Opombe
N-acetilglukozaminilacija je pogosta posttranslacijska sprememba, ki zahteva veliko komponent, kot so glukoza, glutamin, uridin, acetil-CoA in energija. O-ß-N-acetilglukozaminil transferaza (OGT) je encim, ki katalizira prenos N-acetilglukozamina iz UDP-GlcNAc na serinske in treoninske ostanke jedrnih in citoplazemskih proteinov. Medtem pa encim O-GlcNAc hidrolaza (OGA) odstranjuje molekule O-GlcNAc iz teh proteinov in ima tako nasprotno vlogo kot OGT. N-acetilglukozaminilacija je torej dinamičen proces, ki ga uravnavajo tako sami encimi kot razpoložljivost sestavnih delov molekule UDP-GlcNAc. Število odkritih tarčnih proteinov, ki se lahko N-acetilglukozaminilirajo, narašča. Ti proteini so transkripcijski dejavniki, epigenetski regulatorji, različne kinaze, citoplazemski encimi in mitohondrijski proteini. Poleg tega je znano, da protein kinaze tekmujejo z OGT za iste serinske in treoninske hidroksilne skupine na tarčnih proteinih (npr. AKT). Drug način tovrstnih medsebojnih vplivov poteka s spreminjanjem bližnjih aminokislin (npr. c-Myc). Po vezavi prve posttranslacijske modifikacije (PTM), fosfata ali N-acetilglukozamina, ta nato vpliva na vezavo druge. Poleg tega pa je deregulacija N-acetilglukozaminilacije povezana tudi z določenimi boleznimi, vključno z rakavimi obolenji ter kardiovaskularnimi in nevrodegenerativnimi boleznimi. Največja izraženost encima OGT je bila zabeležena v ß-celicah trebušne slinavke, zato ni presenetljivo, da kronično povišana N-acetilglukozaminilacija igra pomembno vlogo pri nastanku inzulinske rezistence in sladkorne bolezni. Povečana raven N-acetilglukozaminilacije in izraženost OGT sta prav tako značilni za nekatere vrste rakavih obolenj. Ker igra imunski sistem pomembno vlogo v boju proti malignim spremembam in patogenom, so vzadnjih letih proučevali vpliv N-acetilglukozaminilacije na delovanje makrofagov, nevtrofilcev ter limfocitov T in B, medtem ko do sedaj še ni na voljo izsledkov o vlogi tega procesa na človeške dendritične celice (DC) in naravne celice ubijalke (NK). Večina imunskih celic potrebuje ustrezno stopnjo N-acetilglukozaminilacije za pravilen razvoj in delovanje, vendar pa trenutno natančna vloga N-acetilglukozaminilacije v mnogih bioloških sistemih še vedno ni povsem pojasnjena. V zadnjih letih je bilo sintentiziranih kar nekaj potencialnih zaviralcev OGT, ki bi jih v obliki molekulskih prob lahko uporabili za proučevanje vloge OGT v bioloških sistemih. Spojine iz serije OSMI so najmočnejši in najpogosteje uporabljeni zaviralci, ki pa imajo še vedno nekaj pomankljivosti, kot je npr. slaba selektivnost. Da bi odpravili njihove pomanjkljivosti, 5 smo sintetizirali nove zaviralce OGT na osnovi kinolinona, z namenom ciljanja njihove vezave v vezavni žep OGT za uridin difosfat (UDP). Naši cilji so bili: izboljšati interakcije v omenjenem vezavnem žepu s sintezo peptidov, konjugiranih z nizkomolekularnimi zaviralci OGT; izboljšati interakcije s podaljšanjem nizkomolekularnih zaviralcev do vezavnega žepa O-GlcNAc in raziskati vpliv dolžine in fleksibilnosti uporabljenega distančnika na zaviralni učinek zaviralcev. Noben od sintetiziranih peptidnih konjugatov in nizko molekularnih zaviralcev ni bil močnejši zaviralec encima OGT od tistih, opisanih v literaturi. Med