UNIVERZA V LJUBLJANI VETERINARSKA FAKULTETA NEKATERE VEKTORSKO PRENOSLJIVE ZOONOZE PRI PAŠNEM GOVEDU V SLOVENIJI SELECTED VECTOR BORN ZOONOSES IN GRAZING CATTLE IN SLOVENIA Boštjan Ošlak Ljubljana, 2017 UNIVERZA V LJUBLJANI VETERINARSKA FAKULTETA UDK: 636.2.09:579.62:57.083:616-097(043.2) NEKATERE VEKTORSKO PRENOSLJIVE ZOONOZE PRI PAŠNEM GOVEDU V SLOVENIJI SELECTED VECTOR BORN ZOONOSES IN GRAZING CATTLE IN SLOVENIA Boštjan Ošlak Delo je pripravljeno v skladu s Pravilnikom o podeljevanju Prešernovih nagrad študentom, pod mentorstvom izr. prof. dr. Jožeta Stariča na Kliniki za reprodukcijo in velike živali in somentorstvom znanstvenega sodelavca dr. Igorja Gruntarja na Inštitutu za mikrobiologijo in parazitologijo Veterinarske fakultete Univerze v Ljubljani. Ljubljana, 2017 B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga II POVZETEK V raziskavi smo spremljali prisotnost Anaplasma phagocytophilum, Babesia divergens in Borrelia burgdorferi pri pašnem govedu v Sloveniji. Vsi trije povzročitelji se prenašajo s klopi in se pojavljajo v širokem spektru gostiteljev, tudi pri ljudeh. Okužbe z A. phagocytophilum in B. burgdorferi s.l. potekajo pri govedu asimptomatsko ali nespecifično, zato jih težko diagnosticiramo brez posebnih laboratorijskih testov. B. divergens pogosto povzroča klinično bolezen in jo zato lažje prepoznamo. Skupno smo pregledali kri in serum 291 govedi. Zbrali smo tudi 6 vzorcev goveda s klinično sliko, ki se pojavlja pri okužbah z B. divergens. Zbrane vzorce smo analizirali na hematološke parametre in testirali na prisotnost specifičnih IgG protiteles z indirektno imunofluorescenco. Rezultate smo obdelali z opisno statistiko, z ANOVA testom in s Hi-kvadrat testom. Statistično značilnost smo pripisali rezultatom, pri katerih je bil p < 0,05. Ugotovili smo 158/291 (54,64 %) živali je bilo serološko pozitivnih na A. phagocytophilum, 63/291 (21,65 %) živali je bilo serološko pozitivnih na B. divergens, 137/291 (47,08 %) živali je bilo serološko pozitivnih na B. burgdorferi. 58/291 (19,93 %) živali je bilo hkrati serološko pozitivnih na A. phagocytophilum in B. divergens, 72/291 (24,74 %) živali je bilo hkrati serološko pozitivnih na A. phagocytophilum in B. burgdorferi, ter 25/291 (8,59 %) je bilo serološko pozitivnih na vse tri povzročitelje hkrati. Pri statistični analizi vpliva serološke pozitivnosti na hematološke parametre smo ugotovili značilne vplive na levkocite, eritrocite, hemoglobin, hematokrit, MCHC in trombocite. Ključne besede: govedo; bolezni – epidemiologija; s klopi prenosljive bolezni – epidemiologija; anaplazmoza – diagnostika – kri; babezioza – diagnostika – kri; Lymska bolezen – diagnostika – kri; hematološki testi; serološki testi; fluorescenčno protitelo, tehnika indirektna; seroepidemioloske študije. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga III SUMMARAY The aim of this study was to detect the presence of Anaplasma phagocytophilum, Babesia divergens and Borrelia burgdorfer i in grazing cattle in Slovenia. All three agents are transmitted with ticks and appear in a wide range of hosts, including humans. Infections with A. phagocytophilum and B. burgdorferi s.l. in cattle is asymptomatic or non-specific, so they are difficult to diagnose without special laboratory tests. B. divergens often causes a clinical illness and is therefore easier to recognize. In total we examined the blood and serum of 291 cattle. We also collected 6 samples of cattle with a clinical picture that occurs in B. divergens infections. The collected samples were analyzed for haematological parameters and tested for the presence of specific IgGs with indirect immunofluorescence. The results were treated with descriptive statistics, ANOVA test, and a Hi-square test. The statistical significance was attributed to the results in which p <0.05. 158/291 (54.64 %) of the animals were seropositive to A. phagocytophilum, 63/291 (21.65 %) of the animals were seropositive on B. divergens, 137/291 (47.08 %) of the animals were serologically positive for B. burgdorferi. 58/291 (19.93 %) of the animals were at the same time seropositive to A. phagocytophilum and B. divergens, 72/291 (24.74 %) of the animals were simultaneously seropositive to A. phagocytophilum and B. burgdorferi, and 25/291 (8.59 %) was serologically positive for all three pathogens simultaneously. In the statistical analysis of the effect of serological positivity on hematologic parameters, we found significant effects on leukocytes, erythrocytes, hemoglobin, hematocrit and MCHC. Keywords: Cattle diseases – epidemiology; tick borne diseases – epidemiology; anaplasmosis – diagnostics – blood; babesiosis – diagnostics – blood; Lyme disease – diagnostics – blood; hematological tests; serological tests; fluorescent antibody, technique indirect; seroepidemiologic study B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga IV KAZALO VSEBINE POVZETEK .............................................................................................................................. II SUMMARAY ........................................................................................................................... III KAZALO VSEBINE ................................................................................................................ IV KAZALO TABEL ................................................................................................................. VIII KAZALO SLIK ...................................................................................................................... XII SEZNAM OKRAJŠAV IN SIMBOLOV ............................................................................... XV 1 UVOD ................................................................................................................................. 1 1.1 Opredelitev problema .................................................................................................. 1 1.2 Cilj raziskovanja .......................................................................................................... 1 1.3 Delovne hipoteze ......................................................................................................... 2 2 PREGLED LITERATURE ................................................................................................ 3 2.1 Anaplazmoza ............................................................................................................... 3 2.1.1 Vektorji, taksonomija in nekatere vrste Anaplasma spp. ..................................... 3 2.1.2 Zgodovina Anaplasma phagocytophilum ............................................................. 3 2.1.3 Značilnosti A. phagocytophilum in njeni gostitelji ............................................... 4 2.1.3.1 Patogeneza ..................................................................................................... 5 2.1.3.2 Klinična slika................................................................................................. 5 2.1.3.3 Diagnostika A. phagocytophilum ................................................................. 6 2.1.3.4 Zdravljenje okužb z A. phagocytophilum ...................................................... 6 2.1.3.5 Preventiva ...................................................................................................... 6 2.1.4 Razvojni krog ....................................................................................................... 7 2.1.5 Govedo in Anaplasma spp. ................................................................................... 7 2.1.6 Imunski odziv gostitelja ....................................................................................... 7 2.1.7 Ekotipi A. phagocytophilum ................................................................................. 8 2.1.8 Anaplazmoza kot zoonoza .................................................................................. 10 B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga V 2.1.8.1 Klinična slika pri ljudeh .............................................................................. 10 2.1.8.2 Diagnostika in zdravljenje ........................................................................... 11 2.1.8.3 Humana granulocitna anaplazmoza v Sloveniji .......................................... 11 2.1.8.4 Anaplazmoza pri živalih v Sloveniji ........................................................... 12 2.2 Babezioza ................................................................................................................... 13 2.2.1 Taksonomija, vektorji in gostitelji ...................................................................... 13 2.2.2 Zgodovina ........................................................................................................... 13 2.2.3 Pomembnejše vrste Babesia spp. ....................................................................... 13 2.2.4 Razvojni krog ..................................................................................................... 15 2.2.5 Imunski odziv gostitelja ..................................................................................... 16 2.2.6 Govedo in Babesia spp. ...................................................................................... 18 2.2.6.1 Patogeneza ................................................................................................... 18 2.2.6.2 Klinična slika............................................................................................... 18 2.2.6.3 Postavitev diagnoze ..................................................................................... 18 2.2.7 Ekonomski vpliv Babesia spp. ........................................................................... 19 2.2.8 Babesia divergens ............................................................................................... 20 2.2.9 Zdravljenje Babesia spp. .................................................................................... 20 2.2.10 Preventiva ........................................................................................................... 21 2.2.11 Babesia spp. kot zoonoza ................................................................................... 21 2.2.11.1 Patogeneza ................................................................................................... 23 2.2.11.2 Klinični znaki pri ljudeh .............................................................................. 23 2.2.11.3 Diagnostika in zdravljenje ........................................................................... 23 2.3 Borelioza .................................................................................................................... 25 2.3.1 Zgodovina Lymske borelioze ............................................................................. 25 2.3.2 Skupina Borrelia burgdorferi sensu lato ............................................................ 25 2.3.3 Prenos in gostitelji .............................................................................................. 25 B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga VI 2.3.4 Imunski odziv gostitelja ..................................................................................... 26 2.3.5 Potek bolezni ...................................................................................................... 27 2.3.6 Diagnostika ......................................................................................................... 27 2.3.7 Borrelia burgdorferi pri ljudeh .......................................................................... 28 2.3.8 Borrelia burgdorferi pri ljudeh v Sloveniji ........................................................ 29 2.3.9 Stanje pri živalih v Sloveniji .............................................................................. 30 2.4 Serološka diagnostika s pomočjo imunofluorescenčne tehnike................................. 31 3 MATERIALI IN METODE ............................................................................................. 32 3.1 Materiali ..................................................................................................................... 32 3.1.1 Živali, vključene v raziskavo .............................................................................. 32 3.1.2 Vzorčenje in odvzem vzorcev ............................................................................ 32 3.1.3 Priprava vzorcev v laboratoriju .......................................................................... 33 3.2 Metode analize vzorcev ............................................................................................. 34 3.2.1 Krvni razmazi ..................................................................................................... 34 3.2.2 Serologija ............................................................................................................ 35 3.2.3 Statistična analiza ............................................................................................... 37 4 REZULTATI .................................................................................................................... 38 4.1 Dvojno vzorčenje 28 živali pred in po paši ............................................................... 38 4.2 Klinično pozitivni vzorci na B. divergens.................................................................. 40 4.3 Rezultati seroloških preiskav 291 vzorcev ................................................................ 42 4.4 Rezultati hematologije 291 vzorcev........................................................................... 45 4.5 Geografska lokacija serološko pozitivnih živali ........................................................ 46 4.6 Vpliv serološke pozitivnosti (Babesija, Anaplasma in Borelia) na krvno sliko krav 49 4.6.1 Vpliv na levkocite ............................................................................................... 49 4.6.2 Vpliv na eritrocite ............................................................................................... 51 4.6.3 Vpliv na hemoglobin .......................................................................................... 53 B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga VII 4.6.4 Vpliv na hematokrit ............................................................................................ 54 4.6.5 Vpliv na MCV .................................................................................................... 56 4.6.6 Vpliv na MCH .................................................................................................... 57 4.6.7 Vpliv na MCHC ................................................................................................. 58 4.6.8 Vpliv na trombocite ............................................................................................ 59 5 RAZPRAVA ..................................................................................................................... 62 6 SKLEPI ............................................................................................................................. 65 6.1 Delovne hipoteze ....................................................................................................... 65 6.2 Drugi sklepi ................................................................................................................ 66 7 POVZETEK ..................................................................................................................... 67 8 ZAHVALA ....................................................................................................................... 69 9 LITERATURA ................................................................................................................. 71 10 PRILOGE ......................................................................................................................... 75 B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga VIII KAZALO TABEL Tabela 1: Nekatere vrste Anaplasma spp. in njihovi gostitelji (povzeto po Atif, 2015) Table 1: Some species of Anaplasma spp. and their hosts (summarized by Atifu, 2015) ......... 3 Tabela 2: Klinični znaki pri nekaterih živalskih vrstah (povzeto po Stuen in sod., 2013) Table 2: Clinical signs in some animal species (summarized by Stuen et al., 2013) ................. 5 Tabela 3: Rezultati analiz študije Jahfarija s sodelavci (2014) Table 3: Results of the study of Jahfari and colleagues (2014) .................................................. 8 Tabela 4: Občutljivost metode dokazovanja A. phagocytophilum glede na čas trajanja bolezni pri ljudeh (Bakken in Dumler, 2006) Table 4: Sensitivity of the methods for A. phagocytophilum detection in adicction to the duration of human disease (Bakken and Dumler, 2006) .......................................................... 11 Tabela 5: Prisotnost specifičnih protiteles A. phagocytophilum pri divjih živalih v Sloveniji (Žele s sod., 2012) Table 5: Presence of specific A. phagocytophilum antibodies in wild animals in Slovenia (Žele et al., 2012) ............................................................................................................................... 12 Tabela 6: Nekatere vrste Babesia spp., njihovi gostitelji in geografska razširjenost (Povzeto po Ulienberg, 2006; Bock in sod., 2004) Table 6: Some species of Babesia spp., their hosts and geographical distribution (Summarized by Ulienberg, 2006; Bock et al., 2004) .................................................................................... 14 Tabela 7: Pojavnost dokumentirane babezioze pri ljudeh (povzeto po Gray in sod., 2010) Table 7: Occurrence of documented babesiosis in humans (summarized by Gray et al., 2010) .................................................................................................................................................. 22 Tabela 8: Različne oblike obolenj pri okužbi z Borrelia burgdorferi s.l. v Evropi (Gray in sod., 2002). Table 8: Different forms of disease in Borrelia burgdorferi infection in Europe (Gray et al., 2002). ........................................................................................................................................ 29 B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga IX Tabela 9: Prijavljeni primeri Lymske borelioze v Sloveniji glede na klinično sliko v letih 2011–2015 (Sočan in sod., 2016) Table 9: Reported cases of Lyme borelliosis in Slovenia according to the clinical picture in the years 2011–2015 (Sočan et al., 2016) ................................................................................. 29 Tabela 10: Pojavnost Lymske borelioze v Sloveniji v letih 2014 in 2015 po regijah (Sočan in sod., 2016). Table 10: Appearance of Lyme borreliosis in Slovenia in 2014 and 2015 by region (Sočan et al., 2016). .................................................................................................................................. 30 Tabela 11: Število seropozitivnih oz. negativnih živali pred oz. po pašni sezoni posameznega povzročitelja Table 11: Number of seropositive or Negative animals before or After the grazing season of the individual agent .................................................................................................................. 38 Tabela 12: Število seropozitivnih oz. negativnih živali pred oz. po pašni sezoni za dva oz. vse tri povzročitelje Table 12: Number of seropositive or Negative animals before or After the grazing season for two or All three agents.............................................................................................................. 39 Tabela 13: Diferencialna bela krvna slika klinično bolnih živali s sumom na B. divergens Table 13: Differential white blood count of clinically ill animals with a suspicion of B. divergens ................................................................................................................................... 41 Tabela 14: Referenčne vrednosti parametrov bele krvne slike pri govedu Laboratorija za klinično patologijo (KRVŽ) Veterinarske fakultete Table 14: Reference values of white blood cell parameters in cattle Laboratory for clinical pathology Veterinary faculty .................................................................................................... 42 Tabela 15: Število živali, ki so bile serološko pozitivne na različne povzročitelje Table 15: Number of animals serologically positive for different pathogens .......................... 44 B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga X Tabela 16: Referenčne vrednoti hematoloških parametrov Laboratorija za klinično patologijo(KRVŽ) Veterinarske fakultete Table 16: Reference values of hematological parameters Laboratory for Clinical Pathology Veterinary faculty ..................................................................................................................... 46 Tabela 17: Opisna statistika števila levkocitov pri serološko pozitivnih in negativnih živalih Table 17: Descriptive statistics on the number of leukocytes in serologically positive and negative animals ....................................................................................................................... 