Acta agriculturae Slovenica, 118/3, 1–13, Ljubljana 2022 doi:10.14720/aas.2022.118.3.2419 Review article / pregledni znanstveni članek Razvoj raziskovalnih metod za karakterizacijo združb arbuskularnih mikoriznih gliv in potencialni vpliv biodiverzitete glivnih endofitov na vegetacijo Irena MAČEK 1, 2 Received November 12, 2021; accepted July 13, 2022. Delo je prispelo 12. novembra 2021, sprejeto 13. julija 2022 1 Oddelek za biologijo, Biotehniška fakulteta, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija 2 Korespondenčni avtor, e-naslov: irena.macek@bf.uni-lj.si Development of research methods to characterise arbuscular mycorrhizal fungal communities and potential effects of fun- gal endophyte biodiversity on vegetation Abstract: Characterization and quantification of the functional and taxonomic diversity of microbial communities is essential for understanding all aspects of microbial ecology and is closely related to ecosystem function. Arbuscular mycor- rhiza is the most widespread symbiosis on Earth, with arbus- cular mycorrhizal (AM) fungi present in more than 2/3 of all plant species. Just over a decade after the publication of the first review article on molecular approaches to study the ecology of AM fungi in Acta Agriculturae Slovenica (Maček, 2009), the rapid development of molecular tools, especially next genera- tion sequencing (NGS) technology, has accelerated the study of the research field of plant root endophytes. In this paper, the current approach to study the ecology and taxonomy of AM fungi is presented, which also provides some insights into the study of other plant root endophytes. In addition, a widely used system for classifying AM fungi with so-called virtual taxa (VT) is presented, which is used for ecological studies and comparison between different studies. Finally, a brief overview of the importance of climate and soil properties for AM fungal community composition and taxa distribution in global ecosys- tems is presented. Key words: arbuscular mycorrhiza; biodiversity; ecology; endophytes; rhizosphere; sequencing; soil Razvoj raziskovalnih metod za karakterizacijo združb arbu- skularnih mikoriznih gliv in potencialni vpliv biodiverzitete glivnih endofitov na vegetacijo Izvleček: Karakterizacija in kvantifikacija funkcionalne in taksonomske raznolikosti mikrobnih združb je ključnega pomena za razumevanje vseh vidikov mikrobne ekologije in je povezana tudi širše z razumevanjem delovanja ekosistemov. Arbuskularna mikoriza predstavlja najbolj razširjeno in staro- davno simbiozo na Zemlji, saj so arbuskularne mikorizne (AM) glive prisotne v koreninah več kot dveh tretjin vseh rastlinskih vrst. V dobrem desetletju od objave preglednega članka o upo- rabi molekulskih pristopov pri raziskavah arbuskularne miko- rize v reviji Acta Agriculturae Slovenica (Maček, 2009) je razvoj metodologije, predvsem tehnologije določanja nukleotidnega zaporedja (sekvenciranja) naslednjih generacij (NGS), močno pospešil raziskave raznolikosti in ekologije združb AM gliv in drugih koreninskih endofitov. V tem članku so predstavljene novosti na področju raziskav endofitskih gliv v koreninah rast- lin, s poudarkom na aktualnem pristopu k raziskavam v eko- logiji in taksonomiji AM gliv, ter sistem njihove klasifikacije s tako imenovanimi virtualnimi taksoni (VT). Slednji je zelo uporaben za namen ekoloških raziskav in širše primerjave raz- ličnih študij med sabo. Na kratko je predstavljen tudi vpliv kli- matskih in talnih lastnosti okolja na sestavo združb in pojavl- janje posameznih taksonov AM gliv v različnih ekosistemih. Ključne besede: arbuskularna mikoriza; biodiverziteta; ekologija; endofiti; rizosfera; sekvenciranje; tla Acta agriculturae Slovenica, 118/3 – 20222 I. MAČEK 1 UVOD V RAZISKAVE DIVERZITETE AM IN DRUGIH SKUPIN ENDOFITSKIH GLIV V KORENINAH RASTLIN Arbuskularne mikorizne (AM) glive (skupina Glo- meromycotina ali tudi Glomeromycota) (Spatafora in sod., 2016, Tedersoo in sod., 2018) predstavljajo ključno skupino talnih mikroorganizmov v številnih kopenskih ekosistemih in najbolj široko razširjeno simbiozo na planetu (Brachmann in sod., 2006). Povezava med AM glivami in rastlinami je starodavna, saj so bile AM gli- ve prisotne že ob prehodu rastlin iz morja na kopno v paleozoiku pred več kot 450 milijoni let. Poleg AM gliv (Glomeromycotina) pa so bile ob prehodu rastlin na kop- no prisotne tudi endofitske glive iz starodavne in delno saprotrofne skupine Endogonales (Mucoromycotina, Mucoromycota), katerih predstavnike so dolgo uvršča- li med AM glive zaradi podobnih morfoloških struktur (drobne hife in njihov razrastki podobni abuskulom), ki jih te glive tvorijo v koreninah rastlin. Na podlagi mo- lekulskih označevalcev (markerjev) je bilo ugotovljeno, da predstavljajo t.i. drobni koreninski endofiti iz skupine Mucoromycotina (ang. ‚fine root endophytes‘ ali MFRE) filogenetsko ločeno skupino globalno razširjenih rastlin- skih endosimbiontov (Orchard in sod. 2017). Slednji tudi danes še vedno tvorijo endosimbiozo z večino skupin ko- penskih rastlin, pogosto tudi istočasno in funkcionalno komplementarno z AM glivami (Field on sod., 2015; Or- chard in sod., 2017, Hoysted in sod., 2019, Besiana et al., 2021; Sinanaj in sod., 2021). Ker so ugotovitve o pomenu simbioze rastlin z glivami iz skupine Mucoromycotina še relativno nove, je podatkov o njihovi povezavi z rastlina- mi manj kot za arbuskularno mikorizo, tako da obstaja še kar nekaj odprtih vprašanj za boljše razumevanje te skupine gliv in njihove funkcije v ekosistemih (Sinanaj in sod., 2021). V tem preglednem članku se osredotočam predvsem na arbuskularno mikorizo, torej AM glive iz skupine Glomeromycotina, vsekakor pa bo v prihodnosti potrebno spremljati tudi razvoj raziskav drugih skupin rastlinskih endofitov, tako že dlje časa poznanih temnih septiranih endofitov (DSE) (Rodriguez in sod., 2009, Knapp in sod., 2018, Tonjer in sod., 2021), kot tudi drob- nih koreninskih endofitov iz skupine Mucoromycotina (MFRE). Razvoj novih molekulskih metod v zadnjem desetletju vsekakor omogoča lažje odkrivanje in razume- vanje celotnega spektra raznolikosti organizmov, ki živijo v območju rastlinskih korenin oz. rizosferi. V bližnji pri- hodnosti zato lahko pričakujemo veliko novih informacij o starodavnih simbiozah med glivami in rastlinami, nji- hovi biodiverziteti in pomenu za ekosisteme, vključno z agroekosistemi. Že dolgo je znano, da arbuskularna mikoriza rast- linam prinaša številne koristi, od izboljšane mineralne prehrane in preskrbe z vodo ter obrambe pred patogeni, do posrednih koristi npr. izboljšane strukture tal in man- jše erozije tal. AM glive so obvezni biotrofi, od rastlin dobivajo fotoasimilate, ki predstavljajo njihov edini vir organskega ogljika (Smith & Read, 2008). Simbioza vpli- va tudi na sestavo združb kopenskih rastlin, s tem pa tudi na funkcioniranje ekosistemov in njihovo produktivnost (Fitter, 2005, Schnitzer & Klironomos, 2011, Wurzburger in sod., 2017). Taksonomsko lahko AM glive klasificira- mo na več načinov, od tradicionalnih klasifikacij, ki te- meljijo na morfologiji celične stene njihovih spor (npr. Oehl in sod., 2011, Blszkowski, 2012), kar je naslovljeno v prvem delu članka, do molekulskih pristopov, pri kate- rih uporabljamo različne molekulske označevalce, kar je obravnavano v drugem delu članka. Definicija vrste je pri mikroorganizmih, vključno z mikroglivami, na splošno zelo težavna in podvržena konsenzu na podlagi trenut- nega poznavanja posamezne skupine organizmov. Prav zato lahko na tem področju v prihodnosti pričakujemo tudi nadaljnje spremembe klasifikacije, ki bodo temeljile na novo pridobljenih podatkih o AM glivah. V zadnjem delu članka so na kratko povzete tudi glavne omejitve različnih pristopov k raziskovanju raznolikosti AM gliv, s poudarki, kje je na mestu previdnost, z namenom čim bolj kvalitetne interpretacije rezultatov in pridobivanja novega znanja o tej zanimivi in pomembni skupini or- ganizmov. 