PREGLEDNI CLANEK/REVIEW
Zunajcelični membranski vezikli v transfuzijskih pripravkih - biologija in klinična pomembnost
Extracellular membrane vesicles in blood products-biology and clinical relevance
Emilija Krstova Krajnc, Mojca Jež, Primož Rožman
Zavod RS za transfuzijsko medicino
Korespondenca/ Correspondence:
Emilija Krstova Krajnc e: emilija.krstova.krajnc@ gmail.com
Ključne besede:
zunajcelični membranski vezikli; krvni pripravki; transfuzija; detekcija; biologija
Key words:
extracellular membrane vesicles; blood products; transfusion; detection; biology
Citirajte kot/Cite as:
Zdrav Vestn 2015; 84: 809-19
Prispelo: 23. mar. 2015, Sprejeto: 25. sept. 2015
Izvleček
Zunajcelični membranski vezikli (ZMV) so delci, ki se stalno odcepljajo od plazemskih membran vseh vrst celic, še posebej če so celice izpostavljene različnim oblikam stimulacije ali stresa. Tudi v procesu programirane celične smrti (apoptoze) celice razpadajo na različno velike vezikle. Ti delci na zunanji strani membrane izpostavljajo fosfatidilserin in nosijo značilne membranske označevalce celic, iz katerih izhajajo. Zunajcelične vezikle lahko osamimo iz najrazličnejših bioloških tekočin in medceličnine, kot so serum, možganska tekočina, urin, solze, slina, ali pa iz hranilnih medijev celičnih kultur. Od mnogih različnih metodoloških pristopov, ki se uporabljajo za analizo zunajceličnih veziklov, se najbolj uporablja pretočna citometrija. S to metodo lahko okarakteriziramo celično poreklo, velikost populacije, število in strukturo veziklov. Zunajcelični vezikli so prisotni in se kopičijo tudi v shranjenih krvnih komponentah, to je v eritrocitih, v trombocitih in v sveže zamrznjeni plazmi (SZP). Članek poudarja pomen ZMV v medcelični komunikaciji in njihovo vlogo v pa-togenezi različnih bolezni. Poseben poudarek je namenjen vlogi zunajceličnih veziklov v transfuzijskih pripravkih in njihovi klinični pomembnosti. Čeprav njihova vloga v fiziologiji in pri nastanku bolezni še ni popolnoma razjasnjena, si obetamo, da bodo v prihodnosti postali zelo informativen biooznačevalec pri različnih boleznih, v kontroli kakovosti transfuzijskih pripravkov pa označevalec kakovosti in varnosti.
Abstract
Extracellular membrane vesicles are fragments shed from plasma membranes off all cell types that are undergoing apoptosis or are being subjected to various types of stimulation or stress. Even in the process of programmed cell death (apoptosis), cells disintegrate into varying sized vesicles. They expose phosphatidylserine (PS) on the outer leaflet of their membrane, and bear surface membrane antigens reflecting their cellular origin. Extracellular membrane vesicles have been isolated from many types of biological fluids, including serum, cerebrospinal fluid, urine, saliva, tears and conditioned culture media. Flow cytometry is one of the many different methodological approaches that have been used to analyze EMVs. The method attempts to characterize the EMVs cellular origin, size, population, number, and structure. EMVs are present and accumulate in blood products (erythrocytes, platelets) as well as in fresh frozen plasma during storage. The aim of this review is to highlight the importance of extracellular vesicles as a cell-to-cell communication system and their role in the pathogenesis of different diseases. Special emphasis will be given to the implication of extracellular membrane vesicles in blood products and their clinical relevance. Although our understanding of the role of EMVs in disease is far from comprehensive, they display promise as biomarkers for different diseases in the future and also as a marker of quality and safety in the quality control of blood products.
Zdrav Vestn | Zunajcelični membranski vezikli v transfuzijskih pripravkih - biologija in klinična pomembnost
809
PREGLEDNI CLANEK/REVIEW
Uvod
Evkariontske in prokariontske celice sproščajo vezikle, ki so delci sferičnih oblik, ograjeni z dvoplastnim slojem fosfolipidov. Za te delce uporabljajo tudi različne druge izraze, kot so „mikropartikli" in „mikrove-zikli". Najbolj ustrezen termin je: zunajce-lični membranski vezikli (ZMV). Te delce sta prvič opisala Chargaff in West leta 1946 v plazmi, revni s trombociti, in navedla, da imajo potencial za aktiviranje trombina.1 Več kot 20 let kasneje je Peter Wolf (1967) to podcelično frakcijo določil z elektronsko mikroskopijo. Izkazalo se je, da je sestavljena iz majhnih veziklov, ki izvirajo iz trombocitov, zato jih je poimenoval »trombocitni prah«.2 Zaradi uporabe različnih metod za osamitev in karakterizacijo in različnih načinov razvrščanja je poimenovanje zunaj-celičnih membranskih veziklov še vedno precej nesistematično in nekonsistentno. V praksi so vsi pripravki veziklov heterogeni. ZMV lahko osamimo z različnimi protokoli, ki omogočajo prevladovanje ene vrste nad drugo. Vezikle največkrat delimo po velikosti: najmanjši so eksosomi (40-100 nm), srednji so mikrovezikli (100-1.000 nm), največji pa so apoptotska telesca (glej Preglednico 1). Njihova majhnost je tudi eden od razlogov, zakaj so šele pred nekaj leti odkrili njihov pomen. Pri mnogih metodah za karakterizacijo celic so zaradi svoje majhnosti pod mejo detekcije, zato so bili dolgo spregledani.
Vezikli igrajo pomembno vlogo v med-celični komunikaciji, saj lahko tovorijo molekule mRNA, miRNA ali celo proteine (ci-toplazmatske ali citosolne) in jih prenašajo med celicami. Tovor, ki ga prenašajo, lahko vpliva na procese v prejemniški celici. Vezava vezikla na tarčno celico in sproščanje njegove vsebine v celico lahko vnese nove molekule mRNA, ki se nato prevedejo v proteine in spremenijo lastnosti prejemniške celice. Sestava veziklov zrcali sestavo celice, iz katere nastajajo, razne molekule pa se vanje pakirajo selektivno. Zunajcelični membranski vezikli lahko na svoji površini nosijo tudi receptorje in z njimi stimulirajo tarčne celice ter tako povzročajo odziv v oddaljenih celicah.3
Eksosomi nastajajo z eksocitozo in se sproščajo iz multivezikularnega endosoma, ko se le-ta zlije s celično membrano. Mikrovezikli nastajajo neposredno z izvihavanjem celične membrane (eksocitoza) na določenih območjih, ki vsebujejo specifične lipide in proteine. Apoptotska telesca nastajajo v procesu apoptoze - celica razpade na več veziklov, ki se pozneje razgradijo. Ti vezikli so največji in vsebujejo celične organele in dele DNA (glej Sliko 1).
