100	Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 22(2015)

TAKSONOMIJA RODU Verticillium in DOLOČANJE FITOPATOGENE
GLIVE Verticillium albo-atrum
6	7
Kristina MARTON in Sebastjan RADISEK
Pregledni znanstveni članek / review scientific article Prispelo / received: 15. oktober 2015 Sprejeto / accepted: 7. december 2015
Izvleček
Fitopatogene glive rodu Verticillium povzročajo okužbe prevodnega sistema številnih dvokaličnic, ki vodijo v nastanek različnih bolezenskih znamenj, kot so kloroze, nekroze, venenje in odmiranje. Največje težave povzročajo pri trajnicah, kot so oljke, bombaž in hmelj, katerih nasade lahko popolnoma uničijo in posledično povzročijo ogromno gospodarsko škodo. V Sloveniji največ škode povzroča vrsta V. albo-atrum na hmelju, ki z letalnim patotipom PV1 povzroča odmiranje rastlin in sili pridelovalce v krčenje nasadov in večletno sanacijo tal. Pri glivah rodu Verticillium spolni cikel ni poznan, imajo širok nabor gostiteljskih rastlin, samo razlikovanje na osnovi morfoloških lastnosti pa je pogosto zelo zahtevno, zaradi česar ima ta rod zelo razgibano taksonomsko zgodovino. Nadgrajevanje taksonomije je izrednega pomena pri razumevanju izvora, evolucije, mehanizmov prilagajanja različnim substratom ter samega določevanja posameznih povzročiteljev bolezni. Prispevek predstavlja pregled in razlago taksonomskega razvoja rodu Verticillium ter načine določanja s poudarkom na hmeljnih izolatih vrste V. albo-atrum.
Ključne besede: Verticillium /taksonomija / diagnostika / PCR
TAKSONOMY OF GENUS Verticillium AND DETERMINATION OF PHYTOPATHOGENIC FUNGUS Verticillium albo-atrum
Abstract
Phytopathogenic fungi from the genus Verticillium causes infections of the vascular system of numerous dycotledons, which leads to formation of different symptoms, such as chlorosis, necrosis, wilting and plant death. The most harmful infections are on perennial crops, such as olive trees, cotton and hops, where they can destroy entire plantations and cause extensive economic losses. In Slovenia, the most damage is caused on hop by fungus V. albo-atrum, whose lethal pathotype PV1 causes plant withering and forces farmers into eradications and soil sanitation process which may take more years. For fungi from the genus Verticillium, the sexual cycle is not known, they have a wide spectrum of host plants, and their determination based only on morphological characteristics is often very difficult. Therefore, this genus has a very diverse taxonomic history. Upgrading taxonomy is crucial in understanding the origin, the evolution, the mechanisms of adaption to different substrates, and for pathogen determination. This paper presents an overview and explanation of Verticillium taxonomy and a description of different techniques of determination with an emphasis on hop isolates of V. albo-atrum.
Key words: Verticillium / taxonomy / diagnostics / PCR
6	Univ. dipl. bioteh., Biotehniška fakulteta, Oddelek za agonomijo (Department of Agronomy), Jamnikarjeva 101, 1000 Ljubljana, e-pošta: kristina.marton@bf.uni-lj.si
7	Dr., Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije, Oddelek za varstvo rastlin (Plant Protection Department), Cesta Žalskega tabora 2, 3310 Žalec, Slovenija, e-pošta: sebastjan.radisek@ihps.si
100
Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 22(2015)
1	UVOD
Rod Verticillium senso stricto predstavlja skupino fitopatogenih gliv, ki povzročajo okužbe prevodnega sistema rastlin in posledično nastanek različnih bolezenskih znamenj, kot so kloroze, nekroze, venenje in odmiranje (Klosterman in sod., 2009). Gre za skupino gospodarsko pomembnih rastlinskih patogenov, saj njeni predstavniki okužujejo veliko število vrst gojenih rastlin iz skupine dvokaličnic (Pegg in Brady, 2002). Poleg neposredne škode, ki nastaja zaradi okužb rastlin, so omenjene glive problematične zaradi sposobnosti tvorbe trajnih organov, ki jim omogočajo večletno preživetje v tleh in tako povzročajo ponavljajoč gospodarski problem. V povprečju povzročajo izpad pridelka med 10 in 15 %, pri nekaterih rastlinskih vrstah, kot so solata, krompir ali paprika, pa lahko izgube presegajo tudi 50 %. Pri trajnicah, kot so hmelj, bombaž in oljke, lahko vrste iz rodu Verticillium povzročijo tudi propad nasadov (Pegg, 1984; Klosterman, 2009). V Sloveniji največ škode naredi gliva V. albo-atrum na hmelju, ki s pojavom letalnega patotipa PV1 (genotip PG2) povzroča odmiranje rastlin in sili pridelovalce v krčenje nasadov in večletno sanacijo tal (Radišek in sod., 2004, 2006). Omenjena gliva je zaradi visoke škodljivosti hmelju v Evropski uniji uvrščena na listo karantenskih organizmov II.A.II. direktive Sveta 2000/29/ES za nadzor sadilnega in razmnoževalnega materiala.
