KRALJEVINA JUGOSLAVIJA
UPRAVA ZA ZASTITU
Klasa 12 (5)
INDUSTRISKE SVOJINE
Izdan 1. Oktobra 1930.
PATENTNI SPIS BR. 7376
Deutsche Hydrierwerke Aktiengesellschaft, Berlin—Charlottenburg,
Nemačka.
Postupak. za izvođenje biohemijskih procesa.
Prijava od 4. jula 1928.	Važi od 1. marta 1930.
Več je tehnički iskorišćen čitav niz po-znalih biohemijskih procesa, naročilo procesa vrenja, na pr. previranje ugljenih hidrata pomoću kvasca i bakterija, radi pro-izvoaenja etanola, izoprapanola, butanola, acetona, mlečne kiseline, buterne kiseline i I. d. Qva vrenja se sprovode pomoču čistih kultvjra pojedinih vrsta ili pomoču njihovih simbiotičkih mešavina.
Za dobijanje izazivača vrenja poznatih procesa služe opšte uobičajene metode u bakteriologiji (Kohova metoda razblažava-nja, metoda ploča, postupak dušem po Burri-u, kultura kapljica i t. d.). Tako su se bakterije tipa Bacillus butylicus Fitz izo-llsale za istovremeno izvođenje acetona i viših alkohola. Ovaj postupak je tehnički nesavršen, pošto su bakterije veoma oset-Ijive prema infekcijama, pošto pri neznatnem koncentrisanju materije u vrenju daju rđavo iskoriščenje, pošto rade samo pri apsolulnom isključenju vazduha (anerobia), pošto ne mogu da svare belančevine iz materijala u vrenju i sloga zahtevaju skupa dodatak kvasca dobivenog sa Tyrothrix te-nuis. Veliki broj drugih bakterija (Zenlral-bloft f. Bakteriologie II Abt., XXIII Bd. S. 385—568) pokazuju slične nezgode: one zahtevaju pre svega prethoclno povlačenje belančevine celog materijala za previranje pomoču Aspergillus orysae za vreme od 3 — 4 dana, da bi se posliglo osrednje iskoriščenje pri neznalnoj koncentrisanosti. Dalje se predlagala za izvođenje butanola
i acetona upotreba bakterija otpornih prema toploii (D. R. P. 445982), isto kao što je več pre toga Schardinger izolisao bakterije tipa Sacharobityricus mobilis non li-quefaciens, koje proizvode butanol (Zen-Ir Iblatt f. Bakt. II. Abt.,XVIII Bd. S. 748— 67). Ovaj postupak je nesavršen, pošto ga sprečava izbor bakterija veoma nesposobnih za dejstvo. Ako se naime kalemi 100 cevčica pri 90—100° sa nestirilizovanim kukuruznim brašnom, to vrste osetljive u toploti odmah oslabe ili budu ubijene, medu kojima se baš nalaze tehnički najsposob-nije vrste. Ako ove cevčice sada budu ga-jene nekeliko dana i tada budu izležene postupanju toplotom, to bivaju upruvo kulture, u kojima je obrazovana največa količina proizvoda vrenja, koje dakle, sadrže najsposobnije bakterije, najbrže oslabljene ili ubijene, pošto prisustni butanol pri toploti kuvanja deluje kao vrlo jak antisepti-kum, samo fakve kulture mogu preživeti zagrevanje, u kojima su odrasle bakterije sa malom sposobnošču za dejstvo, koje su tako malo produkata vrenja (butanolo) o-brazovale, da njihovo antiseptično dejstvo pri toploti kuvanja nije dovoljno za ubijanje bakterija. Stvarno vodi ova regresivna selektivna metoda ka bakterijama, koje su veoma osetljive prema infekcijama i samo kljukove male koncentrisanosti (napr. 5—8 '/„ kukuruza; Induslia! and Engineering Chemistry, Okt. 1927, S. 1147) mogu prevreli sa iskoriščenjem od približno Vs sadržine
Din. 10.
škroba materijala za previjanje. Sloga su i ovi postupci skupi i nesavršeni.