Zunajcelični membranski vezikli so torej mikropartikli, ki se odcepljajo iz vseh vrst celic, še posebej če so celice izpostavljene različnim oblikam stimulacije ali stresa.6 Stimulacijo lahko povzročajo kemični dražljaji, kot so citokini, trombin in endotoksini, ali fizikalni dražljaji, kot sta strižna napetost in hipoksija.7 ZMV so osamili iz različnih bioloških tekočin, vključno s serumom, možgansko tekočino, urinom, slino, solzami pa tudi iz običajnih celičnih gojišč.8
Njihova običajna koncentracija v krvi je od 5-50 ^g/ml.9 Izražanje površinskih označevalcev iz starševske celice omogoča identifikacijo ZMV glede na njihov izvor, saj ima membranska sestava ZMV značilnosti celic, iz katerih izhajajo. Ločimo zunajcelične membranske vezikle iz trombocitov, levkocitov, eritrocitov ali pa iz endotelnih in drugih tkivnih celic.10
Plazemska membrana celic je sestavljena iz lipidnega dvosloja in je asimetrična - fos-folipidi v notranjem sloju so drugačni kot tisti v zunanjem. Fosfatidilserin (FS) se normalno nahaja na notranji strani membrane. Povečanje koncentracije kalcija v celici je eden od dejavnikov, ki povzroča z encimi nadzorovano preoblikovanje plazemske membrane in premestitev anionskih fosfoli-pidov iz notranje plasti membrane v zuna-njo,n kar privede do izvihavanja membrane in sproščanja ZMV/2 Encimi, ki pri tem sodelujejo, so flopaze, flipaze in skramblaze. Med sproščanjem zunajceličnih membranskih veziklov se normalna asimetrična porazdelitev fosfolipidov v plazemski membrani poruši, kar privede do izpostavljenosti FS na površini celice in torej tudi na površini veziklov. Fiziološke funkcije ZMV in vpliv
810
Zdrav Vestn | december 2015 | Letnik 84
PREGLEDNI ČLAN EK/REVIEW
Slika 1: Vrste in nastanek vezikLov.5
A)	Eksocitoza iz muLtivezikuLarnih endosomov - večji vezikeL nastane že v notranjosti celice in je poLn manjših vezikLov, ki jih ceLica nato sprosti v okolje.
B)	Brstenje vezikLov s ceLične membrane -membrana se izviha navzven in odcepi kot mehurček. C) Apoptotska teLesca nastajajo v procesu apoptoze - ceLica razpade na več vezikLov,
ki se pozneje razgradijo. Ti vezikLi so največji in vsebujejo ceLične organeLe in deLe DNA. Okrajšave: J - jedro, ER - endoplazemski retikulum, GA - golgijev aparat
tovora, ki ga prenašajo v prejemniške celice v številnih tkivih, ostajajo večinoma neznane, vendar njihovo vlogo v patofiziologiji, onkologiji, imunologiji in pri diferenciaciji celic intenzivno raziskujejo.
Metode za odkrivanje in osamitev zunajceličnih membranskih veziklov
Najpogostejši pristopi za preiskovanje ZMV so pretočna citometrija, mikroskopija, dinamično sipanje svetlobe (angl. Dynamic Light Scattering, DLS), analiza nanodelcev s sledenjem (angl. Nanoparticle Tracking Analysis, NTA), funkcionalni testi in testi ELISA.13 S temi metodami poskušamo oka-rakterizirati celično poreklo ZMV, določiti njihovo velikost in število in izražanje različnih označevalcev. S funkcionalni testi pa neposredno ali posredno določamo biološke funkcije ZMV in sicer preko določanja pro-koagulantne aktivnosti, glede na prisotnost fosfolipidov, tkivnega faktorja ali drugih označevalcev na ZMV.14 Za določanje ZMV je potrebno zelo previdno predanalitično ravnanje in obdelovanje vzorcev krvi (fle-botomija, transport, cikel zmrzovanja/odta-jevanja vzorcev in shranjevanje), da preprečimo eksperimentalne artefakte in umetno nastajanje ZMV.15
Pretočna citometrija
Pretočna citometrija je najbolj razširjena metoda za identifikacijo in kvantifikacijo
zunajceličnih membranskih veziklov. Su-spenzije veziklov označimo s fluorescentno konjugiranimi monoklonskimi protitelesi. S protitelesi nato identificiramo različne podtipe veziklov. Tako npr. anti-glikoforin A uporabimo za identifikacijo eritrocitnih zunajceličnih veziklov, anti-CD45 pa za lev-kocitne zunajcelične vezikle. Za tromboci-tne ZMV so najbolj pogosti označevalci površinski receptorji CD41, CD61 ali CD42K oziroma od trombocitne aktivacije odvisni P-selektin (CD62). Protitelesa, specifična za VE-kadherin (CD144), E-selektin (CD62) in V-CAM1, se uporabljajo za identifikacijo en-dotelnih ZMV. Aneksin-V se lahko uporablja kot splošni označevalec za identifikacijo, saj se nahaja na zunanji strani membrane večine veziklov.16 Glavna prednost pretočne citometrije je v tem, da lahko analiziramo veliko število ZMV v enem vzorcu, da identificiramo njihove celične značilnosti in da odkrijemo več antigenov hkrati na enem ZMV. Na žalost sedanji običajni pretočni citometri niso sposobni analizirati ZMV, manjših od 300nm, torej ni primerna za ek-sosome. To težavo delno rešimo, če vezikle obarvamo s protitelesi z vezanimi fluorokro-mi, saj je tako dobljeni fluoroscentni signal dovolj močan, da ga v osnovi lahko zaznamo s pretočnim citometrom. Kljub vsemu je pretočna citometrija še vedno najboljši pristop in je zlati standard za analizo zunajce-ličnih membranskih veziklov. Obstajajo tudi impedančni pretočni citometri ali novi digitalni pretočni citometri, ki omogočajo odkrivanje manjših veziklov.17 Podobno lahko tudi s testi ELISA določamo prisotnost anti-genov na ZMV.
Mikroskopija
Transmisijska elektronska mikroskopija in atomska mikroskopija se lahko uporabljata za določitev fenotipskih lastnosti ZMV, vendar trenutno ne omogočata analize velikega števila veziklov ter njihove kvantifikacije. Zaradi dolgotrajne priprave in obdelave vzorcev ti metodi nista primerni za presejal-no testiranje številnih vzorcev.
