Simpozij z mednarodno udeležbo Vodni dneVi 2017           Portorož, 5.–6. oktober 2017
65 64
PoJAVnoST, KR oŽenJe in 
UČinKi PRoTiRAKAViH ZdRAViL  
V VodneM oK oLJU
dr. MARJeTA ČeSen
1
, doc. dr. TinA KoSJeK
2
, prof. dr. BoRiS K oMPARe
3
, 
doc. dr. TinA eLeRŠeK
4
, MATJAŽ no VAK
5
, doc. dr. BoJAnA ŽeGURA
6
, 
prof. dr. MeTKA FiLiPiČ
7
, doc. dr. FRAnCeSCo BUSeTTi
8
, 
prof. dr. eSTeR HeATH
9
Povzetek 
Preverjali smo pojavnost citostatikov ciklofosfamida (CP), ifosfamida (IF) in transformacij-
skih produktov (TP) ketociklofosfamida (keto-CP), N-dekloroetilciklofosfamida (N-decl-CP) 
in karboksiciklofosfamida (karboksi-CP) v slovenskih odpadnih vodah (OV). CP smo zaznali 
v bolnišnični OV (14-22000 ng/L), v vtoku v čistilno napravo (ČN; 19-27 ng/L) in iztoku iz 
ČN (17 ng/L), medtem ko smo IF določili samo v bolnišnični OV (48-6800 ng/L). Koncentra-
cije karboksi-CP, N-decl-CP in keto-CP so znašale 213-13202 ng/L, 60-2099 ng/L in <LOD-
178 ng/L v bolnišnični OV. Na ČN so bile koncentracije TP-jev <LOD. Proučevali smo tudi 
biološko in abiotsko odstranitev CP-jev in IF-ja. Najvišja odstranitev (99 % za CP-je in 94 
% za IF) je bila dosežena z UV/O3/H2O2. Med UV-obsevanjem smo identificirali TP-je (CP: 
N-decl-CP, keto-CP, imino-fosfamid, CP-TP138a, CP-138b; IF: N-dechloroethyl-ifosfamid, 
keto-ifosfamid, imino-ifosfamid, IF-TP138). Karboksi-CP je izkazal inhibicijo rasti Syneco-
coccus leopoliensis (EC50 = 17,1 mg/L). Genotoksičnost smo potrdili za CP, karboksi-CP in 
zmes (z metabolno aktivacijo +S9) in za karboksi-CP (brez -S9).
Ključne besede: abiotsko čiščenje, biološko čiščenje, citostatik, ekotoksičnost, genotoksič-
nost, metaboliti, odpadne vode, pojavnost, transformacijski produkt
1 Dr. Marjeta Česen, asistent z doktoratom, Odsek za znanosti o okolju, Institut Jožef Stefan, Mednarodna podiplomska 
šola Jožefa Stefana 
2 Doc. dr. Tina Kosjek, znanstvena sodelavka, Odsek za znanosti o okolju, Institut Jožef Stefan, Mednarodna podiplomska 
šola Jožefa Stefana 
3 Prof. dr. Boris Kompare, profesor, Oddelek za okoljsko gradbeništvo, Fakulteta za gradbeništvo in geodezijo, Univerza v 
Ljubljani 
4 Doc. dr. Tina Eleršek, znanstvena sodelavka, Oddelek za genetsko toksikologijo in biologija raka, Nacionalni inštitut za 
biologijo 
5 Matjaž Novak, doktorski študent, Mednarodna podiplomska šola Jožefa Stefana, Oddelek za genetsko toksikologijo in 
biologija raka, Nacionalni inštitut za biologijo 
6 Doc. dr. Bojana Žegura, znanstvena sodelavka, Oddelek za genetsko toksikologijo in biologija raka, Nacionalni inštitut 
za biologijo 
7 Prof. dr. Metka Filipič, profesor, Oddelek za genetsko toksikologijo in biologija raka, Nacionalni inštitut za biologijo 
8 Doc. dr. Francesco Busetti, znanstveni sodelavec, Curtin University, Curtin Water Quality Research Centre (CWQRC) 
9 Prof. dr. Ester Heath, profesor, Odsek za znanosti o okolju, Institut Jožef Stefan, Mednarodna podiplomska šola Jožefa 
Stefana 
šin in povečevanje zelenih površin v mestih, vključno s parki in zelenimi strehami. Vsi ti ukrepi 
bi hkrati ugodno vplivali tudi na kroženje ogljika in blažili učinek tople grede.