Glive rodu Verticillium imajo zaradi izostanka spolnega cikla in zahtevnosti določanja posameznih vrst in patotipov razgibano taksonomsko zgodovino (Radišek in sod, 2011). Zadnjo revizijo, ki obravnava fitopatogene vrste oz. rod Verticillium sensu stricto, so opravili Inderbitzin in sod. (2011). Pri tem nova taksonomija, osnovana na multigenskih analizah in morfoloških lastnostih, razdeljuje obstoječe vrste in hkrati opisuje nove vrste. Tovrstna proučevanja in nadgrajevanje taksonomije so izrednega pomena pri razumevanju izvora, evolucije, mehanizmov prilagajanja različnim substratom ter samega določevanja posameznih povzročiteljev bolezni. Prispevek predstavlja pregled in razlago taksonomskega razvoja rodu Verticillium ter načine določanja s poudarkom na hmeljnih izolatih vrste V. albo-atrum, ki so po zadnji taksonomski reviziji uvrščeni v vrsto V. nonalfalfae (Iderbitzin in sod., 2011).
2	TAKSONOMIJA
Rod Verticillium je prvi opisal nemški mikolog Nees von Esenbeck leta 1816. Ime je izpeljal iz latinske besede verticillius, ki pomeni vretence, saj glive tvorijo značilne vretenaste konidiofore. Dobrih dvajset let za njegovim opisom se je pojavilo tudi ime Acrostalagmus kot poseben rod, vendar so ugotovili, da gre za isto skupino gliv, imenovano Verticillium (Hoffman, 1854).
100	Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 22(2015)

Precejšnjo težavo pri taksonomskem razvrščanju predstavlja nespolni način razmnoževanja teh gliv, zato so jih najprej razvrstili v skupino Deuteromycota, razred Hyphomycetes, red Hyphomycetales in družino Moniliaceae. Ta se je dalje na osnovi morfologije ločila na štiri sekcije (Gams, 1988; Gams in Van Zaayen, 1982):
1.	Prostrata:
-	V. chlamydosporium Goddard (1913),
-	V. balanoides (Drechsler) Dowsett in sod. (1982),
-	V. fungicola (Preuss) Hassebrauk (1936),
-	V. lecanii (Zimmermann) Viegas (1939).
2.	Albo-erecta:
-	V. rexianum (Saccardo) Saccardo (1882).
3.	Verticillium:
-	V. tenerum Nees (1816).
4.	Nigrescentia:
-	V. albo-atrum Reinke in Berthold (1879)
-	V. dahliae Klebhan (1913),
-	V. tricorpus Isaac (1953),
-	V. nigrescens Pethybridge (1919),
-	V. nubilum Pethybridge (1919),
-	V. theobromae (Turconi) Mason in Hughes (1951).
Sekcija Nigrescentia je dobila ime po tvorbi melaniziranih trajnih organov in vključuje fitopatogene vrste, med katerimi po patogenosti izstopata glivi V. albo-atrum in V. dahliae. V ostale sekcije so bile uvrščene glive, ki parazitirajo žuželke, ogorčice, ostale glive ali pa spadajo med saprofite. Taksonomijo, ki je temeljila na morfologiji, je popolnoma prevetrilo razvrščanje gliv na osnovi analize DNK in združilo glive s spolnim ciklom z nespolnimi glivami v enoten sistem. Multigenske molekularne analize so tako uvrstile rod Verticillium v družino Plectosphaerellaceae, red Hypocreales, podrazred Hypocreomycetidae, razred Sordariomycetes, poddeblo Pezizomycotina in deblo Ascomycota (preglednica 1) (Index Fungorum, 2015). Zanimivo je, da je družina Plectosphaerellaceae precej sorodna glivam iz rodu Colletotrichum iz družine Glomerellaceae, ki predstavlja še eno pomembno skupino fitopatogenih gliv (Zhang in sod., 2006). Zare je leta 2003 nadalje razdelil vrste rodu Verticillium sensu lato še na 4 rodove Pochonia, Lecanicillum, Haptocillium in Simplicillum, kar so z nadaljnjimi analizami podprli tudi ostali raziskovalci (Zhang in sod., 2006, Gams in sod., 2005). Rod Verticillium sensu stricto je po teh raziskavah zajemal le še 5 vrst (V. albo-atrum, V. dahliae, V. tricorpus, V. longisporum in V. nubilum), ki predstavljajo izključno rastlinske patogene.
