrifugirke preprosto odpipetiramo. Bakterijski sev: BL21 (DE3) + pET21c(+) + OlyA-mCherry-His6 Slika 10: Indukcija ekspresije rekombinantnih proteinov z IPTG, povzeto po (22). Slika 11: Interakcija med Ni-NTA-agarozo in histidinskim repkom rekombinantnega proteina (23). 47 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Na delovnih pultih vas čakajo preinducirane kulture, v katerih so rekombinantni proteini že namnoženi. 1. Dan: 2. S cepilno zanko prenesite 1 kolonijo BL21 (DE3) + pET21c(+) + OlyA-mCherry v 10 ml LBAp in inkubirajte preko noči na 37 °C s stresanjem na rotacijskem stresalniku pri 180 obratih/minuto. 2. Dan: 1. Precepite 500 µl kulture v 50 ml svežega in na 37 °C ogretega gojišča. Bakterijsko kulturo inkubirajte pri 37 °C v rotacijskem stresalniku pri 180 obratih/min, dokler optična gostota bakterij pri 600 nm ne doseže 0,5 (2-3 h). 2. Ko je ustrezna optična gostota dosežena dodajte 1 M IPTG, da bo njegova končno koncentracija 1 mM in inkubirajte še 4 h na 37 °C s stresanjem na rotacijskem stresalniku pri 180 obratih/minuto. Pričetek vaje 3. Vsak študent si v 1,5 ml mikrocentrifugirke odpipetira 1,5 ml inducirane kulture. Kulturo centrifugirajte 1 min pri maksimalnem številu obratov. 4. Supernatant popolnoma odstranite z avtomatsko pipeto. 5. Usedlino bakterij resuspendirajte v 1 ml pufra za lizo in inkubiraj na ledu 30 min. 6. Centrifugirajte 10 min pri maksimalnem številu obratov in supernatant prenesite z avtomatsko pipeto v svežo mikrocentrifugirko. 7. V naslednjem koraku supernatantu dodajte 20 µl kroglic NI-NTA, ki jih je predhodno potrebno ustrezno pripraviti. 8. Na delovnem pultu vas čaka 120 µl kroglic Ni-NTA, ki so resuspendirane v etanolu. Kroglice posedite s kratkim centrifugiranjem (2000 obratov/min) in previdno odstranite ves supernatant. 9. Kroglicam dodajte 1 ml pufra A, dobro resuspendirajte in jih posedite s kratkim centrifugiranjem. 10. Odstranite supernatant in ponovi korak 9. 11. Odstranite supernatant in kroglice resuspendirajte v začetnem volumnu (150 µl) pufra A. 48 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. 12. Po 30 minutah inkubacije celic na ledu, vsak posameznik v lizirane celice odpipetira 20 µl kroglic Ni-NTA. 13. Inkubirajte z občasnim obračanjem 10 min pri sobni T. 14. Centrifugirajte (2000 obratov/min) 1 min pri maksimalnem številu obratov. 15. Odstranite supernatant in ponovno dodajte 1 ml pufra A ter inkubirajte 10 min pri sobni temperaturi z občasnim obračanjem. 16. Centrifugirajte 1 min pri 2000 obratov/min. 17. Odstranite supernatant in dodajte 1 ml pufra B. Inkubirajte 10 min z občasnim obračanjem. 18. Centrifugirajte 1 min pri 2000 obratov/min. 19. Odstranite supernatant in dodajte 100 µl pufra C. Inkubirajte 10 min z občasnim obračanjem. 20. Centrifugirajte 1 min pri 2000 obratov/min in supernatant s čistimi rekombinantnimi proteini prenesite v svežo mikrocentrifugirko. 21. Vsi člani enega pulta združijo svoje izolate v eno 1,5 ml mikrocentrifugirko in celotno vsebino prenesejo v dializno črevo. 22. Dializno črevo z rekombinantni proteini postavite v dializno raztopino in ob stalnem mešanju inkubirajte 24 ur, z mešanjem v hladni sobi. 3. Dan: 1. Iz dializne raztopine odstranite dializno vrečko in iz nje odpipetirajte rekombinantne proteine. 2. Rekombinantne proteine centrifugirajte 10 min pri maksimalnem številu obratov. 