Diabetična retinopatija kot subklinično vnetje 243 IzvIrnI znanstvenI članek 1 Očesna klinika, Univerzitetni klinični center ljubljana, ljubljana, slovenija 2 Univerzitetna klinika za pljučne bolezni in alergijo Golnik, Golnik, slovenija Korespondenca/ Correspondence: Mojca Urbančič, e: mojca. urbancic@kclj.si Ključne besede: diabetična retinopatija; vnetje; citokini; veGF; MCP-1; Il -6; Il -8 Key words: diabetic retinopathy; inflammation; cytokines; veGF; MCP-1; Il -6; Il -8 Prispelo: 10. 7. 2019 sprejeto: 9. 9. 2020 @publisher.id: 2972 @primary-language: sl, en @discipline-en: Microbiology and immunology, stomatology, Neurobiology, Oncology, Human reproduction, Cardiovascular system, Metabolic and hormonal disorders, Public health (occupational medicine), Psychiatry @discipline-sl: Mikrobiologija in imunologija, stomatologija, Nevrobiologija, Onkologija, r eprodukcija človeka, srce in ožilje, Metabolne in hormonske motnje, Javno zdravstvo (varstvo pri delu), Psihiatrija @article-type-en: editorial, Original scientific article, r eview article, short scientific article, Professional article @article-type-sl: Uvodnik, Izvirni znanstveni članek, Pregledni znanstveni članek, klinični primer, strokovni članek @running-header: Diabetična retinopatija kot subklinično vnetje @reference-sl: z drav vestn | maj – junij 2020 | l etnik 89 @reference-en: z drav vestn | May – June 2020 | volume 89 Diabetična retinopatija kot subklinično vnetje: Analiza citokinov v steklovini in serumu Diabetic retinopathy as a subclinical inflammation: Vitreous and serum cytokine analysis Mojca Urbančič, 1 Peter Korošec, 2 Matjaž Fležar, 2 Mojca Globočnik Petrovič 1 Izvleček Izhodišče: Diabetično retinopatijo lahko opredelimo kot kronično subklinično vnetje. Želeli smo ugotoviti razlike v ravneh vnetnih citokinov med steklovino in serumom pri bolnikih s prolifera- tivno diabetično retinopatijo (PDR) in pri kontrolni skupini ter primerjati ravni citokinov v steklo- vini glede na aktivnost PDR. Boljše poznavanje vnetnega dogajanja v očesu bolnikov s PDR bi lahko prispevalo k razvoju novih načinov zdravljenja teh bolnikov. Metode: V raziskavo smo vključili 37 bolnikov (37 oči) s PDR, pri katerih je bila potrebna vitrekto- mija, ter 20 bolnikov (20 oči) z idiopatskim foramnom makule (FM), ki so predstavljali kontrolno skupino. Glede na pregled pred operacijo in oceno očesnega ozadja med samim posegom smo opredelili aktivnost PDR. V steklovini in serumu smo s citometrično metodo CBA (angl. Cytome- tric Bead Array) analizirali citokine interlevkin 1β (IL-1β), dejavnik tumorske nekroze α (TNF-α), makrofagni vnetni protein 1α (MIP-1α), makrofagni vnetni protein 1β (MIP-1β), monocitni kemo- taktični protein 1 (MCP-1), žilni endotelni rastni dejavnik (VEGF), interlevkin 6 (IL-6), interlevkin 8 (IL-8), interlevkin 10 (IL-10) in interlevkin 12 (IL-12). Rezultati: Ravni vseh citokinov so se v steklovini pomembno razlikovale od ravni v serumu. Raven MCP-1, VEGF, IL-6, IL-8 v steklovini bolnikov s PDR je bila statistično pomembno višja v primerjavi z ravnijo v steklovini bolnikov v kontrolni skupini, raven MIP-1α, IL-10 in IL-12 v steklo- vini bolnikov s PDR je bila statistično pomembno nižja v primerjavi z bolniki v kontrolni skupini (p < 0,05). Ravni citokinov v serumu bolnikov s PDR se niso pomembno razlikovale od ravni ci- tokinov pri kontrolni skupini. Bolniki z aktivno PDR so imeli v steklovini višjo raven MCP-1, VEGF, IL-6 in IL-8 kot bolniki z inaktivno PDR, a razlike niso bile statistično značilne. Zaključek: Z našo analizo smo potrdili pomembne razlike v ravneh citokinov med steklovino in serumom pri bolnikih s PDR, kar kaže na pomen lokalnega vnetnega dogajanja v očesu pri PDR. Višje ravni MCP-1, VEGF, IL-6 in IL-8 nakazujejo aktivnost PDR. Abstract Background: Diabetic retinopathy can be defined as chronic subclinical inflammation. The purpose of this study was to investigate levels of inflammatory cytokines in the vitreous and serum of patients with proliferative diabetic retinopathy (PDR) and of control group. In addition, the purpose was to evaluate the levels of cytokines with regard to the activity of PDR. A better understanding of intraocular inflammation in patients with PDR could lead to the development of new treatment options for these patients. Methods: 37 patients with PDR (37 eyes) that required vitrectomy were included in the study. Twenty patients with idiopathic macular hole (MH) served as a control group. The activity of PDR 244 z drav vestn | maj – junij 2020 | l etnik 89 nevrObIOl OGIJa was defined based on preoperative examination and intraoperative evaluation of the fundus. Cytometric Bead Array (CBA) method was used for cytokine analysis. Cytokines interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNF-α), macrophage inflammatory protein-1α (MIP-1α), macrop- hage inflammatory