Originalni znanstveni œlanki - Scientific Articles Doloœanje povrĝinskih lastnosti vzorcev laktoze, pripravljene s suĝenjem z razprĝevanjem, z liofilizacijo in z obarjanjem Determination of surface properties of lactose samples prepared by spray-drying, lyophilization and precipitation Odon Planinĝek, Jernej Zadnik, Matjaĉ Kunaver, Marjan Bele, Stane Srœiœ POVZETEK: Farmacevtske uœinkovine in pomoĉne snovi izoliramo iz raztopin z uporabo razliœnih postopkov, ki vplivajo na njihovo morfologijo in fizikalno-kemijske lastnosti. Za analizo in vrednotenje takĝnih delcev uporabljamo razliœne metode, ki jih lahko delimo na tiste, kjer merimo in opazujemo celotni vzorec (diferenœna dinamiœna kalorimetrija, rentgenska praĝkovna analiza, kalorimetrija z raztapljanjem) ali samo njegovo povrĝino (merjenje stiœnega kota, gravimetriœna sorpcija, inverzna plinska kromatografija). Namen naĝe raziskave je bil pripraviti razliœne vzorce laktoze in jim z razliœnimi metodami prouœiti povrĝinske lastnosti. Vzorce laktoze smo pripravili iz vodnih raztopin s suĝenjem z razprĝevanjem, z liofilizacijo in z vakuumskim suĝenjem. Razlike med vzorci smo dokazali z inverzno plinsko kromatografijo z merjenjem pri eni in veœ temperaturah. Ugotovili smo, da postopek priprave laktoze vpliva na povrĝinske lastnosti vzorca (gSD, KA, KD). Potrdili smo, da je IGC primerna metoda za prouœevanje majhnih razlik v povrĝinskih lastnostih vzorcev laktoze. Kljuœne besede: fizikalno-kemijske lastnosti, povrĝinske lastnosti, inverzna plinska kromatografija, laktoza ABSTRACT: Pharmaceutical powders are often isolated from solutions by procedures that influence their morphology and physico-chemical properties. Different methods can be used to characterize and evaluate dried powders. They can be divided into those where the bulk sample is analysed (differential scanning calorimetry, x-ray powder diffractometry, solution calorimetry) and those where only the surface of the sample is studied (contact angle measurements, gravimetric sorption, inverse gas chromatography). The purpose of this research was to produce and characterize surfaces of different lactose samples. Spray drying, lyophilization and rota vacuuming were used for preparation of the samples. Differences between samples were confirmed with inverse gas chromatography by measuring at only one and more temperatures. It was established that the method of sample preparation influences the surface properties of lactose (gSD, KA, KD). It was shown that inverse gas chromatography can be used successfully for detecting differences between surfaces of lactose samples. Key words: physico-chemical properties, surface properties, inverse gas chromatography, lactose Jernej Zadnik, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aĝkerœeva 7, 1000 Ljubljana in Krka, d.d., Ĝmarjeĝka cesta 6, 8501 Novo mesto doc. dr. Odon Planinĝek, mag. farm., prof. dr. Stane Srœiœ, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aĝkerœeva 7, 1000 Ljubljana dr. Marjan Bele, dipl. ing. kem. tehn., dr. Matjaĉ Kunaver, dipl. ing. kem., Kemijski inĝtitut, Hajdrihova 19, 1000 Ljubljana, Slovenija 188 farm vestn 2005; 56 Doloœanje povrĝinskih lastnosti vzorcev laktoze, pripravljene s suĝenjem z razprĝevanjem, z liofilizacijo in z obarjanjem 1 Uvod Povrĝinska energija trdnih snovi je lastnost, ki vpliva na medfazne interakcije (npr. trdno-trdno