Opombe
DNA topoizomeraze so družina encimov, ki delujejo kot molekulski motorji in omogočajo topološke spremembe v molekuli DNA ter s tem mnoge procese v celici. V naših raziskavah smo se osredotočili na človeško DNA topoizomerazo IIalfa, ki je validirana in uveljavljena protirakava tarča, saj je njena koncentracija višja v hitro delečih se celicah v primerjavi z normalnimi. Topoizomeraze tipa II delujejo preko kompleksnega katalitičnega cikla, ki ponuja več prijemališč za načrtovanje zdravilnih učinkovin. Klasični zaviralci tega encima, topoizomerazni II strupi, stabilizirajo kovalentni kompleks med DNA in encimom ter ga spremenijo v celični strup. Pri tem tudi poškodujejo DNA molekulo in lahko povzročajo resne neželene učinke, kot sta kardiotoksičnost in nastanek sekundarnih oblik raka. Zato so se v zadnjih letih raziskave usmerile v razvoj katalitičnih zaviralcev, ki ne povzročijo poškodb DNA. V okviru doktorske disertacije smo želeli preko štirih raziskovalnih hipotez identificirati in ovrednotiti nove katalitične zaviralce topoizomeraze IIalfa ter tudi optimizirati obstoječe katalitične zaviralce, ki se vežejo v vezavno mesto za ATP. V prvi raziskavi smo kot izhodiščno točko načrtovanja uporabili poznane zaviralce bakterijske topoizomeraze tipa II, substituirane 4,5%-bitiazole. S primerjavo vezavnih mest za ATP bakterijske DNA giraze in človeške topoizomeraze IIalfa smo določili ključne razlike in podobnosti v vezavnih mestih, ki so omogočile virtualno rešetanje usmerjene kemijske knjižnice za identifikacijo zaviralcev, ki bi se bolje vezali na človeško topoizomerazo IIalfa. Spojine tega razreda delujejo kot katalitični ATP kompetitivni zaviralci človeške DNA topoizomeraze IIalfa in se vežejo na izolirano ATPazno domeno. Spojine so bile učinkovite tudi na celičnem nivoju, saj so nekatere izmed njih izkazovale citotoksičnost na HepG2 in MFC-7 celični linijah v enakem obsegu kot uveljavljena protirakava zdravilna učinkovina etopozid. Za izbrano spojino smo ugotovili, da ustavi celični cikel v G1 fazi, vpliva na proliferacijo celic ter dokazali, da ne povzroča dvojnih prelomov DNA, kar je dodatni dokaz, da spojine tega razreda tudi na celičnem nivoju delujejo drugače kot topoizomerazni II strupi. V drugi raziskavi smo se osredotočili na optimizacijo mesta substitucije 4 kemijskega razreda 4,6-disubstituiranih 1,3,5-triazin-2(1H)-onov, za katere so v prejšnjih študijah pokazali, da so katalitični zaviralci človeške topoizomeraze IIalfa in se vežejo na ATPazno domeno, kjer se nahaja ATP vezavno mesto. S pomočjo in silico vezavnega modela smo zgradili in rešetali usmerjeno kemijsko knjižnico možnih analogov z različnimi substituenti na mestu 4 1,3,5-triazinskega obroča, da bi tako spojini omogočili dodatne interakcije z vezavnim mestom za ATP. Po načrtovanju so bili sintetizirani novi analogi, ki so se izkazali kot boljši katalitični zaviralci človeške topoizomeraze IIalfa kot izhodne spojine. 2 Dve izmed njih sta izkazovala tudi obetavno citotoksičnost na HepG2 rakavi celični liniji. Na celičnem nivoju tudi ta kemijski razred ne povzroča nastanka dvojnih prelomov DNA molekule. V tretji raziskavi smo se lotili optimizacije neaktivnih spojin iz razreda 3,5-disubstituiranih 1,2,4-oksadiazolov, prvotno načrtovanih kot zaviralcev DNA giraze. V molekule smo uvedli rigidnejše fragmente, da bi s tem omogočili stabilnejše interakcije v fosfatnem delu ATP žepa. Poleg sintetiziranih spojin smo ovrednotili tudi nekaj komercialno dostopnih substituiranih oksadiazolov. Identificirali smo več aktivnih spojin, ki nakazujejo, da rigidnejše strukture omogočajo zaviralno aktivnost človeške topoizomeraze IIalfa preko katalitičnega mehanizma zaviranja ter vezave na ATPazno domeno. Spojine so bile citotoksične na MCF-7 rakavi celični liniji ter niso vodile do nastanka dvojnih prelomov DNA. Tekom raziskav doktorske disertacije smo uspeli potrditi vse štiri izhodiščne raziskovalne hipoteze. Odkrite spojine vodnice so primerne za nadaljnjo optimizacijo do predkliničnih kandidatov, ki bi izkazovali primerljivo učinkovitost kot klinično uporabni topoizomerazni II strupi ter imeli sočasno manjšo pojavnost neželenih učinkov kot ta skupina protirakavih učinkovin.