Slovenska pediatrija 2020 | 163 Pregledni znanstveni Ëlanek / Review article IzvleËek Humane genetske spremembe se pojavljajo v celotnem genomu, tako v kodirajoËih kot tudi v nekodirajoËih prede- lih. Opredeljujejo genetsko raznolikost med posamezniki in so v nekaterih primerih lahko vzrok razliËnih genetskih bolezni. ©tevilne se pojavijo že v otroštvu. V prvem delu preglednega prispevka opisujemo razliËne vrste genetskih sprememb, od manjših sekvenËnih sprememb do velikih kromosomskih nepravilnosti. Sledi predstavitev pomemb- nejših pristopov (citogenetskih in molekularnih genet- skih), ki se uporabljajo za doloËanje humanih genetskih sprememb v kliniËni praksi. VeËji poudarek namenjamo metodam sekvenciranja, saj so omogoËile vpogled v nukle- otidno zaporedje celotnega genoma in pomenijo revoluci- jo na podroËju molekularnega genetskega diagnosticiranja. Izpostavili smo težave, ki se porajajo pri doloËanju genetskih sprememb z metodami sekvenciranja naslednje generacije (angl. next generation sequencing, NGS), in predstavili pred - nosti najnovejših metod sekvenciranja − tehnologij dolgih odËitkov. Dandanes precejšnega deleža humanih genetskih sprememb, povezanih z razvojem genetskih bolezni, še ved- no niso odkrili. Zato predstavljamo nekaj možnih pristopov, s katerimi bi lahko izboljšali odkrivanje genetskih sprememb na individualni ravni. KljuËne besede: genetske spremembe, genetsko testira - nje, sekvenciranje naslednje generacije, tehnologije dolgih odËitkov. Abstract Human genetic variants occur throughout the whole genome, both in the coding and non-coding regions. In addition to defining genetic diversity among individuals, they may, in some instances, cause various genetic diseases, many of which have their onset in childhood. In the first part of the review article, we describe different types of genet- ic variants, ranging from minor sequence changes to major chromosomal aberrations. This is followed by a presentation of some of the most important approaches (cytogenetic and molecular genetic) that are used to detect genetic variants in clinical practice. We put greater emphasis on sequenc- ing methods, as they allowed us to gain insight into the nucleotide sequence of the entire genome, and therefore revolutionised the field of molecular genetic diagnostics. We also highlight the problems that arise in determining genetic variants through next-generation sequencing (NGS) methods and outline the benefits of the latest sequencing techniques − long-read sequencing. Today, a substantial proportion of human genetic variants associated with the development of genetic diseases, are still unknown. There - fore, we conclude the article by presenting some possible approaches that could improve the detection of genetic var- iants at the individual level. Key words: genetic variants, genetic testing, next-genera- tion sequencing, long-read sequencing. Humane genetske spremembe in njihovo doloËanje: trenutno stanje in obeti za prihodnost Human Genetic Variants and Their Analysis: Current State and Future Perspectives Lara Slavec, Ksenija Geršak, Nataša Karas KuželiËki, Katarina Trebušak Podkrajšek Slovenska pediatrija 4/2020.indd 163 12/12/2020 12:14 164 | Slovenska pediatrija 2020; 27(4) Uvod Genetske spremembe (spremembe v zapisu DNK) se v Ëloveškem genomu pojavljajo v razliËnih razsežnostih, od majhnih sprememb, npr. sprememb enega nukleotida, do velikih spre - memb, npr. kromosomskih nepravil- nosti (1). Humane genetske spremembe opredeljujejo genetsko raznolikost med posamezniki tako znotraj popula- cije kot tudi med populacijami (2). Vpli- vajo namreË na fenotipske razlike med ljudmi ter povzroËajo razliËne odzive na zdravila in vplive okolja. Nekatere spremembe so lahko tudi vzrok nastan- ka razliËnih bolezni, med katerimi šte- vilne nastopijo že v otroštvu. VËasih lahko z doloËanjem genetskih spre - memb ocenimo nagnjenost k bolezni ali napovemo njen potek (3). Genetske spremembe so lahko bodisi prirojene bodisi pridobljene. Prirojene se preko zarodnih celic staršev prena- šajo na potomce in se nahajajo v vseh celicah posameznika. Nasprotno pa pridobljene spremembe nastanejo le v doloËenih celicah posameznika, in sicer kadar koli v življenju. »e nastanejo v somatskih celicah, se ne prenašajo na potomstvo. »eprav je veËina humanih genetskih sprememb benignih (niso vpletene v razvoj bolezni), so v doloËe- nem deležu tudi patogene in sodeluje- jo pri nastanku genetskih bolezni (4). Poznamo štiri glavne tipe huma - nih genetskih bolezni: monogenske bolezni (posledica napak v zapisu DNK enega gena), kromosomske bolez- ni (posledica sprememb v številu ali strukturi kromosomov), kompleksne oz. veËfaktorske bolezni (posledica kombinacije delovanja veË genetskih in okoljskih dejavnikov) in mitohondrijske bolezni (posledica napak v mitohon- drijski DNK) (5). Raziskovalci so se v preteklosti poslu- ževali razliËnih strategij odkrivanja genetskih oznaËevalcev, ki vplivajo na nastanek genetskih bolezni, npr. analiz vezanega dedovanja, genetskih asociacijskih raziskav/študij primerov in kontrol (npr. analiz kandidatnih genov v populaciji, analiz kandidatnih genov znotraj družin (npr. test TDT) in asoci- acijskih raziskav na celotnem genomu (GWAS)) (4,6). »eprav so ti raziskovalni pristopi dokaj preprosti, je odkrivanje patogenih razliËic DNK in njihovih pos- ledic lahko zelo zapleteno in zahteva desetletja raziskovanja. Vsekakor pa je uspešnost prepoznavanja vzroËnih genetskih razliËic doloËenih bolez- ni v veliki meri odvisna od napredka genomskih tehnologij (7). Vrste humanih genetskih sprememb Genetske spremembe se pojavljajo na celotnem genomu. Humani genom pogosto razdelimo na kodirajoËe regije DNK (manj kot 2 % genoma), ki se pre - pišejo v mRNK in prevedejo v proteine, ter nekodirajoËe regije DNK (približno 98 % genoma) (8). VËasih so razisko- valci nekodirajoËo DNK imenovali tudi ≈odpadna√ DNK (angl. junk DNA), dandanes pa je znano, da ima velik del nekodirajoËe DNK pomembno regula- torno vlogo (npr. kodira razliËne RNK, sodeluje pri aktivaciji genov, urejanju strukture kromatina itd.) (9). RazliËne vrste genetskih sprememb se v diplo- idnem humanem genomu, ki obsega približno 6 Gbp, pojavljajo z