3. Supernatant prenesite v svežo 1,5 ml mikrocentrifugirko in zamrznite pri -20 °C. Gojišča, raztopine in pufri: 1. LBAp: 10 ml in 50 ml 2. 1M IPTG 3. Kroglice Ni-NTA 4. Pufer za lizo = pufer A + 10 µg/ml DNAza (10 mg/ml) + 20 µg/ml RNAza (10 mg/ml) + proteazni inhibitorji cOmplete + 0,5 mg/ml lizocima (100 mg/ml) 5. Pufer A = 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH =8 6. Pufer B = 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH =8 49 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. 7. Pufer C = 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 300 mM imidazol , pH =8 8. Dializni pufer = 20 mM Tris, pH 8 Material: Led, 1,5 ml mikrocentrifugirke, čaše z etanolom, pipete in pipetni nastavki, odlagalniki, pincete, dializno črevo 50 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Vprašanja: 1. Zakaj je potrebno v pufer za lizo dodati proteazne inhibitorje? 2. Ali je za indukcijo sinteze proteine potrebno dodati IPTG? Analog česa je IPTG in kako deluje? 3. V katerem primeru bi bakterije, ki producirajo rekombinantne proteine, gojili pri 30 °C? 4. Ali bi lahko bakterije, ki producirajo rekombinantni protein, lahko gojili v gojišči brez ampicilina? 51 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. 10. VAJA Elektroforezno ločevanje proteinov (NaDS-PAGE) Teorija: Za elektroforezno ločevanje proteinov se uporablja poliakrilamidne gele (poliakrilamidna gelska elektroforeza – PAGE). V električnem polju proteini potujejo v odvisnosti od velikosti, oblike in lastnega naboja. Če jih želimo ločiti po molekulski masi, jih denaturiramo s kuhanjem v prisotnosti natrijevega doecilsulfata (NaDS). V povprečju se ena molekula NaDS veže na dva aminokislinska ostanka. S tem dobijo vsi proteini enotno število negativnih nabojev glede na število aminokislinskih ostankov in hkrati enotno linearno obliko. Metoda po Laemmliju vključuje pripravo dveh plasti gelov. Zbirali gel je namenjen združevanju vseh proteinov v vzorcu, ki smo ga vnesli v žepek gela, v ozek pas. V ločitvenem gelu pa pride do ločitve proteinov v vzorcu glede na molekulsko maso. Proteine po končani elektroforezi obarvamo z barvilom Comassie modro (24). Slika 12: Shema izdelave sistema za ulivanje poliakrilamidnih gelov. Material: Izoliran OlyA-mCherry-His6 Postopek: Uspešnost izolacije bomo preverili s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS-PAGE), s katero bomo preverili, ali je izoliran OlyA- mCherry prave velikosti (54 kDa). Pripravili bomo 12,5 %-na poliakrilamidni gel za ločevanje proteinov, na katerega bomo nanesli svoje vzorce. V mikrocentrifugirki bomo zamešali 5 µl izoliranih proteinov in 1 µl 6-kratnega nanašalnega pufra ter kuhali 2 min ter nanesli na gel. Reagenti za pripravo poliakrilamidnih gelov so navedeni v Preglednici 7. 52 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Preglednica 7: Reagenti za pripravo dveh poliakrilamidnih gelov. Ločevalni gel Nanašalni gel % poliakrilamida 12% 4% dH2O 3,88 ml 2,65 ml 3 M Tris, pH 8,8 0,94 ml / 0,5 M Tris, pH 6,8 / 1,13 ml 40% akrilamid 2,25 ml 0,45 ml 10% NaDS 0,05 ml 0,045 ml 10% APS 0,375 ml 0,225 ml TEMED 0,0075 ml 0,0045 ml 1. Pri delu s poliakrilamidnimi geli je obvezna uporaba rokavic. Obe elektroforezni stekelci in glavniček je potrebno predhodno očistiti z destilirano vodo in etanolom in nato sestaviti elektroforezni sistem. 2. V mikrocentrifugirko odpipetirajte 5 µl rekombinantnega OlyA-mCherry-His6 in 1 µl 6-kratnega nanašalnega pufra za Na-DS elektroforezo. 