JernejŠorli1,HelenaLenasi2 vpliv akutne hiperglikemije na endotelijsko funkcijo mikrožilja The Effect of Acute Hyperglycemia on Microvascular Endothelial Function IZvLEČEK KLJUČNEBESEDE:akutnahiperglikemija,mikrožilje,endotelij,reaktivnahiperemija,laserskadopplerska metoda,oralniglukoznitolerančnitest IZHODIŠČA. Vpliv akutne hiperglikemije in hiperinzulinemije na endotelijsko funkcijo zdravih živali je dobro raziskan in vitro, pri ljudeh pa si ugotovitve raziskav in vivo naspro- tujejo, zato smo želeli raziskati vpliv akutne hiperglikemije na endotelijsko funkcijo pri zdravih preiskovancih. Predpostavljali smo, da bo endotelijska funkcija mikrožilja kože ob akutni hiperglikemiji zmanjšana. METODE. Pri 20 zdravih preiskovancih smo z laser- sko dopplersko metodo izmerili hiperemični odziv mikrožilja kože na blazinici prsta in na podlakti po eno- in triminutnem zažemu nadlaktne arterije, pred in po oralni obre- menitvi s 75g glukoze/2dl vode ter neodvisno po kontrolni obremenitvi z 2dl vode. Istočasno smo preiskovancu merili EKG in krvni tlak v arterijah prsta. REZULTATI. Diastolični tlak se je po obremenitvi z glukozo povečal manj kot po kontrolni obremenitvi (p = 0,044; Wilcoxonov test), medtem ko se vrednosti drugih merjenih hemodinamskih spremenljivk med seboj niso statistično značilno razlikovale. Med obremenitvijo z glukozo in vodo nismo našli razlik v hiperemičnem odzivu mikrožilja kože, razen na blazinici prsta, kjer se je po triminutnem zažemu po obremenitvi z glukozo hiperemični odziv bolj zmanjšal kot po kontrolni obremenitvi (p = 0,067; Wilcoxonov test). Na podlakti smo ugotovili nega- tivno korelacijo med spremembo koncentracije glukoze in spremembo hiperemičnega odziva po enominutnem in po triminutnem zažemu (p = 0,047 in 0,004; linearna regre- sija). ZAKLJUČKI. Z raziskavo nismo potrdili, da akutna hiperglikemija neposredno zmanj- ša endotelijsko funkcijo mikrožilja kože. Pokazali pa smo zmanjšano reaktivnost mikrožilja, ki je najverjetneje posledica aktivacije simpatičnega živčevja. Predvidevamo, da na reaktivnost mikrožilja bolj kot akutna hiperglikemija neposredno vpliva inzulin. aBSTRaCT KEYWORDS:acutehyperglycaemia,microcirculation,endothelium,reactivehyperaemia,laserDoppler fluximetry,oralglucosetolerancetest BACKGROUNDS. The effects of acute hyperglycaemia and hyperinsulinemia on endothe- lial function have been established in vitro in non-diabetic animals, whereas the evidence of their impact on the human endothelium in vivo remain scarce and contradictory. In 1 JernejŠorli,štud.med.,Medicinskafakulteta,Univerzav Ljubljani,Vrazovtrg2,1000Ljubljana 2 Izr.prof.HelenaLenasi,dr.med.,Inštitutzafiziologijo,Medicinskafakulteta,Univerzav Ljubljani,Zaloškacesta4, 1000Ljubljana;helena.lenasi.ml@mf.uni-lj.si 267MedRazgl.2020;59(3):267–79 • Raziskovalni članek dušikovega oksida (eNOS) spodbudi nasta- janje vazodilatatorja dušikovega oksida (NO), druga preko aktivacije z mitogenom aktivirane proteinske kinaze (MAPK) nasta- janje vazokonstriktorja endotelina-1 (13). Na živalskih modelih so pokazali, da v zdravih endotelijskih celicah prevlada prva pot, medtem ko se zdi, da ima pri neodzivnosti na inzulin večji vpliv aktivacija vazokon- striktorne poti (9, 14–16). Akutna hipergli- kemija in hiperinzulinemija imata tako v zdravem organizmu nasprotujoča si učin- ka na endotelij; malo je raziskav, ki bi pre- učevale, kakšen je njun skupni učinek na endotelijsko funkcijo in vivo. Skladno z izsledki raziskav na živalskih modelih so nekatere raziskave in vivo na lju- deh pokazale, da akutna hiperglikemija zmanjša od endotelija odvisno vazodilata- cijo v mikrožilju pri ljudeh, ki so neodzivni na inzulin (17–19). Raziskave na mladih, zdravih preiskovancih pa si po ugotovitvah nasprotujejo (17, 20–26). Razlog bi lahko bilo dejstvo, da je uravnavanje pretoka krvi v mikrožilju zelo kompleksno, saj poleg 268 JernejŠorli,HelenaLenasi vpliv akutne hiperglikemije na endotelijsko funkcijo mikrožilja the present study, we aimed to investigate the effect of acute hyperglycaemia on skin microvascular endothelial function in healthy volunteers, hypothesising it will be attenuated. METHODS. Skin microvascular hyperaemic response was measured using laser Doppler fluximetry on the finger pulp and the volar forearm in 20 participants fol- lowing one- and three-minute brachial artery occlusion, before and after an oral load of 75 g glucose/2 dl water or 2 dl water in the control trial. The blood pressure of the digi- tal arteries and ECG were simultaneously measured. RESULTS. The diastolic blood pres- sure increased significantly less following the glucose load compared to the control load (p = 0.044; Wilcoxon test), while other haemodynamic variables did not differ between the glucose and the water load. There were no significant differences in hyperaemic response following a glucose load and a control load, however, a borderline significance following a three-minute occlusion was shown on the finger pulp (p = 0.067; Wilcoxon