razliËnimi frekvencami. Njihov doprinos k nastan- ku genetskih bolezni je razliËen (7). V nadaljevanju na kratko opisujemo vrste humanih genetskih sprememb. Nekate- re od shematsko prikazujemo na Sliki 1. RazliËice posameznih nukleotidov (angl. single nucleotide variants, SNV) oz. polimorfizmi posameznih nukleotidov (angl. single nucleotide polymorphisms, SNP) RazliËice posameznih nukleotidov (SNV) ali polimorfizmi posameznih nukleotidov (SNP) so substitucije oz. zamenjave enega nukleotida (10). Poznamo dva razliËna tipa zamenjav, in sicer tranzicije (zamenjava purina s purinom (A ↔G) ali pirimidina s pirimidi- nom (T ↔C)) in transverzije (zamenjava dvoobroËnega purina z enoobroËnim pirimidinom ali obratno) (11). SNP so najpogostejše in najbolje definirane spremembe v humanem genomu. V povpreËju se pojavi en SNP na 1000 baznih parov, kar pomeni, da jih je v celotnem humanem genomu približno 4−5 milijonov (12). Po številËnosti pre- segajo vse ostale genetske spremembe v razmerju skoraj 7 proti 1 (7). Zamenjava enega nukleotida v kodira- joËih regijah DNK lahko vodi do sinoni- mnih oz. tihih sprememb (spremenjen kodon kodira isto aminokislino) ali do nesinonimnih sprememb, kot so drugaËnosmiselne spremembe (spre- menjen kodon kodira drugaËno ami- nokislino − bodisi podobno ali zelo razliËno) in nesmiselne spremembe (sprememba nukleotida vodi v nasta- nek prezgodnjega stop kodona ali pa stop kodon odstrani). Predvsem nesinonimne, v nekaterih primerih pa tudi sinonimne spremembe lahko pomembno spremenijo konËni prote- inski produkt in vplivajo na njegovo funkcijo (10,11,13). »e se SNV pojavi- jo v nekodirajoËem delu DNK, npr. v promotorski regiji gena ali v intron- skem zaporedju, lahko v prvem pri- meru spremenijo vezavno mesto za transkripcijski dejavnik, v drugem pa povzroËijo nepravilno izrezovanje intronov. Tudi na ta naËin lahko spre- menijo funkcijo proteina (10). Manjše insercije in delecije (angl. indels) Pri insercijah gre za vrinek nukleotidov, pri delecijah pa za njihovo izgubo. Manj - še insercije in delecije so dolge 1−49 bp (14). Tako kot SNV so tudi te genetske spremembe v genomu zelo pogos- te. Pojavijo se namreË od 700.000- do 800.000-krat (7). »e je število nukleoti- dov, ki se vrine oz. izreže iz kodirajoËe sekvence DNK, veËkratnik števila tri, pride do dodajanja oz. odstranjevanja Slovenska pediatrija 4/2020.indd 164 12/12/2020 12:14 Slovenska pediatrija 2020 | 165 celotnih kodonov in s tem posameznih aminokislin. KonËni proteinski produkt ima spremenjeno funkcijo, a je v neka- terih primerih še vedno lahko funkcio- nalen. »e pa to število ni deljivo s tri, pride do spremembe bralnega okvirja in poslediËno do popolne spremembe strukture proteina. Posledica je nasta- nek nefunkcionalnega proteina ali ta sploh ne nastane (10,11,15). Strukturne spremembe (angl. structural variants) O strukturnih spremembah govorimo, ko so spremembe med dvema geno- moma veËje od 50 bp (14). V humanem genomu jih je 23.000−28.000 (7). Med strukturne spremembe uvršËamo veËje delecije in insercije, inverzije (zamenja- ve smeri odseka DNK na nekem polo - žaju), duplikacije (del kromosoma se podvoji), translokacije (premestitve kromosomskih odsekov znotraj kromo- soma ali med dvema kromosomoma) in razliËice v številu kopij (angl. copy -number variations, CNV) (10,16). CNV so definirani kot veËji odseki DNK, ki se v razliËnih humanih genomih poja- vijo v razliËnem številu kopij (od niË do veË razliËic). NajveËji CNV vkljuËujejo ponovitve veË genov oz. alelov (16). Spremembe v številu ponovitev (angl. repeat variants) Humani genom vsebuje tudi veliko šte- vilo ponovitvenih sekvenc. Nahajajo se predvsem v nekodirajoËih regijah DNK (telomerah, centromerah itd.) in pred- stavljajo približno 50 % genoma. ©tevi- lo ponovitev se med humanimi genomi zelo razlikuje (10,17). PonavljajoËa se zaporedja lahko razdelimo v dve veliki skupini: mobilni ali transpozicijski ele- menti (angl. transposable elements) in tandemske ponovitve (angl. tan- dem repeats). Transpozicijski elemen- ti so razpršena ponovljena zaporedja, za katera je znaËilno, da se prestavlja- jo po genomu. Poznamo dve skupini transpozicijskih elementov: • retroelementi, ki se prestavljajo po genomu z vmesno pretvorbo v RNK -intermediat. Med transpozicijo se ne izrežejo iz DNK, zato se število pono - vitev poveËuje (mehanizem ≈kopiraj in prilepi«). Mednje uvršËamo: - kratke razpršene jedrne elemente (angl. short interspersed nuclear ele- ment, SINE); - dolge razpršene jedrne elemente (angl. long interspersed nuclear ele- ment, LINE); - dolge terminalne ponavljajoËe se retrotranspozone oz. LTR-retrotran- spozone (angl. long terminal repeat retrotransposons); • DNK-transpozoni, ki se iz donorske DNK izrežejo. Pri vstavitvi na drugo mesto v genomu zato ne pride do poveËanja števila ponovitev (meha- nizem ≈izreži in prilepi«) (18). V nasprotju z nakljuËno razpršenimi ponovitvami je za tandemske pono- vitve znaËilno, da se doloËen odsek DNK zaporedoma ponavlja. Enote ostanejo medsebojno povezane in se ne prestavljajo po genomu. Med tan- demske ponovitve štejemo: • satelitno DNK (ponavljajoËa se enota je dolga 100−500 bp); • minisatelite (ponovitve segmenta, dolgega 10−100 bp) in • mikrosatelite (ponovitve segmenta, dolgega 1−9 bp). Med minisatelite uvršËamo npr. spre- menljivo število tandemskih ponovitev (angl. variable number tandem repe- at, VNTR), med mikrosatelite pa npr. kratko tandemsko ponovitev (angl. short tandem repeat, STR) (10,17,19). »eprav se tandemske ponovitve nava- dno nahajajo v kromosomskih regijah brez genov oz. tako imenovanih ≈gen- skih pušËavah«, so nekatere prisotne tudi v funkcionalnih delih genoma (kodirajoËih ali regulatornih). Pred- vsem mikrosateliti so zaradi visoke stopnje interindividualne variabilnosti b) SNV /SNP Manjša de le c ij a Manjša inse r c ij a Spr e m e m ba v š t e vilu pono v it e v ( mikr osa t elit) R e f erenč no z aporedje R e f erenč no z aporedje Du p l i k a ci ja / CN V Del eci ja/C NV In v e r z ij a T r anslok ac ij a SLIKA 1. NEKATERE GENETSKE SPREMEMBE, KI JIH NAJDEMO V HUMANEM GENOMU. A) SEKVEN»NE SPREMEMBE, KI VKLJU»UJE ENEGA ALI NEKAJ NUKLEOTIDOV IN B) STRUKTURNE SPREMEMBE, KI VKLJU»UJEJO VE»JE SEGMENTE