Raziskovalni modeli raka sečnega mehurja za izboljšanje diagnosticiranja in zdravljenja 301 PRegledni znanstveni članek inštitut za biologijo celice, Medicinska fakulteta, Univerza v ljubljani, ljubljana, slovenija Korespondenca/ Correspondence: daša z upančič, e: dasa. zupancic@mf.uni-lj.si Ključne besede: sečni mehur; rak; raziskovalni modeli; in vitro; in vivo Key words: urinary bladder; cancer; research model; in vitro; in vivo Prispelo: 24. 6. 2019 sprejeto: 22. 7. 2019 @publisher.id: 2966 @primary-language: sl, en @discipline-en: Microbiology and immunology, s tomatology, neurobiology, Oncology, Human reproduction, Cardiovascular system, Metabolic and hormonal disorders, Public health (occupational medicine), Psychiatry @discipline-sl: Mikrobiologija in imunologija, s tomatologija, nevrobiologija, Onkologija, Reprodukcija človeka, srce in ožilje, Metabolne in hormonske motnje, Javno zdravstvo (varstvo pri delu), Psihiatrija @article-type-en: editorial, Original scientific article, Review article, short scientific article, Professional article @article-type-sl: Uvodnik, izvirni znanstveni članek, Pregledni znanstveni članek, klinični primer, strokovni članek @running-header: Raziskovalni modeli raka sečnega mehurja za izboljšanje diagnosticiranja in zdravljenja @reference-sl: z drav vestn | maj – junij 2020 | l etnik 89 @reference-en: z drav vestn | May – June 2020 | volume 89 Raziskovalni modeli raka sečnega mehurja za izboljšanje diagnosticiranja in zdravljenja Research models of urinary bladder cancer for improved diagnostics and treatment Daša Zupančič, Samo Hudoklin Izvleček Rak sečnega mehurja je ena najpogostejših rakavih bolezni pri moških in ima visoko stopnjo ponovljivosti, zaradi česar predstavlja velik ekonomski in socialni problem. Za izboljšanje dia- gnosticiranja in zdravljenja raka sečnega mehurja se uporablja veliko različnih raziskovalnih mo- delov. V preglednem članku so predstavljeni najpogosteje uporabljeni modeli, saj predstavljajo približek dejanskemu molekularnobiološkemu dogajanju v človeku med boleznijo. Procesi na celični ravni se raziskujejo na in vitro modelih celičnih kultur, obnašanje celic v živem organizmu pa v različnih živalskih modelih. Izsledke raziskav na teh modelih je potrebno ovrednotiti tudi na človeških vzorcih, ki so nepogrešljivi, preden pride nov diagnostični postopek ali določena nova učinkovina v proces kliničnih študij. V članku so kritično ovrednotene prednosti in slabosti posa- meznega modela raka sečnega mehurja ter predstavljene nekatere raziskovalne študije. Abstract Urinary bladder cancer is one of the leading malignancies in men with high recurrence rate, thus representing a huge economic and social burden. Many different research models are used for studying potential improvements in the diagnostics and treatment of bladder cancer. In this re - view, the most widely used models are described, since they represent the approximation to the molecular and biological processes occurring during human bladder carcinogenesis. Processes at the cellular level are investigated by in vitro models of cell cultures, while processes occurring in whole organisms are explored in different animal models. The results obtained by these two approaches should also be evaluated on human biopsy samples before any new diagnostic pro- cedure or drug can be studied in clinical trials. We provide critical evaluation of advantages and disadvantages of specific models of the urinary bladder cancer and describe some of the studies using these models. Citirajte kot/Cite as: z upančič d, Hudoklin s. [Research models of urinary bladder cancer for improved diagnostics and treatment]. z drav vestn. 2020;89(5–6):301–19. DOI: 10.6016/z dravvestn.2966 302 z drav vestn | maj – junij 2020 | l etnik 89 MikRObiOl OgiJa in iMUnOl OgiJa 1 Uvod 1.1 Incidenca in dejavniki tveganja za nastanek raka sečnega mehurja Rak sečnega mehurja je bolezen raz- vitih zahodnih držav, ki se je v zadnjem desetletju širila tudi na dežele v razvo- ju ter tako postala globalni zdravstve- no-ekonomski problem. V svetovnem merilu se uvršča na šesto mesto najpo- gosteje diagnosticiranih rakavih bolez- ni pri moških (1). Poleg tega predstavlja zaskrbljujoče dejstvo zelo visoka sto- pnja njegove ponovljivosti, ki se giblje med 50 % in 90 % (1). Zaradi pogostosti in (ne)učinkovitosti trenutnih načinov zdravljenja, ki zahtevajo dolgoročno spremljanje že zdravljenih bolnikov, pomeni rak mehurja veliko socialno ter finančno obremenitev družbe in posa- meznikov (2). Najvišja incidenca je pri moških južne in zahodne Evrope ter severne Amerike, kjer predstavlja četrto najpogostejšo obliko raka (3). V Sloveniji je rak mehurja osma najpogostejša obli- ka raka med moškimi (18,1 na 100.000), s čimer zavzema četrto mesto med dr- žavami južne Evrope (Tabela 1). Pri žen- skah je incidenca raka mehurja trenu- tno precej nižja v primerjavi z moškimi (Tabela 1), vendar se povečuje od sredine 90. let prejšnjega stoletja, medtem ko se med moškimi zmanjšuje (1). Petletno preživetje bolnikov z rakom mehurja v Sloveniji je 53,7 %. Glavni dejavnik tveganja za raka me- hurja ostaja kajenje tobaka. Kadilci ima- jo do 2,5-krat višjo verjetnost za razvoj te oblike raka kot nekadilci, pri čemer je tobak odgovoren za približno 50 % vseh primerov in približno 40 % vseh smrti zaradi raka mehurja (4). Glede na te po- datke ni presenetljivo, da vzorec inciden- ce in smrtnosti zaradi raka mehurja v ve- liki meri sovpada z vzorcem kajenja (5). Pri tem je potrebno upoštevati zgodo- vino bolezni, saj se trenutni vzorec po- javljanja raka mehurja ujema s prevalen- co kajenja izpred 20–30 let (6). V zadnjih desetletjih je pogostnost kajenja upadla v številnih Evropskih državah, kar se odslikava tudi v trendu nižanja inciden- ce in smrtnosti zaradi raka mehurja pri moških v teh državah. V nasprotju s tem Tabela 1: Incidenca in umrljivost zaradi raka sečnega mehurja v Evropskih državah (starostno standardizirana incidenca in umrljivost na 100.000) (povzeto po Antoni et al.) (1). Incidenca (moški / ženske) Umrljivost (moški / ženske) Centralna in vzhodna Evropa Poljska (regionalno) 20,2 / 4,1 8,4 / 1,3 Češka 19,8 / 5,4 6,2 / 1,6 Slovaška 16,1 / 3,6 5,4 / 1,2 Bolgarija 15,6 / 3,3 5,2 / 1,1 Severna Evropa Danska 27,4 / 8,4 6,7 / 2,3 Norveška 21,9 / 6,4 4,9 / 1,6 Švedska 18,6 / 5,6 4,1 / 1,2 Irska 11,6 / 4,2 3,6 / 1,4 Južna Evropa Španija (regionalno) 36,7 / 5,0 8,2 / 1,1 Italija (regionalno) 33,2 / 6,1 5,8 / 1,0 Hrvaška 18,2 / 4,4 6,2 / 1,2 Slovenija 18,1 / 4,3 6,2 / 1,4 Zahodna Evropa Švica (regionalno) 26,2 / 6,3 4,0 / 1,3 Nemčija (regionalno) 21,8 / 5,5 4,2 / 1,3 Avstrija 20,3/ 5,2 4,2 / 1,1 Nizozemska 13,9 / 3,5 5,5 / 1,6 Raziskovalni modeli raka sečnega mehurja za izboljšanje diagnosticiranja in zdravljenja 303 PRegledni znanstveni članek pa se je v nekaterih državah prevalen- ca kajenja začela zmanjševati šele pred kratkim ali pa celo še vedno narašča, kar velja predvsem za ženske (7). T o pomeni, da bo incidenca in smrtnost zaradi raka mehurja v teh populacijah še naraščala oziroma se bo začela zmanjševati šele čez nekaj desetletij. Poleg kajenja je med karcinogene de- javnike, ki povzročajo raka mehurja, uvr- ščena tudi izpostavljenost aromatskim aminom in drugim kemikalijam, ki so prisotne v barvni, gumarski in aluminij- ski industriji (8). Tem sledi izpostavlje- nost določenim okoljskim onesnažilom, kot je na primer arzenik v pitni vodi (9). Študije kažejo, da imajo potencialno vlo- go v karcinogenezi mehurja tudi pode- dovani genetski dejavniki (10). Na dru - gi strani pa vloge različnih prehranskih diet pri razvoju raka mehurja študije ne potrjujejo (2). 1.2 Klasifikacija raka sečnega mehurja Rak mehurja se praviloma razvije zaradi transformacije epitelnih celic, ki mejijo na svetlino mehurja in se ime- nujejo urotelijske celice (11). Rakava transformacija uroteljskih celic znotraj urotelija vodi v nastanek urotelijske ne- oplazije. Prva klasifikacija urotelijskih neoplazij je nastala leta 1973 in se je kljub določenim pomanjkljivostim uporablja- la skoraj 30 let (12). Leta 1998 je Svetovna zdravstvena organizacija (angl. World Health Organisation, WHO) v sode- lovanju z Mednarodnim združenjem uroloških patologov (angl. International Society of Urological Pathologist, ISUP) sprejela novo klasifikacijo WHO/ISUP, ki podrobneje razdeli neoplazije glede na obliko sprememb urotelija ter glo- bino invazije rakavih urotelijskih celic (Slika 1 in Tabel a 2). Klasifikacija WHO/ ISUP za določanje urotelijskih neoplazij je v uporabi še danes. 