TEORETIČNE OSNOVE 13C DIHALNIH TESTOV
THEORETICAL BASICS 13C BREATH TEST
AVTOR / AUTHOR:
Suhadolc K, Sešek Briški A in
Osredkar J
Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo, Univerzitetni klinični center Ljubljana, Zaloška cesta 2, 1000 Ljubljana
NASLOV ZA DOPISOVANJE / CORRESPONDENCE: E-mail: josko.osredkar@kclj.si
povzetek
Dihalni test z uporabo stabilnega ogljikovega izotopa 13 (13C) je neinvazivno diagnostično orodje, ki se uporablja v znanstvenih in kliničnih preiskavah številnih fizioloških in patofizioloških procesov. Temelji na merjenju obogatitve ogljika v izdihanem zraku ogljikovega dioksida po zaužitju testnega obroka, ki vsebuje označen 13C v specifični funkcionalni skupini molekule. 13C se v izdihanem zraku lahko meri z masnim spektrometrom za analitiko stabilnih izotopov in z nedisperzivno infrardečo spektrometrijo.
V članku sta predstavljena matematična modela, ki napovedujeta dinamiko razgradnje označenega substrata in s pomočjo katerih se nato izračuna polovični čas izločanja 13CO2 in čas maksimalnega izločanja ogljikovega izotopa 13 ter koeficient praznjenja želodca.
1
uvod
Dihalni testi se v medicini uporabljajo za preiskovanje hlapnih organskih in anorganskih spojin v izdihanem zraku za oceno encimske oziroma metabolne funkcije, določitev diagnoze bolezni, spremljanje napredovanja bolezni in učinkovitosti terapije (1). Prvotno so testi temeljili na merjenju radioaktivnega ogljikovega izotopa 14, ki ima razpolovno dobo 5730 let in je bil strogo prepovedan za uporabo pri nosečnicah in otrocih. Danes pa se uporablja neradioa-ktivni ogljikov izotop 13 (13C), ki je povsem neškodljiv, stabilen in je primeren za uporabo tudi pri otrocih, nosečnicah in doječih materah (2).
Pomanjkljivost dihalnih testov je predvsem v standardizaciji obrokov in izotopov med posameznimi laboratoriji, zato so rezultati preiskav različni in njihova interpretacija je odvisna od posamezne ustanove, ki preiskavo izvaja. Z naraščanjem vrednosti v klinični uporabi, s standardizacijo metod, razvijanjem novih senzorjev in detekcijskih sistemov bodo v naslednjih letih dobili dihalni testi še širšo uporabnost.
abstract
Breath test using a stable isotope of carbon 13 (13C) is a noninvasive diagnostic tool for applications in scientific and clinical research in many physiological and pathophysiological processes. The test is based on measuring the enrichment of carbon in carbon dioxide in exhaled air after ingestion of a test meal, which contains a labeled 13C in one or more specific functional groups of the molecule. 13C in exhaled air can be measured with the Isotope ratio mass spectrometry and Non-dispersive infrared spectrometry.
This paper presents two mathematical models that predict the degradation dynamics of the labeled substrate and from which is then calculated 13CO2 half excterion time, the time of the maximal 13CO2 excretion rate and the gastric emptying coefficient.
The problem with breath tests is that different laboratories use different dosages and types of 13C sub-
3
o
i! LU
OT
Z <
Z
N
O LU _I
a
LU
cc
Q_
> o
H
OT LU
<
I
O
o
LU >
O z
OT O
I-
LU
cc O
LU
strates as well as different isotopes. Therefore, research results vary between laboratories and their interpretation depends on institution that conducted the investigation. With the increasing value in clinical use, standardization of the methods and by developing new sensor and detection systems in the coming years, a breath test will become even widely applicable.
Princip dihalnih testov temelji na zaužitju tekočega ali trdnega testnega obroka v katerega je vmešana snov, ki je označena z ogljikovim izotopom 13. Sestavine testnega obroka spodbudijo izločanje želenega preiskovanega encima, upočasnijo praznjenje želodca in podaljšajo kontaktni čas označene snovi z encimom. V črevesju se snov označena s 13C razgradi v odvisnosti od količine aktivnega encima do različnih presnovkov in 13C označenega ogljikovega dioksida (13CO2) (slika 1). Sproščen ogljikov dioksid se ne izloči direktno iz organizma z izdihanim zrakom, temveč najprej difundira v krvne žile iz preiskovanega organa in se prenese kot bikarbonat (H12CO3-/H13CO3-) v pljuča, kjer se sprosti le 40-70% celotnega 13CO2 v izdihanem zraku (3, 4). Preostali 13C se vgradi v metabolne produkte (npr. ketonska telesca, aminokisline), zadrži v bikarbonatnih bazenih (pools), nekaj pa se ga ireverzibilno izgubi preko nerespira-tornih poti (< 5% z blatom, ~1% transkutano, 1-3% z uri-
12CO2 v
13CC
I
Testni obrok z označeno snovjo
ni.
13CO2
j. ;
nom) (5). Povečano razmerje med 13CO2 in izdihanem zraku kaže na: (1) prisotnost encimske aktivnosti, (2) in količino prisotnega aktivnega encima v telesu ter (3) lahko odraža stopnjo fiziološkega procesa ali pa kaže na prisotnost tujka (npr. bakterije, encima...) (6).