Poleg taksonomskih raziskovalnih skupin so skupino fitopatogenih gliv rodu Verticillium intenzivno proučevali tudi fitopatologi, predvsem v smeri določanja gostiteljske specifičnosti, ločevanja med posameznimi sevi ali patotipi za namene diagnostike ter razumevanja razvoja virulence in patogenosti v okviru posameznih vrst. Raziskave, usmerjene v proučevanje izolatov glive V. albo-atrum, so pokazale, da v okviru te vrste obstaja jasna variabilnost, ki so jo ovrednotili kot skupino izolatov Grp1, ki jo tvorita podskupina L (izolati iz lucerne) in podskupina NL (izolati vseh ostalih gostitelj skih rastlin, kamor uvršamo tudi izolate iz
100
Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 22(2015)
hmelja), in skupino Grp2, ki predstavlja specifične izolate, izolirane iz krompirja (Nazar in sod., 1991; Robb in sod., 1993; Carder in Barbara, 1991; Mahuku in Platt, 2002a). Razlike med omenjenimi skupinami so nakazovale, da bi jih lahko obravnavali kot nove vrste, zato so Inderbitzin in sod. (2011) opravili taksonomsko raziskavo, v kateri so s filogenetsko analizo in analizo morfoloških lastnosti proučili reprezentativne izolate posameznih skupin glive V. albo-atrum ter v analizo vključili tudi izolate in podskupine ostalih fitopatogenih vrst rodu Verticillium.
Preglednica 1: Taksonomska uvrstitev rodu Verticillium (Index fungorum, 2015) Table 1: Taxonomic classification of the genus Verticillium (Index fungorum, 2015)
Taksonomski niz	Ime
Domena	Eukarya
Kraljestvo	Fungi
Deblo	Ascomycota
Poddeblo	Pezizomycotina
Razred	Sordariomycetes
Podrazred	Hypocreomycetidae
Red	Hypocreales
Družina	Plectosphaerellacae
Rod	Verticillium
Preglednica 2: Spremembe poimenovanja in sekcij vrst rodu Verticillium senso stricto (Iderbitzin in sod., 2011)
Table 2: Differences in designation and clades of genus Verticillium senso stricto (Iderbitzin et al., 2011)
Prejšnje	Sprememba v taksonomiji	Sedanje	Sekcija vrste
poimenovanje		poimenovanje	
Verticillium albo-	Razdelila se je na tri vrste,	V. albo-atrum,	Flavexudans
atrum	določen epitip za V. albo-	V. alfalfae in	Flavnonexudans
	atrum.	V. nonalfalfae	Flavnonexudans
Verticillium dahliae	Določen epitip.	V. dahliae	Flavnonexudans
Verticillium	Nobena.	V. longisporum	Flavnonexudans
longisporum			
Verticillium nubilum	Določen epitip.	V. nubilum	Flavnonexudans
Verticillium	Razdelila se je na tri vrste,	V. tricorpus	Flavexudans
tricorpus	določen lektotip za V.	V. isaacii	Flavexudans
	tricorpus.	V. klebhanii	Flavexudans
-	Opisana nova vrsta.	V. zaregamsianum	Flavexudans
100	Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 22(2015)

Rezultat raziskave je bila razdelitev vrst V. albo-atrum na tri nove: V. albo-atrum, V. alfalfae in V. nonalfalfae. Da pa ne bi prišlo do zamenjav v poimenovanju, je EFSA leta 2014 izdala znanstveno mnenje, kjer poimenuje nove vrste V. albo-atrum sensu stricto, V. alfalfae in V. nonalfalfae, vrsto V. albo-atrum pred novim poimenovanjem pa V. albo-atrum sensu lato, ker v starejših člankih ni jasno, za katero vrsto gre (Baker in sod., 2014). Podobna razdelitev na tri vrste je bila potrjena pri vrsti V. tricorpus, pri nekaterih vrstah pa se je potrdilo, da ne spadajo v podrod Verticillium sensu stricto, niti v rod Verticillium, zato so jih preimenovali in razvrstili drugače: V. theobromae vMusicillium theobromae ter V. nigrescens v Gibellulopsis nigrescens (Inderbitzin in Subbarao, 2014).
Poleg samega opisa 5 novih vrst so vrste razdelili tudi na 2 sekciji, Flavexudans (vrste s tvorbo rumenega pigmenta) in Flavnonexudans (neobravane hife) (preglednica 2), ter definirali reprezentativne gostitelje posameznih vrst (preglednica 3).