DNK (Y IN Z STA SEGMENTA DNK IZ DRUGEGA KROMOSOMA); V OBEH PRIMERIH SO SPREMEMBE PRIKAZANE V PRIMERJAVI Z REFEREN»NIM ZAPOREDJEM. FIGURE 1. SOME OF THE GENETIC VARIANTS FOUND IN THE HUMAN GENOME. A) SEQUENCE VARIANTS INVOLVING ONE OR MORE NUCLEOTIDES AND B) STRUCTURAL VARIANTS INVOLVING LARGE DNA SEG- MENTS (Y AND Z REPRESENT DNA SEGMENTS FROM ANOTHER CHROMOSOME); IN BOTH CASES, THE VARIANTS ARE PRESENTED IN RELATION TO THE REFERENCE SEQUENCE. Slovenska pediatrija 4/2020.indd 165 12/12/2020 12:14 166 | Slovenska pediatrija 2020; 27(4) pomembni biološki oznaËevalci. Poleg tega, da so vpleteni v nastanek neka- terih genetskih bolezni, se v forenzi- ki uporabljajo za identifikacijo oseb, koristni pa so tudi za študije kratko- roËne evolucije Ëloveštva (17,19). Spremembe v številu kromosomov (angl. numerical abnormalities) Med humane genetske spremem - be uvršËamo tudi spremembe v šte- vilu kromosomov. V primeru, da celica vsebuje veË kot dva popolna seta humanega haploidnega geno- ma (69 kromosomov ali veË), govori- mo o poliploidiji. Primer je triploidija (trije haploidni seti kromosomov), ki naj bi se pojavila pri 2−3 % noseËnosti in navadno vodi v zgodnji spontani splav (20,21). »e število kromosomov ni mnogokratnik haploidnega števila kromosomov, govorimo o anevploidiji. VeËina anevploidij ni združljivih z živ- ljenjem. Izjeme so nekatere trisomije (npr. trisomija 21 ali Downov sindrom) in monosomije (npr. monosomija X ali Turnerjev sindrom) (21,22). Kadar genetske spremembe povzroËijo nastanek nefunkcionalnega proteina ali povzroËijo, da proteinski produkt sploh ne nastane, gre za škodljive (patogene) genetske spremembe, ki vodijo v doloËeno kliniËno sliko oz. nastanek genetske bolezni. Te bole- zenske genetske spremembe imenuje- mo tudi mutacije (23). »eprav je med humanimi genetski- mi spremembami daleË najveË SNV, je analiza podatkov iz podatkovne baze Human Genome Mutation Database (HGMD) pokazala, da pri približno tretji- ni vseh patogenih genetskih sprememb ne gre za enonukleotidne substitucije (24). Dandanes je znano, da struktur- ne spremembe, ki prizadenejo gene, bistveno prispevajo k nastanku bolez- ni. Te namreË doprinesejo veË razlik v baznih parih med dvema humanima genomoma kot katera koli druga vrsta humanih genetskih sprememb (25). Strukturne spremembe navadno zavze- majo veËje spremembe v sekvenci DNK, ki so zato tudi bolj škodljive (26). Tudi Ëe se pojavljajo v nekodirajoËih regi- jah DNK (kar je za njih znaËilno), lahko tam dodajo, spremenijo ali odstranijo regulatorno sekvenco in s tem spreme- nijo izražanje genov (27). V primerjavi s SNV naj bi imele strukturne spremembe vsaj 28-krat veËjo verjetnost, da bodo vplivale na gensko izražanje (26). »e so strukturne spremembe prisotne v ekso- nih protein-kodirajoËih genov, navadno pride do veliko bolj škodljivih posledic, saj izguba celotnega eksona onemo- goËi sintezo proteina (27). Pri identi- fikaciji genetskih dejavnikov tveganja za nastanek bolezni se moramo tako poleg SNV osredotoËiti tudi na druge humane genetske spremembe in jih ne smemo podcenjevati. DoloËanje humanih genetskih sprememb Humane genetske spremembe doloËa- mo zaradi pridobivanja genetskih informacij posameznika in morebitne- ga kliniËnega ukrepanja. Obstaja veË zdravstvenih razlogov (indikacij), zakaj se odloËamo za izvajanje genetskih preiskav. Primeri indikacij so: • potrditev genetske spremembe pri simptomatskem bolniku, • potrditev genetske spremembe pri brezsimptomnem bolniku, • ugotavljanje prenašalstva za genet- sko spremembo, • testiranje pred rojstvom (predim- plantacijsko in prenatalno), • presejanje v populaciji in • forenziËna identifikacija. Velika veËina indikacij je tudi glavni razlog za izvajanje genetskih preiskav pri otrocih in njihovih družinskih Ëla- nih. Ker obstajajo razliËne indikacije za genetsko testiranje, je z njimi pove - zana tudi pravilna izbira ustreznega testa. Poznamo diagnostiËne in pre- diktivne teste, teste prenašalstva ter farmakogenomske in genetske identi- fikacijske teste (28). Pristope doloËanja humanih genet- skih sprememb v grobem delimo na dve skupini: citogenetske in moleku- larne genetske (29). V Tabeli 1 so zbra - ne pomembne metode, ki se v kliniËni praksi uporabljajo za doloËanje huma- nih genetskih sprememb, in njihove osnovne znaËilnosti. Citogenetske in molekularnocitogenetske preiskave Te preiskave so usmerjene v prepo - znavanje znanih in še neopisanih kro- mosomskih sprememb, torej velikih strukturnih sprememb in sprememb v številu kromosomov, ter razliËic v šte- vilu kopij (CNV) (29,30). Naštevamo in opisujemo jih v Tabeli 1. Molekularne genetske preiskave Za razliko od citogenetskih metod z molekularnimi genetskimi meto - dami zaznavamo manjše sekvenËne spremembe (29). Izjema je metoda hkratnega pomnoževanja od ligaci- je odvisnih sond (MLPA), ki omogoËa tudi identifikacijo veËjih znanih dele- cij, insercij in duplikacij (31). Poleg tega je dandanes razvoj najnovejših metod sekvenciranja (metod 3. gene- racije) usmerjen v zmožnost zaznava- nja veËjih genetskih sprememb, tudi strukturnih (32). Molekularne metode, ki se uporabljajo v praksi, so naštete in opisane v Tabeli 1. Nekatere med njimi se uporabljajo manj kot druge. Primer je PCR z analizo polimorfizmov dolžin restrikcijskih fragmentov (PCR-RFLP), ena prvih genotipizacijskih metod, ki je danes zaradi razvoja enostavnejših in zanesljivejših metod (npr. PCR v real - nem Ëasu (qPCR)) skoraj obsolentna. Metode se bistveno razlikujejo v tem, ali omogoËajo prepoznavanje samo znanih sprememb ali tudi tistih, ki še niso bile opisane (29). Vsem je skupno, Slovenska pediatrija 4/2020.indd 166 12/12/2020 12:14 Slovenska pediatrija 2020 | 167 Metoda Osnovni princip metode Tip analiziranih genetskih sprememb citogenetske in molekularno-citogenetske preiskave klasiËna kariotipizacija analiza kariograma − mikroskopske slike metafaznih kromosomov, ki so obarvani in razporejeni po velikosti znane in še neopisane kromosomske spremembe (velike strukturne spremembe ali spremembe v številu kromosomov) fluorescentna hibridizacija in situ (FISH) oznaËevanje in prepoznavanje posameznih delov kromosomov z uporabo fluorescentnih sond znane mikrodelecije in spremembe v