Svetloba, radikali in fotodinamiona terapija Svetloba, radikali in fotodinamiona terapija Razoirjen povzetek predavanja na simpoziju: Fotobiologija in bolezni ven Slavko Pečar 1 Svetloba in nastajanje reaktivnih snovi v koai Svetloba je elektromagnetno valovanje, katerega energijo opioemo bodisi z valovno dolaino (X) ali s frekvenco (v). Energija (E) fotona svetlobe je opredeljena z enaobo: E = hv ali E= hc/A,, kje je h Planckova konstanta (6,62 x 10-34Js) in c hitrost svetlobe v vakuumu (c=2,997 x 108 m/s). Fotoni svetlobe ali krajoe svetloba se na povroini koae lahko odbije, lahko se v koai absorbira ali pa potuje skozi koao. Kateri dogodek je prevladujoo je odvisno od valovne dolaine (X) svetlobe in od lastnosti koae. Elektromagnetna valovanje s kratkimi valovnimi dolainami (fotoni z visoko energijo) prodirajo v in skozi koao, valovanja z dolgimi valovnimi dolainami pa se odbijajo in le deloma absorbirajo. V tem prispevku se bomo omejili le na ozek del spektra elektromagnetnega valovanja: na svetlobo z valovnimi dolainami med 200 nm in 700 nm. To podrooje razdelimo na podrooje ultravijolione (UV) svetlobe (od 200 do 400 nm) in na podrooje vidne svetlobe (od 400 (vijoliona) do 700 (rdeoa) nm). Samo UV podrooje oe naprej delimo na UVA (400 - 320 nm), UVB (320 - 280 nm) in UVC podrooje (280 -200 nm). Fotoni UVA svetlobe imajo energijo: 71 - 89 kcal/mol, UVB: 89 - 101 kcal/mol in UVC: 101 - 141 kcal/mol. Navedene energije UV svetlobe postanejo pomembne ob dejstvu, da so energetske vrednosti enojnih kovalentnih vezi veoine organskih spojin v obmooju: 70 - 105 kcal/mol. To pomeni, da imajo UV fotoni, oe zlasti UVB in UVC, dovolj energije, da prekinjajo kovalentne vezi v molekulah vode, proteinov, lipidov, nukleinskih kislin ali v drugih sestavinah koae. UV svetloba v koai povzrooa biokemione pookodbe zaradi nastajanja radikalov in poslediono najrazlionejoih sekundarnih, vendar oe vedno kemiono reaktivnih spojin. Poleg takojonje vnetne reakcije so nadaljnje posledice delovanja UV svetlobe na koao lahko zelo razlione: od pospeoenega staranja do mutacij in nastajanja rakavih celic v koai (1). Fotoni vidne svetlobe imajo manj energije: od 71 kcal/mol (vijoliona svetloba) do 40 kcal/mol (rdeoa svetloba). Vidna svetloba pri veoin organskih spojin ne more neposredno prekiniti enojne vezi, lahko pa po absorpciji povzrooa prehod posameznih komponent v koai v razliona vzbujena stanja. Lep dokaz za vpliv svetlobe na aivo snov je fotosinteza v zelenih rastlinah in proces gledanja pri aivalih. V veoini primerov absorpcija vidne svetlobe nima okodljivih posledic, ker se veoina absorbirane svetlobe pretvori v toplotno energijo. Samo v posebnih pogojih se lahko lahko zgodi, da tudi vidna svetloba lahko povzrooa lokalne okvare, kar z uspehom izkoriooajo pri fotodinamioni terapiji 2 Radikali in singletni kisik (2,5) Homolitska cepitev /1/ kovalentne vezi (skupen elektronski par), ki jo povzrooi foton UV svetlobe z ustrezno energijo, vodi v nastanek radikalskega para, od katerih ima vsak fragment po en (nesparjen) elektron A - B + UV-svetloba -»A• + •B /1/ Atomi, ioni, molekule in kompleksi, ki imajo vsaj en nesparjen elektron se imenujejo radikali (angleoko: free radical). Stanje snovi z nesparjenim elektronom je neobioajno, kemiono reaktivno in zaradi tega kratkoaivo. Radikal poskuoa manjkajooi elektron pridobiti iz svoje okolice. Omenjena teanja se uresniouje v treh