Preglednica 3: Vrste rodu Verticillium sensu stricto in njihovi gostitelji (Inderbitzin in sod., 2011; Kasson in sod., 2014; Snyder in sod., 2014)
Table 3: Species of genus Verticillium sensu strictu and their hosts (Inderbitzin et al., 2011; Kasson et al., 2014; Snyder et al., 2014)
Vrsta	Gostitelj
V. albo-atrum sensu stricto	krompir, tla krompirjevih polj
V. alfalfae	lucerna
V. dahliae	rastlinske družine: javorovke, ščirovke, octovke, bršljanovke, nebinovke, križnice, bučevke, metuljnice, komelinovke, slezenovke, oljkovke, makovke, rožnice, razhudnikovke
V. isaacii	paradižnik, artičoka, solata, špinača, tla
V. klebahnii	solata
V. longisporum	oljna ogroščica, zelje, cvetača, hren, redkev, sladkorna pesa, divja redkev
V. nonalfalfae	hmelj, krompir, špinača, petunija, paradižnik, veliki pajesen, javor, kivi, aralije, mnogocvetni šipek, krompir, jajčevec
V. nubilum	kompost gojenih gob, krompir, tla
V. tricorpus	paradižnik, krompir, nagelj
V. zaregamsianum	solata
3 NAČINI DOLOČANJA GLIVE V. nonalfalfae
Pri določanju izolatov glive V. nonalfalfae uporabljamo različne identifikacijske pristope, ki zajemajo morfologijo, patogene teste in molekularne analize.
3.1 Morfološke lastnosti
Po zadnjem poimenovanju (Inderbitzin in sod., 2011) za morfološko določanje glive V. nonalfalfae drži naslednje:
• Kolonije zrastejo na krompirjevem dekstroznem agaiju po dveh tednih, na premer 3,5-5,5 cm. Sprva so bele, pozneje potemnijo, saj se začnejo formirati trajni organi.
100
Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 22(2015)
•	Tvorijo ogromno zračnega micelija v obliki šopov laskov ali belega prahu.
•	Hife imajo gladko steno, v širino merijo 1,5-3 pm.
•	Konidiogene celice so fialide. 2 do 6 jih je razporejenih okoli konidiofor.
•	Vretenca so med seboj oddaljena 50-160 pm, pri apeksu so bližje. Sestavlja jih 25 fialid, ki izhajajo prečno iz septuma. Apikalna vretenca sestavljajo ena apikalna in več lateralnih fialid.
•	Konidiofori so pokončni ali poševni, običajno so razvejeni ali nerazvejeni, hialinski, rjavo obarvani pri bazi, do 11 pm široki. V dolžino merijo 70-570 pm in v širino 4,5-6,5 pm. Proti apeksu se zožijo na 2 do 2,5 pm (slika 1)
•	Konidiji so hialinski, imajo gladko steno cilindrične oblike z okroglimi ali ovalnimi vrhovi. Njihove dimenzije so 6,0 ± 1,0 pm * 3,0 ± 0,5 pm, akumulirajo pa se pri koncu fialid.
•	Trajni micelij je temno obarvan, sestavljajo ga ijavo obarvane hife širine 9 pm (slika 1).
Slika 1: Gliva V. nonalfalfae; (A) konidiofori in konidiji (200x), (B) trajni micelij (100x) (Radišek, 2014)
Figure 1: Fungus V. nonalfalfae; (A) condiophores and conidia (200x), (B) resting micelium (100x) (Radisek, 2014)
3.2 Skupine vegetativne kompatibilnosti (VCG)
Med začetne načine determinacije in določanje sorodnosti različnih vrst gliv iz rodu Verticillium, ki temeljijo na morfoloških lastnostih, uvrščamo skupine vegetativne združljivosti (ang. vegetative compatibility group, VCG), ki jih tvorijo glive istih vrst. To je tako imenovana zmožnost hif dveh sevov iste vrste, da se anastomotsko povežeta in tvorita stabilen heterokarion. Za opazovanje pripadnosti isti VCG je najprej potrebno pripraviti seve mutant, ki nimajo sposobnost izkoriščanja nitratov (ang. nitrate non-utilizing, nit). Izolata pripadata isti skupini VCG, če dva komplementna nit mutanta rasteta na minimalnem mediju. To je rezultat uspešne fuzije med sevi, ki se odraža v stabilnem heterokarionu in ne kaže mutantnega fenotipa (Leslie, 1993; Rowe, 1995; Iglesias-Garcia in sod., 2013). Pri izolatih glive V. albo atrum sensu lato iz različnih gostiteljskih rastlin so Correll in sod. (1988) določili dve VCG skupini. Prvo skupino so sestavljali izolati, ki so jih izolirali iz lucerne,
100	Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 22(2015)

drugo skupino pa so sestavljali izolati iz različnih gostiteljev. Tvorbo VCG skupin med hmeljnimi izolati V. albo-atrum sta prva potrdila Clarkson in Heale leta 1985.