ali trdno-tekoœe). Metoda, ki jo lahko uporabimo za njeno doloœitev, je tudi inverzna plinska kromatografija (IGC). Pri tej metodi je postopek merjenja obraten kot pri klasiœni plinski kro-matografiji (slika 1). Kolono napolnimo s trdnim vzorcem (praĝkom) katerega lastnosti prouœujemo in vanjo injiciramo parno fazo znanih tekoœin. Retencija plina v koloni omogoœa oceno lastnosti trdne povrĝine. V farmaciji je bila metoda uspeĝno uporabljena za razlikovanje razliœnih proizvodnih serij uœinkovin (1) in pomoĉnih snovi (2), prouœe-vanje vpliva mletja na lastnosti povrĝine praĝkov (3, 4, 5), prouœevanje vpliva topila za kristalizacijo na lastnosti povrĝine (6), razlikovanje optiœnih oblik manitola (7), vpliva vlage na lastnosti povrĝine itd. (8, 9). Slika 1: Primerjava principov klasiœne plinske kromatografije in IGC Figure 1: Comparison of conventional and inverse gas chromatography Laktoza se lahko nahaja v dveh osnovnih kristalnih oblikah a in b ali v amorfnem stanju. a-laktoza je lahko monohidrat ali brezvodna. Polimorfne oblike laktoze imajo razliœne fizikalno-kemijske lastnosti kot so: hitrost raztapljanja, gostota in trdnost. Suĝenje z razprĝevanjem, vakuumsko suĝenje in liofilizacija so metode s pomoœjo katerih lahko izdelamo snovi v amorfni obliki oziroma spremenimo njihovo kristaliniœnost. Amorfno stanje je v primerjavi s kristalnim nestabilno zato se snovi v tehnoloĝkih procesih proizvodnje oziroma med shranjevanjem in uporabo zdravil razliœno obnaĝajo. 2 Materiali in metode Materiali Kot izhodni vzorec smo uporabili a-laktozo monohidrat (NF, 200 mesh, DMV International, Nizozemska). Metan (Messer, Slovenija) smo pri doloœanju retencijskih œasov uporabljali kot standard, ki ne reagira. N-heksan, n-heptan (Kemika, Hrvaĝka), n-oktan, n-nonan, n-dekan (Ridel de Haën AG, Nemœija), aceton (Merck, Nemœija), kloro-form, tetrahidrofuran in etilacetat (Kemika, Hrvaĝka) smo uporabljali kot standarde za IGC-meritve. Pridobivanje vzorcev laktoze 10-odstotno vodno raztopino laktoze smo suĝili z razprĝevanjem v aparatu GPCG1 (Glatt, Nemœija). Uporabili smo naslednje pogoje suĝenja: tlak zraka za razprĝevanje 1,5 barov, pretok tekoœine 4 ml/min, pretok zraka skozi procesno komoro 2,5 m/s, vhodna temperatura 80 °C in izhodna temperatura 60 °C. Liofilizirano laktozo smo izdelali s kapljanjem 10-odstotne vodne raztopine v posodo s tekoœim duĝikom in 48-urno liofilizacijo nastalih kroglic pri 20 mTorr in -35 °C. Oborjeno laktozo smo izdelali z vakuumskim suĝenjem 10-odstotne vodne raztopine z uporabo aparata IKA Labortechnik RV05-ST (Nemœija) pri tlaku 100 mbar in temperaturi vodne kopeli 95 °C. Vse vzorce smo hranili nad silikagelom. Termiœna analiza Vzorce smo analizirali z diferenœno dinamiœno kalorimetrijo (Pyris 1 Perkin- Elmer, ZDA). Temperaturo in konstanto grelca smo kalibrirali z uporabo indija. 5-8 mg vzorca smo natehtali in zaprli v aluminijast lonœek in ga analizirali v temperaturnem obmoœju 0-240 °C s hitrostjo 10 °C/min v duĝikovi atmosferi (40 ml/min). Rentgenska praĝkovna analiza Vzorce smo analizirali z rentgenskim praĝkovnim difraktometrom (Philips PW 1710, Nizozemska) Elektronska mikroskopija Za doloœitev morfologije delcev smo uporabili vrstiœni elektronski mikroskop (JEOL T220, Nemœija). Inverzna plinska kromatografija Za analizo vzorcev smo uporabili prirejen plinski kromatograf 6890N (Agilent Technologies, ZDA). Kot