test). A negative correlation between the change in blood glucose concentration and hyper- aemic response was established on the forearm following both one- and three-minute occlusion (p = 0.047 and 0.004; linear regression). CONCLUSIONS. In the present study, we did not observe any attenuation of the microvascular endothelial function due to acute hyperglycaemia. Microvascular reactivity was decreased, however, this could be attrib- uted to increased sympathetic nervous system activity. We suggest that microvascular reactivity is more affected by hyperinsulinemia, rather than hyperglycaemia. IZHODIšČa Ključen patogenetski proces pri nastanku srčno-žilnih zapletov sladkorne bolezni so funkcionalne in strukturne spremembe na ravni mikrožilja, ki se začnejo v endoteliju (1). Znanih je več mehanizmov, preko kate- rih naj bi sladkorna bolezen vplivala na endotelijsko funkcijo, denimo preko poviša- nja oksidativnega stresa in zmanjšane raz- položljivosti endotelijskih vazodilatatorjev (2–5). Zanimivo je dejstvo, da so tudi na bole- zensko nespremenjenih endotelijskih celicah, ki so jih izpostavili akutni hiperglikemiji, ugotovili podobne spremembe, predvsem zmanjšano endotelijsko funkcijo (6–12). Ker so večino raziskav opravili na izo- liranih živalskih žilah in na kulturah endo- telijskih celic, je vpliv akutne hiperglikemije na endotelij pri človeku vprašljiv (6–12). Znano je namreč, da poleg povišane kon- centracije glukoze na endotelij neposredno učinkuje tudi inzulin. Vezava inzulina na inzulinski receptor sproži v endotelijskih celicah dve signalni poti: prva preko akti- vacije kinaze Akt in endotelijske sintaze endotelija vključuje še lokalne mehanizme, kot sta presnovni in miogeni mehanizem ter simpatično avtonomno živčevje, ki delu- je sistemsko in pretežno vazokonstriktor- no. Ker akutna hiperglikemija potencialno učinkuje tako na endotelij kot neposredno na gladke mišice žil in na avtonomno živ- čevje, to predstavlja metodološko težavo za ocenjevanje vpliva akutne hiperglikemije na endotelij pri človeku (6–12, 27–30). Z raziskavo smo želeli preveriti, če akutna hiperglikemija vpliva na funkcijo mikrožilja pri mladih, zdravih preiskovan- cih, in v kolikšni meri morebitni vpliv lahko pripišemo neposrednemu učinku povišane koncentracije glukoze na endotelij. Predpostavljali smo, da bo endotelijska funkcija mikrožilja kože ob akutni hiper- glikemiji zmanjšana. Kot model za oceno funkcije mikrožilja smo izbrali kožo, saj je za merjenje lahko dostopna in hkrati nudi dober vpogled v splošno stanje žilja (31). METODE Preiskovanci V raziskavi je sodelovalo 20 prostovoljcev (15 moških in 5 žensk, starih 21,6 ± 1,6 let), ki smo jih povabili k sodelovanju. Preiskovanci so potrdili, da so zdravi, ne jemljejo nobenih zdravil, ne kadijo in vsaj 12 ur pred prihodom niso uživali hrane, kave ali alkohola. Na dan meritev so pili izključno vodo do 0,5 l in ne eno uro pred pričetkom meritev. Preiskovanke so bile v začetni folikularni fazi menstruacijskega cikla in niso jemale oralne kontracepcije. Preiskovanci so pisno privolili k sode- lovanju v raziskavi. Raziskavo je potrdila Komisija Republike Slovenije za medicinsko etiko (številka soglasja: 0120-175/2017/6). Metode Prekrvljenost mikrožilja smo ocenjevali z uporabo laserske dopplerske (LD) meto- de, s katero merimo laserski dopplerski pre- tok (angl. laser-doppler flux, LDF). Merili smo bazalni pretok v mirovanju (LDFbaz) in pretok po prehodnem zažemu nadlaktne arterije – pookluzivno reaktivno hiperemijo (PORH). Sočasno smo na istem mestu meri- li temperaturo kože. Kontinuirano smo preiskovancem merili arterijski krvni tlak in EKG. Podatke krvnega tlaka, LDF in EKG smo zajemali s 500 Hz in zbirali s pro- gramsko opremo Nevrokard (Nevrokard Kiauta, d. o. o., Izola, Slovenija). Laserska dopplerska metoda za merjenje krvnega pretoka v koži Pretok krvi v mikrožilju kože smo ocenje- vali s pomočjo LD-metode, ki temelji na Dopplerjevem pojavu. Laserski žarek valo- vne dolžine 632,8 nm izhaja iz sonde z emi- tirajočim vlaknom, ki jo namestimo na kožo in se sipa po mirujočih in premikajo- čih se strukturah v spodaj ležečem tkivu, približno 1 mm globoko (32). Delež fotonov se odbije nazaj proti sondi, kjer jih ujame- ta dve optični vlakni. Nameščeni sta tako, da z emitirajočim vlaknom zaobjemata površino približno 1 mm2. Premikajoče se strukture, pretežno eritrociti, povzročijo Dopplerjev premik valovne dolžine odbitih fotonov. Delež odbitih fotonov s spreme- njeno valovno dolžino je sorazmeren številu in hitrosti eritrocitov, ki v časovni enoti pre- hajajo skozi opazovani del kože s prostor- nino približno 1 mm3. Število in hitrost eri- trocitov sta meri za oceno pretoka krvi, ki pa ni dejanski volumski pretok, ampak ga imenujemo LDF in je brezdimenzijska koli- čina, sorazmerna volumskemu pretoku, ki jo ponazorimo z arbitrarnimi pretočnimi enotami (PE). Potrdili so, da meritve, ki jih pridobimo z LD-metodo in z drugimi (ple- tizmografskimi, dilucijskimi) metodami, dobro korelirajo med seboj (32–34). Uporabili smo LD-napravo Periflux 4001 Master/4002 Satellite (Perimed, Järfälla, Švedska). Naprava omogoča soča- sno merjenje temperature kože s sondo, ki je bila v naši raziskavi nameščena 3 mm od izstopišča laserskega žarka. 