protein-1β (MIP-1β), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), vascular endothelial growth factor (VEGF), interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8), interleukin-10 (IL-10) and interleukin-12 (IL-12) were analysed in vitreous and serum samples. Results: Levels of all cytokines in the vitreous differed significantly from levels in the serum. Levels of MCP-1, VEGF, IL-6, IL-8 were significantly higher in the vitreous of patients with PDR in comparison with vitreous levels in the control group. Vitreous levels of MIP-1α, IL-10 and IL-12 in patients with PDR were significantly lower in comparison with the control group (p < 0.05). Se- rum levels of cytokines were similar in both groups. Patients with active PDR had higher vitreous levels of MCP-1,VEGF, IL-6 and IL-8 in comparison with patients with inactive disease, although the differences were not significant. Conclusion: Significant differences in cytokine levels in the vitreous compared to serum levels in patients with PDR indicate the importance of local intraocular inflammation. Higher levels of MCP-1, VEGF, IL-6 and IL-8 might reflect the activity of PDR. Citirajte kot/Cite as: Urbančič M, korošec P, Fležar M, Globočnik Petrovič M. [Diabetic retinopathy as a subclinical inflammation: vitreous and serum cytokine analysis]. z drav vestn. 2020;89(5–6):243–54. DOI: 10.6016/z dravvestn.2972 1 Uvod Diabetična retinopatija (DR) je po- zni zaplet sladkorne bolezni in še vedno pomemben vzrok slepote v delovno ak- tivni populaciji (1). Prve klinično vidne spremembe na očesnem ozadju so obi- čajno mikroanevrizme. Okvara mrež- ničnih žil se kaže kot večja prepustnost žilja ter zapore kapilar. V ečja prepustnost žilja vodi v nastanek edema mrežnice, v mrežnici pa se pojavijo krvavitve in trdi eksudati. Z napredovanjem ishemije za- čenjo nastajati neovaskularizacije. Glede na prisotnost neovaskularizacij delimo diabetično retinopatijo v dve stopnji: neproliferativno, ko neovaskularizacij še ni, in proliferativno, ko so že priso- tne. Zapleti proliferativne diabetične retinopatije so krvavitve v steklovino in trakcijski odstop mrežnice. Posebej opredelimo tudi stanje centralnega dela mrežnice – makule. Če so prisotne di- abetične spremembe v makuli, govorimo o diabetični makulopatiji oziroma di- abetičnem makularnem edemu. Stanja, ki resno ogrožajo vid, so zapleti prolife- rativne diabetične retinoaptije in diabe- tični makularni edem. Biokemični mehanizmi, s katerimi hiperglikemija povzroči spremembe v tkivih, niso v celoti pojasnjeni. Obstaja več teorij, najpomembnejše so teorija aldoza reduktaze, teorija končnih pro- duktov glikacije, teorija reaktivnih ki- sikovih spojin oziroma oksidativnega stresa, teorija protein kinaze C in teorija vnetja. Čeprav se DR klinično kaže pred- vsem s spremembami na žilju mrežnice, jo lahko opredelimo tudi kot kronično subklinično vnetje. Vnetje se odslikava s spremembami na molekularni ravni, s spremembami na ravni celic in s funk- cionalnimi spremembami, kot sta večja prepustnost žilja in slabša vidna funkci- ja (2). Citokini so raznovrstna skupina pro- teinov, ki so ključnega pomena v interak- cijah med vnetnimi in drugimi celicami. Posamezne celice lahko sintetizirajo raz- Diabetična retinopatija kot subklinično vnetje 245 IzvIrnI znanstvenI članek lične citokine. Posamezen citokin lahko vpliva na različne tipe celic, lahko pa tudi različno vpliva na populacijo istih celic. Učinke posameznih citokinov pogosto uravnavajo drugi citokini. Tarčne celice, na katere citokin deluje, so lahko iste ce- lice, ki izločajo citokin, celice v neposre- dni bližini ali v istem mikrookolju, lahko pa tudi bolj oddaljene celice. Citokine, ki uravnavajo delitev celic, imenujemo rastni dejavniki. Citokine, ki vplivajo na kemotakso celic, imenujemo kemokini. Hipoksija in ishemija sprožita večje nastajanje žilnega endotelnega rastne- ga dejavnika (VEGF) v mrežnici, kar povzroči večjo izraženost adhezijskih molekul in levkostazo. Levkostaza vodi v zaporo žilja in zato dodatno ishemijo, ki sproži dodatno sproščanje vnetnih in angiogenih dejavnikov. Poleg VEGF se poveča sinteza drugih vnetnih citokinov in kemokinov, kot so npr. dejavnik tu- morske nekroze α (TNF-α), interlevkin 1β (IL-1β), kemotaktični protein za mo- nocite 1 (MCP-1) in makrofagni vnetni protein (MIP). Zlasti TNF-α in IL-1β naj bi bila ključna za porušenje krvno-mre- žnične pregrade in za degeneracijo ka- pilar mrežnice (3). Angiogeni dejavniki stimulirajo in modulirajo nastajanje ne- ovaskularizacij, ki so značilne za prolife- rativno diabetično retinopatijo (PDR). V vnetnem okolju je prisotna večja ak- tivnost matriksnih metaloproteinaz, ki razgrajujejo zunajcelični matriks (4) in na ta način omogočijo angiogenezo. Matriksno metaloproteinazo 9 (MMP- 9) inducira IL-8, isti encim pa nasprotno tudi aktivira IL-8, ki rekrutira