50 Tabela 18: Statistično značilne razlike števila levkocitov Table 18: Statistically significant differences in the number of leukocytes ............................. 50 Tabela 19: Opisna statistika števila eritrocitov pri serološko pozitivnih in negativnih živalih Table 19: Descriptive statistics on the number of erythrocytes in seropositive and negative animals ...................................................................................................................................... 52 Tabela 20: Statistično značilne razlike števila eritrocitov Table 20: Statistically significant differences in the number of erythrocytes .......................... 52 Tabela 21: Opisna statistika hemoglobina pri serološko pozitivnih in negativnih živalih Table 21: Descriptive statistics of hemoglobin in serologically positive and negative animals .................................................................................................................................................. 53 Tabela 22: Statistično značilne razlike koncentracije hemoglobina Table 22: Statistically significant differences in hemoglobin concentration ........................... 54 Tabela 23: Opisna statistika hematokrita pri serološko pozitivnih in negativnih živalih Table 23: Descriptive statistics of hematocrit in serologically positive and negative animals 55 Tabela 24: Statistično značilne razlike hematokrita Table 24: Statistically significant differences in hematocrit .................................................... 55 Tabela 25: Opisna statistika MCV pri serološko pozitivnih in negativnih živalih Table 25: Descriptive MCV statistics for serologically positive and negative animals ........... 56 B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga XI Tabela 26: Opisna statistika števila MCH pri serološko pozitivnih in negativnih živalih Table 26: Descriptive statistics on the number of MCH in serologically positive and negative animals ...................................................................................................................................... 57 Tabela 27: Opisna statistika MCHC pri serološko pozitivnih in negativnih živalih Table 27: Descriptive MCHC statistics for serologically positive and negative animals ........ 58 Tabela 28: Statistično značilne razlike števila MCHC Table 28: Statistically significant differences in the number of MCHCs................................. 59 Tabela 29: Opisna statistika števila trombocitov pri serološko pozitivnih in negativnih živalih Table 29: Descriptive statistics on the number of platelets in seropositive and seronegative animals ...................................................................................................................................... 60 Tabela 30: Statistično značilne razlike števila trombocitov Table 30: Statistically significant differences in the number of platelets ................................. 60 Tabela 31: Rezultati vseh preiskav opravljenih pri govedu uporabljenih v Prešernovi nalogi (zeleno obarvane vrstice so klinično bolne živali) Table 31: Results of all investigations carried out in cattle used in Prešeren's task (green colored rows are clinically related animals) ............................................................................. 75 B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga XII KAZALO SLIK Slika 1: Anaplasma phagocytophilum (Morula) v nevtrofilcu (Slika A) in limfocitu (Slika B) pobarvanem po Giemsi, povečava 10 x 100 (Henniger in sod., 2013) Figure 1: Anaplasma phagocytophilum (Morulae) in neutrophil (Figure A) and lymphocytes (Fig. B) painted by Giemsa, magnification 10 x 100 (Henniger et al., 2013) ............................ 4 Slika 2: Filogenetsko drevo A. phagocytophilum (Jahfari in sod., 2014) Figure 2: Phylogenetic tree of A. phagocytophilum (Jahfari et al., 2014) .................................. 9 Slika 3: Nahajališča posameznih ekotipov A. phagocytophilum (Jahfari in sod., 2014) Figure 3: Locations of individual ecotypes of A. phagocytophilum (Jahfari et al., 2014) ....... 10 Slika 4: Razvojni krog B. bigemina pri govedu in vektorju klopu, vrste Boophilus microplus (Bock in sod., 2004) Figure 4: B. bigemine development cycle in cattle and bone vector, Boophilus microplus species (Bock et al., 2004) ........................................................................................................ 16 Slika 5: Shema imunskega odziva gostitelja (Homer in sod., 2000) Figure 5: A host immune response scheme (Homer et al., 2000) ............................................ 17 Slika 6: Lokacije, kjer so bili pobrani vzorci (vir: https://www.google.si/maps) Figure 6: Sampling locations (source: https://www.google.com/maps) .................................. 32 Slika 7: Vzorci seruma pred zamrznitvijo (Foto: Ošlak) Figure 7: Serum samples befor freezing (Photo: Ošlak) .......................................................... 33 Slika 8: Hematološki števec scil Vet abc Plus+ (Horiba, Nemčija) (Foto: Ošlak) Figure 8: Hematology counter Vet abc Plus + (Horiba, Germany) (Photo: Ošlak) ................. 34 Slika 9: Uporabljena stekelca za ugotavljanje protiteles proti A. phagocytophilum (A), B. divergens (B) in B. burgdorferi (C) (Foto: Ošlak) Figure 9: Antibody detection slides for A. phagocytophilum (A), B. divergens (B) in B. burgdorferi (C) (Foto: Ošlak) ................................................................................................... 35 Slika 10: Priprava redčitev seruma (Foto: Ošlak) Figure 10: Preparation of serum dilutions (Photo: Ošlak) ........................................................ 36 B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga XIII Slika 11: Stekelca pripravljena za inkubacijo (Foto: Ošlak) Figure 11: Slides ready for incubation (Photo: Ošlak) ............................................................. 36 Slika 12: Spiranje stekelc s PBS (Foto: Ošlak) Figure 12: Washing of slides with PBS (Photo: Ošlak) ........................................................... 37 Slika 13: Shematski prikaz števila serološko pozitivnih živali glede na število različnih povzročiteljev po pašni sezoni (dvakratno vzorčenje 28 živali: pred in po pašni sezoni) Figure 13: Schematic representation of the number of serologically positive animals, according to the number of different pathogens after the grazing season (28 animals were sempled before and after the grazing season) ........................................................................... 40 Slika 14: Lokacije gospodarstev s klinično pozitivnimi živalmi na babeziozo (vir: https://www.google.si/maps) Figure 14: Locations of clinically positive animals for babesiosis (source: https://www.google.com/maps) ................................................................................................ 40 Slika 15: B. divergens (puščice) v eritrocitih (Foto: Ošlak) Figure 15: B. divergens (arrows) in erythrocytes (Photo: Ošlak) ............................................ 41 Slika 16: Shematski prikaz števila serološko pozitivnih živali Figure 16: Schematic representation of the number of serologically positive animals ............ 43 Slika 17: Odstotek serološko pozitivnih živali na izključno enega oz. dva oz. vse tri povzročitelje Figure 17: The percentage of animals serologically positive exclusively on one or two or all three pathogens ......................................................................................................................... 45 Slika 18: Lokacije gospodarstev s serološko pozitivnim govedom na A. phagocytophilum (vir: https://www.google.si/maps) Figure 18: Locations of seropositive cattle on A. phagocytophilum (source: https://www.google.com/maps) ................................................................................................ 47 B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga XIV Slika 19: Lokacije gospodarstev s serološko pozitivnim govedom na B. divergens (vir: https://www.google.si/maps) Figure 19: Locations of serologically positive cattle on B. divergens (source: https://www.google.com/maps) ................................................................................................ 48 Slika 20: Lokacije gospodarstev s serološko pozitivnim govedom na B. burgdorferi (vir: https://www.google.si/maps) Figure 20: Locations of holdings with serologically positive cattle on B. burgdorferi (source: https://www.google.com/maps) ................................................................................................ 49 Slika 21: Grafični prikaz števila levkocitov Figure 21: A graphical representation of leukocytes count ...................................................... 51 Slika 22: Grafični prikaz števila eritrocitov Figure 22: A graphical representation of erythrocytes count ................................................... 53 Slika 23: Grafični prikaz vrednosti hemoglobina Figure 23: Graphical presentation of hemoglobin values ......................................................... 54 Slika 24: Grafični prikaz vrednosti hematokrita Figure 24: Graphical presentation of hematocrit values ........................................................... 56 Slika 25: Grafični prikaz vrednosti MCV Figure 25: Graphical display of MCV values ........................................................................... 57 Slika 26: Grafični prikaz vrednosti MCH Figure 26: Graphical display of the MCH values ..................................................................... 58 Slika 27: Grafični prikaz vrednosti MCHC Figure 27: Graphical representation of MCHC values ............................................................. 59 Slika 28: Grafični prikaz števila trombocitov Table 28: A graphical representation of platelet count............................................................. 61 B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga XV SEZNAM OKRAJŠAV IN SIMBOLOV DNK – deoksiribonukleinska kislina EDTA – etilendiamintetraocetna kislina ELISA – encimska imunoadsorpcijska preiskava groEl – bakterijski protein HGA – humana granulocitna anaplazmoza HGE – humana garnulocitna erlihioza IFAT – indirektna imunofluresca IFN- γ – interferon gama IgG – protitelesa tipa G IL-6 – interlevkin 6 IL-8 – interlevkin 8 kg – kilogram MyD88 – primarni diferenciacijski mieloini odzivni protein mg – miligram NF-kB – jedrni faktor kapa B NIJZ – Nacionalni inštitut za javno zdravje NO – dušikov oksid OspA – opsonin A OspB – opsonin B PAMPs-s – patogeni povezani molekularni vzorec PBS – raztopina fosfatnega pufra PCR – verižna reakcija s polimerazo PRRs – prepoznavni receptor prirojenega imunskega sistema ROS – reaktivne kisikove vrste rRNA – ribosomalna ribonukleinska kislina Scid – severe combined immunodeficiency qPCR – kvantitativna verižna reakcija s polimerazo TBF – klopna vročica ˝Tick-borne fever ˝ TNF - tumor nekrotizirajoči faktor TNF-α – tumor nekrotizirajoči faktor alfa TLRs – bakterijski membranski protein B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga XVI TRL2 – vrsta receptorja imunskega sistema B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 1 1 UVOD Anaplazmoza ( Anaplasma phagocytophilum), babezioza ( Babesia divergens) in Lymska borelioza ( Borrelia burgdorferi s.l. ) so vektorsko prenosljive bolezni goveda, ki se v Evropi prenašajo s klopi vrste Ixodes ricinus. Vse tri okužbe se pojavljajo pri širokem spektru gostiteljev. Vse so zoonoze, ki se lahko prenašajo z goveda na ljudi preko klopov. Kljub temu, da Slovenija predstavlja področje, kjer je Lymska borelioza endemična, kjer je bila granulocitna anaplazmoza pri ljudeh prvič opisana v Evropi in kjer je razširjenost klopov iz roda Ixodes vsesplošna, pa je raziskav o klopno prenosljivih boleznih pri živalih izredno malo. Potek okužb goveda z Anaplasma phagocytophilum in Borrelia burgdorferi s.l. je nespecifičen in jih zato težko diagnosticiramo brez posebnih laboratorijskih testov. Klinične primere babezioze ugotavljamo vsako leto. Okužbe z omenjenimi mikroorganizmi imajo lahko vpliv na dobro počutje in produktivnost goveda, babezioza goveda pa je življenjsko nevarna (Stuen, 2007; Stuen, 2013; Homer in sod., 2000; Borko,1999) 1.1 Opredelitev problema Kljub temu, da Slovenija predstavlja področje, kjer je razširjenost klopov iz roda Ixodes vsesplošna, kjer je Lymska borelioza pri ljudeh endemična in kjer je bila granulocitna anaplazmoza pri ljudeh opisana prvič v Evropi, pa je raziskav o klopno prenosljivih boleznih pri živalih relativno malo. Do sedaj je bilo objavljenih zelo malo študij, ki so preučevale bolezni, ki se prenašajo s klopi pri živalih v Sloveniji. A. phagocytophilum je bila potrjena pri psih (Ravnik, 2012). Klinična poročila o babeziozi ( B. divergens) pri govedu obstajajo na Veterinarski fakulteti. Okužba z B. burgdorferi s. l. je bila serološko potrjena pri psih, konjih in divjadi. V eni študiji so bile spirohete Lymske borelioze potrjene tudi pri govedu (Borko, 1999; Sočan in sod., 2016) 1.2 Cilj raziskovanja Namen raziskave je bil dokazati prisotnost Anaplasma phagocytophilum, Babesia divergens in Borrelia burgdorferi pri pašnem govedu v Sloveniji in določiti okvirna področja, kjer se ti povzročitelji pojavljajo, pri serološko pozitivnem govedu pa ugotoviti, če serološka pozitivnost na omenjene povzročitelje vpliva na krvne parametre goveda. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 2 1.3 Delovne hipoteze 1. Anaplasma phagocytophilum je prisotna pri govedu v Sloveniji. 2. Babesia divergens je prisotna pri govedu v Sloveniji. 3. Borrelia burgdorferi s.l. je prisotna pri govedu v Sloveniji. 4. Pojavnost povzročiteljev je enakomerna po celotni Sloveniji. 5. Serološka pozitivnost goveda na Anaplasma phagocytophilum ali Babesia divergens ali Borrelia burgdorferi s.l. vpliva na hematološke vrednosti. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 3 2 PREGLED LITERATURE 2.1 Anaplazmoza 2.1.1 Vektorji, taksonomija in nekatere vrste Anaplasma spp. Anaplazmoza je obolenje, ki ga povzročajo bakterije iz rodu Anaplasma spp. Med sesalci se prenaša s pomočjo krvosesih vektorjev, predvsem klopov, ki spadajo v rod Ixodes. V Evropi je najpogostejši vektor A. phagocytophilum Ixodes ricinus (Atif, 2015). Povzročajo subklinična in klinična obolenja, ki se lahko končajo tudi s poginom. Najdemo jih pri živalih in ljudeh (Stuen, 2007; Stuen, 2013). Anaplasma spada v rod Anaplasma, družino Anaplasmataceae, red Rickettsiales, razred Alphaproteobacteria, deblo Proteobactria in kraljestvo Bacteria. V Tabeli 1 so prikazane nekatere vrste Anaplasma spp. ter vrste živali, pri katerih povzročajo obolenje (Atif, 2015). Tabela 1: Nekatere vrste Anaplasma spp. in njihovi gostitelji (povzeto po Atif, 2015) Table 1: Some species of Anaplasma spp. and their hosts (summarized by Atifu, 2015) Anaplasma Gostitelj A. marginale Govedo A. centrale Govedo A. bovis Govedo A. ovis Ovce, koze A. platys Psi Aegyptianella pullorum Ptice A. phagocytophilum Številne živalske vrste: prežvekovalci, mali sesalci, konji, ptice in ljudje 2.1.2 Zgodovina Anaplasma phagocytophilum Prvi zapisi o tako imenovani ˝Tick-borne fever˝ (TBF), ki jo povzroča Anaplasma phagocytophilum, segajo v leto 1932 (Woldehiwet, 2010). Pri študijah vrtoglavosti ovac je nekaj ovac, ki so se pasle na travnikih, kjer so bili prisotni klopi, imelo povišano telesno temperaturo iz neznanega razloga. Povišana telesna temperatura se je pojavila tudi pri ovcah, ki so prejele transfuzijo kri živali, ki so imele povišano telesno temperaturo. Zaradi pojava povišane telesne temperature so bolezen poimenovali ˝klopna vročica˝ (Tick-borne fever (TBF)) (Stuen, 2013). B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 4 Podobno obolenje je bilo opisano v Ameriki leta 1969 pri konju in leta 1971 ter leta 1982 pri psih. Do odkritja humane granulocitne anaplazmoze v ZDA leta 1994 so domnevali, da je anaplazmoza bakterijsko obolenje, ki prizadene samo določene domače in divje živali (Woldehiwet, 2010). 2.1.3 Značilnosti A. phagocytophilum in njeni gostitelji A. phagocytophilum je alfa pleomorfna gram negativna bakterija velikosti 0,4–2 μm. Je intracelularna bakterija, ki se po barvanju Romanowsky obarva škrlatno v barvi murve. Te obarvane strukture v celici so mikrokolonije, ki jih imenujemo morule. Morule imajo premer od 1,5–6 μm. Slika 1: Anaplasma phagocytophilum (Morula) v nevtrofilcu (Slika A) in limfocitu (Slika B) pobarvanem po Giemsi, povečava 10 x 100 (Henniger in sod., 2013) Figure 1: Anaplasma phagocytophilum (Morulae) in neutrophil (Figure A) and lymphocytes (Fig. B) painted by Giemsa, magnification 10 x 100 (Henniger et al., 2013) Različni serotipi se pojavljajo kot povzročitelji kliničnih in subkliničnih obolenj pri različnih živalskih vrstah. Glavni gostitelji so govedo in ovce, najdemo jo tudi pri kozah, konjih, oslih, psih, mačkah in divjih prežvekovalcih. Ugotovljena je bila tudi pri malih sesalcih. Obolenja se pojavljajo v Evropi, Severni in Južni Ameriki, Aziji in Afriki. Bolezen je endemična in potencialno endemična v 48 državah sveta (Atif, 2015). B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 5 2.1.3.1 Patogeneza Sama patogeneza A. phagocytophilum v začetni fazi okužbe še ni čisto pojasnjena. Eno izmed glavnih vprašanj, ki se postavlja, je, kje se bakterija množi v času vstopa v dermis in do takrat, ko nastopi bakteriemija, saj jo do razvoja bakteriemije ni možno zaznati. Tudi pri poskusu, kjer so živalim vbrizgali okuženo kri, bakteriemije ni bilo mogoče zaznati 72–96 ur. Zato prevladuje mnenje, da število bakterij ostaja zelo majhno, pod ravnjo detekcije, in da se mora bakterija množiti v drugih celicah do razvoja bakteriemije. Obstajajo različne domneve, po katerih bi se lahko bakterije množile v pljučih, vranici in kostnem mozgu. Prav tako so dokazali, da naj bi v in vitro pogojih mikrovaskularne endotelne celice spodbujale rast A. phagocytophilum, ki povzroča humano granulocitno anaplazmozo (HGA), vendar pa ostaja odprto vprašanje, če celice v in vivo pogojih prav tako pripomorejo k rasti (Woldehiwet, 2010). V času bakteriemije najdemo A. phagocytophilum predvsem v eozinofilcih, bazofilcih in monocitih. V času najvišje stopnje bakteriemije je lahko okuženih tudi do 90 % granulocitov (Woldehiwet, 2010). 2.1.3.2 Klinična slika Pri živalih, okuženih z A. phagocytophilum, zasledimo več različnih kliničnih znakov. Pri vseh sesalcih, ki razvijejo klinično obliko bolezni, zaznamo nenadno povišanje telesne temperature (> 41 °C). Posamezni klinični znaki pri nekaterih živalih so zbrani v Tabeli 2. Pri prežvekovalcih je pojav bolezni bolj značilen za mlade živali in za živali, ki se prvič pasejo na pašnikih, kjer so klopi, okuženi z A. phagocytophilum (Stuen in sod., 2013). Tabela 2: Klinični znaki pri nekaterih živalskih vrstah (povzeto po Stuen in sod., 2013) Table 2: Clinical signs in some animal species (summarized by Stuen et al., 2013) Živalska vrsta Klinični znaki Domači prežvekovalci Anoreksija, otopelost, nenadno znižanje prireje mleka, abortusi pri ovcah, zmanjšana plodnost ovnov, zmanjšan prirast. Konji Anoreksija, depresija, apatija, distalni edem, odpor do premikanja, petehialne krvavitve. Psi Depresija, šepanje, anoreksija. Mačke Anoreksija, letargija, konjuktivitis, bolečine v mišicah, šepanje, bolečine v sklepih, nekoordinirano gibanje. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 6 2.1.3.3 Diagnostika A. phagocytophilum Za dokazovanje A. phagocytophilum se lahko uporablja več metod. Lahko jo diagnosticiramo z mikroskopiranjem, s pomočjo PCR (verižna reakcija s polimerazo) ali s serološkimi testi. S svetlobnim mikroskopom lahko na krvnem razmazu, pobarvanem po May-Grünwald Giemsi, v granulocitih in monocitih vidimo modrikaste inkluzije, morule. Prav tako se lahko diagnozo postavi s pomočjo elektronske mikroskopije in z imunohistokemičnim barvanjem tkiv. Možno je uporabiti tri tehnike PCR, in sicer konvencionalno, nested in real time. Analize se opravijo na osnovi 16S rRNA, groEl in p44 genov (Stuen in sod., 2013). V primeru, da je organizem že tvoril protitelesa, lahko diagnozo postavimo s pomočjo seroloških preiskav. Za dokazovanje protiteles se lahko uporabljajo reakcija vezave komplementa, indirektni imunofluorescenčni test (IFAT) in ELISA test (Stuen in sod., 2013) . 2.1.3.4 Zdravljenje okužb z A. phagocytophilum V večini primerov se za zdravljenje okužb z A. phagocytophilum uporabljajo antibiotiki iz skupine tetraciklinov. Najpogosteje se uporabljata oksitetraciklin in doksiciklin. Izbira antibiotika za zdravljenje omenjene bakterije temelji na empiričnih študijah in nekaj poskusih pri ovcah in kozah. Študije, v katerih so prežvekovalce zdravili zaradi TBF, so pokazale, da je bakterija odporna na penicilin, kloramfenikol, streptomicin in ampicilin (Woldehiwet, 2010). 2.1.3.5 Preventiva Eden od glavnih načinov zaščite živali pred okužbami z A. phagocytophilum je zaščita proti samim vektorjem, klopom. Za zaščito se uporabljajo sintetični piretroidi, ki se nanesejo na živali kot različni polivi oz. se živali z njim poškropi. Nanosi se ponavljajo po navodilih proizvajalca v času sezone klopov (Woldehiwet, 2010). Eden od načinov zaščite je tudi dajanje antibiotikov v profilaktične namene. V Veliki Britaniji so živalim, ki so odšle na pašo, kjer so bili klopi, okuženi z A. phagocytophilum, profilaktično aplicirali dolgo delujoč tetraciklin. Vendar pa je takšen način zaščite vprašljiv z vidika zdravja ljudi, visokih stroškov, predvsem pa zaradi nevarnosti razvoja rezistence (Woldehiwet, 2010). Cepiva proti A. phagocytophilum še niso na voljo. Izdelava vakcine bo uspešna šele, ko bodo odkrite vse komponente bakterije, ki so potrebne za razvoj zaščitne imunosti živali (Woldehiwet, 2010) . B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 7 2.1.4 Razvojni krog Razvoji krog Anaplasme phagocytophilum se prične s parazitiranjem klopa na okuženem sesalcu. A. phagocytophilum se pri klopu prenaša transovarialno na naslednjo generacijo in se ob parazitiranju prenese na novega sesalca (Atif, 2015). 