Izdihan zrak pri odraslem človeku povprečno vsebuje 24% CO2 z izotopskim razmerjem 12C proti 13C 99:1, vendar se dejanska koncentracija CO2 povečuje glede na magni-tudo izdihanega zraka (1, 8). Izotop 13C vsebujejo vsa živila v različnih koncentracijah, zato je dejanska količina 13C v izdihanem zraku odvisna od vrste in količine zaužite hrane.
Razgradnja
Slika 1: Princip 13C dihalnega testa. Test temelji na merjenju obogatitve ogljika v ogljikovem dioksidu v izdihanem zraku po zaužitju testnega obroka, ki vsebuje snov označeno s 13C v eni ali več funkcionalnih skupin v molekuli (7).
Figure 1: Principle of the 13C-labelled breath test. The test is based on measuring the enrichment of carbon in carbon dioxide in exhaled air after ingestion of a test meal, which contains a labeled 13C in one or more specific functional groups of the molecule (7).
Povprečni dnevni vnos 13C znaša med 2 in 3 grame, kar je veliko več, kot ga pacient zaužije pri preiskavi, saj ta odmerek znaša okrog 200 mg in je zato je le malo verjetno, da bi povzročil kakršnekoli neželene učinke pri preiskovancu (2). Količina 13CO2, ki se sprosti iz označene testne snovi predstavlja le majhen delež naravno prisotnega
13CO2, ki se ga lahko izmeri z masnim spektrometrom za analitiko stabilnih izotopov (IRMS - Isotope Ratio Mass Spectrometry) ali z nedisperzivno infrardečo spektrometrijo (NDIRS - Nondispersive infrared spectrometry). Slednja ima manjšo analitično natančnost kot masni spektrometer, vendar je cenejša in enostavnejša za uporabo (8, 12).
Dihalni testi z uporabo stabilnega izotopa 13C so preprosta, varna in neinvazivna metoda, ki se uporabljajo pri znanstvenih in kliničnih preiskavah številnih fizioloških in patofi-zioloških procesov (3, 9). Dihalne teste se lahko uporabi za diagnostiko številnih bolezni (preglednica 1), vendar le
Preglednica 1: Aplikacije 13C dihalnih testov v raziskavah in diagnostiki (10, 12).
13C označen substrat	Aplikacije
Monosaharidi	Absorbcija, mikrosomalna biotransformacija
Oligo in polisaharidi	Hidroliza oligo in polisaharidov, funkcija pankreasa, cistična fibroza
Amino kisline	Razgradnja aminokislin, ocena hitrosti praznjenja želodca, delovanje jeter
Proteini	Razgradnja in resorpcija proteinov
Karboksilne kisline	Ocena hitrosti praznjenja želodca, miokardne metabolne preiskave, hepatična steatoza
Lipidi	Presnova maščob, malabsorpcija maščob
Ogljikova kislina	Okužba s Helicobacter pylori
redko pridejo v rutinsko klinično uporabo predvsem zaradi doseganja slabše občutljivosti in specifičnosti (8, 10). Izmed vseh dihalnih testov, ki so na tržišču je Ameriški urad za zdravila (angl. FDA-Food and Drug Administration) do danes odobril za klinično uporabo le dihalni test s 13C označeno sečnino za diagnostiko okužbe s Helicobacter pylori v prebavnem traktu (11).
Dihalni testi so lahko kvalitativni ali kvantitativni. Kvalitativni pokažejo ali je pri bolniku prisotna bolezen, medtem ko kvantitativni test poda informacijo o njeni resnosti (1). Med seboj se razlikujejo tudi glede na čas izvedbe, število odvzetih vzorcev izdihanega zraka, čas ki poteče med vzetimi zaporednimi vzorci in metodo merjenja izotopske sestave (13).
2
postopek izvedbe dihalnih testov
Pred izvedbo dihalnega testa mora biti preiskovanec tešč 12 ur, najbolje preko noči, med samim testom mora mirovati in ne sme kaditi, s čimer se izognemo hiperventilaciji, ki bi lahko vodila do napačne interpretacije rezultatov testa. Pije lahko le negazirano vodo, saj bi lahko raztopljen CO2 vodil do sprememb v količini izdihanega ogljikovega dioksida in s tem do napačnih rezultatov testa. Najmanj teden dni pred izvedbo testa mora preiskovanec prenehati z jemanjem zdravil, ki bi lahko imela vpliv na rezultate testa. Če bi bilo potrebno test iz kakršnih razlogov ponoviti, ga lahko izvedemo šele naslednji dan. Vsa navedena navodila je potrebno natančno upoštevati, saj lahko vsaka nedoslednost pri izvedbi testa vodi do lažno pozitivnih ali lažno negativnih rezultatov (2).