1.1 GOJENJE AM GLIV V ČISTIH KULTURAH IN KLASIČNA IDENTIFIKACIJA VRST AM GLIV Veliko težavo pri morfološkem določanju vrst AM gliv predstavlja njihovo gojenje v čistih kulturah, saj AM glive brez primerne gostiteljske rastline ne uspevajo. V sklopu raziskav AM gliv čisto, enovrstno (monospecifič- no) kulturo predstavlja kultura, kjer je prisotna samo ena vrsta glive, ki je bila vzgojena iz ene same spore. Postopek vzpostavitve take kulture je zapleten in dolgotrajen, zah- teva veliko ekspertnega znanja ter rastne razmere, ki pre- prečujejo navzkrižno kontaminacijo lončnih kultur rast- lin z drugimi glivami iz okolja (npr. ob zalivanju rastlin, zaradi prenosa z živalskimi vektorji, kot so insekti itd.). Spore nekaterih vrst AM gliv lahko izoliramo iz njihovega okolja (običajno iz talnih vzorcev ali pri ne- katerih vrstah tudi iz korenin) s postopkom redčenja in koncentriranja v vodi in/ali raztopini saharoze ter is- kanjem in prepoznavanjem spor s stereo mikroskopom. Novo, enovrstno lončno kulturo AM gliv vzpostavimo s prenosom posamezne spore v bližino korenin izbranih vrst rastlin. Rastline so običajno za namen tega postop- ka vzgojene iz semen, ki so bila predhodno površinsko sterilizirana. Da povečamo možnost neposrednega stika Acta agriculturae Slovenica, 118/3 – 2022 3 Razvoj raziskovalnih metod za karakterizacijo združb arbuskularnih mikoriznih gliv in potencialni vpliv ... na vegetacijo med korenino rastline in viabilno sporo AM glive, vzpo- stavimo začetno interakcijo med obema organizmoma v omejenem prostoru. Za ta namen se je izkazala primer- na uporaba nastavkov za pipete, napolnjenih z vlažnim, sterilnim substratom (Slika 1). Kasneje rastline skupaj z nastavkom prenesemo v večje lonce, napolnjene s steril- nim substratom (Slika 1). Da zagotovimo bolj raznolik življenjski prostor za glive (koreninska biomasa) lahko v kasnejši fazi rasti dosejemo še več gostiteljskih rastlin. Ko- ristno je, če uporabimo več rastlinskih vrst, kar omogoči večji nabor potencialnih gostiteljev za AM glive, večjo raznolikost in biomaso korenin in s tem večjo možnost, da se simbioza (mikoriza) v rizosferi dejansko vzpostavi. Pomembno je, da tudi kasneje, tekom rasti rastlin, mak- simalno zmanjšamo možnost navzkrižne kontaminaci- je s sporami ali delci infektivnih hif med posameznimi lončnimi kulturami. Taki preventivni postopki zajemajo gojenje rastlin v zaprtih prostorih, kontrolo škodljivcev, kontrolirano odtekanje vode iz loncev z mikorizo, ustrez- no zalivanje, ki je lahko urejeno z avtomatiziranim kapl- jičnim sistemom, in omejeno ventilacijo zraka znotraj prostora. Rastline lahko gojimo tudi v posebnih vrečkah z vgrajenim filtrom, kjer se ustvari mikroklima in so izo- lirane od ostalih rastlin, obenem pa je poseganje v tak sistem (npr. zalivanje) omejeno na minimum. Vzpostavitev enovrstne kulture AM gliv je dol- gotrajni postopek, ki je lahko odvisen od številnih de- javnikov, med drugimi vrste oz. genotipa glive, rastne sezone, gostiteljskih rastlin in rastnih razmer. Tudi spo- rulacija (tvorba spor) je pri AM glivah zelo nepredvidlji- va in odvisna od vrste glive. Namen vseh teh postopkov je zagotovitev zadostne količine materiala (nepoškodo- vanih, živih spor) za njihovo izolacijo in identifikacijo, saj za opis morfološke vrste AM gliv ne zadostuje ena sama spora, ampak jih potrebujemo vsaj nekaj deset za pripravo preparatov in še več za kasnejše shranjevanje glivnega materiala v banko gliv (Oehl in sod., 2011), kar je pogoj za opis nove vrste (Slika 2). Običajno se shranju- je posušen substrat s sporami v suhem, temnem in hlad- nem prostoru oz. se vzdržuje aktivno kulturo AM gliv, skupaj z živimi rastlinskimi simbionti v rastlinjaku, kar pa je časovno in finančno zelo zahtevno. Taksonomske in ekološke raziskave AM gliv na pod- lagi morfološh znakov so torej zelo težavne iz več razlogov. Če povzamemo, so glavne omejitve: (1) veliko taksonov AM gliv ne moremo gojiti v čistih (lončnih) kulturah, obenem je glive nemogoče identificirati na podlagi kolo- nizacije v koreninah (Slika 3), (2) zahteve za rast in spor- ulacijo različnih taksonov AM gliv so zelo raznolike in kompleksne, (3) pri številnih taksonih (še) nismo uspeli izolirati njihovih spor in tako morfološko določene vrste povezati s podatki, ki izvirajo iz molekulskih raziskav na osnovi DNA, (4) taksonomsko določanje AM gliv je zelo zapleteno in zahteva kompleksno ekspertno znanje, ki je Slika 1: Vzpostavitev enovrstnih (monospecifičnih) kultur AM gliv, vzgojenih iz ene same spore, v nastavkih za pipete (levo) in kasneje v lončnih kulturah (sredina, desno). Namen tega postopka je, da omogočimo čim boljši stik korenine rastline s posamezno izolirano sporo AM gliv in kasneje pomnoževanje AM gliv v kulturi. Rastline so vzgojene iz semena, ki je bilo predhodno površin- sko sterilizirano (foto: I. Maček) Figure 1: Monospecific cultures of AM fungi grown from a single AM fungal spore in pipette tips (left) and later in pot cultures (centre, right). The method allows good spatial contact between plant roots grown from a single surface-sterilised seed and a single AM fungal spore and further fungal development (photo: I. Maček) Acta agriculturae Slovenica, 118/3 – 20224 I. MAČEK kljub temu, da na to temo obstaja kar nekaj strokovne lit- erature (Oehl in sod., 2011, Blaszkowski, 2012), omejeno na samo nekaj strokovnjakov (Slika 2), (5) taksonomski znaki različnih skupin AM gliv se lahko tudi prekrivajo, oz. ni znano, če lahko npr. ista gliva v različnih okoljih tvori tudi več različnih morfoloških tipov spor. Prav zato je razvoj molekulskih metod zelo pomem- ben za razumevanje ekologije in diverzitete AM in dru- gih endofitskih gliv. Ena izmed prednosti tega pristopa je tudi ta, da lahko DNA izoliramo direktno iz korenin (Slika 3), s tem pa dobimo podatke o združbi gliv, ki je fiziološko aktivna in v času vzorčenja v dejanski interak- ciji z rastlinami. Molekulske metode in njihov hitri razvoj tako predstavljajo pravo revolucijo v razumevanju teh or- ganizmov in so še vedno med najbolj obetavnimi orodji za raziskave združb endofitskih gliv (Clapp in sod., 2003, Dickie & FitzJohn, 2007, Dumbrell in sod., 2017, Sinanaj in sod., 2021). 2 MOLEKULSKA IDENTIFIKACIJA AM GLIV V OKOLJSKIH VZORCIH IN GEN- SKI MARKERJI Dejstvo je, da obstaja relativno malo vrst oz. tak- sonov AM gliv, ki jih lahko gojimo v lončnih kulturah. Pri številnih genotipih AM gliv, ki jih poznamo samo na osnovi molekulskih označevalcev izolirane DNA iz okoljskih študij, raziskovalci še nismo uspeli izolirati spor ali celo ugotoviti, če ti taksoni sploh sporulirajo v njihovem naravnem okolju. Taki genotipi so poznani samo na osnovi nukleotidnih zaporedij oz. sekvenc določenih genskih označevalcev. V okoljskih študijah se kot ustrezni označevalec za raziskave raznolikosti in ekologije združb AM gliv največkrat uporablja gen 18S rRNA za malo podenoto ribosoma (SSU) (Simon in sod., 1992, Helgason in sod., 1998; Maček in sod., 2019), v zadnjem času pa v manjšem obsegu tudi regija notran- jega prepisanega vmesnika – ITS (nuclear ribosomal in- ternal transcribed spacer region) (npr. Alzarhani in sod., 2019) (Slika 4). Slednja se največkrat uporablja v prim- eru, da so v raziskavo vključene tudi druge skupine gliv (ne samo AM glive), za katere je regija ITS bolj primeren označevalec kot 18S rRNA, obenem pa uporaba ene same regije za vse zmanjša stroške raziskave (uporaba enega označevalca, namesto dveh, čeprav regija ITS ni optimal- no za identifikacijo AM