269MedRazgl.2020;59(3): Pookluzivna reaktivna hiperemija Žilno reaktivnost smo merili z oceno hipe- remije po sprostitvi prehodnega zažema nadlaktne arterije. PORH nastane zaradi več med seboj prepletenih mehanizmov: endo- telijskih in presnovnih dejavnikov, mioge- nega odziva ter aksonskega refleksa sen- zoričnih nevronov (31, 34, 35). PORH smo izzvali tako, da smo nad- laktno arterijo zaželi s standardno manše- to Riva-Rocci za 1 min in v ločenem posku- su za 3 min. Vrednost LDF po sprostitvi zažema strmo naraste, doseže največji pre- tok in postopno pada na bazalno raven (slika 1). Izsledki raziskav predpostavljajo, da naj bi k hiperemiji po eni minuti zaže- ma največ doprinesli endotelijski dejavni- ki, po treh ali več minutah zažema pa v večji meri presnovni, miogeni in nevrogeni me- hanizmi (35, 36). Splošnega strinjanja glede izbire para- metrov, ki opišejo krivuljo odziva PORH, ni. V raziskavah običajno ocenjujejo naslednje parametre (31, 34): • največji LDF (LDFmax), • absolutni in relativni porast LDF, • čas do nastopa največjega LDF, • trajanje hiperemije in • ploščino pod krivuljo LDF v odvisnosti od časa. V naši raziskavi smo ocenjevali LDFmax, saj naj bi bil po navedbah nekaterih raziskav najbolj ponovljiv parameter (36–38). arterijski krvni tlak in srčna frekvenca Z analizo signala drugega odvoda trika- nalnega EKG smo merili interval med zob- cema R (tRR), s pletizmografsko metodo pa arterijski krvni tlak na prstnih arterijah sre- dinca desne roke: sistolični (psis), diastoli- čni (pdia), srednji (psred) in pulzni tlak (ppulz). Uporabili smo napravo FinapressTM BP monitor (Ohmeda 2300, Englewood, USA). Obremenitev z glukozo in merjenje plazemske koncentracije glukoze Hiperglikemijo smo dosegli po protokolu za oralni glukozni tolerančni test (OGTT). Preiskovanci so na tešče popili 82,5 g glu- koze monohidrata (masa ustreza 75 g čiste glukoze), ki smo jih raztopili v 2 dl uste- kleničene vode. 270 JernejŠorli,HelenaLenasi vpliv akutne hiperglikemije na endotelijsko funkcijo mikrožilja 0 5 10 15 35 20 25 30 Čas (s) 250 50 75 100 125 150 175 200 L D F ( P E ) LDFmax LDFbaz Zažem Slika 1.Prikazpookluzivnereaktivnehiperemijenapodlakti.LDF –laserskidopplerskipretok,LDFmax –naj- večjipretokposprostitvizažemaproksimalnearterije,LDFbaz –bazalnipretok,PE –pretočnaenota. Plazemsko koncentracijo glukoze (cglu) smo merili v kapilarni krvi kazalca desne roke. Uporabili smo spektrofotometrični merilnik HemoCue® Glucose 201+ (HemoCue AB, Ängelholm, Švedska). Opravili smo pilot- sko raziskavo, v kateri smo desetim preisko- vancem merili kinetiko cglu v petminutnih intervalih: ugotovili smo, da je bila cglu naj- višja 30 min po OGTT, zato smo meritve žilne reaktivnosti opravili 30 min po OGTT. Protokol Meritve smo izvajali v laboratoriju Inštituta za fiziologijo Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani v temperaturno nadzorovanem (temperatura 23–25 °C), mirnem in tihem prostoru od oktobra do decembra v dopol- danskem času (med 8. in 13. uro). Preisko- vanci so med meritvami ležali, niso se premikali in niso smeli govoriti. Na sredi- nec desne roke smo namestili manšeto za merjenje krvnega tlaka, na levo nadlaket manšeto za zažem nadlaktne arterije, LD- -sondi s temperaturnima sondama na volar- no podlaket in na blazinico sredinca leve roke ter na trup nalepili elektrode za mer- jenje EKG. Namestitev merilnih naprav in potek meritev prikazuje slika 2. 271MedRazgl.2020;59(3): EKG LDF FP M 10 G Z Z OGTT/VODA G Z Z G 1 5 3 10 30 10 5 3 10 (min)1 Slika 2. Shematskiprikazprotokolameritev.Zgoraj:namestitevmerilnihnaprav;spodaj:časovnicaprotokola. M –manšetazazažem,LDF –laserskidopplerskipretok,FP –arterijskitlakv arterijiprstaizmerjenz napravo Finapress,G –meritevplazemskekoncentracijeglukoze,Z –zažem,OGTT –oralniglukoznitolerančnitest. Preiskovancem smo izmerili cglu, jih po- krili z odejo in pred začetkom meritev počakali 20 minut, da so se preiskovanci umirili. Vse parametre smo najprej merili v miro- vanju deset minut. Za tem smo za eno minuto napolnili manšeto na nadlakti nad sistolični tlak in zažem nemudoma sprostili. Po petminutnem neprekinjenem merjenju vseh količin smo zažem izvedli za tri minu- te in nadaljevali meritve deset minut. Prei- skovanca smo namestili v polsedeč položaj, mu dali piti raztopino glukoze, ki jo je spil v manj kot eni minuti, in ga znova name- stili v ležeč položaj; 30 minut po pitju smo izmerili cglu in meritve ponovili. Po konča- nih meritvah smo preiskovancem ponovno izmerili cglu (slika 3). Pri vseh preiskovancih smo pri drugem obisku v enakih pogojih znova opravili kontrolne meritve, pri katerih so namesto raztopine glukoze popili enako količino (2 dl) ustekleničene vode. Statistična analiza LDF, psis, psred, pdia, ppulz