Zdrav Vestn | ZunajceLični membranski vezikLi v transfuzijskih pripravkih - biologija in klinična pomembnost
811
PREGLEDNI CLANEK/REVIEW
Dinamično sipanje svetlobe (angl. Dynamic Light Scatering, DLS)
DLS je fizikalna metoda, s katero lahko določimo velikost majhnih delcev v suspen-ziji. Vzorec, ki vsebuje ZMV, osvetlimo z laserjem. Svetloba se na ZMV sipa, način sipanja pa je odvisen od oblike, zgradbe in gibanja ZMV. Z analizo sipanja torej lahko določimo velikost veziklov.18 Prednost te tehnike je, da potrebujemo le majhno količino vzorca, hkrati pa lahko določimo koncentracijo in porazdelitev ZMV po veliko-
sti.19
Analiza nanodelcev s sledenjem (angl. Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)
Metoda deluje podobno kot prej opisana metoda DLS. Majhni delci v tekočini se gibljejo z Brownovim gibanjem, ki je sorazmerno z njihovo velikostjo. Analiza nanodelcev s sledenjem omogoča določanje velikosti in razporeditve delcev v tekočini.20
Trenutno ni soglasja, kateri postopki za osamitev zunajceličnih membranskih vezi-klov so najboljši. V nadaljevanju se bomo osredinili na zunajcelične membranske ve-zikle, ki nastajajo iz različnih vrst krvnih celic.
Zunajcelični membranski vezikli v krvnih pripravkih
Že od leta 1970 je znano, da shranjene enote polne krvi, trombocitov in eritrocitov v supernatant sproščajo mikrodelce. Čim dlje enote shranjujemo, tem večje je število mikrodelcev v supernatantu, kar predstavlja le eno od sprememb oziroma poškodb, ki nastajajo ob shranjevanju.21
ZMV se nahajajo v vseh krvnih pripravkih, namenjenih transfuziji. Najdemo jih v celičnih (eritrocitnih, trombocitnih) koncentratih kakor tudi v sveži zmrznjeni plazmi." Ker se ZMV kopičijo v krvnih pripravkih med shranjevanjem, s transfuzijo več enot ali „starejših" enot transfundiramo prejemniku večje število ZMV. Transfundirani
ZMV lahko povzročajo neželene učinke in inducirajo hiperkoagulabilno stanje, ki vodi do trombemboličnih zapletov. V določenih primerih transfuzije pa je lahko hiperkoagulabilno stanje koristno, saj zmanjša ali celo pomaga pri zaustavitvi krvavitve. V obeh primerih predstavlja kopičenje ZMV, njihovo celično poreklo in sestava parametre za nadzor kakovosti transfuzijskih pripravkov. Iz polne krvi lahko z raznimi kemičnimi in fizikalnimi (centrifugiranje, filtriranje, zmrzovanje) postopki pripravimo posamezne krvne komponente, ki so za transfuzijo bolj primerne in povzročajo manj neželenih učinkov. S filtriranjem skozi posebne absorpcijske filtre odstranimo 99,9 % levkocitov in zmanjšamo možnost nastanka nehemolitičnih vročinskih reakcij in prenos virusnih okužb. Glede na to, da levkocite ponavadi odstranimo že na začetku priprave krvnih pripravkov, ti ne prispevajo dosti k populaciji ZMV v končnih krvnih pripravkih (glej Sliko 2).
Zunajcelični membranski vezikli, nastali iz levkocitov, torej predstavljajo le majhen delež krvnih veziklov. Lahko izvirajo iz gra-nulocitov, monocitov/makrofagov in limfocitov. Na svoji površini nosijo označevalce iz starševskih celic in vsebujejo citoplazemske proteine kot tudi bioaktivne lipide, vpletene v različne fiziološke procese. Sodelujejo pri hemostazi, trombozi, vnetjih, aterosklerozi in angiogenezi ter lahko vplivajo hkrati na vnetne in protivnetne procese. Vendar pa je razlaga teh podatkov iz različnih študij še vedno težka, predvsem zaradi pomanjkanja standardizacije eksperimentalnih pogojev in analiznih metod.
Zunajcelični membranski vezikli v eritrocitnih pripravkih
Zunajcelični membranski vezikli se od eritrocitov odcepljajo pri normalnem dozorevanju, pri staranju in tudi med shranjevanjem eritrocitov za transfuzijo. So praviloma manjše velikosti od tistih opisanih za druge vrste celic in v premeru merijo približno 150 nm; torej sodijo med mikrovezi-kle. Nastajanje eritrocitnih ZMV je proces membranskega preoblikovanja shranjenih eritrocitov, ki poteka celotni čas shranjeva-
812
Zdrav Vestn | december 2015 | Letnik 84
PREGLEDNI ČLAN EK/REVIEW
Slika 2: ZunajceLični membranski vezikLi v krvnih pripravkih.22 Krvne pripravke eritrocite, trombocite in plazmo pripravimo iz poLne krvi s fizikalnimi metodami (centrifugiranje, filtriranje, zmrzovanje). ZMV se nahajajo v vseh krvnih pripravkih, namenjenih transfuziji.
nja. Med staranjem so eritrociti podvrženi različnim biokemičnim in fizikalnim spremembam. Te spremembe vključujejo oksi-dacijo lipidov in proteinov, deformacije in porušenje osmotske stabilnosti, kar povzroča precejšnjo hemolizo s sproščanjem prostega hemoglobina in železa.23 Ostale spremembe vključujejo povečanje koncentracije lipidov, kalija, laktata, znižanje pH, glukoze, 2,3-difosfoglicerata, natrija in ATP. Eritrociti lahko izgubijo do približno 20 % membranske površine s sprostitvijo zunajceličnih membranskih veziklov. Z vezikulacijo se eritrociti znebijo škodljivih snovi, kot so dena-turirani hemoglobin, band 3-neoantigeni ali imunoglobulin G, ki se sicer kopičijo v celicah. S sproščanjem ZMV eritrociti izločajo te molekule in se tako izognejo zgodnjemu staranju in razgradnji."