2.1.5 Govedo in Anaplasma spp. Večina izbruhov tako imenovane ˝Tick-borne fever˝ je posledica okužbe z Anaplasma marginale. Govedo okuženo z A. phagocytophilum, A. bovis in A. centrale po navadi ne kaže kliničnih znakov, vendar lahko določen odstotek živali zboli in kaže podobne klinične znake kot pri okužbi z Anaplasmo marginale (OIE, 2015) . Bolezen se kaže predvsem z anemijo in zlatenico, ki se pojavita v pozni fazi obolenja. Pri A. phagocytophilum ne pride do pojava hemoglobinurije, kar nam služi kot pomemben znak za diferencialno diagnozo. Namreč za razliko od anaplazmoze se pri babeziozi pojavi hemoglobinurija (OIE, 2015). 2.1.6 Imunski odziv gostitelja Različne študije imunosti na A. phagocytophilum so pokazale, da gostitelj po prvi okužbi pridobi določeno stopnjo imunosti, ki pa je zelo raznolika. Nekatere živali so bile imune le nekaj mesecev, druge tudi več kot leto dni. Odpornost se je razlikovala predvsem zaradi dejavnikov, kot so sev anaplazme, starost in vrsta živali ter čas, ki je pretekel od primarne infekcije do ponovne okužbe (Woldehiwet, 2006). Zanimivo je tudi to, da se je po umaknitvi živali s pašnikov, kjer so bili okuženi klopi, po nekaj mesecih pri nekaterih živali ponovno pojavilo obolenje (Woldehiwet, 2010). Vloga protiteles in celične imunosti še ni točno pojasnjena, vendar pa po dosedanjih študijah sklepajo, da sta oba obrambna sistema pomembna. Ena izmed študij je pokazala, da naj bi bil titer protiteles v periferni krvi povezan z odsotnostjo bakteriemije (Woldehiwet, 1982). Druga študija pa je pokazala, da je prišlo do proliferacije limfocitov ob aplikaciji okuženih granulocitov (Gokce in Woldehiwet, 1999). Težavo dobre imunosti predstavlja predvsem raznolikost antigenov A. phagocytophilum. Imunost, pridobljena proti določenemu tipu A. phagocytophilum, ne zaščiti gostitelja proti drugemu sevu A. phagocytophilum, kar je pokazala ena izmed študij z evropskimi izolati A. phagocytophilum pri ovcah in kravah (Woldehiwet, 2006). B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 8 2.1.7 Ekotipi A. phagocytophilum Jahfari in sodelavci (2014) so opravili študijo prisotnosti A. phagocytophilum pri klopih na Nizozemskem in v Belgiji. Zbrali so 3493 nimf in odraslih klopov vrste I. ricinus na različnih geografskih področjih in jih s pomočjo metode PCR testirali na prisotnost A. phagocytophilum. 90 od 3493 testiranih klopov je bilo pozitivnih na A. phagocytophilum. Prav tako je zanimivo, da so A. phagocytophilum našli na 13 območjih. Skupno so bili vzorci pobrani na 17 različnih področjih. Testirali so tudi različna tkiva živali in jih prav tako analizirali z metodo PCR. V spodnji tabeli so prikazane posamezne živalske vrste, število testiranih in število pozitivnih vzorcev. Tabela 3: Rezultati analiz študije Jahfarija s sodelavci (2014) Table 3: Results of the study of Jahfari and colleagues (2014) Živalska vrsta Število vzorcev Število pozitivih vzorcev na A. phagocytophilum Apodemus flavicollis 2 0 Apodemus sylvaticus 23 1 Crocidura russula 5 0 Microtus arvalis 8 0 Myodes glareolus 35 0 Sorex araneus 6 0 Carduelis chloris 4 0 Coccothraustes coccothraustes 2 0 Fringilla coelebs 3 0 Parus major 4 0 Phylloscopus trochilus 1 0 Pyrrhula pyrrhula 1 0 Turdus iliacus 5 0 Turdus merula 11 1 Turdus philomelos 6 0 Capreolus capreolus 38 26 Equus ferus caballus 14 14 Vulpes vulpes 81 8 Meles meles 40 0 Skupaj 289 50 B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 9 Vsem vzorcem, ki so bili qPCR pozitivni, so dodali fragment groEL in ga pomnožili ter sekvencionirali. Dodali so še groEL sekvence iz genske banke primerov obolenj v Evropi. Vse podatke so statistično obdelali in določili ekotipe A. phagocytophilum in njihove glavne gostitelje ter možnost prenosa na ljudi. Filogenetsko drevo zbranih podatkov je prikazano na Sliki 2. Posamezen krog prikazuje en haplotip, v krogih, ki so pobarvani z različnimi barvami, se je isti haplotip pojavil pri različnih živalskih vrstah. Pobarvani so sorazmerno s pojavnostjo pri določeni živali. Modre pike predstavljajo manjkajoče haplotipe, modri vogali pa predstavljajo mutacije (Jahfari in sod., 2014). Slika 2: Filogenetsko drevo A. phagocytophilum (Jahfari in sod., 2014) Figure 2: Phylogenetic tree of A. phagocytophilum (Jahfari et al., 2014) Na osnovi pridobljenih podatkov so raziskovalci poskušali ugotoviti, ali lahko povežejo raznolikost v ekotipih z geografskim področjem. Ugotovili so, da so vsi ekotipi razpršeni po celi Evropi in da povezave med raznolikostjo ekotipa in geografskim področjem ni. Na Sliki 3 je vidna geografska razpršenost ekotipov v Evropi. Države, v katerih je bil izoliran en (ali več) ekotip, so obarvane sivo. Države, v katerih ni bilo izoliranih ekotipov, so obarvane belo (Jahfari in sod., 2014). B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 10 Slika 3: Nahajališča posameznih ekotipov A. phagocytophilum (Jahfari in sod., 2014) Figure 3: Locations of individual ecotypes of A. phagocytophilum (Jahfari et al., 2014) 2.1.8 Anaplazmoza kot zoonoza Prva okužba človeka z A. phagocytophilum v Evropi je bila opisana v Sloveniji leta 1997 (Rojko in sod., 2006). Sprva je bila bolezen poimenovana humana granulocitna erlihioza (HGE), ki se je kasneje preimenovala v humano granulocitno anaplazmozo (Bakken in Dumler, 2006). 2.1.8.1 Klinična slika pri ljudeh Obolenje lahko poteka čisto asimptomatsko, lahko pa pride do hujših kliničnih znakov in smrti pacientov. Večina pacientov s klinično sliko je bila v stiku s klopom 7–14 dni pred pričetkom kliničnih znakov. Najpogostejši klinični znaki so nespecifični, in sicer povišana telesna temperatura, glavoboli, bolečine v mišicah in mrzlica. Redkeje se lahko pojavijo tudi anoreksija, slabost, kašelj, bolečine v trebuhu, zmedenost in izpuščaji (Bakken in Dumler, 2006). B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 11 2.1.8.2 Diagnostika in zdravljenje Diagnozo se pri ljudeh postavi z istimi metodami kot pri živalih. Prav tako se za zdravljenje ljudi, obolelih za HGA, uporabljajo antibiotiki iz skupine tetraciklinov. Tabela 4 prikazuje učinkovitost posameznega diagnostičnega testa glede na čas obolenja (Bakken in Dumler, 2006). Tabela 4: Občutljivost metode dokazovanja A. phagocytophilum glede na čas trajanja bolezni pri ljudeh (Bakken in Dumler, 2006) Table 4: Sensitivity of the methods for A. phagocytophilum detection in adicction to the duration of human disease (Bakken and Dumler, 2006) Trajanje bolezni Krvni razmaz Hl-60 celične PCR Serološki testi (IFA) kulture 0 – 7 Srednja Srednja Visoka Nizka 8 – 14 Nizka Nizka Nizka Srednja 15 – 30 / / Nizka Visoka 31 – 60 / / / Visoka > 60 / / / Visoka 2.1.8.3 Humana granulocitna anaplazmoza v Sloveniji Lotrić-Furlan je s sodelavci leta 2006 objavila poročilo o humani granulocitni anaplazmozi v Sloveniji med letoma 1996 in 2004. V tem obdobju je bila A. phagocytophilum dokazana pri 24 odraslih ljudeh. Vseh 30 pacientov je pokazalo vročinsko stanje nekje po 30 dneh, odkar so bili v stiku s klopom. Diagnoza je bila postavljena na osnovi serokonverzije pri 18 (75 %), 6 pacientov je imelo vsaj štirikratno povišanje titra protiteles, pri 15 pa so postavili diagnozo s pomočjo molekularne detekcije. Klinična slika in laboratorijski izvidi so bili podobni kot pri pacientih v drugih evropskih državah. Vsi bolniki so imeli povišano telesno temperaturo in glavobole. Levkopenija je bila prisotna pri 16 pacientih, trombocitopenija pri 20 pacientih, nenormalni testi delovanja jeter pri 23 bolnikih, pospešena sedimentacija eritrocitov pri 18 in povišana koncentracija C- reaktivnega proteina pri 23 bolnikih. Zanimiv je tudi podatek, da je bilo po enem letu od prihoda v bolnico serološko pozitivnih 16/24 bolnikov in po dveh letih 10/18 bolnikov. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 12 2.1.8.4 Anaplazmoza pri živalih v Sloveniji Petrovec in sod. so leta 2002 spremljali prisotnost A. phagocytophilum pri srnjadi (56 vzorcev) in jelenjadi (32 vzorcev). Detekcijo protiteles so izvedli s pomočjo indirektne imunofluorescence. Za detekcijo DNA so živalim odvzeli del tkiva vranice. Skupno je bilo 74 % živali serološko pozitivnih in 86 % PCR pozitivnih. Tako jelenjad kot srnjad sta imeli PCR pozitivnost okoli 86 %, vendar pa je bilo bistveno več serološko pozitivne srnjadi (94 % srnjadi in 35 % jelenjadi). Leta 2012 je Ravnik v doktorski disertaciji opisala pojavnost A. phagocytophilum pri psih. V raziskavo je bilo vključenih 754 psov, pri 553 je bila dokazana prisotnost specifičnih protiteles proti A. phagocytophilum. Kot navaja Ravnik, so dokazali 73,8-odstotno pogostost okužbe A. phagocytophilum pri psih in 5,3 % živali je bilo PCR pozitivnih. Prav tako je Žele s sod. (2012) preiskovala prisotnost A. phagocytophilum pri divjih živalih v Sloveniji. Med letoma 2008 in 2010 so zbrali 376 vzorcev seruma različnih divjih živali (vzorce 30 jelenov, 90 srn, 9 gamsov in 224 divjih prašičev). Zbrali so tudi 160 vzorcev vranice divjih prašičev. Med letoma 2004 in 2010 so zbrali tudi 23 vzorcev seruma rjavega medveda. Vse živali so bile odstreljene v sklopu letnega odstrela divjih živali po celotni Sloveniji. Rezultati raziskave so prikazani v Tabeli 5. Tabela 5: Prisotnost specifičnih protiteles A. phagocytophilum pri divjih živalih v Sloveniji (Žele s sod., 2012) Table 5: Presence of specific A. phagocytophilum antibodies in wild animals in Slovenia (Žele et al., 2012) Vrsta živali Navadni jelen Srna Gams Rjavi medved Divji prašič ( Cervus ( Capreolus ( Rupicapra ( Ursus arctos) ( Sus scrofa) elaphus) capreolus) rupicapra) Število serološko pozitivnih/število 18/30 76/90 7/9 15/23 156/224 negativnih (%) (60,0 %) (84,4 %) (77,8 %) (65,2 %) (69,6 %) Skupaj serološko 272 (72,3 %) pozitivnih Skupno 376 pregledanih B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 13 2.2 Babezioza 2.2.1 Taksonomija, vektorji in gostitelji Babezioza je klopno prenosljiva bolezen, ki se pojavlja pri domačih in divjih živalih ter ljudeh (Bock in sod., 2004). Povzroča jo zajedavec iz debla Apicomplexa in rodu Babesia. V razvojnem krogu Babesia spp. sta dva gostitelja, in sicer vretenčar (sesalci) in nevretenčar (družina Ixodidae). Klopi iz družine Ixodidae parazitirajo tudi na ljudeh, kar lahko privede do okužbe ljudi z babeziozo. Pri ljudeh povzročata babeziozo dve vrsti Babesia spp., in sicer Babesia microti (Severna Amerika) in Babesia divergens (Evropa) (Homer in sod., 2000). 2.2.2 Zgodovina Viktor Babes je leta 1888 v Romuniji odkril mikroorganizem v eritrocitih goveda in ovac ter ga povezal s pojavom hemoglobinurije in vročine. Bolezen je poimenoval vročica rdeče vode ˝red water fever˝. V letu 1893 sta Smith in Kilborne dokazala, da se Babesia spp. prenaša s klopi, in jo poimenovala Pyrosoma bigeminum. To je bil prvi opis prenosa bolezni s členonožci. V istem letu je Starcovici rod Pyrosoma preimenoval v Babesia. A kljub temu se je ime ˝piropalsma˝ obdržalo še do danes, saj pogosto babeziozo in theileriozo skupaj označujejo kot piroplazmoze (Ulienberg, 2006). 2.2.3 Pomembnejše vrste Babesia spp. Rod Babesia sodi v deblo Apicomplexa, razred Sporozoasida, red Eucoccidiorida, podred Piroplasmorina in družino Babesiidae (Bock in sod., 2004). S pomočjo različnih analiz je bilo opisanih preko 100 različnih vrst Babesia spp. (Homer in sod. 2000). V Tabeli 6 so navedene nekatere vrste iz rodu Babesia spp. , njihova geografska razširjenost, vrste sesalcev in vektorjev, v katerih zajedajo. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 14 Tabela 6: Nekatere vrste Babesia spp., njihovi gostitelji in geografska razširjenost (Povzeto po Ulienberg, 2006; Bock in sod., 2004) Table 6: Some species of Babesia spp., their hosts and geographical distribution (Summarized by Ulienberg, 2006; Bock et al., 2004) Babesia spp. Najpogostejši klopni vektor Geografsko področje Vretenčar Dermacentor spp., Hyalomma marginatus, Hyalomma truncatum, Afrika, Južna in Centralna Amerika, Konji, osli in B. caballi Rhipicephalus evertsi evertsi Evropa in Azija mule Rhipicephalus sanguineus, Dermacentor spp., Haemaphysalis spp., Južna Evropa, Severna Amerika, Azija, B. canis Hyalomma spp Afrika in Avstralija Pes Ixodes ricinus, Severovzhodna Evropa, Španija, Velika B. divergens Ixodes persulcatus Britanija in Irska Govedo Haemaphysalis spp., B. gibsoni Rhipicephalus sanguineus Afrika, Azija, Evropa in Severna Amerika Pes B. major Haemaphysalis punctata Evropa, Severovzhodna Afrika in Azija Govedo Rhipicephalus bursa, Jugovzhoda Evropa, Severna Afrika in B. motasi Haemaphysalis punctata Azija Ovce in koze Jugovzhoda Evropa, Severna Afrika in B. ovis Rhipicephalus bursa Srednja in Vzhodna Azija Ovce in koze B. (canis) presentii ni poznano Azija (Izrael) Mačke B. beliceri Hyalomma spp. Rusija Govedo Boophilus microplus, Boophilus decoloratus, Boophilus annulatus, Boophilus geigyi, Afrika, Azija, Centralna in Južna Amerika, B. bigemina Rhipicephalus evertsi Južna Evropa Govedo in bivol Boophilus microplus, Boophilus annulatus, Afrika, Azija, Centralna in Južna Amerika, B. bovis Boophilus geigyi Južna Evropa, Afrika Govedo in bivol B. crassa ni poznano Azija Koze, ovce B. felis ni poznano Afrika, Evropa Mačke Govedo, severni B. jakimovi Ixodes spp. Sibirija jelen B. occultans Hyalomma spp. Afrika Govedo B. orientalis Rhipicephalus spp. Azija Bivol B. ovata Haemaphysalis longicornis Vzhodna Azija Govedo B. perroncitoi ni poznano Afrika, Evropa Svinja B. rossi Haemaphysalis spp. Afrika Pes B. trautmanni B. trautmanni Afrika, Evropa Svinja B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 15 B. vogeli Rhipicephalus spp. Afrika, Amerika, Azija, Avstralija, Evropa Pes Babesia Severna Evropa, Afrika in države bivše trautmanni Rhipicephalus spp. Sovjetske zveze Svinje 2.2.4 Razvojni krog Razvojni krog Babesia spp. lahko razdelimo na dva dela, in sicer: 1. razvoj v vretenčarju, 2. razvoj v klopu. Do okužbe vretenčarja z Babesia spp. pride le, če je klop okužen in če je klop dovolj časa parazitiral na vretenčarju, saj verjetnost okužbe s časom parazitiranja klopa narašča. Sporozoiti se preko klopove sline izločajo v podkožje vretenčarja. Tam preidejo v eritrocite in se spremenijo v trofozoite. Le-ti se nato spremenijo v merozoite. Merozoiti nato invadirajo nove eritrocite s procesom invaginacije in s tem oblikujejo vakuolo. Večina merozoitov se nato razvije v trofozoite, ki se z nespolnim razmnoževanjem delijo, kar ponovno privede do propada eritrocitov. Nekaj merozoitov se iz neznanega razloga ne deli, temveč rastejo in postanejo gametociti, ki so razvojna stopnja, s katero se okužijo klopi. Ko klop začne parazitirati na vretenčarju, ki je okužen z Babesia spp. se po nekje 10 urah sesanja krvi vanj naselijo gametociti. Le-te po določenem času pričnejo z oblikovanjem novega organa, ki je v obliki konice puščice. Ta organ je verjetno udeležen pri združitvi gamet. Z združitvijo moške in ženske gamete nastane zigota, ki prodre skozi sluznico črevesja in preko hemolimfe potuje do slinskih žlez klopa. V celicah slinskih žlez se iz zigot v treh stopnjah razvijejo sporozoiti. Invadirane celice hipertrofirajo in v njih se oblikuje sporoblast, iz katerega brstijo sporozoiti. Ko klop začne zajedati na vretenčarju, se prične druga stopnja, v kateri se oblikujejo organeli sporozoita, in nato v tretji fazi sporozoit zapusti sporoblast in s slino klopa preide na novega gostitelja (Homer in sod., 2000). Criado-Fornelio in sod. (2003) so na osnovi genske analize 18 rRNA razdelili podred Piroplasmorina v 5 genotipskih skupin ter jih poimenovali: 1. Skupina Ungulibabesids, ki zajema večinoma Babesia spp. pri prežvekovalcih. To so: B. caballi, B. bigemina, B. ovis, B. bovis in Babesia sp. 2. Skupina Babesids, v katero so uvrščene B. divergens in B. odocoilei z B. canis in B. gibsoni, ki ju najdemo pri kanidih. 3. Skupina Archaeopiroplasmids: v to skupino je poleg B. microti, B. rodhaini, B. felis, B. leo, B. microti uvrščena tudi Theileria annae. 4. Skupina Prototheilerids: v njej so razvrščene piroplazme zahodno-ameriškega tipa. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 16 5. Skupina Theilerids, v katero so zajete vse Theileria spp. , ki jih najdemo pri bovidih (Bock in sod., 2004). Slika 4: Razvojni krog B. bigemina pri govedu in vektorju klopu, vrste Boophilus microplus (Bock in sod., 2004) Figure 4: B. bigemine development cycle in cattle and bone vector, Boophilus microplus species (Bock et al., 2004) 2.2.5 Imunski odziv gostitelja Večina sesalcev je sposobna razviti imunost na Babeisa spp. po invaziji oz. cepljenju. Pri imunskem odzivu sodelujeta tako humoralna kot celična imunost. Humoralna imunost ima manjši pomen, saj so sporozoiti, na katere delujejo protitelesa, le kratek čas izven eritrocitov. Prav tako so miši, ki so bile imune na B. rodhaini, kljub aplikaciji zaviralcev razvoja B limfocitov, ostale zdrave po okužbi z B. rodhaini (Moro in sod. 1998). Prav tako pri transfuziji imunega seruma miškam, ki so obolele za B. microti, ni prišlo do ozdravitve B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 17 (Homer in sod. 2000). Večjo vlogo pri obrambi proti babezijam ima celična imunost. Aktivirani monociti, makrofagi in nevtrofilci izločajo različne protimikrobne faktorje, ki upočasnjujejo razvoj razvojnih oblik oz. jih uničijo (Bock in sod., 2004). Pri odstranjevanju propadlih eritrocitov igra pomembno vlogo vranica (Gray in sod., 2010). Slika 5: Shema imunskega odziva gostitelja (Homer in sod., 2000) Figure 5: A host immune response scheme (Homer et al., 2000) Slika 5 prikazuje teoretično shemo odziva imunskega sistema glede na stadij bolezni in razvojno obliko Babesia spp. Med stadijem vzpostavitve invazije (A) protitelesa IgG preprečijo vstop Babesia spp. v eritrocite. V fazi B Babesia sp. uspe vstopiti v eritrocite, kjer se tvorijo merozoiti, ki povzročijo lizo celice, ti pa nato vstopijo v nove eritrocite. V tej fazi rast merozoitov zavirajo faktorji, ki jih izločajo celice ubijalke (interferon gama (IFN- γ) ter B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 18 makrofagi (tumor nekrotizirajoči faktor alfa (TNF-α), dušikov oksid (NO) in reaktivne kisikove zvrsti (ROS)). V končni fazi (C) pride najprej do najvišje stopnje parazitemije. V tej fazi so limfociti T odgovorni za odstranitev Babesia spp. (Homer in sod., 2000). 2.2.6 Govedo in Babesia spp. Basesia spp. povzroča akutno in perzistentno subklinično okužbo pri govedu. 2.2.6.1 Patogeneza Sporozoiti v času parazitiranja klopa preidejo v krvni obtok in tam invadirajo eritrocite, v katerih se tvorijo trofozoiti ali oblike priroplazem, iz katerih se nato razvijeta 2 ali 4 hčerinske celice. Te nato invadirajo nove eritrocite. To povzroči intravaskularno ali ekstravaskularno hemolizo. Hitra delitev in ponovno invadiranje eritrocitov povzročita hemoglobinemijo, heomoglobinurijo in povišanje telesne temperature. Zmanjševanje števila eritrocitov privede do anemije ali celo do pogina v nekaj dneh. V času parazitemije je lahko prizadetih od 0,2 % do 45 % eritrocitov (Demessie in Derso, 2015). 2.2.6.2 Klinična slika Klinični znaki pri okužbi z Babesia spp. so naslednji: povišana telesna temperatura (tudi do 41 °C), izguba apetita, neaktivnost vampa, oteženo in pospešeno dihanje, depresija, slabo počutje, hujšanje, progresivna hemolitična anemija, ikterus, hemoglobinurija, pospešen srčni utrip, težave z očmi in zmanjšanje mlečnosti. Sluznice so lahko blede in rumenkaste. Urin je rdeče do kavne barve. Nevrološke motnje lahko zaznamo pri B. bovis. Nastanejo zaradi agregacije prizadetih eritrocitov v kapilarah možganov. Klinično se kažejo kot nistagmus, hoja v krogu, tiščanje glave ob trde predmete, krči, ataksija, škripanje z zobmi in mišični tremor (Demessie in Derso, 2015, Zintl in sod., 2003). 2.2.6.3 Postavitev diagnoze Hitra in prava postavitev diagnoze je zelo pomembna pri nadzoru, zdravljenju in kontroli infekcije. Zaradi nespecifičnih znakov postavitev diagnoze na osnovi klinični znakov ni mogoča. Najcenejša in najhitrejša postavitev diagnoze je možna s pomočjo mikroskopiranja pobarvanega krvnega razmaza. Metoda je zelo učinkovita pri govedu, ki je razvilo akutno obliko obolenja, saj je pri le-tem število eritrocitov, okuženih z Babesia spp. , visoko. Tako lahko vidimo s 1000-kratno povečavo značilna telesca v eritrocitih. Povzročitelja lahko B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 19 dokažemo tudi s PCR. Možno je tudi serološko testiranje ELISA ali IFA (Demessie in Derso, 2015). 