3. Kuhajte 5 min in centrifugirajte 1 min pri maksimalnem številu obratov. 4. Na gel nanesite 5 µl vzorca, na gel je potrebno nanesti tudi 5 µl proteinskega standarda. 5. Priključite napetost na 180 mA (elektroforeza traja 45 min). 6. Po končani elektroforezi razstavite elektroforezni sistem in poliakrilamidni gel inkubirajte 5 min v topli destilirani vodi. 7. Poliakrilamidni gel prestavite v barvilo Comassie modro in barvajte 30 min. 8. Po 30 min prestavite poliakrilamidni gel v razbarvalno raztopino in preglejte proteinske lise. Gojišča, raztopine in pufri: 1. 40% suspenzija poliakrilamida 2. 3 M Tris, pH = 8 3. 0,5 M Tris, pH = 6,8 4. 10% Na-DS 5. 10% APS 6. TEMED 7. 6-kratni nanašali pufer za poliakrilamidno elektroforezo 8. Comassie modro 9. Razbravalna raztopina 10. Proteinska lestvica PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa, Thermo Fisher Material: 1,5 mikrocentrifugirke, 4-krat 20 ml čaše, pipete in pipetni nastavki, odlagalniki, 2-posodi za barvanje in razbarvanje gelov, kuhalnik, posoda 53 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Vprašanja: 1. Razložite, zakaj potrebujete posamezne komponente, ki so potrebne za pripravo poliakrilamidnih gelov. 2. Kako bi potovali proteini, če v gelih ne bi bilo prisotnega detergenta Na-DS? 3. Kaj je dvo-dimenzionalna gelska elektroforeza? 54 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. 11. VAJA Priprava suspenzije in ugotavljanje števila bakteriofagov M13 Teorija: Bakteriofag M13 je modelni filamentozni bakteriofag, za katerega je značilno, da celice E. coli okuži preko F konjugativnega pilusa na površini bakterij. Ena izmed njihovih ključnih lastnosti je tudi ta, da virioni ob sproščanju iz gostiteljskih celic, le teh ne lizirajo. Namen vaje je spoznati (i) osnovne značilnosti pri delu z bakteriofagi in (ii) postopke za uporabo bakteriofagnih vektorjev v molekularni biologiji. Prednost bakteriofaga M13 pred ostalimi vektorji je predvsem v tem, da lahko izoliramo njegovo DNA v obliki (i) enoverižne molekule DNA (ssDNA), ki se jo lahko uporabi za določevanje nukleotidnega zaporedja (metoda po Sangerju) ali dvoverižni obliki (dsDNA), ko se virus nahaja v replikativni obliki in ki se v bakterijskih celicah obnaša podobno kot plazmidna DNA. V praksi to pomeni, da lahko dvoverižno obliko njegove molekule DNA lahko uporabimo kot vektor za kloniranje (25). Število bakteriofagov določamo na tak način, da bakteriofage redčimo in tako izoliramo posamezne plake fagov. S posamičnim plakom v nadaljevanju lahko okužimo bakterijsko kulturo in pripravimo čisto kulturo posameznega faga. Bakterijski sev: E. coli TG1 in TG1/M13 Genotip: supE hsd∆5 thi-1 ∆(lac-proAB) ∆(mcrB-hsdSM)5 (rK–mK–)/ F´ traD36 proAB lacI lacZ ∆M15 (za bakteriofag M13 – α-komplementacija) Bakteriofag: 7,25 kb enoverižna krožna DNA (α-komplementacija) Slika 13: Življenjski cikel bakteriofaga M13. Povzeto po (26). 55 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Postopek: Vaja bo razdeljena v 4 termine. V prvem terminu (ponedeljek) bo vsaka od štirih skupin inficirala kulturo TG1 in pripravila indikatorsko kulturo. V drugem terminu (torek) bo vsaka od štirih skupin iz inficirane in indikatorske kulture pripravila plošče mehkega agarja za ugotavljanje števila fagov/ml, kar bomo določali v sredo, hkrati pa bomo izolirali tudi enoverižno DNA bakteriofaga M13. V tretjem terminu (sreda) bo vsaka od skupin preračunala število bakteriofagov/ml iz torkove kulture. Hkrati bomo v prvi sredini skupini ponovno inficirali indikatorsko kulturo TG1 in preko celotnega sredinega termina spremljali rast neinficirane in inficirane kulture ter določili njun generacijski čas. 1. Dan: 1. S cepilno zanko prenesite bakterijski kulturi TG1 in TG1/M13 iz trajnika (-80 °C) na minimalno trdno gojišče M9 s tiaminom. 