gliv) (Alzarhani in sod., 2019). Molekulsko določanje omogoča številčno ovrednotenje (kvantifikacijo) taksonov AM gliv v tleh ali v koreninah rastlin. Geni, ki kodirajo to 18S rRNA (ali 18S SSU) genomsko regijo, so dostopni v velikem številu kopij in vsebujejo veliko ohranjenih kot tudi variabilnih regij, kar omogoča ločevanje taksonov na različnih rav- neh. Sekvence male podenote ribosoma (18S SSU) se v ekologiji AM gliv uporabljajo nekje od začetka devet- desetih let prejšnjega stoletja (Simon in sod., 1992). Do Slika 2: Spore dveh različnih vrst AM gliv iz rodu Rhizophagus (levo, sredina). Spora AM glive s strto celično steno iz rodu Acau- lospora (desno). Vidna je večplastna, strukturirana celična stena. Morfološke značilnosti celične stene, njenih plasti ter pritrjenih hif služijo kot taksonomski znaki v taksonomiji AM gliv (foto: I. Maček) Figure 2: Spores of two different AM fungal species from the genus Rhizophagus (left, centre). Crushed AM fungal spore of the genus Acaulospora with visible multi-layered structured cell wall (right). The morphological structures of the cell wall, its layers and attached hyphae serve as taxonomic features in the taxonomy of AM fungi (photo: I. Maček) Acta agriculturae Slovenica, 118/3 – 2022 5 Razvoj raziskovalnih metod za karakterizacijo združb arbuskularnih mikoriznih gliv in potencialni vpliv ... na vegetacijo danes je bilo objavljenih kar nekaj različnih začetnih oli- gonukleotidov za pomnoževanje odsekov sekvenc, spe- cifičnih za različne skupine AM gliv, v postopku verižne reakcije s polimerazo (PCR). Najpogosteje uporabljen par začetnih oligonukleotidov male podenote ribosoma v okoljskih raziskavah je AM1 (Helgason in sod., 1998) in NS31 (Simon in sod., 1992), kjer je dolžina pomnože- nega fragmenta DNA približno 550 baznih parov. Za ta par začetnih oligonukleotidov je značilno tudi za AM gli- ve nespecifično pomnoževanje drugih fragmentov, sploh, kadar je glivne DNA v okolju oz. ekstraktu malo. To je bil tudi povod za izdelavo novih začetnih oligonukleoti- dov, kot je par AML1-AML2 (Lee in sod., 2008; dolžina pomnoženega fragmenta DNA je okrog 800 baznih pa- rov) (Slika 4). Regija vsebuje tudi začetno regijo pomno- ževanja oligonukleotidov AM1-NS31, in pomnožuje širok nabor taksonomskih skupin AM gliv, ne pa vseh – izključujeta na primer skupino Paraglomeraceae (Lee in sod., 2008). Ribosomska DNA je v posamezni spori AM gliv zelo polimorfna, kar pomeni, da so sekvence rRNA gena med posameznimi taksoni AM gliv močno variabilne (Tisserant in sod., 2013). Dokazano je tudi, da hife in spore AM gliv vsebujejo na stotine jeder (Tisserant in Slika 3: Kolonizacija korenin koruze (Zea mays L.) z AM glivami (levo) in mikroskopski preparati za oceno stopnje kolonizacije korenin z AM glivami (desno). Na sliki levo so vidne znotraj-koreninske hife AM gliv in arbuskuli (drevescom-podobne struktu- re), ki so pomembne za izmenjavo hranil med rastlinami in glivami (foto: I. Maček) Figure 3:. Arbuscular mycorrhizal fungi colonising maize (Zea mays L.) roots (left), with visible intraradical hyphae and arbuscu- les (tree-like structures) important for nutrient exchange between plants and fungi. Slides for microscopy and estimation of AM fungal colonisation in plant roots (right) (photo: I. Maček) Slika 4: Shematski pregled najpogosteje uporabljenih parov začetnih oligonukleotidov, ki se uporabljajo v ekoloških raziskavah AM gliv (NS31-AM1 in AML1-AML2). Na vrhu slike so prikazani molekulski označevalci jedrne ribosomske RNA – mala po- denota ribosoma (18S SSU), velika podenota ribosoma (28S LSU), 5.8S medgenski vmesnik (IGS) in notranji prepisani vmesnik (ITS). Trikotne puščice prikazujejo smer in mesto za prijemanje začetnih oligonukleotidov Figure 4: Schematic of the most common primer pairs and DNA regions used in the community ecology of AM fungi (NS31- -AM1 and AML1-AML2). At the top of the figure are shown molecular markers of nuclear ribosomal RNA (rRNA) – small ribosomal subunit (18S SSU), large ribosomal subunit (28S LSU), 5.8S intergenic spacer (IGS) and the internal transcribed spacer (ITS). The arrows indicate the direction and alignment range of the primers Acta agriculturae Slovenica, 118/3 – 20226 I. MAČEK sod., 2013). Zaradi polimorfizma trenutno razpoložljivih genskih označevalcev je težko določiti vrsto AM gliv z molekulskimi metodami. V večini študij združb AM gliv različne taksone identificiramo kot skupine sorodnih sekvenc (npr. operativne taksonomske enote – OTU), ki pa verjetno bolj kot nivoju posamezne vrste AM gliv ustrezajo posameznim rodovom (npr. Krüger in sod., 2009). Največ okoljskih raziskav raznolikosti AM gliv je bilo izvedenih s pomnoževanjem regije 18S rRNA (npr. Schwarzott & Schuβler, 2001; Helgason in sod., 2002; Vandenkoornhuyse in sod., 2002; Öpik in sod., 2006), najprej z uporabo pirosekvenciranja s platformo Roche 454 GS-FLX (npr. Öpik in sod., 2009, Dumbrell in sod., 2011), kasneje pa tudi s z določanjem nukleotidnega zaporedja (sekvenciranjem) s platformo Illumina (npr. Alzarhani in sod. 2019; Maček in sod., 2019, Davison in sod., 2021). Trenutno poznamo več kot 300 morfotipov AM gliv, določenih na podlagi morfologije spor (http:// www.amf-phylogeny.com/). Na podlagi molekulskih analiz lahko ocenimo, da je število različnih taksonov AM gliv v okolju bistveno večje, kot kažejo taksonom- ske študije na podlagi morfoloških znakov. Virtualna taksonomija (virtualni taksoni – VT) AM gliv, ki je bila vzpostavljena v specializirani bazi podatkov s področja raziskav AM gliv, ki se imenuje MaarjAM (Öpik in sod., 2010), tudi bazira na uporabi genskega markerja 18S rRNA. Enote, definirane znotraj tega sistema, so t.i. vir- tualni taksoni (VT), ki po navedbah avtorjev baze Ma- arjAM verjetno predstavljajo monofiletske skupine AM gliv, pri katerih podobnost sekvenc znotraj skupine pre- sega dogovorno določeno mejo 97 %. Resolucija VT naj bi približno ustrezala tisti, ki definira vrste AM gliv, do- ločene na podlagi morfoloških znakov (Öpik & Davison, 2016). Baza MaarjAM (http://maarjam.botany.ut.ee) vse- buje več kot 450 virtualnih taksonov, identificiranih na podlagi sekvenc za malo podenoto ribosoma (18S rRNA) (Öpik in sod., 2014), vendar se številke spreminjajo oz. so večje, odvisno, katere genske označevalce uporabimo za identifikacijo taksonov. Klasifikacija sekvenc genov 18S rRNA z uporabo virtualnih taksonov (VT), ki so določe- ni na podlagi baze MaarjAM (Öpik in sod., 2009, 2010), nam omogoča poenoten sistem poimenovanja genotipov, ki jih lahko v ekoloških študijah uporabimo za najboljši približek identifikaciji do nivoja vrst oz. rodov (Öpik in sod., 2014). Pogosta kritika uporabe molekulskih metod za številčno ovrednotenje mikrobnih združb so tudi napake posamezne metode, ki lahko vplivajo na končni rezultat analize. Ena izmed najpogosteje omenjenih napak je po- vezana z metodo PCR in neenakomernim pomnoževan- jem DNA različnih taksonov znotraj združbe (t.i. PCR bias ali PCR pristranskost). PCR je ključni del praktič- no vseh molekulskih pristopov za analizo mikrobnih združb, vključno z združbami AM gliv. Znotraj izolata DNA iz vzorca korenin namreč glivna DNA predstavl- ja le majhen del celokupne ekstrahirane DNA, zato je potrebno specifično pomnoževanje (amplifikacija) regij DNA, ki so informativne za ločevanje različnih taksonov AM gliv. Odvisno od ciljev in namena raziskave se za to lahko uporablja različne genske označevalce, najpogos- teje pa je v ekoloških raziskavah AM gliv uporabljena že omenjena regija 18S rRNA. Potencialne napake oz. pristranskost metode PCR za pomnoževanje specifičnih taksonov (genotipov) AM gliv ter primernost uporabe presejalne metode polimorfizma dolžine terminalnih restrikcijskih fragmentov (TRFLP) za kvantitativne ra- ziskave je bila za regijo 18S rRNA AM gliv testirana v študiji Cotton in sod. (2014). V raziskavi so potrdili, da pri uporabi metod PCR za gene 18S rRNA ne prihaja do bistvenih razlik v pomnoževanju DNA med različnimi genotipi AM gliv in se zato te metode lahko uporablja tudi za kvantitativne analize združb AM gliv, zavedati pa se moramo določenih omejitev. Napake v pomnoževanju regij DNA z metodo PCR se lahko zgodijo, če se različni genotipi pomnožujejo različno hitro zaradi razlik v nji- hovih nukleotidnih zaporedjih ali zaradi same kinetike reakcije pomnoževanja (Kanagawa, 2003). Argument, da se to ne pojavlja pri AM glivah ob uporabi najpogosteje uporabljenih začetnih oligonukleotidov AM1 in NS31 je ta, da so regije DNA, na katere se ti oligonukleotidi vežejo zelo konzervativne (ohranjene med sorodstveno oddalje- nimi taksoni) in imajo obenem zelo majhno variabilnost v vsebnosti baz gvanina (G) in citozina (C) v ampliko- nih (Dumbrell in sod., 2010). Odsotnost tovrstnih napak (pristranskosti pri pomnoževanju med različnimi genoti- pi) pri reakciji PCR, je eden izmed osnovnih pogojev, da je neka analiza lahko kvantitativna in obenem omogoča oceno različnih indeksov pestrosti oz. diverzitetnih in- deksov (Cotton in sod., 2014). V nadaljnjih testih so uporabili tudi analizo TRFLP za karakterizacijo umetno ustvarjene združbe z znanimi razmerji količin vhodne DNA različnih genotipov AM gliv. Podatki študije kažejo, da je protokol TRFLP v kom- binaciji s PCR močno in konsistentno orodje za analizo združb AM gliv, medtem, ko na nivoju analiz populacij posameznih taksonov (genotipov) avtorji študije pripo- ročajo več previdnosti (Cotton in sod., 2014). Ta ekspe- riment je torej potrdil hipotezo, da je možno z uporabo PCR in metodo TRFLP ustrezno ugotoviti relativne raz- like med različnimi združbami AM gliv, v smislu njiho- ve diverzitete in sestave. Študija je tudi pokazala, da pri pomnoževanju različnih genotipov AM gliv za gene 18S rRNA metoda PCR posameznih genotipov ne pomno- žuje bolj, kot drugih, kar pomeni, da se ta metoda lah- ko uporablja tudi v sklopu drugih kvantitativnih analiz združb AM gliv, kjer predstavlja metoda PCR pomemb- Acta agriculturae Slovenica, 118/3 – 2022 7 Razvoj raziskovalnih metod za karakterizacijo združb arbuskularnih mikoriznih gliv in potencialni vpliv ... na vegetacijo no komponento. Mednje vsekakor sodijo tudi vse meto- de sekvenciranja naslednjih generacij (NGS), ki so danes za raziskave ekologije združb AM gliv največ v uporabi in katerih sestavni del je tudi pomnoževanje sekvenc s PCR (npr. platforma Illumina). 2.1 UPORABA KLONIRANJA IN DOLOČANJA NUKLEOTIDNEGA ZAPOREDJA PO SANGER- JU TER PRESEJALNIH METOD V času nastanka prvega preglednega članka o upo- rabi molekulskih pristopov pri raziskavi AM gliv (Ma- ček, 2009) se je za raziskave sestave mikrobnih združb, vključno z združbami rizosfernih AM gliv iz okoljskih vzorcev (tal ali korenin), v veliki meri uporabljalo mo- lekulske pristope, ki so temeljili na postopkih kloniranja in določanja nukleotidnega zaporedja po Sangerju. Če povzamemo na kratko, tak pristop običajno vsebuje na- slednje korake: (1) pomnoževanju glivne DNA z reakci- jo PCR, (2) ‚in vivo‘ ločevanje pomnoženih fragmentov DNA s kloniranjem pomnožkov (amplikonov) v plaz- mide in uporabo kolonij bakterij vrste Escherichia coli za ločevanje sekvenc, (3) ponovna/sekundarna reakcija PCR za namen ločevanja sekvenc, potrebnega za upo- rabo (4) sekventorjev prve generacije (sekvenciranje po Sangerju) (glej opis postopka v Maček, 2009). Vsi na- šteti koraki, predvsem pa kloniranje in uporaba celičnih kultur, so predstavljali velik časovni in finančni zalogaj, zato je bilo število vzorcev (biološke ponovitve), kot tudi število sekvenc, ki so bile sekvencirane za posamezni vzorec (globina sekvenciranja), zelo omejeno. Za posa- mezno okoljsko študijo sestave združbe AM gliv smo na tak način tipično lahko pregledali nekje med 500 in 1000 sekvenc za posamezni genski marker (npr. fragment 18S rRNA). Posledica tega je bila, da so bile združbe opisane zelo pomanjkljivo. Lahko se namreč zgodi, da na ta na- čin nevede izpustimo tiste taksone, ki so znotraj združbe manj pogosti (redki), združbo pa zaradi metodoloških omejitev opisujemo zgolj na podlagi bolj dominantnih in bolj številčnih predstavnikov skupine. Vmesna faza med zgoraj opisanim postopkom in novimi postopki sekvenciranja naslednjih generacij (NGS) je bila uporaba različnih presejalnih metod, ki temeljijo na primerjavah t.i. prstnih odtisov združbe oz. ločevanju produktov PCR z dvojno vijačnico podobne dolžine, vendar z različno sekvenco. Te metode so omo- gočile zajem nekoliko večjega števila vzorcev in tudi večjo globino vzorčenja (število obravnavanih sekvenc). Mednje sodijo metode, kot so denaturacijska gradientna gelska elektroforeza (DGGE), temperaturna gradientna gelska elektroforeza (TGGE) in že omenjeni polimorfi- zem dolžine terminalnih restrikcijskih fragmentov (TR- FLP). Med naštetimi metodami ima TRFLP največjo zmogljivost v smislu možnosti obdelave večjega števila bioloških vzorcev, medtem, ko so tehnike gelske elektro- foreze (DGGE, TGGE) zamudne in omogočajo obdela- vo le manjšega števila vzorcev. To pomeni, da so manj uporabne za ekološke študije, kjer je med vzorci običajno velika variabilnost in je zato potrebno v študijo vključiti veliko število vzorcev. Slaba stran vseh teh metod je tudi ta, da so primarno presejalne narave, zato v končni fazi običajno nimamo vpogleda v sekvence posameznega markerskega gena raziskovanih organizmov. Tako meto- do lahko zato uporabljamo samo za relativne primerjave sestave združb in biodiverzitete med primerjanimi vzorci znotraj ene študije, ne omogočajo pa primerjave različ- nih študij med sabo. Tako je bila pred razvojem in širšo uporabo metod NGS relativno pogosto uporabljana ana- liza za relativne primerjave sestave združb organizmov iz okoljskih vzorcev preučevanje polimorfizma dolžine ter- minalnih restrikcijskih fragmentov (TRFLP) tarčnih ge- nov (prokariontskih 16S ali evkariontskih 18S rRNA), ki v nekaterih primerih omogoča tudi kvantitativne študi- je. Metoda je bila pogosto uporabljana tudi na področju mikrobne ekologije in okoljske mikrobiologije, predvsem zaradi cenovne dostopnosti, filogenetske ločljivosti in enostavne analize večjega števila vzorcev. Analiza TRFLP ima torej dovolj veliko zmogljivost (omogoča obdelavo zadostnega števila vzorcev), da lahko z njo preučimo tudi vplive različnih okoljskih dejavnik- ov na strukturo in dinamiko mikrobnih združb. Na tak način dobimo t.i. ‚prstni odtis‘ (finger-print) združbe raziskovane skupine organizmov za analizirane vzorce, zato tehniko TRFLP imenujemo tudi tehnika prstnih odtisov. Take podatke lahko uporabimo za analizo diver- zitete (izračun različnih indeksov raznolikosti) in sestave združbe, pri čemer lahko izvajamo primerjave med vzor- ci, zajetimi znotraj ene študije, ne pa tudi med različnimi študijami, kar je pomanjkljivost tehnik, ki uporabljajo t. i. tehniko prstnih odtisov. Poznati moramo tudi specifike posamezne preučevane skupine organizmov in omejitve uporabe posamezne metode za to skupino. Primernost metode TRFLP so testirali tudi za kvantitativne analize združb AM gliv, pri tem pa avtorji študije opozarjajo, da tehnika TRFLP v vseh testiranih vzorcih precenjuje vrstno pestrost AM gliv znotraj raziskovane združbe, zato je pri kvantitativnem vrednotenju indeksov razno- likosti potrebna pozornost pri interpretaciji s to tehniko pridobljenih rezultatov (Cotton in sod., 2014). Sama me- toda TRFLP ne producira celotnih sekvenc posameznih organizmov znotraj združbe, se pa lahko s TRFLP pri- dobljeni podatki primerjajo z obstoječo bazo sekvenc, če želimo pridobiti podatke o identiteti posmeznega vzorca (Dickie & FitzJohn, 2007, Roberts in sod., 2012). Danes so tehniko TRFLP v raziskavah ekologije združb mik- Acta agriculturae Slovenica, 118/3 – 20228 I. MAČEK roorganizmov v veliki meri nadomestile tehnike NGS, katerih velika prednost je, da končne izhodne podatke predstavljajo celotne sekvence posameznih amplikonov, kar omogoča lažjo in neposredno identifikacijo organ- izmov, ki pa je odvisna od informativnosti regije, ki jo sekvenciramo za posamezno skupino organizmov. Kot že rečeno, naj bi regija 18S rRNA pri AM glivah približno us- trezala nivoju morfološke vrste, se pa to področje še zelo intenzivno raziskuje in lahko v prihodnosti pričakujemo novosti. 