številu kromosomov primerjalna genomska hibridizacija na mikromrežah (aCGH) molekularna kariotipizacija − tekmovanje fluorescentno oznaËene preiskovanËeve DNK in referenËne DNK za vezavo na mikromrežo; analiza sprememb v številu kopij na podlagi sprememb v intenzivnosti signala znane in še neopisane razliËice v številu kopij (CNV) molekularne genetske preiskave verižna reakcija s polimerazo (PCR) poleg opisanih metod obstajajo še številne druge: npr. hkratni PCR (angl. multiplex PCR), vgnezdeni PCR (angl. nested PCR) itd. PCR z analizo polimorfizmov dolžin restrikcijskih fragmentov (PCR-RFLP): PCR pomnožitev odseka z znano genetsko spremembo, specifiËna cepitev z restrikcijskim encimom in detekcija s pomoËjo elektroforeze znane sekvenËne spremembe v restrikcijskem mestu alelnospecifiËni PCR: pomnoževanje odseka DNK z dvema setoma oligonukleotidnih zaËetnikov, komplementarnima mutiranemu ali normalnemu alelu, in detekcija odsekov s pomoËjo elektroforeze znane sekvenËne spremembe (SNV in manjše delecije/insercije PCR v realnem Ëasu (qPCR): pomnoževanje specifiËnega odseka DNK z oligonukleotidnimi zaËetniki in z dvema fluorescentno oznaËenima sondama, komplementarnima mutiranemu ali normalnemu alelu; vsaka sonda ima vezano svoje barvilo, kar omogoËa razlikovanje med razliËnimi genotipi. znane sekvenËne spremembe (predvsem SNV) DNK mikromreže na Ëip z vezanimi enoverižnimi tarËnimi odseki DNK hibridiziramo fluorescentno oznaËeno testno DNK; sledi spiranje nevezanih fragmentov, presvetlitev z laserjem in detekcija fluorescence. prepoznavanje velikega števila sekvenËnih sprememb hkrati (znanih in še neopisanih) preizkus ligiranja oligonukleotidov (OLA) po PCR pomnožitvi odsekov DNK uporabimo dve razliËno dolgi oligonukleotidni sondi, ena je komplementarna normalnemu zaporedju, druga pa mutiranemu zaporedju; uporabimo še skupno, oznaËeno sondo, ki se na tarËno zaporedje veže poleg prve oz. druge sonde; v primeru popolnega prileganja dveh sond pride do njune ligacije; sledita denaturacija DNK in detekcija z elektroforezo (ali encimskoimunsko) znane sekvenËne spremembe (predvsem SNV) metoda hkratnega pomnoževanja od ligacije odvisnih sond (MLPA) temelji na PCR reakciji z uporabo enega para oligonukleotidnih zaËetnikov in posebnih DNK-sond (vsaka je sestavljena iz dveh delov, ki vsebujeta sekvenco, komplementarno neposredni bližini tarËnega odseka, ter sekvenco, kamor se vežejo oligonukleotidni zaËetniki); reakcija je uspešna le, ko pride do hibridizacije obeh delov sond in njune ligacije; sledi loËitev pomnožkov in detekcija s kapilarno elektroforezo znane veËje in manjše delecije in duplikacije analiza talilne krivulje visoke loËljivosti (HRM) po PCR pomnožitvi odsekov DNK dvojno vijaËnico DNA oznaËimo z interkalirajoËim barvilom in poËasi segrevamo do tališËa sekvence, kar vodi do denaturacije, ki se kaže z zmanjšanja signala fluorescence znane in še neopisane sekvenËne spremembe izvedbe sekvenciranja sekvenciranje po Sangerju oz. dideoksi metoda (1. generacija sekvenciranja): metoda je podrobno opisana v podpoglavju molekularne genetske preiskave znane in še neopisane sekvenËne spremembe (predvsem SNV, manjše delecije in insercije) sekvenciranje naslednje generacije (NGS) (2. generacija sekvenciranja): metoda podrobno opisana v podpoglavju Molekularne genetske preiskave znane in še neopisane sekvenËne spremembe (SNV in manjše delecije/insercije) obsežnih genomskih podroËij, omejeno zaznavanje veËjih strukturnih sprememb tehnologije dolgih odËitkov (3. generacija sekvenciranja): osnovni princip metode, opisan v poglavju Omejitve pri doloËanju humanih genetskih sprememb s sekvenciranjem naslednje generacije. znane in še neopisane sekvenËne ter strukturne spremembe TABELA 1. GENETSKE PREISKAVE, KI SE UPORABLJAJO V KLINI»NI PRAKSI, NJIHOV OSNOVNI PRINCIP IN TIP ANALIZIRANIH GENETSKIH SPREMEMB (29−31,33,36−40). TABLE 1. GENETIC METHODS USED IN CLINICAL PRACTICE, THEIR BASIC PRIN - CIPLE AND THE TYPE OF ANALYZED GENETIC VARIANTS (29−31,33,36−40). Slovenska pediatrija 4/2020.indd 167 12/12/2020 12:14 168 | Slovenska pediatrija 2020; 27(4) da se priËnejo z izolacijo nukleinskih kislin (DNK, RNK) iz izbranega biolo- škega vzorca (polne krvi, brisa bukalne sluznice, kostnega mozga itd.). Nava- dno metode vkljuËujejo pomnoževanje odsekov DNK (oz. RNK) z verižno reak - cijo s polimerazo (PCR). Na ta naËin dobimo iz minimalne koliËine zaËetne DNK milijon ali veË kopij odsekov, ki so pomembni za testiranje. Uspešnost reakcije PCR lahko preverimo z elek- troforeznimi tehnikami, ki jih uporab- ljamo za loËevanje fragmentov DNK glede na dolžino. Temu sledi detekcija sekvenËnih sprememb (33). VËasih so bile zelo pomembne prese- jalne metode, kot so analiza talilne krivulje visoke loËljivosti (HRM), PCR z analizo konformacijskih polimor- fizmov enoverižnih DNK (PCR-SSCP), visokotlaËna tekoËinska kromatogra- fija z denaturacijo (dHPLC), denaturi- rajoËa gradientna gelska elektroforeza (DGGE) idr. Te metode omogoËajo ana - lizo omejenih genomskih regij pri veËjem številu preiskovancev hkrati. Z izjemo HRM se z razvojem modernih metod sekvenciranja v kliniËni praksi vse manj uporabljajo (34). Se pa še ved - no uporabljajo v raziskovalne namene. Revolucijo na podroËju molekular- nega genetskega diagnosticiranja so namreË prinesle metode sekvenciranja oz. metode doloËanja nukleotidnega zaporedja. Vsem metodam sekvencira- nja je skupno, da se konËno zaporedje odseka primerja z zaporedjem refe- renËnega genoma. Na ta naËin prepo- znamo mesto razlike v zaporedju (35). Prva generacija sekvenciranja, to je sekvenciranje po Sangerju, je še danes zlati standard za doloËanje nukleoti- dnega zaporedja (34). Postopek meto- de se zaËne s PCR pomnožitvijo odseka genomske DNK, ki ga želimo sekvenci- rati. Nato izvedemo sintezo fragmen- tov, pri Ëemer uporabimo pomnožen odsek DNK, polimerazo, en oligonu- kleotidni zaËetnik, deoksinukleotide (dNTP) in štiri razliËno fluorescentno oznaËene dideoksinukleotide (ddNTP). DdNTP v nasprotju z dNTP na 3' koncu deoksiriboze nimajo hidroksilne skupi- ne, zato se z njihovo vezavo izgrajeva- nje verige DNK konËa. DNTP in ddNTP tekmujejo za vgrajevanje v novonastalo verigo DNK. VsakiË ko se vgradi ddNTP, se