2. Dan: 1. Precepite (i) eno kolonijo bakterije TG1 in (ii) eno kolonijo bakterije TG1 inficirane z M13 (TG1/M13) v erlenmajerici s 50 ml gojišča LB. Inkubirajte 5 – 8 ur pri 37 °C v rotacijskem stresalniku pri 180 obratih/min. 2. Po 5 – 8 urah razmnoževanja fagov (iz kulture TG1/M13) suspenzija fagov vsebuje do 1012 delcev/ml. Razredčite kulturo TG1/M13 in pripravite redčine 10-4, 10-5, 10-6. 3. V 3 epruvete po 3 ml odpipetirajte po 3 ml raztopljenega in do 48 °C ohlajenega mehkega agarja LB. V vsako epruveto dodajte po 200 µl indikatorske kulture TG1 in po 100 µl posamezne razredčine kulture TG1/M13. 4. Premešajte in razlijte po celi površini predgrete (37 °C) plošče hranilnega agarja LB. Ko se mehki agar strdi, obrnite plošče in jih preko noči inkubirajte na 37 °C. 5. Asistent ponovno precepi eno kolonijo bakterije TG1 iz gojišča M9 s tiaminom v erlenmajerico s 50 ml gojišča LB. Inkubirajte preko noči pri 37 °C v rotacijskem stresalniku pri 180 obratih/min. 3. Dan: Pričetek vaje PRIPRAVA SUSPENZIJE BAKTERIOFAGA M13 1. Člani vsakega delovnega pulta precepijo 0,1 ml kulture TG1 v 10 ml svežega, na 37 °C ogretega gojišča LB. Premešajte in odpipetirajte 5 ml precepljene kulture v novo sterilno epruveto. V epruveto s precepljeno kulturo resuspendirajte 1 plak 56 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. bakteriofaga M13 – z nastavkom avtomatske pipete posrkajte plak in ga prenesite v epruveto s kulturo TG1 (1 plak vsebuje 106 – 108 fagov). Pripravite suspenzijo izbranih fagov, tako da inkubirate kulturo s plaki pri 37 C v rotacijskem stresalniku pri 180 obratih/min, približno 5 ur. 2. Po 5 urah bo asistent odpipetiral 1,5 ml inficirane kulture in jo centrifugiral 5 min pri maksimalnem številu obratov. Asistent bo odpipetiral 1 ml suspenzije fagov, ki bodo počakali na ledu do naslednjega dne. 3. Asistent ponovno precepi eno kolonijo bakterije TG1 iz gojišča M9 s tiaminom v erlenmajerico s 50 ml gojišča LB. Inkubiraj preko noči pri 37 °C v rotacijskem stresalniku pri 250 obratih/min. 4. Vsak študent si zato pripravi in označi po dve 1,5 ml mikrocentrifugirki. 4. Dan: UGOTAVLJANJE ŠTEVILA BAKTERIOFAGOV M13 V SUSPENZIJI 1. Člane vsakega delovnega pulta čaka na ledu 1 ml suspenzije fagov M13, ki ste jih namnoževali v prejšnji dan. 2. Vsak član delovnega pulta si odpipetira 20 µl supernatanta in ga prenese v svežo 1,5 ml mikrocentrifugirko iz katere boste naslednji dan izolirali enoverižno DNA. 3. Za določanje števila bakteriofagov M13 v 1 ml suspenzije je potrebno raztopiti mehki agar in ga prestaviti v vodno kopel s temperaturo 48-50 °C. Za vsakega študenta bodo na voljo 1 epruveta z mehkim agarjem. 4. Število bakteriofagov v suspenziji je od 1010 – 1012 fagov/ml. Vsak delovni pult pripravi redčine 10-8, 10-9 in 10-10, suspenzije bakteriofaga M13. Če vas je za delovnim pultom več, pripravite še 1 nižjo in eno višjo redčitev od predvidenih treh. 5. V vsako od epruvet raztopljenega in do 48 °C ohlajenega mehkega agarja LB dodajte po 200 µl indikatorske kulture TG1 in po 100 µl posamezne razredčine kulture TG1/M13. 