Prvi vzorec izdihanega zraka se odvzame pred zaužitim testnim obrokom (čas 0 min) in je namenjen določitvi os-
novne bazalne linije, ki predstavlja naravno prisoten 13CO2 v izdihanem zraku. Pri odvzemu vzorca preiskovanec počasi in enakomerno pihne skozi slamico v epruveto toliko zraka, da se le-ta orosi in jo takoj zamaši (slika 2A). Preiskovanec nato zaužije standardizirani tekoči ali trdni testni obrok odvisno od želene preiskave (slika 2B). Nato poteka nadaljni odvzem vzorcev po enakem postopku, največkrat v časovnem razmaku 15 oz. 30 min (slika 2C). Število vzorcev izdihanega zraka je odvisno od posamezne preiskave (12).
3
izračun rezultatov dihalnih testov
Rezultati 13C dihalnih testov so ponavadi podani kot odstotek izločenega 13C v izdihanem zraku glede na čas (% 13C/h) in kot odstotek kumulativne količine izločenega 13C v merjenem času (% izdihanega 13C) (13, 14, 15). Izračun omenjenih parametrov si bomo natančneje pogledali v nadaljevanju.
Meritve absolutnih vrednosti in izračunana absolutna razmerja so, zaradi številnih možnih napak pri merjenju, pogosto nenatančni (± 0,5%). Le z relativnimi meritvami proti standardu se lahko doseže zahtevano natančnost okrog ± 0,1%. Take meritve omogočajo IRMS in NIDRS, ki imajo vgrajen dvojni uvajalni sistem, s katerim se izmenoma meri vzorec in standard (16). Rezultat meritev je relativna vrednost izotopske sestave izražena z vrednostjo delta (6), ki predstavlja relativno razliko (presežek) izotopske sestave preiskovanega vzorca glede na izbrani standard in je izražena v promilih %0 (enačba 1). Delta vrednost (6) vsakega standarda je definirana z vrednostjo 0%o. Pozitivne vrednosti 6 pomenijo višje izotopsko razmerje R v vzorcu v primerjavi s standardom, negativne vrednosti pa nižje izotopsko razmerje v primerjavi s standardom.
3
o
i!
UJ
č OT
Z <
Z
N
O UJ _i O
UJ
cc
Q_
A

\
Vzorec izdihanega zraka pred obrokom
Slika 2: Postopek izvedbe 13C dihalnih testov Figure 2: Procedure of the 13C breath test
C
A
Vzorec izdihanega zraka se zbira na 15. oz. 30 min odvisno od vrste testa
> o
I—
OT LU
< I
o o
LU >
O z
OT O
I-
LU
cc O
LU
Ôlic,„ =
K-K R
•1000 [%c]
(1)
V enačbi 1 vrednost Rvz predstavlja razmerje med izotopoma 13C in 12C v preiskovanem vzorcu, Rst pa razmerje med izotopoma 13C in 12C v izbranem standardu (12, 17, 18).
Standardi so točno določene homogenizirane naravne spojine. Izbrani so tako, da so izotopska razmerja čim bolj podobna povprečni razširjenosti določenega izotopa v naravi (20). Mednarodne standarde določata Mednarodna agencija za jedrsko energijo na Dunaju (IAEA - International Atomic Energy Agency) in Nacionalni inštitut za standarde in tehnologijo iz ZDA (NIST - National Institute of Standards and Technology). Za ogljik je bil privzet karbonatni standard fosila Belemnitelle americana iz kredne formacije PeeDee v Južni Karolini (PDB - Pee Dee Belemnite) z vrednostjo R, ki znaša 0,0112372 PDB (12, 19, 20). Zaradi premajhne količine PDB v naravi so izdelali umetni karbonat z enako izotopsko sestavo in ga poimenovali Vienna PeeDee Be-lemnite (VPDB), zato se vsi rezultati podajajo glede na to vrednost (18). Izotopsko razmerje se ob prisotnosti aktivnega encima po zaužitju testnega obroka znatno poveča, pri zmanjšani aktivnosti encima je povečanje manjše in v primeru neaktivnega oz. odsotnega encima ostane razmerje nespremenjeno v primerjavi z izmerjenim razmerjem pred zaužitjem testnega obroka. Delež 13C v izdihanem zraku se za vsak vzorčen čas izračuna po naslednji enačbi:
C, =
ó13Ct¡ 1000
+ 1
1
Ô C, + —^ + 1 0,0112372 1000
100
%nct = %13c, -%13c
1	li	1 n
V enačbi 3 % 13Cti predstavlja delež izotopa v izdihanem zraku ob času ti in % 13Ct0 delež izotopa v izdihanem zraku ob meritvi bazalne linije (t0) pred zaužitim testnim obrokom (12, 15, 17).
Hitrost razgradnje označenega substrata glede na zaužito količino in čas, se izračuna po naslednji enačbi:
. 13
C,
- 13
C/h =
100
' co,
• 13/
' sub
'C,
'o
•100%
m
(4)
sub
100
M
sub
(2)
V enačbi 2 613Ct predstavlja relativno razliko izotopske sestave preiskovanega vzorca glede na izbrani standard (izračuna po enačbi 1) in 0,0113272 predstavlja razmerje 13C/12C v karbonatnem standardu za ogljik v fosilu Belemnitelle americana iz kredne formacije PeeDee (12, 17).