tipih kemionih reakcij znaoilnih za radikale: 1. odvzem vodikovega atoma /2/ neradikalski spojini, ki jo sreoa radikal. Pri tem nastane nov radikal. Tovrstne reakcije postopoma pripeljejo do vse stabilnejoih radikalov: R + R1-H -> R-H + R1 /2/ 2. adicija radikala /3/ na dvojno vez. Tudi pri tej reakciji nastane nov radikal: R• + CH2=CH-R1 -» R-CH2-CH•-R1 /3/ 3. Sreoanje in reagiranje dveh radikalov - obratna reakcija nastajanju radikalskega para - povzrooi nastanek neradikalske spojine /4/, ki v veoini primerov ni veo kemiono reaktivna: A• + •B -» A-B /4/ Na tem mestu moramo v radikalske reakcije vpeljati oe kisik (O2), ki je sicer normalna sestavina atmosfere in ki se v razlionih koncentracijah pojavlja tudi v tkivih. Koaa je v primerjavi z drugimi tkivi v nekoliko posebni situaciji, ker je na svoji povroini izpostavljena kar atmosferski koncentraciji kisika (21%), ki difundira tudi v globje plasti koae, v spodnjih plasteh pa je oksigenacija odvisna tudi od prekrvavitve. V molekuli kisika je energetsko ugodnejoa takona razporeditev elektronov, da sta v molekuli dva nesparjena elektrona (biradikal) s spinom usmerjenim v isto smer. Stanje, kjer sta elektrona v paru pa je energetsko bogatejoe. Molekuli kisika z dvema nesparjenima elektronoma pravimo tudi tripletni kisik (3O2) za razliko od kisika, ki ima vse elektrone v parih in ga imenujemo singletni (1O2) kisik. Singletnega kisika obioajno ni, nastaja le v posebnih pogojih in po razlionih poteh Zaradi razlione razporeditve in orientacije spinov se 3O2 in 1O2 moono prof. dr. Slavko Pečar, UL, Fakuteta za farmacijo, Aškerčeva 7, Ljubljana, pecars@ffa.uni-lj.si farm vestn 2008; 59 135 Pregledni znanstveni olanki - Review Scientific Articles razlikujeta tako v kemični reaktivnosti kot v samih reakcijah v katere sta vpletena. Pri reakcijah oksidacije se kisik spaja z najrazličnejšimi snovmi Nastajajo nove kovalentne vezi, ki so pravzaprav novi pari elektronov z nasprotnim spinom. V primeru 302 je nastanek kovalentne vezi povezan z obratom spina elektrona. Ker je ta proces malo verjeten obrat spina preprečuje (spinska restrikcija), da bi se 302 brez težav spajal z različnimi organskimi spojinami. To je tudi glavni razlog, da kljub relativno visoki koncentraciji kisika v atmosferei, v tej atmosferi živijo bitja sestavljena iz organskih snovi, ki se samo pod določenimi pogoji lahko oksidirajo. V primeru 102 ni spinske restrikcije, ki bi preprečevala 102 spajanje z drugimi snovmi in 102 lahko brez težav reagira z organskimi spojinami. Tripletni kisik brez ustrezne aktivacije težko reagira z organskimi pojinami v singletnem stanju. Čisto drugače je, če se 302 sreča z radikalom. V tem primeru ni spinske restrikcije in reakcija radikala s 302 /5/ je zelo hitra. Ker se 302 obnaša kot biradikal, nastane v smislu reakcije /4/ peroksilni radikal /5/, ki vstopa v nadaljne pretvorbe /6/ in /7/: A* + 302 -» A-O-O* /5/ A-O-O* + R-H -» A-O-O-H + R* /6/ R* + 302 -» R-O-O* itd. /7/ Vidimo, da je teoretično dovolj že en sam radikal, da se sproži radikalska reakcija oksidacije. UV fotoni (reakcija /1/) zagotove radikale za sprožitev oksidacije, ki se nadaljuje in širi zaradi biradikalske narave 302. Obseg in vrsta poškodb je odvisna od sposobnosti posameznih plasti kože, kako učinkovito in kako hitro lahko nastale radikale odstrani. Če omenjeni proces oksidacije poteka v celični membrani, govorimo o lipidni peroksidaciji. Končni