1.3 Odkrivanje in zdravljenje raka sečnega mehurja Najbolj ključna za ugoden razplet bo- lezni je hitra postavitev diagnoze, saj so na začetku razvoja bolezni v večini uro- telijske neoplazije neinvazivnih papilar- nih karcinomov oblike pTa. Osnovno diagnosticiranje urotelijskih neoplazij se izvaja z anamnezo in kliničnim pre- gledom, ki ga sestavljajo citološke pre- iskave urina ter cistoskopija in histo- patološka preiskava biopta urotelijske neoplazije, pridobljenega med operaci- jo. Ob postavitvi diagnoze ima približ- Slika 1: Klasifikacija raka sečnega mehurja glede na globino invazije (povzeto po Mertens et al.) (13). 304 z drav vestn | maj – junij 2020 | l etnik 89 MikRObiOl OgiJa in iMUnOl OgiJa Tabela 2: Klasifikacija WHO/ISUP urotelijskih neoplazij in njihovih histopatoloških značilnosti (povzeto po Ovčak, Epstein et al.) (12,14). Klasifikacija Histopatološke značilnosti Normalen urotelij Do 7 skladov celic, za površinski sklad so značilne dežnikaste celice, minimalne citološke atipičnosti in spremembe v zgradbi celic. Hiperplazija Enostavna hiperplazija Zadebeljen urotelij brez citoloških atipičnosti. Papilarna hiperplazija Sluznica je nagubana, lahko tudi resičasta, prisotni so izrastki v obliki prstov, urotelij je neenakomerno zadebeljen in ne kaže citoloških atipičnosti. Nepapilarne (ravne) spremembe z atipičnostmi Reaktivna (vnetna) atipičnost Jedra urotelijskih celic so enakomerno povečana, jedrca so jasno vidna, prisotne so tudi mitoze. Atipičnost neznanega izvora Diagnoza, ko je odločitev med reaktivno atipičnostjo in neoplazijo težka. Zaradi intenzivnega vnetnega procesa je močno izražen polimorfizem jeder. Displazija Hude spremembe, ki se kažejo kot porušenje zgradbe celic, celični in jedrni polimorfizem in povečana mitotska aktivnost. Karcinom in situ (CIS) Prisotnost celic z velikimi, nepravilno oblikovanimi jedri, običajno v celotni debelini urotelija. Mitotska aktivnost je vidna tudi v površinskem in srednjem sloju urotelija. Papilarne neoplazije Papilom Papilarna benigna novotvorba z ozkim vezivnim tkivom, ki ga prekriva urotelij, ki se po zgradbi ne razlikuje bistveno od normalnega. Papilarna urotelijska neoplazija nizkega malignega potenciala (PUNLMP) Papilarna novotvorba z minimalnimi nepravilnostmi v zgradbi celic urotelija in minimalnimi jedrnimi atipijami. Urotelij je praviloma zadebeljen, jedra so večja kot pri papilomu, v bazalnem sloju so redke mitoze. Neinvazivni papilarni urotelijski karcinom nizke stopnje (pTa, low grade) Nepravilnosti v zgradbi celic so pogostejše, polimorfizem jeder je izrazit. Opazne so spremembe v velikosti, obliki in polarnosti celic. Blaga mitotska aktivnost se omejuje na bazalni sloj urotelija. Neinvazivni papilarni urotelijski karcinom visoke stopnje (pTa, high grade) Izrazite nepravilnosti v zgradbi in videzu rakavih celic. Opazna je nepravilna porazdelitev kromatina v jedrih, jedrca so jasno vidna in nepravilno oblikovana. Navadne in patološke mitoze so prisotne v vseh slojih urotelija. Invazivni karcinom Invazija v lamino proprijo (T1) Prisotnost skupkov ali posameznih rakavih celic v lamini propriji. Invazija v proprijo muskularis (mišica detruzor) (T2) Značilna je prisotnost rakavega tkiva med debelimi snopi gladkega mišičja stene mehurja. Invazija skozi mišico (T3) Prisotnost rakavih celic v tunici serosi. Invazija v sosednje organe (T4) Infiltracija rakavega tkiva v sosednje organe. Raziskovalni modeli raka sečnega mehurja za izboljšanje diagnosticiranja in zdravljenja 305 PRegledni znanstveni članek no 75 % bolnikov nemišičnoinvazivno obliko (pTa, CIS, T1) in približno 25 % mišičnoinvazivno obliko (stadij ≥ T2) raka sečnega mehurja (15) . Pri bolnikih z mišičnoneinvazivno obliko bolezni je petletno preživetje sicer relativno viso- ko (> 90 %), vendar pa je ponovljivost te bolezni izjemno visoka (50–90 %), zara- di česar je potrebno drago dolgoročno spremljanje z invazivno cistoskopijo (1). Zdravljenje papilarnih oblik karcino- mov je največkrat transureterna resekci- ja sečnega mehurja (angl. Transurethral Resection of Bladder, TURB). Namen posega je odstraniti vse makroskopsko vidne dele karcinoma, pri čemer hkra- ti pridobimo biopsije rakavega tkiva, s katerimi se določijo stadij, stopnja ter globina invazije (16) . Pri stadijih T3 in T4 je običajna oblika zdravljenja radi - kalna cistektomija z odstranitvijo lokal- nih bezgavk (angl. Radical Cystectomy), ki ji sledi sistemska kemoterapija (17). Izkazalo se je, da neoadjuvantna kemo- terapija na osnovi cisplatina pred radi- kalno cistektomijo izboljša dolgoročno preživetje le za 6 % (18). Približno 50 % bolnikov z diagnozo invazivne obli- ke raka mehurja umre v petih letih po postavitvi diagnoze (19,20) . Ob tem pa spremljanje statistike petletnega pre- živetja pokaže, da se zdravljenje bolni- kov s to obliko raka v zadnjih 20 letih ni bistveno izboljšalo (21). Tako je rak mehurja zaradi visoke pogostosti in ponovljivosti urotelijskih neoplazij ter slabega preživetja invazivnih oblik zelo resen problem javnega zdravstva. Zato je potrebno prihodnje raziskave usmeriti v iskanje novih metod in pristopov v dia- gnosticiranju ter iskanje novih napoved- nih dejavnikov. Visoka ponovljivost raka mehurja je verjetno posledica dejstva, da kljub kirurški odstranitvi cistoskop- sko vidnih urotelijskih neoplazij ostane nekaj rakavih urotelijskih celic v sečnem mehurju, iz katerih se razvijejo nove ne- oplazije. Zato je nujno iskati nove na- čine zdravljenja, kot je na primer cilja- ni vnos zdravil v rakave celice. Od leta 1990, ko so v onkologijo prvič vpeljali ciljano zdravljenje, so se številne terapi- je s ciljanim zdravljenjem uveljavile pri zdravljenju rakavih bolezni, predvsem levkemije, gastrointestinalnih in kolo- rektalnih tumorjev ter raka ledvic (22). Žal pa se nobeno od registriranih ci- ljanih zdravljenj ni izkazalo kot uspeš- no pri zdravljenju raka mehurja (23). Glavni vzroki za to so najverjetneje: a) izjemno hitro pridobljena odpornost tumorja na terapijo, ki je posledica mo- lekularne heterogenosti rakavih urotelij- skih celic (24) , b) delovanje urotelijskih celic kot pregrada, ki lahko na celični ravni zmanjšuje dostop zdravil do raka- vih celic ter c) številni toksični stranski učinki zdravljenja (23). Za razvoj novih oblik zdravljenja raka mehurja so ključ- ni reprezentativni, dobro ovrednoteni in ponovljivi predklinični raziskovalni modeli raka, pri katerih se je potrebno zavedati prednosti in pomanjkljivosti posameznega modela. 2 Raziskovalni modeli raka sečnega mehurja Razvoj novih načinov diagnosticira- nja in zdravljenja raka mehurja se zač- ne s temeljnimi celično-biološkimi in molekularnimi raziskavami na celičnih kulturah (sistemi in vitro), katerim sledi- jo raziskave na kompleksnejših živalskih modelih (predklinične študije in vivo). Živalski modeli raka omogočajo tudi raziskave mehanizmov delovanja že uve- ljavljenih terapij (npr. terapija z bacilom Calmette-Guerin) ter možnosti njihove- ga izboljšanja (25). Od vseh na modelnih sistemih testiranih inovativnih načinov zdravljenja jih le malo pride do stopnje, da se lahko izvede klinična študija na bolnikih. 