2.2.7 Ekonomski vpliv Babesia spp. Invazija z Babesia spp. ima velik ekonomski pomen v govedoreji. Ekonomske izgube ne nastanejo samo zaradi pogina, abortusov, znižanja mlečnosti, zmanjšanja prirasta, zdravljenja ter vakcinacije, temveč tudi zaradi vpliva na mednarodno trgovanje z govedom. McLeod in Kristjanson sta leta 1999 razvila model ˝tick cost˝, na osnovi katerega sta določila ekonomski vpliv klopov in klopno prenosljivih bolezni. Izračunala sta, da babezioza in anaplazmoza avstralsko govedorejo staneta 16,9 milijona ameriških dolarjev. Sama zaščita pred klopi pa 6,4 milijona ameriških dolarjev. Model je kasneje tudi pokazal, da Kenija porabi 5,1, Zimbabve 5,4, Tanzanija 6,8, Južna Afrika 21,6, Kitajska 19,4, Indija 57,2, Indonezija 3,1 in Filipini 0,6 milijona ameriških dolarjev za obvladovanje klopov in klopno prenosljivih bolezni (Bock in sod., 2004). Poznanih je več vrst Babesia spp, ki jih najdemo pri govedu: B. bovis, B. divergens, B. major, B. bigemina in druge (Ulienberg, 2006). B. bovis in B. bigemina invadirata govedo v tropskem in subtropskem podnebju. Zanimivo je, da so teleta v večini primerov imuna na okužbo z B. bigemina in tako ne razvijejo klinične oblike bolezni. Živali, ki zbolijo, razvijejo zelo hudo obliko klinične bolezni (povišana telesna temperatura, kaheksija, hemoglobinemija, hemoglobinurija), ki nastane v nekaj dneh. Propade lahko tudi več kot 75 % eritrocitov. Pogin živali lahko znaša tudi do 50 %, vendar pa je odstotek pogina ob pravočasnem zdravljenju in izogibanju stresa bistveno manjši. B. bovis se po navadi pojavlja na področjih, kjer najdemo tudi B. bigemina. Njena invazija lahko traja tudi do enega leta ali celó celo življenje. Pri živalih, ki se okužijo z B. bovis, zasledimo vrsto značilnih kliničnih zakov, vendar se hemoglobinemija in hemoglobinurija ne pojavita vedno. Lahko se pojavi možganska oblika bolezni ali sindrom dihalne stiske, ki privede do smrti. B. divergens se pojavlja v Evropi in povzroča podoben znake kot B. bovis in B. bigemina. Pri njej se redko razvije možganska oblika (Demessie in Derso, 2015). Prav tako se v Evropi pojavlja B. major, ki je sicer ne-patogena, vendar pa lahko pri teličkih, pri katerih je bila opravljena splenektomija, povzroči razvoj bolezni ali celo pogin (Vial in Gorenflot, 2006). B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 20 2.2.8 Babesia divergens B. divergens prenašajo klopi Ixodes ricinus. Prva sta jo opisala M’Fadyean in Stockman, ki sta jo poimenovala Piroplasma divergens. Sprva so domnevali, da B. divergens invadira le ozek krog vretenčarjev. Garnham in Bray (1959) sta ovrgla to domnevo, saj sta pri šimpanzih in opicah z odstranjeno vranico in invadiranih z B. divergens opazila pojav hemoglobinurije. Kasnejše raziskave so pokazale, da so šimpanzi razvili bolezen tudi, če so bili invadirani z večjim odmerkom babezij. Prav tako so raziskave pokazale, da so za B. divergens občutljivi muflon, srna, severni jelen, damjak, ovce in druge vrste živali. Za klinično zaznavno invazijo z B. divergens je potrebnih približno 103 parazitov. Pri razvoju bolezni igrajo pomembno vlogo imunski status živali ter število klopov, ki parazitirajo na gostitelju in so invadirani z B. divergens. V primeru dobrega imunskega statusa se pogosto razvije subklinično obolenje z nizko stopnjo parazitemije in ga lastniki živali niti ne opazijo. Živali so lahko anoreksične in lahko imajo blago povišano telesno temperaturo. Živali s slabim imunskim sistemom po navadi razvijejo akutno obliko bolezni, ki se kaže s kliničnimi znaki, ki so našteti v poglavju 2.2.6.2. Če lastnik živali ne opazi klinični znakov, bolezen napreduje. Telesna temperatura se zniža, pride do dehidracije in posledično do prenehanja hemoglobinurije. Živali obležijo in preidejo v toksični šok. Srčni utrip se upočasni, lahko se pojavita zlatenica in zaprtje. Anemija in upočasnjeno bitje srca lahko privedeta do nezadostne možganske oksigenacije in živčnih motenj. Pogin živali nastopi zaradi odpovedi srca, insuficience jeter ali ledvic (Zintl in sod., 2003). 2.2.9 Zdravljenje Babesia spp. Do sedemdesetih let 19. stoletja so se za zdravljenje babezioze v večini evropskih držav uporabljala 3 zdravila, in sicer quinuronium sulphat (Ludobal®, Bayer Ltd.), amicarbalid isothionat (Diampron®, May and Baker Ltd.) in diminazen aceturat (Berenil®, Hoechst Ltd.). V teh letih so kot četrto zdravilo predstavili tudi imidocarb dipropionat (Imizol®; Schering- Plough), ki je s časom postal prva izbira pri zdravljenju Babesia spp. in tudi dober profilaktik v primeru aplikacije dvojnega terapevtskega odmerka (Vial in Gorenflot, 2006). V večini primerov je zdravljenje pri goveji babeziozi uspešno, seveda je uspešnost odvisna od zgodnje ugotovitve bolezni ter takojšnjega zdravljenja. Najpogosteje se uporabljajo diminazen diaceturat (3–5 mg/kg telesne teže), imidocarb (1–3 mg/kg telesne teže), in amicarbalid (5–10 mg/kg telesne teže) oz. po navodilu proizvajalca (Vial in Gorenflot, 2006). B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 21 2.2.10 Preventiva Preventiva pred invazijami z Babesia spp. mora zajemati tri glavne dejavnike: obvladovanje vektorjev, kemoprofilakso in imunizacijo (Demessie in Derso 2015). Najpogostejši način zaščite pred vektorji je zaščita goveda z akaricidi (npr. s flumethrinom ali z deltamethrinom), saj s temi uničimo klope še pred začetkom parazitiranja oz. predno se v slinskih žlezah klopa razvijejo sporozoiti. Poleg tega pa sta potrebna redno pregledovanje goveda in ocena uspešnosti zaščite, saj se pojavlja tudi vedno več odpornosti klopov na akaricide (Zintl in sod., 2003). Drugi izmed načinov zaščite je uporaba kemoprofilakse. Imidocarb in diminazen se uporabljta za večmesečno zaščito pred babeziozo (Demessie in Derso 2015). Pri odmerku imidokarba 3 mg/kg zaščita traja do 4 tedne, obenem pa v primeru, da pride do invazije živali z babeziozo, omogoči razvoj imunosti (Zintl in sod., 2003). Imunost pa se lahko doseže tudi z vakcinacijo. Žive vakcine so se izkazale za zelo učinkovite in relativno varne, predvsem ko je bilo cepljeno govedo pod starostjo 1 leta. Največjo problematiko pri izdelavi živih vakcin predstavlja kontrola patogenosti živih parazitov (Zintl in sod., 2003). Druga od metod imunizacije živali je uporaba krvi trajno okuženih živali. To metodo uporabljajo predvsem v tropskih področjih in Avstraliji (Demessie in Derso, 2015). 2.2.11 Babesia spp. kot zoonoza Prvi opisan primer obolenja človeka za babeziozo pri nas sega v leto 1957, ko je zbolel jugoslovanski kmet, ki mu je bila odstranjena vranica (Skrabalo in Deanovic, 1957). Nekaj let kasneje je v Ameriki pozornost vzbudilo večje število ljudi, okuženih z B. microti. Prav tako je bila večini teh ljudi odstranjena vranica (Vial in Gorenflot, 2006). Humana babezioza je vse bolj pomembna kot zoonoza, saj je bilo v Evropi (bivša Jugoslavija, Francija, Velika Britanija, Irska, Portugalska, Španija, Avstrija, Švedska in Švica) že več kot 30 primerov okužb z Babesia spp. , predvsem govejo babeziozo, ki jo povzroča B. divergens. Oboleli so večinoma ljudje, ki jim je bila odstranjena vranica (Zintl in sod., 2003). Prav tako so se v Avstriji, Italiji in Nemčiji pojavile okužbe z B. venatorum (EU1). Še bolj pogosto kot v Evropi se obolenja za babeziozo pojavljajo v ZDA, kjer je eden glavnih povzročiteljev B. microti, ki jo po navadi najdemo pri glodavcih (Gray in sod., 2010). B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 22 Tabela 7: Pojavnost dokumentirane babezioze pri ljudeh (povzeto po Gray in sod., 2010) Table 7: Occurrence of documented babesiosis in humans (summarized by Gray et al., 2010) Humana babezioza v Ameriki Vrsta B. microti B. CA1–CA4 B. divergens-like B. divergens- B. Babesia spp. duncani like divergens- like Tip izolata AF231348 AF15870 AF158704 AY274114 AY887131 AY04811 0 3 Območje Severovzhod, Država Država Država Kentucky Missouri zgornji srednji Washingt Washington, Washington zahod on, California California Vektor Ixodes scapularis Neznano Neznano Neznano Ixodes Ixodes dentatus? dentatus? Prvotni Glodavci, rovke Neznano Neznano Neznano Zajci? Zajci? gostitelj Humana Ljudje z vranico, Ljudje z Ljudje brez Ljudje brez Ljudje brez Ljudje dovzetnost ljudje brez vranico vranice vranice vranice brez vranice vranice Število Več 100 5 4 (resna – 1 (resna) 1 (smrtna) 1 (smrtna) primerov (subklinična do (subklinič smrtna) (stopnja) smrtna) na do resna) Humana babezioza v Evropi Vrsta B. microti B. divergens B. venatorum B. divergens-like Babesia spp. (EU1-3) Tip izolata EF413181 U16370 AY046575 AJ439713 Območje Nemčija Evropa Avstrija, Italija, Portugalska Nemčija Vektor Ixodes ricinus? Ixodes ricinus Ixodes ricinus? Neznano Prvotni Glodavci Govedo Divjad Neznano gostitelj Humana Ljudje z vranico, Ljudje brez Ljudje brez Ljudje brez vranice dovzetnost imunosupresivni vranice vranice ljudje Število 1 (zmerna) > 30 (resna – 3 (zmerno – 1 (smrtna) primerov smrtna) resna) (stopnja)* B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 23 Humana babezioza po svetu (brez Evrope in Amerike)* Vrsta B. microti B. microti Ovine babesia-like B. divergens-like Babesia spp. (KO1 ) Tip izolata AB032434 Ni podatka DQ346955 AF435415 sekvence (nepopolni podatki sekvence) Območje Japonska Tajska Koreja Kanarski otoki Vektor Ixodes ovatus? Neznano Neznano Ixodes ventalloi? Prvotni Japonska poljska Podgane? Prežvekovalci Neznano gostitelj miš? (ovce)? Humana Ljudje z vranico Ljudje brez Ljudje brez vranice Ljudje brez dovzetnost vranice vranice Število 2 (subklinična – 1 (blaga) 1 (resna) 1 (smrtna) primerov zmerna) (stopnja) *Nadaljevanje Tabele 7. *Continued Table 7. 2.2.11.1 Patogeneza Patogeneza pri ljudeh je enaka kot pri živalih. Pri resnih invazijah nastopi hemoliza, posledica le-te sta hemolitična anemija z zlatenico. Če babezioze ne zdravimo, anoksija in toksini privedejo do odpovedi organov in posledično smrti. Stopnja parazitemije ni vedno v korelaciji s kliničnimi znaki. Bolniki lahko kažejo povišano temperaturo, bolečino v mišicah, odpoved ledvic in koagulopatije pri okužbi z B. microti tudi, ko je prizadet manj kot 1 % eritrocitov (Gray in sod., 2010). 2.2.11.2 Klinični znaki pri ljudeh V času inkubacije, ki traja 1–3 tedne, se bolniki počutijo slabotno in nelagodno. Akutna faza nastopi hitro in se kaže s hemoglobinurijo, ki je eden glavnih kliničnih znakov. Bolezen lahko hitro zamenjamo z malarijo. Pojavi se zlatenica z neperiodično povišano telesno temperaturo (40–41°C), mrzlico, močnim potenjem, glavoboli, bolečino v mišicah ter bolečino v področju trebuha in prsnega koša. Lahko se pojavita bruhanje in driska (Zintl in sod., 2003). 2.2.11.3 Diagnostika in zdravljenje Tudi sama diagnostika babezioze se bistveno ne razlikuje od diagnostike pri živalih. Hemoglobinurija je eden glavnih kliničnih znakov okužbe z babeziozo, vendar jo je treba B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 24 potrditi s pregledom krvnega razmaza, pobarvanega po Giemsa metodi. Prav tako se lahko babezioza pri ljudeh potrdi s pomočjo seroloških testov, kot sta ELISA in IFAT, in pa s pomočjo metode PCR. Ob potrditvi diagnoze je potrebno zdravljenje. Zdravljenje poteka s kombinacijo naslednjih dveh učinkovin: kinina in klindamicina. Čeprav učinek ni tako dober kot pri imidokarbu dipropionatu, se ta kombinacija uporablja, saj imidokrab dipropionat ni dovoljen za splošno uporabo v humani medicini. Do sedaj sta bili opravljeni le dve zdravljenji z imidokarbom pri ljudeh. V teh dveh primerih je bilo izdano posebno dovoljenje za uporabo (Zintl in sod., 2003). Pred kratkim razvit hidroksinaftokinon je registriran za uporabo v humani medicini in dobro deluje proti B. divergens, vendar se je pri poskusnih živalih, okuženih z B. mircoti in zdravljenih z omenjenim zdravilom, pojavilo ponovno obolenje. Kot učinkovito pa se je izkazalo zdravljenje v kombinaciji z azitromicinom ali s klindamicinom. Kombinacija atavokvon/azitromicin se je izkazala učinkovita pri obolenjih ljudi z B. mircoti in je priporočena terapija za blažje oblike obolenja (Gray in sod., 2010). B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 25 2.3 Borelioza Je infekcijska bolezen, ki jo povzroča spiroheta Borrelia burgdorferi (B. burgdorferi), za katero obolevajo ljudje, domače in divje živali. Prizadene več organskih sistemov. Njen glavni vektor so klopi. Bolezen večinoma najdemo na severni polobli (Kybicová, 2010). 2.3.1 Zgodovina Lymske borelioze Konec 19. stoletja se je v Evropi pojavilo kronično kožno obolenje, ki so ga poimenovali acrodermatis chronica atropicans. V začetku 20. stoletja je dr. Afzelius opisal primer pacienta s kožnimi spremembami, ki jih je poimenoval erythema migrans (Kybicová, 2010) . Leta 1976 se je pri prebivalcih Lyma v Connecticutu in okoliških skupnostih pojavil revmatoidni artritis, ki je trajal 1–2 tedna in povzročal zatekanja in bolečine večjih sklepov. Iz kliničnih, laboratorijskih in epidemioloških preiskav ni bilo mogoče reči, da gre za imunsko pogojeno patogenezo. Sumili so bakterijo, ki se prenaša preko členonožcev, saj so nekateri oboleli imeli okoli vboda insekta rdeče okrogle izpuščaje, ki so se širili. Sum so potrdili z izolacijo Borrelia burgdorferi iz okuženega klopa Ixodes dammini (danes poimenovan I. scapularis) ter iz krvi, cerebrospinalne tekočine in drugih tkiv, ki so jih odvzeli obolelim ljudem. Bolezen so poimenovali Lymska borelioza po kraju, kjer je bila prvič opisana (Fritz in Kjemtrup, 2003). 2.3.2 Skupina Borrelia burgdorferi sensu lato Ko govorimo o Borrelia burgdorferi sensu lato, govorimo o skupini bakterij, ki imajo zelo podobno zgradbo DNK. V tej skupini najdemo naslednjih 18 bakterijskih vrst: B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii, B. burgdorferi, B. californiensis, B. carolinensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lusitaniae, B. sinica, B, tanukii, B. trudi, B. valaisiana, B. yangtze in genomospecies2 (Margos in sod., 2011). 2.3.3 Prenos in gostitelji Borrelia burgdorferi v naravi kroži s členonožci, predvsem klopi iz rodu Ixodes. Le-ti zajedajo na različnih malih in velikih sesalcih ter ptičih. Klopi iz rodu Ixodes v svojem razvoju potrebujejo 3 gostitelje. V vsaki fazi (ličinka, nimfa in odrasel klop) zajedajo pri drugem gostitelju. V fazi ličinke in nimfe jih najdemo predvsem v odpadlem listju in zgornjem delu humusa. Tam gredo na godalce, kuščarje in ptiče. Po 2–4 dneh se napijejo krvi B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 26 in odpadejo. Ko preidejo v odraslo obliko, se povzpnejo na nižje grmičevje in konice trav, kjer počakajo na večje sesalce (Fritz in Kjemtrup, 2003) . Ko ena izmed razvojnih oblik klopa zajeda na okuženi živali, Borrelia burgdorferi preide v klopa, do njegovega črevesja in se množi, dokler klop parazitira na gostitelju. Ko klop ponovno preide na novega gostitelja, se Borrelia burgdorferi ponovno prične namnoževati, ter migrirati preko hemolimfe do slinskih žlez in preko njih v novega gostitelja. Za migracijo je potrebno 2–3 dni, zato je pomembno, da klope pravočasno odstranjujemo in s tem preprečimo prenos Borrelia burgdorferi (Fritz in Kjemtrup, 2003) . 2.3.4 Imunski odziv gostitelja Raziskave imunskega odziva na Borrelia burgdorferi so bile v večini raziskane pri ljudeh. Ko se Borrelia burgdorferi iz okuženega klopa prenese na človeka, človeški imunski sistem v prvi fazi odgovori s celično imunostjo. Pri odzivu sodelujejo komplement in levkociti. Različne vrste Borrelia spp. se razlikujejo po tako imenovanem s patogeni povezanim molekularnim vzorcem ˝pathogen-associated molecular patterns˝ (PAMPs), ki ga prepoznajo receptorji (pattern recognition receptors (PRRs)). Te receptorje izrazijo celice celične imunosti (Petzke in Schwartz, 2015). Pomembno vlogo pri imunosti igrajo na membrano vezani proteini TLRs, ki se nahajajo na površju oz. v endosomih obrambnih celic. Večina proteina TRLs porabi protein MyD88, ki začne s kaskado, katere posledica je izločanje citokinov in kemokinov. Poleg tega proteina Borrelia burgdorferi na membrani izraža več kot 100 drugih lipoproteinov, ki delujejo stimulativno na imunski sistem. Ti lipoproteini vsebujejo tripalmitoyl-S-glyceryl-cysteine (Pam3Cys) variacije, ki jih prepozna TRL2 in povzroči spremembe v jedru faktorja NF-kB ter nato izločanje NF-kB odvisnih citokinov (TNF, IL-6, IL-8) in adhezijskih faktorjev (E- selectin, vaskularne celične adhezijske molekule 1 in znotrajcelične adhezijske molekule 1) (Petzke in Schwartz, 2015). Tvorba protiteles je odvisna od več dejavnikov, kot so vrsta gostitelja, starost, mesto okužbe, prejšnje okužbe, razlike med osebki. Pojavi se lahko tudi zakasnel imunski odgovor, saj določeni osebki, kljub klinični sliki, ne tvorijo protiteles tudi do 8 tednov po okužbi (Petzke in Schwartz, 2015). Pri poskusih na miših, so ugotovili, da je serološki odgovor odvisen predvsem od količine bakterij, ki so prišle v miš, in od mesta, kjer je prišlo do vdora oz. aplikacije Borrelia burgdorferi. Organizem tvori protitelesa proti borelijskim antigenom OspA in OspB, a le v B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 27 primeru, ko je v organizem vstopilo večje število bakterij. V primeru manjšega vdora bakterij, organizem ne tvori protiteles. Zanimiva je tudi ugotovitev, da pri miših Scid (občutljivi sev miši, ki po okužbi z Borrelia burgdorferi klinično kažejo obolenje z vnetjem sklepov, jeter in srčne mišice) lahko preprečimo oz. blažimo klinično sliko z aplikacijo monoklonalnih protiteles proti OspA. Prav tako je zanimivo, da so hrčki, ki so bili vakcinirani z Borrelia burgdorferi fiksirano s formalinom in nato v krajšem času okuženi z Borrelia burgdorferi, zboleli za močnim artritisom, saj niso uspeli razviti protitelesne zaščite. V kolikor čas med vakcinacijo in aplikacijo podaljšamo, hrčki ne zbolijo (Petzke in Schwartz, 2015; Borko, 1999). 2.3.5 Potek bolezni Potek bolezni pri obolelih živalih je različen. Pri nekaterih se klinična slika sploh ne razvije. Na endemičnih področjih je lahko okuženost psov med 25–95 %, vendar pa vsi psi ne razvijejo klinične slike. Večjo verjetnost razvoja kliničnih znakov pri okužbi z Borrelia burgdorferi lahko pričakujemo pri mlajših živalih (Fritz in Kjemtrup, 2003). Psi, ki razvijejo klinično obolenje, imajo povišano telesno temperaturo, so anoreksični in šepajo. Po navadi artritis prizadene le en sklep, in sicer tarsus ali metatarsus. Borrelia burgdorferi lahko pri psih povzroči tudi glomerulonefritis, tubularno nekrozo, živčne motnje in limfoplastično vnetje črevesja, ki je povezano s hitro potekajočo in pogosto smrtno glomerularno boleznijo (Fritz in Kjemtrup, 2003). Okuženost konj je v endemičnih področjih do 20 %, vendar pa je klinična manifestacija pri konjih zelo redka. Kaže se kot blago povišana telesna temperatura, letargija, togost in oteklost v distalnih delih okončin (Fritz in Kjemtrup, 2003). Serološko so bile potrjene tudi okužbe pri prežvekovalcih, vendar pa se klinična oblika bolezni pojavlja redko. Po navadi se pojavita šepanje in oteklost sklepov, lahko pa tudi hujšanje, eritem, otekle noge in strma stoja (Fritz in Kjemtrup, 2003; Gray in sod. 2002; Borko, 1999) 2.3.6 Diagnostika Ugotavljanje okužb z Borrelia burgdorferi temelji predvsem na dokazovanju protiteles oz. na dokazovanju antigena. Če najdemo protitelesa proti Borrelia burgdorferi, lahko iz tega sklepamo, da je žival bila oz. je okužena z B. burgdorferi. Ne moremo pa trditi, da je bil organizem okužen v času, ko so bili odvzeti vzorci za analiziranje (Gray in sod. 2002) . B. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 28 burgdorferi lahko dokazujemo direktno oz. indirektno. Direktne metode dokazujejo bakterijo oz. njene antigene. Slednje lahko dokazujemo v telesnih tekočinah oz. tkivih. Najpogosteje se za direktno dokazovanje uporabljajo mikroskopiranje in molekularne metode, kot je PCR. Pri indirektnih metodah dokazujemo protitelesa in specifične dele bakterije, kot so zunanja celična membrana, specifični proteini itd. Metode dokazovanja so ELISA, direktna in indirektna imunofluorescenca in western blot test (Kybicová, 2010). 