LiTeRATURA in ViRi
1. Anav, A., Mariotti, A., Sensitivity of natural vegetation to climate change in the Euro-Mediterranean area. 
Climate Research, 2011, 46, 3, 277–292.
2. Buckley, T. N., The control of stomata by water balance. New Phytologist, 2005, 168, 2, 275–291. 
3. Duran, Z. H. V., Pleguezuelo, C. R. R., Soil-erosion and runoff prevention by plant covers. A revew. Agro-
nomic Sustainable Development, 2008, 28, 65-86.
4. Gorshkov, V. G., Makarieva, A. M., Gorshkov, V. V., Revising the fundaments of ecological knowledge: the 
biota-environment interaction. Ecological Complexity, 2004, 1, 17–36.
5. Gurevitch, J., Scheiner, S. M., Fox, G., 2002. The Ecology of Plants. Sinauer Associates.
6. Haslam, S. M., 1991. The Historic River. Rivers and culture down the ages Cobden of Cambridge Press, 
Cambridge, England.
7. Kravčík, M., Pokorný, J., Kohutiar, J., Kováč, M., Tóth, E., 2008. Water for the Recovery of the Climate - A 
New Water Paradigm. Krupa Print, Žilina.  
8. Larcher, W., 2001. Physiological Plant Ecology, 4th edition. Springer Verlag, pp 232-295.
9. Millennium Ecosystem Assessment, 2005. Ecosystems and human well-being: synthesis. Island Press, 
Washington, DC.
10. Raval, A., Ramanathan, V., Observational determination of the greenhouse-effect. Nature, 1989, 342, 
6251, 758–761.
11. Schlesinger, W. H., Reynolds, J .G., Cuningham, G. L., Huennecke, W. M., Jarrell, W. M., Virginia, R. A., 
Withford, W. G., Biological feedbacks in global desertification. Science, 1990, 247, 1043–1048.
12. Schulze, E. D., Beck, E., Müller- Hohenstein, K., 2005. Plant Ecology. Springer, Heidelberg. 
13. Takahashi, M., Giambelluca, T. W., Mudd, R. G., Delay, J. K., Nullet, M. A., Asner, G. P., Rainfall partitioning 
and cloud water interception in native forest and invaded forest in Hawai›i Volcanoes National Park. Hy-
drological processes, 2011, 25, 3, 448–464.

Simpozij z mednarodno udeležbo Vodni dneVi 2017           Portorož, 5.–6. oktober 2017
67 66
Slika 1: Kemijska struktura preiskovanih spojin
2. MATeRiALi in MeT ode
2.1.  Standardi, reagenti in kemikalije
CP, IF in derivatizacijsko sredstvo za TP-je, N-(terc-butildimetilsilil)-N-metil-trifluoroacetamid 
z 1-% terc-butildimetilklorsilanom (MTBSTFA z 1-% TBDMCS) smo kupili pri Sigma-Aldrich 
(Steinheim, Nemčija). Derivatizacijsko sredstvo za CP in IF, trifluoroocetni anhidrid (TFAA) 
smo kupili pri Fluki (Buchs, Švica). Karboksi-CP, 4-keto-CP, N-decl-CP in devteriran ciklofos-
famid-d6 (interni standard za CP in IF analizo) smo kupili pri podjetju Niomech-IIT GmbH 
(Bielefeld, Nemčija), devteriran ibuprofen-d3 (interni standard za TPje) pa pri CDN Isotopes 
(Quebec, Kanada). Vsa uporabljena topila so imela analitsko čistost.