sinteza verige zaustavi, zato nastane - jo razliËno dolgi fragmenti. Ti se nato s pomoËjo kapilarne elektroforeze loËi- jo po velikosti. Fragmenti potujejo po kapilari in na koncu dosežejo detektor. Tam barvilo na 3' koncu ddNTP osvetli laser, pri Ëemer pride do oddajanja fluo- rescence. Sledi tolmaËenje rezultatov na podlagi valovne dolžine in intenzivnosti fluorescence. Pristop omogoËa detekcijo znanih in še neopisanih sprememb (38). V zadnjih letih je glavna osnovna meto - da izbire za doloËanje nukleotidnega zaporedja sekvenciranje naslednje generacije. Druga generacija sekven- ciranja v primerjavi s sekvenciranjem po Sangerju omogoËa masovno vzpo- redno sekvenciranje veËjih genomskih regij (34). RazliËni proizvajalci upora- bljajo razliËne izvedbe NGS. Vsem je skupno, da DNK najprej fragmentira- mo in pripravimo nakljuËne, prekriva- joËe se odseke podobnih dolžin. Sledi vezava adapterjev na oba konca fra- gmentov, kar omogoËi kasnejšo hibridi- zacijo odsekov na trdno površino. Na ta naËin pripravimo knjižnico. Preverimo kakovost in kvantiteto knjižnice. Nato fragmente v knjižnici klonalno pomno- žimo (emulzijski PCR ali premostitveni PCR). Na koncu poteËe sekvenciranje vsakega klona (sekvenciranje s sintezo ali sekvenciranje z ligacijo). Sekvence analiziramo z bioinformatskimi orod- ji in preverimo prisotnost sekvenËnih sprememb. Tako lahko doloËimo nukle - otidno zaporedje vseh kodirajoËih regij DNK − eksoma (angl. whole exome sequencing, WES) ali celotne sekven- ce DNA − genoma (angl. whole geno- me sequencing, WGS) (39). Za NGS je v primerjavi z dideoksi metodo znaËil- na veËja hitrost pridobivanja podat- kov in nižja cena analize na nukleotid. Pomanjkljivosti tehnike pa sta krajša dolžina sekvenc, ki jih hkrati sekven- ciramo (za zagotavljanje Ëim veËje kakovosti prebranih odËitkov), in veËja stopnja napak (manjša toËnost) (34,40). Vseeno omogoËa zelo zanesljivo detek - cijo SNV ter malih insercij in delecij (40). Omejitve pri doloËanju humanih genetskih sprememb s sekvenciranjem naslednje generacije Med kljuËnimi parametri platform NGS, ki vplivajo na zanesljivost pridobljenih rezultatov, so dolžina in natanËnost odËitkov ter globina sekvenciranja (41). Med sekvenciranjem lahko nastajajo nakljuËne napake, ki jih je v nekaterih primerih težko prepoznati. Ta problem v praksi rešujemo s poveËanjem glo- bine sekvenciranja, torej poveËanjem konËnega števila sekvenciranih odËit- kov. Z veËjim številom odËitkov je veËja tudi zanesljivost prepoznavanja pra- ve baze na posameznem odËitku, saj napaka sekvenciranja v tem primeru postane statistiËno nepomembna. Žal pa je veËje število odËitkov povezano tudi z višjimi stroški sekvenciranja. Izraz pokritost se nanaša na globino sekven - ciranja izbranih tarËnih podroËij (42). Trenutno žal v kliniËni praksi ni jasnega priporoËila glede minimalne pokritosti. Ta je namreË odvisna od meje detekci- je, ki jo želimo doseËi, in je na primer pri doloËanju pridobljenih sprememb izredno visoka, tolerance glede lažno pozitivnih oziroma negativnih rezulta- tov in seveda napake izbranega inštru - mentalnega pristopa. DoloËanje strukturnih sprememb NGS je precej uspešna metoda za doloËanje SNV in manjših sekvenËnih sprememb. NajveËji problem so struk- turne spremembe, ki jih s kratkimi dol- žinami odËitkov, znaËilnimi za metode NGS, ne uspemo identificirati (7). DoloËanje veËjih insercij, delecij ali dup - likacij z NGS lahko izboljšamo tako s poveËanjem globine sekvenciranja kot tudi z uporabo obojestranskih odËit- kov, ki nam dajo informacijo o približni razdalji med dvema parnima odËitko- ma. Na ta naËin lahko sklepamo, da oba odËitka prihajata iz istega izho- dišËnega fragmenta in tako identifici- ramo doloËene strukturne spremembe Slovenska pediatrija 4/2020.indd 168 12/12/2020 12:14 Slovenska pediatrija 2020 | 169 (41). Vseeno pa kljub vsem izboljša- vam tehnologije NGS veliko struktur- nih sprememb zgrešimo. Pomembno je tudi dejstvo, da je doloËanje genet- skih sprememb z NGS posredno, saj je odvisno od primerjave preiskovanËeve- ga zaporedja DNK z zaporedjem refe- renËnega genoma (trenutno GRCh38). Tako o resniËnem zaporedju struktur- ne spremembe sklepamo, ne da bi jo toËno doloËili (43,44). Pogosto kratkih dolžin odËitkov ne moremo toËno prilegati doloËenim delom humanega genoma. Primer so srednje velike strukturne spremembe (manjše od 2000 bp), inverzije, pono- vitvene sekvence, GC- ali AT-bogata podroËja ter razliËni deli genoma, kjer se nahajajo zaporedja s homolognimi elementi (npr. CNV). V teh primerih se odËitki prilegajo na veË lokacij v geno- mu, kar povzroËi napake pri identifi- kaciji doloËenih genetskih sprememb. Krajši kot so odËitki, veËji del genoma je podvržen netoËnemu (dvoumnemu) prileganju (14,43,45). Pomanjkljivosti referenËnih genomov Po sekvenciranju prvega humanega genoma (osnova za sedanji referenËni genom − GRCh38) in kasneje nasled- njih genomov so raziskovalci z zaËude- njem ugotovili, da med njimi obstajajo velike razlike. Genoma dveh posame- znikov se med seboj ne razlikujeta le v milijonih SNV, temveË tudi v veË deset tisoËih veËjih strukturnih spremembah (veËjih od 50 bp) (7). Ta informacija je zelo pomembna, saj genetiki upora- bljajo referenËni humani genom za pri- merjavo s preuËevano sekvenco DNK in identifikacijo genetskih sprememb, ki so povezane z razliËnimi boleznimi. Zaradi razprostrtosti genetskih spre- memb po celotnem genomu lahko predvidevamo, da ima vsak posame- zni genom, kot je tudi prvi referenËni genom, genetske spremembe, ki so ali tudi niso prisotne pri veËini ljudi (46,47). Tako ni nujno, da je referenËni genom ustrezen standard (47). Prav tako vemo, da se humane genet- ske spremembe razlikujejo med etniËnimi skupinami. Zato se razisko- valci v zadnjem Ëasu trudijo, da bi sis- tematiËno analizirali razliËne humane genome in sestavili referenËne geno- me razliËnih Ëloveških populacij (48). RazliËni referenËni genomi bodo omo- goËili veËjo obËutljivost odkrivanja humanih genetskih sprememb (47). Pomen 3. generacije sekvenciranja; tehnologije dolgih odËitkov Tehnologije dolgih odËitkov (angl. long-read sequencing) so nadgra- dnja tehnologij NGS. OmogoËajo direktno sekvenciranje zelo dolgih sekvenc DNK (veË kot 