2.3.7 Borrelia burgdorferi pri ljudeh Boreliozo pri ljudeh glede na trajanje obolenja razdelimo v tri faze. Prva je lokalizirana faza, ki se pojavi nekje 10–30 dni po vstopu B. burgdorferi. V tej fazi se pojavi erythema migrans, kožna sprememba, kolobar rdeče barve, ki se koncentrično širi. S krvjo oz. z mezgo lahko bakterije v nekaj dneh oz. tednih preidejo v organe. To je faza razsejane oblike bolezni. V tej fazi bakterije povzročajo spremembe na koži, živcih, sklepih, srcu, mišicah in očeh. Če se bolezen ne pozdravi, se lahko le-ta po enem oz. več letih razvije v kronično fazo in povzroči spremembe na koži, sklepih in živčnem sistemu (Borko, 1999). Klinične spremembe pri ljudje se odražajo predvsem na štirih organskih sistemih, to so koža, živčni sistem, sklepi in srce. Eden glavnih kliničnih znakov, ki se pojavi na koži, je erythema migrans. Gre za homogeno spremembo svetlo rdeče ali modro rdeče barve. Pojavlja se pri večini pacientov, ki obolijo pozno spomladi in zgodaj poleti, ne glede na starost ali spol. Pojavi se na mestu, kjer je bil klop pritrjen. Do razvoja erythema migrans pride v 10 dneh po ugrizu klopa, vendar lahko pride do pojava že v nekaj dneh ali redko šele po mesecu dni ali celo več (Gray in sod., 2002). Pri okužbi z Borrelia burgdorferi se pojavijo tudi nespecifični znaki, kot so povišana telesna temperatura, glavobol, utrujenost in bolečine v mišicah in sklepih (Fritz in Kjemtrup, 2003). B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 29 Tabela 8: Različne oblike obolenj pri okužbi z Borrelia burgdorferi s.l. v Evropi (Gray in sod., 2002). Table 8: Different forms of disease in Borrelia burgdorferi infection in Europe (Gray et al., 2002). Organski sistem Faza obolenja Oblika obolenja Koža Akutna faza • Erythema migrans • Borrelial lymphocytoma Kronična faza • Acrodermatitis chronica atrophicans Živčni sistem Akutna faza • Meningo-poliradikuloneuritis Kronična faza • Subtilna senzorna nevropatija Srce Akutna faza • Atrioventrikularni blok • Subtilni miokarditis Kronična faza • Diletativna kardiomiopatija Mišice in sklepi Akutna faza • Artritis • Poliartritis Kronična faza • Perzistenten artritis 2.3.8 Borrelia burgdorferi pri ljudeh v Sloveniji Okužbe z Borrelia burgdorferi v Sloveniji po podatkih NIJZ sodijo med najpogostejše nalezljive bolezni, ki jih prenašajo klopi. Pojavljajo se skozi celotno leto, vendar so obolenja pogostejša v poletnih mesecih. V Tabeli 9 in Tabeli 10 vidimo število prijavljenih primerov glede na klinično sliko ter regije v katerih je se Lymska borelioza pojavljala (Sočan in sod., 2016). Tabela 9: Prijavljeni primeri Lymske borelioze v Sloveniji glede na klinično sliko v letih 2011–2015 (Sočan in sod., 2016) Table 9: Reported cases of Lyme borelliosis in Slovenia according to the clinical picture in the years 2011–2015 (Sočan et al., 2016) Leto 2011 2012 2013 2014 2015 ERYTHEMA MIGRANS 5552 4897 6914 3875 3729 MENINGITIS 25 10 11 10 6 POLINEVROPATIJA 31 22 8 4 2 ARTROPATIJA 12 2 5 1 5 SKUPAJ 5620 4931 6938 3890 3742 B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 30 Tabela 10: Pojavnost Lymske borelioze v Sloveniji v letih 2014 in 2015 po regijah (Sočan in sod., 2016). Table 10: Appearance of Lyme borreliosis in Slovenia in 2014 and 2015 by region (Sočan et al., 2016). Leto 2014 – št. primerov na Leto 2015 – št. primerov na Regija 100.000 100.000 Celje 648 / 214,9 547 / 181,3 Nova Gorica 278 / 273,4 308 / 303,2 Koper 214 / 144,0 237 / 159.4 Kranj 571 / 280 480 / 235,4 Ljubljana 851 / 130,3 887 / 135,0 Maribor 523 / 161,8 537 / 166,5 Murska Sobota 328 / 280,0 303 / 260,2 Novo mesto 357 / 254,9 325 / 321,9 Ravne 120 / 167,7 118 / 165,7 Skupaj 3890 / 188,7 3742 / 181,4 2.3.9 Stanje pri živalih v Sloveniji Borko (1999) je v svoji doktorski disertaciji testiral 892 goved na prisotnost protiteles proti B. burgdorferi. S pomočjo indirektne imunofluorescence (IIF) je spomladi 1996 ugotovil 36,6- odstotno serološko pozitivnost in 39,7 % pozitivnih živali z ELISA testom. V jeseni pa je bilo 59,6 % živali IIF pozitivnih in 62,2 % živali pozitivnih z ELISA testom. 1997 je pred pašo ugotovil 29,4 % serološko pozitivnih živali s testom IIF in 59,6 odstotno pozitivnost živali s testom ELISA. V jeseni, po paši, je z IIF ugotovil 49,4-odstotno serološko pozitivnost in z ELISA testom 59,3 % pozitivnih govedi. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 31 2.4 Serološka diagnostika s pomočjo imunofluorescenčne tehnike Z imunofluorescenčno tehniko lahko dokazujemo antigen ali protitelesa. V tej metodi so na protitelesa, s katerimi bomo dokazovali antigen oz. druga protitelesa, vezana barvila, ki nam na koncu postopka služijo kot merilo, s katerim določamo, ali so bili antigeni oz. protitelesa prisotna v preiskovanem vzorcu. Poznamo dve metodi imunofluorescenčne tehnike: • Neposredna (direktna) metoda. S to metodo v večini primerov dokazujemo antigen. Pri tej metodi se uporabljata samo dve komponenti, in sicer antigen, ki ga želimo dokazati, in specifično konjugirana protitelesa. Vzorec, v katerem iščemo antigen, nanesemo na predmetno stekelce, ga posušimo in fiksiramo. V naslednji fazi ga prelijemo z raztopino specifičnih konjugiranih protiteles. Nato preparat inkubiramo in speremo ter odčitamo rezultate z mikroskopom za opazovanje fluorescence. V primeru prisotnosti fluorescentnih bakterij je rezultat pozitiven (Borko, 1999). • Posredna (indirektna) metoda. S to metodo v večini primerov dokazujemo protitelesa. V tej metodi potrebujemo znan antigen (povzročitelja, ki ga preiskujemo). Potrebujemo še konjugirana protitelesa za gamaglobuline živalske vrste, katere vzorec bomo preiskovali. Na predmetno stekelce nanesemo suspenzijo preiskovanega antigena, jo osušimo in fiksiramo. Na to na predmetnico nanesemo preiskovano tekočino, npr. krvni serum, v primernem redčenju in inkubiramo 30 minut. Sledita dvakratno spiranje in sušenje. Potem stekelce prelijemo s konjugiranimi protitelesi, specifičnimi za gamaglobuline preiskovane živalske vrste, in inkubiramo 30 minut. Sledita ponovno 2-kratno spiranje in osušitev preparata. Na preparat kanemo kapljico raztopine glicerola in PBS (raztopina fosfatnega pufra), prekrijemo s krovnim stekelcem ter odčitamo rezultate z mikroskopom za opazovanje fluorescence. V primeru prisotnosti fluorescentnih bakterij je rezultat pozitiven (Borko, 1999). B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 32 3 MATERIALI IN METODE 3.1 Materiali 3.1.1 Živali, vključene v raziskavo V našo raziskavo je bilo vključeno pašno govedo. Večina goveda, pri katerem smo jemali kri, se je pasla že lansko pašno sezono. Vzorce krvi smo jemali pri govedu, ki se pase tako na nižinskih kot višje ležečih in gorskih pašnikih oz. planinah. Del vzorcev smo pobrali v regijah, kjer se vsako leto pojavlja babezioza. Slika 6: Lokacije, kjer so bili pobrani vzorci (vir: https://www.google.si/maps) Figure 6: Sampling locations (source: https://www.google.com/maps) 3.1.2 Vzorčenje in odvzem vzorcev Skupno smo za namen Prešernove naloge vzorčili 291 govedi na 52 različnih kmetijah. Od tega smo 28 živalim odvzeli kri dvakrat, in sicer spomladi pred pašo in nato še v jeseni po končani pašni sezoni. Pregledali smo tudi 6 vzorcev goveda, ki je kazalo klinično sliko babezioze . B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 33 Kri se je pri govedu jemala iz v. caudalis mediana v vakuumske epruvete (serum clot activator 9 ml, Vacuette, Avstralija) in vakuumske epruvete z dodanim EDTA (K3E K3EDETA 2 ml, Vacuette, ZDA). Mesto vboda smo očistili in ga nato razkužili s 70 % alkoholom. Epruvete s krvjo smo ustrezno označili in jih shranili v hladilne torbe do prihoda v laboratorij, kjer smo vzorce obdelali. 3.1.3 Priprava vzorcev v laboratoriju Kri v serumskih epruvetah smo pustili koagulirati. Po dvakratnem centrifugiranju (na 3000 obratih na minuto po 10 minut) smo krvni serum razdelili v 4 epruvete in ga shranili na temperaturi –20 ºC do nadaljnjih preiskav. Slika 7: Vzorci seruma pred zamrznitvijo (Foto: Ošlak) Figure 7: Serum samples befor freezing (Photo: Ošlak) Epruvete EDTA smo položili na mešalno mizo in jih pustili mešati, da so se krvne celice enakomerno porazdelile. Nato smo naredili hematološko preiskavo s pomočjo hematološkega števca scil Vet abc Plus+ (Horiba, Nemčija), ki je prikazan na Sliki 8. Pripravili smo tudi krvne razmaze. Vzorce, polne krvi, smo pobarvali in pri klinično pozitivnih vzorcih naredili še difericianlno belo krvno sliko. Preostanek krvi iz epruvet EDTA smo shranili na temperaturi –20 ºC za morebitne dodatne molekularne preiskave. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 34 Slika 8: Hematološki števec scil Vet abc Plus+ (Horiba, Nemčija) (Foto: Ošlak) Figure 8: Hematology counter Vet abc Plus + (Horiba, Germany) (Photo: Ošlak) 3.2 Metode analize vzorcev 3.2.1 Krvni razmazi Iz epruvete z dodanim EDTA smo vzeli kapljico krvi in jo kanili na predmetno stekelce. Z drugim stekelcem smo se pod kotom 30o približali kapljici krvi in počakali, da se je ta razlila ob robu stekelca. Nato smo stekelce potegnili stran od kapljice in tako ustvarili tanek razmaz, ki smo ga posušili na sobni temperaturi. Posušene razmaze smo pobarvali s Hemacolor® barvilom (Merck, USA). Pri Hemacolor® barvanju se uporabljajo 4 različne raztopine. Raztopina 1 je namenjena fiksaciji preparata, raztopina 2 vsebuje rdeče barvilo, raztopina 3 modro barvilo in 4. raztopina je puferska raztopina, namenjena spiranju. Posušen krvni razmaz smo potopili 5-krat po 1 s v raztopino ena, nato 3-krat po 1 s v raztopino dve in nato 6-krat po 1 s v raztopino 3. Nato smo preparat potopili v raztopino 4 za 45 s in ga nato posušili. Ko je bil preparat suh, smo na stekelce kanili kapljico imerzijskega olja in začeli mikroskopirati. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 35 V razmazu, pobarvanim s Hemacolor® barvanjem, se jedra celic obarvajo rdeče do vijolično, citoplazma limfocitov in monocitov modro, granule nevtrofilnih granulocitov svetlo modro, granule eozinofilnih granulocitov opečnato rdeče do rdeče-rjavo, granule bazofilnih granulocitov temno vijolično do črno, trombociti vijolično in eritrociti rdečkasto. 3.2.2 Serologija Za ugotavljanje specifičnih protiteles razreda IgG pri govedu smo uporabili metodo indirektne imunofluorescence. Detekcijo protiteles A. phagocytophilum in B. divergens smo izvedli s pomočjo komercialno pripravljenih stekelc (Megacor, Avstrija), za detekcijo B. burgdorferi pa smo stekelca pripravili sami. Slika 9: Uporabljena stekelca za ugotavljanje protiteles proti A. phagocytophilum (A), B. divergens (B) in B. burgdorferi (C) (Foto: Ošlak) Figure 9: Antibody detection slides for A. phagocytophilum (A), B. divergens (B) in B. burgdorferi (C) (Foto: Ošlak) V metodi smo uporabljali še raztopino fosfatnega pufra, s FITC markirana kunčja protitelesa proti govejim IgG (rabbit anti – cow fluorescein-isothiocyanate (FITC) – conjugated antibodies (Sigma, XXXX) in barvilo Evans blue (BioMerieux, Francija) za lažje odčitavanje rezultatov s fluorescenčnim mikroskopom. Dokaz protiteles s pomočjo indirektne imunofluorescence je potekal v več fazah. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 36 V prvi fazi smo pripravili stekelca za ugotavljanje protiteles IgG proti B. burgdorferi. Na prazna stekelca smo nanesli suspenzijo bakterije B. burgdorferi, jo posušili in fiksirali. V drugi fazi smo pripravili ustrezno redčenje seruma v fosfatnem pufru, in sicer smo pri A. phagocytophilum in B. divergens uporabili redčitev 1 : 64, pri B. burgdorferi pa 1 : 128. Slika 10: Priprava redčitev seruma (Foto: Ošlak) Figure 10: Preparation of serum dilutions (Photo: Ošlak) V tretji fazi smo pripravljene redčitve nanesli na stekelca in jih inkubirali 30 minut na 37 oC +/- 1 oC. Slika 11: Stekelca pripravljena za inkubacijo (Foto: Ošlak) Figure 11: Slides ready for incubation (Photo: Ošlak) B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 37 Po tretji fazi je sledilo dvakratno spiranje s PBS (pH 7,2) po 10 minut. Spiranju so sledili nanos konjugiranih kunčjih protiteles proti kravjim IgG protitelesom ter dodatek Evans blue (1 kapljica na 5 ml PBS), inkubacija in spiranje, kot je že opisano zgoraj. Slika 12: Spiranje stekelc s PBS (Foto: Ošlak) Figure 12: Washing of slides with PBS (Photo: Ošlak) Po spiranju smo stekelca posušili in dodali kapljico Fluoprepa in pokrili s krovnim steklom ter s fluorescenčnim mikroskopom odčitavali rezultate, ki smo jih primerjali s pozitivno in z negativno kontrolo, na osnovi česar smo podali končne rezultate. Če so v preiskovanemu serumu bila prisotna protitelesa, smo videli pod fluorescentnim mikroskopom fluorescentno obarvane A. phagocytophilum, B. divergens in B. burgdorferi. 3.2.3 Statistična analiza S pomočjo programa IBM SPSS Statistic 22 (IBM, ZDA) smo izvedli deskriptivno statistično analizo, ANOVA test z LSD post hock testi in Hi kvadrat test za linearni trend. Za statistično značilne smo smatrali rezultate, pri katerih je bil p < 0,05. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 38 4 REZULTATI 4.1 Dvojno vzorčenje 28 živali pred in po paši Vseh 28 živali, katerim so bili odvzeti vzorci krvi dvakrat, se v času pašne sezone pasejo na Robnikovi planini, torej bodo rezultati vzorčenja vezani na stanje okuženosti klopov na tem območju. Skupno 28 živalim je bila kri odvzeta dvakrat, in sicer pred in po pašni sezoni. Pred pašo je bilo serološko negativnih na vse tri povzročitelje 17 živali, po pašni sezoni pa so bile živali serološko pozitivne vsaj na enega povzročitelja. Na B. burgdorferi je bila serološko pozitivna 1/28 živali, po paši pa 12/28 živali. Iz tega sledi, da je bilo 12 živali tekom pašne sezone v kontaktu z B. burgdorferi, saj je bila žival, ki je bila pred pašno sezono serološko pozitivna, po pašni sezoni serološko negativna. Število serološko pozitivnih živali na A. phagocytophilum je bilo pred pašno sezono 10/28, po pašni sezoni 27/28 živali, kar pomeni, da je tekom pašne sezone v kontakt z A. phagocytophilum prišlo 17 živali. Število serološko pozitivnih živali na B. divergens je bilo pred pašno sezono 9/28, po pašni sezoni 20/28 živali, kar pomeni, da je tekom pašne sezone v kontakt z B. divergens prišlo 12 živali, saj je bila ena žival pred pašno sezono serološko pozitivna, po pašni sezoni pa serološko negativna. Tabela 11: Število seropozitivnih oz. negativnih živali pred oz. po pašni sezoni posameznega povzročitelja Table 11: Number of seropositive or Negative animals before or After the grazing season of the individual agent Povzročitelj A. phagocytophilum B. divergens* B. burgdorferi* Stanje protiteles + - + - + - Pred pašno 10 18 9 19 1 27 sezono Po pašni sezoni 27 1 20 8 12 16 *Ena od živali je bila pred pašno sezono serološko pozitivna, po pašni sezoni pa serološko negativna na označenega povzročitelja. * One of the animals was serologically positive before the grazing season, and after the grazing season it was serologically negative for the identified pathogen. Kot je razvidno iz Tabele 12, je bilo pred pašo na A. phagocytophilum in B. divergens serološko pozitivnih 8 živali, po paši pa 20 živali. Na A. phagocytophilum in B. burgdorferi je B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 39 bila serološko pozitivna le ena žival, po paši pa 11 živali. Prav tako je bila na B. divergens in B. burgdorferi pred pašo pozitivna ena žival, po paši pa 9 živali. Pred pašo je bila na vse tri povzročitelje serološko pozitivna le ena žival, po paši pa je bilo pozitivnih kar 9 živali. Tabela 12: Število seropozitivnih oz. negativnih živali pred oz. po pašni sezoni za dva oz. vse tri povzročitelje Table 12: Number of seropositive or Negative animals before or After the grazing season for two or All three agents. Povzročitelj A. A. B. divergens + B. A. phagocytophilum burgdorferi phagocytophilum phagocytophilum + B. burgdorferi + B. divergens+ B. + B. divergens burgdorferi Stanje + - + - + - + - protiteles Pred pašno 8 20 1 27 1 27 1 27 sezono Po pašni 20 8 11 16 9 18 9 18 sezoni Slika 13 prikazuje število po paši serološko pozitivih živali na posameznega povzročitelja oz. dva oz. vse tri povzročitelje. Razvidno je, da so vse živali, ki so bile serološko pozitivne na A. phagocytophilum, hkrati tudi serološko pozitivne na B. divergens. Prav tako so vse živali, ki so bile serološko pozitivne na B. divergens in B. burgdorferi, hkrati tudi pozitivne na A. phagocytophilum. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 40 Slika 13: Shematski prikaz števila serološko pozitivnih živali glede na število različnih povzročiteljev po pašni sezoni (dvakratno vzorčenje 28 živali: pred in po pašni sezoni) Figure 13: Schematic representation of the number of serologically positive animals, according to the number of different pathogens after the grazing season (28 animals were sempled before and after the grazing season) 4.2 Klinično pozitivni vzorci na B. divergens S pomočjo terenskih veterinarjev nam je uspelo dobiti tudi 6 vzorcev krvi živali, ki so kazale klinične znake, značilne za okužbe z B. divergens. Slika 14: Lokacije gospodarstev s klinično pozitivnimi živalmi na babeziozo (vir: https://www.google.si/maps) Figure 14: Locations of clinically positive animals for babesiosis (source: https://www.google.com/maps) B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 41 Kar 6/6 vzorcev je bilo serološko pozitivnih na A. phagocytophilum in B. burgdorferi in 2/6 vzorcev sta bila serološko pozitivna na B. divergens. Nobena od živali ni imela povišanih levkocitov, le ena od živali je imela levkocite pod spodnjo mejo. 2/6 živali sta imeli vrednost eritrocitov pod spodnjo mejo, vendar pa so bile vrednosti eritrocitov ostalih živali v spodnji polovici normalnih vrednosti za govedo, saj je bila najvišja vrednost eritrocitov 6,3 x 1012/l. Število trombocitov je bilo pri vseh živalih znotraj normalnih vrednosti, vendar pa so bile vrednosti zelo blizu spodnje meje normalnih vrednosti za govedo. Na pobarvanih krvnih razmazih smo diagnosticirali B. divergens, ki se v eritrocitih vidi kot eozinofilne inkluzije. Inkluzije so prikazane na Sliki 15. Slika 15: B. divergens (puščice) v eritrocitih (Foto: Ošlak) Figure 15: B. divergens (arrows) in erythrocytes (Photo: Ošlak) Pri petih vzorcih smo pod mikroskopom na krvnem razmazu videli prisotnost B. divergens, pri enem od vzorcev pa nismo mogli pripraviti razmaza, saj nam je veterinar poslal le krvni serum. Prav tako smo na razmazih prešteli bele krvne celice (levkocite). Rezultati so vidni v Tabeli 13. Tabela 13: Diferencialna bela krvna slika klinično bolnih živali s sumom na B. divergens Table 13: Differential white blood count of clinically ill animals with a suspicion of B. divergens Krvni Številka razmaz ( B. vzorca SEGM. EOS. BAZO. LIMFO. MONO. PAL. divergens) 42 27 2 0 67 2 2 poz. 44 63 1 0 33 1 2 poz. 46 35 3 1 60 1 0 poz. 249 26 1 0 73 0 0 poz. 251 37 15 1 46 1 2 poz. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 42 Pri 1/6 vzorcev je vidno povišano število nevtrofilnih granulocitov (SEGM). Število eozinofilnih granulocitov (EOS) je bilo povišano pri 1/6 živalih. Število bazofilnih granulocitov (BAZO) je bilo pri vseh 6 živalih normalno. Pri eni od 6 živali je število limfocitov (LIMFO) znižano, pri dveh živalih pa povišano. Število monocitov (MONO) in paličastih nevtrofilnih granulocitov (PAL) je bilo pri vseh normalno. Za primerjavo prilagam Tabelo 14 z referenčnimi vrednostmi bele krvne slike. Tabela 14: Referenčne vrednosti parametrov bele krvne slike pri govedu Laboratorija za klinično patologijo (KRVŽ) Veterinarske fakultete Table 14: Reference values of white blood cell parameters in cattle Laboratory for clinical pathology Veterinary faculty Parameter Vrednost (%) Nevtorfilni granulociti 25–45 Eozinofilni granulociti 1–10 Bazofilni granulociti 0–2 Limfociti 45–65 Paličasti nevtorfilni granulociti 0–2 Monociti 2–8 4.3 Rezultati seroloških preiskav 291 vzorcev V tem poglavju je narejena analiza rezultatov 291 vzorcev, saj je bila 28 živalim odvzeta kri dvakrat. Vključili pa smo le rezultate drugega odvzema, saj smo se tako izognili podvajanju rezultatov. Serološko pozitivnih na A. phagocytophilum je bilo 158 živali, ena žival je bila sumljiva, na B. divergens je bilo serološko pozitivnih 63 živali, na B. burgdorferi pa je bilo serološko pozitivnih 137 živali. Hkrati je bilo na A. phagocytophilum in B. divergens serološko pozitivnih 58 živali, na A. phagocytophilum in B. burgdorferi pa je bilo serološko pozitivnih 72 živali. Na B. divergens in B. burgdorferi ni bilo serološko pozitivnih živali. Na vse tri povzročitelje je bilo pozitivnih 25 živali. Slika 16 nam prikazuje shematski prikaz serološko pozitivnih živali. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 43 Slika 16: Shematski prikaz števila serološko pozitivnih živali Figure 16: Schematic representation of the number of serologically positive animals Od 291 živali je bilo 54,64 % živali serološko pozitivnih na A. phagocytophilum, 21,65 % živali serološko pozitivnih na B. divergens in 47,08 % živali serološko pozitivnih na B. burgdorferi. Zanimiva je tudi ugotovitev, da je bilo serološko negativnih na vse povzročitelje 63 živali, samo na A. phagocytophilum je bilo serološko pozitivnih 53 živali, samo na B. divergens so bile serološko pozitivne 4 živali, samo na B. burgdorferi je bilo serološko pozitivnih 65 živali, samo na A. phagocytophilum in B. divergens je bilo serološko pozitivnih 33 živali, samo na A. phagocytophilum in B. burgdorferi je bilo serološko pozitivnih 48 živali, samo na B. divergens in B. burgdorferi ni bilo serološko pozitivnih živali. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 44 Tabela 15: Število živali, ki so bile serološko pozitivne na različne povzročitelje Table 15: Number of animals serologically positive for different pathogens Povzročitelj Število serološko pozitivnih živali na enega povzročitelja oz. na določeno kombinacijo povzročiteljev A. phagocytophilum 53 B. divergens 4 B. burgdorferi 65 A. phagocytophilum + B. divergens 33 A. phagocytophilum + B.burgdorferi 48 B. divergens + B. burgdorferi 0 A. phagocytophilum + B. divergens + B. 25 burgdorferi Število serološko negativnih živali 63 Na Sliki 17 je viden odstotek živali, ki so bile serološko negativne na vse tri povzročitelje oz. so bile serološko pozitivne le na enega izmed povzročiteljev oz. so bile serološko pozitivne le na dva oz. vse tri povzročitelje. Serološko negativnih je bilo 21,65 % živali, samo na A. phagocytophilum je bilo serološko pozitivnih 18,20 % živali, le na B. divergens je bilo serološko pozitivnih 1,38 % živali, le na B. burgdorferi je bilo serološko pozitivnih 22,34 % živali, le na A. phagocytophilum in B. divergens je bilo serološko pozitivnih 11,34 % živali, le na A. phagocytophilum in B. burgdorferi je bilo serološko pozitivnih 16,50 % živali, samo na B. divergens in B. burgdorferi ni bilo serološko pozitivnih živali in na vse tri povzročitelje je bilo 8,59 % serološko pozitivnih živali. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 45 A. phagocitophilum 18,20 % B. divergens 21,65 % 1,38 % B. burgdorferi A. phagocitophilum + B. divergens 8,59 % A. phagocitophilum + 22,34 % B.burgdorferi 0 % B. divergens + B. burgdorferi 16,50 % A. phagocitophilum + B. 11,34 % divergens + B. burgdorferi Število serološko negativnih živali Slika 17: Odstotek serološko pozitivnih živali na izključno enega oz. dva oz. vse tri povzročitelje Figure 17: The percentage of animals serologically positive exclusively on one or two or all three pathogens 4.4 Rezultati hematologije 291 vzorcev Pri vseh vzorcih smo naredili tudi hematološko preiskavo. Pri 16 vzorcih hematološke preiskave nismo mogli narediti, ker je bila krvi v EDTA epruvetah koagulirala. Pri 17/291 vzorcev smo ugotovili povišano število levkocitov, pri 3 vzorcih pa znižano število levkocitov. Od 17 vzorcev je bil en vzorec serološko negativen na vse tri povzročitelje, štirje vzorci so bili serološko pozitivni le na A. phagocytophilum, prav tako so bili štirje vzorci serološko pozitivni le na B. burgdorferi, trije vzorci pa so bili serološko pozitivni na A. phagocytophilum in B. burgdorferi, dva vzorca sta bila pozitivna na A. phagocytophilum in B. burgdorferi in trije vzorci so bili pozitivni na vse tri povzročitelje. Od treh vzorcev, ki so imeli znižano vrednost levkocitov, je bil en vzorec serološko negativen na vse tri povzročitelje, en vzorec je bil serološko pozitiven na A. phagocytophilum in B. burgdorferi in en vzorec je bil pozitiven na A. phagocytophilum in B. divergens. Pri osmih od 291 vzorcev smo ugotovili odstopanje števila eritrocitov od normalnih vrednosti. 3 živali so imele preveliko število eritrocitov, pri petih živalih pa so bile vrednosti eritrocitov prenizke. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 46 Dve od živali s povišanim številom eritrocitov sta bili serološko pozitivni na A. phagocytophilum, ena pa je bila serološko pozitivna na A. phagocytophilum in B. burgdorferi. Pri živalih z znižanim številom eritrocitov je bila ena žival serološko pozitivna na vse tri povzročitelje, tri so bile serološko pozitivne na A. phagocytophilum in B. burgdorferi in ena žival je bila serološko pozitivna na B. burgdorferi. Število trombocitov je odstopalo od normalnih vrednosti pri 30 vzorcih. Dve živali sta imeli trombocite pod spodnjo mejo, 28 živali pa je imelo trombocite nad zgornjo mejo. Za referenčne vrednosti posameznih parametrov smo uporabili vrednosti, ki jih uporabljajo v Laboratoriju za klinično patologijo (KRVŽ) Veterinarske fakultete. Vrednosti so prikazane v Tabeli 16. Tabela 16: Referenčne vrednoti hematoloških parametrov Laboratorija za klinično patologijo(KRVŽ) Veterinarske fakultete Table 16: Reference values of hematological parameters Laboratory for Clinical Pathology Veterinary faculty Parameter Enota Vrednost Eritroctit 1012/l 5,0–8,5 Hemoglobin g/dl 9,0–14,0 Hematokrit % 28–38 Levkociti 109/l 5–10 MCV fl 40–60 MHC pg 14–24 MCHC g/dl (%) 26–35 Trombociti 109/l 200–800 4.5 Geografska lokacija serološko pozitivnih živali Kot je razvidno na Sliki 18 in Sliki 20, so bila serološko pozitivna goveda na A. phagocytophilum in B. burgdorferi najdena na vseh področjih, kjer smo pobrali vzorce. Serološko pozitivna goveda na B. divergens so bila najdena predvsem na področju severnega in severno zahodnega dela Slovenije (Slika 19), kjer se pojavljajo tudi klinična obolenja. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 47 Slika 18: Lokacije gospodarstev s serološko pozitivnim govedom na A. phagocytophilum (vir: https://www.google.si/maps) Figure 18: Locations of seropositive cattle on A. phagocytophilum (source: https://www.google.com/maps) B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 48 Slika 19: Lokacije gospodarstev s serološko pozitivnim govedom na B. divergens (vir: https://www.google.si/maps) Figure 19: Locations of serologically positive cattle on B. divergens (source: https://www.google.com/maps) B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 49 Slika 20: Lokacije gospodarstev s serološko pozitivnim govedom na B. burgdorferi (vir: https://www.google.si/maps) Figure 20: Locations of holdings with serologically positive cattle on B. burgdorferi (source: https://www.google.com/maps) 4.6 Vpliv serološke pozitivnosti (Babesija, Anaplasma in Borelia) na krvno sliko krav 4.6.1 Vpliv na levkocite Pri statistični analizi vpliva serološke pozitivnosti na levkocite smo ugotovili statistično značilne razlike števila levkocitov med zdravimi živalmi in živalmi, ki so bile serološko pozitivne na A. phagocytophilum, ki so bile hkrati serološko pozitivne na A. phagocytophilum in B. divergens, ki so bile serološko pozitivne na A. phagocytophilum in B. burgdorferi, in živalmi, ki so bile serološko pozitivne na vse tri povzročitelje. Opisna statistika je zbrana v Tabeli 17. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 50 Tabela 17: Opisna statistika števila levkocitov pri serološko pozitivnih in negativnih živalih Table 17: Descriptive statistics on the number of leukocytes in serologically positive and negative animals Cou Aver Standard Coeff. of Minim Maxim Ran Stnd. Stnd. nt age deviation variation um um ge skewness kurtosis WBCHealt 60 6,99 2,07209 29,6154% 3,1 15,4 12,3 3,58096 5,40862 hy WBCAn 50 8,77 2,59108 29,5246% 3,1 18,1 15,0 3,28964 4,46482 WBCBo 60 7,77 2,34852 30,2125% 4,5 16,4 11,9 4,1532 4,27081 WBCBa 4 8,43 1,82277 21,6353% 7,0 11,1 4,1 1,41646 1,3466 WBCAnB 28 8,96 2,22834 24,8778% 3,7 12,2 8,5 -1,20941 - a 0,0448759 WBCAnB 44 8,19 2,30155 28,0988% 2,0 14,0 12,0 0,626458 1,87429 o WBCAnB 25 8,1 2,57139 31,7299% 4,2 13,4 9,2 0,979732 -0,515148 aBo Total 271 8,02 2,40368 29,9838% 2,0 18,1 16,1 5,2418 5,10089 S pomočjo Hi kvadrat testa za linearni trend smo ugotovili, da se z večanjem vrednosti levkocitov povečuje delež serološko pozitivnih živali na A. phagocytophilum glede na serološko negativne. Povezava ni linearna. Prav tako se z večanjem vrednosti levkocitov povečuje delež serološko pozitivnih živali na A. phagocytophilum in B. divergens glede na serološko negativne. Povezava ni linearna. Z večanjem vrednosti levkocitov se povečuje delež tudi serološko pozitivnih živali na A. phagocytophilum in B. burgdorferi glede na serološko negativne. Povezava je linearna. Prav tako se z večanjem vrednosti levkocitov povečuje delež serološko pozitivnih živali na vse tri povzročitelje glede na serološko negativne. Povezava je linearna. Razlike v številu levkocitov prikazuje Tabela 18. Tabela 18: Statistično značilne razlike števila levkocitov Table 18: Statistically significant differences in the number of leukocytes Contrast Difference +/- Limits WBCHealthy - WBCAn -1,77933 0,880014 WBCHealthy - WBCAnBa -1,96048 1,05182 WBCHealthy - WBCAnBo -1,19424 0,912154 WBCHealthy - WBCAnBaBo -1,10733 1,094 WBCAn - WBCBo 1,00267 0,880014 WBCBo - WBCAnBa -1,18381 1,05182 B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 51 Število levkocitov za posamezno skupino je prikazano na Sliki 21. Slika 21: Grafični prikaz števila levkocitov Figure 21: A graphical representation of leukocytes count 4.6.2 Vpliv na eritrocite Pri statistični analizi vpliva serološke pozitivnosti na eritrocite smo ugotovili statistično značilne razlike števila eritrocitov med zdravimi živalmi in živalmi, ki so bile serološko pozitivne na A. phagocytophilum, ter živalmi, ki so bile hkrati serološko pozitivne na A. phagocytophilum in B. divergens. Opisna statistika je zbrana v Tabeli 19. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 52 Tabela 19: Opisna statistika števila eritrocitov pri serološko pozitivnih in negativnih živalih Table 19: Descriptive statistics on the number of erythrocytes in seropositive and negative animals Cou Averag Standard Coeff. of Mini Maxim Rang Stnd. Stnd. nt e deviation variation mum um e skewness kurtosis RBCHea 60 6,72 0,869704 12,9359% 5,17 9,89 4,72 3,19331 3,51937 lthy RBCAn 50 7,27 1,50816 20,749% 4,68 12,36 7,68 3,23319 2,29483 RBCBo 60 6,79 0,880224 12,9626% 5,2 9,24 4,04 1,45777 -0,181247 RBCBa 4 6,47 0,508658 7,8618% 6,18 7,23 1,05 1,59558 1,56579 RBCAn 28 7,51 0,860988 11,4651% 5,62 8,84 3,22 -1,46719 -0,0430698 Ba RBCAn 44 6,61 1,1845 17,9266% 3,92 10,66 6,74 1,79821 4,06177 Bo RBCAn 25 7,06 1,32626 18,7888% 4,94 9,7 4,76 0,535281 -0,728092 BaBo Total 271 6,93 1,13829 16,4293% 3,92 12,36 8,44 5,94208 7,22221 S pomočjo Hi kvadrat testa za linearni trend smo ugotovili, da se z večanjem vrednosti eritrocitov povečuje delež serološko pozitivnih živali na A. phagocytophilum glede na serološko negativne. Povezava je linearna. Prav tako se z večanjem vrednosti eritrocitov povečuje delež serološko pozitivnih živali na A. phagocytophilum in B. divergens glede na serološko negativne. Povezava je linearna. Razlike v številu eritrocitov prikazuje Tabela 20. Tabela 20: Statistično značilne razlike števila eritrocitov Table 20: Statistically significant differences in the number of erythrocytes Contrast Difference +/- Limits RBCHealthy - RBCAn -0,545433 0,418415 RBCHealthy - RBCAnBa -0,786476 0,500101 RBCAn – RBCBo 0,4781 0,418415 RBCAn – RBCAnBo 0,6611 0,451673 RBCBo – RBCAnBa -0,719143 0,500101 RBCAnBa - RBCAnBo 0,902143 0,528241 B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 53 Število eritrocitov za posamezno skupino je prikazano na Sliki 22. 8 7,6 7,2 nae 6,8 M 6,4 6 5,6 yhtl An Bo Ba Ba Bo Bo ae BC BC BC An An Ba H R R R BC BC An BC R R R BCR Slika 22: Grafični prikaz števila eritrocitov Figure 22: A graphical representation of erythrocytes count 4.6.3 Vpliv na hemoglobin Pri statistični analizi vpliva serološke pozitivnosti na hemoglobin smo ugotovili statistično značilne razlike hemoglobina med zdravimi živalmi in živalmi, ki so bile serološko pozitivne na A. phagocytophilum in B. divergens. Opisna statistika je zbrana v Tabeli 21. Tabela 21: Opisna statistika hemoglobina pri serološko pozitivnih in negativnih živalih Table 21: Descriptive statistics of hemoglobin in serologically positive and negative animals Coun Average Standard Coeff. of Minim Maxi Ra Stnd. Stnd. t deviation variation um mum nge skewness kurtosis HGBHealt 60 10,2333 1,23737 12,0915% 7,6 13,3 5,7 0,930233 -0,29836 hy HGBAn 50 10,634 1,30033 12,2281% 7,8 14,0 6,2 0,0730191 0,186662 HGBbo 60 10,3733 1,31753 12,7011% 7,5 14,0 6,5 1,92953 0,775555 HGBBa 4 9,425 0,464579 4,92922% 9,0 10,0 1,0 0,458035 -1,0117 HGBAnBa 28 11,0929 1,47997 13,3417% 8,4 14,2 5,8 0,796121 -0,463908 HGBAnBo 44 10,1818 1,2926 12,6952% 6,5 12,4 5,9 -1,61317 0,34182 HGBAnBa 25 10,704 1,19215 11,1375% 8,6 13,2 4,6 0,481227 -0,775804 Bo Total 271 10,4502 1,31481 12,5817% 6,5 14,2 7,7 1,60919 0,361199 S pomočjo Hi kvadrat testa za linearni trend smo ugotovili, da se z večanjem vrednosti hemoglobina povečuje delež serološko pozitivnih živali na A. phagocytophilum in B. divergen glede na serološko negativne. Povezava je linearna. Razlike v količini hemoglobina prikazuje Tabela 22. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 54 Tabela 22: Statistično značilne razlike koncentracije hemoglobina Table 22: Statistically significant differences in hemoglobin concentration Contrast Difference +/- Limits HGBHealthy - HGBAnBa -0,859524 0,582663 HGBbo - HGBAnBa -0,719524 0,582663 HGBBa - HGBAnBa -1,66786 1,36081 HGBAnBa - HGBAnBo 0,911039 0,615449 Vrednosti hemoglobina za posamezno skupino so prikazane na Sliki 23. 11,5 11 10,5 nae 10 M 9,5 9 8,5 y n o a a o o htl A b B B B B a B B B n n a e G G G A A B H H H H B B n B G G A G H H B H GH Slika 23: Grafični prikaz vrednosti hemoglobina Figure 23: Graphical presentation of hemoglobin values 4.6.4 Vpliv na hematokrit Pri statistični analizi vpliva serološke pozitivnosti na hematokrit smo ugotovili statistično značilne razlike hematokrita med zdravimi živalmi in živalmi, ki so bile serološko pozitivne na A. phagocytophilum in B. divergens. Opisna statistika je zbrana v Tabeli 23. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 55 Tabela 23: Opisna statistika hematokrita pri serološko pozitivnih in negativnih živalih Table 23: Descriptive statistics of hematocrit in serologically positive and negative animals Cou Average Standard Coeff. of Minim Maxim Ran Stnd. Stnd. nt deviation variation um um ge skewness kurtosis HCTHeal 60 30,865 4,05633 13,1422% 22,7 40,5 17,8 1,08307 -0,435062 thy HCTAn 50 32,44 4,57634 14,1071% 22,4 44,8 22,4 0,250092 0,178651 HCTBo 60 31,4133 4,61664 14,6964% 22,3 45,4 23,1 2,71777 1,51796 HCTBa 4 28,6 1,90613 6,66479% 26,9 30,3 3,4 0,0 -2,43826 HCTAnB 28 33,7607 4,32087 12,7985% 25,0 43,2 18,2 0,541054 -0,0220258 a HCTAnB 44 30,6477 4,35172 14,1991% 17,8 37,9 20,1 -2,62662 1,69096 o HCTAnB 25 32,808 3,77888 11,5182% 26,1 39,8 13,7 0,239098 -0,888559 aBo Total 271 31,6867 4,40426 13,8994% 17,8 45,4 27,6 1,33032 1,2991 S pomočjo Hi kvadrat testa za linearni trend smo ugotovili, da se z večanjem vrednosti hemoglobina povečuje delež serološko pozitivnih živali na A. phagocytophilum in B. divergens glede na serološko negativne. Povezava je linearna. Razlike hematokrita prikazuje Tabela 24. Tabela 24: Statistično značilne razlike hematokrita Table 24: Statistically significant differences in hematocrit Contrast Difference +/- Limits HCTHealthy - HCTAnBa -2,89571 1,94669 HCTAn - HCTAnBo 1,79227 1,75818 HCTBo - HCTAnBa -2,34738 1,94669 HCTBa - HCTAnBa -5,16071 4,5465 HCTAnBa - HCTAnBo 3,11299 2,05623 HCTAnBo - HCTAnBaBo -2,16027 2,13029 B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 56 Vrednosti hematokrita za posamezno skupino so prikazane na Sliki 24. 35 33 31 naeM 29 27 25 yhtl An Bo Ba Ba Bo Bo a T T T e C C C An An Ba H H H H T T T C C AnT C H H C H H Slika 24: Grafični prikaz vrednosti hematokrita Figure 24: Graphical presentation of hematocrit values 4.6.5 Vpliv na MCV Pri statistični analizi vpliva serološke pozitivnosti na MCV nismo ugotovili statistično značilne razlike MCV med zdravimi in serološko pozitivnimi živalmi. Opisna statistika je zbrana v Tabeli 25. Tabela 25: Opisna statistika MCV pri serološko pozitivnih in negativnih živalih Table 25: Descriptive MCV statistics for serologically positive and negative animals Coun Average Standard Coeff. of Minimu Maxim Ran Stnd. Stnd. t deviation variation m um ge skewness kurtosis MCVHeal 60 46,2 5,34187 11,5625% 34,0 59,0 25,0 0,164905 0,162372 thy MCVAn 50 45,38 5,95181 13,1155% 35,0 61,0 26,0 0,476614 -0,672283 MCVBo 60 46,35 4,25391 9,1778% 39,0 55,0 16,0 0,727055 -1,33884 MCVBa 4 44,25 3,20156 7,23517% 42,0 49,0 7,0 1,52396 1,47756 MCVAnB 28 45,1429 5,51573 12,2184% 34,0 55,0 21,0 -0,0863259 -0,629067 a MCVAnB 44 46,9318 5,91961 12,6132% 33,0 62,0 29,0 0,0894451 0,408188 o MCVAnB 25 47,36 6,56937 13,8711% 37,0 61,0 24,0 0,263868 -0,999033 aBo Total 271 46,1697 5,45018 11,8046% 33,0 62,0 29,0 0,797169 -0,674159 B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 57 Vrednosti MCV za posamezno skupino so prikazane na Sliki 25. 50 48 46 naeM 44 42 40 y n o a a o o htl A B B B B B a V V V n n a e C C C A A B H n M M M V V V C C A C M M VC M M Slika 25: Grafični prikaz vrednosti MCV Figure 25: Graphical display of MCV values 4.6.6 Vpliv na MCH Pri statistični analizi vpliva serološke pozitivnosti na MCH nismo ugotovili statistično značilne razlike MCH med zdravimi in serološko pozitivnimi živalmi. Opisna statistika je zbrana v Tabeli 26. Tabela 26: Opisna statistika števila MCH pri serološko pozitivnih in negativnih živalih Table 26: Descriptive statistics on the number of MCH in serologically positive and negative animals Coun Average Standard Coeff. of Minimu Maximu Rang Stnd. Stnd. t deviation variation m m e skewness kurtosis MCHHealt 60 15,305 1,73756 11,3529% 11,3 19,2 7,9 0,400231 -0,276353 hy MCHAn 50 14,948 2,20401 14,7445% 11,1 21,3 10,2 0,68173 -0,0149271 MCHBo 60 15,3567 1,40246 9,1326% 12,8 18,5 5,7 0,87409 -1,03852 MCHBa 4 14,575 0,699405 4,79866% 13,8 15,5 1,7 0,517283 0,704103 MCHAnBa 28 14,8179 1,95941 13,2233% 11,2 18,3 7,1 0,028469 -0,690445 MCHAnBo 44 15,6341 1,98821 12,7172% 10,9 20,5 9,6 -0,101901 0,339611 MCHAnBa 25 15,488 2,26887 14,6492% 11,5 20,0 8,5 0,0714649 -1,07898 Bo Total 271 15,2598 1,87697 12,3001% 10,9 21,3 10,4 0,636029 -0,346429 B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 58 Vrednost MCH za posamezno skupino so prikazana na Sliki 26. 33,8 33,5 33,2 nae 32,9 M 32,6 32,3 32 yhtl An Bo Ba Ba Bo Bo a C C C e H H H An An Ba H C C C C C An C M M M H H C H C C H C M M C M M Slika 26: Grafični prikaz vrednosti MCH Figure 26: Graphical display of the MCH values 4.6.7 Vpliv na MCHC Pri statistični analizi vpliva serološke pozitivnosti na MCHC smo ugotovili statistično značilne razlike MCHC med zdravimi živalmi in živalmi, ki so bile serološko pozitivne na vse tri povzročitelje. Opisna statistika je zbrana v Tabeli 27. Tabela 27: Opisna statistika MCHC pri serološko pozitivnih in negativnih živalih Table 27: Descriptive MCHC statistics for serologically positive and negative animals Cou Average Standard Coeff. of Minim Maxim Ran Stnd. Stnd. nt deviation variation um um ge skewness kurtosis MCHCHe 60 33,16 0,733508 2,21203% 31,7 35,2 3,5 1,31462 0,681439 althy MCHCAn 50 32,894 1,07578 3,27046% 30,5 35,7 5,2 -0,540142 0,4678 MCHCBo 60 33,1183 0,892434 2,69468% 30,5 34,8 4,3 -2,33931 1,07635 MCHCBa 4 33,0 0,83666 2,53533% 31,8 33,7 1,9 -1,22685 0,985628 MCHCAn 28 32,8036 0,849611 2,59% 31,0 34,8 3,8 1,02284 0,644369 Ba MCHCAn 44 33,3273 1,35155 4,05538% 31,5 39,5 8,0 7,12148 13,1686 Bo MCHCAn 25 32,632 0,838511 2,5696% 31,0 34,3 3,3 -0,272653 -0,165665 BaBo Total 271 33,041 0,989042 2,99338% 30,5 39,5 9,0 6,9439 22,5199 B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 59 S pomočjo Hi kvadrat testa za linearni trend smo ugotovili, da se z večanjem vrednosti hemoglobina povečuje delež serološko pozitivnih živali na vse tri povzročitelje glede na serološko negativne. Povezava je linearna. Razlike količine hemoglobina prikazuje Tabela 28. Tabela 28: Statistično značilne razlike števila MCHC Table 28: Statistically significant differences in the number of MCHCs Contrast Difference +/- Limits MCHCHealthy - MCHCAnBaBo 0,528 0,45835 MCHCAn - MCHCAnBo -0,433273 0,398002 MCHCBo - MCHCAnBaBo 0,486333 0,45835 MCHCAnBa - MCHCAnBo -0,523701 0,465472 MCHCAnBo - MCHCAnBaBo 0,695273 0,482238 Vrednost hemoglobina za posamezno skupino je prikazano na Sliki 27. 33,8 33,5 33,2 nae 32,9 M 32,6 32,3 32 yhtl An Bo Ba Ba Bo Bo a C C C e H H H An An Ba H C C C C C An C M M M H H C H C C H C M M C M M Slika 27: Grafični prikaz vrednosti MCHC Figure 27: Graphical representation of MCHC values 4.6.8 Vpliv na trombocite Pri statistični analizi vpliva serološke pozitivnosti na število trombocitov smo ugotovili statistično značilne razlike števila trombocitov med zdravimi živalmi in živalmi, ki so bile serološko pozitivne na A. phagocytophilum in B. burgdorferi, in živalmi, ki so bile pozitivne na vse tri povzročitelje. Opisna statistika je zbrana v Tabeli 29. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 60 Tabela 29: Opisna statistika števila trombocitov pri serološko pozitivnih in negativnih živalih Table 29: Descriptive statistics on the number of platelets in seropositive and seronegative animals Cou Average Standard Coeff. of Minim Maxim Range Stnd. Stnd. nt deviation variation um um skewness kurtosis PLTHealt 60 549,083 230,623 42,0014% 99,0 1151,0 1052,0 -0,458259 -0,15967 hy PLTAn 50 569,64 323,574 56,8033% 92,0 1703,0 1611,0 3,41767 3,6623 PLTBo 60 485,883 192,481 39,6146% 93,0 1115,0 1022,0 0,877926 1,56513 PLTBa 4 449,0 225,281 50,1738% 132,0 664,0 532,0 -1,02834 0,962664 PLTAnB 28 467,75 215,806 46,137% 101,0 861,0 760,0 0,288943 -0,733883 a PLTAnB 44 441,045 229,283 51,9863% 113,0 956,0 843,0 1,28474 -0,681288 o PLTAnB 25 389,36 301,354 77,3973% 99,0 1577,0 1478,0 5,47998 9,96998 aBo Total 271 496,727 252,385 50,8097% 92,0 1703,0 1611,0 6,37773 9,05317 S pomočjo Hi kvadrat testa za linearni trend smo ugotovili, da se z večanjem vrednosti hemoglobina povečuje delež serološko pozitivnih živali na A. phagocytophilum in B. burgdorferi glede na serološko negativne. Povezava ni linearna. Prav tako se z večanjem vrednosti eritrocitov povečuje delež serološko pozitivnih živali na vse tri povzročitelje glede na serološko negativne. Povezava je linearna. Razlike števila trombocitov prikazuje Tabela 30. Tabela 30: Statistično značilne razlike števila trombocitov Table 30: Statistically significant differences in the number of platelets Contrast Difference +/- Limits PLTHealthy - PLTAnBo 108,038 97,119 PLTHealthy - PLTAnBaBo 159,723 116,481 PLTAn - PLTAnBo 128,595 101,144 PLTAn - PLTAnBaBo 180,28 119,858 B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 61 Vrednost hemoglobina za posamezno skupino je prikazano na Sliki 28. 