Acta agriculturae Slovenica, 85 - 1, maj 2005 str. 97 - 105 Agrovoc descriptors: soil, nitrogen, nitrogen content, soil chemistry, soil fertility, fertilizer application soil testing, analytical methods, chemical composition Agris category code: P33, P35, F04 Kmetijski inštitut Slovenije Centralni laboratorij COBISS koda 1.02 Vpeljava in ovrednotenje metode določevanja mineralnega dušika v tleh Veronika KMECL1, Lucija ZUPANČIČ-KRALJ2 Delo je prispelo 27. decembra 2004; sprejeto 12. maja 2005 Received: December 27, 2004; accepted : May 12, 2005 IZVLEČEK Ugotavljanje vsebnosti anorganskega oz. mineralnega dušika (Nmin), ki ga ekstrahiramo iz zemlje z 0,01 M razt. CaCl2, omogoča izboljšanje napovedovanja gnojenja z dušikom. V ta namen smo razvili analitske metode določevanja amonijevih, nitratnih in nitritnih ionov v zemlji. Metode smo verificirali; določili smo točnost, natančnost, mejo zaznavnosti (LOD) in mejo kvantitativne določitve (LOQ). Točnost meritev smo dokazali z uspešnim sodelovanjem laboratorija v mednarodni medlaboratorijski primerjalni shemi WEPAL (Wageningen Evaluating Programme for Analytical Laboratories, Nizozemska). Natančnost meritev (ponovljivost in obnovljivost) smo izrazili z relativnim standardnim odmikom (RSD), ki je bil v vseh primerih pod 2%. Vrednosti LOD in LOQ za nitratni dušik sta bili 0,05 mg/kg oz. 0,18 mg/kg in za amonijski dušik 0,09 mg/kg oz. 0,31 mg/kg. Ključne besede: mineralni dušik (Nmin), analize tal, segmentirani pretočni analizator, ovrednotenje. ABSTRACT INTRODUCTION AND VERIFICATION OF METHODS USED FOR DETERMINATION OF MINERAL NITROGEN IN SOIL Determination of inorganic or mineral nitrogen content (Nmin), extracted from the soil with the 0.01 M CaCl2 solution, enables improvements of fertilization recommendations with nitrogen. For this purpose we have developed analytical methods for determination of ammonium, nitrate and nitrite ions in the soil. The methods were verified; trueness, precision, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) were determined. The trueness of measurements was proofed by successful participation of our laboratory in the international interlaboratory exchange programme WEPAL (Wageningen Evaluating Programme for Analytical Laboratories, Netherland). The precision of measurements (repeatability and 1 mag., univ. dipl. inž. kem., Kmetijski inštitut Slovenije, Hacquetova 17, SI-1000 Ljubljana 2 prof., dr., univ. dipl. kem., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Aškerčeva 5, SI-1000 Ljublj ana, 98 reproducibility) was expresed as relative standard deviation (RSD) which was under 2% in all cases. The values of LOD and LOQ were 0,05 mg/kg and 0,18 mg/kg respectively for nitrate nitrogen and 0,09 mg/kg or 0,31 mg/kg for ammonium nitrogen. Key words: mineral nitrogen (Nmin), soil analyses, segmented flow analyser, verification 1 UVOD Dušik v tleh se nahaja v različnih kemijskih oblikah. Zelo grobo se deli v organski in anorganski dušik. Skoraj 95% vsega dušika v tleh je vezanega v razne organske kemijske spojine v rastlinski ali živalski biomasi. Anorganski dušik oz. mineralni dušik (NO2--N, NO3--N, NH4+-N) zajema le majhen delež celotnega dušika v zemlji (približno 1-2%) (Wilson in sod., 1999). Okoljevarstveni vidiki izpiranja mineralnega dušika iz zemlje, kot tudi pomembnost amonijevih in nitratnih ionov v prehrani rastlin so vzpodbudili številne raziskovalce k študijam anorganskega oz. mineralnega