več vne- tnih celic, kar ustvarja destruktivno po- zitivno povratno zanko (5). V več študijah so v steklovini bolnikov s PDR ugotovili višjo raven VEGF (5-12). Raven VEGF je korelirala z aktivnostjo bolezni (10,11,13). V steklovini bolnikov s PDR so ugotovili tudi višjo raven MCP- 1 (6-8,11,13), IL-6 (7,9) in IL-8 (7,9,12,14). Ravni MCP-1, IL-6 in IL-8 v steklovini bolnikov s PDR so korelirale z ravnijo VEGF (6). Višja raven IL-6 v steklovini pri bolnikih s PDR je korelirala z ak- tivnostjo bolezni (15), višja raven IL-8 pa z ishemijo in slabšo napovedjo izida za vid (16 ,17). V nekaterih študijah so v steklovini bolnikov s PDR ugotovili tudi višjo raven IL-1β in TNF-α (9,18) ter MIP-1β (19). Tudi v serumu bolnikov s sladkorno boleznijo so ugotovili spremembe v rav- ni citokinov. Tako pri bolnikih s sladkor- no boleznijo tipa 1 kot tipa 2 je višja ra- ven C-reaktivnega proteina (CRP), IL-6 in TNF-α ter zlasti ICAM-1, VCAM-1 in E-selectina povezana z nefropatijo, retinopatijo in srčno-žilnimi bolezni- mi (20). Tudi v drugih študijah so v se- rumu bolnikov s PDR ugotovili višjo ra- ven TNF- α, pa tudi VEGF , MCP-1, IL-1β, IL-6 in IL-8 (18,20-22). Nekatere študije niso pokazale razlik v ravneh citokinov IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-10 in IL-12 v seru- mu bolnikov z DR v primerjavi s kontro- lno skupino (22,23). Z našo analizo smo želeli ugotoviti razlike v ravneh citokinov med steklo- vino in serumom pri bolnikih s PDR in kontrolno skupino ter primerjati ravni citokinov v steklovini glede na aktivnost PDR. Boljše poznavanje vnetnega do- gajanja v očesu bolnikov s PDR bi lah- ko prispevalo k razvoju novih načinov zdravljenja teh bolnikov. 2 Metode V raziskavo smo vključili 37 bolnikov s sladkorno boleznijo tipa 2 (37 oči) s PDR, pri katerih je bila potrebna vitrek- tomija zaradi trakcijskega odstopa, ter 20 bolnikov (20 oči) z idiopatskim fora- mnom makule (FM), ki so predstavljali kontrolno skupino. Izključitvena merila za skupino bol- nikov s PDR so bila: sveža krvavitev v 246 z drav vestn | maj – junij 2020 | l etnik 89 nevrObIOl OGIJa steklovino (manj kot tri mesece), laser- ska fotokoagulacija v zadnjih treh me- secih, zapleti med in po operaciji, izra- zite spremembe v fovei (atrofija, fibroza, trdi eksudati), katarakta ter vrednosti glikiranega hemoglobina (HbA1c) nad 10 %. Izključitveno merilo za kontrol- no skupino je bila sladkorna bolezen. Izključitvena merila za obe skupini so bili predhodna vitrektomija, sočasna pri- sotnost druge očesne bolezni, sistemske vnetne bolezni ali hematološke bolezni. Bolniki so bili seznanjeni z name- nom in potekom raziskave in so se vanjo vključili prostovoljno. Pred vključitvi- jo v raziskavo so podali pisno soglasje k sodelovanju. Raziskavo je odobrila Komisija Republike Slovenije za medi- cinsko etiko (118/12/11). Raziskava je bila opravljena v skladu s Helsinško deklara- cijo iz leta 1975 (revizija 1983). Popisali smo klinične značilnosti bol- nikov (starost, spol, trajanje sladkorne bolezni, vrednost glikiranega hemog- lobina, indeks telesne mase, prisotnost zdravljenja z inzulinom, arterijske hiper- tenzije, hiperlipidemije). Podatke o bol- nikovem splošnem zdravstvenem sta- nju in urejenosti sladkorne bolezni smo pridobili z anamnezo in od bolnikove- ga splošnega zdravnika ali diabetologa. Vrednost HbA1c, izraženo v odstotkih glikiranega hemoglobina, smo izmerili z analizo venske krvi en dan pred opera- cijo. HbA1c odslikava povprečno raven glukoze v krvi v zadnjih 6–8 tednih in nam služi za oceno urejenosti sladkor- ne bolezni. Arterijsko hipertenzijo smo opredelili s sistoličnim tlakom, enakim ali višjim od 140 mm Hg in/ali z diasto- ličnim tlakom, enakim ali višjim od 85 mm Hg, ali na podlagi podatka, da bolnik jemlje antihipertenzivna zdravila. Hiperlipidemijo smo opredelili na pod- lagi vrednosti celokupnega holesterola več kot 5 mmol/l in/ali vrednosti trigli- ceridov več kot 2 mmol/l ali na podlagi podatka, da bolnik jemlje hipolipemična zdravila. Vsi bolniki so opravili pred opera- cijo natančen oftalmološki pregled z določitvijo najboljše korigirane vidne ostrine, pregled na biomikroskopu in pregled očesnega ozadja pri široki zeni- ci. Opravili smo gonioskopijo in izmerili očesni tlak. Pri pregledu očesnega ozadja smo beležili aktivne ali neaktivne neova- skularizacije ter obliterirane mrežnične žile pa tudi morebitne dodatne spre- membe v makuli. Spremembe očesnega ozadja smo vrednotili tudi med operaci- jo. Bolnikom smo slikali očesno ozadje s fundusno kamero in makulo z optično koherenčno tomografijo (OCT). Glede na pregled očesnega ozadja pred operacijo in oceno očesnega ozadja med posegom smo opredelili aktivnost PDR. Opredelitev aktivnosti PDR smo povzeli po študiji Aiella s sod.: PDR smo opredelili kot aktivno retinopatijo, če so bile ob pregledu (pred in/ali med ope- racijo) v