produkti lipidne peroksidacije so različn aldehidi in dialdehidi (malon dialdehid), ketoni, alkoholi, alkani, alkeni, epoksidi, itd in posledična sprememba ali porušitev membranske strukture. Za nekatere od teh produktov so ugotovili (nenasičen aldehidi, malon dialdehid itd.), da so mutageni in tudi kancerogeni Pri izpostavljanju kože UV sevanju nastajajo primarni radikali naključno in povsod tam, kjer UV foton homolitsko prekine kovalentno vez. Reakcije oksidacije s 302 lahko potekajo ne samo v membrani, kjer je koncetracija kisika največja, ampak tudi v jedru (poškodbe DNK molekule, mutacije, kancerogenost) ali kjerkoli drugje v celicah kože. Z UV svetlobo povzročeno nastajanje radikalov je v koži uvod v oksidacijo sestavin celic z najrazličnejšimi končnimi razpleti. Premik ravnotežja redoks reakcij v smeri oksidativnih procesov imenujemo oksidativni stres. Oksidativni stres sproži na eni strani bodisi nenadna pojava radikalov (UV obsevanje) ali povečanje koncentracije reaktivnih kisikovih (ROS) oziroma dušikovih (RNS) zvrsti. Med ROS in RNS uvrščajo tako radikale kot spojine, ki so bodisi nastale iz radikalov in so kemično še reaktivne, oziroma pod določenimi pogoji lahko iz njih nastanejo novi radikali. Tipični predstavniki ROS so: • radikali: superoksid (02*~), hidroksil (HO*), peroksil (ROO*); hidroperoksil (HOO*), alkoksil (RO*): • neradikalske spojine: vodikov peroksid (H202), hipoklorid (CIO-), 102, peroksinitrit (ONOO-), ozon (03), itd. 136 farm vestn 2008; 59 in RNS: • radikali: dušikov oksid f NO), dušikov dioksid (*N02) • neradikalske spojine: peroksinitrit (ONOO"), didušikov trioksid (N203), didušikov tetraoksid (N204), nitrozil kation (ON+), nitrozil anion (ON"), itd. Do oksidativnega stresa pride tudi, če se zmanjša celična zaščita, ki sloni na antioksidantih (2,6). Ti po različnih mehanizmih in na različnih ravneh preprečujejo oksidativni stres oziroma skrbijo, da ostaja koncentracija posameznih predstavnikov ROS in RNS na obvladljivi ravni. V primeru obsevanja kože z UV svetlobo nastali radikali sprožijo oksidativni stres, ki je intenzivnejši ter obsežnejši tudi zaradi neposrednih in škodljivih vplivov UV svetlobe na encime, ki so nosilci antioksidativnega delovanja v celici. Ko je proces lipidne peroksidacije v razmahu (verižna radikalska reakcija) začne kemično nastajati še 102 predvsem v reakciji med dvema peroksilnima radikaloma: R.,-0-0* + *0-0-R2 -» R^O-O-Rj + 102 /8/ Neugodna situacija (radikalsko sprožene oksidacije) se s pojavom 102 še poslabša. Nastali 102 ne potrebuje več »radikalske« aktivacije ampak oksidira celične sestavine v svoji neposredni okolici po neradikalskih poteh. Primarno nastajajo hidroperoksidi in ciklični endoperoksidi (Slika 1). Oboji se lahko ob prisotnosti ionov železa ali bakra (Fe2+, Cu+) pretvorijo v hidroksilne in alkoksilne radikale, ki sprožijo nov val oksidacij s 302. A B Slika 1. Oksidacija s 1O2 do ciklionega endoperoksida (A) in hidroperoksida (B) Vsako nenadzorovano nastajanje radikalov v koži, ki preseže celično antioksidativno kapaciteto, pahne celico v oksidativni stres, kjer potekajo najprej radikalske reakcije s 302, v kasnejši fazi pa se v oksidacije vmeša tudi 102. Od množine absorbirane UV svetlobe je odvisno, kakšen obseg biokemičnih poškodb bo UV svetloba povzročila. Koža je v evolucijskem razvoju razvila mnoge obrambne sisteme (pigmentacija, antioksidanti) pred UV sevanjem in čeprav človeštvo proizvaja zaščitne pripravke, ki UV svetlobi preprečijo prodor v živa področja kože, se ljudje še premalo zavedamo vseh nevarnosti pri izpostavljanju kože UV sevanjem. 