Staranje eritrocitov opisujeta dva glavna modela: model eriptoze (angl. eryptosis) in model grupiranja proteina band 3 (anionski transporter). Eriptoza je mehanizem, podoben apoptozi. Eriptozo lahko stimuliramo z osmotskim šokom^4 oksidativnim stresom/5 pomanjkanjem energije in raznimi kemičnimi substancami. Ključni dogodek eriptoze je povečanje koncentracije cito-solnega Ca2+. Ca2+ sproži vezikulacij^6 in preurejanje celične membrane.27 Dotok ionskega kalcija v celico preko nespecifičnih ka-tionskih kanalov vodi do aktiviranja različnih encimov, kot so kalpain ali skramblaze. Razlogi za vnos kalcija v celico so večinoma
neznani, vedar se kot najpogostejši vzrok omenjajo spremembe nespecifičnih kation-skih kanalov.28 Model grupiranja proteina band 3 povezuje oksidacijo hemoglobina z dimerizacijo proteina band 3 na membrani. Dimerizacija povzroči strukturno spremembo v zunajcelični domeni proteina band 3. Na ta način nastane neoantigen, ki eritrocite naredi prepoznavne za uničenje. V ZMV so opazili veliko molekul proteina band 3 in njegovih dimerov, kar kaže, da ima lahko ve-zikulacija vlogo pri odstranjevanju neoanti-genov band 3 z membrane eritrocitov.
Pri obeh modelih pride na koncu do prenosa FS na zunanjo stran membrane in razgradnje citoskeleta, ki ji sledi sprememba fosforilacije banda 3. Te spremembe zagotovijo, da je membrana dovolj prožna, da lahko nastajajo zunajcelični membranski vezikli. Sestava eritrocitnih ZMV je odvisna od dražljajev, ki delujejo na celice, ali od in vitro oziroma in vivo pogojev, v katerih se eritrociti nahajajo.29 Poročajo, da sproščanje eritrocitnih ZMV v shranjenih enotah eritrocitov povzroči spremembo oblike celic iz diskoidne preko ehinocitne do sferocitne, kar so opazovali z elektronskim mikrosko-pom.30 V prvih desetih dneh shranjevanja do sprememb skoraj ne prihaja, nato pa sledi hitro spreminjanje od desetega do petnajstega dneva. Po petnajstem dnevu sledijo majhne enakomerne spremembe še od štiri do pet tednov. Obseg mikrovezikulacije v eritrocitnih pripravkih ni odvisen le od trajanja shranevanja, ampak tudi od uporabljene ohranitvene raztopine, v kateri shranjujemo eritrocite: nižjo akumulacijo ZMV so ugotovili pri shranjevanju eritrocitov v ohranitveni raztopini CPD-SAGM (angl. citrate-phosphate-dextrose-saline-adenine--glucose-mannitol), ki učinkovito preprečuje oksidativni stres/1 a tudi po levkoreduk-ciji.32
Klinična pomembnost sprememb, do katerih prihaja med shranjevanjem, je slabo raziskana. Nekatera nepovratna poslabšanja shranjenih eritrocitov, kot so hemoliza, sproščanje kalija in kopičenje zunajcelič-nih membranskih veziklov, povezujemo z zmanjšano potranfuzijsko učinkovitostjo in povečanim tveganjem za nastanek neželenih učinkov pri prejemnikih.33
Zdrav Vestn | ZunajceLični membranski vezikLi v transfuzijskih pripravkih - biologija in klinična pomembnost
813
PREGLEDNI CLANEK/REVIEW
Ugotovili so, da lahko eritrocitni ZMV in vitro vežejo komponente komplementa in na ta način delujejo provnetno preko aktiva-cije komplementnega sistema. To najverjetneje prispeva k protrombotičnemu stanju, ki ga opazujemo pri hemolitičnih boleznih, vključno z anemijo srpastih celic, paroksiz-malno nočno hemoglobinurijo, talasemijo, dedno sferocitozo in eliptocitozo,32'34 Te ugotovitve kažejo, da so eritrocitni ZMV v shranjeni krvi morda razlog za nekatere s komplementom posredovane neželene učinke transfuzije.
Pri anemiji srpastih celic nenormalni hemoglobin S prispeva k nestabilnosti membrane in spodbuja razvoj ZMV.35 Pri tej bolezni je število zunaj celičnih membranskih veziklov v korelaciji s stopnjo znotrajžilne hemolize in stopnjo aktivacije strjevanja krvi36 ter tako določa subklinične fenotipe s povečanimi zapleti.
Tung in sodelavci menijo, da so trombo-citni in eritrocitni zunajcelični membranski vezikli, ki nastanejo s podaljšanjim shranjevanjem krvnih pripravkov, potencialni posrednik TRALI (angl. Transfusion Related Acute Lung Injury)/7 Na modelu ovce so pokazali, da se žival odzove z indukcijo vnetja preko lipopolisaharidov, ki aktivirajo nevtrofilce; ko so transfundirali bodisi supernatant pet dni starih trombocitov ali supernatant dvainštirideset dni starih eritrocitov, je prišlo do sekvestracije nevtrofil-cev v pljučih in razvoja TRALI pri 80-90 % poskusnih živali^8 Poleg tega eritrocitni ZMV izražajo tudi krvnoskupinske antigene
starševskih celic, vključno z antigeni sistema Rhesus39'40 in so zato lahko potencialno imunogeni, če so prisotni v velikem številu. Eritrocitni ZMV tudi lahko prenašajo FS na površino raznih celic in jih lahko „označijo" kot lažno apoptotične.41
Vloga eritrocitnih ZMV je torej dvojna. Omogočajo izločanje strupenih molekul ter odstranjevanje različnih celičnih signalov in tako izboljšujejo preživetje transfundiranih eritrocitov pri prejemnikih. Lahko pa okrepijo škodljive učinke, ki utegnejo poslabšati mikroobtok in na ta način prispevajo k poslabšanju zdravstvenega stanja bolnikov.10
Zunajcelični membranski vezikli v trombocitnih pripravkih
Trombociti so krvne celice brez jedra, ki nastanejo z razpadom megakariocitov. Od krvnih komponent so koncentrirani trombociti najbolj občutljivi na shranjevanje/2 Med shranjevanjem, ki traja največ 5-7 dni in poteka na sobni temperaturi 20-24 °C, prihaja do aktivacije, proteolize in sprememb v morfologiji ter izražanju površinskih recep-torjev trombocitov. 43 Trombocitni ZMV se lahko sprostijo iz trombocitov v normalnih fizioloških pogojih ali kot posledica aktivacije in apoptoze. Prav trombocitni zunaj-celični membranski vezikli predstavljajo največji delež veziklov pri zdravih osebah (70-90 % vseh v krvi)44 in sicer v območju od loo-i.ooo/^l/5 Nastajajo tudi med ob-
Tabela 1: Značilnosti eksosomov, mikrovezikLov in apoptotskih teles.4
	Eksosomi	Mikrovezikli	Apoptotska telesa
Velikost (nm)	40-100	100-1.000	>1.000
Nastanek	iz multivezikularnih teles v notranjosti celice	membrana se izviha navzven in odcepi kot mehurček	celica razpade na več veziklov
Označevalci	CD63, CD81, CD9, Tsg101, Alix, Hsc70, FSb	z Lipidnim raftom -povezane molekule (TF, flotiLin), FSt	FS
Vsebina	proteini, lipidi, mRNA in miRNA; redko DNA	proteini, Lipidi, mRNA in miRNA; redko DNA	fragmentirana DNA in celični organeli
Okrajšave: Hsc70 - protein toplotnega šoka 70; FS - fosfatidilserin; TF - tkivni faktor; Tsg101 - Tumor susceptibility gene 101.