3.3	RFLP analize
Polimorfizem dolžin restrikcijskih fragmentov (ang. Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) je analiza, ki temelji na razliki dolžin fragmentov, ki nastanejo med vzorci homolognih DNA molekul. Te razlike so posledica različnih zaporedij nukleotidov in posledično tudi različnih mest za restrikcijske encime (Saiki in sod., 1985). Na podlagi teh razlik lahko tudi determiramo vrste gliv rodu Verticillium med seboj. Analiza RFLP je bila pretežno bolj v uporabi pred odkritjem PCR in objavo specifičnih začetnih oligonukleotidov, vendar je še vedno zelo uporabno orodje za determinacijo glive V. nonaflalfae. Zare je leta 2003 na podlagi mitohondrijske RFLP analize ločil med vsemi dotlej znanimi vrstami rodu Verticillium. V. theobromae in V. nigrescens sta celo kazala določene podskupine. Uporabil je encim Hae III po metodi Kouvelis in sod. (1999). Še pred njim pa so leta 1992 Typas in sodelavci poskušali RFLP analizo z encimoma EcoRI in HaeIII na genomski DNA gliv rodu Verticillium. Ugotovili so, da prvi encim ne ločuje med V. albo-atrum in V. dahliae, drugi pa ju ločuje (Typas in sod., 1992). Carder in Barbara (1991) sta z RFLP določila razlike med šestimi vrstami gliv rodu Verticillium.
3.4	PCR analize - analiza nukleotidnega zaporedja ITS in IGS regij
Morfološka determinacija glive V. nonalfalfae sama po sebi ni dovolj, saj se lahko lastnosti, ki se uporabljajo za identifikacijo, izgubijo v laboratorijskih razmerah gojenja. Nekatere glive rodu Verticillium niti nimajo morfoloških lastnosti, po katerih bi jih lahko ločili med seboj. Zato se je treba poleg uporabe dihotomskega ključa zateči tudi k drugim molekularnim metodam, kot so verižna reakcija s polimerazo (ang. polymerase chain reaction, PCR), določanje nukleotidnega zaporedja in iskanje razlik v regiji jedrne ribosomalne DNA, imenovani notranji prepisni vmesnik ribosomske DNA (ang. internal transcribed spacer, ITS), z blast algoritmom. ITS regije so uradna barkoding regija za glive, poleg tega so najbolj razširjena metoda, ki temelji na identifikaciji DNA (Inderbitzin in sod., 2013; Baker in sod., 2014; Inderbitzin in Subbarao, 2014).
V evkariontski jedrni DNA se zaporedje za rRNA ribosoma nahaja v tandemskih ponovitvah s številom kopij do 5000. Sestavljajo ga del male podenote, imenovane 18S (SSU), in deli velike podenote 26S (LSU), 5,8S in 5S. Omenjene funkcionalne regije so med seboj ločene z vmesniki; z medgenskim vmesnikom (IGS) med dvema ponovitvama 18S in 26S + 5,8S rRNA ter z notranjima prepisanima vmesnikoma (ITS1, ITS2) med 18S in 26S rRNA. Mutacije v teh predelih so lahko podlaga za filogenetske študije, vendar so se pojavile prve omejitve, saj regije, ki so določile in razjasnile sorodnost med določenimi taksoni, niso bile uporabne pri določanju sorodnosti med drugimi taksoni. Za reševanje tega problema so v filogenetske namene začeli iskati in ugotavljati še uporabnost drugih lokusov, kot so nukleotidna zaporedja genov za RNA-polimeraze, elongacijski faktor 1a in geni za različne strukturne proteine (aktin, P-tubulin) (Tang in sod., 2007).
Na podlagi PCR metode so glive rodu Verticillium v preteklosti poskušale razlikovati različne raziskovalne skupine (Koike in sod., 1997; Mahuku in Platt, 2002b; Lievens in sod., 2006;
100
Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 22(2015)
Gayoso in sod., 2007; Bilodeau in sod., 2012). Kljub temuje najbolj aktualna prav zadnja objava iz leta 2013 avtorjev Inderbitzin in sod.
Inderbitzin in sod. (2011) so razvili specifične začetne oligonukleotide za polimerazno verižno reakcijo (PCR), ki lahko ločijo med vsemi desetimi vrstami gliv rodu Verticillium na podlagi ITS regij, genov za aktin, za elongacijski faktor 1a, za gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenazo in triptofan sintazo. Še posebno težko se ločijo vrste in podvrste V. dahliae in V. longisporum, saj je V. dahliae starševska vrsta dveh od treh linij glive V. longisporum. Iz tega razloga je za določitev ostalih vrst dovolj simpleks PCR, za razlikovanje med glivo V. dahliae in V. longisporum pa je potreben mulipleks PCR (Inderbitzin in sod., 2013).
Podobno kot analiza ITS nukleotidnega zaporedja je lahko podlaga za razlike med vrstami rodu Verticillium tudi nukleotidno zaporedje medgenskega vmesnika (ang. intergenic spacer, IGS) ribosomalne RNA. Geni, ki kodirajo ribosomalno RNA in vmesnike, se pojavljajo v več tandemskih ponovitvah, ki so dolge več tisoč nukleotidov. Ti so med seboj ločeni z IGS. Za IGS regijo so značilne podponovitve, ki so jih opazili Collins in sod. (2003). Te so tudi omogočile ločevanje med V. alfalfae, V. dahliae, V. tricorpus in V. nonalfalfae.