3 Fotodinamiona terapija (7, 8) Singletni kisik nastaja v celici po različnih poteh. Poleg nastajanja iz peroksilnih radikalov /8/ je pomembno še fotokemično nastajanje, kjer se v proces vključi posrednik: fotosenzibilizator. Vidna svetloba (400 do 700 nm) lahko po absorpciji v snovi povzroča prehod molekul v različna vzbujena stanja. Ponavadi se iz vzbujenega stanja molekula vrne v osnovno stanje z izsevanjem fotona svetlobe (fluorescenca) ali pa se energija vzbujenega stanja pretvori v toploto. V nekaterih posebnih primerih se energije vzbujenega stanja lahko uporabi za obrat enega izmed spinov eletronov. Slednje se v različnem obsegu dogaja pri spojinah, ki jih imenujemo fotosenzibilizatorji. Iz osnovnega Svetloba, radikali in fotodinamiona terapija singletnega stanja molekula fotosenzibilizatorja po absorpciji vidne svetlobe preide v vzbujeno stanje, to stanje pa lahko preide v osnovno tripletno stanje, ki je stabilneše in se počasneje vrača (fosforescenca) nazaj. Obstaja pa še možnost, da fotosenzibilizator v tripletnem stanju izmenja usmeritve spinov z okolišnim 302 pri čemer nastane 102 in molekula fotosenzibilizatorja v osnovnem singletnem stanju (Shema 1). Fotokemično nastajanje 102 si predstavljamo kot proces, ki poteka v treh stopnjah: 1. fotoekscitacija B B(T4-) + hv <-> B*(T4-) 2. prehod B v tripletno stanje B*(T4-) -» B*(TT) 3. rakcija s 302 B*(TT) + 302 (4-4-) -» B(T4-) + 102 (4-T) Shema 1. Fotokemiono nastajanje singletnega kisika (1O2), kjer je B fotosenzibilizator, B* vzbujeno stanje fotosenzibilizatorja, TJ. je singletno stanje, in TT tripletno stanje. Vidna svetloba lahko ob posredovanju molekule fotosenzibilizatorja preskrbi dovolj energije (22,5 kcal/mol), ki je potrebna za obrat spina elektrona tripletnega kisika in prehod v singletno stanje, ki je pri kisiku (izjema) energetsko višje kot tripletno stanje. Če v topilu raztopimo fotosenzibilizator in tako raztopino obsevamo z vidno svetlobo, potem bo v raztopini fotokemično nastajal 102. Ugotovili so, da v tkivu molekula 102 zaradi velike reaktivnosti zreagira z okolišnimi organskmi snovmi v kroglici s polmerom 0,1 mm od mesta svojega nastanka. Fotokemično nastajanja 102 in njegova velika kemična reaktivnost sta osnova za fotodinamično terapijo, ki izkorišča možnost lokaliziranega nastajanja 102 za doseganje terapevtskega učinka. Nastali 102 namreč poškoduje samo molekule v neposredni bližini svojega nastanka, kar pomeni, da lahko z usmerjenim obsevanjem pričakujemo zelo lokalizirane učinke. Znani so številni fotosenzibilizatorji za lokalno ali sistemsko aplikacijo. Po aplikaciji fotosenzibilizatorja z lokaliziranim obsevanjem z ozkimi snopi koherentne (laserske) ali nekoherentne svetlobe dosežemo nastajanje 102 samo v tanki plasti področja obsevanja in s tem zelo lokalizirane učinke. Današnja fotodinamična terapija je primerna za posege na koži in sluznicah povsod tam, kjer je možna osvetlitev z žarki svetlobe iz vidnega področja spektra. Pogoj za uspešnost fotodinamične terapije je zadostna prisotnost 302 v tkivu. Uspeh je nadalje odvisen od uporabljenega fotosenzibilizatorja in od svetlobnega vira. Fotosenzibilizator mora biti farmakološko inertna spojina z ustezno