nosilni plin smo uporabili helij s pretokom 7 ml/min pri temperaturah 30, 35, 40, 50 in 60 °C. Temperatura injektorja je bila 150 °C in detektorja 250 °C. Vzorce smo redœili s Chromosorbom W (Supelco, ZDA) v masnem razmerju 1:1 in jih s stre-salnikom (VanKel, ZDA) stresli v stekleno kolono (dolĉina 30 cm, notranji premer 3 mm). Pred merjenjem smo tako pripravljeni vzorec prepiho-vali s helijem (pretok 7 ml/min, temperatura 30 °C) najmanj pet ur. Nato smo v kolono injicirali tako majhne mnoĉine parne faze tekoœin, ki ustrezajo meji detekcije aparata, s œimer smo dosegli neskonœno razredœenje. Na osnovi izmerjenega retencijskega œasa smo z uporabo naslednje enaœbe izraœunali neto retencijski volumen Vn (10): V = iF(t —t ) [1] F = volumski pretok nosilnega plina, tr = retencijski œas injicirane kapljevine, t0 = retencijski œas kapljevine, ki ne vstopa v interakcije z vzorcem (metan), j = korekcijski parameter, ki upoĝteva stisljivost nosilnega plina in ga izraœunamo iz naslednje enaœbe: farm vestn 2005; 56 Originalni znanstveni œlanki - Scientific Articles 7 = *{P J P J?-I 2(PJPoulf-l [2] Pin = tlak v koloni Pout = zunanji tlak Pri tehniki neskonœnega razredœenja lahko termodinamsko opiĝemo naslednje ravnoteĉje: AGA = RT\nV+C [3] pri œemer je DGA sprememba proste energije adsorpcije, R sploĝna plinska konstanta, T absolutna temperatura in C konstanta adsorpci-je, ki je odvisna od izbranega referenœnega stanja. Prosta energija adsorpcije kapljevine injicirane v kolono je vsota nepolarnega (D) in polarnega (SP) prispevka. Kadar v kolono injiciramo alkane je sprememba proste energije adsorpcije DGA enaka le spremembi nepolarnega prispevka DGAD: Slika 2: Diagram linearne odvisnosti RTlnVn od aJyf . Iz naklona premice doloœimo nepolarni del proste povrĝinske energije g Figure 2: Schematic diagram showing the dependence of RTlnVn on aJyf . The dispersive component of surface free energy g can be obtained from the slope of the line AGA = AG/ = -RTlnV+C [4] Po metodi, ki so jo razvili Schulz in sodelavci, lahko nepolarni del proste povrĝinske energije trdne snovi gsd izraœunamo iz naslednje enaœbe (10): RT\nV —2N a-Jydyd +C [5] kjer predstavljajo: NA = Avogadrovo ĝtevilo a = povrĝina adsorbirane molekule g= povrĝinska napetost injiciranega alkana gf = disperzijski del proste povrĝinske energije preiskovane trdne snovi V kolono injiciramo alkane z razliœno dolĉino verige (heksan, heptan, oktan, nonan, dekan) in iz naklona (2NAJyf) premice v grafu RTlnVn=f(aA//f) doloœimo vrednost nepolarnega dela proste povrĝinske energije (slika 2). Polarne kapljevine vstopajo v interakcije s trdnimi povrĝinami z nepo-larnimi in polarnimi silami. Tako leĉi toœka za polarno kapljevino v diagramu odvisnosti RTlnVn od aJyf nad premico, ki jo tvorijo alkani. Na osnovi raziskav Draga (11, 12), Gutmana (13) in Fowkesa (14) opredeljujemo polarne interakcije kot Lewisove kislo-baziœne ali kot elektron donor-elektron akceptor interakcije. Tako pride do polarnih interakcij le med kislino in bazo, ne pa med dvema kislinama ali bazama, kljub njihovim velikim polarnostim. Po Gutmanu (13) in Riedlu in Fowkesu (15) lahko kapljevine opredeimo glede na akceptorsko (AN*) ali donorsko ĝtevilo (DN). Lastnosti kapljevin, ki jih uporabljamo pri inverzni plinski kromatografiji so zbrane v preglednici 1 190 farm vestn 2005; 56 Preglednica 1: Povrĝine molekul, povrĝinske