3.5	AFLP analize
Polimorfizem dolžin pomnoženih fragmentov (ang. Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP) je analiza, ki deluje na podlagi različnih polimorfizmov na mestih prileganja začetnih oligonukleotidov. Zaradi tega dobimo različno dolge pomnožene fragmente DNA med PCR (Vos in sod., 1995). Na podlagi te razlike so Collins in sod. (2003) ločili med V. alfalfae, V. dahliae, V. tricorpus in V. nonalfalfae s pomočjo treh setov začetnih oligonukeltoidov (15 parov začetnih oligonukleotidov). Določili so tudi skupine, ki so se pojavile v okviru posameznih vrst. Tako so Radišek in sod. (2003a) s pomočjo AFLP analize odkrili razlike na nivoju genoma med različno virulentnima patotipoma glive V. nonalfalfae na hmelju.
3.6	RAPD analize
Naključno pomnožena polimorfna DNA (ang. Randomly Amplified Polymorphic DNA, RAPD) je analiza, ki temelji na naključnem pomnoževanju DNA segmentov. Poteka z dizajnom več arbitrarnih, od 8 do 12 nukleotidov dolgih začetnih oligonukleotidov, ki se uporabljajo za PCR genomske DNA. Kot rezultat se na gelu pojavijo unikatni profili različno dolgih fragmentov DNA za posamezne vrste (Williams in sod., 1990), na podlagi česar lahko ločimo vrste med sabo. Bhat in Subbarao (1999) sta uspešno uporabila RAPD test za določanje razlik med V. dahliae in V. alfalfae. Od 40 naključnih začetnih oligonukleotidov jih je DNA od prej omenjenih organizmov pomnoževalo 18. Ti so jasno ločevali med V. dahliae in V. alfalfae.
Prav tako so Koike in sod. (1996) ločili med sevi V. dahlie in V. alfalfae sensu lato. Na podlagi te analize so tudi določili različne podskupine med prej omenjenimi glivami.
100	Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 22(2015)

3.7	Določanje patogenosti vrste V. nonalfalfae
Vrsta V. nonalfalfae uspešno okužuje širši nabor gostiteljev, vendar ne povzroča vidnih bolezenskih znamenj na vseh rastlinah. Različni sevi glive V. nonalfalfae povzročajo različna bolezenska znamenja. Kasson in sod. (2014) predlagajo določanje patogenosti glede na bolezenska znamenja, ki jih povzročajo različne koncentracije konidijev V. nonalfalfae po metodi namakanja korenin (Qin in sod., 2006). Podobno klasifikacijo predlagajo tudi Radišek in sod. (2003a in 2003b).
3.8	NGS
Novejše metode določevanja nukleotidnega zaporedja, kot je tudi naslednja generacija določevanja nukleotidnega zaporedja (ang. Next Generation Sequencing, NGS), so bolj namenjene iskanju razlik v posamičnih bazah, kar lahko s pridom izkoristimo za določevanje novih začetnih oligonukleotidov ali restrikcijskih encimov za določanje razlik med posameznimi vrstami gliv rodu Verticillium. Pri tej metodi lahko določimo tudi razlike med posameznimi sevi gliv na podlagi primerjave večjih regij ali celo celega genoma, kar pa pride bolj v poštev pri študijah patogenosti posameznih podskupin organizmov ali pri iskanju regij, povezanih s povečano patogenostjo. Tak primer je tudi določanje sintenije med različnimi patotipi glive V. nonalfalfae naše raziskovalne skupine (neobjavljeni podatki).
4	ZAKLJUČEK
Rod Verticillium je imel od odkritja prve vrste pa vse do danes več taksonomskih revizij, ki so pomembno vplivale na samo klasifikacijo posameznih vrst in hkrati prispevale k razvoju njihovega določevanja. Največji premik je naredil napredek znanosti na nivoju molekularne biologije in posledično diagnostike, ki določa posamezne vrste ali patotipe na nivoju nukleinskih kislin, proteinov ali celo celotnih genomov. Zadnja taksonomska revizija fitopatogenih vrst rodu Verticillium je postavila nove temelje in hkrati odprla vrata za vključevanje novih vrst v ta rod. S fitopatološkega stališča nas zanima predvsem variabilnost v okviru posameznih vrst, ki jo določajo sevi ali patotipi. Ta vidik je pomemben zlasti pri sprejemanju ukrepov, pri reševanju bolezenskih izbruhov in hkrati pomemben pri samem razumevanju mehanizmov razvoja bolezni. Ne glede na obsežen razvoj različnih diagnostičnih tehnik pa kot osnovni del določanja še vedno ostaja morfološka analiza, ki se v procesu določanja nadgrajuje z ostalimi analizami.