farmakokinetiko, porazdeljevanjem po tarčnih tkivih in s primerno visokim izkoristkom tvorbe 102. Zelo pomembna lastnost fotosenzibilizatorja je, da absorbira svetlobo v področju valovnih dolžin, ki jih tkivo ne absorbira. Temu morajo biti prilagojeni tudi viri svetlobe Slika 2. Struktura fotosenzibilizatorja protoporfirina IX tako po valovni dolžini, kot po možnosti obsevanja samo določenih predelov kože ali sluznice. Največ se uporabljajo laserski viri koherentne svetlobe z valovno dolžino iz vidnega območja (valovne dolžine nad 600 nm) in z močjo od 1 do 4 W. Taka svetloba prodira v tkivo nekaj mm globoko in pozroča nastajanje 102. V uporabni je več fotosenzibilizatorjev, razvijajo pa številne nove z boljšimi lastnostmi. Najpogostejši so derivati porfirina. Uporabljajo pa tudi 5-aminolevulinsko kislino, ki sama sicer ni fotosenzibilizator, vendar celica lahko iz nje sintetizira protoporfirin IX (Slika 2), ki po osvetlitvi pretvarja 302 v 102. Trenutno se s fotodinamično terapijo zdravijo vsa tista lokalizirana rakava in druga obolenja kože ter sluznic, ki jih lahko dosežemo z sistemi za obsevanje z vidno svetlobo. Izkorišča se tudi protibakterijski učinek 102, še zlasti v dentalni medicini 4 Zakljuoek UV in vidna svetloba povzročata v koži različne učinke. UV svetloba je energetsko dovolj bogata, da povzroči nastanek radikalov na posameznih sestavinah celic kože. Primarni radikali sprožijo oksidativne procese in s tem pojav oksidativnega stresa, ki v koži v procesih lipidne peroksidacije, poškodbe proteinov in nukleinskih kislin vodi bodisi v pospešeno staranje, v degenerativne spremembe, v nastanek raka ali neposredno v celično smrt. Od količine absorbirane UV svetlobe ter od zaščitne kapacitete kože (antioksidanti) je odvisno, kakšen bo razplet dogodkov po obsevanju Vidna svetloba neposredno ne more povzročiti nastajanje radikalov, lahko pa preko vzbujenih stanj fotosenzibilizatorjev povzroča nastajanje singletnega kisika v obsevanem tkivu. Singletni kisik kot zelo reaktiven oksidant prav tako povzroča prostorsko omejene oksidativne poškodbe in smrt celice. Z uporabo primernih fotosenzibilizatorjev in sistema za lokalilzirano obsevanje dosežemo, da singletni kisik nastaja samo v področju, kjer želimo doseči terapevtski učinek. V tem primeru omenjeno lokalizirano nastajanje izrabljamo za fotodinamično terapijo, ki je uporabna pri obravnavi površinskih patoloških sprememb na dostopni površini kože ali sluznic. 5 Literatura 1. Fossel M. B.: Cells, Aging, and Human Disease, Oxford University Press, 2004, 140-160 (The Skin): 2. Halliwell B., Gutteridge J. M. O: Free Radicals in Biology and Medicine, 4th Ed. Oxford, 2007. 3. Pečar S.: Radikali v naoem okolju, Kemija v šoli: (2006), 18(2), 1-5: 4. Pečar S.: Radikali v naoem aivljenju, Kemija v šoli: (2006), 18(3), 13-19: 5. Byrne-Habic B., Mravljak J., Pečar S.: Duoikov oksid I: lastnosti, kemiona reaktivnost 6. Jurkovič P., Šentjurc M., Gašperlin M., Kristl J., Pečar S.: Skin protection against ultraviolet induced free radicals with ascorbyl palmitate in microemulsions, Eur. J. Pharm & Biopharm: (2003), 56, 59-66; in nastajanje NO v organizmu,. Farm Vest. (2004), 55, 469-478: 7. Bonnett R.: Chemical Aspects of Photodynamic Therapy, Gordon and Brech Science Publishers, Amsterdam 2000: 8. Japelj B., Pečar S.: Osnove in moanosti fotodinamionega zdravljenja. Farm Vest (2006), 57, 131-139. farm vestn 2008; 59 1371 98