Opombe
Uporaba ustreznih in zanesljivih in vitro modelov nosnih in pljučnih epitelijskih barier je ključnega pomena pri vrednotenju permeabilnostnih lastnosti potencialnih zdravilnih učinkovin in formulacij, ki so namenjene nazalni in pulmunarni aplikaciji. In vitro modeli morajo ustrezno posnemati barierne lastnosti nosne in dihalne sluznice, zaželena pa je tudi podobna ekspresija proteinov, ki tvorijo tesne stike in prenašalcev zdravilnih učinkovin kot tudi podobne vrednosti za transepitelijsko električno upornost (TEER). Pred uporabo za visoko zmogljivo testiranje permeabilnosti zdravilnih učinkovin je potrebna tudi validacija in vitro modelov. In vitro modeli, ki se uporabljajo v ta namen, so izrezana tkiva, primarne celične kulture in nesmrtne celične linije, pri čemer ima vsak model svoje prednosti in slabosti. Vendar pa so nesmrtne celične linije v zgodnji fazi raziskav običajno model prvega izbora, saj uporaba primarnih celic ali izrezane sluznice, kljub temu da bolje posnemata epitelijske bariere in vivo, ni primerna za visoko zmogljivo testiranje permeabilnosti zdravilnih učinkovin, prav tako lahko pride do vpliva na variabilnost. RPMI 2650 in Calu-3 celični liniji sta človeškega izvora (nosnega oz. traheo-bronhialnega izvora) in predstavljata potencialni celični model nosnega (RPMI 2650 in Calu-3) in dihalnega (celična linija Calu-3) epitelija. V uvodu smo predstavili pregled anatomije in fiziologije nosne votline in traheo-bronhialnega epitelija ter znane in vivo in in vitro modele epitelijskih barier. Prav tako smo podali podroben pregled že objavljenih podatkov o karakterizaciji celic RPMI 2650 in Calu-3, saj sta bili ti dve celični liniji v zadnjem desetletju predmet obsežne raziskave glede optimalnih pogojev gojenja celic, morfologije in karakterizacije ultrastrukture, pa tudi glede genskega, proteinskega in funkcionalnega izražanja prenašalcev zdravilnih učinkovin. Ugotovitev, da rast na meji zrak-tekočina (A-L) omogoča večjo podobnost gojenih nesmrtnih celic z in vivo nosnim in dihalnim epitelijem, je narekovala vse nadaljnje raziskave glede celičnih linij RPMI 2650 in Calu-3. Vendar vrednotenje ustreznosti teh celičnih linij kot modelov nosnega in dihalnega epitelija za napovedovanje permeabilnosti zdravilnih učinkovin z uporabo dovolj velikega nabora vzorcev še ni bilo narejeno. Cilj naše raziskave je bil raziskati ustreznost RPMI 2650 in Calu-3 celičnih linij, gojenih na meji A-L in L-L (tekočina-tekočina), kot modelov nosnega in dihalnega epitelija za določanje permeabilnosti zdravilnih učinkovin, pri čemer smo upoštevali najnovejše ICH (International Council for Harmonization of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use ) in FDA (US Food and Drug Administration) smernice za ustreznost in vitro permeabilnostnih metod za razvrstitev zdravilnih učinkovin glede na njihovo permeabilnost. Ko smo določili, kateri pogoj rasti vodi do primernejšega modela za testiranje permeabilnosti zdravilnih učinkovin, smo raziskali uporabnost posameznih modelov za vrednotenje in vitro permeacije intranazalno apliciranih zdravilnih učinkovin iz različnih formulacij, ki so na trgu. V prvem delu disertacije (Poglavje 1) smo v skladu z regulativnimi smernicami ovrednotili dva celična modela RPMI 2650 (A-L in L-L) za napovedovanje nazalne permeabilnosti zdravilnih učinkovin. Najprej smo preverili integriteto celične plasti obeh celičnih modelov tako, da smo izvedli teste permeabilnosti s številnimi označevalci ničelne permeabilnosti (dekstran, konjugiran s flourescein izotiocianatom (FD) z visoko molekulsko maso). Ker smo pridobili nižje permeabilnostne vrednosti za model A-L RPMI 2650, sklepamo, da so bili celični večplastni sloji manj prepustni, če smo jih gojili na fiziološko bolj relavantni A-L meji. V obeh modelih smo s pomočjo dvosmernih transportnih študij z uporabo ustreznih prenašalnih substratov in zaviralcev prikazali zanemarljivo funkcionalno ekspresijo prenašalcev, ki pospešujejo izločanje, kot sta npr. P-gp (P-glikoprotein) in BCRP (protein odpornosti za raka dojke, angl. Breast Cancer Resistance Protein). Z namenom, da bi ocenili permeabilnost 23 modelnih zdravilnih učinkovin z nizko, srednjo in visoko permeabilnost, smo izvedli dvosmerne transportne študije. Model A-L RPMI 2650 je omogočal jasno razlikovanje med visoko permeabilnimi učinkovinami (razreda 1 in 2 po biofarmacevtskem klasifikacijskem sistem (BCS)) in učinkovinami z zmerno in nizko permeabilnostjo (BCS razreda 3 in 4), česar pa model L-L ni razlikoval. Vrednosti za permeabilnost, ki smo jih določili dvanajstim modelnim zdravilnim učinkovinam s celičnim modelom A-L RPMI 2650, so dobro korelirale (Pearsonov koeficient korelacije (r = 0.96)) z vrednostmi pri popolnoma diferenciranem modelu nosnega epitelija (MucilAir). Potrdili smo, da celični model A-L RPMI 2650 predstavlja obetaven model nosnega epitelija za napovedovanje permeabilnosti zdravilnih učinkovin za nazalno aplikacijo od modela L-L. Ugotovili smo, da sta korelaciji med vrednostmi za permeabilnosti 22 modelnih zdravilnih učinkovin v A-L RPMI 2650 modelu in tistimi, ki so bile določene v črevesnih modelih (celice Caco-2 in izolirani jejunum podgan), dobri, vendar nekoliko nižji. V Poglavju 2 smo na isti način raziskali ustreznost dveh celičnih modelov Calu-3 (A-L in L-L) za napovedovanje permeabilnosti zdravilnih učinkovin skozi epitelij dihalnih poti. Ugotovili smo, da imata oba modela visoko barierno integriteto, kar je bilo razvidno iz zelo nizkih vrednosti za permeabilnost testiranih FD z visoko molekulsko maso. Z uporabo ABC (angl. ATP-binding cassette) transportnih substratov in zaviralcev smo izvedli dvosmerne transportne študije, prav tako smo določili funkcionalno aktivnost P-gp, vendar ne BCRP. Vrednosti za permeabilnost 22 modelnih zdravilnih učinkovin z različno (nizko, srednjo in visoko) permeabilnostjo smo določili z dvosmernimi permeabilnostnimi testi, asimetrično permeabilnost (i.e. efluksno razmerje (ER) > 2) pa smo določili za več nizko in srednje permeabilnih modelnih zdravilnih učinkovin z obema celičnima modeloma Calu-3. Ne glede na način rasti smo permeabilnost nizko permeabilnih zdravilnih učinkovin zlahka ločili od permeabilnosti visoko permeabilnih zdravilnih učinkovin, saj je bila očitna razlika v Papp vrednostih, ki so bile znotraj območja dveh redov velikosti. Dodatno smo ugotovili, da so bile izračunane Papp (navidezni permeabilnostni koeficient) vrednosti modelnih zdravilnih učinkovin za oba celična modela v splošnem znotraj istega velikostnega razreda, pri čemer so Papp vrednosti pri večini zdravilnih učinkovin nižje za L-L Calu-3 model. Papp vrednosti, ki smo jih določili s Calu-3 celičnima modeloma, so imele enak red velikosti kot Papp vrednosti, ki so bile določene s Caco-2 modelom. Ker je bila korelacija med celičnimi modeli zelo visoka (r = 0.93 za A-L Calu-3 in Caco-2 ter r = 0.92 za L-L Calu-3 in Caco-2), smo zaključili, da celični liniji Calu-3 in Caco-2 ločujeta med zdravilnimi učinkovinami z različno peremabilnostjo na podoben način. Kljub drugačnemu anatomskemu izvoru predstavljajo