in tRR smo določili kot časovno povprečje začetnega desetmi- nutnega intervala meritev v mirovanju. LDFmax smo določili iz krivulje PORH. Dob- ljene spremenljivke smo preračunali v razli- ke med vrednostmi pred obremenitvijo in po obremenitvi – spremembe (Δkoličina = količina po obremenitvi – količina pred obre- menitvijo). Izhodiščne vrednosti in spre- membe prikazujemo kot mediane (prvi kvartil; tretji kvartil) za nenormalno poraz- deljene spremenljivke in kot srednje vred- nosti ± standardni odklon (angl. standard deviation, SD) za normalno porazdeljene spremenljivke. Normalnost porazdelitve smo določali na podlagi testa Shapiro- Wilk. Razlike med poskusi z OGTT smo pri- merjali z razlikami med poskusi z obre- menitvijo z vodo, in sicer z Wilcoxonovim testom, tRR in cglu pa smo primerjali s par- nim testom t. Odvisnost spremembe LDFmax od spremembe koncentracije glukoze smo opredelili z linearno regresijo. Preiskovance smo razdelili v dve skupini glede na veli- kost spremembe cglu in LDFmax primerjali s testom Mann-Whitney. Vse statistične teste smo opravili z uporabo programske opreme SPSS 24 (IBM, Armonk, New York, ZDA). Kot statistično značilno smo upo- števali vrednost p ≤ 0,05. REZULTaTI Preiskovanci in izhodiščne vrednosti merjenih spremenljivk Z izjemo dveh preiskovancev, ki se meritev v drugem sklopu (kontrolnih meritev) nista udeležila, smo meritve opravili pri vsakem preiskovancu dvakrat – meritve po OGTT in kontrolne meritve po obremenitvi z vodo. Izhodiščne vrednosti vseh merjenih spre- menljivk pred obremenitvijo z OGTT ali z vodo prikazujemo v tabeli 1. Ugotovili smo, da so imeli preiskovanci pred obremenitvi- jo z OGTT višjo srčno frekvenco, nižja LDFbaz in LDFmax na podlakti po obeh časih zažema, zato moramo absolutne vrednosti spre- menljivk interpretirati s previdnostjo in raje primerjati njihove spremembe (razlike med vrednostmi spremenljivk pred in po testu). Plazemska koncentracija glukoze po obremenitvi z glukozo Po OGTT je cglu narasla in do konca meri- tev ostala povišana pri vseh preiskovancih, kar prikazuje slika 3. Spremembe hemodinamskih spremenljivk po obremenitvi z glukozo LDFbaz se je na blazinici zmanjšal tako po OGTT kot po obremenitvi z vodo po eno- minutnem (OGTT: p=0,019; voda: p=0,048) in po triminutnem zažemu (OGTT: p=0,033; voda: p = 0,004), vendar nismo našli stati- stično značilnih razlik med obremenitvijo z OGTT in z vodo (tabela 2). Po OGTT se je po enominutnem zaže- mu LDFmax na blazinici značilno zmanjšal (p=0,022), po obremenitvi z vodo tega nismo 272 JernejŠorli,HelenaLenasi vpliv akutne hiperglikemije na endotelijsko funkcijo mikrožilja 273MedRazgl.2020;59(3): Tabela 1.Značilnostipreiskovancevinizhodiščnevrednostimerjenihspremenljivkpredobremenitvijoz OGTT aliz vodo.Vrednostiprikazujemokotmedianeininterkvartilnirazmik(prvikvartil;tretjikvartil).cglu –pla- zemskakoncentracijaglukoze,tRR –intervalmedzobcemaRv EKG,psis,psred,pdia,ppulz –sistolični,sred- nji,diastoličniinpulzniarterijskitlak,LDFbaz –laserskidopplerskipretokv mirovanju,LDFmax –največjilaserski dopplerskipretokposprostitvizažema,PE –pretočnaenota,OGTT –oralniglukoznitolerančnitest,p – vrednostp(Wilcoxonovtest). Izhodišče pred OGTT Izhodišče pred obrem. z vodo p Velikostvzorca N = 20 N= 18 Starost(leta) 21(21;22) 22(22;23) Moški 15 13 Ženske 5 5 cglu (mM) 5,0(4,7;5,2) 5,3(4,9;5,5) 0,210 tRR (ms) 968(918;1.000) 1.029(941;1.163) 0,010 a psis (mmHg) 115(107;124) 118(103;125) 0,831 psred (mmHg) 81(77;88) 83(74;87) 0,868 pdia (mmHg) 66(60;69) 64(59;71) 0,981 ppulz (mmHg) 52(44;55) 51(45;56) 0,687 Mesto Zažem LDFbaz (PE) Podlaket 6,0(4,7;8,9) 7,3(6,6;8,5) 0,020 a Blazinica 243(174;329) 313(214;345) 0,446 LDFmax (PE) Podlaket 1min 27(21;32) 33(28;39) 0,038 a 3min 41(29;51) 46(36;63) 0,025a Blazinica 1min 336(254;384) 399(321;418) 0,570 3min 336(268;457) 417(368;448) 0,777 a p ≤ 0,05 4 5 6 10 7 8 9 G1 G2 G3 C (m M ) g lu Slika 3. Koncentracijaglukozev plazmipredOGTT(G1),30minutpoOGTT(G2)inpozaključkumeritev(G3). PorazdelitvepodatkovG1,G2inG3sonormalne.N=20.cglu –plazemskakoncentracijaglukoze,G1 –predOGTT, G2 –30minutpoOGTT,G3 –pozaključkumeritev,*p<0,05(parnitestt),gledenaizhodišče(G1). * * ugotovili (p = 0,127). Tudi po triminutnem zažemu se je LDFmax značilno zmanjšal po OGTT (p = 0,006), česar po obremenitvi z vodo nismo zasledili (p = 0,215), prav tako ne sprememb LDF na podlakti. Ugotovili smo torej, da je obremenitev z OGTT vpli- vala na LDFmax na blazinici, vendar se spre- memba ni statistično značilno razlikovala od tiste po obremenitvi z vodo. Mejno zna- čilno razliko (p = 0,067) med obremenitvijo z OGTT in vodo smo ugotovili le po trimi- nutnem zažemu na blazinici (tabela 2). Tako po OGTT kot po obremenitvi z vo- do se je povišal psis (OGTT: p = 0,012, voda: p = 0,002), psred se je povišal samo po obre- menitvi z vodo (p=0,001), pdia samo po obre- menitvi z vodo (p = 0,001) in ppulz po obeh obremenitvah (OGTT: p = 0,003; voda: p=0,004). Spremembe srčne frekvence niso bile značilne, a smo ugotovili trend večjih sprememb po OGTT v primerjavi z vodo (tabela 3). Zveza med koncentracijo glukoze in največjim pretokom Ko smo primerjali, kako se je pri preiskovancu spremenil LDFmax glede na spremembo cglu, smo ugotovili, da je bila na podlakti spre- 274 JernejŠorli,HelenaLenasi vpliv akutne hiperglikemije na endotelijsko funkcijo mikrožilja Tabela 3. Primerjavaspremembplazemskekoncentracijeglukoze,srčnefrekvenceinarterijskegatlakapo obremenitviz OGTTinz vodo.RezultateprikazujemokotsrednjovrednostinSDprinormalniporazdeli- tvioz.kotmedianeininterkvartilnirazmik(prvikvartil;tretjikvartil),čeporazdelitevninormalna.∆cglu – spremembaplazemskekoncentracijeglukoze,∆tRR –spremembaintervalaRRv EKG,∆psis,∆psred,∆pdia, ∆ppulz –spremembasistoličnega,srednjega,diastoličnegainpulznegaarterijskegatlaka,OGTT –oralniglu- koznitolerančnitest,p –vrednostp(parnitesttzanormalnoinWilcoxonovtestzanenormalnoporaz- deljenespremenljivke). OGTT voda p ∆cglu (mM) 2,2±0,5 0,0±0,5 <0,001 a ∆tRR (ms) –15,8±63,9 26,0±94,2 0,113 ∆psis (mmHg) 10,2(–1,2;19,3) 11,6(4,9;17,5) 0,266 ∆psred (mmHg) 4,1(–3,0;10,5) 6,4(3,3;11,4) 0,136 ∆pdia (mmHg) 0,7(–4,0;5,8) 6,2(2,1;7,6) 0,044 a ∆ppulz (mmHg) 7,3(3,2;11,9) 5,9(1,2;10,3) 0,868 a p≤ 0,05 Tabela 2. Primerjavaspremembbazalnegapretokainnajvečjegapretokaposprostitvizažemapoobre- menitviz OGTTinz vodonaobehmerilnihmestih.Rezultateprikazujemokotmedianeininterkvartilni razmik(prvikvartil;tretjikvartil).∆LDFbaz –spremembalaserskegadopplerskegapretokav mirovanju, ∆LDFmax –spremembanajvečjegalaserskegadopplerskegapretokaposprostitvizažema,PE –pretočna enota,OGTT –oralniglukoznitolerančnitest,p –vrednostp(Wilcoxonovtest). Zažem Podlaket p Blazinica p OGTT voda OGTT voda ∆LDFbaz (PE) 0,7 0,5 0,286 –54,3 –55,9 0,711 (–0,8;2,1) (–0,3;1,0) (–116,6;–6,3) (–81,4;–16,1) ∆LDFmax (PE) 1min 0,0 0,5 0,408 –37,0 –28,0 0,551 (–5,0;7,0) (–2,8;13,0) (–97,0;4,5) (–51,0;8,8) 3min –0,5 2,5 0,471 –32,0 –17,5 0,067 (–4,8;6,8) (–1,5;6,5) (–78,0;–9,0) (–40,8;8,0) memba LDFmax negativno sorazmerna spre- membi cglu po enominutnem (koeficient sorazmerja: –8,1; 95-% interval zaupanja: [–16,1; –0,1]; R2 = 0,24; p = 0,047) in po tri- minutnem zažemu (koeficient sorazmerja: –9,7; 95-% interval zaupanja: [–15,8; –3,6], R2 = 0,38; p = 0,004) (slika 4). Zveze na bla- zinici po enominutnem (p=0,506) ali po tri- minutnem zažemu (p = 0,597) nismo ugo- tovili. Če smo razdelili preiskovance na tiste, pri katerih je bila sprememba cglu 30 minut po OGTT večja kot 2,3mM, in ostale, smo ugotovili, da je bila v skupini z večjo spremembo cglu sprememba LDFmax bolj ne- gativna kot pri tistih z manjšo spremembo cglu (pri teh je bila na podlakti celo poziti- vna): v skupini z manjšo spremembo cglu po enominutnem zažemu so bile spremembe LDFmax na podlakti 1,0 PE (0,0; 6,0) in v sku- pini z večjo spremembo cglu –5,0 PE (–8,3; 2,3), po triminutnem zažemu pa 3,0 PE (–1,3; 7,3) oz. –7,0 PE (–11,0; 0,0). Skupini se po enominutnem zažemu med seboj nista razlikovali (p=0,123), pri triminutnem zažemu pa smo ugotovili statistično značilno bolj negativne spremembe LDFmax v skupi- ni z večjo spremembo cglu (p = 0,017; test Mann-Whitney). Na blazinici zveze nismo 275MedRazgl.2020;59(3): podlaket, 1 min blazinica, 1 min ∆ L D F m a x ∆cglu podlaket, 3 min blazinica, 3 min 100 50 0 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 –50 –100 –150 –200 ∆ L D F m a x ∆cglu 100 50 0 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 –50 –100 –150 –200 ∆ L D F m a x ∆cglu 20 10 0 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 –10 –20 ∆ L D F m a x ∆cglu 20 10 0 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 –10 –20 Slika 4.OdvisnostspremembenajvečjegapretokaposprostitvizažemapoOGTTodspremembeplazemske koncentracijeglukoze.Nadposameznimgrafomjeoznačenomerilnomestoinčastrajanjazažema.Premica označuje odvisnost med spremenljivkama. ∆LDFmax – sprememba največjega pretoka po sprostitvi zažema,∆cglu –spremembaplazemskekoncentracijeglukoze. ugotovili. Preiskovanci v skupinah z večjo in manjšo spremembo cglu se po starosti niso značilno razlikovali (p = 0,619; test Mann- Whitney). RaZPRava Z raziskavo smo potrdili, da je akutna hiperglikemija povezana z zmanjšano žilno reaktivnostjo, ki pa najverjetneje ni posle- dica zmanjšane endotelijske funkcije, saj nismo potrdili enoznačne povezave med akutno hiperglikemijo in od endotelija odvi- sno vazodilatacijo. Predpostavljamo, da akutna hiperglikemija vpliva na sistemski nadzor pretoka v mikrožilju preko spre- membe tonusa simpatičnega živčevja, med- tem ko je v endotelijski nadzor žilne funkcije verjetno vpleteno delovanje inzulina med hiperglikemijo. Naše ugotovitve se skladajo z ugotovitvami nekaterih podobnih raziskav, kjer so v različnih pogojih raziskovali vpliv akutne hiperglikemije na endotelij, medtem ko so v nekaterih drugih raziskavah ugo- tovili nasprotno (17, 20–26, 39). Različne ugotovitve so lahko posledica različnih raziskovalnih pristopov, različne vzdraže- nosti avtonomnega živčevja, različne cglu