2.2 DOLOČANJE NUKLEOTIDNEGA ZAPOREDJA (SEKVENCIRANJE NASLEDNJIH GENERACIJ – NGS) Metode NGS so najprej uporabljali v medicini in pri poskusih sekvenciranja človeka in drugih primatov (Wheeler in sod., 2008). Relativno hitro so se te metode razširile tudi na področje ekoloških raziskav in raziskav mikrobnih združb (mikrobiomov) v različnih okoljih, saj so omogočale vključevanje bistveno večjega števila vzorcev v raziskavo in obenem bistveno večjo globino sekvenciranja znotraj posameznega vzorca (najprej od več sto tisoč pa vse do več sto milijonov sekvenc pri danes uporabljanih pristopih). Ti novi principi so močno vplivali na številna področja v mikrobni ekologiji, okoljs- ki mikrobiologiji, ekologiji tal in raziskavah rizosfere, kot tudi pri raziskavah različnih interakcij med organizmi, vključno z interakcijami rastlin z drugimi organizmi (npr. mikoriza). Danes je tudi v okoljskih raziskavah pogosta praksa pomnoževanja tarčnih filogenetskih in/ali funkcional- nih genskih označevalcev in obenem uporaba pristop- ov NGS za karakterizacijo njihove raznolikosti. Nova tehnologija omogoča vse številčnejše sete vzorcev, kar je bistvenega pomena za ekološke raziskave, ki se lahko iz- vajajo v različnih dimenzijah, tako prostora, kot tudi časa (vzorčenja v več prostorskih in časovnih točkah, raziskave dinamike procesov in sukcesije). Zavedati pa se moramo, da so prav vsi pristopi NGS podvrženi metodološkim napakam oz. so lahko pristranski, pri čemer gre na eni strani za produkcijo visoko kvalitetnih podatkov, ki jih zahtevajo raziskave, in na drugi napačnih sekvenc ter metodološkega šuma. Vsi pristopi z uporabo NGS zato zahtevajo natančno bioinformacijsko analizo in proce- siranje podatkov, kar omogoča kvalitativno filtriranje in procesiranje sekvenc z namenom izogibanja zavajajočih interferenc iz metodoloških napak. Podobna previdnost je potrebna tudi pri vseh nadaljnjih statističnih anali- zah pridobljenih podatkov, saj lahko nepravilen izbor statističnega pristopa rezultira v napačnih zaključkih raziskave. Prav s tem namenom je nastalo tudi kar nekaj preglednih objav oz. pregleda metodoloških pristopov, ki sistematično podajajo navodila za lažje spopadanje z izzivom obdelave podatkov, ki izhajajo iz NGS (npr. za osnovno analizo podatkov, ki izhajajo iz sekven- ciranja amplikonov z namenom raziskav raznolikosti in ekologije združb AM gliv (Dumbrell in sod., 2017). Tipično bioinformacijski pristopi vključujejo metode za preverjanje kakovosti sekvenc in odstranjevanja šuma, formiranje operacijskih taksonomskih enot (Operational Taxonomic Unit – OTU), taksonomsko določanje posa- meznih sklopov sekvenc ter osnovne statistične analize za testiranje hipotez. Prikaz teh metod za dva pogosto uporabljena pristopa (QIIME in mothur), skupaj s sa- mostojnimi orodji (vključno z odprtokodnim program- skim okoljem ter jezikom R), so predstavljene v objavi Dumbrell in sod. (2017), kjer so predstavljeni pristopi za obdelavo podatkov sekvenciranja amplikonov, ki izhajajo iz dveh pogosto uporabljenih tehnologij NGS, v pretek- losti več uporabljane tehnologije 454-pirosekvenciranja ter danes široko uporabljane platforme Illumina. Zaradi hitrega napredka tehnologije in z njo povezane bioinformatike pa je nujno redno spreml- janje tekočih objav in drugih virov na to temo. Zaradi obsežnosti in kompleksnosti podatkov, ki izhajajo iz tehnik sekvenciranja amplikonov z NGS je pogost izziv tudi njihova ustrezna predstavitev. Izziv, ki se skriva v novih tehnologijah je predvsem ta, da nas lahko za- slepi analitična moč novih metod, obenem pa je naše zavedanje o tem, da zaradi hitrega razvoja teh pris- topov lahko pridemo tudi do napačnih zaključkov, po- manjkljivo. Napačni zaključki so lahko rezultat napak v sami tehnologiji, pomanjkljivega testiranja metod in/ ali pomanjkanja izkušenj. Nujno je, da nek problem oz. študijo že v začetni fazi načrtovanja naslovimo z jasni- mi vprašanji, posledica katerih so tudi jasno zastavljene raziskovalne hipoteze in ciljni metodološki pristopi, ki izhajajo iz teh hipotez. Vsekakor pa predstavljajo me- tode NGS ob pravilni uporabi močno analitično orodje, ki odpira povsem nove možnosti v raziskavah ekologije tako bolj vidnih in karizmatičnih nadzemnih organ- izmov, kot tudi bolj skritih, a pomembnih akterjev v podzemnem delu kopenskih ekosistemov. 3 VPLIV OKOLJSKIH IN GEOGRAFSKIH DEJAVNIKOV NA SESTAVO ZDRUŽB AM GLIV IN NJIHOVO RAZŠIRJENOST Znano je, da sestavo združb AM gliv določajo raz- lični dejavniki okolja, vključno s klimatskimi in talnimi specifikami, ki delujejo tako na lokalni, kot tudi na glo- balni ravni (npr. Dumbrell in sod., 2010, Kivlin in sod., Acta agriculturae Slovenica, 118/3 – 2022 9 Razvoj raziskovalnih metod za karakterizacijo združb arbuskularnih mikoriznih gliv in potencialni vpliv ... na vegetacijo 2011, Lekberg in sod., 2011, Maček in sod., 2011, Ha- zard in sod., 2013, Davison in sod., 2015, Maček in sod., 2019, Vetrovsky in sod., 2019, Davison in sod., 2021). Na splošno je pri pojavljanju različnih taksonov AM gliv še vedno relativno malo dostopnih informacij na ravni odnosa posameznega organizma in okolja (Davison in sod., 2020). Po podatkih iz številnih študij, ki so zbrane v bazi MaarjAM (Öpik in sod., 2010) lahko vidimo, da so mnogi virtualni taksoni (VT) AM gliv široko geograf- sko razširjeni in se pojavljajo v številnih habitatnih tipih (Davison in sod., 2015, Savary in sod., 2018). Taka opa- žanja pa so nastala večinoma na podatkih o prisotnosti taksonov v določenem habitatu, ni pa podatkov v ko- likšni meri številčnost (abundanca) posameznih VT va- riira vzdolž gradienta določenega abiotskega dejavnika. Taksone AM gliv so v preteklosti klasificirali v različne ekotipe (Alzarhani in sod., 2019) ter v ekološke skupine, kot so generalisti in specialisti na osnovi različnih ran- gov, ki vključujejo geografske dejavnike (Moora in sod., 2011, Bouffaud in sod., 2016), habitat (Sykorova in sod., 2007, Oehl in sod., 2010, Vályi in sod., 2015) ali rastlinske gostiteljske vrste (Helgason in sod., 2007). Poudariti pa je treba, da je tovrstno klasificiranje taksonov v posamezne ekološke niše omejeno na obseg okoljskih dejavnikov, ki jih pokriva posamezna študija in posplošenje tega poja- va ni mogoče. V nekaterih novejših objavah poročajo, da so si določene funkcionalne lastnosti med sorodnimi morfološkimi vrstami AM gliv podobne (Powell in sod., 2009, Hoeksema in sod., 2018). Dejstvo pa je, da pred- stavljajo morfološko opisane vrste AM gliv, identificira- ne na podlagi morfologije celične stene njihovih spor, le majhen del raznolikosti AM gliv, ki so bile določene na osnovi molekulskih označevalcev (markerskih genov) (Öpik in sod., 2014). V zelo obsežni nedavni študiji, ki je vključevala več kot 300 talnih vzorcev iz različnih naravnih ekosistemov iz celega sveta so ugotovili, da so porazdelitev VT v različnih ekosistemih skupaj pojasnile tako okoljske, kot tudi prostorske (geografske) variable. Med njimi sta bili temperatura okolja in vrednost pH tal najpomembnejša okoljska določevalnika porazdelitve in lokalne relativne abundance (številčnosti) različnih taksonov AM gliv (Davison in sod., 2021). V študiji so ugotovili tudi različne vzorce ekoloških niš, ki so bili naj- bolj opazni na ravni družin AM gliv, kar kaže, da sorod- ni taksoni oz. VT zavzemajo podobne ekološke niše. Za predstavnike družine AM gliv Acaulosporaceae je tako značilen optimum pri manjši vrednosti pH tal, in nižji temperaturi, medtem, ko so predstavniki družine Gi- gaporaceae bolj številčni v bolj vlažnih območjih z več dežja (Davison in sod., 2021). Na to temo pa bo v prihod- njem desetletju sigurno še veliko novih podatkov, tudi v luči vpliva klimatskih sprememb na AM glive in njihovo simbiozo z rastlinami (Maček in sod., 2019). 