10.000 bp). Dodatna prednost teh metod je mož- nost sekvenciranja ene same mole - kule DNK, zaradi Ëesar predhodno klonalno pomnoževanje ni potreb - no, globina sekvenciranja oz. pokri- tost pa je zato bolj enakomerna (43). V raziskavah so ugotovili, da lahko zaradi naštetih prednosti lažje pre - poznamo oz. identificiramo struktur- ne spremembe, predvsem tiste, ki so dolge 50−2000 bp (7). S temi meto - dami zaznamo skoraj 2,5-krat veË strukturnih sprememb kot z meto - dami NGS. Z uporabo predhodnih tehnik bi rutinsko lahko spregleda - li vsaj 48 % delecij in 83 % insercij (49). S tehnologijami dolgih odËitkov pa so raziskovalci uspeli prepoznati tudi kompleksne regije, npr. VNTR, segmentne duplikacije (veËje od 1000 bp) in sekvenco centromer (7). Naj - veËja pomanjkljivost teh metod je dejstvo, da so relativno nove, gene - rirajo napake in imajo dokaj nizko zmogljivost (nizka hitrost) s posle - diËno visoko ceno. Zaradi vsega naštetega jih za zdaj ne uporablja - mo v kliniËnem diagnosticiranju. Se pa tehnologije 3. generacije pospe - šeno razvijajo in obetajo napredek v zaznavanju strukturnih sprememb, tudi v kliniËnem okolju (43). Obeti za prihodnost Nezanemarljiv delež humanih genet- skih sprememb, povezanih z razvo- jem genetskih bolezni, še ni odkrit oz. doloËen. »eprav so se z razvojem tehno- logije v zadnjem desetletju naše mož- nosti za njihovo identifikacijo izredno poveËale, še vedno obstajajo omejitve in možnosti za izboljšanje pristopov. Zato moramo natanËneje opredeli- ti veËje število humanih referenËnih genomov Ëim veË razliËnih Ëloveških populacij. Tehnologije dolgih odËitkov (skupaj s tehnologijami kratkih odËit- kov, ki odpravljajo napake) omogoËa- jo izdelavo velikega števila referenËnih genomov. Ocenjujejo, da bi v primeru poznavanja sekvence približno 300 raz - liËnih referenËnih genomov podvojili število znanih strukturnih sprememb in odkrili veËino pogostih strukturnih sprememb (s frekvenco manj pogoste- ga alela, veËjo od 1 %). Tako bi pozna - vanje strukture teh sprememb olajšalo njihovo doloËanje v genomih, ki so bili pridobljeni s tehnologijami kratkih odËitkov (47,50). ©tevilne patogene genetske razliËice se nahajajo v nekodirajoËih regijah genoma. Za doloËanje teh genet - skih sprememb je kljuËno sekvencira- nje celotnega genoma (WGS), ki ga danes v kliniËni praksi uporabljamo redko. ©iršo implementacijo WGS v kliniËno prakso namreË upoËasnjujejo visoki stroški izvedbe, nizka pokritost sekvenciranja in velika koliËina ustvar- jenih podatkov, ki so problematiËni za obdelavo (51,52), kar naj bi se v bližnji prihodnosti spremenilo. Poleg WGS je pomembna tudi doloËi- tev faznih genomov. To pomeni, da se genetske spremembe dodeli bodisi materinim ali oËetovim kromosomom. Oba starševska haplotipa namreË sekvenciramo, s Ëimer dobimo bolj popolno informacijo o genomu posa- meznika. S takim naËinom lahko ugotavljamo vzorce dedovanja, alelno -specifiËno izražanje (raven izražanja posameznega alela pri heterozigotih), analiziramo sestavljene heterozigo- te in identificiramo patogene genet- Slovenska pediatrija 4/2020.indd 169 12/12/2020 12:14 170 | Slovenska pediatrija 2020; 27(4) ske razliËice. S faznimi genomi, ki so sekvencirani s tehnologijami dolgih odËitkov, lahko odkrijemo 30 % veË strukturnih sprememb kot z upora- bo enakih tehnologij, ki ne doloËa - jo faznih genomov (14,43). Danes je neposredno faziranje genoma še nekoliko oteženo, saj je s tehnologija- mi kratkih odËitkov, ki so dostopne na trgu, težko sestaviti sekvence posame- znih homolognih kromosomov. Genetske spremembe lahko identifici- ramo tudi s pomoËjo sestavljanja geno - ma vsakega posameznika de novo. V prihodnosti naj bi bil to vodilni naËin identifikacije genetskih sprememb v kliniËni praksi. Z naprednimi/novi- mi tehnologijami dolgih odËitkov bi najprej sekvencirali oba haplotipa pre- iskovanca (oËetovega in materinega) in tako sestavili fazni genom. Nato bi oba haplotipa primerjali z drugimi refe- renËnimi genomi. To bi bilo še posebej primerno za bolezni, ki se razvijejo v starosti, saj v teh primerih starševska DNK navadno ni dostopna. Tako bi lahko pospešili odkrivanje osebnih oz. družinskih patogenih genetskih spre- memb (7,53). ZakljuËek Prepoznavanje genetskih sprememb, ki so vzrok genetskih bolezni ali vplivajo na kliniËno odloËanje pri posameznem bolniku, postaja vsakdanja kliniËna praksa. To posebej velja na podroËju opredelitve prirojenih bolezni v otro- ški populaciji, saj omogoËa hitro in dokonËno opredelitev vzroka bolezni, kar je v veËini kljuËno za uËinkovito in pravoËasno kliniËno ukrepanje. PriËa- kujemo, da bo napredek na podroËju genomike vodil v nekoliko drugaËen pristop pri kliniËnem prepoznavanju genetskih bolezni. Ko bo cena teh - nologij dolgih odËitkov (3. generacije sekvenciranja) dovolj dostopna in ko bodo bolj zmogljive, hitrejše in zanes- ljive, bomo lahko sekvencirali, fazirali in sestavljali genom vsakega posame- znega preiskovanca. To je osnova za uËinkovito odkrivanje posamezniko- vih genetskih sprememb in identifika- cijo morebitnih patoloških sprememb. V Sloveniji je uvajanje tehnologi - je sekvenciranja naslednje generaci- je potekalo hitro po njeni uveljavitvi in je tako na voljo že od leta 2014. Izkušnje pri tem pa bodo seveda izre- dnega pomena za nadgradnjo obsto- jeËih diagnostiËnih pristopov, in sicer s sekvenciranjem dolgih odËitkov, ki ga v Sloveniji raziskovalno na podroËju humane genetike že uporabljamo. Literatura 1. Kidd JM, Cooper GM, Donahue WF, Hayden HS, Sampas N, Graves T, et al. Mapping and sequencing of structural variation from eight human genomes. Nature. 2008; 453(7191): 56−64. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm. nih.gov/18451855. 2. Serre D, Pääbo S. Evidence for gradients of human genetic diversity within and among conti- nents. Genome Res. Cold Spring Harbor Labora- tory Press; 2004; 14(9): 1679−85. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15342553. 3. Rahim NG, Harismendy O, Topol EJ, Frazer KA. Genetic determinants of phenotypic diversity in humans. Genome Biol. BioMed Central; 2008 24; 9(4): 215. Available from: https://pubmed. ncbi.nlm.nih.gov/18439327. 4. Griffiths AJF, Wessler SR, Carroll SB, Doebley J. An Introduction to Genetic Analysis. 