ali vpliva hiperinzulinemije na endotelijsko funkcijo in morda s tem povezano starost- jo preiskovancev. Akbari in sodelavci so ugotovili, da se je endotelijska funkcija po obremenitvi z glukozo zmanjšala, vendar ugotovitev niso primerjali s kontrolno skupino, v kateri bi preiskovance obremenili zgolj s tekočino (20). Predvidevamo, da bi zmanjšan odziv na iontoforezo acetilholina (ki so jo upo- rabili za oceno endotelijske funkcije) in zmanjšano PORH, ki so ju izmerili, lahko pripisali volumski obremenitvi prebavil s tekočino, ki naj bi, skladno z izsledki razi- skave Scotta in sodelavcev, povečala vzdra- ženost simpatičnega vazokonstrikcijskega nitja in s tem vplivala na krvne pretoke v mirovanju in reaktivnost žilja (40). Sim- patični vazokonstrikcijski odziv bi lahko povzročil tudi stres, ki ga raziskovalni postopek predstavlja preiskovancu (41). V nekaterih raziskavah so namreč pokaza- li, da akutna hiperglikemija poveča vzdra- ženost simpatika, kar so druge raziskave ovrgle (29, 42). V naši raziskavi smo more- biten vpliv simpatika ocenjevali z merje- njem sprememb sistemskih hemodinam- skih spremenljivk (arterijskega tlaka in srčne frekvence). Spremembe vrednosti arterijskega tlaka in srčne frekvence so bile primerljive med obremenitvijo z OGTT in z vodo. Med obremenitvijo z OGTT in vodo se je razlikovala le sprememba dia- stoličnega tlaka, ki je po OGTT padel bolj kot po obremenitvi z vodo. Morda je manj- šo spremembo diastoličnega tlaka po OGTT povzročila višja osmolarnost zaužite teko- čine (43). Oceno vzdraženosti simpatika bi zato v naši raziskavi morali izboljšati, deni- mo z analizo variabilnosti srčne frekvence, kar načrtujemo v prihodnje. Tudi v nekaterih drugih raziskavah, v katerih so preiskovanci izvedli OGTT in kontrolno obremenitev z vodo, so med akut- no hiperglikemijo pri zdravih ugotovili zmanjšano endotelijsko funkcijo (21, 24, 26). Vendar pa so bili preiskovanci v povpreč- ju 8–14 let starejši kot v naši raziskavi. Možen vzrok za različne rezultate bi lahko bila drugačna kinetika glukoze v plazmi in s tem različna cglu pri starejših preisko- vancih (v primerjavi z mlajšimi). Loader in sodelavci so izmerili najvišjo koncentraci- jo 8,85 ± 0,36 mM 40 minut po pitju slad- kane pijače, ki je vsebovala 72,5 g neopre- deljenega sladkorja (24). Ta koncentracija je bila v povprečju višja kot v naši raziskavi, a natančnih podatkov za primerjavo nima- mo. Še višjo plazemsko koncentracijo glu- koze, 16,7mM, so izmerili Williams in sode- lavci, ki so akutno hiperglikemijo povzročili z intraarterijsko infuzijo dekstroze (26). Ugotovili so, da se je endotelijska funkcija mikrožilja kože zmanjšala med šest ur tra- jajočo infuzijo dekstroze, tako brez in s soča- sno inhibicijo izločanja inzulina z oktreo- tidom (26). To bi lahko pomenilo, da so pri 276 JernejŠorli,HelenaLenasi vpliv akutne hiperglikemije na endotelijsko funkcijo mikrožilja dovolj visoki cglu učinki glukoze na zmanj- šanje endotelijske funkcije prevladali nad učinki inzulina, ki poveča razpoložljivost endotelijskih vazodilatatorjev (9, 14–16). Zanimivo je, da v drugi raziskavi pri preiskovancih povprečne starosti 22 let, v katerih so z intraarterijsko infuzijo do- segli cglu 18 mM, učinka na endotelijsko funkcijo mikrožilja kože niso izmerili, ko so meritve opravili 20, 40 in 60 minut po začetku infuzije (23). Rezultati so skladni z rezultati naše raziskave. Prav tako pri enaki starostni skupini učinka na mikrožilje niso izmerili, ko so infuzijo podaljšali na 6, 12 in 24 ur (22). V slednjem primeru so hiperglikemijo povzročili lokalno na zgor- nji okončini in vselej spremljali, da se pla- zemska koncentracija glukoze v nasprotni zgornji okončini ni povišala. Nasprotno pa so zmanjšano endotelijsko funkcijo izme- rili v raziskavi, kjer so meritve opravili dve uri po OGTT, ko je bila cglu v normoglike- mičnem območju, koncentracija inzulina pa še povišana – spet so bili preiskovanci v povprečju deset let starejši od naših (21). Zato menimo, da je zmanjšana endo- telijska funkcija, ki so jo pokazali v neka- terih raziskavah, lahko posledica spreme- njene signalne poti inzulina v endoteliju, kot so potrdili na izoliranih živalskih arte- rijah, in ne hiperglikemija sama (16). S tem se skladajo tudi naši rezultati – pri pre- iskovancih, pri katerih smo izmerili večje spremembe cglu po OGTT, smo namreč izmerili manjše odzive PORH, kar lahko kaže na zmanjšano odzivnost na inzulin pri teh preiskovancih ali na nižjo koncentra- cijo inzulina pri njih. Podobno so ugotovili v drugi raziskavi, v kateri so največji vpliv na endotelijsko funkcijo izmerili med pre- iskovanci z moteno toleranco za glukozo in kompenzatorno hipersekrecijo inzuli- na (17). Vpliv na endotelij ni bil povezan s plazemsko koncentracijo glukoze, saj tako pri mladih kot pri sladkornih bolnikih, pri katerih je bila cglu najvišja, vpliva niso pokazali (17). V naši raziskavi smo vpliv na endote- lijsko funkcijo vrednotili z oceno PORH po dveh različnih časih zažema proksimalne