306 z drav vestn | maj – junij 2020 | l etnik 89 MikRObiOl OgiJa in iMUnOl OgiJa 2.1  In vitr o sistemi omogočajo temeljne študije karcinogeneze urotelija Celične kulture so odlično orodje za študij osnovnih celičnobioloških, mole- kularnih in genetskih značilnosti raka- vih urotelijskih celic in vitro. Poglavitni prednosti uporabe in vitro sistemov urotelijskih celic sta možnost nadzoro- vanja pogojev in neposrednega opazo- vanja celic v kulturi. Rast normalnih in rakavih urotelijskih celic, pridobljenih od glodavcev, prašičev ali ljudi, predsta- vlja možnost raziskovanja 'čistih' popu- lacij celic brez vpliva celic drugih tkiv. Celične kulture omogočajo tudi prve faze testiranja novih zdravilnih učinko- vin, npr. testiranje mehanizma vstopa- nja v celice, prenosov znotraj celic ter mehanizmov delovanja. V literaturi je opisanih več metod gojenja rakavih in normalnih urotelijskih celic, od trajnih celičnih linij in različno diferenciranih primarnih in sekundarnih celičnih kul- tur do kultur eksplantatov (26,27). Trajne celične linije urotelijskih celic se pridobe bodisi iz normalnih urotelijskih celic, ki so bile izpostavljene kemijskim karcino- genom, bodisi iz rakavih celic različnih tumorjev sečnega mehurja (28). Obstaja več celičnih linij človeškega izvora (npr. RT4, RT112, T24, UMUC3 in UMUC14), ki predstavljajo raziskovalne modele različnih stopenj raka mehurja ter iz- ražajo številne genetske in morfološke spremembe ter spremembe v izražanju genov, opažene v človeških urotelijskih neoplazijah. V raziskovalne namene se uporabljajo tudi mišje (npr. MB49 in MBT-2) in podganje trajne celične lini- je (npr. AY-27) (29). Vsi ti sistemi in vi - tro so modelni sistemi za študije vpliva dejavnikov, ki spremljajo rast in dife- renciacijo normalnih in rakavih urote- lijskih celic (npr. rastni faktorji, signalne molekule, mitogeni, inhibitorji). Poleg tega omogočajo spremljanje nastanka in razvoja rakave transformacije celic po izpostavitvi karcinogenu ter prvo ugotavljanje učinkovitosti protirakavih zdravilnih učinkovin (30). Celične kul- ture omogočajo tudi raziskave genetskih sprememb, povezanih z razvojem raka mehurja, ter testiranje tumorogenosti in sposobnosti celic za metastaziranje. Čeprav so sistemi in vitro zaradi pregle- dnosti in sorazmerno enostavne upora- be učinkovit modelni sistem, pa imajo svoje omejitve predvsem zaradi odsot- nosti kompleksnega (tkivnega) okolja. Metabolizem (31) in odzivnost (32) celic na signale iz okolja v trajni celični liniji se npr. opazno razlikujeta od tistega, ki poteka v celicah normalnega ali rakave- ga tkiva in situ. Celične linije, ki rastejo v monoslojih, ne posnemajo kompleksne tridimenzionalne urejenosti, značilne za tkiva v organizmu. Z uporabo tridi- menzionalnih sistemov celičnih kultur in komponent zunajceličnega matriksa lahko sicer vzpostavimo bolj fiziološki modelni sistem arhitekture in dinamike tumorja (33), ne moremo pa povsem na- domestiti kompleksnega okolja tkiva in vivo. Velik vpliv le-tega namreč prispe- vajo celice, ki obkrožajo rakave celice in situ, npr. imunske celice, mezenhimske celice, sistem ožiljenja, kompleksnost ve- zivnega tkiva in drugi tipi celic. Te ome- jitve celičnih kultur lahko delno prema- gamo z različnimi živalskimi modeli, ki so opisani v naslednjem poglavju. V slovenskem prostoru se z gojenjem urotelijskih in vitro sistemov ukvar- jamo na Inštitutu za biologijo celice Medicinske fakultete v Ljubljani. V od- lično opremljenem celičnem laboratori- ju gojimo primarne in sekundarne kul- ture urotelijskih celic, trajne celične linije in tudi kulture urotelijskega tkiva, ki jih uporabljamo za študije diferenciacije in regeneracije urotelija, za študije načinov internalizacije učinkovin, citotoksičnos- Raziskovalni modeli raka sečnega mehurja za izboljšanje diagnosticiranja in zdravljenja 307 PRegledni znanstveni članek ti idr. Na modelih in vitro urotelijskih celic raziskujemo tudi načine medce- lične komunikacije z membranskimi nanocevkami (34) ter z zunajceličnimi vezikli (35 ,36), kar je v zadnjem obdobju v središču raziskovalne pozornosti in naj bi imelo vlogo tudi pri rakavih boleznih. Ob tem je ključno, da imamo vzpostav- ljene poleg modelov trajnih celičnih linij papilarnih in metastazirajočih urotelij- skih celic tudi modele normalnih kultur urotelijskih celic, ki jih lahko diferencira- mo do visoke stopnje. To nam omogoča raziskovanje podobnosti in razlik v ce- ličnih procesih, ki potekajo v normalnih in rakavo spremenjenih urotelijskih celi- cah, izdelovanje sokultur ter spremljanje relevantne interakcije med normalnimi in rakavimi celicami med karcinogenezo (npr. način pritrjevanja rakavih celic na normalne, potek medcelične komunika- cije med njimi, način migracije rakavih celic med normalnimi). 2.2 Živalski modeli raka sečnega mehurja so ključni za predklinične študije Živalske modeli predstavljajo osre- dnjo raziskovalno povezavo med prep- rostejšimi sistemi in vitro ter kliničnimi študijami s končno aplikacijo spoznanj pri ljudeh. Poglavitna prednost živalskih modelov je njihova kompleksnost, ki omogoča sorazmerno dobro simulacijo celičnih procesov pri ljudeh, hkrati pa še vedno obstaja možnost za nadzorovanje eksperimentalnih pogojev. Najpogosteje uporabljene vrste živalskih modelov raka mehurja so v Tabeli 3. Razdelimo jih lahko na več načinov, npr. glede na gensko ozadje rakavih celic in gosti- teljske živali, na singenske (enako ozad- je) in na ksenogenske (različno ozadje) modele, glede na položaj tumorja v po- skusni živali pa na heterotopne in orto- topne modele. Heterotopni modeli raka mehurja so sicer z vidika vzpostavitve enostavnejši, saj se nasaditev suspenzije rakavih urotelijskih celic izvede z injek- Tabela 3: Vrste živalskih modelov, ki se uporabljajo v predkliničnih raziskavah raka sečnega mehurja (povzeto po van Kessel et al.) (29). Vrsta modela Primeri Gensko ozadje singenski modeli spontano nastali rak kemijsko induciran rak transgeni modeli, mišji modeli, pripravljeni z genskim inženirstvom presaditev celic iste živalske vrste v gostiteljsko žival ksenogenski modeli presaditev celic druge živalske vrste v gostiteljsko žival Položaj tumorja ortotopni ksenogenski modeli tuje ali lastne celice rastejo v živali na anatomski lokaciji, ki je enaka lokaciji, iz katere so bile celice izolirane heterotopni ksenogenski modeli tuje ali lastne celice rastejo v živali na anatomski lokaciji, ki je različna od lokacije, iz katere so bile celice izolirane 308 z drav vestn | maj – junij 2020 | l etnik 89 MikRObiOl OgiJa in iMUnOl OgiJa cijo bodisi subkutano (pod kožo), intra- vensko (v repno veno) ali intraperitone- alno (v trebušno votlino). Tumor se torej razvije na anatomski lokaciji v organiz- mu, ki se razlikuje od lokacije, iz katere so se celice izolirale, zaradi česar se po- raja vprašanje, ali se tumor na različnih lokacijah v telesu razvija enako, kot bi se razvijal v organu, iz katerega rakave ce- lice izvirajo (37). Zato je bolj primerna uporaba ortotopnih modelov, pri katerih z intravezikalno nasaditvijo rakavih uro- telijskih celic vnesemo le-te neposredno v sečni mehur (38). Prednost singenskih živalskih mo- delov je enotno gensko ozadje, saj se tumor razvije iz tkiva gostiteljske živali. Singenski modeli vključujejo poskus- ne živali, pri katerih tumorji nastane- jo spontano ali jih inducirajo. Tumorje induciramo z določenimi kemikalija- mi (npr. 0,05-odstotnim N-butil-N-(4- hidroksibutil) nitrozaminom (BBN)), z genskimi modifikacijami (npr. izbitje gena p53 za supresorski protein za tu- mor P53) ali pa se uporabi kombinacija obojega. Spontano nastali tumorji pri glodavcih so zelo redki in so v več kot 99 % povezani z visoko starostjo (39). Znan je spontani model raka sečnega mehurja pri psih, pri katerih je sponta- no pojavljanje te bolezni podobno kot pri ljudeh (40). Pri psih gre najpogosteje za invazivni urotelijski karcinom visoke stopnje, ki je v svojih celičnih bioloških in molekularnih značilnostih, mestih in frekvencah metastaz ter odzivu na zdravljenje podoben človeškim invaziv- nim urotelijskim karcinomom. Pasji mo- del je zato dobra dopolnitev mišjim in podganjim modelom raka mehurja (41). Največja prednost singenskih modelov je naravno makro- in mikrookolje tu- morja, vključno z aktivnim imunskim sistemom poskusne živali. Ksenogenski modeli raka mehurja so modeli, pri katerih uporabimo rakave celice neke živalske vrste in jih presa- dimo v gostiteljsko žival druge vrste. S tem dosežemo, da so rakave celice bolj podobne raku donorskega organizma (npr. človeka), katerega biologija nas najbolj zanima. Pri presaditvi človeških rakavih celic v mehur poskusnih živali so nastale neoplazije načeloma bolj po- dobne raku mehurja pri ljudeh, kot če uporabimo (živalski) singenski model karcinogeneze. Vendar pa imajo kse- nogenski modeli določene omejitve. Za njihovo uporabo je potrebno imeti živa- li z imunsko pomanjkljivostjo, s čimer omogočimo, da človeške rakave celice preživijo v tujem organizmu (42). Za čim boljšo ohranjenost heterogenosti tumorske arhitekture raka mehurja je najboljša neposredna presaditev svežega ksenografta iz bolnika v poskusno žival. Prva študija, ki opisuje metodo priprave ksenografta, pridobljenega iz bolnika, je bila objavljena leta 2015 (43) , vendar se uporaba uveljavlja sorazmerno po- časi. Kljub napredku v presajanju tujih ali lastnih rakavih urotelijskih celic ter razvoju najrazličnejših gensko spreme- njenih modelnih živali se za predklinič- ne študije še vedno najpogosteje upora- bljajo kemijsko inducirani modeli raka mehurja. 