4 ZAKLJUČEK Razumevanje vpliva globalnih sprememb na terest- rične ekosisteme zahteva povezovalen pristop med raz- ličnimi disciplinami, ki raziskuje odzive skozi vse ravni biološke organizacije in skozi različne prostorsko-ča- sovne skale. Obenem mora ta pristop vključevati tako nadzemno, kot tudi podzemno raznolikost znotraj eko- sistemov, saj sta obe neločljivo povezani in prepleteni. V večini primerov še vedno ni celostnega razumevanja odziva interakcij komponent nadzemne in podzemne raznolikosti na akutne kratkoročne (npr. suša, toplotni valovi) ter kronične dolgoročne globalne in klimatske spremembe (npr. segrevanje, povečana koncentracija CO2, onesnaženje). Prav zato so nujno potrebni ekspe- rimenti, ki naslavljajo te vrzeli v razumevanju delovanja ekosistemov. Nove metode sekvenciranja omogočajo ve- liko ponovljivost in s tem dokaj robusten pristop k ra- ziskavam v ekologiji, predvsem v smislu velikega števila bioloških ponovitev (zadosti ponovitev za ustrezno ana- lizo podatkov), obravnavo vseh ravni ekoloških združb (nadzemnega in podzemnega – rizosfernega), in v smislu primernega trajanja eksperimenta (zaželene so dolgoroč- ne študije, ki zajemajo vzorčenje preko več sezon ali celo let). Slednje je nujno za razumevanje in ločevanje dol- goročnih in kratkoročnih odzivov na vseh ravneh biod- iverzitete. Najnovejša molekulska orodja za raziskave v eko- logiji združb, kot so metode NGS, ki omogočajo prido- bivanje podatkov o sekvencah organizmov iz različnih okolij, postavljajo vse cenejše in široko dostopne. Pri tem pa je nujno zavedanje, da kljub široki dostopnosti, kva- litetna biološka interpretacija molekulske karakterizacije združb posameznih skupin organizmov zahteva veliko specialističnega znanja o specifični skupini organizmov. Zavedati se moramo na primer, da tako tehnika TRFLP, kot tudi NGS, predstavljata analize relativne številčnosti (abundance) taksonov znotraj vzorcev, zato ju ne smemo uporabljati za ugotavljanje razlik v absolutni številčnosti med posameznimi vzorci. Na koncu se moramo zaveda- ti tudi dejstva, da lahko podajajo ocene sestave združb, ki temeljijo na ekstraktih DNA, le podatke o genski raz- nolikosti in genski sestavi združb. Nemogoča je namreč ocena biomase posameznih vrst teh organizmov v nekem okolju na osnovi takih podatkov zaradi medvrstne in ča- sovne variabilnosti števila kopij posameznih genov na enoto rasti, kar posebej velja za nitaste organizme, kot so AM glive (Corradi in sod., 2007, Jansa in sod., 2008). Bistveno je torej, da se obenem zavedamo tako moči te- hnologije, da v kratkem času producira ogromno količi- no podatkov, kot tudi vseh omejitev in novosti, vključno s hitro spreminjajočimi se postopki bioinformatike, ki je neločljivo povezana z vsakim postopkom NGS. Tak pris- Acta agriculturae Slovenica, 118/3 – 202210 I. MAČEK top v kar največji možni meri zmanjša možnost napačne interpretacije podatkov, ki jih pridobimo z NGS, in obe- nem poveča trajno znanstveno vrednost in odmevnost našega dela. 5 ZAHVALA Raziskovalno delo, povezano z vsebino tega članka, poteka v okviru programske skupine P4-0085, ARRS. 6 REFERENCE Alzarhani, A.K., Clark, D.R., Underwood, G.J., Ford, H., Cot- ton, T.A., and Dumbrell, A.J. (2019). Are drivers of root- associated fungal community structure context specific? ISME Journal, 13, 1330–1344. https://doi.org/10.1038/ s41396-019-0350-y Besiana, S., Hoysted, G.A., Pressel, S., Bidartondo, M.I., and Field, K.J. (2021). Critical research challenges facing Muco- romycotina ‘fine root endophytes. New Phytologist, Forum, 1–7. https://doi.org/10.1111/nph.17684 Bouffaud, M.L., Creamer, R.E., Stone, D., Plassart, P., van Tuinen, D., Lemanceau, P., Wipf, D., and Redecker, D. (2016). Indicator species and co-occurrence in communi- ties of arbuscular mycorrhizal fungi at the European scale. Soil Biology and Biochemistry, 103, 464–470. https://doi. org/10.1016/j.soilbio.2016.09.022 Błaszkowski J. (2012). Glomeromycota. W. Szafer Institute of Botany, Polish Academy of Sciences, Kraków., 300 pp. Brachmann, A. and Parniske, M. (2006). The most widespread symbiosis on earth. PLoS Biol 4, e239. DOI: 10.1371/ journal.pbio.0040239. https://doi.org/10.1371/journal. pbio.0040239 Clapp, J.P., Helgason, T., Daniell, T.J., and Young, J.P.W. (2003). Chapter 8: Genetic studies of the structure and diversity of arbuscular mycorrhizal fungal communities. In: van der Heijden, M.G.A. and Sanders, I.R. (eds.). Mycorrhizal Ecol- ogy (Ecological Studies 157). Germany: Springer., pp. 201– 221. https://doi.org/10.1007/978-3-540-38364-2_8 Corradi, N., Croll, D., Colard, A., Kuhn, G., Ehinger, M., and Sanders, I.R. (2007). Gene copy number polymorphisms in an arbuscular mycorrhizal fungal population. Applied an Environmental Microbiology, 73(1), 366–369. https://doi. org/10.1128/AEM.01574-06 Cotton, T.E., Dumbrell, A.J., Helgason, T. (2014). What goes in must come out: testing for biases in molecular analysis of arbuscular mycorrhizal fungal communities. PLoS One, 9(10), e109234, doi: 10.1371/journal.pone.0109234. https:// doi.org/10.1371/journal.pone.0109234 Davison, J., García de León, D., Zobel, M., Moora, M., Bueno, C.G., Barceló, M., Gerzm M., León, D., Meng, Y., Pillar, V.D., Sepp, S., Soudzilovaskaia, N.A., Tedersoo, L., Vaessen, S., Vahter, T., Winck, B., and Öpik, M. (2020). Plant func- tional groups associate with distinct arbuscular mycorrhi- zal fungal communities. New Phytologist, 226, 1117–1128. https://doi.org/10.1111/nph.16423 Davison, J., Moora, M., Öpik, M., Adholeya, A., Ainsaar, L., Bâ, A., Burla, S., Diedhiou, A.G., Hiiesalu, I., Jairus, T., Johnson, N.C., Kane, A., Koorem, K., Kochar, M., Ndiaye, C., Pärtel, M., Reier, Ü., Saks, Ü., Singh, R., Vasar, M., and Zobel, M. (2015). Global assessment of arbuscular mycor- rhizal fungus diversity reveals very low endemism. Science, 349, 970–973. https://doi.org/10.1126/science.aab1161 Davison, J. Moora, M., Semchenko, M., Adenan, S.B., Ahmed, T., Akhmetzhanova, A.A., Alatalo, J.M., Al-Quraishy, S., Andriyanova, E., Anslan, S., Bahram, M., Batbaatar, A., Brown, C., Bueno, C.G., Cahill, J., Cantero, J.J., Casper, B.B., Cherosov, M., Chideh, S., Coelho, A.P., Coghill, M., Decocq, G., Dudov, S., Fabiano, E..C., Fedosov, V.E., Fraser, L., Glassman, S.I., Helm, A., Henry, H.A.L., Hérault, B., Hi- iesalu, I., Hiiesalu, I., Hozzein, W.N., Kohout, P., Kõljalg, U., Koorem, K., Laanisto, L., Mander, U., Mucina, L., Munyam- pundu, J., Neuenkamp, L., Niinemets, U., Nyamukondiwa, C., Oja, J., Onipchenko, V., Pärtel, M., Phosri, C., Põlme, S., Püssa, K., Ronk, A., Saitta, A., Semboli, O., Sepp, S., Seregin, A., Sudheer, S., Peña-Venegas, C.P., Paz, C., Vahter, T., Vasar, M., Veraart, A.J., Tedersoo, L., Zobel, M., and Öpik, M. (2021). Temperature and pH define the realised niche space of arbuscular mycorrhizal fungi. New Phytolo- gist, 231, 763–776. https://doi.org/10.1111/nph.17240 Dickie, I.A. and FitzJohn, R.G. (2007). Using terminal restric- tion