814	Zdrav Vestn | december 2015 | Letnik 84
PREGLEDNI ČLAN EK/REVIEW
delavo krvnih celic in shranjevanjem46 in lahko povzročajo neželene potransfuzijske učinke.45
Sproščanje trombocitnih ZMV lahko in vitro izzovemo z različnimi dražljaji, kot so npr. epinefrin, adenozin difosfat, trombin, kolagen in kalcij, ki aktivirajo trombocite.45 Pri predelavi krvi in s trombociti bogate plazme uporabljamo centrifugiranje in prenose med vrečkami. Vsi ti postopki predstavljajo mehaničen stres, povzročen s stri-žnimi silami v tekočini, ki poveča nastajanje veziklov. Gracia in sodelavci so ugotovili, da trombocitni ZMV vsebujejo površinske membranske proteine, kot so GPIIIa, IIb in P-selektin.47
Trombocitni ZMV imajo klinično pomembno vlogo pri koagulaciji pri bolnikih z levkemijo in trombocitopenijo. Kljub nizkemu številu trombocitov ti bolniki nimajo težav s krvavitvami, kar prepisujejo visokemu številu cirkulirajočih tromboci-tnih mikroveziklov. Zaradi njihove visoke prokoagulantne aktivnosti so Boulanger in sodelavci predlagali, da verjetno prispevajo k patogenezi arterijskih trombotičnih bolezni. Številne študije so pokazale, da so lahko zunajcelični membranski vezikli v krvnem obtoku zanimiv napovedni označevalec za aterosklerotične žilne bolezni^8
Michelsen in sodelavci so prikazali, da imajo bolniki, ki so preživeli miokardni infarkt, povečano število trombocitnih vezi-klov.49 Ugotovili so, da trombogeni tkivni faktor (angl. tissue factor, TF) na levkocitnih zunajceličnih membranskih veziklih sodeluje pri spontanem nastajanju tromboze.50 Kot vir cirkulirajočega TF so predlagali mo-nocite in nevtrofilce. Takšen primer vpliva trombocitnih ZMV na koagulacijo in vivo je Scottov sindrom, redka dedna hemora-gična bolezen, povezana s pomanjkanjem aktivnosti encima skramblaza, ki je odgovoren za naključno potovanje fosfolipidov preko celične membrane. Pri pomanjkanju skramblaze se ob aktiviranju trombocitov fosfolipidne površine ne prenašajo na zunanjo stran celične membrane. V tem primeru ne pride do ekspresije FS niti do sproščanja zunajceličnih membranskih veziklov. Tako ni katalitične površine za interakcijo koagu-lacijskih faktorjev, zato je sistem koagulacije
zelo oslabljen. Pride do hemoragične diate-ze.51
ZMV iz trombocitov so kot napovedni označevalec raziskovali pri sindromu koronarnih arterij, anevrizmah, trombozah, pljučni emboliji, trombotično-tromboci-topenični purpuri, paroksizmalni nočni hemoglobinuriji, s heparinom inducirani trombocitopeniji, anemiji srpastih celic, sepsi, revmatoidnih boleznih, sklerozah, preeklampsiji, mieloproliferativnih boleznih in nekaterih vrstah raka.52 Številne študije so pokazale, da trombocitni vezikli inducirajo angiogenezo in sodelujejo pri metasta-ziranju raka.53 Po drugi strani pa razvijajo tudi več protokolov zdravljenja raka, z zu-najceličnimi membranskimi vezikli. Ker jih lahko osamimo iz periferne krvi in so torej enostavno dosegljivi, so zanimivi označevalci za diagnostiko raka. Molekule, ki sodelujejo pri nastajanju zunajceličnih membranskih veziklov in njihovem sproščanju bi bile lahko v prihodnosti pomembne tarče proti-rakavih učinkovin. Menijo tudi, da bi zunaj-celične membranske vezikle lahko uporabili kot sistem za vnos zdravilnih učinkovin (npr.miRNA) v rakave celice, npr v kombinaciji s kemoterapijo. Aktivirani trombociti in trombocitni ZMV lahko sproščajo tudi rastni faktorji, kot so vaskularni endotel-ni rastni faktor (angl. vascular endothelial growth factor, VEGF), trombocitni rastni faktor (angl. platelet derived growth factor, PDGF) in bazični fibroblastni rastni faktor (angl. basic fibroblast growth factor, bFGF), ki imajo proangiogeno aktivnost in spodbujajo rast tumorja.54 ZMV lahko uporabimo za napovedovanje hiperkoagulabilnih stanj pri bolnikih z rakom55 in pri bolnikih z večjim tveganjem metastaziranja. Trombocitni ZMV lahko prispevajo k patofiziologiji rev-matoidnega artritisa. Povzročajo tromboze pri okužbah in vnetih sklepih zaradi stimulacije kolagenskih receptorjev, GPVI.56
Zunajcelični membranski vezikli v pripravkih iz plazme
Zunajcelični membranski vezikli v sveži zmrznjeni plazmi povzročajo nastanek krvnih strdkov in vzdrževanje hemostaze zato, ker izpostavljajo FS, ki zagotavlja vezna me-
Zdrav Vestn | ZunajceLični membranski vezikLi v transfuzijskih pripravkih - biologija in klinična pomembnost
815
PREGLEDNI CLANEK/REVIEW
sta za aktivirane faktorje strjevanja krvi.57 Sposobnost SZP, da ustvarja trombin in tvori strdek, je ključnega pomena za izboljšanje hemostaze in vivo. Pretočna citometri-ja je pokazala, da je največ ZMV v plazmi, pripravljeni iz polne krvi, ki je bila čez noč shranjena na 4 °C. Ugotovili so, da imajo ZMV iz sveže zmrznjene plazme minimalen učinek na koagulacijske teste, npr. protrom-binski čas (PČ) in koagulacijske faktorje (faktor VIII, antitrombin III ...).57 Število in celično poreklo ZMV v SZP je drugačno v primerjavi s tistimi v periferni krvi.57 Kopičenje eritrocitnih ali trombocitnih ZMV v SZP je odvisno od tega, ali so levkodeplecijo izvedli na polni krvi ali po ločitvi plazme.58
S filtriranjem zmanjšamo število trom-bocitnih ZMV v krvnih pripravkih, povečamo pa število eritrocitnih ZMV v nastalem pripravku. Daljše shranjevanje krvi pred ločitvijo in zmrzovanjem plazme tudi prispeva k nastanku trombocitnih ZMV in s tem izboljša njeno hemostazno funkcionalnost. Plazemske enote, pripravljene iz polne krvi, zadržane čez noč na 4°C pred predelavo, vsebujejo znatno povečano število ZMV v primerjavi s plazmo, ki je bila predelana 8 ur po odvzemu krvi.5®
Zunajcelični membranski vezikli iz matičnih celic
Zaradi prenosa proteinov, maščob in nu-kleinskih kislin delujejo ZMV iz matičnih celic parakrino/endokrino in sodelujejo pri signalizaciji med matičnimi in zrelimi diferenciranimi celicami. Lahko povzročajo tudi epigenetske spremembe v tarčnih celicah in na ta način uravnavajo rast, regeneracijo in diferencijacijo celic. Skupaj z matičnimi celicami prispevajo k regeneraciji po poškod-bi.60
Ratajczak in sodelavci6J so pokazali, da zunajcelični vezikli iz embrionalnih matičnih celic povečajo potentnost krvotvornih matičnih celic s prenosom določenih molekul mRNA, ki zapisujejo transkripcijske dejavnike. Zunajcelični membranski vezikli, ki se sproščajo iz poškodovanih tkiv, lahko spodbujajo regeneracijo.