2.2.1 Kemijsko inducirani rak sečnega mehurja Najpogosteje uporabljani kemijski karcinogen za indukcijo raka mehurja, ki se uporablja še danes, je BBN (44). BBN se pogosto pojavlja v barvni indu- striji in je metabolni produkt različnih N-nitrozo sestavin, ki so prisotne tudi v cigaretnem dimu (45). Za z BBN indu - cirani model raka mehurja so bile nare- jene obsežne histološke, morfološke, ce- ličnobiološke, molekularne in genetske analize ter primerjave s človeških rakom mehurja (46,47). Največja prednost BBN je odsotnost sistemske toksičnosti in Raziskovalni modeli raka sečnega mehurja za izboljšanje diagnosticiranja in zdravljenja 309 PRegledni znanstveni članek indukcija izključno urotelijskih neopa- zij (48), ki so po nastanku in časovnem poteku pojavljanja ekvivalentne človeš- kim urotelijskim neoplazijam (46,47). Patološke in genetske podobnosti med modelom raka mehurja, inducira- nim z BBN, in človeško boleznijo uvr- ščajo ta model med najbolj primerne sisteme za študij različnih stopenj člo- veških urotelijskih neoplazij (Slika 2). Kot tak omogoča raziskave biologije urotelijskih rakavih celic in razvoja tu- morjev s pomočjo slikovnih, genetskih, molekularnih, histoloških in elektron- skomikroskopskih metod. Z BBN indu- cirani model raka mehurja pri glodavcih je tudi zelo uporaben za ovrednotenje novih načinov zdravljenja raka mehurja ter ciljanega vnosa zdravilnih učinkovin v rakave celice. Ta model se uporablja za določanje učinkovitosti zdravilnih učin- kovin, ki se v organizem vnesejo intra- vezikalno (s katetrom v sečni mehur) ali na druge načine, kot sta oralno ali intra- peritonealno (27). Pred začetkom obrav- nave poskusnih živali je nujno potrebno potrditi, da so rakave urotelijske celice sposobne privzemanja zdravilne učinko- vine, kar se običajno testira na celičnih kulturah. BN inducira raka mehurja pri miših, podganah in psih, medtem ko se je pri hrčkih in prašičih izkazal kot šibek kar- cinogen (49,50). Najpogosteje se v razi- skavah uporablja model BBN karcinoge- neze pri miših in podganah, s katerimi je sorazmerno enostavno rokovati in jih imeti nastanjene, njihovo vzdrževanje pa je poceni. Psi se zaradi etičnih razlogov, cene in zahtevnejših pogojev nastanitve kot modelni sistemi karcinogeneze ne uporabljajo več (51). BBN se vnese v žival v obliki 0,05-od- stotne raztopine v pitni vodi, lahko pa Slika 2: Parafinske rezine, obarvane s hematoksilinom in eozinom. Normalni mišji (A) in človeški (D) urotelij. Patohistologija mišjega modela raka mehurja, induciranega z BBN (B - 0,05 % BBN v pitni vodi 20 tednov; C - 0,05 % BBN v pitni vodi 20 tednov in nato še 15 tednov pitja vode brez BBN) in človeških vzorcev, primerljivih stopenj raka mehurja (E- pTa, low grade; F – pT1, high grade). Merilo: 200 µm. 310 z drav vestn | maj – junij 2020 | l etnik 89 MikRObiOl OgiJa in iMUnOl OgiJa tudi 0,005-odstotne ali 0,5-odstotne, odvisno od seva miši oziroma podgan in stopnje želenega tumorja (52). Zaužiti BBN se presnavlja v jetrih, kjer encimski sistem alkohol/aldehid dehidrogenaze oksidira alkoholno skupino BBN v kar- boksilno skupino in nastane N-butil-N- (3-karboksipropil)-nitrozamin (BCPN). BCPN se izloča iz telesa z urinom, ki se skladišči v mehurju in na ta način pride v stik z urotelijem. BCPN je stabilna mo- lekula, ki se kovalentno veže na urotelij- ske celice in je neposredno odgovorna za začetek procesa rakave preobrazbe (53). Glede na mehanizem delova- nja sodi BBN med genotoksične ali DNA-reaktivne karcinogene (54). BBN povzroči poškodbe molekul DNA v uro- telijskih celicah in na ta način selektivno inducira raka mehurja pri miših in pod- ganah (55). Intenziteta procesa karcino- geneze in stopnja, do katere se v dolo- čeni poskusni živali razvije rak mehurja (hiperplazija, displazija, CIS, neinvazivni papilarni urotelijski karcinom nizke in visoke stopnje, invazivni karcinomi), je odvisna od uporabljene koncentracije BBN, trajanja pitja vode z BBN (2–24 te- dnov), časovnega presledka od preneha- nja pitja vode z BBN do evtanazije živali in odvzema urotelijskega tkiva ter vrste in seva živali. Pri mišji patogenezi pride običajno najprej do vnetnih procesov v lamini propriji pod urotelijem, čemur sledi displazija z urotelijsko metaplazijo različnih stopenj ali brez nje, nato na- stopita CIS in invazivni karcinom (56). Metastaze pri mišjem modelu niso ti- pične, saj se živali zaradi obstrukcijske uropatije evtanazirajo, preden pride do metastaziranja. Za razliko od mišjega modela je pri podganjem modelu rezul- tat obravnave z BBN skoraj izključno ne- invazivni papilarni karcinom nizke in vi- soke stopnje. Med razvojem tumorjev je nujno opravljati redne telesne preglede poskusnih živali. Pri miših in podganah se klasično uporabljata palpacija mehur- ja in pregled urina. Hematurija in otip- ljiva masa v sečnem mehurju sta znaka, ki se razvijeta šele pri poznih in napre- dujočih stopnjah raka. Za spremljanje razvoja tumorja so zato priporočljive neivazivne in vivo metode slikanja, kot so UZ, endoskopija, cistoskopija in ma- gnetno resonančno slikanje (MRI) ter računalniško podprta aksialna tomogra- fija (CAT) in bioluminiscenca. Možnost uporabe teh metod slikanja omogoča natančno spremljanje in merjenje tu- morjev ter s tem zmanjšanje števila ži- vali, potrebnih za raziskavo. Poleg tega metode in vivo slikanja omogočajo tudi natančnejše spremljanje počutja živali in ugotavljanje stopnje njihovega trpljenja, kar omogoča zvestejše sledenje uveljav- ljenim etičnim pravilom, imenovanim 3Rs (angl. Replacement, Reduction, Refinement). V Sloveniji smo na Inštitutu za bi- ologijo celice Medicinske fakultete v Ljubljani s pomočjo mišjega in podga- njega modela BBN analizirali spreme- njeno izražanje uroplakinov (UP), ki so značilni za visoko diferencirane urote- lijske celice (57). Poleg tega smo na mo- delih BBN proučevali selektivno vezavo lektinov (glikoproteinov, ki se specifično vežejo na določene sladkorne preostan- ke) na normalne in rakavo spremenjene urotelijske celice, kar bi lahko omogoči- lo izboljšano diagnosticiranje in ciljano zdravljenje raka mehurja (58). 2.2.2 Ortotopni modeli raka sečnega mehurja Ortotopni modeli raka mehurja omogočajo široko paleto celičnobiolo- ških raziskav rakavih celic znotraj go- stiteljevega zdravega, normalno diferen- ciranega urotelija ter novih možnosti zdravljenja. Ksenogenski ortotopni mo- deli odlično posnemajo morfološke zna- čilnosti človeških tumorjev, singenski Raziskovalni modeli raka sečnega mehurja za izboljšanje diagnosticiranja in zdravljenja 311 PRegledni znanstveni članek ortotopni modeli pa naravno sistemsko okolje organizma (imunski in hormo- nalni sistem). Izvedbeno so ortotopni modeli kar zahtevni in vključujejo dve fazi vzpostavljanja tumorja. V prvi je potrebno gojenje rakavih urotelijskih celic, ki so lahko človeškega, mišjega ali podganjega izvora, v ustreznih in vitro sistemih. V drugi fazi je potrebna uspe- šna nasaditev rakavih celic v ustrezno predpripravljeni sečni mehur živali. Pri tem je potrebno suspenzijo rakavih uro- telijskih celic vnesti v svetlino mehurja, kar je možno izvesti z injekcijo pri od- prti trebušni votlini ali pa z injiciranjem suspenzije celic po katetru skozi sečnico. Predpriprava mehurja pomeni, da zdrav, normalen urotelij gostiteljske živali prej kemijsko ali mehansko poškodujemo, sicer se rakave urotelijske celice nanj ne morejo pritrditi (59). Po nasaditvi rakavih celic v žival je potrebno zdra- vstveno stanje le-teh redno spremljati in opravljati serijske preglede urina za primer hematurije ter ugotavljati, ali na- staja otipljiva tumorska masa v sečnem mehurju. Za spremljanje rasti tumorja se lahko uporabijo tudi v poglavju 2.2.1 omenjeni neinvazivne metode in vivo slikanja. Ortotopni modeli raka mehurja ima- jo določene omejitve. T ako se npr. induk- cija razvoja raka razlikuje od naravnega začetka bolezni pri ljudeh. Poleg tega se ne morejo