6. Premešajte in razlijte po celi površini predgrete (37 °C) plošče hranilnega agarja LB. Ko se mehki agar strdi, obrnite plošče in jih preko noči inkubirajte na 37 °C. 7. Asistent ponovno precepi eno kolonijo bakterije TG1 iz gojišča M9 s tiaminom v erlenmajerico s 50 ml gojišča LB. Inkubirajte preko noči pri 37 °C v rotacijskem stresalniku pri 180 obratih/min. 57 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. 5. Dan: PRIPRAVA AGAROZNEGA GELA IN AGAROZNA ELEKTROFOREZA Uspešnost izolacije enoverižne DNA faga M13 boste preverili z agarozno gelsko elektroforezo na 0,8% agaroznem gelu z 0,5-kratnim pufrom TBE, ki mu dodate barvilo etidijev bromid. En študent iz skupine pripravi 0,8% agarozni gel. 1. Pri pripravi agaroznih gelov je nujno potrebna uporaba rokavic! V erlenmajerici pripravi 40 ml 0,5-kratni elektroforeznega pufra TBE. Dodajte ustrezno količino agaroze za pripravo 0,8% gela. Raztopite agarozo ob segrevanju v mikrovalovni pečici. Erlenmajerica naj bo v mikrovalovni pečici toliko časa, da se agaroza popolnoma raztopi. 2. Ohladite raztopino agaroze pod tekoče hladno vodo. 3. Medtem, ko se erlenmajerica z raztopljenim gelom ohlaja, pripravite nosilec za gel s primernima glavničkoma. Nekoliko ohlajeni agarozi dodajte 1 µl etidijevega bromida (10 mg/ml) v končni koncentraciji 0,5 µg/ml in jo zlijte v nosilec. Dobro premešajte in razlijte agarozo po nosilcu za gel. Po 30 – 45 minutah je gel strjen. Obvezno delajte z rokavicami, ki jih po razlitju gela zamenjajte. 4. Po 30 – 45 min prenesite agarozni gel v elektroforezno kadičko in vanje nalijte 400 ml 0,5-kratnega pufer TBE in iz njega odstranite glavnik. Gel mora biti prekrit s pufrom. Zamenjajte rokavice. 5. Ostali študenti 20 µl suspenzije fagov M13, ki vsebujejo enoverižno DNA dodajo 1 µl 2% NaDS, premešajo na mešalu in inkubirajo v vodni kopeli pri 65 °C 5 min. 6. Po inkubaciji dodajte vzorcu 5 µl 6-kratnega elektroforeznega nanašalnega pufra, premešajte in 5 µl vzorca vnesite v jamico 0,8% agaroznega gela. Poleg vzorcev vnesite tudi 4 µl standardne DNA. 7. Priključite na vir napetosti na 100 V in izvedite elektroforezo (30 - 45 min). Po elektroforezi osvetlite gel osvetlite z UV transiluminatorjem (G-Box Chemi, Syngene) in ga fotografirajte. UGOTAVLJANJE ŠTEVILA BAKTERIOFAGOV M13 V SUSPENZIJI (NADALJEVANJE) 1. Člani vsakega delovnega pulta preštejejo plake na posameznih ploščah in ugotovijo število fagov/ml, ki so jih pripravil v 1. dnevu vaje, pri čemer upoštevajo faktor redčenja in dejstvo, da so števne plošče tiste, ki vsebujejo 30 – 300 plakov. 58 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. DOLOČEVANJE GENERACIJSKEGA ČASA KULTURE TG1 IN KULTURE TG1, OKUŽENE S FAGOM M13 1. Prva skupina precepi 0,5 ml kulture TG1 v dve erlenmajerici, v katerih je 50 ml gojišča LB. Bakterijski kulturi gojimo pri 37 °C v rotacijskem stresalniku 180 obratih/min in vsako uro pomerimo optično gostoto OD600 pri 600 nm. 2. Ko optična gostot OD600 doseže vrednost 0,5, v eno izmed erlenmajeric resuspendiramo 1 plak in nato optično gostoto spremljamo do konca vaj. Študentje si boste po koncu vaj izmenjajo meritve in iz podatkov optične gostote izračunali generacijski čas v eksponentni fazi rasti celic inficirane in neinficirane kulture. V tabeli označi tudi čas, ob katerem