Najpogosteje uporabljena vrsta matičnih celic v regenerativni medicini so mezenhim-
ske matične celice (MMC), multipotentne matične celice, ki se lahko diferencirajo v celice kosti, hrustanca, mišic in maščobne celice.62 MMC sproščajo znatno količino ZMV, ki vsebujejo razne molekule mRNA in zrele miRNA.63 Te se lahko prenesejo do prejemniških celic in na ta način povzročajo funkcionalne in fenotipske spremembe. Presajene MMC spodbujajo angiogenezo, povečujejo preživetje celic na mestu poškodbe in spodbujajo njihovo proliferacijo ter uravnavajo vnetni proces. Najnovejše ugotovitve kažejo tudi, da igrajo zunajcelični membranski vezikli iz MMC določeno regenerativno vlogo, vključno z regeneracijo ledvic, srca, jeter in živcev. Timmers in sodelavci64 so dokazali, da aplikacija medija, v katerem so gojili človeške MMC, znatno zmanjša pogostost infarkta v prašičjih in mišjih modelih ishemije/reperfuzije. Kasneje je ista skupina dokazala, da je učinek zaščite srca posledica sproščanja ZMV iz MMC.65
V drugi študiji so Herrera in sodelavci66 pokazali, da po vnosu ZMV iz humanih jetrnih matičnih celic pride do inducirane proliferacije in odpornosti na apoptozo pri človeških in podganjih hepatocitih. Ta učinek so dosegli s horizontalnim prenosom specifičnih podskupin mRNA in obdelavo ZMV z encimom RNazo pred uporabo. Ko so ZMV uporabili in vivo, so pospešili morfološko in funkcionalno okrevanje jeter v modelu 70 % hepatektomiranih podgan.
Torej je vloga ZMV v regenerativni medicini samo delno raziskana, ponuja nove in zanimive možnosti uporabe ZMV za spodbujanje tkivne regeneracije. Glede na obetavne rezultate, uporabe veziklov iz MMC lahko v bližnji prihodnosti pričakujemo tudi humane klinične študije. Poleg tega uporaba ZMV namesto matičnih celic predstavlja popolnoma novo terapevtsko strategijo. Glavna prednost pri tem je, da lahko ZMV v laboratoriju spremenimo po svojih željah in vanje tudi naložimo molekule s ciljnimi učinki. Zaradi svoje majhnosti so manj imu-nogeni, kar zanesljivo predstavlja prednost pred alogenskimi celicami.
816
Zdrav Vestn | december 2015 | Letnik 84
PREGLEDNI ČLAN EK/REVIEW
Zaključek
Celice so tako in vivo kot in vitro veliko bolj dinamične, kot si običajno predstavljamo. Stalno se premikajo, komunicirajo s sosednjimi celicami, izločajo hormone ali druge signalne molekule. Od vseh vrst celic se odcepljajo zunajcelični membranski vezikli, ki so le eden od načinov medcelične komunikacije.
Pri raziskavah ZMV se soočamo s številnimi izzivi, povezanimi najprej s standardizacijo metodologije. V zadnjem desetletju je bil dosežen velik napredek. Toda naše razumevanje molekularnih mehanizmov, preko
Literatura
1.	Chargaff E, West R. The biological significance of the thromboplastic protein of blood. J Biol Chem. 1946; 166: 189-97.
2.	Wolf P. The nature and significance of platelet products in human plasma. Haematol Br J 1967; 13: 269-88.
3.	Mause Sebastian F, Weber C. Microparticles:protagonists of a novel communication network for intercellular information exchange. Circ Res 2010; 107: 1047-57.
4.	Biancone L, Bruno S, Deregibus MC, Tetta C, Ca-mussi G. Therapeutic potential of mesenchymal stem cell-derived microvesicles. Nephrol Dial Transpl 2012; 27: 3037-42.
5.	Turturici G, Tinnirello R, Sconzo G, Geraci F. Extracellular membrane vesicles as a mechanism of cell-to-cell communication: advantages and disadvantages. Am J Physiol Cell Physiol. 2014; 306: 621-33.
6.	Van der Pol E, Boing AN, Harrison P, Sturk A, Ni-euwland R. Classification functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacol Rev 2012; 64: 676-705.
7.	Vanwijk MJ,Svedas E, Boer K, Nieuwland R, Van-Bavel E, Kublickiene KR. Isolated microparticles, but not whole plasma from women with pree-clampsia impair endothelium-dependent relaxation isolated myometrial arteries from healthy pregnant women. Am J Obs Gynecol 2002; 187: 1686-93.
8.	Morel O, Jesel L, Freyssinet JM, Toti F. Cellular mechanisms underlying the formation of circulating microparticles. Aterioscler Thromb Vasc Biol 2011; 31: 15-26.
9.	Hoyer FF, Nickenig G, Werner N. Microparticles--messengers of biological information. J Cell Mol Med 2010; 14: 2250-56.