izvajati raziskave ugotavlja- nja specifičnega imunskega odziva na zdravljenje v miših z imunsko pomanj- kljivostjo, ki so potrebne v primerih kse- nogenskih modelov. Tudi časovni okvir študij metastaziranja je pri ortotopnih modelih zelo omejen, saj pride pogosto do smrti poskusne živali zaradi obstruk- cije sečnice, ki jo povzroči že primarni tumor pred nastankom invazivnega raka in metastaziranja. V primerih, ko pride do metastaziranja, pa se mesta metastaz poskusnih živali mnogokrat razlikujejo od mest, ki so značilna za človeške uro- telijske karcinome (60). Pri singenskih ortotopnih modelih raka mehurja se v sečni mehur vsadi- jo rakave urotelijske celice iste živalske vrste. Najbolj znana sta podganji (61) in mišji model, pri katerih se presadijo rakave urotelijske celice istega seva ži- vali (38). Slabost singenskih ortotopnih modelov je v tem, da gre za celične lini- je mišjih ali podganjih rakavih urotelij- skih celic, katerih rakava preobrazba se kemijsko inducira, zaradi česar se razli- kujejo od človeških rakavih urotelijskih celic. Poleg tega onkogene mutacije, ki so za nekatere človeške celične linije znane (na primer celice T24 – mutaci- ji HRAS in TP53, celice RT4 – mutacija RHOA, celice UMUC3-mutacije PTEN in KRAS), niso znane za podganjo celič- no linijo AY-27 ter za mišji celični liniji MB49 in MBT-2 (29). Prednosti singen - skih ortotopnih modelov raka mehurja pa so v tem, da so poskusne živali imun- sko brezhibne in torej lahko raziskujemo rast tumorja in učinke različnih terapij v organu in organskem sistemu, kjer hormonski in imunološki procesi po- tekajo nemoteno. Čeprav je fiziološko stanje imunskega sistema teh posku- snih živali normalno in torej podobno stanju v človeškem organizmu, pa se je pri interpretaciji rezultatov potrebno za- vedati medvrstnih razlik in razlik med spoloma (62). Na Inštitutu za biologijo celice Medicinske fakultete v Ljubljani smo uporabili singenski ortotopni mišji model, pri katerem smo nasadili mišje rakave urotelijske celice MB49 nepos- redno v mehur preko katetra. Uspešnost nasaditve se je povečala po predpripravi urotelija s poli-L-lizinom, s katerim se je večina visoko diferenciranih površin- skih urotelijskih celic odluščila, tako da so se rakave celice lahko pritrdile na ne- diferencirane urotelijske celice in tvorile tumor (63). Histopatološka analiza teh 312 z drav vestn | maj – junij 2020 | l etnik 89 MikRObiOl OgiJa in iMUnOl OgiJa tumorjev je pokazala, da so podobni člo- veškim karcinomom in situ (CIS). 2.2.3 Transgeni modeli – mišji modeli, pripravljeni z genskim inženirstvom Mišji modeli, pripravljeni z genskim inženirstvom (angl. Genetically engine- ered mouse models, GEM ali GEMM) se v danes pogosto uporabljajo za raz- lične raziskave biologije rakavih celic, vključno z analizo tumorskega fenotipa, modeliranje podtipov bolezni, mehani- stične raziskave kandidatnih genov in signalnih poti ter predklinična testira- nja možnih zdravilnih učinkovin (64). Najpomembnejša prednost modelov GEM je, da se pri njih tumorji razvijejo na novo v mikrookolju urotelija podob- no kot pri kemijsko induciranih mode- lih, hkrati pa so zasnovani na natančno opredeljenih genskih spremembah. Tako lahko študiramo vpliv spremenjenega, vendar poznanega izražanja genov na razvoj raka. Na drugi strani je neugod- no to, da je opisanih sorazmerno malo modelov GEM za raka mehurja, še po- sebej takih z mišično invazivnim in/ali metastatskim fenotipom. Večina enoj- nih mutacij in tudi številne kombinacije mutacij se namreč zrcalijo kot majhne spremembe fenotipa (hiperplazija, CIS in neinvazivni papilarni urotelijski kar- cinomi) (65). Zaradi nedavnega opisa molekularnih sprememb, značilnih za raka mehurja, ki se lahko modelirajo v miših (66), bodo verjetno igrali modeli GEM vse pomembnejšo vlogo v priho- dnosti. Razvoj modelov GEM za raka mehurja se je pospešil po odkritju genov za urop- lakine, ki so integralni transmembranski proteini, značilni predvsem za urotelij- ske celice (67,68). Promotor za mišji gen, ki kodira uroplakin II (UPII), se lahko namreč uporabi za nadzorovani vnos onkogenih mutacij v mišje urotelijske celice. Najprej so promotor za UPII upo- rabili v kombinaciji z onkoproteinom SV40T, ki inaktivira tumor supresorska proteina p53 in pRb (protein retinoblas- toma), za katera je znano, da sta pogosto mutirana v človeških rakavih urotelij- skih celicah (69). Za transgene miši, ki so nastale na ta način, so značilni predvsem CIS in invazivni urotelijski karcinomi, izmed katerih nekateri tudi metastazira- jo (69,70). Molekularni profil teh miši je podoben kot pri ljudeh (71). Druga prednost modelov GEM je visoka predvidljivost poteka tvorbe in razvoja tumorja, zaradi česar je lažje določiti specifične vplive na inhibira- nje razvoja tumorja. Za modele GEM se običajno uporabljajo inbridirani sevi poskusnih živali, kar zelo zmanjša vplive različnih genskih ozadij na metabolizem zdravilnih učinkovin, na odziv tumorja in na odpornost tumorja na zdravilno učinkovino. Na teh modelih lahko raz- iskujemo tako inovativne terapevtske pristope kot tudi preventivne strategije in to na različnih stopnjah napredovanja tumorja (72). Večina današnjih modelov GEM vključuje ciljan vnos genov v specifič- no tkivo. Vendar pa take modele raka mehurja vedno bolj zamenjuje sistem vnosa genov z aleli Cre, ki omogoča še bolj ciljani vnos genov, izključno v izbra- ni celični tip (65). Znano je, da pogojno aktiviranje β-katenina v mehurju z aleli Cre, ki so vezani na izražanje promo- torja gena UPII (imenovani UroII-Cre), povzroči hiperplazijo, skupaj z aktivira- njem genov Hras in Kras ali pa izgubo funkcije gena Pten pa neinvazivni papi- larni urotelijski karcinom (72). Druga metoda za študij vpliva spre- menjenega izražanja genov v uroteliju na razvoj in napredovanje raka mehur- ja je s pomočjo vnosa genov z adeno- virusi. Za to je potrebna kateterizacija poskusne živali in vnos adenovirusov z Raziskovalni modeli raka sečnega mehurja za izboljšanje diagnosticiranja in zdravljenja 313 PRegledni znanstveni članek zapisom za želeni gen v svetlino sečne- ga mehurja (73). V praksi se največkrat uporabljajo mišje samičke; kateterizaci- ja samčkov je namreč zaradi anatomije prostate in dolžine sečnice bolj zahtev- na. Prednost vnosa genov z adenovirusi je možnost vnosa transgena (74) ali pa gena za rekombinazo Cre (tak sistem se imenuje Adeno-Cre), ki povzroči dele- cije glodavskih genov, označenih z mes- ti flox/flox (73). Poleg tega je ta živalski model sorazmerno poceni. Največja sla- bost sistema je nepopoln prenos virusne DNA ali RNA v genom urotelijskih celic in, v odvisnosti od uspešnosti prenosa, dolgotrajno čakanje na razvoj fenotip- skih sprememb. Vendar pa predhodno tretiranje svetline mehurja z detergenti, kot sta natrijev dodecil sulfat (SDS) in dodecil-β-D-maltozid (DDM), izboljša učinkovitost vnosa virusne nukleinske kisline (74); verjetno zato, ker povzroči majhne poškodbe apikalne plazmaleme urotelijskih celic. S sistemom Adeno-Cre so inaktivirali gena za Trp53 in Pten v urotelijskih celicah, zaradi česar se je raz- vil invazivni rak sečnega mehurja, ki je pogosto metastaziral (73). Nadaljnje raz- iskave modelov Adeno-Cre so potrdile njihovo uporabnost v predkliničnih štu- dijah zdravljenja v mehurju z rapamici- nom (75) in so osnova za klinične študije, namenjene oceni učinkovitosti intrave- zikalnega tretiranja z rapamicinom pri visoko tveganih zgodnjih stopnjah raka sečnega mehurja (https://clinicaltrials. gov/ct2/show/NCT02009332). Podobno so predklinične študije na tem modelu pokazale učinkovitost vnosa več različ- nih kemoterapevtikov skozi mehur, raz- porejenih po posebnem režimu. Tudi te raziskave so vodile do kliničnih študij, namenjenih oceni učinkovitosti obrav- nave na ljudeh (https://clinicaltrials.gov/ ct2/show/NCT02202772). Ti primeri ka- žejo, da so lahko predklinične raziskave na modelih GEM uporabne pri testira- nju učinkovitosti obetavnih novih zdra- vilnih učinkovin, a tudi pri optimizaciji načina vnosa teh učinkovin. 