fibrovaskularnih membranah vidne prekrvljene žile, ali kot neaktivna (involutivna) retinopatija, če so bile pri- sotne le fibrozne membrane brez pre- krvljenih žil (11). Tik pred operacijo smo odvzeli vzo- rec venske krvi (dve epruveti) iz komo- lčne vene. Ob začetku vitrektomije smo odvzeli vzorec nerazredčene steklovine (0,5–1,0 ml). Steklovino smo vsrkali iz centralnega dela steklovinskega pros- tora z vitrektomom v brizgo, ki smo jo priključili na sistem vitrektoma, preden smo odprli dotok znotrajočesne tekoči- ne (angl. balanced salt solution, BSS) po infuzijski cevki v oko. Vzorec nerazredčene steklovine, ki smo ga odvzeli ob začetku vitrektomi- Diabetična retinopatija kot subklinično vnetje 247 IzvIrnI znanstvenI članek je, in serum smo zamrznili na –80 °C in shranili do analize. V steklovini in kontrolnem serumu smo s citometrično metodo CBA (angl. Cytometric Bead Array) analizirali cito- kine interlevkin 1β (IL-1β), dejavnik tu- morske nekroze α (TNF-α), makrofagni vnetni protein 1α (MIP-1α), makrofagni vnetni protein 1β (MIP-1β), monocitni kemotaktični protein 1 (MCP-1), žilni endotelni rastni dejavnik (VEGF), in- terlevkin 6 (IL-6), interlevkin 8 (IL-8), interlevkin 10 (IL-10) in interlevkin 12 (IL-12). Statistična analiza. Vrednosti spre- menljivk niso bile normalno porazde- ljene, zato smo za opis uporabili medi- ano ter najmanjšo in največjo vrednost. Za oceno razlik med primerjanimi skupinami smo uporabili Wilcoxonov test predznačenih rangov in Mann- Whitneyjev test. Za oceno korelacije med skupinami spremenljivk smo upo- rabili Spearmanov korelacijski koefici- ent. Zaradi večjega števila testov smo pri oceni statistične pomembnosti uporabili Benjamini-Hochbergovo prilagojeno vrednost p. Kot statistično pomembno smo upoštevali vrednost p, manjšo od 0,05. Statistično analizo smo opravili z računalniškim programom SPSS, verzija 19 (SPSS Inc., Illinois). 3 Rezultati Raven citokinov smo določali v vzor- cih steklovine in seruma 37 bolnikov s PDR ter 20 bolnikov kontrolne skupine (FM). Klinične značilnosti bolnikov so prikazane v Tabeli 1. Raven citokinov v steklovini smo pri bolnikih s PDR primerjali z ravnijo ci- Tabela 1: Klinične značilnosti bolnikov s PDR (n = 37) in kontrolne skupine s foramnom makule (FM) (n = 20). PDR (n = 37) FM (n = 20) Vrednost p Starost (leta) 62,5 ± 11,5 71,2 ± 10,2 0,009 Spol 19 moških (51,4 %), 18 žensk (48,6 %) 8 moških (40,0 %), 12 žensk (60,0 %) 0,32 Trajanje SB (leta) 13,8 ± 8,8 0 HbA1c (%) 7,9 ± 1,0 0 Zdravljenje z inzulinom (n) 16 (70,3 %) 0 Incidenca arterijske hipertenzije (n) 35 (94,6 %) 7 (31,8 %) 0,0001 Incidenca hiperlipidemije (n) 21 (56,7 %) 6 (27,3 %) 0,0001 BMI 30,7 ± 4,8 24,0 ± 6,3 0,0001 NV šarenice/zakotja (n) 2 (5,4 %) 0 Aktivnost PDR 27 aktivna (72,9 %), 10 neaktivna (27,1 %) 0 l egenda: PDr – bolniki s proliferativno diabetično retinopatijo; FM – bolniki z idiopatskim foramnom makule; sb – sladkorna bolezen; Hba1c – glikirani hemoglobin; bMI – indeks telesne mase; nv – neovaskularizacija 248 z drav vestn | maj – junij 2020 | l etnik 89 nevrObIOl OGIJa tokinov v serumu (Tabela 2). Ravni vseh analiziranih citokinov so bile v steklo- vini statistično pomembno različne od ravni v serumu, najbolj pa so izstopale razlike v ravni MCP-1, VEGF, IL-6, IL-8 (p = 0,0025; višja raven v steklovini kot v serumu) ter IL-12 (p = 0,0025; nižja ra- ven v steklovini kot v serumu). Raven MIP-1α je bila v 16 vzor - cih steklovine bolnikov s PDR nižja od minimalne zaznavne koncentracije (< 7 pg / ml), prav tako raven IL-12 v enem vzorcu (< 1 pg/ml) in IL-10 v dveh vzor - cih (< 5 pg/ml). V enem vzorcu seruma bolnika s PDR je bila raven TNF-α nižja od minimalne zaznavne koncentracije (< 3 pg/ml). Pri dveh bolnikih kontrolne skupine je bila raven MIP-1β v steklovini pod zaznavno mejo 1 pg/ml. Primerjavo vzorcev bolnikov s PDR z vzorci bolnikov s FM prikazuje Tabela 3. Vzorci steklovine se glede na raven IL- 1β, TNF-α in MIP-1β niso pomembno razlikovali, statistično pomembne raz- like pa so bile v ravneh drugih citoki- nov, pri čemer je najbolj izstopala raz- lika v ravni VEGF, MCP-1, IL-6 in IL-8 (p = 0,00025). V vzorcih serumov med skupinama nismo ugotovili pomembne razlike v ravni citokinov. Raven MCP-1 v steklovini bolni- kov s PDR je dobro korelirala z ravnijo IL-6 v steklovini (Spearmanov koefici- ent 0,65; p = 0,0001) ter z ravnijo IL-8 (Spearmanov koeficient 0,51; p = 0,002). Zmerno korelacijo smo ugotovili tudi med ravnijo VEGF in IL-8 (Spearmanov koeficient 0,43; p = 0,01), med TNFα Tabela 2: Primerjava vzorcev steklovine in seruma bolnikov s PDR (mediana, najmanjša vrednost – največja vrednost; Wilcoxonov test predznačenih rangov). Bolniki s PDR (n = 37) steklovina serum p- vrednost (Benjamini-Hochberg) IL-1β (pg/ml) 9,15 (7,51–67,36) 7,54 (6,91–15,16) 0,0025 TNF-α (pg/ml) 13,4 (2,41–69,09) 5,67 (0–23,35) 0,008 MIP-1β (pg/ml) 