11th ed. New York: W. H. Freeman and Company; 2015. 5. Davis CP. Types and List of Examples of Genetic (Hereditary) Diseases [Internet]. eMedicineHealth. [cited 2020 Apr 23]. Ava- ilable from: https://www.emedicinehealth. com/types_and_list_of_genetic_diseases/ article_em.htm 6. Cui Y, Li G, Li S, Wu R. Designs for Linka- ge Analysis and Association Studies of Complex Diseases BT - Statistical Methods in Molecu- lar Biology. In: Bang H, Zhou XK, van Epps HL, Mazumdar M, editors. Totowa, NJ: Humana Press; 2010. p. 219−42. Available from: https:// doi.org/10.1007/978-1-60761-580-4_6 7. Eichler EE. Genetic Variation, Comparative Genomics, and the Diagnosis of Disease. N Engl J Med 2019; 381(1): 64−74. Available from: https:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31269367 8. Patton KT, Thibodeau GA. Genetics and Here- dity: The Human Genome. Anat Physiol. 8th ed. London: Elsevier Health Sciences; 2014. p. 1133−5. 9. Shabalina SA, Spiridonov NA. The mamma- lian transcriptome and the function of non-co- ding DNA sequences. Genome Biol. 2004; 5(4): 105. Available from: https://doi.org/10.1186/ gb-2004-5-4-105. 10. Jackson M, Marks L, May GHW, Wilson JB. The genetic basis of disease. Essays Biochem. Portland Press Ltd.; 2018 Dec 2; 62(5): 643−723. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih. gov/30509934. 11. Bhattacharyya N, Khanra K. Mutation - Types of point mutations. A Text B. Mol Biol. First edition. New Delhi: EduPedia Publications; 2016. p. 218−22. 12. Help Me Understand Genetics (Genomic Rese- arch): What are single nucleotide polymorphisms (SNPs)? Natl Libr Med. (US); Genet. Home Ref. 2020 [cited 2020 May 25]. Available from: https:// ghr.nlm.nih.gov/primer/genomicresearch/snp. 13. Strachan T, Read A. Human Molecular Gene- tics. 5th ed. London: Garland Science; 2018. 14. Huddleston J, Chaisson MJP, Steinberg KM, Warren W, Hoekzema K, Gordon D, et al. Disco- very and genotyping of structural variation from long-read haploid genome sequence data. Geno- me Res. 2016/11/28. Cold Spring Harbor Labora- tory Press; 2017; 27(5): 677−85. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27895111. 15. Hu J, Ng PC. Predicting the effects of frame- shifting indels. Genome Biol. [Internet]. BioMed Central; 2012; 13(2): R9−R9. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22322200. 16. Stankiewicz P, Lupski JR. Structural Variation in the Human Genome and its Role in Disease. Annu Rev Med. Annual Reviews; 2010; 61(1): 437−55. Available from: https://doi.org/10.1146/ annurev-med-100708-204735. 17. Mlinaric-Rascan I, Karas Kuzelicki N, Ostanek B, Jagodic Mlinaric K. Farmakogenomika. Ljublja- na: Fakulteta za farmacijo; 2010. 18. Ivics Z, Izsvák Z. Repetitive elements and genome instability. Semin Cancer Biol. 2010; 20(4): 197−9. Available from: http:// www.sciencedirect.com/science/article/pii/ S1044579X10000623. 19. Duitama J, Zablotskaya A, Gemayel R, Jan- sen A, Belet S, Vermeesch JR, et al. Large-scale analysis of tandem repeat variability in the human genome. Nucleic Acids Res. 2014/03/20. Oxford University Press; 2014; 42(9): 5728−41. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24682812. 20. Kolarski M, Ahmetovic B, Beres M, Topic R, Nikic V, Kavecan I, et al. Genetic Counseling and Prenatal Diagnosis of Triploidy During the Second Trimester of Pregnancy. Med Arch. (Sarajevo, Bosnia Herzegovina). AVICENA, d.o.o., Sarajevo; 2017; 71(2): 144−7. Available from: https://pub- med.ncbi.nlm.nih.gov/28790549. 21. Miller OJ, Therman E. Abnormal Phenotypes Due to Autosomal Aneuploidy or Polyploidy. Hum. Chromosom. New York, NY: Springer New York; 2001. p. 175−85. Available from: https:// doi.org/10.1007/978-1-4613-0139-4_12. 22. O’Connor C. Chromosomal Abnor- malities: Aneuploidies. Nat Educ. 2008; 1(1): 172. Available from: https:// www.nature.com/scitable/topicpage/ chromosomal-abnormalities-aneuploidies-290/. 23. Help Me Understand Genetics (Mutations and Health): How can gene mutations affect health and development? Natl Libr Med (US); Genet Home Ref 2020 [cited 2020 Apr 25]. Available from: https://ghr.nlm.nih.gov/primer/ mutationsanddisorders/mutationscausedisease. 24. Stenson PD, Ball E V, Mort M, Phillips AD, Shiel JA, Thomas NST, et al. Human Gene Muta- tion Database (HGMD®): 2003 update. Hum Mutat. John Wiley & Sons, Ltd; 2003 Jun 1; 21(6): 577−81. Available from: https://doi.org/10.1002/ humu.10212. Slovenska pediatrija 4/2020.indd 170 12/12/2020 12:14 Slovenska pediatrija 2020 | 171 25. Sudmant PH, Rausch T, Gardner EJ, Handsa- ker RE, Abyzov A, Huddleston J, et al. An integra- ted map of structural variation in 2,504 human genomes. Nature. 2015; 526(7571): 75−81. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih. gov/26432246. 26. Chiang C, Scott AJ, Davis JR, Tsang EK, Li X, Kim Y, et al. The impact of structural variation on human gene expression. Nat Genet 2017; 49(5): 692−9. Available from: https://doi.org/10.1038/ ng.3834. 27. Hurles ME, Dermitzakis ET, Tyler-Smith C. The functional impact of structural variation in humans. Trends Genet 2008; 24(5): 238−45. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih. gov/18378036. 28. Geršak K. Genetsko svetovanje in prenatalna diagnostika. In: TakaË I, Geršak K, editors. Gine- kol. Perinatol. 1. izd. Maribor: Medicinska fakul- teta; 2016. p. 447−54. 29. Mahdieh N, Rabbani B. An overview of muta- tion detection methods in genetic disorders. Iran J Pediatr. Tehran University of Medical Sciences 2013; 23(4): 375−88. Available from: https://pub- med.ncbi.nlm.nih.gov/24427490 30. Lovrecic L, Peterlin B. Implementation of molecular karyotyping in clinical genetics. Zdr Vestn. 2013; 82(10): 669−76. Available from: https://vestnik.szd.si/index.php/ZdravVest/article/ view/960 31. Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwij- nenburg D, Diepvens F, Pals G. Relative quantifi- cation of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Res 2002 15; 30(12): e57−e57. Available from: https://doi.org/10.1093/nar/gnf056 32. Jenko Bizjan B, Katsila T, Tesovnik T, ©ket R, Debeljak M, Matsoukas MT, et al. Challenges in identifying large germline structural variants for clinical use by long read sequencing. Comput Struct Biotechnol J 2020; 18: 83−92. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/ article/pii/S2001037019303678 33. Cerne D, Ostanek B, Lukac-Bajalo J, Marc J, Hvala I. Biomedicinska analitika I. Ljubljana: Fakulteta za farmacijo; 2012. 34. Katsanis SH, Katsanis N. Molecular gene- tic testing and the future of clinical genomi- cs. Nat Rev Genet 2013 Jun; 14(6): 415−26. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih. gov/23681062 35. Giani AM, Gallo GR, Gianfranceschi L, For- menti G. Long walk to genomics: History and current approaches to genome sequencing and assembly. Comput Struct Biotechnol J 2020; 18: 9−19. Available from: http://www.sciencedirect. com/science/article/pii/S2001037019303277 36. Eggerding FA. Oligonucleotide Ligation Assay. In: Walker JM, Rapley R, editors. Med Biomethods Handb Totowa, NJ: Humana Press; 2005. p. 293−303. Available from: https://doi. org/10.1385/1-59259-870-6: 293 37. Tucker EJ, Huynh BL. Genotyping by High -Resolution Melting Analysis BT - Crop Breeding: Methods and Protocols. In: Fleury D, Whitford R, editors. New York, NY: Springer New York; 2014. p. 59−66. Available from: https://doi. org/10.1007/978-1-4939-0446-4_5 38. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequ- encing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1977; 74(12): 5463−7. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih. gov/271968 39. Knief C. Analysis of plant microbe intera- ctions in the era of next generation sequen- cing technologies. Front Plant Sci 2014. p. 216. Available from: https://www.frontiersin.org/ article/10.3389/fpls.2014.00216 40. Basturea GN. MATER METHODS: Somatic Mutations [Internet]. Labome.com. 2018 [cited 2020 Apr 29]. p. 8:2673. Available from: https:// www.labome.com/method/Somatic-Mutations.html 41. Progar V, PetroviË U. Vpliv parametrov sekvenciranja naslednje generacije na zanesljivost rezultatov v metagenomskih študijah. Inform. Medica Slov 2013; 18(1/2): 1−8. 42. Sims D, Sudbery I, Ilott NE, Heger A, Ponting CP. Sequencing depth and coverage: key consi- derations in genomic analyses. Nat Rev Genet 2014; 15(2): 121−32. Available from: https://doi. org/10.1038/nrg3642 43. Mantere T, Kersten S, Hoischen A. Long-Re- ad Sequencing Emerging in Medical Geneti- cs. Front Genet 2019. p. 426. Available from: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/ fgene.2019.00426 44. Guan P, Sung W-K. Structural variation detection using next-generation sequencing data: A comparative technical review. Metho- ds [Internet]. 2016;102:36−49. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/ S1046202316300184 45. Chaisson MJP, Huddleston J, Dennis MY, Sudmant PH, Malig M, Hormozdiari F, et al. Resolving the complexity of the human genome using single-molecule sequencing. Nature. 2015 29; 517(7536): 608−11. Available from: https:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25383537 46. Pan B, Kusko R, Xiao W, Zheng Y, Liu Z, Xiao C, et al. Similarities and differences between variants called with human reference genome HG19 or HG38. BMC Bioinformatics 2019; 20(2): 101. Available from: https://doi.org/10.1186/ s12859-019-2620-0 47. Ballouz S, Dobin A, Gillis JA. Is it time to change the reference genome? Genome Biol. [Internet]. 2019;20(1):159. Available from: https:// doi.org/10.1186/s13059-019-1774-4 48. Li R, Li Y, Zheng H, Luo R, Zhu H, Li Q, et al. Building the sequence map of the human pan- genome. Nat Biotechnol 2010; 28(1): 57−63. Available from: https://doi.org/10.1038/nbt.1596 49. Chaisson MJP, Sanders AD, Zhao X, Mal- hotra A, Porubsky D, Rausch T, et al. Multi-plat- form discovery of haplotype-resolved structu- ral variation in human genomes. Nat. Commun 2019; 10(1): 1784. Available from: https://doi. org/10.1038/s41467-018-08148-z 50. Audano PA, Sulovari A, Graves-Lindsay TA, Cantsilieris S, Sorensen M, Welch AE, et al. Cha- racterizing the Major Structural Variant Alleles of the Human Genome. Cell 2019 24; 176(3): 663- 675.e19. Available from: https://pubmed.ncbi. nlm.nih.gov/30661756 51. Pereira MA. Application of Next-Generation Sequencing in the Era of Precision Medicine. In: Malta FSV, editor. Rijeka: IntechOpen; 2017. p. Ch. 13. Available from: https://doi.org/10.5772/ intechopen.69337 52. Gloss BS, Dinger ME. Realizing the significan- ce of noncoding functionality in clinical genomi- cs. Exp Mol Med. Nature Publishing Group UK; 2018 ;50(8): 97. Available from: https://pubmed. ncbi.nlm.nih.gov/30089779 53. Tian S, Yan H, Klee EW, Kalmbach M, Slager SL. Comparative analysis of de novo assemblers for variation discovery in personal genomes. Bri- ef Bioinform. Oxford University Press 2018. 28; 19(5): 893−904. Available from: https://pubmed. ncbi.nlm.nih.gov/28407084 Lara Slavec, mag. lab. biomed. Univerzitetni kliniËni center Ljubljana, Ginekološka klinika, Ljubljana, Slovenija in Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Katedra za kliniËno biokemijo, Ljubljana, Slovenija. prof. dr. Ksenija Geršak, dr. med., svet. Univerzitetni kliniËni center Ljubljana, Ginekološka klinika, Ljubljana, Slovenija in Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Katedra za ginekologijo, Ljubljana, Slovenija. doc. dr. Nataša Karas KuželiËki, mag. farm. Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Katedra za kliniËno biokemijo, Ljubljana, Slovenija. izr. prof. dr. Katarina Trebušak Podkrajšek, spec. lab. med. genet., spec. med. biokem. (kontaktna oseba / contact person) Univerzitetni kliniËni center Ljubljana, PediatriËna klinika, Inštitut za specialno laboratorijsko diagnostiko, Vrazov trg 1, 1000 Ljubljana, Slovenija in Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Inštitut za biokemijo in molekularno genetiko, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana, Slovenija. tel:. +386 1 543 7669 e-naslov: katarina.trebusakpodkrajsek@ mf.uni-lj.si prispelo / received: 16. 7. 2020 sprejeto / accepted: 2. 10. 2020 Trebušak Podkrajšek K, et al. Humane genet- ske spremembe in njihovo doloËanje: trenu- tno stanje in obeti za prihodnost. Slov Pediatr 2020; 27(4): 163−171. https://doi.org/10.38031/ slovpediatr-2020-4-01. Slovenska pediatrija 4/2020.indd 171 12/12/2020 12:14