10.	Diehl P, Fricke A, Sander L,Stamm J,Bassler N, Htun N, et al. Microparticles: major transport vehicles for distinct microRNAs in circulation. Car-diovasc Res. 2012; 93: 633-44.
11.	Zwaal RF, Comfurius P, Bevers E. Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells. Cell Mol Life Sci 2005; 62: 971-88.
katerih zunajcelični membranski vezikli delujejo, še vedno nepopolno. Merila za identifikacijo različnih vrst veziklov so le delno določena. Biološkega pomena zunajceličnih membranskih veziklov v zdravju in pri boleznih še vedno ne razumemo. Za povečanje njihove klinične koristnosti bo potrebno razviti nove in zanesljive instrumente za njihovo zaznavanje in osamitev ter standardizirati laboratorijske meritve. Zunajcelični membranski vezikli bodo v prihodnosti zanimivi biološki označevalci za različne bolezni, uporabni bodo tudi pri posredovanju določenih, regenerativnih funkcij, kot je npr. spodbujanje angiogeneze in proliferacije.
12.	Hugel B, Martinez MC, Kunzelmann C, Freyssinet JM. Membrane microparticles:two sides of the coin. Physiology 2005; 20: 22-7.
13.	Rubin O, Crettaz D, Canellini G, Tissot JD, Lion N. Microparticles in stored red blood cells:an approach using flow cytometry and proteomic tools. Vox Sang. 2008; 95: 288-97.
14.	Combes V, Simon AC, Grau GE, Arnoux D, Ca-moin L, Sabatier F et al. In vitro generation of en-dothelial microparticles and possible prothrom-botic activity in patients with lupus anticoagulant. J Clin Invest 1999; 104: 93-102.
15.	Lacroix R, Judicone C, Poncelet P, Robert S, Arnaud L, Sampol J et al. Impact of pre-analytical parameters on the measurement of circulating microparticles: towards standardization of protocol. J Thromb Haemost 2012; 10: 437-46.
16.	Ayers L, Kohler M, Harrison P, Sargent I, Dragovic R, Schaap M et al. Measurement of circulating cell-derived microparticles by flow cytometry:sources of variability within the assay. Thromb Res. 2011;
127: 370-77.
17.	Zwicker JI, Lacroix R, Dignat-George F, Furie BC, Furie B. Measurement of platelet microparticles. Methods Mol Biol 2012; 788: 127-39.
18.	Lawrie AS, Albanyan A, Cardigan RA, Mackie IJ HP. Microparticles sizing by dynamic light scattering in fresh-frozen plasma. Vox Sang 2009; 96: 206-12.
19.	Xu Y, Nakane N, Maurer-Spurej E. Novel test for microparticles in platelet-rich plasma and platelet concentrates using dynamic light scattering. Transfusion 2011; 51: 363-70.
20.	Gyorgy B, Szabo TG, Turiac L, Wright M, Herczeg P, Ledeczi Z et al. Improved flow cytometric assessment reveals distinct microvesicle( cell-derived microparticle) signatures in joint diseases. PLoS One 2012; 7.
21.	Rumsby MG, Trotter J, Allan D, Michell R. Recovery of membrane micro-vesicles from human erythrocytes stored for transfusion:a mechanism for the erythrocyte discocyte-to-spherocyte shape transformation. Biochem Soc Trans 1977; 5: 126-28.
Zdrav Vestn | ZunajceLični membranski vezikLi v transfuzijskih pripravkih - biologija in klinična pomembnost
817
PREGLEDNI CLANEK/REVIEW
22.	Kriebardis A, Antonelou M, Stamoulis K, Papassi-deri I. Cell-derived microparticles in stored blood products:innocent-bystanders or effective mediators of post-transfusion reactions? Blood Transfus 2012; 10 Suppl 2: 25-38.
23.	Card RT. Red cell membrane changes during storage. Transfus Med Rev 1988; 2: 40-7.
24.	Lang KS, Duranton C, Poehlmann H, Myssina S, Bauer C, Lang F et al. Cation channels trigger apoptotic death of erythrocytes. Cell Death Differ 2003; 10: 249-56.
25.	Barvitenko NN, Adragna NC, Weber RE. Erythrocyte signal transduction pathways,their oxygenation dependence and functional significance. Cell Physiol Biochem 2005; 15: 1-18
26.	Allan D, Michell RH. Calcium iondependent dia-cylglycerol accumulation in erythrocytes is associated with microvesiculation but not with efflux of potassium ions. Biochem J 1977; 166: 495-99.
27.	Niemoeller OM, Akel A, Lang PA, Attanasio P, Kempe DS, Hermle T, et al. Induction of eryptosis by cyclosporine. Naunyn Schmiederbergs Arch Pharmacol. 2006; 374: 41-49.
28.	Lang F, Gulbins E, Lerche H, Huber SM, Kempe DS, Foller M. Eryptosis, a window to systemic disease. Cell Physiol Biochem 2008; 22: 373-80.
29.	Tissot JD, Rubin O, Canellini G. Analysis and clinical relevance of microparticles from red blood cells. Curr Opin Hemato 2010; 17: 571-7.
30.	Shukla SD, Coleman R, Finean JB, Michell RH. The use of phospholipase c to detect structural changes in the membranes oh human erythro-cytes aged by storage. Biochim Biophys Acta 1978;
512: 341-9.
31.	Antonelou MH, Kriebardis AG, Stamoulis KE, Economou-Petersen E, Margaritis LH, Papasside-ri IS. Red blood cell aging markers during storage in citrate-phosphate-dextrose-saline-adenine--glucose-mannitol. Transfusion 2010; 50: 376-89.
32.	Rubin O, Crettaz D, Tissot JD, Lion N. Microparticles in stored red blood cells:submicron clotting bombs? Blood Transfus 2010; 8: s31-s38.
33.	Bosman GJ, Lasonder E, Luten M, Roerdinkhol-der-Stoelwinder B, Novotny VM, Bos H, et al. The proteom of red cell membranes and vesicles during storage in blood bank conditions. Transfusion 2008; 48: 827-35.
34.	Kozuma Y, Sawahata Y, Takei Y, Chiba S, Nino-miya H. Procoagulant properties of microparticles released from red blood cells in paroxysmal nocturnal haemoglobinuria. Br J Haematol 2011; 152:
631-9.
35.	Bosman GJ. Erythrocyte aging in sickle cell disease. Cell Mol Biol 2004; 50: 81-6.
36.	van Beers EJ, Schaap MC, Berckmans RJ, Nieu-wland R, Sturk A, van Doormaal FF et al. Circulating erythrocyte-derived microparticles are associated with coagulation activation in sickle cell disease. Haematologica 2009; 94: 1513-9.