2.3 Človeški vzorci, pridobljeni z biopsijami Zaradi pogostosti in visoke pono- vljivosti urotelijskih neoplazij je treba prihodnje raziskave usmeriti v iskanje novih diagnostičnih pristopov ter v iska- nje novih napovednih dejavnikov, kot je na primer analiza soodvisnosti različnih diagnostičnih in napovednih označeval- cev. Še vedno nimamo dobrih napove- dnih označevalcev odzivanja tumorja, ki bi jih lahko učinkovito uporabili kot vodilo pri odločanju o najprimernejšem načinu zdravljenja. Zato je pri raku me- hurja nujno dolgoročno pooperativno spremljanje bolnikov. Z ugotovitvijo, kateri označevalci so primerni za napo- vedovanje preživetja bolnika z rakom mehurja in napredovanja bolezni, ozi- roma katere od obravnavanih bolnikov bi bilo potrebno aktivno spremljati po operasciji in katere ne, bi zelo zmanjšali obremenitev zdravstvenega sistema. Za takšne študije so najprimernejši človeš- ki vzorci, pridobljeni z biopsijo. Poleg celičnih kultur in živalskih modelov je namreč koristno preveriti, ali se določe- na nova zdravilna učinkovina lahko in- ternalizira v človeške rakave urotelijske celice in situ. Na našem inštitutu smo s presevno elektronsko mikroskopijo ana- lizirali selektivno endocitozo lektinov, označenih s koloidnim zlatom, v nor- malne in rakave urotelijske celice, gojene in vitro. Uporabili smo model normalnih prašičjih urotelijskih celic in dve celični liniji rakavih urotelijskih celic RT4 in T24. Normalne urotelijske celice lek- tinov niso endocitirale, medtem ko so rakave urotelijske celice endocitirale lek- tine (Slika 3). Nato smo endocitozo lek- tinov preverili tudi na človeških vzorcih 314 z drav vestn | maj – junij 2020 | l etnik 89 MikRObiOl OgiJa in iMUnOl OgiJa takoj po biopsiji (tj. na vzorcih ex vivo) in ugotovili, da tudi te rakave urotelijske celice endocitirajo lektine (Slika 3 C, D). Ker smo endocitozo lektinov potrdili ne le na celičnih kulturah, pač pa tudi na človeških vzorcih, lahko iz teh raziskav zaključimo, da bi se lektini uporabljali lahko za ciljani vnos zdravilnih učinko- vin v rakave urotelijske celice. Za dolgoročno spremljanje bolni- kov in retrospektivne študije so najbolj uporabni arhivirani človeški vzorci, pri- dobljeni z biopsijo, ki jih običajno vkla- pljamo v parafin, ali pa se zamrznejo in hranijo na –80 °C. Na zamrznjenih vzorcih je možno izvajati imunohisto- kemijska in ostala specifična označeva- nja ter tudi najrazličnejše molekular- ne, biokemijske in genetske analize. V Sloveniji se vsi parafinski bloki z vzorci bolnikov arhivirajo na Inštitutu za pato- logijo Medicinske fakultete v Ljubljani. Ob pridobitvi ustreznega etičnega do- voljenja se lahko uporabijo za različne študije. Vzorci, ki so bili že uporabljeni v raziskovalne namene na Inštitutu za Biologijo celice Medicinske fakultete v Ljubljani, se hranijo pri nas. Gre za para- finske in eponske (za presevno elektron- sko mikroskopijo) bloke, pa tudi zamr- znjene, kripoltanke in ultratanke rezine in zamrznjene vzorce za biokemijske analize ter posušene vzorce za vrstično elektronsko mikroskopijo. 3 Inovativni pristopi diagnosticiranja in zdravljenja Trenutni načini zdravljenja raka mehurja predstavljajo običajno le krat- kotrajno rešitev, saj se tumor pogosto ponovi. Najverjetnejši vzrok visoke po- novljivosti tumorjev mehurja je preži- vetje rakavih matičnih urotelijskih celic po resekciji in kemoterapiji s citostatiki. Ker konvencionalni načini zdravljenja s citostatiki delujejo le na proliferativne celice, lahko mirujoče rakave matične urotelijske celice preživijo. Razumevanje bioloških mehanizmov, ki kontrolirajo proliferacijo in diferenciacijo matičnih celic, bi lahko vodilo v razvoj inovativnih protirakavih strategij in njihovih kombi- nacij, ki bi uspešno odstranile populacije vseh tipov rakavih urotelijskih celic, tudi matičnih rakavih celic. Poleg proteinskih označevalcev raka mehurja, kot so uroplakini in puriner- gični receptorji, se v zadnjem času vedno bolj raziskuje tudi spremenjene sladkor- ne preostanke proteinov. Spremembe v Slika 3: Presevna elektronska mikroskopija rakavih urotelijskih celic z endocitiranim lektinom jakalinom označenim s koloidnim zlatom. Celice celičnih linij RT4 (A) in T24 (B), ki so rasle v gojilnem mediju in vitro. Koloidno zlato, vezano na lektin jakalin (puščice), se nahaja na površini celic in v endocitotskih veziklih. Celice človeških vzorcev ex vivo so bile odvzete z biopsijami pri bolnikih z neinvazivnim papilarnim urotelijskim karcinomom nizke stopnje (C) in neinvazivnim papilarnim urotelijskim karcinomom visoke stopnje (D). Koloidno zlato, vezano na lektin jakalin (puščice), se nahaja v endocitotskih veziklih urotelijskih celic. Merilo: 500 nm. Raziskovalni modeli raka sečnega mehurja za izboljšanje diagnosticiranja in zdravljenja 315 PRegledni znanstveni članek sestavi sladkornih preostankov na po- vršini celic so namreč klasičen znak ra- kave transformacije. Čeprav spremembe v glikozilaciji med rakavo transforma- cijo urotelija še niso dovolj natančno raziskane, velja, da vendarle povzročajo spremembe v interakcijah med celicami in z ligandi (76). Takšni ligandi so npr. lektini, ki imajo zaradi svoje specifič- ne afinitete do vezave sladkornih pre- ostankov tudi zmožnost označevanja ciljnih molekul. Zaradi svojih lastnosti so postali lektini zelo uporabni v razi- skovalnem delu, saj omogočajo karak- terizacijo in izoliranje glikoproteinov ter raziskovanje sladkornih preostankov in njihovega spreminjanja med rakavo transformacijo (77). Metoda, s katero označujemo sladkorne preostanke, se imenuje lektinska histokemija. Le-ta bi lahko predstavljala inovativni pristop pri diagnosticiranju in napovedovanju poteka bolezni. Neposredno soodvisnost med proteinskimi in sladkornimi ozna- čevalci je mogoče izvesti na isti tkivni rezini z združenim označevanjem slad- kornih preostankov z lektinsko histoke- mijo in proteinov z imunohistokemijo Slika 4: Metoda združene lektinske histokemije in imunohistokemije (CLIH) na človeškem normalnem uroteliju in vzorcu papilarne urotelijske neoplazije nizkega malignega potenciala (PUNLMP). Z zelenim fluorokromom so označeni lektini (ACA – Amaranthus caudatus aglutinin, DSA – Datura stramonium aglutinin, JAC – jakalin). Z rdečim fluorokromom so označeni proteini uroplakini (UP). Bela črta predstavlja potek bazalne lamine. Merilo: 20 µm. 316 z drav vestn | maj – junij 2020 | l etnik 89 MikRObiOl OgiJa in iMUnOl OgiJa (Slika 4). To kombinirano metodo smo uvedli na Inštitutu za biologijo celice in jo poimenovali metoda združene lek- tinske histokemije in imunohistokemije (angl. Correlative Lectin- and Immuno- Histochemistry, CLIH). Uporabili smo kriopoltanke rezine človeškega normal- nega urotelija in različnih urotelijskih neoplazij. Lektina ACA (Amaranthus caudatus aglutinin) in JAC (jakalin) sta se vezala na apikalno plazmalemo in apikalno citoplazmo dežnikastih celic, medtem ko se je lektin DSA (Datura stramonium aglutinin) vezal predvsem na vmesne celice normalnega uroteli- ja (Slika 4). Protitelesa proti uroplaki - nom so označila apikalno plazmalemo dežnikastih celic, v katerih je prišlo do kolokalizacije uroplakinov z lektinoma ACA in JAC. Pri vzorcu papilarne uro- telijske neoplazije nizkega malignega potenciala (PUNLMP) so bile z vsemi tremi lektini močno označene vmesne celice, torej je bila označba drugačna kot pri normalnem uroteliju (Slika 4). Imunohistokemija uroplakinov je bila negativna (Slika 4). Ker CLIH omogoča sočasno umeščanje sladkornih preostan- kov in proteinov, bi lahko dodatno pri- spevala k izboljšanemu diagnosticiranju. Prav tako se lektini uporabljajo v razi- skavah ciljanega vnosa zdravil v rakave celice (Slika 3), kar bi lahko pripomoglo k učinkovitejšim strategijam zdravlje- nja raka mehurja. Poleg lektinov smo na našem inštitutu testirali uporabnost nanodiamantov (78), kombinacije UV- sevanja in nanodelcev iz titanijevega oksida (79) ter hitozana (80). Vsi inova - tivni načini zdravljenja raka mehurja so se izkazali kot potencialno uporabni. 4 Zaključek Trenutno nobeno sredstvo za cilja- ni vnos zdravilnih učinkovin v rakave celice, ki ima dovoljenje za zdravlje- nje rakavih bolezni, še ni v uporabi za zdravljenje raka sečnega mehurja. Poleg tega so imele že zaključene klinične štu- dije zelo omejene uspehe, pogosto zaradi pomanjkanja učinkovitosti in zaradi ob- sežnih stranskih učinkov (29). Na drugi strani pa nova sredstva za ciljani vnos zdravilnih učinkovin in določene inova- tivne tehnologije vlivajo upanje za večjo učinkovitost zdravljenja v prihodnosti. Opisani raziskovalni modeli so pri tem osnova za predklinične in klinične raz- iskave, ki bodo omogočile večjo uspeš- nost odkrivanja, znižanje ponovljivosti in učinkovitejše zdravljenja raka sečnega mehurja. 