2.2. Priprava vzorcev
Za analizo na osnovi plinske kromatografije sklopljene z masno spektrometrijo smo 100 mL vzor -
ca OV, ki je vseboval CP, IF in keto-CP, koncentrirali s postopkom ekstrakcije na trdnem nosilcu 
(SPE) s kartušami Oasis™ HLB (60 mg, 3 mL). Kartuše smo kondicionirali s 3 mL etil acetata 
(EtAc), 3 mL metanola (MeOH) in 3 mL vode. Po nanosu vzorca in sušenju sorbenta smo analite 
eluirali s 3 ml EtAc (Česen idr., 2015). SPE za karboksi-CP in N-decl-CP smo izvedli s kartušami 
Isolute ENV + (100 mg, 3 mL). Kondicioniranje, nanos vzorca in sušenje sorbenta smo izvedli na 
enak način kot za CP, IF in keto-CP. V tem primeru smo analite eluirali s 6 mL 5-% ocetne kisline 
v EtAc (Česen idr., 2016). Derivatizacijo CP-ja in IF-ja smo izvedli s 100 μL TFAA v 100 μL EtAc. 
Vzorce smo derivatizirali 1 uro pri 60 °C. Metabolite/TP-je smo derivatizirali s 30 μL MTBSTFA z 1 
% TBDMCS v 220 μL ACN, kjer smo ekstrakte segrevali 20 ur pri 90 °C (Česen idr., 2016). 
Za identifikacijo TP-jev, ki so se tvorili med obsevanjem z UV in UV/H
2
O
2
, smo vzorce direktno inji-
cirali na tekočinski kromatograf, sklopljen z masnim spektrometrom visoke ločljivosti (LC-HRMS).
Abstract 
The occurrence of cytostatics cyclophosphamide (CP), ifosfamide (IF) and transformation 
products (TPs) ketocyclophosphamide (keto-CP), N-dechloroethylcyclophosphamide (N-de-
cl-CP) and carboxy-cyclophosphamide (carboxy-CP) in Slovene wastewaters (WWs) was 
studied. CP was detected in hospital WWs (14-22,000 ng/L), wastewater treatment plant 
(WWTP) influent (19-27 ng/L) and effluent (17 ng/L). IF was detected in hospital WW (48-
6,800 ng/L). Carboxy-CP, N-decl-CP and keto-CP concentrations were 213-13,202 ng/L, 60-
2,099 ng/L and <LOD-178 ng/L in hospital WW, respectively. At WWTPs they were <LODs. 
The biological and abiotic removal of CP and IF was also studied. The highest removal (99 
% for CP and 94 % for IF) was achieved by UV/O3/H2O2. The formation of TPs (CP: N-de-
cl-CP, keto-CP, imino-phosphamide, CP-TP138a, CP-138b; IF: N-dechloroethyl-ifosfamide, 
keto-ifosfamide, imino-ifosfamide, IF-TP138) was confirmed during UV-irradiation. Growth 
inhibition of Synecococcus leopoliensis was observed for carboxy-CP (EC50=17.1 mg/L). CP, 
carboxy-CP and mixture were genotoxic (with metabolic activation +S9) and carboxy-CP 
was genotoxic also without -S9.
1. UVod
Povečanje incidence raka je povezano z naraščajočo porabo zdravilnih učinkovin (ZU) za zdra-
vljenje raka, ki se izločajo iz telesa predvsem z urinom kot zmesi starševskih spojin in njihovih 
metabolitov. Tovrstne mešanice se odplaknejo v kanalizacijsko omrežje in preko iztokov iz či-
stilne naprave (ČN) lahko pridejo v površinske vode. Med številnimi registriranimi zdravilnimi 
učinkovinami za zdravljenje raka sta dva izmed najstarejših predstavnikov ciklofosfamid (CP) 
in ifosfamid (IF) še vedno pogosto predpisana, kljub poznanim neželenim učinkom. Koncen-
tracije CP in IF v bolnišničnih odpadnih vodah (OV), OV iz ČN ter površinskih vodah se gibljejo 
v območju ng/L do μg/L, njihovi aktivni metaboliti in transformacijski produkti (TP) pa ostaja-
jo v veliki meri neproučeni, predvsem zaradi zahtevnosti problematike in nizkih koncentracij 
(Kosjek in Heath, 2011). Za zniževanje prisotnosti ostankov CP-jev in IF-ja v OV in posledično 
površinskih vodah je pomemben razvoj novih tehnologij čiščenja OV. Poleg tega je tudi po-
znavanje njihovih razgradnih poti izrednega pomena, saj so lahko TP-ji, ki se tvorijo v času 
določenega čiščenja OV, še bolj strupeni za vodne organizme kot starševske spojine.