Pri izračunu deleža 13C v izdihanem zraku je potrebno upoštevati tudi meritev bazalne linije pred zaužitjem testenega obroka, ki odstrani vpliv endogeno prisotnega 13CO2. Delež izotopa v izdihanem zraku z upoštevanjem meritve bazalne linije se izračuna po enačbi 3.
V enačbi 4 %13Ct predstavlja delež izotopa 13C v izdihanem zraku v času t po zaužitju testnega obroka, %13Csub delež izotopa 13C v zaužitem substratu, ki je ponavadi 99 %, % 13Ct0pa delež izotopa 13C v izdihanem zraku ob meritvi bazalne linije ob času t0 pred zaužitim testnim obrokom, Vco2 volumen izdihanega ogljikovega dioksida izražen v mmol/h/m2, msub maso zaužitega testnega substrata izraženo v mg in Msub molsko maso označenega substrata izraženo v g/mol (15, 17, 21).
Za izračun hitrosti razgradnje označenega substrata je potrebno poznati volumen izdihanega ogljikovega dioksida (Vco2), saj se oksidiran 13CO2 iz zaužitega substrata razredči z endogenim CO2 iz metabolizma. Preiskovanci morajo med izvedbo testa mirovati, da ne pride do povečanega izločanja CO2, kar bi vodilo do zmanjšane koncentracije 13C v izdihanem zraku in tako tudi do napačne interpretacije rezultatov (21).
Volumen izdihanega ogljikovega dioksida je pri odraslem človeku v mirovanju, ocenjen s 5 mmol/min/površino telesa (m2) in se ga izračuna po enačbi 5 (13, 17). Pri izračunu volumna ogljikovega dioksida pa je potrebno upoštevati tudi telesno površino (BSA - Body Surface Area), ki se jo izračuna iz podatkov o telesni teži izraženo v kilogramih in telesni višini izraženo v centimetrih po enačbi 6 (13, 17). Volumen izdihanega CO2 se lahko izračuna tudi iz bazalnega metabolizma (BMR-Basal Metabolic Rate) in iz frekvence srčnega utripa ali pa se ga določi s pomočjo indirektne kalorimetrije (21).
Vco = BSA(m2 ) • 5mmol /min/m2 -60min/ h
(5)
V enačbi 5 VCO2 pomeni volumen izdihanega ogljikovega dioksida in BSA telesno površino, ki se jo izračuna po enačbi 6.
BSA(m2) =
m(kg) • h(cm)
3600
(6)
13.
kumulativni C (i,) [%] =

bnC/h (/,) + %13C/h (fM) (i,. -f M)
60
4
kinetika presnove testnega substrata
talne podatke opišemo z matematično enačbo v obliki Y = f(x), kjer je X neodvisna spremenljivka, Y odvisna spremenljivka in f funkcija, ki vključuje enega ali več parametrov za opis podatkov.
V enačbi 6 parameter m predstavlja telesno maso izraženo v kilogramih in h telesno višino izraženo v centimetrih (13).
Kumulativna količina izločenega 13C izražena v odstotkih se izračuna po enačbi 7 in je definirana kot celotna količina 13C, ki se izloči v izdihanem zraku v določenem času, glede na količino vnesenega 13C s testnim obrokom.
Prvi matematični model izhaja iz x2 porazdelitve (enačba 8) in opiše krivuljo izdihanega
(%13CO2/h).
13CO2 v odvisnosti od časa
y(t) = a-tb-e
(8)
(7)
V enačbi 7 oznaka %13C/h (t) predstavlja delež izotopa 13C v izdihanem zraku v času ti in % 13C/h (tM) delež izotopa 13C v izdihanem zraku v času tM po zaužitju testnega obroka, ki se ju izračuna po enačbi 4. ti in tM predstavlja čas izražen v urah pri katerem se izloči delež izotopa 13C v izdihanem času (22).
Izločen kumulativni 13C nikoli ne doseže 100%, ker se določen delež 13C zadrži v telesu v obliki bikarbonata ali pa se vključi v druge metabolne cikle kot je cikel trikarboksilnih kislin (9).
V enačbi 8 t predstavlja čas merjen v urah; a, b in c pa so parametri, ki se jih pridobi z nelinearno regresijsko analizo (13, 14, 15).
Stopnjo praznjenja želodca (GEC- angl. gastric emptying coefficient) se izračuna po enačbi 9. Večja kot je stopnja praznjenja želodca, hitrejše je praznjenje vsebine želodca (13, 14, 15).
GEC = In a
(9)
V enačbi 9 parameter a predstavlja konstanto, ki se jo izračuna z nelinearno regresijsko analizo.
Polovični čas izločanja (t1/2) in čas maksimalnega izločanja (tmax) 13C v izdihanem zraku se izračunata po enačbi 10 in 11 (15). Polovični čas izločanja 13C, je čas izražen v minutah, ko se presnovi polovica količine označenega substrata, kar je grafično prikazano na sliki 3 (14, 15).
tU2 =r_1(0,5;Z> + l;l/c)
(10)
Kinetika presnove substrata oz. stopnja praznjenja želodca je opisana s polovičnim časom izločanja 13C (t1/2), s časom maksimalnega izločanja 13C (tmax) in s koeficientom praznjenja želodca (GEC) (14, 15). Omenjene parametre se lahko izračuna z uporabo dveh različnih matematičnih modelov, ki napovedujeta dinamiko razgradnje označenega substrata in jih je prvi opisal Ghoos leta 1993 (13, 22). Koeficient praznjenja želodca in čas maksimalnega izločanja se izračuna iz krivulje, ki opisuje delež izdihanega 13C v odvisnosti od časa in polovični čas izločanja pa iz krivulje, ki opisuje kumulativno količino izločenega 13C z izdihanim zrakom (5, 14).