fragment length polymorphism (T-RFLP) to identify mycorrhizal fungi: a methods review. Mycorrhiza, 17, 259– 270. https://doi.org/10.1007/s00572-007-0129-2 Dumbrell, A.J., Ashton, P.D., Aziz, N., Feng, G., Nelson, M., Dytham, C., Fitter, A.H., and Helgason, T. (2011). Dis- tinct seasonal assemblages of arbuscular mycorrhizal fungi revealed by massively parallel pyrosequencing. New Phytologist, 190, 794–804. https://doi.org/10.1111/j.1469- 8137.2010.03636.x Dumbrell, A.J., Ferguson, R.M.W., and Clark, D.R. (2017). Microbial Community Analysis by Single-Amplicon High-Throughput Next Generation Sequencing: Data Analysis - From Raw Output to Ecology. In: McGen- ity, T.J., Timmis, K.N., and Nogales, B. (eds) Hydrocarbon and lipid microbiology protocols. Springer protocols hand- books. Springer, Heidelberg, pp. 155–206. https://doi. org/10.1007/8623_2016_228 Dumbrell, A.J., Nelson, M., Helgason, T., Dytham, C., and Fit- ter, A.H. (2010). Relative roles of niche and neutral process- es in structuring a soil microbial community. ISME Journal, 4, 337–345. https://doi.org/10.1038/ismej.2009.122 Field, K.J., Rimington, W.R., Bidartondo, M.I., Allinson, K.E., Beerling, D.J., Cameron, D.D., Duckett, J.G., Leake, J.R., and Pressel, S. (2015). First evidence of mutualism between ancient plant lineages (Haplomitriopsida liverworts) and Mucoromycotina fungi and its response to simulated Pal- aeozoic changes in atmospheric CO2. New Phytologist, 205, 743–756. https://doi.org/10.1111/nph.13024 Fitter, A.H. (2005). Darkness visible: reflections on under- ground ecology. Journal of Ecology, 93, 231–243. https://doi. org/10.1111/j.0022-0477.2005.00990.x Acta agriculturae Slovenica, 118/3 – 2022 11 Razvoj raziskovalnih metod za karakterizacijo združb arbuskularnih mikoriznih gliv in potencialni vpliv ... na vegetacijo Hazard, C., Gosling. P., Van Der Gast, C.J., Mitchell, D.T., Doohan, F.M., and Bending, G.D. (2013). The role of lo- cal environment and geographical distance in determining community composition of arbuscular mycorrhizal fungi at the landscape scale. ISME Journal, 7, 498–508. https://doi. org/10.1038/ismej.2012.127 Helgason T., Daniell T. J., Husband R., Fitter A. H., and Young J. P. W. (1998). Ploughing up the wood-wide web? Nature, 394, 431. https://doi.org/10.1038/28764 Helgason T., Merryweather J. W., Denison J., Wilson P., Young J. P. W., and Fitter A. H. (2002). Selectivity and functional diversity in arbuscular mycorrhizas of co-occurring fungi and plants from a temperate deciduous woodland. Journal of Ecology, 90, 371–384. https://doi.org/10.1046/j.1365- 2745.2001.00674.x Helgason, T., Merryweather, J.W., Youngm J.P.W., and Fitter A.H. (2007). Specificity and resilience in the arbuscular mycorrhizal fungi of a natural woodland community. Jour- nal of Ecology, 95, 623–630. https://doi.org/10.1111/j.1365- 2745.2007.01239.x Hoeksema, J.D., Bever, J.D., Chakraborty, S., Chaudhary, V.B., Gardes, M., Gehring, C.A., Hart, M.M., Housworth, E.A., Kaonongbua, W., Klironomos, J.N., Lajeunesse, M.J., Meadow, J., Milligan, B.G., Piculell, B.J., Pringle, A., Rúa, M.A., Umbanhowar, J., Viechtbauer, W., Wang, Y., Wilson, G.W.T, and Zee, P.C. (2018). Evolutionary history of plant hosts and fungal symbionts predicts the strength of mycor- rhizal mutualism. Communications Biology, 1, 116. https:// doi.org/10.1038/s42003-018-0120-9 Hoysted, G.A., Jacob, A.S., Kowal, J., Giesemann, P., Bidar- tondo, M.I., Duckett, J.G., Gebauer, G., Rimington, W.R., Schornack, S., Pressel, S., and Field, K.J. (2019). Mucoromy- cotina fine root endophyte fungi form nutritional mutual- isms with vascular plants. Plant Physiology, 181, 565–577. https://doi.org/10.1104/pp.19.00729 Jansa, J., Smith, F.A., and Smith, S.E. (2008). Are there benefits of simultaneous root colonization by different arbuscular mycorrhizal fungi? New Phytologist, 177, 779–789. https:// doi.org/10.1111/j.1469-8137.2007.02294.x Lee, J., Lee, S., and Young, J.P. (2008). Improved PCR primers for the detection and identification of arbuscular mycorrhi- zal fungi. FEMS Microbiology Ecology, 65, 339–349. https:// doi.org/10.1111/j.1574-6941.2008.00531.x Lekberg, Y., Meadow, J., Rohr, J.R., Redecker, D., and Zabinski, C.A. (2011). Importance of dispersal and thermal environ- ment for mycorrhizal communities: lessons from Yellow- stone National Park. Ecology, 92, 1292–1302. https://doi. org/10.1890/10-1516.1 Kanagawa, T. (2003). Bias and artifacts in multitemplate poly- merase chain reactions (PCR). Journal of Bioscience and Bioengineering, 96, 317–323. https://doi.org/10.1016/ S1389-1723(03)90130-7 Kivlin, S.N., Hawkes, C.V., and Treseder, K.K. (2011). Global diversity and distribution of arbuscular mycorrhizal fungi. Soil Biology & Biochemistry, 43, 2294-2303. https://doi. org/10.1016/j.soilbio.2011.07.012 Knapp, D.G., Nemeth, J.B., Barry, K., Hainaut, M., Henrissat, B., Johnson, J., Kuo, A., Lim, J.H.P., Lipzen, A., Nolan, M., Ohm, R.A., Tamas, L., Grigoriev, I.V., Spatafora, J.W., Nagy, L.G., and Kovacs, G.M. (2018). Comparative genomics pro- vides insights into the lifestyle and reveals functional het- erogeneity of dark septate endophytic fungi. Scientific Re- ports, 8, 6321. https://doi.org/10.1038/s41598-018-24686-4 Krüger, M., Stockinger, H., Krüger, C., and Schüssler, A. (2009). DNA-based species level detection of Glomeromycota: one PCR primer set for all arbuscular mycorrhizal fungi. New Phytologist, 183, 212–223. https://doi.org/10.1111/j.1469- 8137.2009.02835.x Maček, I. (2009). Molekulski pristopi pri raziskavah arbusku- larne mikorize. Acta Agriculturae Slovenica, 93(1), 77–85. Maček, I., Clark, D.R., Šibanc, N., Moser, G., Vodnik, D., Mül- ler, C., and Dumbrell, A.J. (2019). Impacts of long-term elevated atmospheric CO2 concentrations on communities of arbuscular mycorrhizal fungi. Molecular Ecology, 28(14), 3445–3458. https://doi.org/10.1111/mec.15160 Maček, I., Dumbrell, A.J., Nelson, M., Fitter, A.H., Vodnik, D., and Helgason, T. (2011). Local adaptation to soil hypoxia determines the structure of an arbuscular mycorrhizal fungal community in roots from natural CO2 springs. Ap- plied and Environmental Microbiology, 77(14), 4770–4777. https://doi.org/10.1128/AEM.00139-11 Moora, M., Berger, S., Davison, J., Öpik, M., Bommarco, R., Bruelheide, H., Kühn I, Kunin WE, Metsis M, Rortais A., Vanatoa, A., Vanatoa, E., Stout, J.C., Truusa, M., Westphal, C., Zobel, M., and Walther G. (2011). Alien plants asso- ciate with widespread generalist arbuscular mycorrhizal fungal taxa: evidence from a continental-scale study us- ing massively parallel 454 sequencing. Journal of Bioge- ography, 38, 1305–1317. https://doi.org/10.1111/j.1365- 2699.2011.02478.x Oehl, F., Laczko, E., Bogenrieder, A., Stahr, K., Bösch, R., van der Heijden, M., and Sieverding, E. (2010). Soil type and land use intensity determine the composition of arbuscular my- corrhizal fungal communities. Soil Biology & Biochemistry, 42, 724–738. https://doi.org/10.1016/j.soilbio.2010.01.006 Oehl, F., Sieverding, E., Palenzuela, J., Ineichen, K., and da Silva, G.A. (2011). Advances in Glomeromycota taxonomy and classification. IMA Fungus, 2, 191–199. https://doi. org/10.5598/imafungus.2011.02.02.10 Orchard, S., Standish, R.J., Dickie, I.A., Renton, M., Walker, C., Moot, D., and Ryan, M.H. (2017). Fine root endo- phytes under scrutiny: A review of the literature on arbus- cule-producing fungi recently suggested to belong to the Mucoromycotina. Mycorrhiza, 27, 619–528. https://doi. org/10.1007/s00572-017-0782-z Öpik, M. and Davison, J. (2016). Uniting species-and commu- nity-oriented approaches to understand arbuscular mycor- rhizal fungal diversity. Fungal Ecology, 24, 106–113. https:// doi.org/10.1016/j.funeco.2016.07.005 