5	VIRI
Baker R., Bragard C., Caffier D., Candresse T., Gilioli G., Grégoire J.-C., Holb I., Jeger M. J., Evtimova Karadjova O., Magnusson C., Makowski D., Manceau C., Navajas M., Rafoss T., Rossi V., Schans J., Schrader G., Urek G., Vloutoglou I., van der Werf W., Winter S. Scientific Opinion on the pest categorisation of Verticillium albo-atrum. EFSA Journal. 2014; 12(12): 3927. Bhat R. G., Subbarao K. V. Host Range Specificity in Verticillium dahliae. Phytopathology. 1999; 89(12): 1218-1225.
Bilodeau G. J., Koike S. T., Uribe P., Martin F. N. Development of an assay for rapid detection and
quantification of Verticillium dahliae in soil. Phytopathology. 2012; 102(3): 331-43. Carder J. H., Barbara D. J. Molecular variation and restriction fragment length polymorphisms (RFLPs) within and between six species of Verticillium. MycologicalResearch. 1991; 95(8): 935-942.
100
Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 22(2015)
Clarkson J. M., Heale J. B. Heterokaryon compatibility and genetic recombination within a host lant between hop wilt isolates of Verticillium albo-atrum. Plant pathology. 1985; (34):129-138.
Collins A., Okoli C. A. N., Morton A., Parry D., Edwards S. G., Barbara D. J. Isolates of Verticillium dahliae Pathogenic to Crucifers Are of at Least Three Distinct Molecular Types. Phytopathology. 2003; 93(3): 364-376.
Correll J. C., Gordon T. R., McCain A. H. Vegetative compatibility and pathogenicity of Verticillium albo-atrum. Phytopathology. 1988; (78):1017-1021.
Gams W. A contribution to the knowledge of nematophagous species of Verticillium. Netherlands Journal of Plant Pathology. 1988; (94):123-148.
Gams W., Zare R., Summerbell R. C. Proposal to conserve the generic name Verticillium (anamorphic Ascomycetes) with a conserved type. Taxon. 2005; 54(1):179.
Gams W., Van Zaayen A Contribution to the taxonomy and pathogenicity of fungicolous Verticillium species I. Taxonomy. Netherlands Journal of Plant Pathology. 1982; (88):57-58.
Gayoso C., de Ilarduya O. M., Pomar F., Merino de Caceres F. Assessment of real-time PCR as a method for determining the presence of Verticillium dahliae in different Solanaceae cultivars. European Journal of Plant Pathology. 2007; 118(3): 199-209.
Hoffman H. Spermatien bier einem Fadenpilze. Botanische Zeitung. 1854, (12):249-254.
Iglesias-Garcia A. M., Villarroel-Zeballos M. I., Feng C., du Toit L. J., Correll J. C. Pathogenicity, Virulence, and Vegetative Compatibility Grouping of Verticillium Isolates from Spinach Seed. Plant Disease. 2013; 97(11): 1457-1469.
Inderbitzin P., Bostock R. M., Davis R. M., Usami T., Platt H. W., Subbarao K. V. Phylogenetics and taxonomy of the fungal vascular wilt pathogen Verticillium, with the descriptions of five new species. PloS one. 2011; 6(12): e28341.
Inderbitzin P., Davis R. M., Bostock R. M., Subbarao K. V. Identification and Differentiation of Verticillium Species and V. longisporum Lineages by Simplex and Multiplex PCR Assays. PloS one. 2013; 8(6): e65990.
Inderbitzin P., Subbarao K. V. Verticillium systematics and evolution: how confusion impedes Verticillium wilt management and how to resolve it. Phytopathology, 2014; 104(6): 564-74.
Index fungorum. www.indexfungorum.org. 2015
Kasson M. T., Short D. P. G., O'Neal E. S., Subbarao K. V, Davis D. D. Comparative pathogenicity, biocontrol efficacy, and multilocus sequence typing of Verticillium nonalfalfae from the invasive Ailanthus altissima and other hosts. Phytopathology. 2014; 104(3): 282-92.
Klosterman S. J., Atallah Z. K., Vallad G. E., Subbarao K. V. Diversity, pathogenicity, and management of Verticillium species. Annual review of phytopathology. 2009; 47: 39-62.
Koike M., Itaya T., HoshIno K.-I., Nagao H., Ohshima S. PCR Detection of Japanese Isolates of Verticillium dahliae and V. albo-atrum using European Subgroup-specific Primers. Microbes and environments. 1997; 12(1): 15-18.
Koike M., Watanabe M., Nagao H., Ohshima S. Random amplified polymorphic DNA analysis of Japanese isolates of Verticillium dahliae and Verticillium albo-atrum. Letters in applied microbiology. 1996; 21(2): 75-78.