Pri obeh modelih gre za simulacijo eksperimentalnih podatkov z ustreznim matematičnim modelom. Eksperimen-
V enačbi 10 r-1 predstavlja inverzno gama funkcijo ter b in c konstanti, ki se ju izračuna z nelinearno regresijsko analizo.
Čas maksimalnega izločanja 13C (tmax) ponazarja stanje pretoka v želodcu in je grafično prikazan na sliki 3. Ko je izločanje 13CO2 maksimalno, zapusti želodec več kot 80% želodčne vsebine (14, 15).
b
'max = " i™"]
C
(11)
Drugi matematični model pa izhaja iz Siegelove funkcije, ki posnema retenzijsko scintigrafsko krivuljo modificirano za korekcijski faktor m (enačba 12). Model opiše kumulativno količino 13C v izdihanem zraku, ki je definirana kot celotna količina 13C, ki se izloči v izdihanem zraku v določenem času, glede na količino vnesenega 13C s substratom.
3
o
ž
LU
č œ
z <
z
N
O LU
a
LU
cc
Q_
> o
H
OT LU
<
I
O
o
LU >
O z
OT O
I-
LU
cc O
LU
z(t) = m(\-e~a)

(12)
V enačbi 12 z predstavlja kumulativno količino izdihanega 13CO2 v določenem času, t je čas merjen v urah, m celotno kumulativno količino 13CO2 v izdihanem zraku ko je čas neskončen, parametri m, k in p so ocenjene regresijske konstante (13, 14, 23).
Parametre m, k in p ter a, b in c se pridobi z nelinearno iterativno metodo najmanjših kvadratov s pomočjo Excell-ovega programa Reševalec (Solver). Reševalec je matematično orodje, ki poizkuša med eksperimentalnimi in teoretičnimi podatki zmanjšati razliko kvadratov na minimum, pri tem pa spreminja parametre funkcije. Pri vsakem koraku izračuna nove vrednosti za matematično funkcijo in primerja razliko kvadratov s prejšnjo vrednostjo. Postopek se ponavlja dokler ne doseže minimuma. Reševanja se loti s posplošeno reducirano metodo gradientov (GRG - Generalized Reduced Gradient method). Naloga Reševalca je torej, da najde vrednosti vhodnih spremenljivk, ki dajo najboljšo vrednost ciljne funkcije. To pomeni najboljšo rešitev modela (24, 25).
Pri obeh matematičnih modelih je potek reševanja podoben. Natančneje pa bomo opisali postopek za drugi model. Najprej je potrebno izračunati odvod funkcije (enačba 13), ki teoretično opiše krivuljo izločanja 13C z izdihanim zrakom v odvisnosti od časa.
z\t) = mkpe-k,(\-e-hy
datkov, pridobi krivuljo, ki se čim bolj prilega rezultatom dihalnega testa. Z metodo najmanjših kvadratov se izračuna napako med eksperimentalno dobljeno količino 13C v izdihanem zraku, ki se jo izračuna po enačbi 4 (%13C/h) in teoretično pridobljeno količino 13C v izdihanem zraku, ki se jo izračuna po enačbi 13 (% 13C/h). Z nelinearno regresijo se s programom Reševalec izračuna natančnejše vrednosti konstant m, k in p, tako da je napaka med eksperimentalnimi in teoretičnimi rezultati čim manjša. Te vrednosti se vstavi v enačbo 12 in se izračuna teoretični delež kumulativnega 13C v izdihanem zraku. S pomočjo programa Reševalec se določi nove vrednosti konstant m, k in p v enačbi 12, tako da je napaka med teoretičnimi in eksperimentalnimi deleži kumulativnega 13C v izdihanem zraku čim manjša, kar pomeni da se krivulja, ki opisuje kumulativno količino 13C v izdihanem zraku čim bolj prilega eksperimentalno dobljenim podatkom. Na novo pridobljene vrednosti konstant k in p lahko sedaj uporabimo za izračun polovičnega časa praznjenja želodca (t1/2) po enačbi 14 (13, 14, 23, 24) in maksimalnega časa izločanja 13C (tmax) po enačbi 15 (14, 23, 24), ki sta tudi grafično prikazana na sliki 3. Oba prametra sta določena z obliko krivulje in tako neodvisna od endogeno proizvedenega CO2 (24).

[ln(l-2~1//J)]
t =
max
In p
(14)
(15)
(13)
V enačbi 13 parametri m, k in p predstavljajo regresijske konstante in t čas merjen v urah (13, 14, 23, 24).