12,09 (2,9–38,02) 18,9 (6,89–48,83) 0,0056 IL-12 (pg/ml) 3,17 (0–22,26) 17,7 (2,49–42,91) 0,0002 MCP-1 (pg/ml) 1404,75 (403,05– 3990,74) 72,6 (25,06–227,83) 0,0002 MIP-1α (pg/ml) 9,55 (0–82,83) 14,36 (7,78–91,74) 0,0014 IL-8 (pg/ml) 93,29 (20,04–295,71) 12,08 (10,12–31,69) 0,0002 VEGF (pg/ml) 334,96 (26,41–1439,3) 39,74 (6,17–149,12) 0,0002 IL-6 (pg/ml) 60,82 (13,64–798,23) 5,95 (2,41–24,76) 0,0002 IL-10 (pg/ml) 5,67 (0–8,12) 7,64 (5,3–15,28) 0,0014 l egenda: PDr – proliferativna diabetična retinopatija; Il -1β – interlevkin 1β; tnF-α – dejavnik tumorske nekroze α; MIP-1β – makrofagni vnetni protein 1β; Il -12 – interlevkin 12; MCP-1 – monocitni kemotaktični protein 1; MIP-1α – makrofagni vnetni protein 1α; Il -8 – interlevkin 8; veGF – žilni endotelni rastni dejavnik; Il -6 – interlevkin 6; Il -10 – interlevkin 10. Diabetična retinopatija kot subklinično vnetje 249 IzvIrnI znanstvenI članek in IL-10 (Spearmanov koeficient 0,42; p = 0,014), med IL-6 in MIP-1β (Spearmanov koeficient 0,40; p = 0,02), med MIP-1α in IL-10 (Spearmanov koe- ficient 0,36; p = 0,04), med IL-6 in IL-10 (Spearmanov koeficient 0,35; p = 0,04), med IL-12 in IL-10 (Spearmanov koe- ficient 0,35; p = 0,042) ter med IL-8 in TNF-α (Spearmanov koeficient 0,35; p = 0,045). Primerjavo vzorcev steklovine bol- nikov s PDR (n = 37) z aktivno in ne- aktivno obliko PDR prikazuje Tabela 4. Aktivno bolezen je imelo 27 bolnikov s PDR, neaktivno obliko PDR pa 10 bol- nikov. Bolniki z aktivno PDR so imeli v steklovini višje ravni MCP-1, VEGF, IL-8 in IL-6, toda razlike niso bile statistično značilne. 4 Razpravljanje Bolniki s PDR so imeli v steklovini pomembno različne ravni vseh določe- nih citokinov v primerjavi s serumom. Bolniki s PDR so imeli v steklovini po- Tabela 3: Primerjava vzorcev skupine PDR z vzorci kontrolne skupine s foramnom makule (FM) (mediana, najmanjša vrednost – največja vrednost; Mann-Whitneyjev test). Steklovina Serum PDR (n = 37) FM (n = 20) p-vrednost (Benjamini- Hochberg) PDR (n = 37) FM (n = 20) p-vrednost (Benjamini- Hochberg) IL-1β (pg/ml) 9,15 (7,51–67,36) 10,5 (7,7–35,99) 0,53 7,54 (6,91–15,16) 7,72 (5,55–15,55) 0,89 TNF-α (pg/ml) 13,4 (2,41–69,09) 21,5 (5,16–38,4) 0,29 5,67 (0–23,35) 4,79 (4,0–8,76) 0,79 MIP-1β (pg/ ml) 12,09 (2,9–38,02) 13,44 (0–14,4) 0,31 18,9 (6,89–48,83) 17,72 (10,5–27,72) 0,60 IL-12 (pg/ml) 3,17 (0–22,26) 3,99 (2,56–11,18) 0,04 17,7 (2,49–42,91) 11,71 (7,09–18,84) 0,71 MCP-1 (pg/ml) 1404,75 (403,05– 3990,74) 374,17 (295,01–881,87) 0,00025 72,6 (25,06–227,83) 43,4 (30,24–76,64) 0,10 MIP-1α (pg/ ml) 9,55 (0–82,83) 14,25 (9,67–47,34) 0,014 14,36 (7,78–91,74) 20,38 (11,83–91,07) 0,52 IL-8 (pg/ml) 93,29 (20,04–295,71) 14,49 (13,12–16,64) 0,00025 12,08 (10,12–31,69) 12,71 (11,21–13,33) 0,80 VEGF (pg/ml) 334,96 (26,41–1439,3) 4,58 (3,5–31,79) 0,00025 39,74 (6,17–149,12) 25,73 (17,62–63,61) 0,78 IL-6 (pg/ml) 60,82 (13,64–798,23) 6,0 (5,28–8,1) 0,00025 5,95 (2,41–24,76) 9,14 (5,81–28,4) 0,60 IL-10 (pg/ml) 5,67 (0–8,12) 6,05 (5,84–6,08) 0,04 7,64 (5,3–15,28) 6,63 (5,43–8,43) 0,60 l egenda: PDr – skupina bolnikov s PDr; FM – skupina bolnikov s foramnom makule; Il -1β – interlevkin 1β; tnF-α – dejavnik tumorske nekroze α; MIP-1β – makrofagni vnetni protein 1β; Il -12 – interlevkin 12; MCP-1 – monocitni kemotaktični protein 1; MIP-1α – makrofagni vnetni protein 1α; Il -8 – interlevkin 8; veGF – žilni endotelni rastni dejavnik; Il -6 – interlevkin 6; Il -10 – interlevkin 10. 250 z drav vestn | maj – junij 2020 | l etnik 89 nevrObIOl OGIJa membno različne ravni citokinov IL-12, MCP-1, MIP-1α, IL-8, VEGF, IL-6 in IL- 10 v primerjavi z bolniki kontrolne sku- pine. Bolniki z aktivno PDR so imeli v steklovini višje ravni MCP-1,VEGF, IL-8 in IL-6 v primerjavi z bolniki z neaktiv- no PDR, čeprav razlike niso bile statistič- no značilne. Bolniki s PDR in kontrolna skupina so imeli podobne ravni citoki- nov v serumu. Citokini igrajo pomembno vlogo pri aktiviranju levkocitov, ojačanju in širitvi lokalnega vnetja ter v moduliranju celič- ne proliferacije in razvoju neovaskulari- zacije. Izvora citokinov v steklovini ne moremo natančno določiti. Prav gotovo jih tvorijo celice mrežnice kot odgovor na vnetje, vendar citokini lahko prehaja- jo v steklovino tudi iz krvi prek porušene krvno-mrežnične pregrade. Tvorijo jih tudi vnetne celice v steklovini. Ne glede na svoj izvor citokini vplivajo na razvoj DR neposredno in posredno, na podla- gi ravni citokinov v steklovini pa lahko posredno sklepamo na dogajanje v mre- žnici. V steklovini bolnikov s PDR smo ugotovili višjo raven MCP-1, IL-8, VEGF , IL-6, IL-1β in TNF-α, kot v serumu. MCP-1 je najpogostejši kemokin in pomemben dejavnik v patogenezi vne- tnih sprememb v mrežnici pri DR. Igra pomembno vlogo pri kemotaksi, sproži angiogenezo in fibrozo (24). Pri bolnikih s PDR so ugotovili višjo raven MCP-1 v steklovini v primerjavi s kontrolno