Opombe
Razvoj novega zdravila v farmacevtski industriji je sestavljen iz različnih procesov, med katere uvrščamo tudi razvoj analiznih metod. Rezultati, ki jih dobimo z njihovo uporabo, nam omogočajo odločitev glede strategije za nadaljnji razvoj zdravila oziroma podajo informacijo, ali je zdravilo primerno za sprostitev na trg. Zato je bistveno, da so analizne metode natančne, točne in zanesljive. Ključna analizna metoda za analizo in sproščanje zdravil je tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC), katere razvoj je zaradi kompleksne sestave vzorcev tekom razvoja lahko zelo zahteven. S tradicionalnim pristopom (>>one factor at a time<< ali OFAT) je proces razvoja in optimizacije metode HPLC dolgotrajen in nepregleden, hkrati pa z njim ni mogoče določiti morebitnih interakcij med parametri (faktorji), ki vplivajo na delovanje metode. Leta 2004 je Ameriška agencija za hrano in zdravila (FDA) prvič predstavila pristop razvoja z vgrajeno kakovostjo (QbD), katerega namen je izboljšati kakovost zdravil z njenim načrtovanjem neposredno v farmacevtski proces. Junija 2018 je ICH naznanila novo smernico ICH Q14, ki bo vključevala uporabo QbD za razvoj, optimizacijo in validacijo analiznih metod, imenovan pristop razvoja analiznih metod z vgrajeno kakovostjo (AQbD). V uvodnem poglavju smo v obliki preglednega znanstvenega članka predstavili teoretično ozadje uporabe AQbD in podrobno predstavili novejše primere, na katerih po korakih prikažemo metodologijo AQbD pristopa pri razvoju in optimizaciji metod HPLC. V prvem poglavju raziskovalnega dela smo se osredotočili na metodo HPLC iz Evropske farmakopeje (EP) za določitev sorodnih snovi v zdravilni učinkovini celekoksib. Ta metoda ne dosega v farmakopeji predpisanega kriterija testa ustreznosti kromatografskega sistema (TUKS): resolucija med celekoksibom in nečistoto B je bila neustrezna, resolucija med nečistoto A in celekoksibom pa mejna. Z uporabo načrtovanja eksperimentov (DoE) smo metodo optimizirali v območju farmakopejsko dovoljenih odstopanj. Z DoE smo ovrednotili štiri kritične parametre: delež metanola in acetonitrila v mobilni fazi, temperaturo kolone in pretok mobilne faze in določili optimalno območje delovanja metode (>>sweet spot<<), kjer sta obe resoluciji ustrezni. To območje je bilo zelo ozko, na račun izboljšanih resolucij pa smo morali podaljšati čas analize za faktor 1,5. V drugem poglavju smo opisali razvoj in optimizacijo nove metode HPLC za določitev sorodnih snovi celekoksiba, saj je bila optimizirana farmakopejska metoda predolga in nerobustna. Na forumu Ameriške farmakopeje (USP) smo zasledili metodo HPLC za celekoksib kapsule, s katero bi lahko določali šest procesnih nečistot celekoksiba, ne pa tudi EP nečistote A, saj je eluirala pod vrhom celekoksiba. Od tu naprej je bil cilj razviti eno metodo HPLC, ki bo sposobna določiti vseh sedem procesnih nečistot celekoksiba iz EP in USP. Zaradi strukturne podobnosti nekaterih procesnih nečistot (položajni izomeri) smo poiskali primernejšo stacionarno fazo za njihovo ločbo. Zadovoljivo ločbo smo dosegli z uporabo kiralne stacionarne faze v reverzno faznem načinu elucije. Z uporabo programa MODDE smo metodo optimizirali in določili območje robustnosti. S 17 eksperimenti po modelu >>central composite face design<< smo ovrednotili delež acetonitrila v mobilni fazi, temperaturo kolone in pretok mobilne faze, ter kot kritične odzive spremljali tri kritične resolucije in retencijski čas elucije zadnje nečistote. Z metodo večkratne linearne regresije (MLR) smo povezali vrednosti faktorjev z eksperimentalno določenimi vrednostmi odzivov v statistično pomemben matematični model z odličnimi napovednimi lastnostmi. Z uporabo metode Monte Carlo simulacij smo določili območje robustnosti metode (>>design space<<), v katerem z 99 % verjetnostjo vsi odzivi ustrezajo kriterijem. V območju robustnosti smo določili tudi kombinacijo vrednosti faktorjev, ki dajejo optimalne odzive ter potrdili ustrezno ponovljivost, točnost, linearnost in občutljivost razvite metode HPLC. V tretjem poglavju smo se osredotočili na metodo HPLC iz EP za določitev sorodnih snovi v zdravilni učinkovini ropinirolijev klorid. Obstoječa metoda ni ločila dveh parov nečistot, hkrati pa je bil čas analize predolg. Za razvoj nove metode smo uporabili analizno tehniko UHPLC. Zaradi velikega števila kritičnih parametrov metode (molarna koncentracija in pH pufra, delež metanola v mobilni fazi, temperatura kolone, delež organske faze na začetku gradienta in strmina gradienta) smo v prvi fazi zasnovali pregledni eksperimentalni načrt z 19 eksperimenti. Določili smo tri faktorje (delež metanola v mobilni fazi, temperatura kolone in strmina gradienta) z velikim vplivom na kritične odzive. Za preostale tri faktorje pa smo že v tej fazi določili optimalne vrednosti. V fazi optimizacije metode smo zasnovali polni interakcijski načrt in po modelu >>central composite face-centered design<< izvedli 17 eksperimentov. Z metodo MLR smo povezali vrednosti faktorjev z eksperimentalno določenimi vrednostmi odzivov v statistično pomemben matematični model z zelo dobrimi napovednimi lastnostmi. Z metodo Monte Carlo simulacij smo določili dve možni območji robustnosti metode (>>design space<<) v odvisnosti od vrstnega reda elucije nečistote C in neznanega razkrojnega produkta. Za POVZETEK 3 končno metodo smo izbrali optimalno kombinacijo faktorjev, ki leži v robustnejšem območju ter potrdili ustrezno ponovljivost, točnost, linearnost in občutljivost razvite metode UHPLC. Z uporabo AQbD smo razvili dve novi robustni metodi in s tem odpravili težave obstoječih farmakopejskih metod. Z uporabo DoE smo zmanjšali število izvedenih eksperimentov, ki bi bili potrebni pri uporabi OFAT načina, matematični model pa nam je omogočil pridobitev podrobnih informacij glede vplivov faktorjev in faktorskih interakcij na posamezen odziv, česar z OFAT načinom ni mogoče ugotoviti. Na ta način smo določili območje robustnosti. V primeru ropinirolijevega klorida smo bistveno skrajšali čas analize in zmanjšali porabo organskih topil, kar je v skladu z aktualnimi trendi v analizni kemiji. Na obeh primerih smo dokazali učinkovitost uporabe AQbD pri razvoju in optimizaciji metod HPLC.