Nato z oceno začetnih vrednosti parametrov m, k in p na podlagi predhodnih izkušenj ali pa na smiselnem ugibanju, ki temelji na poznavanju uporabljene funkcije za opis po-
Krajši tmax ali t1/2 pomeni hitrejše praznjenje želodca. Vrednosti parametra p, ki so večje od 1, označujejo zakasnjeno praznjenje želodca (počasnejša rast krivulje), vrednosti manjše od 1 pa pomenijo hitro praznjenje želodca (hitrejša rast krivulje) (14, 26). Večje vrednosti parametra k pomenijo hitrejšo rast kumulativne krivulje, medtem ko manjše vrednosti pomenijo bolj postopno rast krivulje (23, 26).
Tabela 1: Prikazuje čas praznjenja želodca za tekoče in trdne substrate (27).
Table 1: Shows the 13CO2 half excretion time and the time of maximal 13CO2 excretion rate for liquid and solid meal (27).
Cas praznjenja želodca	Zmanjšano	Normalno	Zakasnjeno	Zelo zakasnjeno
Tekoči substrat				
tmax [min]	< 25	22-25	55-80	> 80
11/2 [min]	< 35	35-80	80-120	> 120
Trdni substrat				
tmax [min]	< 50	50-100	100-150	> 150
11/2 [min]	< 75	75-135	135-200	> 200
Slika 3: Prikazuje polovični čas izločanja in čas maksimalnega izločanja 13C (24).
Figure 3: Shows the 13CO2 half excretion time and the time of maximal 13CO2 excretion rate (24).
5
interpretacija parametrov dihalnih testov
V matematičnem modelu konstanti a in m določata višino krivulje, ki opisuje delež izdihanega in kumulativnega 13CO2 v odvisnosti od časa (slika A in B) oz. predstavljata količino izločenega 13CO2 z izdihanim zrakom. Konstante k, p, b in c pa določajo obliko krivulje, ki opisuje delež izdihanega in kumulativnega 13CO2 v odvisnosti od časa (slika C in D) oz. predstavljajo hitrost izločenega 13CO2 z izdihanim zrakom. Na količino oz. hitrost izločenega 13cO2 z izdihanim zrakom vpliva tako izguba kot tudi zadrževanje 13CO2 v telesu (14).
Kadar je praznjenje označenega substrata iz želodca pospešeno se poveča tako količina (slika 4A in 4B) kot tudi hitrost izločanja 13CO2 v izdihanem zraku (slika 4C in 4D). Ko se količina izločenega 13CO2 v izdihanem zraku poveča, se krivulji ki opisujeta delež izdihanega in kumulativnega 13CO2 v odvisnosti od časa zvišata, pri tem pa oblika kri-
vulje ostane nespremenjena, kar je prikazano na sliki 4A in 4B. Če pa se poveča hitrost praznjenja želodca, potem krivulja ki opisuje delež izdihanega 13CO2 v odvisnosti od časa postane bolj strma, površina pod njo pa ostane nespremenjena (slika 4C). Krivulja, ki opisuje delež kumulativnega 13CO2 v izdihanem zraku v odvisnosti od časa, se bo premaknila na desno, končna količina 13CO2 v izdihanem zraku pa ostane nespremenjena. Kadar je praznjenje želodca konstantno, izguba in zadrževanje 13CO2 v telesu, vplivata na količino in hitrost izločanja z izdihanim zrakom in s tem na rezultate dihalnih testov (14).
Kot je bilo že omenjeno, povečanje količine 13CO2 v izdihanem zraku glede na izhodiščno koncentracijo, odraža preiskovano funkcijo. Vendar pa je izmerjen le končni produkt 13CO2, ki ne pove nobene informacije o zalogi in tokovih označenega substrata in njegovih presnovkov. Vsaj pri prirojenih napakah metabolizma, verjetno pa pri katerikoli bolezni, je potrebno predvidevati, da so ti rezervoarji in tokovi bistveno spremenjeni. Tako tudi izguba in zadrževanje 13CO2 v telesu vplivata na kinetiko metabolizma in tako na parametre dihalnega testa kot so GEC, tmax in t1/2. In sicer, če se količina izgubljenega 13CO2 poveča, npr. z vezavo na druge presnovke v telesu, se količina le tega v izdihanem zraku zmanjša, kar je prikazano na sliki 5A in 5B z znižanjem krivulj, ki opisujeta delež izdihanega in kumulativnega 13CO2 v odvisnosti od časa. Oblika obeh krivulj ostane enaka, kar pomeni da se hitrost izločanja 13CO2 pri tem ne spreminja. Pri tem se GEC zmanjša, čeprav tmax in t1/2 ostaneta enaka. Zaradi vezave 13CO2 na druge presnovke v telesu se ga v izdihanem zraku izloči kar za 50% manj. Po drugi strani pa, če se čas zadrževanja 13CO2 v bikarbonatnem rezervoarju v telesu podaljša, postaneta krivulji, ki opisujeta delež izdihanega in kumulativnega 13CO2 v odvisnosti od časa, bolj ploščati, kar pomeni da se hitrost izločanja 13C upočasni pri tem pa površina pod krivuljama
3
o
i! LU
č OT
Z <
Z
N
O LU _I
a
LU
cc
Q_
"/a 13C/h	kumulativni "Vb 13C	% 13C/Ji	kumulativni 13C
Slika 4: Vpliv količine in hitrosti 13CO2 v izdihanem zraku na višino in obliko krivulje, ki opisuje delež izdihanega in kumulativnega 13CO2 v odvisnosti od časa (3).