sku- pino, raven v steklovini pa je bila tudi pomembno višja kot v serumu in je ko- Tabela 4: Primerjava vzorcev steklovine bolnikov s PDR z aktivno in neaktivno obliko PDR (mediana, najmanjša vrednost – največja vrednost; Mann-Whitneyjev test). PDR (n = 37) aktivna PDR (n = 27) neaktivna PDR (n = 10) p-vrednost (Benjamini- Hochberg) IL-1β (pg/ml) 8,07 (7,51–67,36) 28,14 (7,71–56,44) 0,41 TNF-α (pg/ml) 13,41 (2,41–69,09) 19,58 (3,51–31,52) 0,64 MIP-1β (pg/ml) 11,85 (2,9–30,67) 16,36 (4,56–38,02) 0,32 IL-12 (pg/ml) 2,66 (0–14,99) 3,80 (1,07–22,26) 0,41 MCP-1 (pg/ml) 1623,19 (437,43–3990,74) 987,23 (403,05–1625,84) 0,06 MIP-1α (pg/ml) 0 (0–68,26) 12,58 (0–82,83) 0,48 IL-8 (pg/ml) 112,76 (37,57–295,71) 54,97 (20,04–275,07) 0,225 VEGF (pg/ml) 477,87 (26,41–1439,30) 188,32 (29,86–1367,13) 0,20 IL-6 (pg/ml) 62,95 (20,41–798,23) 32,82 (13,64–220,31) 0,42 IL-10 (pg/ml) 5,57 (0–6,9) 5,79 (5,37–8,12) 0,26 l egenda: PDr – vzorci steklovine bolnikov s PDr; Il -1β – interlevkin 1β; tnF-α - dejavnik tumorske nekroze α; MIP-1β – makrofagni vnetni protein 1β; Il -12 – interlevkin 12; MCP-1 – monocitni kemotaktični protein 1; MIP-1α – makrofagni vnetni protein 1α; Il -8 – interlevkin 8; veGF – žilni endotelni rastni dejavnik; Il -6 – interlevkin 6; Il -10 – interlevkin 10. Diabetična retinopatija kot subklinično vnetje 251 IzvIrnI znanstvenI članek relirala z aktivnostjo PDR (11,19). Naši rezultati se ujemajo z ugotovitvami ome- njenih študij. Yoshimura s sod. je ugotovil po- membno višjo raven IL-6, IL-8 in MCP-1 v steklovini bolnikov s PDR in DME in pomembno višjo raven VEGF v steklo- vini bolnikov s PDR (6). Več drugih študij je prav tako ugotovilo višjo ra- ven IL-6 in IL-8 v steklovini bolnikov s PDR (9,17,19). Naši rezultati se ujemajo z rezultati omenjenih študij. Vloga IL-6 in IL-8 v patogenezi PDR ni popolno- ma pojasnjena. IL-6 in vitro lahko vpli- va na obliko endotelnih celic in s tem na krvno-mrežnično pregrado (25). IL-8 deluje kemoatraktivno, aktivira nevtro- filce in limfocite T ter deluje tudi angi- ogeno. Ugotovljeno je bilo, da njegova raven v steklovini korelira z aktivnostjo PDR (11). Samo porušenje krvno-mre- žnične pregrade najverjetneje ni edini in zadosten razlog za višjo raven IL-6 in IL-8 v steklovini. Bolj verjetno je, da oba citokina tvorijo tudi celice, prisotne v steklovini bolnikov s PDR (makrofagi, monociti, celice glija, celice retinalnega pigmentnega epitela). VEGF je proangiogeni citokin, ki je ključnega pomena za razvoj neovaskula- rizacij, pomembno pa vpliva tudi na krv- no-mrežnično pregrado. Številne študije so dokazale višjo raven VEGF pri bolni- kih s PDR (6,8-11) in korelacijo VEGF z aktivnostjo bolezni (5,10,11,13). Tudi v naši raziskavi smo ugotovili višjo raven VEGF v steklovini bolnikov s PDR tako v primerjavi s serumom kot v primerjavi s steklovino kontrolne skupine. Bolniki z aktivno PDR so imeli višjo raven VEGF v steklovini kot bolniki z neaktivno PDR, vendar razlike niso bile statistično pomembne. IL-1β je provnetni citokin, za katere- ga je bilo v študijah na živalskih modelih ugotovljeno, da igra pomembno vlogo pri razvoju DR. Ker ima kratek razpolov- ni čas in ker nastaja pretežno v tkivu, je višjo raven v steklovini bolnikov s slad- korno boleznijo v primerjavi s kontrolno skupino dokazalo le malo študij (18,26) . V študiji, ki jo je opravil Yoshimura s sod., IL-1β v steklovini bolnikov s PDR niso dokazali, ker so bile koncentraci- je pod zaznavno mejo metode, ki so jo uporabili (6). Raven IL-1β v steklovini se v naši raziskavi ni pomembno razlikova- la med skupino bolnikov s PDR in kon- trolno skupino. TNF-α je provnetni citokin, ki je vključen v patogenezo številnih kro- ničnih vnetnih bolezni. Pri bolnikih s sladkorno boleznijo so ugotovili višjo raven TNF-α v serumu v primerjavi s kontrolno skupino ter močno korelacijo med ravnijo TNF-α v serumu in napre- dovalostjo DR (18,21). V študiji, ki jo je opravil Yoshimura s sod. (6), je bila ra- ven TNF-α v steklovini bolnikov s PDR nezaznavna, v naši raziskavi pa je bila v steklovini bolnikov s PDR sicer višja kot v serumu, vendar se ni pomembno raz- likovala od ravni v steklovini bolnikov kontrolne skupine. Tudi TNF-α ima po- dobno kot IL-1β kratek razpolovni čas, kar lahko daje lažno negativne rezultate. Ravni IL-12, IL-10 ter MIP-1α in MIP- 1β so bile v naši raziskavi v steklovini po- membno nižje kot v serumu. IL-12 je provnetni citokin z antiangio- genim delovanjem (27). Študij, v katerih so preučevali IL-12 pri ljudeh s sladkor - no boleznijo, je zelo malo. Pri otrocih s sladkorno boleznijo tipa 1 in DR so ugotovili pomembno nižjo raven IL-12 v serumu v primerjavi s kontrolno skupi- no (27). Z našo raziskavo smo ugotovili pomembno nižjo raven IL-12 v steklo- vini bolnikov s PDR v primerjavi s se- rumom. Raven IL-12 je bila v steklovini 252 z drav vestn | maj – junij 2020 | l etnik 89 