V okviru te študije smo proučevali pojavnost, kroženje in učinke citostatikov CP-jev, IF-ja in 
njihovih izbranih metabolitov/TP-jev: 4-ketociklofosfamid (keto-CP), N-dekloroetilciklofosfa-
mid ali 3-dekloretilifosfamid (N-decl-CP) in karboksi-ciklofosfamid (karboksi-CP, slika 1). V ta 
namen smo razvili analizne metode za njihovo določitev v različnih vrstah OV. Validirane meto-
de smo nato uporabili za analizo različnih bolnišničnih OV ter vtokov in iztokov iz pripadajočih 
ČN. Raziskovali smo tudi odstranjevanje in transformacije starševskih spojin med različnimi 
biološkimi in abiotskimi postopki čiščenja ter preverili ekotoksičnost in genotoksičnost vseh 
preiskovanih spojin in njihovih mešanic.

Simpozij z mednarodno udeležbo Vodni dneVi 2017           Portorož, 5.–6. oktober 2017
69 68
Tabela 1: Seznam vzorcev OV in določene koncentracije CP-ja in IF-ja
Vzorec Datum CP (ng/L) IF (ng/L)
A:  
bolnišnična OV
15. 4. 2013 754 ± 28,2 2040 ± 136
5. 12. 2013 14,6 ± 0,351 <LOD
16. 1. 2014 1080 ± 200 47,9 ± 10,3
9. 5. 2014 5320 ± 33,2 6810 ± 0,619
4. 6. 2014 22100 ± 764 <LOD
B:  
bolnišnična OV 
21. 11. 2013 129 ± 16,3 <LOD
21. 11. 2013 125 <LOD
A and B: 
pripadajoči vtoki v ČN
9. 12. 2013 <LOD <LOD
29. 1. 2014* 27,4 ± 7,35 <LOD
2. 6. 2014 19,0 ± 3,44 <LOD
A and B: 
pripadajoča iztoka iz ČN
10. 12. 2013 <LOD <LOD
3. 6. 2014 17,4 ± 5,02 <LOD
C: 
bolnišnična OV/vtok ČN
28. 11. 2013 <LOD <LOD
C: 
pripadajoč iztok iz ČN
28. 11. 2013 <LOD <LOD
D:  
bolnišnična OV
14. 11. 2013 <LOD <LOD
D: 
pripadajoč vtok na ČN
14. 11. 2013 <LOD <LOD
D: 
pripadajoč iztok iz ČN
15. 11. 2013 <LOD <LOD
E:
bolnišnična OV (brez ČN)
7. 11. 2013 <LOD <LOD
* V tem primeru ni bil vzorčen iztok iz ČN. 
2.5. Čiščenje oV na laboratorijskem nivoju
Odstranitev CP-jev in IF-ja smo proučevali v prezračevanih pretočnih bioreaktorjih s pritrjeno 
biomaso na nosilcih Mutag BiochipTM. CP in IF smo dodajali v umetno pripravljeno OV s kon- 
čno koncentracijo 10 μg/L, ki smo jo uvajali v dva bioreaktorja med 3-mesečnim eksperimen-
tom (pretok: 4 L/dan). Tretji bioreaktor je služil kot kontrolni bioreaktor (slika 2).
2.3. Kemijska analiza
2.3.1. GC/MS 
Za kemijsko analizo realnih vzorcev OV in vzorcev OV iz laboratorijskih eksperimentov (bio-
loško in abiotsko čiščenje) smo uporabili plinski kromatograf serije HP 6890 s kvadrupolnim 
masnim spektrometrom (Hewlett-Packard, Waldbron, Nemčija). Kromatografsko ločbo smo 
izvedli na kapilarni koloni DB-5 MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm, Agilent, ZDA) in s He kot 
nosilnim plinom. Za optimalno kromatografsko ločbo smo uporabili dva različna temperaturna 
programa (Česen idr., 2015; Česen idr., 2016). Identifikacijo analitov smo opravili v načinu 
selektivnega ionskega spremljanja (SIM mode) s primerjavo retencijskega časa standardov 
in vzorcev ter s spremljanjem izbranih ionov derivatiziranih analitov (Česen idr., 2016; Česen 
idr., 2015).