670 570 nae 470 M 370 270 y n o a a o o htl A B B B B B a T T T n n a e L L L A A B H P P P T T n T L L A L P P T P LP Slika 28: Grafični prikaz števila trombocitov Table 28: A graphical representation of platelet count B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 62 5 RAZPRAVA V tej raziskovalni nalogi smo dokazali prisotnost A. phagocytophilum pri pašnem govedu v Sloveniji. Na A. phagocytophilum je bilo serološko pozitivnih 158 živali, kar predstavlja 54,64 % vzorčenih živali. Samo na A. phagocytophilum je bilo pozitivnih 53 živali, kar predstavlja 18,2 % vzorčenih živali. Odstotek serološko pozitivnega goveda je v primerjavi s serološko pozitivnostjo psov, ki jo je preiskovala Ravnik (2012) (73,8 %) v svoji doktorski disertaciji, nižji. Prav tako je odstotek serološko pozitivne divjadi, ki so ga v svoji raziskavi ugotovili Petrovec s sodelavci (2002) (74 %) ter Žele s sodelavci 2012 (72 %), višji. Razlika med deležem serološko pozitivnih psov in serološko pozitivnih goved je lahko posledica manjšega števila vzorčenih goved. Možnost razlike v deležu lahko izvira tudi iz tega, da so v disertaciji bili zajeti pacienti Klinike za male živali VF, ki so bili testirani na A. phagocytophilum. Ti pacienti so verjetno na Kliniko za male živali VF prišli zaradi nekega razloga, ki je lahko tudi bolezen, mi pa smo vzorčili naključno govedo. Razlika med deležem serološko pozitivnih goved in divjadi najverjetneje izhaja iz tega, da divjad živi v gozdovih in na obrobju gozdov, kjer je več podrastja, na katerem najdemo klope. Prav tako je divjad ves čas svojega življenja v naravi, kar pomeni daljšo izpostavljenost klopom. Večina goveda se pase od pozne pomladi do jeseni. Nekatere kmetije govedo čez noč vhlevijo, kar zmanjša čas možnega kontakta s klopi. Serološka pozitivnost goveda nam nakazuje, da so na področjih, kjer se pase govedo, prisotni okuženi klopi, ki predstavljajo nevarnost okužbe tudi za ljudi. Prisotnost protiteles proti A. phagocytophilum nam dokazuje, da je govedo v nekem obdobju bilo v kontaktu s klopom, ki je bil okužen s A. phagocytophilum, vendar točnega časovnega obdobja ne moremo določiti (Kybicova, 2010). Trdimo lahko, da je večja nevarnost ponovne okužbe goveda oz. okužbe ljudi s A. phagocytophilum na Robnikovi planini, saj je tekom paše 17 živali razvilo protitelesa proti A. phagocytophilum, 10 živali pa je bilo pozitivnih že pred začetkom paše. Večina kmetov ne izvaja vsakodnevne kontrole na invadiranost živali s klopi, prav tako je zelo težko na odlakani koži videti klope ob začetku parazitiranja. Klopi postanejo opazni šele, ko se napijejo krvi. Ta čas zadošča, da se iz klopov, okuženih z A. phagocytophilum, le-ta prenese na govedo. Iz tega lahko sklenemo, da se obolenja za HGA pri ljudeh pojavljajo redkeje, saj smo ljudje veliko bolj pozorni na morebitni ugriz klopa in ga po navadi B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 63 odstranimo hitro, kar zmanjša možnost vstopa A. phagocytophilum v človeka (Fritz in Kjemtrup, 2003). Prav tako smo dokazali prisotnost B. divergens pri pašnem govedu v Sloveniji. Serološko je bilo pozitivnih 63 živali, od katerih sta dve kravi kazali klinično sliko. Ker je za razvoj klinične slike potrebnih vsaj 103 parazitov, do pojava obolenja ne pride tako pogosto (Zintl in sod., 2003). Živali so kazale klinična znamenja babezioze, kot jih navaja tudi literatura (Demessie in Derso, 2015; Zintl in sod., 2003). Na pojav obolenja z B. divergens vplivata tudi sam imunski status in splošno stanje živali. Pri vseh 6 živali, ki so kazale klinično obliko obolenja, smo ugotovili istočasno serološko pozitivnost na A. phagocytophilum in B. burgdorferi. Ta fenomen opisujejo tudi avtorji (Ravnik, 2012; Stuen, 2013). Sicer nam serološka pozitivnost ne pomaga pri določitvi časovnega okvira, v katerem je bila žival v kontaktu s povzročiteljem, vendar bi lahko hkratna okužba z drugimi povzročitelji, kot sta A. phagocytophilum in B. burgdorferi, dodatno obremenila imunski sistem in pripomogla nastanku klinične slike. Na drugi strani pa nam dvakratno vzorčenje 28 živali kaže, da kljub temu, da je kar 8 živali v pašni sezoni pridobilo protitelesa proti vsem trem povzročiteljem, ni nobena od živali kazala klinične slike (Demessie in Derso, 2015). V raziskavi smo tudi potrdili uporabnost postavitve diagnoze s pomočjo krvnega razmaza. S svetlobnim mikroskopom smo na pripravljenih razmazih klinično pozitivnih živali lahko videli številne babezije v eritrocitih. Pri nekaterih vzorcih smo videli več babezij v vsakem vidnem polju, pri drugih manj. V primeru nejasnosti pojava ˝krvavega˝ urina je pregled krvnega razmaza ena izmed zelo uporabnih metod izključevanja oz. potrditve diferencialnih diagnoz. S to raziskavo smo potrdili tudi prisotnost B. burgdorferi pri govedu v Sloveniji. Prisotnost B. burgdorferi pri govedu v Sloveniji je že potrdil Borko v svoji doktorski disertaciji leta 1999. V svoji raziskavi je po zaključku pašne sezone s pomočjo IIF leta 1996 ugotovil 59,6- odstotno serološko pozitivnost goveda in leta 1997 49,4-odstotno pozitivnost goveda. V naši raziskavi je bilo 47,08 % serološko pozitivnih goved, kar je zelo blizu odstotku iz leta 1997 (Borko,1999). Naši rezultati pri dvakratnem vzorčenju 28 živali kažejo velik porast seropozitivnosti. Pred pašo je bilo v naši raziskavi serološko pozitivno na B. burgdorferi 1/28 goved (3,57 %), po paši pa 12/28 goved (42,86 %). Pri Borku (1999) so bili rezultati naslednji: spomladi 1996 je ugotovil 36,6-odstotno serološko pozitivnost, jeseni 59,6 % B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 64 pozitivnih, leta 1997 pred pašo 29,4 % serološko pozitivnih, v jeseni pa 49,4-odstotno serološko pozitivnost. Serološka pozitivnost pred pašo se med našo in Borkovo (1999) raziskavo močno razlikuje, vendar je število vzorcev naše raziskave bistveno manjše. Rezultati serološke pozitivnosti v jeseni pa se razlikujejo bistveno manj. Na osnovi pobranih 291 vzorcev in na osnovi rezultatov doktorske disertacije Borka lahko rečemo, da je v Slovenji serološka pozitivnost goveda na B. burgdorferi nekje okoli 50 %, iz česar lahko sklepamo, da je stopnja okuženosti klopov z B. burgdorferi po Sloveniji visoka. Iz podatkov NIJZ je razvidno, da obstaja visoka verjetnost okužbe tudi pri ljudeh. Podatki iz leta 2015 kažejo, da je za boreliozo obolelo 3742 ljudi, leto pred tem 3890 in leta 2013 6938 (Sočan in sod., 2016). V raziskavi smo tudi ugotovili statistično značilen vpliv serološke pozitivnosti na vrednosti hematoloških parametrov. Serološka pozitivnost ima največji vpliv na število levkocitov. Prav tako je serološka pozitivnost vplivala na vrednosti eritrocitov, hematokrita, hemoglobina, MCHC in trombocitov. Na vrednosti so lahko vplivali tudi drugi dejavniki, kot so okužbe z drugimi povzročitelji, poškodbe, stres, nadmorska višina. V raziskavi teh možnosti nismo upoštevali. Študij, ki bi povezovale vpliv serološke pozitivnosti omenjenih povzročiteljev na hematološke vrednosti, v svetovni literaturi nismo našli. Zelo zanimive bi lahko bile ugotovitve serološke pozitivnosti goveda glede na nadmorsko višino pašnikov, kjer se je govedo paslo. Tako bi lahko postavili okvirno nadmorsko višino, na kateri se pojavljajo določeni povzročitelji. Prav tako bi bil zanimiv podatek, koliko od 291 živali je bilo pozitivnih na antigen oz. ali so bile vse živali, ki so bile serološko negativne, tudi antigensko negativne, in koliko živali, ki so bile serološko pozitivne je bilo tudi antigensko pozitivnih, kar je cilj naših nadaljnjih raziskav. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 65 6 SKLEPI 6.1 Delovne hipoteze Hipoteza 1: Okužbe z Anaplasma phagocytophilum so prisotne pri govedu v Sloveniji. V raziskovalni nalogi smo potrdili hipotezo, da so okužbe z Anaplasma phagocytophilum pri pašnem govedu v Sloveniji prisotne, saj je bilo 158 živali serološko pozitivnih, ena žival pa je bila sumljiva. Hipoteza 2: Okužbe z Babesia divergens so prisotne pri govedu v Sloveniji. Prav tako smo v raziskovalni nalogi potrdili hipotezo, da so okužbe z Babesia divergen pri pašnem govedu v Sloveniji prisotne , saj je bilo 63 živali serološko pozitivnih. Hipoteza 3: Okužbe z Borrelia burgdorferi s.l. so prisotne pri govedu v Sloveniji. S to raziskavo smo potrdili tudi hipotezo, da so okužbe z Borrelia burgdorferi s.l. pri pašnem govedu v Sloveniji prisotne, saj je bilo137 živali serološko pozitivnih. Hipoteza 4: Pojavnost povzročiteljev je enakomerna po celotni Sloveniji. V raziskovalni nalogi smo ugotovili, da je serološko pozitivno govedo na A. phagocytophilum in B. burgdorferi najdeno po celotni Sloveniji, za razliko od Babesia divergens, ki se pojavlja na področju severne in severozahodne Slovenije. Hipoteza 5: Serološka pozitivnost goveda na Anaplasma phagocytophilum ali Babesia divergens ali Borrelia burgdorferi s.l. vpliva na hematološke vrednosti živali. V raziskavi smo ugotovili, da serološka pozitivnost goveda na preiskovane povzročitelje statistično značilno vpliva na levkocite, eritrocite, hematokrit, hemoglobin, MCHC in trombocite. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 66 6.2 Drugi sklepi • V Sloveniji se pojavljajo klinična obolenja, ki jih povzroča Babesia divergens. • Krvni razmaz služi kot dobra diagnostična metoda za potrditev invazije z Babesia divergens pri klinično obolelih živalih. • Na Robnikovi planini je visoka stopnja okuženosti klopov z Anaplasma phagocytophilum, Babesia divergens in Borrelia burgdorferi. • V Sloveniji so klopi okuženi z Anaplasma phagocytophilum, Babesia divergens in Borrelia burgdorferi in predstavljajo potencialno nevarnost za ljudi in živali. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 67 7 POVZETEK Anaplazmoza (povzročitelj: Anaplasma phagocytophilum), babezioza (povzročitelj: Babesia divergens) in borelioza (povzročitelj: Borrelia burgdorferi s.l. ) so s klopi prenosljive vektorske bolezni goveda. Vse tri okužbe se pojavljajo v širokem spektru gostiteljev, tudi pri ljudeh. Okužbe z A. phagocytophilum in B. burgdorferi s.l. potekajo pri govedu asimptomatsko ali nespecifično, zato jih težko diagnosticiramo brez posebnih laboratorijskih testov. Pri živalih, okuženih z A. phagocytophilum, zasledimo več različnih kliničnih znakov. Pri vseh sesalcih, ki razvijejo klinično obliko bolezni, zaznamo nenadno povišanje telesne temperature (> 41 °C). Drugi klinični znaki domačih prežvekovalcev, ki so okuženi z A. phagocytophilum, so: anoreksija, otopelost, nenadno znižanje prireje mleka, abortusi pri ovcah, zmanjšana plodnost ovnov in zmanjšan prirast. Pri živalih, okuženih z B. burgdorferi s.l. , se po navadi pojavita šepanje in oteklost sklepov, lahko pa tudi hujšanje, eritem, otekle noge in strma stoja. B. divergens pogosto povzroča klinično bolezen in jo zato lažje prepoznamo. Klinični znaki pri okužbi z Babesia spp. so naslednji: povišana telesna temperatura (tudi do 41 °C), izguba apetita, neaktivnost vampa, oteženo in pospešeno dihanje, depresija, slabo počutje, hujšanje, progresivna hemolitična anemija, ikterus, hemoglobinurija, pospešen srčni utrip, težave z očmi in zmanjšanje mlečnosti. Sluznice so lahko blede in rumenkaste. Urin je rdeče do kavne barve. V raziskavi smo ugotavljali prisotnost protiteles proti A. phagocytophilum, B. divergens in B. burgdorferi pri pašnem govedu. Naša glavna cilja sta bila potrditev okužb pašnega goveda z različnih koncev Slovenije z omenjenimi povzročitelji s pomočjo serološke diagnostike in preučevanje povezave med rezultati seroloških preiskav ter hematološkimi vrednostmi pri živalih v raziskavi. Skupno smo pregledali kri in serum 291 govedi. Zbrali smo tudi 6 vzorcev goveda s klinično sliko, ki se pojavlja pri okužbah z B. divergens. Zbrane vzorce smo analizirali na hematološke parametre in testirali na prisotnost specifičnih IgG z indirektno imunofluorescenco. Rezultate smo obdelali z opisno statistiko, z ANOVA testom in s Hi-kvadrat testom. Statistično značilnost smo pripisali rezultatom, pri katerih je bil p < 0,05. 158/291 (54,64 %) živali je bilo serološko pozitivnih na A. phagocytophilum, 63/291 (21,65 %) živali je bilo serološko pozitivnih na B. divergens, 137/291 (47,08 %) živali pa je bilo serološko pozitivnih na B. burgdorferi. 58/291 (19,93 %) živali je bilo hkrati serološko B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 68 pozitivnih na A. phagocytophilum in B. divergens, 72/291 (24,74 %) živali je bilo hkrati serološko pozitivnih na A. phagocytophilum in B. burgdorferi ter 25/291 (8,59 %) je bilo serološko pozitivnih na vse tri povzročitelje hkrati. Pri statistični analizi vpliva serološke pozitivnosti na hematološke parametre smo ugotovili značilne vplive na: levkocite: z večanjem vrednosti levkocitov se povečuje delež serološko pozitivnih živali) med zdravimi živalmi in živalmi, ki so bile serološko pozitivne na A. phagocytophilum, vključno s tistimi, ki so bile hkrati seropozitivne tudi na druga dva povzročitelja; eritrocite: z večanjem vrednosti eritrocitov se povečuje delež serološko pozitivnih živali med zdravimi živalmi in živalmi, ki so bile serološko pozitivne na A. phagocytophilum, ter tistimi, ki so bile hkrati serološko pozitivne na A. phagocytophilum in B. divergens; hemoglobin: z večanjem vrednosti hemoglobina se povečuje delež serološko pozitivnih živali med zdravimi živalmi in živalmi, ki so bile serološko pozitivne na A. phagocytophilum in B. divergens; hematokrit: z večanjem vrednosti hemoglobina se povečuje delež serološko pozitivnih živali med zdravimi živalmi in živalmi, ki so bile serološko pozitivne na A. phagocytophilum in B. divergens; MCHC: z večanjem vrednosti hemoglobina se povečuje delež serološko pozitivnih živali med zdravimi živalmi in živalmi, ki so bile serološko pozitivne na vse tri povzročitelje; trombocite: z večanjem vrednosti trombocitov se povečuje delež serološko pozitivnih živali med zdravimi živalmi in živalmi, ki so bile serološko pozitivne na A. phagocytophilum in B. burgdorferi, ter živalmi, ki so bile pozitivne na vse tri povzročitelje. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 69 8 ZAHVALA Iskreno se zahvaljujem mentorju izr. prof. dr. Jožetu Stariču in somentorju dr. Igorju Gruntarju za vse strokovne nasvete, pomoč, prijaznost in potrpežljivost. Doc. dr. Marku Cincoviću iz Univerze v Novem Sadu za pomoč pri statistični obdelavi podatkov. Mag. Giti Grecs Smole za ponovni pregled literature in popravke. Zahvaljujem se zaposlenim v Laboratoriju za klinično patologijo (KRVŽ) Veterinarske fakultete v Ljubljani za pomoč pri izvedbi hematoloških preiskav krvnih vzorcev, še posebno Bernardi Oblak za pripravo evidenc pobranih vzorcev in organizacijo. Zahvaljujem se Inštitutu za mikrobiologijo in parazitologijo Veterinarske fakultete v Ljubljani za izvedena serološka testiranja, še posebno Alenki Magdaleni Usenik, za prijaznost in pomoč. Zahvaljujem se vsem veterinarskim postajam, ki so sodelovale pri organizaciji zbiranja vzorcev in tako pripomogle k uspešni izvedbi raziskave. To so: - Šekli & Kukovica veterinarska ambulanta, d. o. o. - Veterina Kamnik, d. o .o., - Veterina Mozirje, d. o. o., - Veterina Novo Mesto, d.o.o., - Veterinarska ambulanta Žužemberk, - Veterinarska ambulanta Idrija, d. o. o., - Veterinarska ambulanta Tolmin, d. o. o., - Veterinarska ambulanta Vinko Pristov, s. p., - Veterinarska postaja Konjice, d. o. o., - Veterinarska postaja Postojna, - Veterinarska praksa Tenetiše, d. o. o., - ZVC Lipej – Šerbec, d. o. o. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 70 Zahvaljujem se tudi vsem kmetom, ki so dovoli odvzem krvi njihovim živalim in tako omogočili izvedbo raziskave. Zahvaljujem se družini in prijateljem za razumevanje, potrpežljivost, dobro voljo in nesebično podporo. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 71 9 LITERATURA Atif FA. Anaplasma marginale and Anaplasma phagocytophilum: rickettsiales pathogens of veterinary and public health significance. Parasitol Res 2015; 114(11): 3941–57. Bakken JS, Dumler JS. Clinical diagnosis and treatment of human granulocytotropic anaplasmosis. Ann N Y Acad Sci 2006; 1078: 236–47. Bock R, Jackson L, De Vos A, Jorgensen W. Babesiosis of cattle. Parasitology 2004; 129: S247–69. Borko Č. Humoralni imunski odziv goveda po naravnem in poskusnem stiku z bakterijo Borrelia burgdorferi s.l. Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Veterinarska fakulteta, 1999. Doktorska disertacija Criado-Fornelio A, Martinez-Marcos A, Buling-Sarana A, Barba-Carretero JC. Molecular studies on Babesia, Theileria and Hepatozoon in southern Europe Part II Phylogenetic analysis and evolutionary history.Vet Parasitol 2003; 114: 173–94. Demessie Y, Derso S. Tick borne hemoparasitic diseases of ruminants: a review. Adv Biol Res 2015; 9(4): 210–24. Fritz LC, Kjemtrup AM. Zoonosis update: Lyme borreliosis. J Am Vet Med Assoc 2003; 223: 1261–70. Garnham PCC, Bray RS. The susceptibility of the higher primates to piroplasms. J Protozool 1959; 6: 352–5. Gocke HI, Woldehiwet Z. Lymphocyte responses to mitogens and rickettsial antigens in sheep experimentally infected with Ehrlichia (Cytoecetes) phagocytophila. Vet Parasitol 1999; 83: 55–64. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 72 Gray JS, Khal O, Lane RS, Stanek G. Lyme borreliosis biology, epidemiology, and control: history and characteristic of Lyme borreliosis. Wallingford: CABI International, 2002: 1–28 Gray JS, Zintl A, Hildebrandt A, Hunfeld KP, Weiss L. Zoonotic babesiosis: overview of the disease and novel aspects of pathogen identity. Ticks Tick Borne Dis 2010; 1(1): 3–10. Henniger T, Henniger P, Grossmann T, Distl O, Ganter M, Von Loewenich FD. Congenital infection with Anaplasma phagocytophilum in a calf in northern Germany. Acta Vet Scand 2013; 55: e38 (4 str.) https://actavetscand.biomedcentral.com/articles/10.1186/1751-0147-55-38 (22. 6. 2017) Homer MJ, Aguilar Delfin I, Telford SR, Krause PJ, Persing DH. Babesiosis. Clin Microbiol Re 2000; 13: 451–69. Jahfari S, Coipan EC, Fonvile M at al. Circulation of four Anaplasma phagocytophilum ecotypes in Europe. Parasit Vectors 2014; 7: e365 (11str.) https://parasitesandvectors.biomedcentral.com/articles/10.1186/1756-3305-7-365 (13. 7. 2017) Kybicová K . Borrelia burgdorferi sensu lato and Anaplasma phagocytophilum in the Czech Republic. Prague: Charles University, Faculty of Science, 2010. Doktorska disertacija Lotric Furlan S, Rojko T, Petrovec M, Avsic-Zupanc T, Strle F. Epidemiological, clinical and laboratory characteristics of patients with human granulocytic anaplasmosis in Slovenia. Wien Klin Wochenschr 2006; 118(21/22): 708–13. Margos G, Vollmer SA, Ogden SH, Fish D. Population genetics, taxonomy, phylogeny and evolution of Borrelia burgdorferi sensu lato. Infect Genet Evol 2011; 11(7): 1545–63. Moro MH, David CS, Magera JM, Wettstein PJ, Barthold SW, Persing DH. Differential effects of infection with a Babesia-like piroplasm, WA1 in inbred mice. Infect Immun 1998; 66: 492–8. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 73 OIE. Bovine anaplasmosis. In: Manual of diagnostic tests and vaccines foe terrestrial animals. Paris: Office International des Epizooties, 2015: Chapter 2.4.1. (15 str.) http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.04.01_BOVINE_ANAPLA SMOSIS.pdf (23. 6. 2017) Petrovec M, Bidovec A, Sumer JW, Avsic Zupanc T. Infection with Anaplasma phagocytophila in cervids from Slovenia: evidence of two genotypic lineages. Wien Klin Wochenschr 2002; 114(13/14): 641–7. Petzke M, Schwartz I. Borrelia burgdorferi pathogenesis and the immune response. Clin Lab Med 2015; 35: 745–64. Ravnik U. Patogeneza in imunski odziv pri naravni okužbi psov z bakterijo Anaplasma phagocytophilum. Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Veterinarska fakulteta, 2012. Doktorska disertacija Rojko T, Ursic T, Avisc Zupanc T, Petrovec M Strle F, Lotric Furan S. Seroprevalence of human anaplasmosis in Slovene forestry workers. Ann NY Acad Sci 2006; 1078: 92–4. Skrabalo Z, Deanovic Z. Piroplasmosis in man: report of a case. Doc Med Geogr Trop 1957; 9: 11–6. Sočan M, Blaško Markič M, Grgič Vitek M. Bolezni, ki jih prenašajo členonožči in hemoragične mrzlice. Lymska borelioza. In: Epidemiološko spremljanje nalezljivih bolezni v Sloveniji v letu 2015. Ljubljana: Nacionalni inštitut za javno zdravje, 2016: e79–81, pogl. 2.4. http://www.nijz.si/sites/www.nijz.si/files/datoteke/epidemiolosko_spremljanje_nb_v_letu_20 15.pdf (23. 6. 2017) Stuen S, Granquist EG, Silaghi C. Anaplasma phagocytophilum: a widespread multi-host pathogen with highly adaptive strategies. Front Cell Infect Microbiol 2013; 3: e31 (39 str.) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3717505/ (23. 6. 2017) B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 74 Stuen S. Anaplasma phagocytophilum - the most widespread tick-borne infection in animals in Europe. Vet Res Commun 2007; 31 (Suppl 1): 79–84. Ulienberg G. Babesia a historical overview. Vet Parasitol 2006; 138: 3–10. Vial HJ, Gorenfolt A. Chemotherapy against babesiosis. Vet Parasitol 2006; 138: 147–60. Woldehiwet Z, Scott GR. Immunological studies on tick-borne fever in sheep. J Comp Pathol 1982; 92: 457–67. Woldehiwet Z. Anaplasma phagocytophilum in ruminants in Europe. Ann N Y Acad Sci 2006; 1078: 446–60. Woldehiwet Z. The natural history of Anaplasma phagocytophilum. Vet Parasitol 2010; 167: 108–22. Zintl A, Mulcahy G, Skerrett HE, Taylor SM, Gray JS. Babesia divergens, a bovine blood parasite of veterinary and zoonotic importance. Clin Microbiol Revi 2003; 16: 622–36. Žele D, Avberšek J, Gruntar I, Ocepek M, Vengušt G. Evidence of Anaplasma phagocytophilum in game animals from Slovenia. Acta Vet Hung 2012; 60(4): 441–8. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 75 10 PRILOGE Tabela 31: Rezultati vseh preiskav opravljenih pri govedu uporabljenih v Prešernovi nalogi (zeleno obarvane vrstice so klinično bolne živali) Table 31: Results of all investigations carried out in cattle used in Prešeren's task (green colored rows are clinically related animals) Zaporedna Borrelia burgdorferi Anaplasma Babesia divergens številka WBC RBC HGB HCT MCV MCH MCHC PLT (1 : 128) phagocytophilum (1 : 64) (1 : 64) 1 4,7 5,87 9,2 27,6 47 15,6 33,2 510 neg. sum(+/-) poz(+++) 2 5,5 6,79 11 31,4 46 15,7 34 421 neg. poz(+++) poz(++) 3 9,4 8,12 12 34,4 42 14,7 34,6 469 neg. poz(+++) poz(+) 4 5,5 6,48 9,6 28,4 41 14 33,9 453 neg. poz(+++) neg. 5 KOAG. neg. poz(+++) neg. 6 9,7 6,16 9,8 28,7 47 16 34,3 548 neg. poz(+) neg. 7 7,9 8,05 12 36 45 14,7 33 616 neg. poz.