nevrObIOl OGIJa bolnikov s PDR tudi pomembno nižja v primerjavi s kontrolno skupino, čeprav so vrednosti precej variirale. O možni vlogi protivnetnih citokinov v patogenezi PDR je malo znanega. IL-10 je protivnetni citokin, ki ustavi makrofa- ge in zavira izražanje VEGF. Mao s sod. je ugotovil višjo raven IL-10 v steklovi- ni bolnikov s PDR (28), kar naj bi bilo v skladu z zaščitno vlogo IL-10 v vnetnem okolju. Nasprotno pa Hernandez in sod. niso ugotovili višje ravni IL-10 v steklo- vini bolnikov s PDR, iz česar so sklepali, da višje ravni provnetnih citokinov ne izzovejo tudi povišanja ravni citokinov z nasprotnim učinkom (29). Podobno tudi Zhou s sod. ni našel pomembne razlike med ravnijo IL-10 v steklovini bolni- kov s PDR in ravnijo IL-10 v steklovini kontrolne skupine (10). Naši rezultati so v skladu z zaključki Hernandeza s sod. in Zhouja s sod., saj je bila raven IL-10 v steklovini naših bolnikov s PDR nižja kot raven v steklovini kontrolne skupine. MIP-1α in MIP-1β tvorijo makrofagi, delujeta kemotaktično, pomembna pa sta tudi v patogenezi neovaskularizaci- je mrežnice (30). Polimorfonuklearne celice, aktivirane z MIP-1α in MIP-1β, sproščajo citokine, kot so IL-1β, IL-6 in TNF-α. V študiji, ki jo je opravil Maier s sod., niso bile zaznavne ravni MIP-1α in MIP-1β v vzorcih steklovine tako v skupini bolnikov s PDR kot v kontrol- ni skupini, prav tako Capeans s sod. ni dokazala prisotnosti MIP-1α in MIP-1β v vzorcih steklovine skupine bolnikov s PDR in kontrolne skupine (14,30). Capeans s sod. je na podlagi rezultatov svoje študije sklepala, da MIP-1α in MIP- 1β verjetno nista vpletena v patogene - zo PDR. Yoshimura in sod. so dokazali MIP-1β le v steklovini nekaterih bolni- kov s PDR, raven MIP-1α pa je bila nižja od minimalne zaznavne koncentraci- je (6). V naši študiji je bila raven MIP-1α nad minimalno zaznavno mejo v 21 od 37 vzorcev steklovine bolnikov s PDR (56,7 %) ter v vseh vzorcih steklovine kontrolne skupine (100 %), razlike v rav- ni so bile statistično pomembno različne, variabilnost pa je bila v skupini bolnikov s PDR zelo velika. Raven MIP-1β je bila nižja od minimalne zaznavne koncen- tracije le v dveh vzorcih steklovine kon- trolne skupine, v vseh vzorcih steklovine bolnikov s PDR pa smo dokazali priso- tnost MIP-1β. Razlike med skupinama niso bile statistično pomembne. Med skupino bolnikov z aktivno obliko PDR in skupino bolnikov z neaktivno obliko PDR ni bilo pomembne razlike v ravni MIP-1α in MIP-1β. Glede na naše rezul- tate lahko pritrdimo sklepu Capeans s sod., da MIP-1α in MIP-1β verjetno ni- mata pomembne vloge v patogenezi DR. Statistično pomembno razliko med sku- pino bolnikov s PDR in kontrolno sku- pino, ki smo jo ugotovili glede na raven MIP-1α v steklovini, lahko pripišemo večji variabilnosti ravni v posameznih vzorcih (razpon 0–82,83 pg/ml pri bol- nikih s PDR v primerjavi z razponom 9,67–47,34 pg/ml pri kontrolni skupini). To pa posredno prav tako lahko kaže na verjetno manjši pomen MIP-1α v pato- genezi DR. 5 Zaključek Vnetje v očesu je povezano s spre- membami, ki nastanejo v sklopu diabe- tične retinopatije. Z našo raziskavo smo pri bolnikih s PDR dokazali pomembne razlike v ravneh citokinov med steklo- vino in serumom. Višja raven MCP-1, VEGF, IL-6 in IL-8 ter nižja raven MIP- 1α, IL-10 in IL-12 v steklovini bolnikov s PDR v primerjavi s kontrolno skupino dodatno potrjuje pomen lokalnega vne- Diabetična retinopatija kot subklinično vnetje 253 IzvIrnI znanstvenI članek tja v očesu pri diabetični retinopatiji. Višje ravni MCP-1, VEGF, IL-6 in IL-8 v steklovini nakazujejo aktivnost PDR. Boljše poznavanje patogenetskih meha- nizmov in lokalnega vnetnega dogajanja v očesu lahko prispeva k razvoju učinko- vitejših načinov zdravljenja. Literatura 1. Fong Ds, aiello l, Gardner tW, king Gl, blankenship G, Cavallerano JD, et al.; american Diabetes associati- on. r etinopathy in diabetes. Diabetes Care. 2004;27:s84-7. 2. t ang J, kern ts. Inflammation in diabetic retinopathy. Prog r etin eye r es. 2011;30(5):343-58. 3. kaur C, Foulds Ws, ling ea. blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management. Prog r etin eye r es. 2008;27(6):622-47. 4. Ishizaki e, t akai s, Ueki M, Maeno t , Maruichi M, sugiyama t , et al. Correlation between angiotensin-con- verting enzyme, vascular endothelial growth factor, and matrix metalloproteinase-9 in the vitreous of eyes with diabetic retinopathy. am J Ophthalmol. 2006;141(1):129-34. 5. van den steen Pe, Proost P, Wuyts a, van Damme J, Opdenakker G. neutrophil gelatinase b potentiates interleukin-8 tenfold by aminoterminal processing, whereas it degrades C taP-III, PF-4, and GrO-alpha and leaves rantes and MCP-2 intact. blood. 2000;96(8):2673-81. 6. Yoshimura t , sonoda kH, sugahara M, Mochizuki Y, enaida H, Oshima Y, et al. Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases. Pl os One. 2009;4(12):e8158. 