Öpik, M., Davison, J., Moora, M., and Zobel, M. (2014). DNA- based detection and identification of Glomeromycota: the virtual taxonomy of environmental sequences. Botany- Botanique, 92, 135–147. https://doi.org/10.1139/cjb-2013- 0110 Öpik, M., Metsis, M., Daniell, T.J., Zobel, M., and Moora, M. (2009). Large-scale parallel 454 sequencing reveals eco- Acta agriculturae Slovenica, 118/3 – 202212 I. MAČEK logical group specificity of arbuscular mycorrhizal fungi in a boreonemoral forest. New Phytologist, 184, 424–437. https://doi.org/10.1111/j.1469-8137.2009.02920.x Öpik, M., Moora, M., Liira, J., and Zobel, M. (2006). Composi- tion of root-colonizing arbuscular mycorrhizal fungal com- munities in different ecosystems around the globe. Journal of Ecology, 94, 778–790. https://doi.org/10.1111/j.1365- 2745.2006.01136.x Öpik, M., Vanatoa, A., Vanatoa, E., Moora, M., Davison, J., Kalwij, J.M., Reier, U., and Zobel, M. (2010). The online da- tabase MaarjAM reveals global and ecosystem distribution patterns in arbuscular mycorrhizal fungi (Glomeromyco- ta). New Phytologist, 188, 223–241. https://doi.org/10.1111/ j.1469-8137.2010.03334.x Öpik, M., Zobel, M., Cantero, J.J., Davison, J., Facelli, J.M., Hiiesalu, I., Jairus, T., Kalwij, J.M., Koorem, K., Leal, M.E., Liira, J., Metsis, M., Neshataeva, V., Paal, J., Phosri, C., Põlme, S., Reier, Ü., Saks, Ü., Orchard, S., Standish, R.J., Dickie, I.A., Renton, M., Walker, C., Moot, D., and Ryan, M.H. (2017). Fine root endophytes under scrutiny: a review of the literature on arbuscule-producing fungi recently sug- gested to belong to the Mucoromycotina. Mycorrhiza, 27, 619–638. https://doi.org/10.1007/s00572-017-0782-z Powell, J.R., Parrent, J.L., Hart, M.M., Klironomos, J.N., Rillig, M.C., and Maherali, H. (2009). Phylogenetic trait con- servatism and the evolution of functional trade-offs in ar- buscular mycorrhizal fungi. Proceedings of the Royal Soci- ety of London B, 276, 4237–4245. https://doi.org/10.1098/ rspb.2009.1015 Roberts, D.M., Schofield, P.G., Don, S., and Daniell, T.J. (2012). Directed terminal restriction analysis tool (DRAT): an aid to enzyme selection for directed terminal-restriction fragment length polymorphisms. Methods in Ecology and Evolution, 3(1), 24–28. https://doi.org/10.1111/j.2041- 210X.2011.00139.x Rodriguez, R.J., White, J.F., Arnold, A.E., and Redman, R.S. (2009). Fungal endophytes: diversity and functional roles. New Phytologist, 182, 314–330. https://doi.org/10.1111/ j.1469-8137.2009.02773.x Savary, R., Masclaux, F.G., Wyss, T., Droh. G., Corella, J.C., Machado, A.P., Morton, J.B., and Sanders, I.R. (2018). A population genomics approach shows widespread geo- graphical distribution of cryptic genomic forms of the sym- biotic fungus Rhizophagus irregularis. ISME Journal, 12, 17–30. https://doi.org/10.1038/ismej.2017.153 Schnitzer, S.A. and Klironomos, J. (2011). Soil microbes regu- late ecosystem productivity and maintain species diversity. Plant Signaling & Behavior, 6-8, 1240–1243. https://doi. org/10.4161/psb.6.8.16455 Schwarzott, D. and Schüßler A. (2001). A simple and reliable method for SSU rRNA gene DNA extraction, amplification, and cloning from single AM fungal spores. Mycorrhiza, 10, 203–207. https://doi.org/10.1007/PL00009996 Simon, L., Lalonde, M., and Bruns, T.D. (1992). Specific ampli- fication of 18S fungal ribosomal genes from vesicular ar- buscular endomycorrhizal fungi colonising roots. Applied and Environmental Microbiology, 58, 291–295. https://doi. org/10.1128/aem.58.1.291-295.1992 Sinanaj, B., Hoysted, G.A., Pressel, S., Bidartondo, M.I., and Field, K.J. (2021). Critical research challenges facing Muco- romycotina ‘fine root endophytes’. New Phytologist. https:// doi.org/10.1111/nph.17684 Smith, S.E and Read, D.J. (2008). Mycorrhizal Symbiosis, 3rd Edition. Academic Press, 800 pg. Spatafora, J.W., Chang, Y., Benny,G.L., Lazarus, K., Smith, M.E., Berbee, M.L., Bonito, G., Corradi, N., Grigoriev, I., Grygan- skyi, A, James, T.Y., O’Donnell, K., Roberson, R.W., Taylor, T.N., Uehling, J., Vilgalys, R., White, M.M., and Stajich, J.E. (2016). A phylum-level phylogenetic classification of zygo- mycete fungi based on genome-scale data. Mycologia, 108, 1028–1046. https://doi.org/10.3852/16-042 Sýkorová, Z., Ineichen., K., Wiemken, A., and Redecker, D. (2007). The cultivation bias: different communities of ar- buscular mycorrhizal fungi detected in roots from the field, from bait plants transplanted to the field, and from a green- house trap experiment. Mycorrhiza, 18, 1–14. https://doi. org/10.1007/s00572-007-0147-0 Tedersoo, L., Sánchez-Ramírez, S., Kõljalg, U., Bahram, M., Döring, M., Schigel, D., May, T., Ryberg, M., and Abaren- kov, K. (2018). High-level classification of the Fungi and a tool for evolutionary ecological analyses. Fungal Diversity, 90, 135–159. https://doi.org/10.1007/s13225-018-0401-0 Tisserant, E., Malbreil, M., Kuo, A., Kohler, A., Symeonidi, A., Balestrini, R., Charron, P., Duensing, N., Frei Dit Frey, N., Gianinazzi-Pearson, V., Gilbert, L.B., Handa, Y., Herr, J.R., Hijri, M., Koul, R., Kawaguchi, M., Krajinski, F., Lammers, P.J., Masclaux, F.G., Murat, C., Morin, E., Ndikumana, S., Pagni, M., Petitpierre, D., Requena, N., Rosikiewicz, P., Ri- ley, R., Saito, K., San Clemente, H., Shapiro, H., van Tuinen, D., Bécard, G., Bonfante, P., Paszkowski, U., Shachar-Hill, Y.Y., Tuskan, G.A., Young, P.W., Sanders, I.R., Henrissat, B., Rensing, S.A., Grigoriev, I.V., Corradi, N., Roux, C., and Martin, F. (2013). Genome of an arbuscular mycor- rhizal fungus provides insight into the oldest plant sym- biosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 110, 20117–20122. https://doi. org/10.1073/pnas.1313452110 Tonjer, L.R., Thoen, E., Morgado, L., Botnen, S., Mundra, S., Nybakken, L., Bryn, A., and Kauserud, H. (2021). Fungal community dynamics across a forest-alpine ecotone. Mo- lecular Ecology, 30, 4926–4938. https://doi.org/10.1111/ mec.16095 Vandenkoornhuyse, P., Husband, R., Daniell, T.J., Watson, I.J., Duck, J.M., Fitter, A.H., and Young, Y.P. (2002). Ar- buscular mycorrhizal community composition associated with two plant species in a grassland ecosystem. Molecu- lar Ecology, 11, 1555–1564. https://doi.org/10.1046/j.1365- 294X.2002.01538.x Větrovský, T., Kohout, P., Kopecký, M., Machac, A., Man, M., Bahnmann, B.D., Brabcová, V., Choi, J., Meszárošová, L., Human, Z.R., Lepinay, C., Lladó, S., López-Mondéjar, R., Martinović, T., Mašínová, T., Morais, D., Navrátilová, D., Odriozola, I., Štursová, M., Švec, K., Tláskal, V., Urbanová, M., Wan, J., Žifčáková, L., Howe, A., Ladau, J., Peay, K.G., Storch, D., Wild, J., and Baldrian, P. (2019). A meta-anal- ysis of global fungal distribution reveals climate-driven patterns. Nature Communications, 10, 5142. https://doi. org/10.1038/s41467-019-13164-8 Acta agriculturae Slovenica, 118/3 – 2022 13 Razvoj raziskovalnih metod za karakterizacijo združb arbuskularnih mikoriznih gliv in potencialni vpliv ... na vegetacijo Wurzburger, N., Brookshire, E.N.J., Mccormack, M.L. and Lankau, R. (2017). Mycorrhizal fungi as drivers and modu- lators of terrestrial ecosystem processes. New Phytologist, 213(3), 996–999. https://doi.org/10.1111/nph.14409 Wheeler, D.A., Srinivasan, M., Egholm, M., Shen, Y., Chen, L., McGuire, A., He, W., Chen, Y., Makhijani, V., Roth, G.T., Gomes, X., Tartaro, K., Niazi, F., Turcotte, C.L., Irzyk, G.P., Lupski, J.R., Chinault, Xing-zhi Song, Yue Liu, Ye Yuan, Lynne Nazareth, Xiang Qin, Donna M. Muzny, Marcel Margulies, C., Weinstock, G.M., Gibbs, R.A., and Roth- berg, J.M. (2008). The complete genome of an individual by massively parallel DNA sequencing. Nature, 452, 872–876. https://doi.org/10.1038/nature06884