2.3.2. LC/HrMS 
Neznane strukture TP-jev smo identificirali s pomočjo kemijske analize na LC-HRMS sistemu 
Thermo Accela 600 LC, ki je sklopljen z masnim spektrometrom LTQ Orbitrap XL (Thermo 
Fisher Scientific Corporation, Waltham, MA, ZDA). Sistem je bil opremljen z ionizacijo z ele-
ktrosprejem. Kromatografsko ločbo smo dosegli z uporabo kolone Kinetex C18 (100 mm × 
2,1 mm, 3 μm, 100 Å, Phenomenex, Sydney, Avstralija). Kot mobilno fazo smo uporabili ultra 
čisto vodo in metanol z dodatkom 0,1-% mravljinčne kisline. Strukturo TP-jev smo določili v 
načinu »data dependent mode« na osnovi petih najintenzivnejših ionov v MS spektru (Česen 
idr., 2016).
2.4. Vzorčenje
V okviru raziskave smo izvedli dve vzorčenji OV. Med prvim vzorčenjem smo zbrali vzorce OV 
iz petih slovenskih bolnišnic in pripadajoče vtoke in iztoke iz ČN (april, 2013–junij, 2014; ta-
bela 1) in v njih določili koncentracije starševskih spojin (CP in IF). Drugo vzorčenje (15. 12. 
2014–21. 12. 2014) smo izvedli v 7 zaporednih dneh v bolnišnici A (tabela 1) in sredi tedna 
na pripadajoči ČN, kjer smo preverjali prisotnost tako starševskih spojin kot tudi izbranih 
metabolitov/TP-jev. Vsi vzorci OV iz bolnišnice so bili vzorčeni trenutno, vzorci iz ČN pa so bili 
časovno povprečni 24-urni. Tehnologija čiščenja OV na ČN, vključenih v to študijo, je temeljila 
na čiščenju s suspendirano biomaso (ČN, ki prejme OV iz bolnišnic A, B in C) ali na čiščenju z 
membransko biofiltracijo (ČN, ki prejme vodo iz bolnišnice D). 
 

Simpozij z mednarodno udeležbo Vodni dneVi 2017           Portorož, 5.–6. oktober 2017
71 70
Tvorbo TP-jev smo proučevali med postopkoma čiščenja UV in UV/H
2
O
2
 (koncentracija H
2
O
2
 
8,5 mg/L) v steklenem reaktorju pri koncentraciji 26,1 mg/L CP oziroma IF (V = 500 mL deio-
nizirane vode). Vsebino reaktorja smo mešali z magnetnim mešalom (500 rpm), za obsevanje 
pa smo uporabili nizkotlačno živosrebrovo sijalko (15 W, intenziteta UV = 4,5 × 10
-6
/Ein). Po-
skusi so trajali 60 min (UV) oziroma 36 min. (UV/H
2
O
2
).
2.6. ocena strupenosti
Ocenili smo ekotoksičnost in genotoksičnost preiskovanih posameznih spojin (CP, IF, karbo-
ksi-CP, keto-CP in N-decl-CP) ter njihove mešanice. Za oceno ekotoksičnosti smo kot testne 
organizme uporabili zelene alge Pseudokirchneriella subcapitata SAG 61.81 in cianobakterije 
Synechococcus leopoliensis SAG 1402-1, ki so bile gojene in izpostavljene posamezni spojini 
ali zmesi, kot je opisano v OECD TG 201. Rast celic smo določili s pretočnim citometrom (BD 
FACSCalibur, Sparks, MD, USA). Testirane koncentracije posameznih spojin so bile 3,05; 9,77; 
31,25; 100 in 320 mg/L, medtem ko smo koncentracije vsake spojine v zmesi določili na pod-
lagi vrednosti EC
5-90
 spojine karboksi-CP (6,0; 7,9; 10,5; 17,1 in 37,2 mg/L, tabela 2).
Genotoksičnost preiskovanih spojin in zmesi smo ocenili s testom SOS/umuC (Reifferscheid 
idr., 1991). Testne koncentracije spojin so bile enake kot pri ekotoksikološkem testiranju. 