dušika (Nmin) v tleh (Groot in Houba, 1995, Harper, 1984, Mengel, 1985, Scharph in Wehrmann, 1975). Poraba dušika je zaradi nestrokovnega gnojenja marsikdaj nesmotrna. Včasih poljščine gnojijo z večjo količino dušika, kot ga zares potrebujejo. Velik del tega dušika je mobilen v zemlji (NH4+, NO2-, NO3-) in se lahko prenese v podtalnico, kar lahko pomeni onesnaženje pitne vode ali pa večjo vsebnost dušika v pridelkih. Po drugi strani pa lahko popolna opustitev mineralnega gnojenja z dušikom že v prvem letu zmanjša pridelek. Zato je poznavanje vsebnosti dušika v tleh pomembno. V več letnih poskusih smo na Kmetijskem inštitutu Slovenije ugotavljali vpliv dušika v zemlji na rast poljščin (Briški in sod., 1996, Sušin in sod. 1999). V ta namen smo vpeljali in ovrednotili metode določevanja mineralnega oz. anorganskega dušika v tleh. 2 METODE DELA IN MATERIALI 2.1 Priprava vzorca Vse vzorce zemlje, ki smo jih analizirali, smo homogenizirali, nato pa v približno 300 ml plastične steklenice zatehtali 50 g svežega vzorca, prelili z 200 ml 0,01 M razt. CaCl2. Plastične steklenice z vzorcem smo stresali na stresalniku 1 uro. Ekstrakt smo filtrirali preko filter papirja (Schleicher& Schuell 5893). Preostanek je bila raztopina, ki smo jo analizirali (Hoffmann, 1991, Houba in sod., 1999). Vsebnost anorganskega oz. mineralnega dušika v vzorcih smo ugotovili z merjenjem absorbance na segmentiranem pretočnem analizatorju – SFA (Bran+Luebbe, Alfa Laval). KMECL, V., ZUPANČIČ-KRALJ, L.: Vpeljava in ovrednotenje metode določevanja… 99 2.2 Določanje anorganskega oz. mineralnega dušika s segmentiranim pretočnim analizatorjem 2.2.1 Opis inštrumenta - segmentirani pretočni analizator (Segmented Flow Analyser) Inštrument deluje na principu črpanja tekočine skozi sistem cevk, s točno določenim premerom. Tekočina, ki potuje skozi cevke, je zaradi boljše separacije dveh zaporednih vzorcev ter zaradi enakomernega pretoka skozi sistem, ločena z zračnimi mehurčki. Intenziteto barve, ki jo daje iskana komponenta v vzorcu s potrebnimi dodanimi reagenti, merimo fotometrično. Inštrument omogoča analizo serij vzorcev. Med dvema zaporednima vzorcema se sistem izpira z vodo; s tem preprečimo mešanje dveh vzorcev (Crompton, 1996). Segmentirani pretočni analizator je sestavljen iz: ¦ avtomatskega vzorčevalnika ¦ peristaltične črpalke ¦ analitske enote ¦ detektorja (enokanalni fotometer, dvožarkovni princip) ¦ vmesnika ¦ računalnika 2.2.2 Določanje anorganskega oz. mineralnega dušika 2.2.2.1 Določanje nitratnega in nitritnega dušika Princip: Nitrat se reducira s hidrazinijevim sulfatom v nitrit. Nitrit določamo fotometrično s tvorbo rdečega azo-barvila. Poteče diazotiranje aminske skupine (-NH2) na sulfanilamidu v prisotnosti nitritnega iona (NO2-) v kislem mediju. Nastala diazonijeva sol se veže na N -naftiletilen diamin (NEDD) na mesto 4, pri čemer nastane rdeče azo-barvilo, ki ima maksimalni absorbcijski vrh pri valovni dolžini 520 nm (ISO/DIS 14255). Rezultat je vsota nitratnega in nitritnega dušika. Če želimo izraziti samo nitratni dušik, moramo odšteti predhodno določeni nitritni dušik, ki pa je v zemlji v zanemarljivo majhni količini - pod mejo zaznavnosti (LOD). 