arterije in na dveh različnih merilnih mestih. V odzivu PORH, ki sledi krajšemu zažemu, naj bi na vazodilatacijo po sprostitvi zaže- ma najbolj vplivali endotelijski vazodila- tatorji, po daljših zažemih pa presnovni, miogeni in nevrogeni mehanizmi (35, 36). Poleg tega je odziv PORH na blazinici, kjer je veliko s simpatikom oživčenih arterio- venskih anastomoz, pretežno pod nadzorom centralnih mehanizmov (vegetativnega živ- čevja), medtem ko je vpliv vegetativnega živčevja na volarni strani podlakti manjši, vpliv endotelija pa večji (34). V naši razi- skavi je bila razlika v odzivu PORH po OGTT v primerjavi z obremenitvijo z vodo mejno značilna le po daljšem zažemu na blazini- ci, kar bi lahko pripisali od endotelija neod- visnim mehanizmom, denimo simpatiku. To lahko razložimo s prej omenjenim vplivom akutne hiperglikemije na vzdraženost sim- patika in z izsledki raziskave na kulturi glad- komišičnih celic podganje aorte (27, 29). V omenjeni raziskavi so namreč ugotovili, da je glukoza vpletena v znotrajcelično signalizacijo s Ca2+ in s tem povezanim krče- njem gladkih mišic žil (4, 27). Po drugi stra- ni smo v naši raziskavi povezavo med veli- kostjo spremembe cglu in spremembo odziva PORH zasledili le pri krajšem zažemu in samo na podlakti, kar lahko potrjuje vple- tenost endotelija. Predpostavljamo, da povi- šana koncentracija inzulina, ki razmeroma hitro sledi povišanju koncentracije gluko- ze, nasprotuje zmanjšanju od endotelija odvisne vazodilatacije zaradi same hiper- glikemije, vendar pa bi morali za potrditev te domneve izmeriti kinetiko plazemske koncentracije inzulina, kar načrtujemo v nadaljnji raziskavi (17, 25). Poleg tega bi za zanesljivejše ugotovitve potrebovali večji vzorec preiskovancev. Z raziskavo torej nismo ugotovili, da bi akutna hiperglikemija neposredno zmanj- šala endotelijsko funkcijo mikrožilja kože. 277MedRazgl.2020;59(3): 278 JernejŠorli,HelenaLenasi vpliv akutne hiperglikemije na endotelijsko funkcijo mikrožilja Predvidevamo, da na reaktivnost mikroži- lja bolj kot akutna hiperglikemija nepo- sredno vpliva inzulin, učinki katerega so odvisni od spremenjenih signalnih poti v endoteliju. Akutna hiperglikemija verjetno vpliva tudi na aktivnost simpatičnega živ- čevja, ki spremeni reaktivnost in s tem vazo- dilatacijsko sposobnost mikrožilja. LITERaTURa 1. MapangaRF,EssopMF.Damagingeffectsofhyperglycemiaoncardiovascularfunction:spotlightonglucose metabolicpathways.AmJPhysiolHeartCircPhysiol.2016;310(2):H153–H73. 2. CassutoJ,DouH,CzikoraI,etal.PeroxynitritedisruptsendothelialcaveolaeleadingtoeNOSuncouplingand diminishedflow-mediateddilationincoronaryarteriolesofdiabeticpatients.Diabetes.2014;63(4):1381–93. 3. XiaP,InoguchiT,KernTS,etal.Characterizationofthemechanismforthechronicactivationofdiacylglyc- erol-proteinkinaseCpathwayindiabetesandhypergalactosemia.Diabetes.1994;43(9):1122–9. 4. InoguchiT,BattanR,HandlerE,etal.PreferentialelevationofproteinkinaseCisoformbetaIIanddiacyl- glycerollevelsintheaortaandheartofdiabeticrats:differentialreversibilitytoglycemiccontrolbyisletcell transplantation.ProcNatlAcadSciUS A.1992;89(22):11059–63. 5. MoriA,SuzukiS,SakamotoK,etal.VasodilationofretinalarteriolesinducedbyactivationofBKCachannels isattenuatedindiabeticrats.EurJPharmacol.2011;669(1–3):94–9. 6. BohlenHG,LashJM.TopicalhyperglycemiarapidlysuppressesEDRF-mediatedvasodilationofnormalratarte- rioles.AmJPhysiol.1993;265(1Pt2):H219–H25. 7. GraierWF,SimecekS,KukovetzWR,etal.HighD-glucose-inducedchangesinendothelialCa2+/EDRFsig- nalingareduetogenerationofsuperoxideunions.Diabetes.1996;45(10):1386–95. 8. NgHH,LeoCH,O’SullivanK,etal.1,4-Anhydro-4-seleno-d-talitol(SeTal)protectsendothelialfunctionin themouseaortabyscavengingsuperoxide radicalsunderconditionsofacuteoxidativestress.Biochem Pharmacol.2017;128:34–45. 9. SobreviaL,NadalA,YudilevichDL,etal.ActivationofL-argininetransport(systemy+)andnitricoxidesynthase byelevatedglucoseandinsulininhumanendothelialcells.TheJPhysiol.1996;490(Pt3):775–81. 10. TesfamariamB,BrownML,DeykinD,etal.Elevatedglucosepromotesgenerationofendothelium-derived vasoconstrictorprostanoidsinrabbitaorta.JClinInvest.1990;85(3):929–32. 11. TsaiS-H,HeinTW,KuoL,etal.HighglucoseimpairsEDHF-mediateddilationofcoronaryarteriolesviareduced cytochromeP450activity.MicrovascRes.2011;82(3):356–63. 12. ZhouZW,XieXL,ZhouSF,etal.Mechanismofreversalofhighglucose-inducedendothelialnitricoxidesynthase uncouplingbytanshinoneIIAinhumanendothelialcelllineEA.hy926.EurJPharmacol.2012;697(1–3):97–105. 13. Arce-EsquivelAA,BunkerAK,MikusCR,etal.Insulinresistanceandendothelialdysfunction:macroandmicroan- giopathy. In:MasuoK,ed.Type2diabetes [Internet]. InTech;2013 [citirano2019Feb14].Dosegljivona: http://www.intechopen.com/books/type-2-diabetes/insulin-resistance-and-endothelial-dysfunction-macro- and-microangiopathy 14. ImaedaK,OkayamaN,OkouchiM,etal.Effectsofinsulinontheacetylcholine-inducedhyperpolarizationin theguineapigmesentericarterioles.JDiabetesComplications.2004;18(6):356–62. 