bomo eni izmed kultur dodali plak. Tabela 8: Čas gojenja in optična gostote inficirane in neinficirane kulture TG1. Čas Optična gostota OD600 Optična gostota OD600 neinficirane kulture TG1 neinficirane kulture TG1 Gojišča, raztopine in pufri: 1. Minimalne agarske plošče M9 – za 1000 ml: 6 g NaH2PO4, 3 g KH2PO4, 1 g NH4Cl, 0,5 g NaCl, 10 ml 0,01 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4, 20 ml 20% glukoze, 15 g agarja Tiamin – (50 mM) v gojišču 0,1 mM 2. Gojišče LB: 25 g gojišča Luria-Bertani (Difco) do 1000 ml vode 3. Mehki agar LB (LB top – soft agar): 25 g gojišča Lauria Bertani (Difco), 7 g agarja do 1000 ml vode 4. Agarske plošče LB: 25 g gojišča Luria-Bertani (Difco), 15 g agarja do 1000 ml vode 5. 2% NaDS 6. 0,8% agaroza v 0,5-krantem TBE 59 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. 7. 5-kratni TBE – Tris-boratni elektroforezni pufer; 0,45 M Tris-borat (54 g Tris, 27,5 g borove kisline), 10 mM EDTA (pH 8) 8. Etidijev bromid – 10 mg/ml 9. 6-kratni nanašalni pufer – 0,25% raztopina bromfenol modro, 0,25% raztopina ksilen cinaol, 40% saharoza (w/v) 10. DNA lestvici Gene Ruler 1 kb DNA ladder Material: Pipete (10 ml), termo blok (48 °C), steklene epruvete s kovinskim zamaškom, 1,5 ml mikrocentrifugirke, pipete in pipetni nastavki, erlenmajerice (150 ml in 500 ml), valj (100 in 500 ml), led, parafilm, električni napajalnik, elektroforezna banjica, nosilec za gel, glavnik (15 zob), mizica z libelo, centrifuga, odlagalniki, rokavice 60 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Vprašanja: 1. Zakaj moramo pri večini bakteriofagov (npr. pri λ, a ne pri M13) paziti na čas inkubacije fagov z bakterijami pred razlitjem na plošče? 2. Zakaj uporabljamo za infekcijo z M13 bakterije TG1, ki so zrasle na ploščah z minimalnim gojiščem M9 s tiaminom? 3. Zakaj uporabljamo pri delu z bakteriofagi preliv z mehkim agarjem? 4. Ali lahko pri nasičeni bakterijski kulturi TG1 opazimo okužbo s fagom M13? Razložite! 61 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. 5. Kaj pričakujete, če bi primerjali potovanje enoverižne in dvoverižne DNA faga M13? Razloži! 6. Zakaj dodamo, če želimo izolirati dvoverižno obliko DNA faga M13, v kulturo TG1/M13 antibiotik kloramfenikol? 62 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Priloge: Slika 14: Ekspresijski vektor pET21c(+). 63 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Slika 15: Ekspresijski vektor pET21c(+) z vstavljenim zaporedjem za OlyA. 64 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Slika 16: Ekspresijski vektor pET21c(+) z vstavljenim zaporedjem za OlyA-mCherry. 65 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Slika 17: Standardna DNA lestvica: Gene Ruler 1 kb DNA ladder. 66 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Slika 18: Navodila proizvajalca za uporabo restrikcijskih encimov. 67 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Slika 19: Standardna proteinska lestvica: PageRuler Prestained Protein Ladder. 68 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. Literatura: 1. Del Sal G, Manfioletti G, Schneider C. A one-tube plasmid DNA mini-preparation suitable for sequencing. Nucleic Acids Res. 1988 Oct 25;16(20):9878. 2. Gopal GJ, Kumar A. Strategies for the Production of Recombinant Protein in Escherichia coli. Protein J. 2013 Aug;32(6):419–25. 