Figure 4: Influence of the amount and velocity of 13CO2 in exhaled air on the hight and shape of percent dose recovery and cumulative recovery curves (3).
> o
H
OT LU
<
I
O
o
LU >
O z
OT O
I-
UJ
cc O
LU
kmniüativtii % I3C
	ffi)
	...1...
	
	
Eai
Slika 5: Vpliv izgube in zadrževannja 13CO2 v telesu na kinetiko izločanja (14). Figure 5: Effects of the loss and the retention of 13CO2 on the breath test resoults (14).
ostane nespremenjena (slika 5C in 5D). Kot posledica zadrževanja se krivulji, ki opisujeta delež izdihanega in kumulativnega 13CO2 v odvisnosti od časa, pomakneta nižje v desno stran kot je prikazano na sliki 5C in 5D. Ob podaljšanem zadrževanju 13CO2 v telesu se zmanjša tudi GEC, t1/2 in tmax pa se podaljšata (5, 14).
Zanesljivost izračunanih parametrov dihalnih testov je odvisno od tega, kako dobro se eksperimentalni podatki 13CO2 prilegajo posamznemu matematičnemu modelu. To nam pokaže koeficient korelacije, ki mora biti večji od 0,9 drugače se test zavrne. Na dobro prileganje krivulje eksperimentalnim podatkom, zelo vpliva tudi čas dihalnega testa in sicer krajši kot je čas testa, slabše je prileganje krivulje (14).
Meje dihalnih testov s katerimi se določi normalna ali patološka aktivnost preiskovanega organa, ponavadi določi vsak laboratorij zase, glede na rezultate analiziranih kontrolnih skupin. Na podlagi teh rezultatov se nato izračuna spodnjo in zgornjo mejo intervala zaupanja (po navadi se določi 95%) in pomeni interval v katerem se z dano gotovostjo nahaja ocenjevani parameter.
13CO2/12CO2 (laser, infrardeča in masna spektroskopija). Standardni protokoli bodo omogočali primerjavo rezultatov 13C dihalnih testov med različnimi raziskovalnimi laboratoriji in omogočili lažjo interpretacijo za klinično diagnozo ali za spremljanje poteka zdravljenja.
Pri prirojenih napakah metabolizma, verjetno pa pri katerikoli bolezni, je potrebno predvidevati, da so rezervoarji in tokovi 13CO2 bistveno spremenjeni. V takih primerih imajo izračuni majhno napovedno moč, zato je za postavitev pravilne diagnoze potrebno uporabiti invazivne metode. Za natančen izračun parametrov dihalnih testov je prav tako potreben izračun bazalnega metabolizma (BMR-angl. basal metabolic rate) in dejanski endogeno proizveden CO2 pri preiskovancu, kar v večini primerov ni znano. Težko je vzdrževati stabilno endogeno količino proizvedenega CO2, še posebno pri mlajših otrocih, ki so težko pri miru ali pri novorojenčkih in majhnih otrocih, ki se bodo upirali odvzemu vzorcev izdihanega zraka. Te omejitve so vzrok, zakaj dihalni testi še niso dosegli rutinske klinične uporabe, še posebno pri diagnostiki motenj delovanja jeter ali prirojenih napakah metabolizma.
6 zaključek
Problem dihalnih testov je, da pri njihovi izvedbi različni laboratoriji uporabljajo različne količine in vrste hrane kot tudi različne izotope. Zato se rezultati preiskav med seboj razlikujejo in je njihova interpretacija odvisna od ustanove, ki preiskavo izvaja. Potrebno bi bilo standardizirati postopke glede količine zaužitega označenega 13C substrata, količine in sestave testnega obroka, časa izvedbe testa, pogostosti jemanja vzorcev izdihanega zraka, metode zbiranja vzorcev in metode merjenja izotopskega razmerja
Glede na njihovo preprosto izvedbo in neinvazivnost bodo 13C dihalni testi v prihodnosti postali nepogrešljivo orodje v kliničnih raziskavah in diagnostiki, predvsem pri prehran-skih preiskavah, diagnostiki gastrointetstinalnih bolezni in motnjah v metabolizmu. Število substratov in s tem različnih vrst testov iz leta v leto narašča.
reference
1. Rubin T, von Haimberger T, Helmke A, Heyne K. Quantitative determination of metabolization dynamics by a real-time 13CO2
breath test. J Breath Res. 2011; 5(2):027102. Epub 2011 Apr 19.
2.	Malferheiner P. Expert report on the clinical documentation for the product Pylori 13, Medical Instruments Corporation; PartIC3
3.	Lock JF, Taheri P, Bauer S, Holzhütter HG, Malinowski M, Neuhaus P, Stockmann M. Interpretation of Non-Invasive Breath Tests Using 13C-labeled Substrates - A Preliminary Report With superset13 C-Methacetin. Eur J Med Res. 2009; 14(12):547-50.
4.	Jackson SJ, Bluck LJ. Measurment of gastric emtying by octanoate metabolism. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 2005;8(5):538-44.