Eksperimente smo izvedli na genetsko spremenjenem organizmu S. typhimurium TA1535/
pSK1002 v prisotnosti metabolne aktivacije (+S9) in v njeni odsotnosti (–S9). Genotoksično 
aktivnost smo določili z indukcijskim razmerjem (IR), pri čemer je bil IR ≥ 2 prag, pri katerem 
je bila spojina/zmes spoznana kot genotoksična (Reifferscheid idr., 1991). Analize podatkov 
smo izvedli z uporabo programske opreme Prism 5 (GraphPad Inc., La Jolla, ZDA).
3. ReZULTATi
3.1. Kemijska analiza realnih oV
V sklopu prvega vzorčenja sta dva vzorca OV vsebovala CP v koncentracijah med 14,6 in 
22100 ng/L, IF pa smo določili le v eni bolnišnični OV (< LOD do 6810 ng/L; tabela 1). CP smo 
določili tudi v dveh vzorcih vtoka v ČN (19–27 ng/L) in enkrat v pripadajočem iztoku iz ČN (17 
ng/L). Koncentracije IF-ja so bile < LOD v vseh vtokih in iztokih iz ČN, ki smo jih vključili v to 
študijo (tabela 1).
Analiza vzorcev OV iz bolnišnice v okviru drugega vzorčenja je pokazala naslednje najvišje 
koncentracije: CP = 2690 ng/L, IF = 47,9 ng/L, karboksi-CP = 13200 ng/L, N-decl-CP = 2100 
ng/L in keto-CP = 178 ng/L, medtem ko so bile koncentracije v pripadajočem vtoku in iztoku 
iz ČN < LOD. Karboksi-CP smo zaznali v najvišjih koncentracijah, IF pa v najnižjih (25–47 
ng/L, slika 4). Najvišje koncentracije analitov so bile določene v vzorcih, zbranih med torkom 
in petkom. Koncentracije CP-ja in IF-ja so primerljive z literaturnimi podatki, medtem ko je 
bila prisotnost preiskovanih metabolitov/TP-jev v OV prvič kvantitativno ovrednotena v naši 
raziskavi (Kosjek in Heath, 2011; Česen idr., 2016).
Slika 2: Pretočni bioreaktorji s pritrjeno biomaso
Uspešnost odstranjevanja CP-ja in IF-ja smo poleg biološkega čiščenja proučevali tudi pri 
naslednjih abiotskih postopkih čiščenja OV: UV-obsevanje, ozonacija (O
3
) ter napredni oksi-
dacijski postopki (AOP), kot so UV/O
3
, UV/H
2
O
2
, O
3
/H
2
O
2
 in UV/O
3
/H2O
2
. Vzorec OV (4,8 L) s 
koncentracijo 10 μg/L CP ali IF smo izpostavili posameznemu postopku čiščenja, pri čemer je 
vzorec krožil po sistemu s pretokom 60 L/uro (slika 3). Vzorce smo izpostavili posameznemu 
postopku za 0–120 min in eksperimente izvedli pri različnih začetnih koncentracijah H
2
O
2
 (0–5 
g/L). Generator ozona je proizvajal O
3 
v končni koncentraciji 10 mg/L. Za UV-obsevanje vzor-
ca smo uporabili nizkotlačno bakreno UV sijalko (12 W, UV-doza: 44 mJ/cm
2
). Da bi povečali 
uspešnost odstranitve izbranih spojin, smo najučinkovitejši AOP (UV/O
3
/H
2
O
2
) zaporedno ve-
zali z biološkim čiščenjem.
Slika 3: Shema naprave abiotskega postopka čiščenja OV

Simpozij z mednarodno udeležbo Vodni dneVi 2017           Portorož, 5.–6. oktober 2017
73 72
Med abiotskim čiščenjem (UV in UV/H
2
O
2
) smo identificirali več TP-jev. S kemijsko analizo 
smo potrdili nastanek štirih TP-jev iz CP-ja (N-decl-CP, keto-CP, CP-TP138a in CP-TP138b) in 
štirih TP-jev iz IF-ja (N-dekloroetil-ifosfamid, keto-ifosfamid, imino-ifosfamid in IF -TP138) 
med UV-obsevanjem. Med čiščenjem z UV/H
2
O
2 
smo poleg vseh TP-jev, ki smo jih zaznali pri 
UV obsevanju, identificirali še dodatni TP iz CP-ja, imino-fosfamid. Z identifikacijo navedenih 
TP-jev smo potrdili, da so nekateri TP-ji, ki se tvorijo med abiotskimi postopki čiščenja, lahko 
strukturni analogi humanih metabolitov (Li idr., 2010). Poleg tega smo kot prvi identificirali tri 
TP-je (CP-TP138a, imino-ifosfamid in IF-TP138), ki so prikazani na sliki 6 (Česen idr., 2016).