5 Zahvala Avtorja se zahvaljujeva doc. dr. Tomažu Smrkolju, dr. med., in Igorju Sterletu, dr. med., s Kliničnega oddelka za urologijo Univerzitetnega klinične- ga centra v Ljubljani, in vsem bolni- kom, ki so darovali biopsijske vzorce raka sečnega mehurja v raziskovalne namene. Najlepša hvala tudi prof. dr. Petru Veraniču, predstojniku Inštituta za biologijo celice Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani za pregled članka in konstruktivne pripombe. Delo je nasta- lo v okviru raziskovalnega programa št. P3–0108, infrastrukturnega programa št. MRIC UL IP-0510 in projekta št. J3– 7494, ki jih je sofinancirala Javna agen- cija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije iz državnega proračuna. Literatura 1. antoni s, Ferlay J, soerjomataram i, znaor a, Jemal a, bray F. bladder Cancer incidence and Mortality: a global Overview and Recent t rends. eur Urol. 2017;71(1):96–108. Raziskovalni modeli raka sečnega mehurja za izboljšanje diagnosticiranja in zdravljenja 317 PRegledni znanstveni članek 2. Casilla-l ennon MM, Choi sk, deal aM, bensen Jt , narang g, Filippou P, et al. Financial t oxicity among Pati- ents with bladder Cancer: Reasons for delay in Care and effect on Quality of life. J Urol. 2018;199(5):1166–73. 3. siegel s, noblett k, Mangel J, bennett J, griebling tl, sutherland se, et al. Five-Year Followup Results of a Prospective, Multicenter s tudy of Patients with Overactive bladder t reated with sacral neuromodulation. J Urol. 2018;199(1):229–36. 4. Park s, Jee sH, shin HR, Park eH, shin a, Jung kW, et al. attributable fraction of tobacco smoking on cancer using population-based nationwide cancer incidence and mortality data in korea. bMC Cancer. 2014;14(1):406. 5. ng M, Freeman Mk, Fleming td, Robinson M, dwyer-lindgren l, thomson b, et al. smoking prevalence and cigarette consumption in 187 countries, 1980–2012. JaMa. 2014;311(2):183–92. 6. Moolgavkar sH, s tevens Rg. smoking and cancers of bladder and pancreas: risks and temporal trends. J natl Cancer inst. 1981;67(1):15–23. 7. eriksen M, Mackay J, schluger n, islami gomeshtapeh F, drope J. the tobacco atlas. 5th ed. new York: american Cancer society; 2015. 8. Cogliano vJ, baan R, straif k, grosse Y, lauby- secretan b, el ghissassi F, et al. Preventable exposures asso - ciated with human cancers. J natl Cancer inst. 2011;103(24):1827–39. 9. steinmaus C, Miller Md, Cushing l, blount bC, smith aH. Combined effects of perchlorate, thiocyanate, and iodine on thyroid function in the national Health and nutrition examination survey 2007–08. environ Res. 2013;123:17–24. 10. antonova O, t oncheva d, grigorov e. bladder cancer risk from the perspective of genetic polymorphisms in the carcinogen metabolizing enzymes. J bUOn. 2015;20(6):1397–406. 11. Jost sP, gosling Ja, dixon Js. the morphology of normal human bladder urothelium. J anat. 1989;167:103– 15. 12. Ovčak z. klasifikacija urotelnih tumorjev sečnega mehurja WHO/isUP (WHO/isUP classification of the urothelial tumors of the urinary bladder). z dr vestn. 2005;74:529–33. 13. Mertens ls, neuzillet Y, Horenblas s, van Rhijn bW. landmarks in non-muscle-invasive bladder cancer. nat Rev Urol. 2014;11(8):476–80. 14. epstein Ji, amin Mb, Reuter vR, Mostofi Fk; bladder Consensus Conference Committee. the World Health Organization/international society of Urological Pathology consensus classification of urothelial (transitio - nal cell) neoplasms of the urinary bladder. am J surg Pathol. 1998;22(12):1435–48. 15. babjuk M, burger M, zigeuner R, shariat sF, van Rhijn bW, Compérat e, et al.; european association of Uro- logy. eaU guidelines on non-muscle-invasive urothelial carcinoma of the bladder: update 2013. eur Urol. 2013;64(4):639–53. 16. Herr HW, donat sM. Quality control in transurethral resection of bladder tumours. bJU int. 2008;102(9b):1242– 6. 17. shariat sF, karakiewicz Pi, Palapattu gs, l otan Y, Rogers Cg, amiel ge, et al. Outcomes of radical cystectomy for transitional cell carcinoma of the bladder: a contemporary series from the bladder Cancer Research Consortium. J Urol. 2006;176(6 Pt 1):2414–22. 18. griffiths g, Hall R, sylvester R, Raghavan d, Parmar Mk; international Collaboration of t rialists; et al. inter- national phase iii trial assessing neoadjuvant cisplatin, methotrexate, and vinblastine chemotherapy for muscle-invasive bladder cancer: long-term results of the ba06 30894 trial. J Clin Oncol. 2011;29(16):2171–7. 19. nomura s, suzuki Y, t akahashi R, t erasaki M, kimata R, Hamasaki t , et al. snail expression and outcome in t1 high-grade and t2 bladder cancer: a retrospective immunohistochemical analysis. bMC Urol. 2013;13(1):73. 20. stein JP , skinner dg. Radical cystectomy for invasive bladder cancer: long-term results of a standard pro - cedure. World J Urol. 2006;24(3):296–304. 21. abdollah F, gandaglia g, thuret R, schmitges J, tian z, Jeldres C, et al. incidence, survival and mortality ra- tes of stage-specific bladder cancer in United s tates: a trend analysis. Cancer epidemiol. 2013;37(3):219–25. 22. devita vt , Chu e. a history of cancer chemotherapy. Cancer Res. 2008;68(21):8643–53. 23. ghosh M, brancato s J, agarwal Pk, apolo ab. t argeted therapies in urothelial carcinoma. Curr Opin Oncol. 2014;26(3):305–20. 24. gerlinger M, Catto JW, Orntoft tF, Real FX, z warthoff eC, swanton C. intratumour heterogeneity in urologic cancers: from molecular evidence to clinical implications. eur Urol. 2015;67(4):729–37. 25. kamat aM, tharakan st , sung b, aggarwal bb. Curcumin potentiates the antitumor effects of bacillus Cal- mette-guerin against bladder cancer through the downregulation of nF-kappab and upregulation of tRail receptors. Cancer Res. 2009;69(23):8958–66. 26. kreft Me, Hudoklin s, sterle M. establishment and characterization of primary and subsequent subcultures of normal mouse urothelial cells. Folia biol (Praha). 2005;51(5):126–32. 27. višnjar t , kocbek P, kreft Me. Hyperplasia as a mechanism for rapid resealing urothelial injuries and main- taining high transepithelial resistance. Histochem Cell biol. 2012;137(2):177–86. 28. Masters JR, Petzoldt Jl. In vitro studies on the pathogenesis of bladder cancer. verh dtsch ges Pathol. 1993;77:157–60. 29. van kessel ke, z uiverloon t C, alberts aR, boormans Jl, z warthoff eC. t argeted therapies in bladder cancer: an overview of in vivo research. nat Rev Urol. 2015;12(12):681–94. 30. sens da, Park s, gurel v, sens Ma, garrett sH, somji s. inorganic cadmium- and arsenite-induced malignant transformation of human bladder urothelial cells. t oxicol sci. 2004;79(1):56–63. 318 z drav vestn | maj – junij 2020 | l etnik 89 MikRObiOl OgiJa in iMUnOl OgiJa 31. deberardinis RJ, thompson Cb. Cellular metabolism and disease: what do metabolic outliers teach us? Cell. 2012;148(6):1132–44. 32. killion JJ, Radinsky R, Fidler iJ. Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tu- mors in mice. Cancer Metastasis Rev. 1998–1999;17(3):279–84. 33. kyker kd, Culkin dJ, Hurst Re. a model for 3-dimensional growth of bladder cancers to investigate cell-ma- trix interactions. Urol Oncol. 2003;21(4):255–61. 34. Resnik n, Prezelj t , de l uca gM, Manders e, Polishchuk R, veranič P , et al. Helical organization of microtu- bules occurs in a minority of tunneling membrane nanotubes in normal and cancer urothelial cells. sci Rep. 2018;8(1):17133. 35. Ogorevc e, Hudoklin s, veranič P , kralj-iglič v. extracellular vesicle-mediated transfer of membranous com- ponents from the highly malignant t24 urinary carcinoma cell line to the non-malignant R t4 urinary papil- loma cell line. Protoplasma. 2014;251(3):699–702. 36. lainšček d, kadunc l, keber MM, bratkovič iH, Romih R, Jerala R. delivery of an artificial t ranscription Regu- lator dCas9-vPR by extracellular vesicles for therapeutic gene activation. aCs synth biol. 2018;7(12):2715– 25. 37. ibrahiem eH, nigam vn, brailovsky Ca, Madarnas P, elhilali M. Orthotopic implantation of primary n-[4-(- 5-nitro-2-furyl)-2-thiazolyl]formamide-induced bladder cancer in bladder submucosa: an animal model for bladder cancer study. Cancer Res. 1983;43(2):617–22. 