Kouvelis V. N., Zare R., Bridge P. D., Tyoas M. A. Differentiation of mitochondrial subgroup in the Verticillium lecanii species complex. Letters in Applied Microbiology. 1999; 28(4): 263-268.
Leslie J. F. Fungal vegetative compatibility. Annual Review of Phytopathology. 1993; 31: 127-150.
Lievens B., Brouwer M., Vanachter A. C. R. C., Cammue B. P. A., Thomma B. P. H. J. Real-time PCR for detection and quantification of fungal and oomycete tomato pathogens in plant and soil samples. Plant Science. 2006; 171(1): 155-165.
Mahuku G. S., Platt H. W. Molecular evidence that Verticillium albo-atrum Grp2 isolates are distinct from V. albo-atrum Grp1 and V. tricorpus. Molecular Plant Pathology. 2002a; 3(2): 71-79.
Mahuku G. S., Platt H. W. Quantifying Verticillium dahliae in soils collected from potato fields using a competitive PCR assay. American Journal of Potato Research. 2002b; 79(2): 107-117.
Nazar R. N., Hu X., Schmidt J., Culham D., Robb J. Potential use of PCR-amplified detection and differentiation of Verticillium wilt pathogens. Molecular Plant Pathology. 1991; 39(1): 1-11.
100	Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 22(2015)

Pegg G. F. The impact of Verticillium diseases in agriculture. Phytopathologia Me diterr anea. 1984; 23(2-3): 176-192.
Pegg G. F., Brady B. L. Verticillium Wilts. Wallingford, CABI Publishing, 2002; 552.
Qin Q. M., Vallad G. E., Wu B. M., Subbarao K. V. Phylogenetic Analyses of Phytopathogenic Isolates of Verticillium spp. Phytopathology. 2006; 96(6): 582-592.
Radišek S., Jakše J., Simončič A., Javornik B. Characteriztaion of Verticillium albo-atrum Field Isolates Using Pathogenicity Data and AFLP Analysis. Plant Disease Journal. 2003a;87(6): 633638.
Radišek S., Jakše J., Javornik B. Development of pathotype-specific SCAR markers for detection of Verticillium albo-atrum isolates from hop. Plant Dis. 2004; 88(10): 1115-1122.
Radišek S., Jakše J., Javornik B. Genetic variability and virulence among Verticillium albo-atrum isolates from hop. European Journal of Plant Pathology. 2006; 116(4): 301-314.
Radišek S., Jakše J., Javornik B. Identifikacija dveh patotipov glive Verticillium albo-atrum na hmelju z molekulskimi markerji in umetnimi okužbami hmelja. Hop Bulletin. 2003b; 107-111.
Radišek S., Javornik B. Taxonomy and variability of phytopathogenic Verticillium species. Hop Bulletin, 2011; 18: 41-55.
Robb J., Moukhamedov R., Hu X., Platt H., Nazar R. N. Putative subgroups of Verticillium albo-atrum distinguishable by PCR-based assays. Physiological and Molecular Plant Pathology. 1993; 43(6): 423-436.
Rowe R. C. Recent progress in understanding relationships between Verticillium species and subspecific groups. Phytoparasitica. 1995; 23(1): 31-38.
Saiki R., Scharf S., Faloona F., Mullis K., Horn G., Erlich H., Arnheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985; 230(4732): 1350-1354.
Snyder A. L., Salom S. M., Kok L. T. Survey of Verticillium nonalfalfae (Phyllachorales) on tree-of-heaven in the southeastern USA. Biocontrol Science and Technology. 2014; 24(3): 303-314.
Tang A. M. C., Jeewon R., Hyde K. D. Phylogenetic utility of protein (RPB2, ß-tubulin) and ribosomal (LSU, SSU) genbe sequences in the systematics of Sordariomycetes (Ascomycota, Fungi). Antonie van Leeuwenhoek, 2007; 91(4): 327-349.
Typas M. A., Griffen A. M., Bainbridge B. W., Heale J. B. Restriction fragment length polymorphisms in mitochondrial DNA and ribosomal RNA gene complexes as an aid to the characterization of species and sub-species populations in the genus Verticillium. FEMS Microbiology Letters. 1992; 95(2-3), 157-162.
Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee T., Hornes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Kuiper M. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic acids research. 1995; 23(21): 4407-14.
Williams J. G., Kubelik A. R., Livak K. J., Rafalski J. A., Tingey S. V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic acids research. 1990; 18(22): 6531-5.
Zare R. A revision of plant-associated Verticillium species. Rostaniha. 2003; 4: 29 - 54.
Zhang N., Castelbuiy L. A., Miller A. N., Huhndorf A. M. Schoch C. L., Seifert K. A., Rossman A. Y., Rogers J. D., Volkmann-Kohlmeyer B., Sung G. H. An overview of the systematics of the Sordariomycetes based on a four-gene phylogeny. Mycologia. 2006; 98(6):1076-1087.