Sad je nađeno, da je za postizanje naročilo sposobnih izazivača vrenja, veoma olpornih prema produklima vrenja podesna niže opisana seleklivna metoda, pošto ona dozvoljava dobijanje takvih bakterija, koje su malo osetljive prema infenkcijama pri visokoj koncentrlsanosti materijala za pre-viranje, i daju mnogo veča iskoriščenja no dosadanji postupci i mogu prevreli sirovi-ne svakog porekla, jednom reči, pružaju sva preimučstva pečenja kvasca. Ovaj postupak sastoji se u torne, što se probi kljuka, ko-ja služi za odabiranje (selekciju) dodaje produkat, koji treba da se proivede vrenjem. Ovaj dodatak za selekciju sprečava raščenje takvih bakterija, koje su osetijive prema selektivnem dodatku, ali povlađuje razvijanje takvih vrsta, koje mogu da pro-izvedu dotični produkat. Pomoču podesnih koncentrisanosti selektivnog dodatka poleži za rukom takođe, da se spreči razvijanje manje sposobnih vrsta, koje su otporne samo prema neznatnim koncentrisanostima proizvoda, i da se pomogne isključivo razvijanje takvih vrsta, koje su otporne prema višim koncentrisanostima proizvoda vrenja i, dakle, i same mogu proizvoditi dotični produkat u višim koncentrisanoslima, a da postali proizvod ne sprečava dalji proces vrenja. Pošto postupanje toplotom pri ovom postupku nije potrebno, zajemčeno je i dobijanje naročilo sposobnih, oseliji-vih prema toploti, vrsta. Postupkom nastu-pajuče, progresivno automatski tekuče odabiranje, biva dopunjeno još sistematskim izborom i prekalemljivanjem naročilo sposobnih kultura pod izdvajanjem nepodesnih, po poznatim bakteriološkim postupcima.
U daljem donosi sobom — prema upo-trebi čistih kultura i njihovih simbiotičkih mešavina upotreba takvih mešavina kultura velike koristi, u kojima mikroorganizmi međusobno žive u pseudo simbiozi i melabiozi, t. j. uspevaju jedno po-red drugoga, a da nisu upučeni jedno na drugo (pseudosimbioza) i u stanju su, da proizvode eksploatisanja i proizvode izmene materija uzajamno dalje prerađuiu (metabioza). Takođe je korisno, ako bakterije ili veči deo istih ne bude upotrebijen da lebdi slobodno ili da je vezan na ne-utralne materije, nego da su vezane na čvrste, biohemiski netaložljive nosioce (na pr. biljne deliče), koji u ostalom mogu biti slobodno pokretni, usled čega postaje ta-kozvani mikroplankfon. U rastvorima imaju bakterije na raspoloženju samo rastvorene materije, dok se u mikroplanktonu nalaze i nerastvorene materije, naročilo belanče-vine, koje omogučuju uposlenje i iskorišče-
nje svih fermenata bakterija i time izaziva-ju efekat vrenja.
Prema torne sastoji se postupak po pro-nalasku u torne, da se upotrebljuju isključivo bakterije ili pseudosimbiotične kulture mešavina, koje su veoma otporne prema proizvodima vrenja i koje se mogu dobiti sledečom seleklivnom metodom:
Kalemljenje kljukove probe, pomešane sa proizvodom vrenja kao selektivnim dodatkom, sa prirodnim nosiocima bakleiije, gajenje kljukovih proba i izbor kljukovih proba, koje najjače previru i sadrže bakterije koje izgledaju normalno sa podjedna-kom nezrnastom protoplazmom. Dobro je da se upotrebljuju takve, koje pokazuju naklo-nost za obrazovanje planktona, pri čemu se u potrebnom slučaju izabrane uskome-šale kljukove probe prekalemljuju u sveže kljukove probe, pomešane sa istim selektivnim dodatkom, gajenje se ponavlja i izbor i prekalemljivanje se nastavlja pod istim uslovima, dok se ne dobiju jedinstve-ne tehnički sposobne za dejstvo kulture, koje su veoma otporne prema proizvodima vrenja.
Ako se kod dobijanja izazivača vrenja postupa po pomenutim osnovnim pravilima (izbegavanje zagrevanja, proizvod vrenja kao selektivni dodatek, pseudosimbioza, metabioza, mikroplankton) to se dobivaju' kao što se pokazalo, prema dosadanjim postupcima sledeča preimučstva kod spro-vodenja procesa vrenja i drugih biohemis-kih procesa:
1.	Dobiveni izazivači su veoma otporni prema spoljašujim uticajima. Upadnici (na-metljivci) su na pr, odmah napadnuti i njihovo infektivno dejstvo biva uništeno u Samom početku.