15. ZengG,QuonMJ.Insulin-stimulatedproductionofnitricoxideisinhibitedbywortmannin.Directmeasure- mentinvascularendothelialcells.JClinInvest.1996;98(4):894–8. 16. HuangSS,LuYJ,HuangJP,etal.Theessentialroleofendothelialnitricoxidesynthaseactivationininsulin- mediatedneuroprotectionagainstischemicstrokeindiabetes.JVascSurg.2014;59(2):483–91. 17. NataliA,BaldiS,VittoneF,etal.Effectsofglucosetoleranceonthechangesprovokedbyglucoseingestion inmicrovascularfunction.Diabetologia.2008;51(5):862–71. 18. WilhelmB,WeberMM,KreisselmeierHP,etal.Endothelialfunctionandarterialstiffnessinuncomplicated type1diabetesandhealthycontrolsandtheimpactofinsulinontheseparametersduringaneuglycemicclamp. JDiabetesSciTechnol.2007;1(4):582–9. 19. WoerdemanJ,MeijerRI,EringaEC,etal.Insulinsensitivitydetermineseffectsofinsulinandmealingestion onsystemicvascularresistanceinhealthysubjects.Microcirculation.2016;23(1):62–8. 20. AkbariCM,SaouafR,BarnhillDF,etal.Endothelium-dependentvasodilatationisimpairedinbothmicro- circulationandmacrocirculationduringacutehyperglycemia.JVascSurg.1998;28(4):687–94. 21. DeMarchiS,PriorM,RigoniA,etal.Ascorbicacidpreventsvasculardysfunctioninducedbyoralglucoseload inhealthysubjects.EurJInternMed.2012;23(1):54–7. 22. HoubenAJHM,SchaperNC,deHaanCHA,etal.Local24-h hyperglycemiadoesnotaffectendothelium-depen- dentor-independentvasoreactivityinhumans.AmJPhysiol.1996;270(6Pt2):H2014–H20. 23. HoubenAJ,SchaperNC,KrusemanAC,etal.Acuteeffectsoflocalhyperglycaemiaonperipheralbloodflow inman.DiabetMed.1993;10(1):39–43. 24. LoaderJ,MeziatC,WattsR,etal.Effectsofsugar-sweetenedbeverageconsumptiononmicrovascularand macrovascularfunctionina healthypopulation.ArteriosclerThrombVascBiol.2017;37(6):1250–60. 25. TitleLM,CummingsPM,GiddensK,etal.Oralglucoseloadingacutelyattenuatesendothelium-dependent vasodilationinhealthyadultswithoutdiabetes:aneffectpreventedbyvitaminsCandE.JAmCollCardiol. 2000;36(7):2185–91. 26. Williams SB, Goldfine AB, Timimi FK, et al. Acute hyperglycemia attenuates endothelium-dependent vasodilationinhumansinvivo.Circulation.1998;97(17):1695–701. 27. El-NajjarN,KulkarniRP,NaderN,etal.EffectsofhyperglycemiaonvascularsmoothmuscleCa2+ signaling. BiomedResInt.2017;2017:3691349. 28. HienTT,TurczyńskaKM,DahanD,etal.Elevatedglucoselevelspromotecontractileandcytoskeletalgene expressioninvascularsmoothmuscleviarho/proteinkinaseCandactinpolymerization.JBiolChem.2016; 291(7):3552–68. 29. MarfellaR,NappoF,DeAngelisL,etal.TheeffectofacutehyperglycaemiaonQTcdurationinhealthyman. Diabetologia.2000;43(5):571–5. 30. PaolissoG,ManzellaD,FerraraN,etal.GlucoseingestionaffectscardiacANSinhealthysubjectswithdiffer- ent amountsofbodyfat.AmJPhysiol.1997;273(3Pt1):E471–E8. 31. CracowskiJL,MinsonCT,Salvat-MelisM,etal.Methodologicalissuesintheassessmentofskinmicrovascular endothelialfunctioninhumans.TrendsPharmacolSci.2006;27(9):503–8. 32. SerupJ,JemecGBE,GroveGL,etal.Handbookofnon-invasivemethodsandtheskin[Internet].CRCPress; 2006[citirano2019Feb14].Dosegljivona:https://www.taylorfrancis.com/books/9781420003307 33. JohnsonJM,TaylorWF,ShepherdAP,etal.Laser-Dopplermeasurementofskinbloodflow:comparisonwith plethysmography.JApplPhysiolRespirEnvironExercPhysiol.1984;56(3):798–803. 34. LenasiH.Assessmentofhumanskinmicrocirculationanditsendothelialfunctionusinglaserdoppler flowmetry. In:EronduOF,ed.MedicalImaging[Internet].InTech;2011[citirano2019Feb14].Dosegljivona: http://www.intechopen.com/books/medical-imaging/assessment-of-human-skin-microcirculation-and- its-endothelial-function-using-laser-doppler-flowmetry 35. TeeGB,RasoolAH,HalimAS,etal.Dependenceofhumanforearmskinpostocclusivereactivehyperemia onocclusiontime.JPharmacolToxicolMethods.2004;50(1):73–8. 36. Yvonne-TeeGB,RasoolAH,HalimAS,etal.Methodoptimizationontheuseofpostocclusivehyperemiamodel toassessmicrovascularfunction.ClinHemorheolMicrocirc.2008;38(2):119–33. 37. Yvonne-TeeGB,RasoolAH,HalimAS,etal.ReproducibilityofdifferentlaserDopplerfluximetryparameters ofpostocclusivereactivehyperemiainhumanforearmskin.JPharmacolToxicolMethods.2005;52(2):286–92. 38. RašićL,ČavkaA,BariF,etal.Reproducibilityofpost-occlusionreactivehyperaemia.Periodbiol.2014;116(1):77–82. 39. VarsamisP,WaltherG,ShareB,etal.Transientendothelialdysfunctioninducedbysugar-sweetened beverage consumptionmaybeattenuatedbya singleboutofaerobicexercise.MicrovascRes.2018;115:8–11. 40. ScottEM,GreenwoodJP,GilbeySG,etal.Wateringestionincreasessympatheticvasoconstrictordischarge innormalhumansubjects.ClinSci(Lond).2001;100(3):335–42. 41. MullerMD,SauderCL,RayCA.Mentalstresselicitssustainedandreproducibleincreasesinskinsympathetic nerveactivity.PhysiolRep.2013;1(1):e00002. 42. vanGurpPJ,RongenGA,LendersJW,etal.Sustainedhyperglycaemiaincreasesmusclebloodflowbutdoes notaffectsympatheticactivityinrestinghumans.EurJApplPhysiol.2005;93(5–6):648–54. 43. BrownCM,BarberiniL,DullooAG,etal.Cardiovascularresponsestowaterdrinking:doesosmolalityplaya role? AmJPhysiolRegulIntegrCompPhysiol.2005;289(6):R1687–R92. Prispelo3. 1. 2020 279MedRazgl.2020;59(3):