(+++) poz.(++) 8 7,6 5,32 8,6 25 47 16,1 34,3 800 neg. poz.(+++) neg. 9 6 5,76 9,8 29,7 52 17 33 384 neg. poz.(++) poz.(++) 10 7,4 5,27 8,9 26,1 49 16,9 34,2 971 neg. poz.(++) neg. 11 5,6 6,14 10 30,6 50 16,3 32,8 335 neg. poz.(++) neg. 12 KOAG. neg. poz.(+++) neg. 13 10,4 7,35 12 35,7 49 16,3 33,5 828 neg. poz.(+++) poz.(++) 14 9,8 7,41 11 35,3 48 15,4 32,3 371 neg. poz.(+++) poz.(+) 15 11,7 8,21 14 41,5 51 16,4 32,5 273 neg. poz.(++) poz.(+) B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 76 Zaporedna Borrelia burgdorferi Anaplasma Babesia divergens številka WBC RBC HGB HCT MCV MCH MCHC PLT (1 : 128) phagocytophilum (1 : 64) (1 : 64) 16 10,4 9,89 11 33,1 34 11,3 33,6 911 neg. neg. neg. 17 12,7 12,4 14 44,8 36 11,3 31,3 600 neg. poz.(++) neg. 18 8,9 8,22 9,9 30,8 37 12,1 32,3 792 neg. poz.(++) neg. 19 7,6 7,57 11 36,3 48 15 31,4 176 neg. poz.(+++) neg. 20 18,1 8,41 10 33,6 40 12,2 30,5 433 neg. poz.(+++) neg. 21 11,3 9,55 11 35,3 37 11,8 32 644 neg. poz.(+++) neg. 22 8,9 8,94 12 35,8 40 12,8 32,1 668 neg. poz.(+++) neg. 23 15,7 8,55 11 34,4 40 12,8 31,9 1703 neg. poz.(++) neg. 24 8,8 6,46 10 31,5 49 15,8 32,5 861 neg. poz.(+) poz.(+) 25 10,4 7,3 10 31,6 43 14 32,4 751 neg. poz.(+++) poz.(+) 26 7,5 6,14 9 27,9 45 14,7 32,4 512 poz.(+) poz.(++) neg. 27 12,2 7,63 11 34,6 45 14,5 31,9 142 neg. poz.(++) poz.(+) 28 7,8 7,16 8,9 27,4 38 12,4 32,4 732 neg. poz.(++) poz.(++) 29 10,6 6,42 7,8 23,8 37 12,1 32,7 543 neg. poz.(++) neg. 30 8 6,2 8,8 26,4 43 14,1 33,2 517 neg. poz.(+) neg. 31 6,3 7,02 12 38,5 55 17,7 32,3 124 Poz.(++) poz.(+++) poz.(+++) 32 5,2 5,92 12 36,3 61 20 32,6 175 poz.(+) poz.(++) poz.(++) 33 4,3 4,94 8,6 26,1 53 17,3 32,9 593 poz.(+) poz.(++) poz.(+) 34 KOAG. poz.(++) poz.(+) neg. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 77 Zaporedna Borrelia burgdorferi Anaplasma Babesia divergens številka WBC RBC HGB HCT MCV MCH MCHC PLT (1 : 128) phagocytophilum (1 : 64) (1 : 64 ) 35 5,3 5,81 9,6 29,3 50 16,5 32,7 556 poz.(+) poz.(+++) poz.(+) 36 4,9 5,1 11 31,6 62 20,5 33,1 295 poz.(+) poz.(++) neg. 37 8,6 5,27 9,7 29,5 56 18,3 32,8 371 poz.(++) poz.(++) poz.(++) 38 7,1 5,14 8,7 25,3 49 17 34,5 1867 poz.(+) poz.(++) neg. 39 5,9 8,62 12 37,3 43 13,5 31,2 245 poz.(++) neg. neg. 40 4,3 7,39 8,9 27,2 37 12,1 32,8 486 neg. neg. neg. 41 3,1 8,27 11 31,6 38 12,8 33,4 547 neg. neg. neg. 42 7 5,79 9,4 28,2 49 16,2 33,2 175 poz.(++) poz.(+++) poz.(+++) 43 8,5 6,69 12 36,7 55 17,8 32,4 332 poz.(++) poz.(++) neg. 32 5,1 6,3 11 33,2 53 17,5 33,2 239 poz.(++) poz.(+++) neg. 45 5,5 3,92 7,5 18,9 48 19 39,5 113 poz.(+) poz.(+++) neg. 46 7,9 5,84 8,5 24,4 42 14,6 34,8 195 poz.(++) poz.(+++) neg. 47 10,2 6,91 11 33 48 15,2 31,9 601 poz.(+) neg. neg. 48 9 5,98 9,1 27,7 46 15,2 32,7 894 neg. neg. neg. 49 7,8 6,19 9,6 30,3 49 15,5 31,8 664 neg. neg. poz.(+++) 50 5,1 6,23 9,8 29,7 48 15,7 32,9 468 neg. neg. neg. 51 4,5 7,44 11 33,4 45 15 33,4 447 poz.(+) neg. neg. 52 6,9 6,85 9,5 28,6 42 13,9 33,3 528 neg. neg. neg. 53 15,4 6,05 9,9 28,2 47 16,4 35,2 636 neg. neg. neg. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 78 Zaporedna Borrelia burgdorferi Anaplasma Babesia divergens številka WBC RBC HGB HCT MCV MCH MCHC PLT (1 : 128) phagocytophilum (1 : 64) (1 : 64) 54 KOAG. neg. neg. neg. 55 16,4 7,25 12 33,6 46 16 34,6 378 poz.(++) neg. neg. 56 6,4 7,22 12 35 49 16,4 33,7 515 poz.(+) neg. neg. 57 11,1 7,23 10 30,2 42 13,8 33,1 513 neg. neg. poz.(++) 58 7,8 6,18 9 26,9 43 14,5 33,4 132 neg. neg. poz.(++) 59 7 6,28 9,1 27 43 14,5 33,7 487 neg. neg. poz.(++) 60 7,4 6,89 10 31,1 45 15 33,1 625 poz.(+) neg. neg. 61 11 6,13 9,4 28,5 46 15,3 32,9 640 neg. neg. neg. 62 7,6 6,92 11 32,7 47 15,7 33,3 297 poz.(+) neg. neg. 63 6,8 6,42 9 26,2 41 14 34,3 644 poz.(+++) poz.(+) neg. 64 4,7 7017 9,2 28,1 39 12,8 32,6 570 neg. neg. neg. 65 6,9 6,61 10 30,9 47 15,5 33,1 678 neg. neg. neg. 66 KOAG. neg. neg. neg. 67 4,2 7,54 12 36,9 49 15,6 31,8 138 neg. neg. neg. 68 5,2 7,47 10 30,3 41 13,5 33,3 552 poz.(++) neg. neg. 69 KOAG. poz.(+) neg. neg. 70 7,3 6,45 8,9 26,4 41 13,9 33,9 595 poz.(++) neg. neg. 71 5,7 6,84 8,9 26,1 38 13 33,9 879 neg. neg. neg. 72 7,9 6,04 83 24,8 41 13,7 33,4 699 neg. neg. neg. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 79 Zaporedna Borrelia burgdorferi Anaplasma Babesia divergens številka WBC RBC HGB HCT MCV MCH MCHC PLT (1 : 128) phagocytophilum (1 : 64) (1 : 64) 73 5,9 6,28 8,9 26,4 42 14,1 33,6 373 poz.(+) neg. neg. 74 7,8 7,12 9,1 28,2 40 12,8 32,5 459 poz.(++) neg. neg. 75 4,7 6,22 8,4 24,3 39 13,6 34,7 604 poz.(+) neg. neg. 76 6,8 6,94 9,7 28,9 42 13,9 33,5 492 neg. neg. neg. 77 7 6,58 8,7 25,4 39 13,3 34,4 714 neg. neg. neg. 78 8,3 7,75 13 38,8 50 16,1 32,3 99 neg. neg. neg. 79 6,8 8,12 12 37,8 47 14,9 32,1 737 neg. neg. neg. 80 4 7,07 11 33,9 48 15,6 32,5 116 neg. neg. neg. 81 7,9 6,32 8,6 25,6 41 13,6 33,5 483 neg. neg. neg. 82 KOAG. neg. neg. neg. 83 8,7 6,53 8,6 26 40 13,2 33,1 448 poz.(++) neg. neg. 84 7,2 7,53 11 34,1 45 14,7 32,4 135 neg. neg. neg. 85 7,2 6,56 9,8 28,9 44 15 34,1 1115 poz.(++) neg. neg. 86 14 5,83 8,6 24,7 42 14,8 34,8 320 poz.(++) neg. neg. 87 5,1 6,84 8,9 26,3 38 13 33,7 733 neg. poz.(+) neg. 88 14 6,79 8,8 26,7 39 13 33,1 181 poz.(++) poz.(+) neg. 89 KOAG. poz.(+) neg. neg. 90 9,1 7,86 11 32,7 43 13,8 32,4 421 poz.(+) neg. neg. 91 6,2 7,5 10 30,8 41 13,5 32,9 947 poz.(+++) poz.(++) neg. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 80 Zaporedna Borrelia burgdorferi Anaplasma Babesia divergens številka WBC RBC HGB HCT MCV MCH MCHC PLT (1 : 128) phagocytophilum (1 : 64) (1 : 64) 92 4,5 7,03 8,7 25,3 36 12,4 34,6 250 neg. neg. neg. 93 KOAG. poz.(+) neg. neg. 94 7,4 7,91 14 43,2 55 18 32,9 122 neg. poz.(+) poz.(+) 95 6 5,79 10 29,8 52 17,4 33,8 357 neg. poz.(++) neg. 96 6,3 6,88 12 36,2 53 17,8 33,7 477 poz.(++) poz.(++) poz.(+++) 97 6,3 8,06 13 39,8 49 16,4 33,1 240 poz.(++) poz.(+) poz.(+) 98 8,9 7,06 13 38,6 55 18,3 33,5 366 neg. poz.(++) poz.(+) 99 9,9 7076 12 36 46 15,6 33,6 757 neg. poz.(+) poz.(+++) 100 KOAG. neg. poz.(+++) poz.(+) 101 12 8,23 14 40,9 50 16,8 33,8 426 neg. poz.(++) poz.(+) 102 10,3 7,74 13 39,3 51 17 33,4 958 neg. poz.(++) poz.(+++) 103 8,3 8,54 12 36,7 43 14,5 33,7 516 poz.(+) poz.(+++) neg. 104 11,8 9,83 13 39,6 40 13 32,2 757 neg. poz.(+) neg. 105 8,3 8,01 11 34,3 43 14 32,7 486 neg. poz.(++) poz.(+) 106 7,8 7,59 11 32,9 43 14,4 33,1 105 neg. poz.(++) neg. 107 8,9 8,45 11 32,7 39 12,5 32,4 101 neg. poz.(++) poz.(+) 108 7,2 4,68 9,9 28,7 61 21,3 34,7 783 neg. poz.(+++) neg. 109 11,7 6,85 13 35,8 52 18,2 34,8 598 neg. poz.(+) poz.(+) 110 10 7,69 13 38,2 50 16,4 33 396 neg. poz.(+++) neg. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 81 Zaporedna Borrelia burgdorferi Anaplasma Babesia divergens številka WBC RBC HGB HCT MCV MCH MCHC PLT (1 : 128) phagocytophilum (1 : 64) (1 : 64) 111 10,8 7,65 13 38,2 50 16,4 32,9 301 neg. poz.(+) poz.(+) 112 8,6 5,84 11 32 55 18,4 33,6 632 neg. poz.(++) neg. 113 7,8 7,67 13 38,4 50 16,5 33 103 neg. poz.(++) neg. 114 8,4 7,01 11 31,6 45 15,5 34,4 568 poz.(+) poz.(+++) neg. 115 6,9 6,1 11 31,8 52 1707 34 1467 neg. poz.(+) neg. 116 8 8,99 12 37,9 42 13,8 32,7 341 poz.(+) poz.(+) neg. 117 8,5 8,99 13 37,6 42 14 33,6 598 neg. neg. neg. 118 4,9 5,64 9,6 29 51 17 33,1 289 poz.(+) neg. neg. 119 5,3 7,35 13 40,5 55 18,1 32,9 310 neg. neg. neg. 120 7,2 6,64 13 39,4 59 19,1 32,3 1968 neg. neg. neg. 121 8,1 7,77 12 36,1 46 15,2 32,8 417 poz.(++) poz.(+++) poz.(+) 122 8 7,57 12 35,9 47 15,7 33,2 764 neg. poz.(++) neg. 123 9,6 7,03 11 32,4 46 15,4 33,4 684 poz.(+) neg. neg. 124 8,7 6,3 11 33,8 54 17,7 32,9 223 neg. poz.(+) neg. 125 7 8,12 12 37,3 46 15 32,6 92 neg. poz.(+++) neg. 126 KOAG. poz.(+) poz.(++) neg. 127 7,6 8,56 13 40 47 15 32 238 neg. poz.(+) neg. 128 7,5 7,4 11 32,2 44 14,2 32,7 257 poz.(++) poz.(++) neg. 129 7,6 7,82 11 34,1 44 13,9 31,9 129 neg. neg. neg. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 82 Zaporedna Borrelia burgdorferi Anaplasma Babesia divergens številka WBC RBC HGB HCT MCV MCH MCHC PLT (1 : 128) phagocytophilum (1 : 64) (1 : 64) 130 6,9 7,77 12 37 48 15,3 32,2 524 neg. poz.(++) neg. 131 9,6 8,06 11 34,5 43 14 32,7 805 neg. poz.(++) poz.(+) 132 6,6 7,52 11 32,4 43 14,6 33,8 307 poz.(+) poz.(+) neg. 133 4,5 5,2 8,9 25,9 50 17,1 34,3 218 neg. neg. neg. 134 8,7 7,84 10 30,2 39 12,9 33,4 450 neg. poz.(+) neg. 135 8,7 6,73 11 33,4 50 16,7 33,7 887 neg. poz.(+) neg. 136 8,4 5,83 8 22,4 38 13,7 35,7 665 neg. poz.(+) neg. 137 7,1 6,26 9,1 26,5 42 14,5 34,1 483 neg. neg. neg. 138 9,7 6,18 10 30,1 49 16,3 33,3 430 poz.(+) poz.(+) neg. 139 6,2 6,39 9,1 27,,5 43 14,3 33,3 551 poz.(++) neg. neg. 140 7,4 6,65 10 30,7 46 15,4 33,3 891 poz.(++) poz.(+) neg. 141 10,3 6,33 10 30,9 49 16,3 33,3 274 neg. poz.(+) neg. 142 9,4 6,19 9,8 28,7 46 15,9 34,3 1041 neg. poz.(+) neg. 143 5,3 6,93 11 31,8 46 15,5 33,7 498 poz.(+) neg. neg. 144 9,8 6,5 10 31,5 48 16 33 660 poz.(+) poz.(++) neg. 145 6,4 6,64 11 32,8 49 16,5 33,5 793 neg. neg. neg. 146 5,7 5,91 11 34,2 58 18,9 32,6 811 neg. neg. neg. 147 9,7 7,18 11 32,3 45 14,9 33 505 neg. poz.(++) neg. 148 5,6 6,62 9,8 29,5 45 14,7 33,1 554 neg. neg. neg. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 83 Zaporedna Borrelia burgdorferi Anaplasma Babesia divergens številka WBC RBC HGB HCT MCV MCH MCHC PLT (1 : 128) phagocytophilum (1 : 64) (1 : 64) 149 52 6,29 11 33,1 53 17,2 32,7 396 neg. poz.(+) neg. 150 6,8 7,43 12 35,6 48 15,5 32,3 497 neg. neg. neg. 151 4,3 5,64 7,6 22,7 40 13,6 33,7 632 neg. neg. neg. 152 8,5 6,53 9,2 28,2 43 14 32,4 642 poz.(++) poz.(++) neg. 154 10,8 7,36 11 33 45 15,2 33,9 559 poz.(++) neg. neg. 155 5,4 7,16 9,8 29,5 41 13,6 33,1 225 poz.(++) neg. neg. 156 8,3 7,42 11 31,5 42 14,2 33,4 696 poz.(+) neg. neg. 157 8,8 7,41 9,9 29,3 39 13,4 33,9 471 poz.(+) neg. neg. 158 10,1 6,97 11 32,7 47 15,6 33,2 130 poz.(++) poz.(+) neg. 159 6,1 6,77 11 32,3 48 15,8 33,2 94 poz.(+) neg. neg. 160 7,5 7,02 10 30,7 44 14,4 32,9 362 neg. neg. neg. 161 6 6,3 10 30,2 48 16,1 33,5 126 poz.(+) neg. neg. 162 7,2 6,96 9,6 29,3 42 13,7 32,6 519 poz.(+) neg. neg. 163 8,8 6,37 9,8 29,5 46 15,4 33,3 714 neg. neg. neg. 164 8,8 6,82 11 32,6 48 15,6 32,7 550 poz.(+) poz.(+) neg. 165 9,7 5,63 10 30 53 18,2 34,1 350 poz.(++) neg. neg. 166 7 7,26 11 32,4 45 14,7 32,9 377 neg. neg. neg. 167 13,4 6,38 9,6 29 45 15,1 33,1 677 poz.(+) neg. neg. 168 6,2 6,49 11 32 49 16,4 33,2 661 poz.(+) neg. neg. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 84 Zaporedna Borrelia burgdorferi Anaplasma Babesia divergens številka WBC RBC HGB HCT MCV MCH MCHC PLT (1 : 128) phagocytophilum (1 : 64) (1 : 64) 169 7,8 7,48 11 34,9 47 15 32,2 313 poz.(+) neg. neg. 170 9,2 6,44 11 31,7 49 16,2 33 655 poz.(++) neg. neg. 171 4,5 6,05 8,8 25,8 43 14,5 34 287 poz.(+) neg. neg. 172 6,7 6,38 10 31,6 49 16,2 32,8 304 neg. neg. neg. 173 7,8 6,22 9,8 30,2 49 15,8 32,4 534 neg. neg. neg. 174 6 5,9 10 31,2 53 17,3 32,7 560 poz.(++) neg. neg. 175 8,6 6,74 9,8 29,2 43 14,5 33,6 128 neg. neg. neg. 176 7,6 7,81 11 34,3 44 14,2 32,3 230 poz.(+) neg. neg. 177 7,2 6,51 11 32,1 49 16,5 33,5 563 neg. neg. neg. 178 6,8 6,05 9,1 26,8 44 15 33,9 595 poz.(+) neg. neg. 179 7,8 7,67 11 35,4 46 14,9 32,2 847 poz.(++) neg. neg. 180 6,8 6,38 9,8 30,5 48 15,4 32,1 778 neg. neg. neg. 181 8 6,39 10 30 47 15,7 33,5 535 poz.(+) neg. neg. 182 KOAG. poz.(+) neg. neg. 183 9 5,95 110 29,6 50 17,4 35 859 neg. neg. neg. 184 9,1 5,71 11 31,6 55 18,5 33,5 560 poz.(++) neg. neg. 185 12,5 5,72 9,5 28,6 50 16,7 33,3 261 poz.(+) neg. neg. 186 6,2 5,64 10 29,5 52 17,6 33,7 456 neg. neg. neg. 187 9,6 7,03 11 31,9 45 15 33 381 neg. neg. neg. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 85 Zaporedna Borrelia burgdorferi Anaplasma Babesia divergens številka WBC RBC HGB HCT MCV MCH MCHC PLT (1 : 128) phagocytophilum (1 : 64) (1 : 64) 188 7,1 6,45 12 37,7 58 19,2 32,9 686 neg. neg. neg. 189 5,4 6,29 11 34,4 55 17,5 31,8 144 poz.(+) poz.(+) neg. 190 KOAG. neg. poz.(++) neg. 191 6,1 5,44 9,6 28,7 53 17,7 33,5 458 neg. neg. neg. 192 12,1 6,44 12 34,8 54 17,9 333,1 287 neg. poz.(+) neg. 193 9,9 6,32 11 34,6 55 18 32,9 429 poz.(+) poz.(+) neg. 194 6,6 5,53 9,7 30,1 54 17,5 32,3 550 poz.(+) poz.(++) neg. 195 9 6,63 10 31,3 47 15,7 33,3 712 neg. poz.(+++) neg. 196 8,5 7,21 12 35,7 49 16,4 33,1 343 neg. poz.(+++) neg. 197 8,5 5,49 7,5 22,3 41 13,7 33,6 594 poz.(++) neg. neg. 198 10,9 8,05 11 32,7 41 13,1 32,2 432 neg. poz.(+++) neg. 199 9,5 7,39 11 34,1 46 15,1 32,8 725 neg. neg. neg. 200 8,3 6 8,5 24,6 41 14,2 34,7 492 poz.(+) poz.(+) neg. 201 4,9 5,2 9,1 26,8 51 17,5 34 597 poz.(+) neg. neg. 202 9 6,07 10 30,5 50 16,9 33,6 419 poz.(++) neg. neg. 203 5,8 5,17 7,9 23,5 46 15,4 33,8 534 neg. neg. neg. 204 6,3 6,16 9,9 29,5 48 16,1 33,7 340 neg. poz.(+) neg. 205 10,8 7,57 10 30,4 40 13,5 33,5 777 neg. neg. neg. 206 3,1 6,01 11 32,6 54 18,2 33,6 191 neg. poz.(+) neg. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 86 Zaporedna Borrelia burgdorferi Anaplasma Babesia divergens številka WBC RBC HGB HCT MCV MCH MCHC PLT (1 : 128) phagocytophilum (1 : 64) (1 : 64) 207 6,2 6,12 11 31,5 51 17,2 33,5 885 neg. neg. neg. 208 7,7 6,8 12 34 50 16,9 33,8 633 neg. neg. neg. 209 8,9 6,25 12 32,5 52 18,3 35,5 2019 poz.(+) poz.(++) neg. 210 7,9 6,28 11 32,6 52 17,2 33 756 poz.(+) poz.(++) neg. 211 7,9 6,75 11 32 47 15,8 33,3 367 neg. poz.(++) neg. 212 7,7 6,82 10 30,4 45 14,7 32,9 439 neg. poz.(++) neg. 213 8,3 5,92 9,5 28,9 49 16,1 33 460 neg. neg. neg. 214 9,8 7,1 11 32,7 46 15,7, 34,1 418 poz.(+) neg. neg. 215 8,4 6,19 9,5 29,2 47 15,4 32,6 807 neg. poz.(+++) neg. 216 7,5 7,37 11 34,6 47 15,4 32,9 581 poz.(+) poz.(+) neg. 217 4,9 5,87 9,1 27,8 47 15,6 32,8 798 neg. neg. neg. 218 7 7,64 11 34,5 45 14,3 31,7 542 neg. neg. neg. 219 7 6,55 11 32,7 50 16,2 32,5 586 neg. neg. neg. 220 4,3 5,52 9,4 28,3 51 17 33,2 1151 neg. neg. neg. 221 8,6 6,23 9,7 29,1 47 15,5 33,2 605 neg. neg. neg. 222 6,4 6 9,5 27,9 47 15,9 34,1 540 poz.(+++) neg. neg. 223 5,7 6,65 9,9 29,9 45 14,8 33 434 poz.(+++) neg. neg. 224 4,8 6,18 11 33,2 54 17,7 33 619 poz.(++) neg. neg. 225 5,1 6,84 12 34,8 51 17 33,4 634 neg. neg. neg. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 87 Zaporedna Borrelia burgdorferi Anaplasma Babesia divergens številka WBC RBC HGB HCT MCV MCH MCHC PLT (1 : 128) phagocytophilum (1 : 64) (1 : 64) 226 8,6 6 10 30,6 51 17,2 33,6 590 neg. neg. neg. 227 9,3 6,79 9,7 29,4 43 14,3 33 793 poz.(++) neg. neg. 228 5,6 5,79 10 30,5 53 17,6 33,3 637 poz.(++) neg. neg. 229 11,6 8,47 11 33,5 40 13,1 33,2 732 poz.(++) poz.(+) neg. 230 7,4 7,41 13 39,1 53 17,1 32,3 817 poz.(+++) neg. neg. 231 9 7,92 13 39,8 50 16,1 32,2 532 poz.(+) neg. neg. 232 7,9 8,55 14 45,4 53 16,4 30,9 453 poz.(++) neg. neg. 233 13,3 6,25 11 34,1 54 18,3 33,5 956 poz.(++) poz.(+++) neg. 234 7,6 6,46 12 35,3 55 18,1 33,1 275 poz.(+++) poz.(+++) poz.(+) 235 8,6 6,41 11 31,5 49 16,4 33,4 522 poz.(++) poz.(+++) neg. 236 7,4 6,49 9,8 29,5 46 15 33,1 236 poz.(+++) poz.(+++) neg. 237 7,4 6,49 9,8 29,5 46 15 33,1 236 poz.(+) poz.(+++) neg. 238 6 5,8 10 30,9 53 17,7 33,3 200 poz.(+++) poz.(+++) poz.(+) 239 8,5 5,37 9 26,8 50 16,7 33,5 465 poz.(+++) poz.(+++) poz.(+) 240 8,8 7 11 334 48 15,8 32,7 475 poz.(++) poz.(+++) neg. 241 8,4 7,17 10 32,6 45 14,6 32 189 poz.(+++) poz.(+++) poz.(++) 242 7,6 5,82 10 31 53 17,5 32,9 99 poz.(+) poz.(+++) poz.(+) 243 7,8 6,52 9,3 27,8 43 14,3 33,6 201 poz.(++) poz.(+++) neg. 244 8 5,92 9,7 30,1 51 16,3 32,1 337 poz.(++) poz.(+) neg. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 88 Zaporedna Borrelia burgdorferi Anaplasma Babesia divergens številka WBC RBC HGB HCT MCV MCH MCHC PLT (1 : 128) phagocytophilum (1 : 64) (1 : 64) 245 9,5 5,44 9,1 26,9 49 16,8 34 346 poz.(+) neg. neg. 246 KOAG. poz.(++) neg. neg. 247 8,9 7,75 12 37,2 48 15,1 31,4 677 poz.(++) neg. neg. 248 6,5 9,24 13 41,9 45 14,6 32,1 498 poz.(+) neg. neg. 249 2 3,92 6,5 17,8 45 16,6 36,5 119 poz.(+++) poz.(+++) neg. 250 5,7 7,76 10 31,7 41 13,2 32,2 379 poz.(+) poz.(+++) poz.(++) 251 4,2 5,85 9,3 28,8 49 15,8 32,2 113 poz.(+++) poz.(+++) poz.(+) 252 4,1 4,88 9 28 57 18,5 32,3 176 poz.(+++) poz.(+++) neg. 253 8,5 7,02 11 34,7 49 15,8 32 422 poz.(++) poz.(+) neg. 254 7,8 6,33 10 30,3 48 15,7 32,9 322 poz.(++) poz.(+) neg. 255 6,4 6,63 8,6 25,7 39 13 33,6 444 neg. neg. neg. 256 7,5 8,04 13 41,9 52 16,6 31,9 93 poz.(+) neg. neg. 257 9,3 6,44 8,6 26,2 41 13,3 32,8 652 poz.(+) poz.(++) neg. 258 7,3 7,21 9,4 29,3 41 13,1 32,2 156 poz.(+) neg. neg. 259 7,8 5,65 8,6 25,8 46 15,2 33,3 490 poz.(++) neg. neg. 260 8,4 5,93 11 32,3 54 17,9 32,9 321 poz.(++) neg. neg. 261 KOAG. poz.(++) poz.(+++) neg. 262 5,1 7,08 11 32,4 46 14,8 32,4 656 neg. neg. neg. 263 7 5,82 8,3 25 43 14,3 33,2 623 neg. poz.(+) neg. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 89 Dvojno vzorčenje(v belem polju so rezultati prvega vzorca, v sivem polju so rezultati drugega vzorca iste živali) Double sampling (in the white field are results of the first sample in the gray field are the results of the second sample of the same animal) Zaporedna Borrelia burgdorferi Anaplasma Babesia divergens številka WBC RBC HGB HCT MCV MCH MCHC PLT (1 : 128) phagocytophilum (1 : 64) (1 : 64) 264 9,4 8,84 12 37,2 42 13,6 32,4 205 neg. neg. neg. 265 7 8,21 10 31,8 39 12,3 31,7 713 neg. poz.(++) poz.(+) 266 10,3 9,32 12 35,3 38 12,6 33,2 550 neg. neg. neg. 267 9,9 8,84 9,9 30,5 34 11,2 32,5 582 neg. poz.(+++) poz.(+) 268 8,5 8,08 12 36 45 14,9 33,6 672 neg. neg. neg. 269 11,9 8,39 11 32,8 39 13,4 34,3 272 poz.(++) poz.(+++) poz.(+++) 270 11,5 8,85 12 36,6 41 13,7 33,2 734 neg. neg. neg. 271 8,8 8 10 31,9 40 12,8 32 677 poz.(+) poz.(+++) poz.(+++) 272 4,2 7,32 9,3 27,2 37 12,7 34,3 532 neg. neg. neg. 273 9,5 9,7 12 37,5 39 12,3 31,9 572 poz.(++) poz.(+++) poz.(+++) 274 10,5 10,9 13 37,4 34 11,6 33,8 695 neg. neg. neg. 275 10,3 8,8 10 31,7 36 11,4 31,7 391 neg. poz.(+++) poz.(++) 276 10,1 6,18 9,4 28,1 45 15,3 33,6 444 neg. poz(+++) poz.(++) 277 10,9 8,16 11 31,8 39 13,2 34 256 poz.(+) poz.(++) poz.(++) 278 6,9 6,68 10 30 45 15,6 34,7 561 poz.(+) poz.(+) poz.(+) 279 3,7 5,62 8,4 25 44 14,9 33,4 155 neg. poz.(+++) poz.(+) B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 90 Zaporedna Borrelia burgdorferi Anaplasma Babesia divergens številka WBC RBC HGB HCT MCV MCH MCHC PLT (1 : 128) phagocytophilum (1 : 64) (1 : 64) 280 12,2 8,37 12 35,4 42 13,7 32,5 743 neg. neg. poz.(+) 281 7,7 6,59 9,9 30,3 46 15,1 32,7 482 neg. poz.(+++) poz.(+++) 282 12 9,31 13 41,5 45 14,1 31,7 524 neg. poz.(++) poz.(+++) 283 12,5 8,27 12 38,2 46 14,5 31,3 298 poz.(+) poz.(++) poz.(+++) 284 9,4 8,26 12 36,8 45 14,2 31,9 707 neg. neg. neg. 285 8,8 7,52 10 32,2 43 13,3 31,1 1577 poz.(+) poz.(+) poz.(+++) 286 8,7 8,7 12 38,5 44 13,8 31,2 719 neg. neg. neg. 287 7,6 7049 10 31,6 42 13,6 32,2 515 neg. poz.(+++) poz.(++) 288 7,3 9,18 12 36,4 40 12,5 31,6 939 neg. neg. neg. 289 12,2 9,65 111 35,7 37 11,5 31 217 poz.(+) poz.(++) poz.(+) 290 9,3 7,58 11 34 45 14,6 32,5 343 neg. poz.(+++) poz.(+++) 291 9,2 7,04 9,8 29,8 42 13,9 32,8 644 poz.(+) poz.(+++) poz.(+++) 292 11,5 8,7 12 35,8 41 13,3 32,2 513 neg. poz.(+++) poz.(+++) 293 13,4 8,05 11 33,2 41 13,3 32,1 373 poz.(++) poz.(++) poz.(+++) 294 9,8 7,05 11 33,1 47 15,2 32,3 578 neg. poz.(+++) poz.(+++) 295 10,2 6,42 10 30,7 48 15,5 32,5 928 neg. poz.(++) poz.(+++) 296 8,3 8,11 11 35,2 43 14 32,2 606 neg. poz.(++) neg. 297 9 7,4 9,9 30,8 42 13,4 32,3 724 neg. poz.(+++) neg. 298 9,8 8,72 11 33,5 38 12,5 32,5 911 neg. poz.(++) neg. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 91 Zaporedna Borrelia burgdorferi Anaplasma Babesia divergens številka WBC RBC HGB HCT MCV MCH MCHC PLT (1 : 128) phagocytophilum (1 : 64) (1 : 64) 299 9,6 8,84 11 33 37 12 32,3 660 neg. poz.(+++) poz.(+++) 300 8,1 7,93 11 34,4 43 14 32,4 1319 neg. neg. neg. 301 8,6 7,69 11 33,7 44 13,6 31 490 neg. poz.(+++) poz.(++) 302 7,9 8,16 9,9 29 35 12,1 34,2 909 neg. neg. neg. 303 11,4 10,7 12 36,7 34 11,2 32,6 745 poz.(+) poz.(+++) neg. 304 12,1 6,35 11 31,6 50 16,7 33,7 707 neg. poz.(+++) poz.(+++) 305 12,1 8,35 12 37 44 14,3 32,2 2318 neg. poz.(++) poz.(+) 306 9,6 7,9 9,9 30,2 38 12,5 32,7 747 neg. neg. neg. 307 11,8 9,72 12 36,7 38 11,8 31,3 746 neg. poz.(++) neg. 308 8,6 8,43 9,9 30,2 36 11,8 32,8 1303 neg. neg. neg. 309 9,8 9,8 11 34,5 35 11,1 31,7 1053 neg. poz.(+) neg. 310 10,3 9,36 12 38,2 41 13 31,7 833 neg. neg. neg. 311 11,5 10,6 12 39,1 37 11,3 30,6 185 neg. poz.(+++) neg. 312 10 12,6 14 41,5 33 11 33,6 937 neg. neg. neg. 313 8,7 7,88 8,6 26,1 33 10,9 33 584 poz.(+) poz.(+++) neg. 314 8,2 9,4 11 36,1 38 11,8 30,9 505 neg. neg. neg. 315 9,4 7,43 9,6 29,1 39 12,9 32,8 370 neg. poz.(+++) poz.(+) 316 8,3 4,43 7,4 20,3 46 16,7 36,4 879 neg. poz.(+) poz.(++) 317 8,4 7,48 11 35 47 14,3 30,6 658 neg. poz.(+) neg. B. Ošlak: Nekatere vektorsko prenosljive zoonoze pri pašnem govedu v Sloveniji UL, Veterinarska fakulteta, 2017. Raziskovalna naloga 92 Zaporedna Borrelia burgdorferi Anaplasma Babesia divergens številka WBC RBC HGB HCT MCV MCH MCHC PLT (1 : 128) phagocytophilum (1 : 64) (1 : 64) 318 10,7 6,4 10 29,2 46 15,7 34,3 358 neg. neg. neg. 319 6,7 8,36 13 40,9 49 15 30,5 481 poz.(+) neg. neg.