2.	Podesnom varijacijom selektivnog dodatka mogu izazivači vrenja biti dobiveni sa najraznovrsnijim sposobnostima za vrenje, koji predstavlaju čelu bogatu skalu pri-rodnih procesa cepanja i oksidisanja i u kvalitativnom odnosu mogu da utiču u širokim razmerama na tok biohemiskih procesa. Time je moguče svesno vodenje ovih procesa, dobijanje potpuno određenih proizvoda, povečanje njihovog proizvođenja na račun drugih neželjenih proizvoda.
3.	Pomoču metabionističkih osobina izu-zivača vrenja dobivenih po Bakony-ovoj metodi, otklanjaju se nekorisni proizvodi vrenja odnosno pretvaraju se u korisne.
4.	Usled nesravnjeno jače virulence ovih izazivača vrenja izlazi se na kraj sa vrlo kratkim vremenima vrenja.
5.	Ovom seleklivnom melodom zajamčena otpornost prema proizvodima vrenja, kao i sa metodom vezano otklanjanje škodljivih proizvoda izmene materija, dozvolja-
va održavanje daleko većih koncentrisano-sli, no šlo je ovo moguče kod dosadanjih postupaka, pošlo, kao šlo je poznalo, ovi proizvodi izmene materija, koji smetaju, često pričinjavaju prevremeni kraj ovih bio-hemiskih procesa.
Kod sprovođenja drugih biohemiskih po-slupaka osim procesa vrenja je primena gore opisanih osnovnih pravila vezana sa istim koristima (preimučstvima).
Primer 1. Prirodni nozioci bakterija (bilj-ni delovi, humus, izmeti biljoždera itd.) pre-livaju se vodovodnem vodom iti sterilnim kljukom i na to se dodaje neznatna količina, na pr. 1—2% kakvog hemiskog sredstva, najbolje proizvoda vrenja, koji treba da bude proizveden vrenjem na pr. buta-nol. (Isto tako mogu, naravno, u slučaju da vrenje treba da da više određenih proizvoda, bili dodane mešavine ovih materija namesto jednog jedinog). Ovim dodatkom se sprečava razvijanje svih bakterija, koje nisu otporne prema butanolu. Probe se gaje oko 24 časa. Mogu se pri tom u-potrebiti temperature do 70° najbolje su ipak takve, koje su između 28 i 38°. Posle 24 časa predstavljajo sve uskomešane probe prethodno nediferencirano mešavinu najraznovrsnijih bakterija otpornih prema bulanoi-u, koje mogu biti obeležene kao „butanol-flora“ upotrebljenog prirodnog no-sioca bakterija. Ove flora-probe se mikro-skopišu, pri čemu se izdvajajo sve takve, u kojima se može videti veči broj jako degenerisanih (zrnastih ili deformisanih) individua. Samo se takve flora-probe upo-trebljuju dalje, kod kojih bakterije pokazu-ju ravnomernu protoplazmu i normalne oblike — dva znaka za to, da su razne vrste međusobno bar snošljive.
Ponovnim mikroskopskim pregledom oda-biraju se one flora-probe, u kojima bakterije pokazuju naklonosti za obrazovanjem planktona.
Sa ovim flora-probama kaleme se steri-lizovane kljukove probe, koje su isto tako pomešane sa oko 1—2% upotrebljenog selektivnog dodatka. Prethodno zagrevanje ovih proba, kao što je to običaj kod izves-nih dosadanjih metoda gajenja (na pr. D. R. P. 445982), mora biti strogo izbegavano, jer može dovesti do slabljenja ili ubijanja, kako se pokazalo, vrlo važnih vrsti osetljivih na toploti i do potpunog razore-nja naklonosti za plankton. Kalemljenje kljakove probe se ponovo gaje 24 časa, posle čega se ponavlja gore opisani mikroskopski izbor prema normalnom izgledu i intenzitelu i obilnosti obrazovanja planktona. Izabrani materijal se na isti način kalemi dalje u sterilne, sa selektivnim dodatkom pomešane kljukove probe i usko-
mešale probe podvrgavaju se deljem mi-kroskopskom izboru. Ove mere se ponav-Ijaju dotle, dok se ne dobiju kulture, koje pokazuju potpuno normalnog izgleda i jako obrazovanje planktona.
Sa ovim kulturama se sad priređuju ogledi vrenja, pri čemu se kljukovoj probi za previranje dodaje isto tako unapred 1—2% selektivnog dodatka. Tada se oda-biraju medu ovima takve kljukove probe, koje su najbrže provrele, i opredeljuju na podesan način, na pr. destilisanjem probe odatle aseptično uzete, one, koje pokazuju največu sadržinu u željenim proizvodima vrenja, u ovom slučaju butanola. Ove probe vrenja se upotrebljuju za dalje oglede vrenja i ogledi se dotle ponavijaju, dok se ne posfigne maksimalno iskoriščenje pri minimalnom trajanju vrenja.