Slika 6: Novi TP-ji (od leve proti desni: CP-TP138a, imino-ifosfamid in IF-TP138)
3.3. ocena toksičnosti
Ugotovili smo, da sta CP in IF nestrupena za organizma P. subcapitata in S. leopoliensis pri 
koncentracijah do 320 mg/L (tabela 2). Dobljeni rezultati so v skladu z literaturo za CP, med-
tem ko za IF tovrstni podatki niso na voljo (Grung idr., 2008; Zounkova idr., 2007). Kot prvi 
smo proučevali ekotoksičnost izbranih metabolitov/TP-jev na S. leopoliensis, kjer je le spojina 
karboksi-CP signifikantno inhibirala rast cianobakterij (EC50 = 17,1 mg/L; tabela 2).
Tabela 2: ECx in NOEC (no observed effect concentration)  
vrednosti za vsako spojino na organizmu S. leopoliensis;  
n.c. = not converged (program Prism 5)
Spojina EC5-90 in 95 % CI (mg/L) NOEC (mg/L)
CP n.c. > 320 
IF n.c. > 320
karboksi-CP
EC
5
: 6,0 (4,4 – 8,3)
EC
10
: 7,9 (6,0 – 10,2)
EC
20
: 10,5 (8,5 – 12,9)
EC
50
: 17,1 (14,4 – 20,3)
EC
90
: 37,2 (27,8 – 49,7)
9,8 
Keto-CP n.c. > 320 
N-decl-CP n.c > 320
Slika 4: Dnevne koncentracije preiskovanih spojin v bolnišnični OV (15. 12. 2014–21.12.2014; SD < 15,9 % 
za vse spojine)
3.2. Čiščenje oV
Povprečni delež odstranitve CP-ja in IF-ja med biološkim čiščenjem je znašal 42 % za CP in 18 
% za IF, kar smo pričakovali, saj sta CP in IF iz literaturnih podatkov znani kot biološko slabo 
razgradljivi spojini (Česen idr., 2015). Uspešnost odstranitve CP-ja in IF-ja po 120 min različ-
nih abiotskih čiščenj je prikazana na sliki 5. Višanje koncentracije H
2
O
2
 je povečalo odstotek 
odstranitve CP-ja in IF-ja v primeru čiščenja z UV/H
2
O
2
, medtem ko smo opazili obraten pojav 
pri postopku z O
3
. Kljub temu smo dosegli najvišji odstotek odstranitve, npr. 99 % za CP in 94 
% za IF s kombinacijo UV/O
3
/H
2
O
2
 pri 5 g/L (slika 5). Z zaporedno vezanim postopkom čišče-
nja (biološko čiščenje ter UV/O
3
/H
2
O
2
 pri 5 g/L) pa smo prvi dosegli zelo visoko odstranitev (> 
99 %) CP-ja in IF-ja (Česen idr., 2015).
 
Slika 5: Delež odstranitve CP-ja in IF-ja med različnimi abiotskimi postopki čiščenja

Simpozij z mednarodno udeležbo Vodni dneVi 2017           Portorož, 5.–6. oktober 2017
75 74
6. OECD TG 201, 2011. Test No. 201: Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test: OECD 
Publishing.
7. Reifferscheid, G., Heil, J., Oda, Y., Zahn, R. K., 1991. A microplate version of the SOS/umu-test for rapid 
detection of genotoxins and genotoxic potentials of environmental samples. Mutation Research/Enviro-
nmental Mutagenesis and Related Subjects 253, 215-222.
8. Zounkova, R., Odraska, P., Dolezalova, L., Hilscherova, K., Marsalek, B., Blaha, L., 2007. Ecotoxicity and 
genotoxicity assessment of cytostatic pharmaceuticals. Environmental Toxicology and Chemistry 26, 
2208-2214.