38. günther JH, Jurczok a, Wulf t , brandau s, deinert i, Jocham d, et al. Optimizing syngeneic orthotopic mu- rine bladder cancer (Mb49). Cancer Res. 1999;59(12):2834–7. 39. Clayson db, Fishbein l, Cohen sM. effects of stones and other physical factors on the induction of rodent bladder cancer. Food Chem t oxicol. 1995;33(9):771–84. 40. knapp dW, Henry CJ, Widmer WR, t an kM, Moore ge, Ramos- vara Ja, et al. Randomized trial of cisplatin versus firocoxib versus cisplatin/firocoxib in dogs with transitional cell carcinoma of the urinary bladder. J vet intern Med. 2013;27(1):126–33. 41. knapp dW, Ramos-vara Ja, Moore ge, dhawan d, bonney Pl, Young ke. Urinary bladder cancer in dogs, a naturally occurring model for cancer biology and drug development. ilaR J. 2014;55(1):100–18. 42. sausville ea, burger aM. Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development. Can- cer Res. 2006;66(7):3351–4. 43. Jäger W, Xue H, Hayashi t , Janssen C, awrey s, Wyatt aW, et al. Patient-derived bladder cancer xenografts in the preclinical development of novel targeted therapies. Oncotarget. 2015;6(25):21522–32. 44. Matsuo t , Miyata Y, asai a, sagara Y, Furusato b, Fukuoka J, et al. green t ea Polyphenol induces Changes in Cancer-Related Factors in an animal Model of bladder Cancer. Pl os One. 2017;12(1):e0171091. 45. slocum sl, kensler tW. nrf2: control of sensitivity to carcinogens. arch t oxicol. 2011;85(4):273–84. 46. gofrit On, birman t , dinaburg a, ayesh s, Ohana P , Hochberg a. Chemically induced bladder cancer—a sonographic and morphologic description. Urology. 2006;68(1):231–5. 47. ariel i, ayesh s, gofrit O, ayesh b, abdul-ghani R, Pizov g, et al. gene expression in the bladder carcinoma rat model. Mol Carcinog. 2004;41(2):69–76. 48. bertram Js, Craig aW. specific induction of bladder cancer in mice by butyl-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine and the effects of hormonal modifications on the sex difference in response. eur J Cancer. 1972;8(6):587–94. 49. kunze e, Chowaniec J. Pathology of tumours in laboratory animals. t umours of the rat. t umours of the urinary bladder. iaRC sci Publ. 1990(99):345–97. 50. Okajima e, Hiramatsu t , Hirao k, ijuin M, Hirao Y, babaya k, et al. Urinary bladder tumors induced by n-butyl-n-(4-hydroxybutyl)nitrosamine in dogs. Cancer Res. 1981;41(5):1958–66. 51. vasconcelos-nóbrega C, Colaço a, l opes C, Oliveira Pa. Review: bbn as an urothelial carcinogen. in vivo. 2012;26(4):727–39. 52. t suda H, Miyata Y, Hagiwara a, Hasegawa R, shirai t , ito n. damage and repair of dna in urinary bladder epithelium of rats treated with n-butyl-n-(4-hydroxybutyl) nitrosamine. gan. 1977;68(6):781–3. 53. airoldi l, Magagnotti C, bonfanti M, Fanelli R. alpha-oxidative metabolism of the bladder carcinogens n-ni- trosobutyl(4-hydroxybutyl)amine and n-nitrosobutyl(3-carboxypropyl)amine within the rat isolated blad- der. Carcinogenesis. 1990;11(8):1437–40. 54. Cohen sM, Ohnishi t , Clark nM, He J, arnold ll. investigations of rodent urinary bladder carcinogens: col- lection, processing, and evaluation of urine and bladders. t oxicol Pathol. 2007;35(3):337–47. 55. Cohen sM. Urinary bladder carcinogenesis. t oxicol Pathol. 1998;26(1):121–7. 56. Ohtani M, kakizoe t , nishio Y, sato s, sugimura t , Fukushima s, et al. sequential changes of mouse blad- der epithelium during induction of invasive carcinomas by n-butyl-n-(4-hydroxybutyl)nitrosamine. Cancer Res. 1986;46(4 Pt 2):2001–4. 57. z upančič d, Ovčak z, vidmar g, Romih R. altered expression of UPia, UPib, UPii, and UPiiia during urothelial carcinogenesis induced by n-butyl-n-(4-hydroxybutyl)nitrosamine in rats. virchows arch. 2011;458(5):603– 13. 58. z upančič d, kreft Me, Romih R. selective binding of lectins to normal and neoplastic urothelium in rat and mouse bladder carcinogenesis models. Protoplasma. 2014;251(1):49–59. 59. Chan es, Patel aR, smith ak, klein Jb, thomas aa, Heston Wd, et al. Optimizing orthotopic bladder tumor implantation in a syngeneic mouse model. J Urol. 2009;182(6):2926–31. 60. sengeløv l, kamby C, von der Maase H. Pattern of metastases in relation to characteristics of primary tumor and treatment in patients with disseminated urothelial carcinoma. J Urol. 1996;155(1):111–4. Raziskovalni modeli raka sečnega mehurja za izboljšanje diagnosticiranja in zdravljenja 319 PRegledni znanstveni članek 61. Xiao z, McCallum tJ, brown kM, Miller gg, Halls sb, Parney i, et al. Characterization of a novel transplanta- ble orthotopic rat bladder transitional cell tumour model. br J Cancer. 1999;81(4):638–46. 62. Marks P, soave a, shariat sF, Fajkovic H, Fisch M, Rink M. Female with bladder cancer: what and why is there a difference? t ransl androl Urol. 2016;5(5):668–82. 63. erman a, kapun g, novak s, Pavlin M, dražić g, drobne d, et al. How cancer cells attach to urinary bladder epithelium in vivo: study of the early stages of tumorigenesis in an orthotopic mouse bladder tumor model. Histochem Cell biol. 2019;151(3):263–73. 64. abate-shen C, Pandolfi PP . effective utilization and appropriate selection of genetically engineered mouse models for translational integration of mouse and human trials. Cold spring Harb Protoc. 2013;2013(11):pdb. top078774. 65. kobayashi t , Owczarek tb, Mckiernan JM, abate-shen C. Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges. nat Rev Cancer. 2015;15(1):42–54. 66. Cancer genome atlas Research network. Comprehensive molecular characterization of urothelial bladder carcinoma. nature. 2014;507(7492):315–22. 67. Wu XR, lin JH, Walz t , Häner M, Yu J, aebi U, et al. Mammalian uroplakins. a group of highly conserved urothelial differentiation-related membrane proteins. J biol Chem. 1994;269(18):13716–24. 68. Wu XR, Manabe M, Yu J, sun tt . large scale purification and immunolocalization of bovine uroplakins i, ii, and iii. Molecular markers of urothelial differentiation. J biol Chem. 1990;265(31):19170–9. 69. zhang zt , Pak J, shapiro e, sun tt , Wu XR. Urothelium-specific expression of an oncogene in transgenic mice induced the formation of carcinoma in situ and invasive transitional cell carcinoma. Cancer Res. 1999;59(14):3512–7. 70. ayala de la Peña F, kanasaki k, kanasaki M, t angirala n, Maeda g, kalluri R. l oss of p53 and acquisition of angiogenic microRna profile are insufficient to facilitate progression of bladder urothelial carcinoma in situ to invasive carcinoma. J biol Chem. 2011;286(23):20778–87. 71. s tone R, sabichi al, gill J, l ee il, adegboyega P , dai Ms, et al. identification of genes correlated with early- -stage bladder cancer progression. Cancer Prev Res (Phila). 2010;3(6):776–86. 72. Wu XR. biology of urothelial tumorigenesis: insights from genetically engineered mice. Cancer Metastasis Rev. 2009;28(3–4):281–90. 73. Puzio-kuter aM, Castillo-Martin M, kinkade CW, Wang X, shen tH, Matos t , et al. inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer. genes dev. 2009;23(6):675–80. 74. Ramesh n, Memarzadeh b, ge Y, Frey d, vanRoey M, Rojas v, et al. identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Mol ther. 2004;10(4):697–705. 75. seager CM, Puzio-k uter aM, Patel t , Jain s, Cordon-Cardo C, Mc kiernan J, et al. intravesical delivery of rapamycin suppresses tumorigenesis in a mouse model of progressive bladder cancer. Cancer Prev Res (Phila). 2009;2(12):1008–14. 76. kim Y J, varki a. Perspectives on the significance of altered glycosylation of glycoproteins in cancer. glyco - conj J. 1997;14(5):569–76. 77. višnjar t , Romih R, z upančič d. l ectins as possible tools for improved urinary bladder cancer management. glycobiology. 2019;29(5):355–65. 78. z upančič d, kreft Me, grdadolnik M, Mitev d, iglič a, veranič P. detonation nanodiamonds are promising nontoxic delivery system for urothelial cells. Protoplasma. 2018;255(1):419–23. 79. imani R, veranič P , iglič a, kreft Me, Pazoki M, Hudoklin s. Combined cytotoxic effect of Uv -irradiation and tiO2 microbeads in normal urothelial cells, low-grade and high-grade urothelial cancer cells. Photochem Photobiol sci. 2015;14(3):583–90. 80. erman a, veranič P . the Use of Polymer Chitosan in intravesical t reatment of Urinary bladder Cancer and infections. Polymers (basel). 2018;10(3):e265.