Tada se postepeno smanjuje koncentri-sanost selektivnog dodatka, dok se pome-nuti cilj ne postigne potpuno bez selektivnog dodatka.
Najzad se povečava koncentrisanost kljukove probe, koja treba da prevre, dokle god je ova moguča bez smanjivanja isko-riščenja i bez prodiženja trajanja vrenja.
Kranji rezultat selekcije može biti razume se, još povečan daljim izdvajanjem kultura manje otpornih prema infekciji.
Primer 2. U primeru 1 navedeni selektivni način (pul) može biti skračen na sledeči način :
Dobivena flora, na pr. gornja butanol-flora preraduje se dalje po jednoj poznatoj bakteriološkoj metodi, na pr. metodi plo-ča, t. j. pojedine kolonije, koje se na-laze na pločama, ispituju se u prisustvu selektivnog dodatka upotrebljenog za pri-premanje flore u pogledu na njihovu sposobnost za dejstvo u sterilnim kljukovim probama i samo kulture sposobne za dejstvo podvrguju se eventualnoj daljoj selekciji ako je potrebno.
Primer 3. Sprovođenje vrenja cepanjem za izvođenje etanola, propanola, izopropa-nola, butanola, izobufanola, acetona it. d. ili njihovih mešavina pomoču kultura dobi-venih po 1. i 2. primeru vrši se na sledeči način:
Materije, koje sadrže škrob ili šečer suspendirajo se u isitnjenom stanju u vodi, pri čemu može biti zadržano uobičajeno koncentiisanje pečenjem. Škrob se kuva-njem želatiniše i ohladi se na selektivnu temperaturo izazivača vrenja. Tada se izvršuje dodatak izazivača vrenja, koji iza-ziva snažno vrenje, koje je najdalje posle 40 časova potpuno svršeno. Dobivanje pro-dukata dešava se destilisanjem. Pri kon-koncentrisanosli od na pr. 12^—15'/g kuku-ruza (sa 60% škroba) izno*i iskoriščenje
(đobif) u alkoholima i ketonlma 40—4570 od upotiebljenog škroba.
Rastvori, koji sadrže šećera (na pr. melasa) mešaju se sa biljnom kašom radi omogućavanja obrezovanja planktona.
Primer 4. Ako se hoće da izazove oksi-daciono vrenje, to se menja gore opisana selektivna metoda na taj način, što se do-daje slobodna orgaska kiselina (mlečna ki-selina, buterna kiselina, sirčelna kiselina) prema vrsti želienog produkta. Osim toga se postala kiselina, čim prode koncentri-sanost od 2°/ , neutrališe sa kredom, sodom, amonijakom i t. d. Na ovaj način slobodna kiselina, koje uvek ima, deluje kao naročiti selektivni dodatak i vodi ka kulurama veoma otpornim prema kiselini. Pri sprovodenju procesa, koji vodi izvo-đenju organske kiseline dodaje se takva oksidaciona kultura kljuka i stalno se neutrališe i ovde postala kiselina, u koliko ona prelazi preko 20/(,- Aseptičan rad je pri tom izlišan, pošto su kulture, dobivene prema opisanoj selektivnoj metodi, apso-lutno otpome protiv infekcija. Postale ki-
seline stavljaju se u slobodu i dobijaju se čiste na uobičajen način.
Patentni zahtevi:
1.	Postupak za izvođenje biohemiskih procesa vrenja, pomoču čistih kultura, bakterija ili smeša čistih kultura, naznačen time, što se upotrebljuju samo lakve kulture, koje su otporne prema produktima vrenja i dobijaju se na taj način, šlo se sterilne probe kljuka najpre mešaju sa l0/n produkta vrenja (na pr. bulanola), zalim inficiraju sa prirodnim nosiocima bakterija (krompir, žito, zemlja, izmet) i posle 24-časovnog vrenja uzimaju se probe kljuka, koje najjače previru i sadrže bakterije, koje izgledaju zdrave.
2.	Postupak po zahtevu 1 naznačen time, što se izabrane probe kljuka, koje su počele vreti, prekalemljuju u probe kljuka, kojima je dodata ista selekcija, i što se gajenje ponavlja, a izbor i prekalemljivanje nastavlja pod istim uslovima, dok se ne dobiju jednostavne tehnički sposobne kulture, koje su vrlo otporne prema produk-tima vrenja.