Calu-3 celice obetaven model nosne epitelne bariere, kar smo dokazali z odlično korelacijo z MucilAir modelom za 11 modelnih zdravilnih učinkovin (r = 0.97 za A-L Calu-3 in MucilAir), pa tudi z dobro korelacijo s celično linijo RPMI 2650 (r = 0.95 za A-L Calu-3 in A-L RPMI 2650). Čeprav nismo mogli zaključiti, da eden izmed Calu-3 celičnih modelov (A-L in L-L) omogoča boljše razlikovanje med zdravilnimi učinkovinami z različno permeabilnostjo, smo se odločili, da bomo za nadaljnje permeabilnostne teste formulacij za intranazalno uporabo uporabili le modele A-L RPMI 2650 in A-L Calu-3 zaradi opažene prisotnosti mukusa, višje genske ekspresije prenašalcev zdravilnih učinkovin pri A-L Calu-3 modelu ter zaradi tega, ker se TEER vrednosti omenjenjega modela zelo dobro ujemajo z objavljenimi vrednostmi TEER-a dihalnega epitelija kuncev. V 3. poglavju smo uporabili tri različne in vitro metode za vrednotenje nosnega pršila: celice RPMI 2650 in Calu-3, gojene na način A-L, polikarbonatne membrane Transwell z različno velikostjo por in trislojno membrano lipid-olje-lipid v PAMPA sistemu (test permeabilnosti s sistemom vzporednih umetnih membran) (angl. parallel artificial membrane permeability assay). Oba celična modela smo uporabili za permeabilnostne teste dveh kortikosteroidov prve generacije, medtem ko sta bili drugi dve metodi dodatno uporabljeni za in vitro vrednotenje permeacije kortikosteroidov druge generacije. Pokazali smo, da in vitro rezultati permeacije zdravilnih učinkovin sovpadajo z rezultati farmakokinetičnih študij različnih formulacij preiskovanih intranazalnih kortikosteroidov in pravilno napovedali (ne) enakovrednost nosnih pršil. To pomeni, da so omenjene tri in vitro metode obetavne v smislu napovedovanja rezultatov bioekvivalenčnega testiranja nosnih sprejev. V poglavju 4 smo za vrednotenje in vitro permeacije intranazalno apliciranih zdravilnih učinkovin z lokalnim in sistemskim učinkom v obliki raztopin in suspenzij prav tako uporabili A-L RPMI 2650 in A-L Calu-3 celična modela, z namenom, da pojasnimo vpliv različnih formulacij na permeabilnost zdravilnih učinkovin. Celična modela sta se izkazala za dovolj diskriminatorna, prav tako smo z njima zaznali razlike v in vitro permeaciji zdravilnih učinkovin glede na in vivo biološko uporabnost, pri čemer smo pri samo enem primeru opazili večje razlike med formulacijami in vitro, kot pa dejansko obstajajo v in vivo. Za nekatere zdravilne učinkovine, ki so bile v obliki raztopin, smo dobili dobro korelacijo z objavljenimi podatki o biološki uporabnosti. Oba celična modela sta izkazala ustreznost za vrednotenje različnih nosnih formulacij in sta zaznala vpliv sestave formulacije na permeabilnost zdravilne učinkovine. Ta raziskava je pokazala, da sta celični liniji RPMI 2650 in Calu-3 primerni za napovedovanje permeabilnosti zdravilnih učinkovin kot modela nosnega in dihalnega epitelija. Model A-L RPMI 2650 omogoča boljše razlikovanje med zdravilnimi učinkovinami z različno permeabilnostjo v primerjavi z L-L modelom, medtem ko celična modela A-L in L-L Calu-3 ločita med zdravilnimi učinkovinami z nizko, zmerno in visoko permeabilnostjo na podoben način. Modela A-L RPMI 2650 in A-L Calu-3 sta primerna za vrednotenje formulacij na osnovi raztopine in suspenzije za intranazalno uporabo, s pomočjo katerih lahko pridobimo uporabne informacije o vplivu formulacije na permeabilnost zdravilne učinkovine. In vitro modeli predstavljajo obetaven sistem za pravilno napovedovanje izida bioekvivalenčnih testiranj za generične nosne formulacije.