3.XXhttps://www.google.com/search?q=ctab&rlz=1C1GCEU_enSI822SI822&source=lnms &tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwiyr4SQsfffAhWbDmMBHcGGAnsQ_AUIDigB&bi w=1920&bih=969#imgrc=-skodchwc8toBM: 4.XXhttps://www.google.com/search?q=triton+x+100&rlz=1C1GCEU_enSI822SI822&sour ce=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwjD8farsfffAhUJkhQKHUj4DwQQ_AUIDig B&biw=1920&bih=969#imgrc=rV_9L0Y8D1cYGM: 5. Koonin EV, Wolf YI. Genomics of bacteria and archaea: the emerging dynamic view of the prokaryotic world. Nucleic Acids Res. 2008 Dec;36(21):6688–719. 6. Tan SC, Yiap BC. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present. J Biomed Biotechnol 2009. 7. https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Lysozyme&oldid=872356584 8. Defence Mechanisms and Innate Immunity. Biology Discussion. 2016. 9. Stellwagen NC. Electrophoresis of DNA in agarose gels, polyacrylamide gels and in free solution. Electrophoresis. 2009 Jun;30(Suppl 1):S188–95. 10. Garibyan L, Avashia N. Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR). J Invest Dermatol. 2013 Mar;133(3):e6. 11. Coney R. Polymerase Chain Reaction: The Past, Present and Future [Internet]. xxpresspcr. 2017. 12. Rosano GL, Ceccarelli EA. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Front Microbiol 2014. 13. Kaur J, Kumar A, Kaur J. Strategies for optimization of heterologous protein expression in E. coli: Roadblocks and reinforcements. Int J Biol Macromol. 2018 Jan 1;106:803– 22. 14. Pingoud A, Fuxreiter M, Pingoud V, Wende W. Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. Cell Mol Life Sci. 2005 Mar;62(6):685–707. 15. https://socratic.org/questions/how-are-restriction-and-dna-ligase-enzymes-used-to- insert-a-foreign-gene-into-a- 16. https://www.thermofisher.com/document-connect/document- connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS- Assets/LSG/manuals/MAN0012657_Silica_Bead_DNA_Gel_Extraction_UG.pdf 69 MOLEKULARNA BIOLOGIJA (GRADIVO ZA VAJE), 2019. 17. Different types of commercially available DNA gel extraction kit 18. Yoshida N, Sato M. Plasmid uptake by bacteria: a comparison of methods and efficiencies. Appl Microbiol Biotechnol. 2009 May 27;83(5):791. 19. Asif A, Mohsin H, Tanvir R, Rehman Y. Revisiting the Mechanisms Involved in Calcium Chloride Induced Bacterial Transformation. Front Microbiol 2017. 20. Chan W-T, Verma CS, Lane DP, Gan SK-E. A comparison and optimization of methods and factors affecting the transformation of Escherichia coli. Biosci Rep 21. from: https://da.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-cloning- tutorial/a/bacterial-transformation-selection 22.Xhttps://www.google.com/search?rlz=1C1GCEU_enSI822SI822&biw=1920&bih=920&t bm=isch&sa=1&ei=W95BXMvzJ7CRrgTo46qADw&q=pET+expression+system&oq= pET+expression+system&gs_l=img.3..0i19j0i8i30i19.70697.75101..75372...0.0..0.92.1 551.21......1....1..gws-wiz- img.......35i39j0i67j0j0i30j0i30i19.Z9Oi6XVOVzs#imgrc=9uLdyoUoSM3nzM: 23. http://ouopentextbooks.org/biochemical-methods/lab-8/ 24. Smith BJ. SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. In: Walker JM, editor. Basic Protein and Peptide Protocols. Totowa, NJ: Humana Press; 1994. p. 23–34. (Methods in Molecular BiologyTM). 25. Endō I, Nagamune T, Akita H, editors. Nano/micro biotechnology. Berlin ; New York: Springer; 2010. 270 p. (Advances in biochemical engineering/biotechnology). 26. http://what-when-how.com/molecular-biology/m13-phage-molecular-biology/ 70