2.2.2.2. Določanje amonijevega dušika Princip: Določanje amonijevega iona temelji na Berthelotovi reakciji, kjer tvori fenolni derivat (salicilat) v prisotnosti amonijevega iona in hipoklorita, z nitroprusidom kot katalizatorjem barvilo. V alkalnem mediju je nastali indofenolni derivat modro-zeleno obarvan in ima maksimalni absorbcijski vrh pri valovni dolžini 660 nm. Acta agriculturae Slov 100 enica, 85 - 1, maj 2005 Mesto vstopa posameznih raztopin v analitsko enoto segmentiranega pretočnega analizatorja (SFA) in procesno shemo za določanje nitratnega, nitritnega in amonijevega dušika prikazujeta preglednica 1 in slika 1. Preglednica 1: Mesto vstopa raztopin v analitsko enoto segmentiranega pretočnega analizatorja pri določanju NO3--N, NO2--N in NH4+-N Table 1: The entrance of the solutions into SFA - analytical chamber (determination of NO3--N, NO2--N in NH4+-N) Cevka A B C D E F G H Filter Pretok ml/min 0.6 0.23 0.05 brij brij pufer (citra t) 0.8 0.23 0.23 0.16 0.16 NO3-N 0-2 (mg/l) brij brij pufer (NH4Cl) brij vzorec hidrazin sulfat sulfani lamid/ NEDD 520 nm NO2-N 0-2 (mg/l) brij brij brij brij vzorec brij sulfani lamid/ NEDD 520 nm NH4-N 0.2 -10 (mg/l) vzorec pufer (citrat) pufer (citrat) brij hipokl. salicilat brij 660 nm Slika 1: Procesna shema za določanje NO3--N, NO2--N in NH4+-N s SFA tehniko Figure 1: Flow diagram for determination of NO3--N, NO2--N and NH4+-N by SFA 2.3 Ovrednotenje analitskih metod Ovrednotenje metod določanja mineralnega dušika smo opravili na vzorcu tal, ki smo ga posušili pri T = 40°C, nato pa presejali skozi 5 milimetrsko sito. Ovrednotili smo metodo za KMECL, V., ZUPANČIČ-KRALJ, L.: Vpeljava in ovrednotenje metode določevanja…101 določanje nitratnega (NO3--N) in amonijevega dušika (NH4+-N). Vsebnost nitritnega dušika (NO2--N) je v zemlji v zanemarljivo majhni količini - pod mejo zaznavnosti, zato te metode nismo ovrednotili. Ovrednotenje analitske metode zajema ugotavljanje točnosti, natančnosti (ponovljivost in obnovljivost meritev) ter mejo zaznavnosti (LOD) in mejo kvantitativne določitve (LOQ) (Miller in Miller, 1988). 3 REZULTATI IN RAZPRAVA 3.1 Vpeljava in ovrednotenje metod za določanje mineralnega dušika v tleh 3.1.1. Vpeljava metod Metode mineralnega dušika (NO3--N, NO2--N in NH4+-N) smo vpeljali glede na standard »International Organisation for Standardisation - ISO/DIS 14255, Soil quality – determination of soluble nitrogen fractions”. 3.1.2. Ovrednotenje metod Točnost rezultatov analiz nitratnega in amonijevega dušika (NO3--N in NH4+-N) smo preverili z analizo vzorcev iz mednarodne medlaboratorijske primerjalne sheme WEPAL (Wageningen Evaluating Programme for Analytical Laboratories, Nizozemska) (van Dijk in Houba, 2000). Preglednica 2: Točnost rezultatov analiz NO3--N in NH4+-N Table 2: The trueness of the results of NO3--N and NH4+-N Mednarodna shema WEPAL (vzorec) Povprečna vrednost (X) (mg NO3--N/kg) Standardni odmik (?) (mg NO3- -N/kg) X - 2? (mg NO3--N/kg) Rezultat KIS (mg NO3--N/kg) X + 2? (mg NO3--N/kg) Točnost analize 1 5,4 0,2 4,9 5,6 5,8 DA 2 1,3 0,6 0,0 1,3 2,6 DA 3 57 2,8 51 58 63 DA 4 8,0 0,5 6,9 7,7 9,1 DA 5 4,8 0,2 4,3 5,0 5,3 DA 6 56 0,4 55 56 57 DA 7 4,7 0,7 3,2 4,4 6,2 DA 8 6,2 1,1 4,0 5,6 8,5 DA Mednarodna shema WEPAL (vzorec) Povprečna vrednost (X) (mg NH4+-N/kg) Standardni odmik (?) (mg NH4+-N/kg) X - 2? (mg NH4+-N/kg) Rezultat KIS (mg NH4+-N/kg) X + 2? (mg NH4+-N/kg) Točnost analize 1 30,5 8,61 13,3 24,3 47,7 DA 2 21,9 2,86 16,2 19,0 27,6 DA 3 8,03 1,14 5,75 7,85 10,3 DA 4 3,73 1,44 0,85 6,16 6,61 DA 5 92,3 12,8 66,7 102 117,9 DA 6 4,78 0,86 3,06 4,18 6,50 DA 7 2,72 1,13 0,46 2,16 4,98 DA 8 10,2 1,80 6,62 12,8 13,8 DA Acta agriculturae Slov 102 enica, 