37.	Tung JP, Fung YL, Nataatmadja M, Colebourne KI, Esmaeel HM, Wilson K, et al. A novel in vivo ovine model of transfusion-related acute lung injury(TRALI). Vox Sang 2011; 100: 219-30.
38.	Tung JP, Fraser JF, Nataamadja M, Barnett, Adrian G, Colebourne, et al. Dissimilar respiratory and hemodynamic response in TRALI induced by sto-
red cells and whole blood platelets. Blood 2010; 116: 484-5.
39.	Greenwalt TJ. The how and why of exocytic vesicles. Transfusion 2006; 46: 143-52.
40.	Oreskovic RT, Dumaswala UJ, Greenwalt TJ. Expression of blood group antigens on red cell microvesicles. Transfusion 1992; 32: 848-9.
41.	Liu R, Klich I, Ratajczak J, Ratajczak MZ, Zuba--Surma EK. Erythrocyte-derived microvesicles may transfer phosphatidylserine to the surface of nucleated cells and falsely"mark" them as apoptotic. Eur J Haematol 2009; 83: 220-9.
42.	Shrivastava M. The platelet storage lesion. Trans-fus Apher Sci 2009; 41: 105-13.
43.	George JN, Pickett EB, Heinz R. Platelet membrane glycoprotein changes during the preparation and storage of platelet concentrates. Transfusion 1988; 28: 123-6.
44.	Lynch SF, Ludlam CA. Plasma microparticles and vascular disorders. Br J Haematol 2007; 137: 36-48.
45.	Simak J, Gelderman MP. Cell membrane micro-particles in blood products:potentially pathogenic agents and diagnostic markers. Transfus Med Rev 2006; 20: 1-26.
46.	Saas P, Angelot F, Bardiaux L, Seilles E, Garnache--Ottou F, Perruche S. Phosphatidylserine expressing cell by products in transfusion: A pro-inflammatory or an anti-inflammatory effect? Transfus Clin Biol 2012; 19: 90-7.
47.	Garcia BA, Smalley DM, Cho H, Shabanowitz J, Ley K, Hunt DF. The platelet microparticle prote-ome. J Proteome Res 2005; 4: 1516-21.
48.	Boulanger CM, Amabile N, Tedqui A. Circulating microparticles: a potential prognostic marker for atherosclerotic vascular disease. Hypertension 2006; 48: 180-6.
49.	Michelsen AE, Brodin E, Brosstad F, Hansen JB. Increased level of platelet microparticles in survivors of myocardial infarction. Sc Clin Lab Invest 2008; 68: 386-92.
50.	Giesen PL, Rauch U, Bohrmann B, Kling D, Roque M, Fallon JT, et al. Blood-borne tissue factor: another view of thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A 1999; 96: 2311-5.
51.	Zwaal RF, Comfurius P, Bevers EM. Scott syndrome, a bleeding disorder caused by defective scrambling of membrane phospholipids. Biochim Biophys Acta 2004; 1636: 119-28.
52.	Zwaal RF, Schroit AJ. Pathophysiologic implications of membrane phospholipid asymmetry in blood cell. Blood 1997; 89: 1121-32.
53.	Kim HK, Song KS, Chung JH, Lee KR, Lee SN. Platelet microparticles induce angiogenesis in vitro. Br J Haematol. 2004; 124: 376-84.
54.	Falanga A, Tartari CJ, Marchetti M. Microparticles in tumor progression. Thromb Res 2012; 129 Su-ppl :s132-6.
55.	Toth B, Liebhardt S, Steinig K, Ditsch N, Rank A, Bauerfeind I et al. Platelet-derived microparticles and coagulation activation in breast cancer patients. Thromb Haemost 2008; 100: 663-9.
56.	Boilard E, Nigrovic PA, Larabee K, Watts GF, Coblyn JS, Weinblatt ME et al. Platelets amplify inflammation in arthritis via collagen-dependent microparticle production. Science 2010; 327: 580-3.
818
Zdrav Vestn | december 2015 | Letnik 84
PREGLEDNI ČLAN EK/REVIEW
57.	Lawrie AS, Harrison P, Cardigan RA, Mackie IJ. The characterization and impact of microparticles on haemostasis within fresh-frozen plasma. Vox Sang 2008; 95: 197-204.
58.	Krailadsiri P, Seghatchian J, Macgregor I, Drum-mond O, Perrin R, Spring F, et al. The effects of leukodepletion on the generation and removal of microvesicles and prion protein in blood components. Transfusion 2006; 46: 407-17.
59.	Lawrie AS, Cardigan RA, Williamson LM, Machin SJ, Mackie IJ. The dynamics of clot formation in fresh-frozen plasma. Vox Sang 2008; 94: 306-14.
60.	Quesenberry PJ, Aliotta JM. The paradoxical dynamism of marrow stem cells:considerations of stem cells, niches and microvesicles. Stem Cell Rev 2008; 4: 137-47.
61.	Ratajczak J, Miekus K, Kucia M, Zhang J, Reca R, Dvorak P, et al. Embryonic stem cell-derived microvesicles reprogram hematopoietic progenitors:evidence for horizontal transfer of mRNA and protein delivery. Leukemia 2006; 20: 847-56.
Zdrav Vestn | ZunajceLični membranski vezikLi v transfuzijskih pripravkih - biologija in klinična pomembnost	819
62.	Rožman P, Jež M. Matične celice in napredno zdravljenje ( zdravljenje s celicami, gensko zdravljenje in tkivno inženirstvo. Pojmovnik. Celje: Mohorjeva družba; 2011. p. 289.
63.	Bruno S, Grange C, Deregibus MC, Calogero RA, Saviozzi S, Collino F, et al. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury. J Am Soc Nephrol. 2009; 20: 1053-67.
64.	Timmers L, Lim SK, Arslan F, Armstrong JS, Ho-efer IE, Doevendans PA et al. Reduction of myocardial infarct size by human mesenchymal stem cell conditioned medium. Stem Cell Res. 2007; 1:
129-37.
65.	Lai RC, Chen TS, Lim SK. Mesenchymal stem cell exosome: a novel stem cell-based therapy for cardiovascular disease. Regen Med. 2011; 6: 481-92.
66.	Herrera MB, Fonsato V, Gatti S, Deregibus MC, Sordi A, Cantarella D, et al. Human liver stem cell-derived microvesicles accelerate hepatic regeneration in hepatectomized rats. J Cell Mol Med. 2010; 14: 1605-18.