Eksperimentalno določeno toksičnost zmesi smo primerjali z modelom »concentration additi-
on« (CA). Ugotovili smo, da je toksičnost, napovedana po modelu CA (EC
50
 = 21,1 mg/L) nižja 
od eksperimentalno določene (EC
50
 = 11,5 mg/L). S tem smo dokazali potencirajoči učinek 
preiskovane mešanice. Test SOS/umuC je pokazal genotoksično aktivnost spojin CP-ja, kar-
boksi-CP pri 320 mg/L in zmesi pri posameznih koncentracijah 37,2 mg/L v prisotnosti +S9, 
medtem ko je bila spojina karboksi-CP (320 mg/L) genotoksična tudi v odsotnosti –S9.
4. ZAKLJUČeK
V okviru študije smo potrdili prisotnost CP-ja in IF-ja v dveh od petih preiskovanih slovenskih 
bolnišničnih OV. CP smo zaznali tudi v vtokih in iztoku iz ene ČN, medtem ko so bile koncen-
tracije IF-ja v vseh OV iz ČN < LOD. Analiza bolnišnične OV iz enotedenskega vzorčenja je 
pokazala prisotnost spojine karboksi-CP v najvišjih koncentracijah (predvsem med torkom in 
petkom). Z biološkim čiščenjem smo le delno odstranili CP in IF iz OV,   najvišjo učinkovitost 
odstranjevanja pa smo dosegli z UV/O
3
/H
2
O
2
 (pri 5 g/L; > 94 % za CP in IF). Ko smo izbrani 
AOP zaporedno povezali z biološkim čiščenjem, smo dosegli še višji odstotek odstranitve (> 99 %) 
za obe spojini. Med postopkoma UV in UV/H
2
O
2
 smo identificirali 3 nove TP-je iz CP-ja oziro-
ma IF-ja: CP-TP138a, imino-ifosfamid in IF-TP138. Ocena ekotoksičnosti je pokazala, da je 
karboksi-CP škodljiv za testne organizme pri izbranem delovnem koncentracijskem območju. 
Prav tako je bila mešanica ekotoksična in genotoksična z opaženim potencirajočim učinkom. 
ZAHVALA
Raziskovalno nalogo je delno financirala Evropska unija v okviru Evropskega projekta EU FP7 
CytoThreat. Finančna podpora raziskave je tekla tudi v okviru programske skupine P1-0143, 
projektov L1-5457, J1-6744 in L1-7544, štipendije AdFutura za izobraževanje doktorskih štu-
dentov v tujini ter usposabljanja in financiranja M. Česen preko ARRS. Vsem sodelujočim ČN 
in bolnišnicam se zahvaljujemo za sodelovanje in podporo pri vzorčenju. 
LiTeRATURA in ViRi
1. Česen, M., Kosjek, T., Busetti, F., Kompare, B., Heath, E., 2016. Human metabolites and transformation 
products of cyclophosphamide and ifosfamide: analysis, occurrence and formation during abiotic treat-
ments. Environmental Science and Pollution Research electronic version.
2. Česen, M., Kosjek, T., Laimou-Geraniou, M., Kompare, B., Širok, B., Lambropolou, D., Heath, E., 2015. 
Occurrence of cyclophosphamide and ifosfamide in aqueous environment and their removal by biological 
and abiotic wastewater treatment processes. Science of The Total Environment 527–528, 465-473.
3. Grung, M., Källqvist, T., Sakshaug, S., Skurtveit, S., Thomas, K. V., 2008. Environmental assessment of 
Norwegian priority pharmaceuticals based on the EMEA guideline. Ecotoxicology and Environmental Safety 
71, 328-340.
4. Kosjek, T., Heath, E., 2011. Occurrence, fate and determination of cytostatic pharmaceuticals in the envi-
ronment. TrAC Trends in Analytical Chemistry 30, 1065-1087.
5. Li, F., Patterson, A. D., Höfer, C. C., Krausz, K. W., Gonzalez, F. J., Idle, J. R., 2010. Comparative meta-
bolism of cyclophosphamide and ifosfamide in the mouse using UPLC–ESI-QTOFMS-based metabolomics. 
Biochemical Pharmacology 80, 1063-1074.