napetosti, elektron donorska in elektron akceptorska ĝtevila nekaterih kapljevin Table 1: Surface area, surface free energy, donor and acceptor numbers of some liquids a [A°2] gld [mJ/m2] DN [kJ/mol] AN* [kJ/mol] Heksan 51,5 18,4 0 0 Heptan 57,0 20,3 0 0 Oktan 63,0 21,3 0 0 Nonan 69,0 22,7 0 0 Dekan 75,0 23,4 0 0 Tetrahidrofuran 45,0 22,5 84,4 2,1 Kloroform 45,0 25,0 0 22,7 Aceton 42,5 16,5 71,4 10,5 Etilacetat 50,0 19,6 71,8 6,3 Pri doloœeni vrednosti a^yf predstavlja razlika med toœko, ki ustreza polarni kapljevini in referenœno premico za alkane, specifiœn (polarni) del spremembe proste energije adsorpcije DGASP. Iz krivulje odvisnosti DGASP od temperature lahko izraœunamo spremembo specifiœne proste entalpije DHASP in spremembo specifiœne proste entropije adsorpcije DSASP z uporabo naslednje enaœbe: AG/^AHf-T-ASf [6] Doloœanje povrĝinskih lastnosti vzorcev laktoze, pripravljene s suĝenjem z razprĝevanjem, z liofilizacijo in z obarjanjem Spremembo specifiœne proste entalpije adsorpcije uporabljamo za izraœun kislih (KA) in baziœnih (KD) lastnosti trdnih povrĝin: AH SP AN1 =Kn+KA DN AN* [7] V literaturi pogosto sreœamo poenostavljeno enaœbo (neupoĝtevanje entropijskega œlena), kjer je prosta entalpija adsorpcije zamenjana s prosto energijo adsorpcije, tako da lahko kisle in baziœne lastnosti trdnih povrĝin doloœimo le pri eni temperaturi: AG*SF' -K ħK DN -KD+KA- AN' AN' [8] 3 Rezultati in razprava Vzorce laktoze smo najprej analizirali z diferenœno dinamiœno kalorimetrijo (DSC, slika 3). Originalna laktoza je monohidrat, saj je pri 145 °C prisoten dehidratacijski vrh, ki mu pri 215 °C sledi taljenje a-laktoze. DSC-krivulji originalne laktoze, suĝene z razprĝevanjem in liofilizirane laktoze vsebujeta rekristalizacijski vrh v obmoœju 160-180 °C. Pri originalni laktozi je rekristalizacija komaj opazna in jo lahko prip-iĝemo restrukturiranju kristala po odparitvi kristalno vezane vode, oziroma prisotnosti amorfne oblike. Pri laktozi, suĝeni z razprĝevanjem in liofilizirani laktozi je entalpija rekristalizacije veœja kot pri originalni laktozi in jo lahko pripiĝemo rekristalizaciji amorfnega dela vzorca, podobno kot je to storil Elamin s sodelavci prav tako na primeru laktoze (16). Pri obeh vzorcih rekristalizaciji sledi taljenje a-laktoze. DSC-krivulja oborjene laktoze kaĉe, da je v vzorcu zanemarljiv deleĉ amorfne oblike. Tako pri laktozi, suĝeni z razprĝevanjem, kot pri liofil-izirani in oborjeni laktozi gre za brezvodne vzorce, saj DSC-krivulje ne vsebujejo dehidratacijskega vrha. Slika 3: DSC-krivulje originalne laktoze, laktoze, suĝene z razprĝevanjem, liofilizirane in oborjene laktoze Figure 3: DSC curves of original, spray dried, lyophilized and precipitated lactose Stopnjo kristaliniœnosti in prisotnost razliœnih kristalnih oblik v vzorcu smo prouœevali tudi z rentgensko praĝkovno analizo (slika 4). Ugotovili smo, da se razliœno suĝeni vzorci razlikujejo od originala. Uklonski maksimumi originalne laktoze pripadajo laktozi monohidratu (Powder Diffraction File: 27-1947) (17). Rezultat se ujema z DSC-analizo vzorca. V primeru obor-jene laktoze uklonski maksimumi pripadajo brezvodni obliki laktoze (Powder Diffraction File: 39-1762) (17). Tudi pri laktozi, suĝeni z razprĝevanjem, sklepamo, da je brezvodna, œeprav je ta vzorec preteĉno amorfen in je intenziteta uklonskih maksimumov manjĝa kot pri oborjeni