pripravljenimi zaviralci je sicer najmočnejši zaviralni učinek na izoliranem encimu izkazal fragment 3b, z IC50 = 116,0 µM. V dosedanjih maloštevilnih študijah, so spremenjen obseg N-acetilglukozaminilacije nekaterih proteinov, opazili v povezavi z nepravilnim imunskim odzivom. V naši študiji smo zato raziskali vpliv zmanjšane N-acetilglukozaminilacije na človeške DC, pripravljene iz monocitov in celice NK. Pri slednjih smo pričakovali imunosupresivne učinke zaviralcev OGT in jih tudi potrdili na osnovi opažene zmanjšane citotoksičnosti celic NK zoper tarčne rakave celice K562. Ta se je, v primeru, ko smo celice NK izpostavili OSMI-1 (20 µM), znižala za 33,4 ± 10,9%. Razlog za to bi lahko bilo ugotovljeno zmanjšano število celic NK, ki so sposobne degranulacije in zmanjšan obseg proizvodnje topnih vnetnih molekul. Nepojasnjeno pa ostaja, kako pride do teh učinkov. Poleg tega smo pokazali, da igra OGT pomembno vlogo tudi v dendritičnih celicah, pripravljenih iz monocitov (moDC) saj so zaviralci OGT vplivali tako na njihovo funkcionalnost kot tudi fenotip. Med postopkoma diferenciacije in dozorevanja DC je prisotnost zaviralca OSMI-1 tako v nezrelih kot tudi v zrelih moDC povzročila modulacijo aktivnosti signalnih poti mTOR/AKT in MEK/ERK. Prisotnost OSMI-1 je povzročila tudi spremembe v profilih izražanja značilnih molekulskih membranskih označevalcev DC, pri čemer smo opazili zmanjšani ekspresiji molekul CD80 in DC-SIGN ter povečano izražanje molekul CD14, CD86 in HLA-DR na nezrelih moDC. Ti izsledki kažejo, da zaviranje N-acetilglukozaminilacije ovira diferenciacijo monocitov v nezrele moDC. Poleg tega je prisotnost OSMI-1 v moDC povzročila zmanjšan obseg proizvodnje IL-10 in povečano izločanje IL-6. V nezrelih moDC je OSMI-1 zavrl tudi proces endocitoze. Zaviranje OGT je vplivalo tudi na dozorevanje oz. aktivacijo moDC, ki so posledično izkazovale večjo sposobnost sprožitve proliferacije alogenskih limfocitov T, pri čemer nismo opazili vidnega vpliva na njihovo polarizacijo. S tem smo potrdili, da OSMI-1 lahko vpliva na diferenciacijo in delovanje človeških moDC v pogojih in vitro. 6 Ugotovili smo tudi, da bi zaviralce OGT morda lahko uporabljali za podporno terapijo, skupaj z nekaterimi že znanim kemoterapevtiki, pri zdravljenju raka. Opazili smo namreč povečan zaviralni učinek kombinacije regorafeniba in OSMI-1 na metabolno aktivnost nekaterih človeških rakavih celičnih linij, in vitro. Vrednost IC50 za regorafenib se je, ob dodatku netoksične koncentracije OSMI-1 (10 µM) zmanjšala za 3,68-krat (celična linija AMO-1). Nadaljnji poskusi so razkrili tudi sinergistični citotoksični učinek na celično linijo AMO-1, ko je bila ta sočasno izpostavljena 5 µM regorafeniba in 10 µM OSMI-1, pri čemer se je odstotek mrtvih celic povečal z 11% na 38%, apoptoza pa v tem primeru ni predstavljala prevladujočega načina celične smrti. Poleg tega smo, v primeru uporabe obeh zaviralcev, opazili še zavrtje proliferacije celic AMO-1, pri čemer smo določili zmanjšano število celičnih delitev in povečano populacijo celic v fazi G0/G1 celičnega cikla. Ti rezultati so posledica zavrte aktivacije ciklina D in od ciklina odvisne kinaze 4 (CDK4), blokirane fosforilacije retinoblastoma ter zavrte transkripcije genov faze S celičnega cikla.