85 - 1, maj 2005 Vse analizirane vrednosti so bile v okviru dveh standardnih odmikov (2?) glede na povprečno vrednost meritev (X) vseh sodelujočih laboratorijev. S tem smo potrdili točnost naših analiz. Za določitev natančnosti metod (ponovljivosti in obnovljivost meritev) smo analizirali posušeni in homogenizirani vzorec zemlje. Ponovljivost smo preverili z analizo homogeniziranega vzorca zemlje v šestih ponovitvah, analiziranih v enem dnevu (slika 2, 4). Obnovljivost smo preverili z analizo vzorca v treh ponovitvah, ki smo jih analizirali šest dni zaporedoma (slika 3, 5). 18, 3 18,0 17, 9 -+3o -+2a '.-2n --3c 01 234567 št evi l o meri t ev Slika 2: Ponovljivost meritev (metoda določanja NO3--N v zemlji) Figure 2: Repeatibility of the results (determination of NO3--N in soil) 1 9 ,0 1 8 ,5 1 8 ,0 1 7 ,5 -----------------------------------------------------+3o "...........................+2a _____________________i______*______ipovp. ......*................¦.....-2a --------------------------------------------------------------3c 1 7 ,0 01234567 števi l o dni Slika 3: Obnovljivost meritev (metoda določanja NO3- -N v zemlji) Figure 3: Reproducibility of the results (determination of NO3--N in soil) KMECL, V., ZUPANČIČ-KRALJ, L.: Vpeljava in ovrednotenje metode določevanja…103 5,6 5,4 5,2 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 +3? +2? povp. -2? -3? 01234567 število meritev Slika 4: Ponovljivost meritev (metoda določanja NH4+-N v zemlji) Figure 4: Repeatibility of the results (determination of NH4+-N in soil) 5, 3 5, 2 5, 1 5, 0 4, 9 4, 8 4, 7 4, 6 4, 5 4, 4 4, 3 ------------------------------------------------------------------+3a ...........................i........,........;+2c :—i—i—----------------------po vp. k........!.................t........*........!* _______-__________________________________3a 0123 4567 število dni Slika 5: Obnovljivost meritev (metoda določanja NH4+-N v zemlji) Figure 5: Reproducibility of the results (determination of NH4+-N in soil) Ponovljivost in obnovljivost meritev smo izrazili s standardnim odmikom (SD) in relativnim standardnim odmikom (RSD). Ponovljivost meritev smo pri metodi določevanja nitratnega dušika določili s SD=0,03 mg/kg oz. RSD=0,2% in pri metodi določevanja amonijevega dušika s SD=0,09 mg/kg oz. RSD=1,9%, Acta agriculturae Slov 104 enica, 85 - 1, maj 2005 Obnovljivost meritev pa smo pri metodi nitratnega dušika določili s SD=0,14 mg/kg in RSD=0,8% ter pri metodi za določanje amonijevega dušika s SD=0,08 mg/kg in RSD =1,7%. Mejo zaznavnosti (LOD) in mejo kvantitativne določitve (LOQ) smo za obe metodi določili po definiciji za izračun teh dveh parametrov (Miller in Miller, 1988): V območju od 0-2 mg NO3-N/l in 0-2 mg NH4-N/l smo naredili umeritveno krivuljo. V obeh primerih je bil korelacijski koeficient 0,9996, kar potrjuje visoko stopnjo linearnosti v koncentracijskem območju od 0-2 mg /l. Zato smo lahko to premico uporabili za umeritveno krivuljo pri določanju LOD in LOQ. Za izračun LOD smo analizirali raztopino z najnižjo možno koncentracijo, ki je dala signal, različen od 0. To je bila koncentracija slepega vzorca. Vzorec smo analizirali v desetih ponovitvah. Izračunali smo LOD in LOQ na način: LOD = 3 • ssl LOQ = 10 • ssl ssl…standardni odmik 10 meritev slepega vzorca Izračunane vrednosti LOD in LOQ so naslednje: NO3- -N: LOD = 0,05 mg/kg zemlje, LOQ = 0,18 mg/kg zemlje NH4+-N: LOD = 0,09 mg/kg zemlje, LOQ = 0,31 mg/kg zemlje 4 ZAKLJUČKI Na Kmetijskem inštitutu Slovenije smo v okviru raziskovalnih projektov ugotavljali vpliv mineralnega dušika (Nmin) v zemlji na rast poljščin. V ta namen smo vpeljali analitske metode za določanje nitratnega, nitritnega ter amonijevega dušika, izmenljivega v 0,01 M CaCl2. Metode smo vpeljali na segmentirani pretočni analizator (SFA – Segmented Flow Analyser, Alfa Laval, Bran + Luebbe). Analitske metode za določanje nitratnega (NO3--N) in amonijevega (NH4+-N) dušika smo ovrednotili (vsebnost nitrita je v tleh zanemarljiva – pod mejo zaznavnosti, zato metode za določanje nitritnega dušika v zemlji nismo ovrednotili). Z ovrednotenjem vpeljanih metod smo preverili točnost in natančnost (ponovljivost in obnovljivost) metod ter mejo zaznavnosti (LOD) in mejo kvantitativne določitve (LOQ).Vrednosti dobljenih parametrov prikazuje preglednica 3. Preglednica 3: Ovrednotenje analitskih metod s statističnimi parametri: povprečna vrednost, natančnost (ponovljivost in obnovljivost meritev), meja zaznavnosti in meja kvantitativne določitve. Table 3: Verification of analytical methods with parameters: average, repeatibility, reproducibility, LOD, LOQ. NO3--N NH4+-N Povprečna vrednost, mg/kg 18,04 4,84 Ponovljivost (RSD), % 0,2 1,9 Obnovljivost (RSD), % 0,8 1,7 Meja zaznavnosti (LOD), mg/kg 0,05 0,09 Meja kvantitativne določitve (LOQ), mg/kg 0,18 0,31 KMECL, V., ZUPANČIČ-KRALJ, L.: Vpeljava in ovrednotenje metode določevanja…105 Točnost meritev smo dokazali z uspešnim sodelovanjem v mednarodni medlaboratorijski primerjalni shemi WEPAL. 5 LITERATURA Briški, L., Gregorčič, A., Kmecl, V. 1996. Gnojenje poljščin z dušikom na podlagi meritev mineralnega dušika v tleh. Zbornik predavanj. Posvet: Dušik-naravovarstvena paradigma. ZTI, Ljubljana, 28.-29.3.1996, s. 107-118. Crompton, T. R. 1996. Determination of anions. A guide for the analytical chemist, Springer –Verlag, Berlin van Dijk D., Houba V.J.G. 2000. Interlaboratory analytical Studies and their Evaluation. Wageningen Agricultural University, 39 s. Groot J.J.R., Houba V.J.G. 1995. A comparison of different indices for nitrogen mineralization. Biology and Fertility of Soils, 19, 1-9. Harper J.E. 1984. Nitrogen in crop production. R.D.Hauck (ed.), ASA, CSSA, SSSA, Madison, 165 s. Hoffmann G. 1991. Die Untersuchung von Boden. Methodenbuch, Band 1, VDLUFA -Verlag, Darmstadt, 316 s. Houba V.J.G., Temminghoff E.J.M., Gaikhorst G.A., van Wark W. 1999. Soil analysis procedures, Extractions with 0,01 M CaCl2. Wageningen Agricultural University, 95 s. International Organisation for Standardisation (ISO). 1995. ISO/DIS 14255, Soil quality – determination of soluble nitrogen fractions, Geneva. Mengel K. 1985. Dynamics and availability of major nutrients in soils. Adv.Soil Sci., 2, 65-131. Miller J.C., Miller J.N. 1988. Statistics for analytical chemistry, Second edition. Ellis Horwood limited, West Sussex, 245 s. Scharph, H.C., Wehrmann, J. 1975. Die Bedeutung des Mineralstickstoffvorrates des Bodens zu Vegetationsbeginn für die N-Düngung zu Winterweizen. Landw. Forsch., 32/I, sw. 100-114. Sušin J., Kmecl V., Žnidaršič-Pongrac V., Resnik M. 1999. Gnojilni poskus z dušikom v koruzi v letih 1997-1999. Nasveti svetovalcev celjske in koroške regije. Kmetijska svetovalna služba Slovenije, 4, 23-28. Wilson W.S., Ball A.S. 1999. Managing risk of nitrates to humans and the environment. The Royal Society of Chemistry, Cambridge, 347 s.