5.	Sanaka M, Yamamoto T, Kuyama Y. Retention, fixation and loss of the 13C label: a review for the understanding of gastric emptying breath tests. Dig Dis Sci. 2008; 53(7):1747-56. Epub 2008 Feb 29.
6.	Klein PD. 13C breath tests: visions and realities. Journal of Nutrition 2001; 131: 1637S-1642S.
7.	Domínguez-Muñoz JE. Pancreatic exocrine insufficiency: diagnosis and treatment. J Gastroenterol Hepatol. 2011;26 Suppl 2:12-6.
8.	Vogt JA, Wachter U, Mehring J, Radermacher P, Georgieff M, Fischer H, Hölscher U, Moede M, Fabinski W. Adaptation of the NDIR technology to 13CO2 breath tests under increased inspiratory O2 concentrations. J Appl Physiol. 2009;107(1):302-7. Epub 2009 May 14.
9.	Berthold HK, Giesen TA, Gouni-Berthold I. The stable isotope ketoisocaproic acid breath test as a measure of hepatic decarboxylation capacity: a quantitative analysis in normal subjects after oral and intravenous administration. Ioanna Gouni-Berthold, 2009; 29 (9): 1356-1364.
10.	Fischer H, Wetzel K. The future of 13C breath tests. Food Nutr Bull. 2002;23(3 Suppl):53-6.
11.	Paschke KM, Mashir A, Dweik RA. Clinical applications of breath testing. F1000 Med Rep. 2010; 22;2:56.
12.	Recent Results of the Development and Application of 13C-Breath Tests. 1st edition 1999, Fischer ANalysen Instrumente GmbH (FAN), Leipzig.
http://www. fan-gmbh.de/docs/13c_recent_results.pdf
14.	Wetzel K, Fischer H, 13C-Breath Tests in Medical Research and Clinical Diagnosis 2005. 4st - Edition, Fischer ANalysen Instrumente GmbH (FAN), Leipzig.
http://www. fan-gmbh.de/docs/13c_recent_results.pdf
15.	Sanaka M, Nakada K. Stable isotope breath tests for assessing gastric emptying: A comprehensive review. J Smooth Muscle Res. 2010;46(6):267-80.
16.	Kasicka JA, Kamihska M, Jonderko K, Setera O, Blohska FB. Short- and medium-term reproducibility of gastric emptying of a solid meal determined by a low dose of 13C-octanoic acid and nondispersive isotope-selective infrared spectrometry. World J Gastroenterol. 2006 Feb 28;12(8):1243-8.
17.	Pezdic J. Izotopi in geokemijski procesi. Univerzitetni ucbenik, Univerza v Ljubljani, Naravoslovnotehniska fakulteta, Oddelek za geologijo. 1999, str. 11, Ljubljana http://www.geo.ntf.uni-lj.si/jpezdic/Izotopi_1.del.pdf
18.	Gastric motility breath test. Site Manual. Version 3.0 January 15, 2008. Metabolic Solutions Inc.
http://www. stableisotopeanalysis.com/docs/GMBT_Site_Manu al_Version_2008.pdf
19.	Werner RA, Brand WA. Referencing strategies and techniques in stable isotope ratio analysis. Rapid Commun Mass Spectrom. 2001;15(7):501-19.
20.	Craig H. Isotopic standards for carbon and oxygen and correction factors for mass spectrometric analysis of carbon
dioxide. Geochimica et Cosmochimica Acta, 1957: 12(1-2), 133-149.
21.	Engel MH, Macko SA. Organic geochemistry: Principles and applications. 1993 New York, London, Plenum Press: 861 str.
22.	Slater C, Preston T, Weaver LT. Improving the specificity of the [13C]mixed triacylglycerol breath test by estimating carbon dioxide production from heart rate. Eur. J. Clin Nutr, 2006, 60(11):1245-52. Epub 2006 May 31.
23.	Ghoos YF, Maes BD, Geypens BJ, Mys G, Hiele MI, Rutgeerts PJ, Vantrappen G. Measurement of gastric emptying rate of solids by means of a carbon-labeled octanoic acid breath test. Gastroenterology, 1993, 104(6):1640-7.
24.	Berthold HK, Giesen TA, Gouni-Berthold I. The stable isotope ketoisocaproic acid breath test as a measure of hepatic decarboxylation capacity: a quantitative analysis in normal subjects after oral and intravenous administration. Liver Int. 2009; 29(9):1356-64.
25.	Perri F, Pastore MR, Annese V. 13C-octanoic acid breath test for measuring gastric emptying of solids. European Review for Medical and Pharmacological Sciences 2005; 9(Suppl 1): 3-8.
26.	Brown AM. A step-by-step guide to non-linear regression analysis of experimental data using a Microsoft Excel spreadsheet. Comput Methods Programs Biomed. 2001 Jun;65(3):191-200.
27.	Siegel JA, Urbain JL, Adler LP et al. Biphasic nature of gastric emptying. Gut 1988; 29: 85-9.
28.	13C-Gastric emptying breath tests. Wagner Analysen Technik GmbH
www.wagner-bremen.de/Seite32.pdf
3 o
z
UJ
OT
Z <
z
N
O UJ _i
LU
cc
Q_