7. Chan CC, smith WM. Inflammatory r esponse and Mediators in r etinal Injury. In: ryan s J, editor. r etina. 5th ed. Philadelphia: W.b. saunders; 2013. pp. 553-61. 8. abu el-asrar aM, struyf s, kangave D, Geboes k, van Damme J. Chemokines in proliferative diabetic retino- pathy and proliferative vitreoretinopathy. eur Cytokine netw. 2006;17(3):155-65. 9. abu el-a srar aM, nawaz MI, kangave D, Mairaj siddiquei M, Geboes k. angiogenic and vasculogenic factors in the vitreous from patients with proliferative diabetic retinopathy. J Diabetes r es. 2013;2013:539658. 10. zhou J, Wang s, Xia X. r ole of intravitreal inflammatory cytokines and angiogenic factors in proliferative diabetic retinopathy. Curr eye r es. 2012;37(5):416-20. 11. aiello lP, avery rl, arrigg PG, keyt ba, Jampel HD, shah st , et al. vascular endothelial growth factor in ocu- lar fluid of patients with diabetic retinopathy and other retinal disorders. n engl J Med. 1994;331(22):1480-7. 12. Wakabayashi Y, Usui Y, Okunuki Y, kezuka t , t akeuchi M, Goto H, et al. Correlation of vascular endothelial growth factor with chemokines in the vitreous in diabetic retinopathy. r etina. 2010;30(2):339-44. 13. el-asrar aM, nawaz MI, kangave D, Geboes k, Ola Ms, ahmad s, et al. High-mobility group box-1 and bi- omarkers of inflammation in the vitreous from patients with proliferative diabetic retinopathy. Mol vis. 2011;17:1829-38. 14. Capeans C, De r ojas Mv, l ojo s, salorio Ms. C-C chemokines in the vitreous of patients with proliferative vitreoretinopathy and proliferative diabetic retinopathy. r etina. 1998;18(6):546-50. 15. abu el asrar aM, Maimone D, Morse PH, Gregory s, r eder at . Cytokines in the vitreous of patients with pro- liferative diabetic retinopathy. am J Ophthalmol. 1992;114(6):731-6. 16. Petrovič MG, korošec P, košnik M, Hawlina M. association of preoperative vitreous Il -8 and veGF levels with visual acuity after vitrectomy in proliferative diabetic retinopathy. acta Ophthalmol. 2010;88(8):e311-6. 17. Petrovic MG, korošec P, košnik M, Hawlina M. vitreous levels of interleukin-8 in patients with proliferative diabetic retinopathy. am J Ophthalmol. 2007;143(1):175-6. 18. Demircan n, safran bG, soylu M, Ozcan aa, sizmaz s. Determination of vitreous interleukin-1 (Il -1) and tu- mour necrosis factor (tnF) levels in proliferative diabetic retinopathy. e ye (l ond). 2006;20(12):1366-9. 19. Dai Y, Wu z, Wang F, zhang z, Yu M. Identification of chemokines and growth factors in proliferative diabetic retinopathy vitreous. bioMed r es Int. 2014;2014:486386. 20. Goldberg rb. Cytokine and cytokine-like inflammation markers, endothelial dysfunction, and imbalanced coagulation in development of diabetes and its complications. J Clin endocrinol Metab. 2009;94(9):3171-82. 21. Hang H, Yuan s, Yang Q, Yuan D, liu Q. Multiplex bead array assay of plasma cytokines in type 2 diabetes mellitus with diabetic retinopathy. Mol vis. 2014;20:1137-45. 22. Ozturk bt , bozkurt b, kerimoglu H, Okka M, kamis U, Gunduz k. effect of serum cytokines and veGF levels on diabetic retinopathy and macular thickness. Mol vis. 2009;15:1906-14. 23. Doganay s, evereklioglu C, er H, t ürköz Y, sevinç a, Mehmet n, et al. Comparison of serum nO, tnF-alpha, Il -1beta, sIl -2r, Il -6 and Il -8 levels with grades of retinopathy in patients with diabetes mellitus. eye (l ond). 2002;16(2):163-70. 24. t aghavi Y, Hassanshahi G, kounis n, koniari I, khorramdelazad H. Monocyte Chemoattractant protein-1 (MCP-1/CCl2) in Diabetic r etinopathy: latest evidence and Clinical Considerations. J Cell Commun signal. 2019;13(4):451-62. 25. simó- servat O, Hernández C, simó r. Usefulness of the vitreous fluid analysis in the translational research of diabetic retinopathy. Mediators Inflamm. 2012;2012:872978. 26. t sai t , kuehn s, t siampalis n, vu Mk, kakkassery v, stute G, et al. anti-inflammatory cytokine and angio- genic factors levels in vitreous samples of diabetic retinopathy patients. Pl os One. 2018;13(3):e0194603. 254 z drav vestn | maj – junij 2020 | l etnik 89 nevrObIOl OGIJa 27. z orena k, raczyńska D, raczyńska k. biomarkers in diabetic retinopathy and the therapeutic implications. Mediators Inflamm. 2013;2013:193604. 28. Mao C, Yan H. r oles of elevated intravitreal Il -1β and Il -10 levels in proliferative diabetic retinopathy. Indian J Ophthalmol. 2014;62(6):699-701. 29. Hernández C, segura rM, Fonollosa a, Carrasco e, Francisco G, simó r. Interleukin-8, monocyte chemoa- ttractant protein-1 and Il -10 in the vitreous fluid of patients with proliferative diabetic retinopathy. Diabet Med. 2005;22(6):719-22. 30. Maier r, Weger M, Haller- schober eM, el-shabrawi Y, Wedrich a, theisl a, et al. Multiplex bead analysis of vitreous and serum concentrations of inflammatory and proangiogenic factors in diabetic patients. Mol vis. 2008;14:637-43.