laktozi. Odsotnost vode v tem vzorcu smo potrdili tudi z DSC-analizo. Najbolj amorfna je liofilizirana laktoza, manj laktoza, suĝena z razprĝevanjem, in ĝe manj oborjena laktoza. Originalna laktoza izkazuje med vsemi prouœevanimi vzorci najveœjo kristaliniœnost. Rezultat je priœakovan. Slika 4: Difraktogrami originalne laktoze in vzorcev laktoze pridobljene s suĝenjem Figure 4: XRD patterns of original lactose and samples obtained after drying Tudi morfologija delcev je odvisna od postopka izdelave vzorcev. Elektronsko mikroskopska slika originalne laktoze (slika 5) kaĉe prisotnost kristalov velikih 1-100 mm. Pri oborjeni laktozi so prisotni aglomerati. S suĝenjem z razprĝevanjem so nastali delci sferiœnih oblik, z liofilizacijo pa delci v obliki ploĝœic. farm vestn 2005; 56 191 Originalni znanstveni œlanki - Scientific Articles Slika 5: Elektronsko mikroskopske slike originalne (A), oborjene (B), suĝene z razprĝevanjem (C) in liofilizirane (D) laktoze Figure 5: SEM micrographs of original lactose (A), precipitated lactose (B), spray-dried lactose (C) and lyophilized lactose (D) samples Po uspeĝnem razlikovanju vzorcev, z uporabo nekaterih standardnih metod za doloœanje fizikalno-kemijskih lastnosti praĝkov, smo vzorce laktoze analizirali ĝe z inverzno plinsko kromatografijo (IGC). Za vrednotenje povrĝine vzorcev smo uporabili tri pristope. Najprej smo izraœunali nepolarni del proste povrĝinske energije z uporabo alkanov (C6-C10, preglednica 2). Ugotovili smo, da se vrednost glede na originalno laktozo pri oborjeni laktozi in laktozi, suĝeni z razprĝevanjem, zniĉa, pri liofilizirani laktozi pa zviĝa. Vrednost nepolarnega dela proste povrĝinske energije pri oborjeni laktozi in laktozi, suĝeni z razprĝevanjem, znaĝa pribliĉno 33 mN/m2 in ju s tem parametrom ne moremo razlikovati Za razlikovanje vzorcev smo kislinski (KA) in baziœni del (KD) proste povrĝinske energije najprej doloœili pri 30 °C z uporabo enaœbe, kjer ni upoĝtevan entropijski œlen adsorpcije. Ta pristop je v farmacevtski literaturi najpogosteje uporabljan, saj je meritev kratka. Kljub temu, da je pristop termodinamsko nepravilen, so rezultati ponovljivi in pogosto uporabni za razlikovanje med vzorci, ki so si po veœini izmerjenih fizikalno-kemijskih lastnostih podobni. KA je za vse vzorce podoben, tako da razlikovanje vseh vzorcev na osnovi tega parametra ni moĉno (preglednica 2). Relativno majhne razlike med vzorci kaĉejo tudi vrednost KD. Najveœjo baziœnost izkazujeta originalna in laktoza, suĝena z razprĝevanjem, najmanjĝo pa liofilizirana laktoza. Œe za izraœun KA in KD uporabimo DH, se le-te med vzorci razlikujejo signifikantno. Vrednost KA je podobna le pri oborjeni in laktozi, suĝeni z razprĝevanjem. Vrednosti KD se najbolj razlikujejo. Najbolj baziœna je laktoza, suĝena z razprĝevanjem, najmanj pa oborjena laktoza. 192 farm vestn 2005; 56 Doloœanje povrĝinskih lastnosti vzorcev laktoze, pripravljene s suĝenjem z razprĝevanjem, z liofilizacijo in z obarjanjem Preglednica 2: Izraœunani parametri proste povrĝinske energije vzorcev laktoze Table 2: Calculated surface free energy parameters of lactose samples gsd [mN/m2] KA KD KA KD VZOREC (pri 30 °C) (pri 30 °C) (iz DH) (iz DH) Originalna laktoza 38.0 (0.9) 0.11 (0.01) 0.53 (0.02) 0.50 (0.04) 0.79 (0.09) Oborjena laktoza 33.8 (0.1) 0.12 (0.01) 0.50 (0.03) 0.42 (0.03) 0.40 (0.08) Laktoza, suĝena z razprĝevanjem 32.3 (0.2) 0.10 (0.01) 0.54 (0.02) 0.40 (0.01) 1.24 (0.08) Liofilizirana laktoza 42.3 (0.7) 0.08 (0.01) 0.47 (0.03) 0.19 (0.02) 0.71 (0.02) 4 Zakljuœek Raziskava je pokazala, da lahko z uporabo inverzne plinske kro-matografije uspeĝno razlikujemo med povrĝinami vzorcev laktoze pripravljene z razliœnimi metodami suĝenja. Rezultati so pokazali, da je potrebno za popolno razlikovanje vseh vzorcev meritve izvesti pri veœ temperaturah. Vzorci se razlikujejo tako v nepolarnih kot v speci-fiœnih prispevkih proste povrĝinske energije. Dodatno smo z DSC in rentgensko analizo ugotovili, da se vzorci razlikujejo tudi v tistih lastnostih, ki niso vezane samo na povrĝino. 5 Literatura 1. Ticehurst MD, Rowe RC, York P. Determination of the surface properties of two batches of salbutamol sulphate by inverse gas chromatography. Int J Pharm 1994; 111: 241-249. 2. Ticehurst MD, York P, Rowe RC et al. Characterization of the surface properties of a-lactose monohydrate with inverse gas chromatography, used to detect batch variation. Int J Pharm 1996; 141: 93-99. 3. Roberts RJ, Rowe RC, York P. The relationship between indentation hardness of organic solids and their molecular structure. J Matter Sci 1994; 29: 2289-2296. 4. York P, Ticehurst MD, Osborn JC et al. Characterization of the surface energetics of milled DL propranolol hydrochloride using inverse gas chro-matography and molecular modeling. Int J Pharm 1998; 174: 179-186. 5. Trowbridge L, Grimsey IM, York P. Influence of milling on the surface properties of acetaminophen. Pharm Sci 1998; (Suppl) 1(1): 310. 6. Storey RA. The nucleation, growth and solid state properties of particulate pharmaceuticals, PhD Thesis, 1997, UK, University of Bradford. 7. Grimsey IM, Sunkersett MR, Osborn JC et al. Interpretation of the differences in the surface energetics of two optical forms of mannitol by inverse gas chromatography and molecular modeling. Int J Pharm 1999; 191: 43-50. 8. florfieviċ NM, Rohr M, Hintnerleitner M et al. Adsorption of water on cyclosporine A, from zero to finite coverage. Int J Pharm 1992; 81: 21-29. 9. Sunkersett MR, Grimsey IM, Doughty SW et al. The changes in surface energetics with relative humidity of carbamazepine and paracetamol as measured by inverse gas chromatography. Eur J Pharm Sci 2001; 13: 219-225. 10. Shulz J, Lavielle L, Martin C. The role of the interface of carbon fiber epoxy composites. J Adhesion 1987; 23: 45-60. 11. Drago RS, Vogel GC, Needham TE. A four parameter equation for predicting enthalpies of adduct formation. J Am Chem Soc 1971; 93: 6014-6026. 12. Drago RS, Parr LB, Chamberlain CS. Solvent effects and their relationship to E and C equation. J Am Chem Soc 1977; 99(10): 3203-3209. 13. Gutmann V. The donor acceptor approach to molecular interactions. Plenum press, New York 1982. 14. Fowkes FM, Maruchi S. Surface acidity and basicity of polymers. J Am Chem Soc 1977; 173: 110-117. 15. Riddle FL, Fowkes FM. Spectral shifts in acid base chemistry 1. Van der Waals contributions to acceptor numbers. J Am Chem Soc 1990; 112: 3259-3269. 16. Elamin AA, Sebhatu T, Ahlneck C. The use of amorphous model substances to study mechanically activated materials in the solid state. Int J Pharm 1995; 119: 25-36. 17. PDF-2 Powder Diffraction File Database, The International Centre for Diffraction Data, Newtown Square, PA, USA. http://www.icdd.com/. farm vestn 2005; 56